JP2022068788A - Evaluation of oxidation stress in mild cognitive impairment - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、軽度認知障害における酸化ストレスの評価に関する。 The present invention relates to the evaluation of oxidative stress in mild cognitive impairment.
軽度認知障害(Mild cognitive impairment, MCI)、アルツハイマー病(Alzheimer’s disease, AD)を初めとする認知症等の患者数が、高齢化社会に伴い急増している。MCI を放置すると、年間10～15％程度の割合で、MCIの症状が進行して認知症へと移行する。 The number of patients with dementia such as mild cognitive impairment (MCI) and Alzheimer's disease (AD) is increasing rapidly with the aging society. If MCI is left untreated, the symptoms of MCI progress and progress to dementia at a rate of about 10 to 15% per year.
一方、酸化ストレスの高い状態が続くと、とりわけ脳組織では、活性酸素種(ROS)の産生増加、抗酸化システム機能の低下、及び修復メカニズムの効率低下が、アルツハイマー型認知症の発症と増悪につながるとされてきた。 On the other hand, when oxidative stress continues to be high, especially in brain tissues, increased production of reactive oxygen species (ROS), decreased antioxidant system function, and decreased efficiency of repair mechanism lead to the onset and exacerbation of Alzheimer's disease. It has been said that it will be connected.
非特許文献１は、アルツハイマー病(AD)の患者の髄液中において、βアミロイドのオリゴマー形成を阻害することによりアルツハイマー病の発症に対して抑制的に働いている可能性が示唆されているトランスサイレチン（TTR）が、特に強く酸化を受けていることを報告している。この試験では、アルツハイマー病(AD)及びMCIの患者の髄液中で、TTRのメチオニンの酸化レベルが上昇していることを示唆するデータが得られている。
非特許文献２は、アルツハイマー病(AD)及びMCIの患者の脳脊髄液中のトランスサイレチンが、正常圧水頭症（NPH）及び健常対象者（HC）という対照群と比較して有意に高い割合で酸化により修飾されており、特には10番目のシステインでより多く修飾されていることを示している。
In
MCIや認知症の診断は、各疾患の診断基準に基づき、問診、認知機能テスト、画像診断等を用いて医師により従来行われているが、MCIや認知症は予防が重要であり、より早期に簡便に、MCIに対する酸化ストレスの影響を評価する方法、並びに健常者からMCIを経て認知症への発症（移行）を評価するための方法が求められている。従って、本発明は、酸化ストレスレベルに基づいてMCI又は認知症を検査又は評価する方法、認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置のスクリーニング方法、及び認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置の評価方法を提供することにある。 Diagnosis of MCI and dementia is conventionally performed by doctors using interviews, cognitive function tests, diagnostic imaging, etc. based on the diagnostic criteria of each disease, but prevention is important for MCI and dementia, and it is earlier. There is a need for a simple method for evaluating the effect of oxidative stress on MCI and a method for evaluating the onset (transition) of dementia from a healthy person via MCI. Therefore, the present invention is effective for a method for testing or evaluating MCI or dementia based on the oxidative stress level, a screening method for measures effective for preventing or delaying the onset of dementia, and a method for preventing or delaying the onset of dementia. It is to provide an evaluation method for various measures.
本願発明者は、酸化ストレスの指標として、10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチン総量に対する比（CysTTR／TTR比）に着目し、被検者の体液における当該比を測定し、測定値とMCIの症状との相関を見出した。本願発明者はさらに、このCysTTR／TTR比の値を用いた検査を、MCIリスクインデックス値を用いた検査と組み合わせると、MCI又は認知症の検査精度が向上することを見出した。 The inventor of the present application focused on the ratio (CysTTR / TTR ratio) of cysteine-ized transthyretin obtained by adding cysteine to the cysteine at the 10-position to the total amount of transthyretin as an index of oxidative stress. The ratio was measured and the correlation between the measured value and the symptoms of MCI was found. The inventor of the present application has further found that when the test using the CysTTR / TTR ratio value is combined with the test using the MCI risk index value, the test accuracy of MCI or dementia is improved.
すなわち、本発明は、以下の実施形態を包含する。 That is, the present invention includes the following embodiments.
項１． 被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチンに対する比（CysTTR／TTR比）を測定することを含む、酸化ストレスに基づくMCI又は認知症の検査方法。
項２．前記CysTTR／TTR比が基準値以上である場合に、認知症へ移行する可能性が高いことを示す、項１に記載の方法。
項３．前記CysTTR／TTR比が基準値よりも低い場合に、認知症へ移行する可能性が低いことを示す、項１又は２に記載の方法。
項４．被検者の体液中の配列番号4～15で表されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチドの測定値の関数であるリスクインデックス値を測定することをさらに含む項１～３のいずれかに記載の方法。
Item 4.
項５．前記リスクインデックス値が基準値以上である場合に、認知症へ移行する可能性が高いことを示す、項４に記載の方法。 Item 5. Item 4. The method according to Item 4, which indicates that there is a high possibility of developing dementia when the risk index value is equal to or higher than the reference value.
項６．前記リスクインデックス値が基準値よりも低い場合に、認知症へ移行する可能性が低いことを示す、項４又は５に記載の方法。 Item 6. Item 4. The method according to Item 4 or 5, indicating that when the risk index value is lower than the reference value, the possibility of developing dementia is low.
項７．前記MCI又は認知症の検査方法は、認知症の発症リスクの検査方法である項１～６のいずれかに記載に記載の方法。
Item 7. The method according to any one of
項８．認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置のスクリーニング方法であって、
措置を施した被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチンに対する比（CysTTR／TTR比）を測定することを含み、
前記措置後のCysTTR／TTR比が、基準値又は前記措置前のCysTTR／TTR比と比べて低下している場合に、前記措置はアルツハイマー型認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いことを示す、方法。
Item 8. It is a screening method for effective measures to prevent or delay the onset of dementia.
Including measuring the ratio (CysTTR / TTR ratio) of cysteine-added cysteine-added cysteine to transthyretin at position 10 in the body fluid of the treated subject to transthyretin.
If the CysTTR / TTR ratio after the measure is lower than the reference value or the CysTTR / TTR ratio before the measure, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of Alzheimer's disease. How to show that is high.
項９．前記措置は医薬の投与、食品の投与、脳機能活性化トレーニング、食事療法、運動療法、音楽療法、睡眠療法、及び生活習慣改善指導から成る群から選択される少なくとも一つである項７又は８のいずれか一項に記載の方法。 Item 9. Item 7 or 8 which is at least one selected from the group consisting of drug administration, food administration, brain function activation training, diet therapy, exercise therapy, music therapy, sleep therapy, and lifestyle-related improvement guidance. The method described in any one of the above.
項１０．認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置の評価方法であって、
措置を施した被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチンに対する比（CysTTR／TTR比）を測定することを含み、
前記措置後のCysTTR／TTR比が、基準値又は前記措置前のCysTTR／TTR比と比べて低下している場合に、前記措置はアルツハイマー型認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いことを示す、方法。
Item 10. It is an evaluation method of effective measures for preventing or delaying the onset of dementia.
Including measuring the ratio (CysTTR / TTR ratio) of cysteine-added cysteine-added cysteine to transthyretin at position 10 in the body fluid of the treated subject to transthyretin.
If the CysTTR / TTR ratio after the measure is lower than the reference value or the CysTTR / TTR ratio before the measure, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of Alzheimer's disease. How to show that is high.
項１１．CysTTR／TTR比は、システイン化トランスサイレチンのうちの10番目から15番目までの6個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号２）のシグナルの強度の、トランスサイレチンのうちの81番目から103番目までの23個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号３）のシグナルの強度に対する比から計算される項１～１０のいずれかに記載の方法。
Item 11. The CysTTR / TTR ratio is the 81st to 103rd of the transthyretin of the signal intensity of the peptide (SEQ ID NO: 2) consisting of 6 amino acids from the 10th to the 15th of the cysteineized transthyretin. Item 6. The method according to any one of
CysTTR／TTR比は被検者における酸化ストレスを反映しており、本発明によれば、かかる指標を被検者における健常者からMCIを経て認知症への発症又は移行を評価に利用することができる。 The CysTTR / TTR ratio reflects oxidative stress in the subject, and according to the present invention, such an index can be used to evaluate the onset or transition from a healthy subject to dementia via MCI. can.
また、措置を施した被検者におけるCysTTR／TTR比を測定することにより、当該措置による酸化ストレスの低減効果、さらには認知症の発症予防又は発症遅延の効果を確認することができる。 In addition, by measuring the CysTTR / TTR ratio in the subject to whom the measures have been taken, it is possible to confirm the effect of reducing the oxidative stress by the measures and the effect of preventing or delaying the onset of dementia.
本発明は、被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチン総量に対する比（CysTTR／TTR比）を測定することを含む、軽度認知障害（以下、MCIとも称する）又は認知症の評価又は検査方法を提供する。 The present invention comprises measuring the ratio (CysTTR / TTR ratio) of cysteine-added transthyretin to the total amount of transthyretin in which cysteine is added to the cysteine at position 10 in the body fluid of the subject (CysTTR / TTR ratio). Hereinafter, also referred to as MCI) or a method for evaluating or testing dementia is provided.
なお、本明細書において、かかる評価又は検査には、CysTTR／TTR比が高いことによるMCIの診断（特には早期診断）の補助的判定又は補助的評価、CysTTR／TTR比の低減によるMCIから認知症への発症遅延または発症予防の可能性の判定又は評価が含まれる。MCIの判定には、MCIの有無を判定することのみならず、予防的にMCIの罹患可能性を判定することが含まれる。 In addition, in this specification, such evaluation or examination is recognized from MCI by auxiliary judgment or auxiliary evaluation of diagnosis of MCI (particularly early diagnosis) due to high CysTTR / TTR ratio, and reduction of CysTTR / TTR ratio. Includes determination or evaluation of the possibility of delaying or preventing the onset of dementia. Determining MCI includes not only determining the presence or absence of MCI, but also prophylactically determining the likelihood of MCI.
被検者は、主観的に自覚症状のない健常者、MCIに罹患していると疑われる患者、又はMCI患者を含み、「MCIに罹患していると疑われる被検者」は、被検者本人が主観的に疑いを抱く者（何らかの自覚症状がある者に限らず、単に予防検診の受診を希望する者を含む）であっても、何らかの客観的な根拠に基づく者（例えば、従来公知の臨床検査）及び／又は診察の結果、MCIの合理的な罹患可能性があると医師が判断した者）であってもよい。 Subjects include healthy subjects who are subjectively asymptomatic, patients suspected of having MCI, or MCI patients, and "subjects suspected of having MCI" are subjects. A person who is subjectively suspicious (including not only those who have some subjective symptoms but also those who simply wish to undergo a preventive examination) but who are based on some objective basis (for example, conventional). It may be a known clinical test) and / or a person who is judged by a doctor to have a reasonable possibility of suffering from MCI as a result of a medical examination).
上記MCIの評価又は検査方法において、好ましいいくつかの実施形態では、被検者はMCIに罹患している被検者又はMCIに罹患していると疑われる被検者である。 In some preferred embodiments of the MCI evaluation or testing method, the subject is a subject suffering from or suspected of having MCI.
図１に示されるように、天然のトランスサイレチンは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチン（CysTTR、以下、単に「システイン化トランスサイレチン」と称する場合がある）とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において10位のシステインにシステインが付加されている修飾トランスサイレチンを指す。CysTTRのレベルは、システイン化トランスサイレチンを選択的に検出できる公知の方法でシステイン化トランスサイレチンの一部のレベル（シグナル強度、量、濃度）を測定することにより測定することができる。 As shown in FIG. 1, natural transcyletin is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is a cysteineized transcyletin (CysTTR, hereinafter referred to as CysTTR) in which cysteine is added to the cysteine at position 10. (Sometimes referred to simply as "cysteineized transcyletin") refers to a modified transcyletin in which cysteine is added to the cysteine at position 10 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The level of CysTTR can be measured by measuring the level (signal intensity, amount, concentration) of a portion of the cysteinylated transthyretin by a known method capable of selectively detecting the cysteinylated transthyretin.
CysTTR／TTR比の分母は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の一次配列すなわちアミノ酸の種類が保存されたトランスサイレチン総量を指す。トランスサイレチン総量には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる非修飾のトランスサイレチン、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるが少なくとも一つのアミノ酸が修飾された修飾トランスサイレチンが含まれる。修飾トランスサイレチンには、システイン化（Ｓ－システイニル）トランスサイレチン、グルタチオン化トランスサイレチン、Ｓ－Ｓ結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、アセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付加トランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体等が含まれる。
CysTTRのレベルは、TTR総量を選択的に検出できる公知の方法でトランスサイレチンの全部又は一部のレベル（シグナル強度、量、濃度）を測定することにより測定することができる。
The denominator of the CysTTR / TTR ratio refers to the primary sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, the total amount of transthyretin in which the amino acid type is conserved. The total amount of transthyretin includes unmodified transthyretin consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and modified transthyretin consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 but modified with at least one amino acid. Is included. Modified transthyretin includes cysteine-ized (S-cystinyl) transthyretin, glutathioneized transthyretin, SS bond-forming transthyretin, oxidized transthyretin, formylated transthyretin, acetylated transthyretin, etc. Includes phosphorylated transthyretin, sugar chain-added transthyretin, myristylated transthyretin, and complex derivatives thereof.
The level of CysTTR can be measured by measuring the level (signal intensity, amount, concentration) of all or part of transthyretin by a known method capable of selectively detecting the total amount of TTR.
被験試料となる被検者由来の体液は特に限定されないが、被検者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液など生体から容易に採取できるものや、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液、リンパ液など比較的容易に採取されるものが挙げられる。一実施形態では、体液が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液及びリンパ液からなる群より選択される体液からなる。血清や血漿を用いる場合、常法に従って被検者から採血し、前処理を施さず直接、又は液性成分を分離することにより分析にかける被験試料を調製することができる。必要に応じて、体液から、抗体カラムやスピンカラムなどを用いて、予め高分子量の蛋白質画分などを分離除去しておくこともできる。 The body fluid derived from the subject as the test sample is not particularly limited, but it is preferable that the body fluid does not invade the subject, and for example, blood, plasma, serum, saliva, urine, tears, etc. can be easily obtained from the living body. Examples include those that can be collected, and those that can be collected relatively easily, such as spinal fluid, bone marrow fluid, pleural fluid, abdominal fluid, synovial fluid, aqueous humor, plasma fluid, and lymph fluid. In one embodiment, the body fluid is selected from the group consisting of blood, plasma, serum, saliva, urine, spinal fluid, bone marrow fluid, pleural effusion, ascites, joint fluid, tear fluid, aqueous humor, vitreous fluid and lymph fluid. Become. When serum or plasma is used, a test sample to be analyzed can be prepared by collecting blood from a subject according to a conventional method and directly or by separating the liquid component without pretreatment. If necessary, a high molecular weight protein fraction or the like can be separated and removed from the body fluid in advance by using an antibody column, a spin column, or the like.
体液中のCysTTR及びTTRの測定は、例えば、体液を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、表面プラズモン共鳴法、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、及び質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計、免疫質量分析計、安定同位体ペプチドを内部標準にした質量分析計、免疫顕微鏡計など）を組み合わせる方法等に供し、該ペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。 The measurement of CysTTR and TTR in body fluids includes, for example, various molecular mass spectrometry methods for body fluids, such as gel electrophoresis and various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse). Phase chromatography, etc.), surface plasmon resonance, ionization (eg, electron impact ionization, field dispersion, secondary ionization, fast atomic collision, matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), electrospray (Ionization method, etc.), and mass spectrometers (eg, double-convergent mass spectrometer, quadrupole mass spectrometer, time-of-flight mass spectrometer, Fourier transform mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, immunomass spectrometer, etc. It can be carried out by subjecting it to a method of combining a stable isotope peptide as an internal standard (mass spectrometer, immunomicrometer, etc.) and detecting a band, spot, or peak that matches the molecular weight of the peptide. Not limited to.
本発明における好ましいCysTTR／TTR比の測定方法は、トリプシン消化した被検者の体液をクロマトグラフィーで分離し、質量分析にかけ、それぞれのTTRの測定値からCysTTR／TTRのモル比を計算することである。 The preferred method for measuring the CysTTR / TTR ratio in the present invention is to separate the body fluid of a trypsin-digested subject by chromatography, subject it to mass spectrometry, and calculate the molar ratio of CysTTR / TTR from the measured values of each TTR. be.
トリプシン消化物を用いて、CysTTRのレベルは、システイン化トランスサイレチンのうちの10番目から15番目までの6個のアミノ酸からなるペプチド（CPLMVK、配列番号２）のシグナルの強度を測定することにより推算することができる。TTRのレベルは、トランスサイレチンのうちの81番目から103番目までの23個のアミノ酸からなるペプチド（ALGISPFHEHAEVVFTANDSGPR、配列番号３）のシグナルの強度を測定することにより推算することができる。 Using tryptic digests, the level of CysTTR is measured by measuring the signal intensity of a peptide consisting of 6 amino acids (CPLMVK, SEQ ID NO: 2) from the 10th to the 15th of the cysteineized transthyretin. Can be estimated. The level of TTR can be estimated by measuring the signal intensity of a peptide consisting of 23 amino acids from the 81st to 103rd amino acids of transthyretin (ALGISPFHEHAEVVFTANDSGPR, SEQ ID NO: 3).
支持体表面上に捕捉された被験試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から、標的分子であるCysTTR及びTTRの存在及び量を同定することができる。質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、MCI患者、AD患者もしくは健常者由来の体液における質量分析データと比較して、示差的な（differential）情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができる。 By mass spectrometry of the molecules in the test sample captured on the surface of the support, the presence and amount of the target molecules CysTTR and TTR can be identified from the information on the molecular weight. It is also possible to output the information from the mass spectrometer as differential information by comparing it with the mass spectrometric data in the body fluids derived from MCI patients, AD patients or healthy subjects by using an arbitrary program. .. Such programs are well known, and one of ordinary skill in the art can easily construct or modify such programs using known information processing techniques.
高精度な質量分析結果を得るためには、高速液体クロマトグラフィーに接続した三連四重極型等の質量分析装置を用いて分析する。標的分子の安定同位体標識ペプチドを合成して、それを既知量の内部標準品として被験試料に混合し、逆相固相担体等でペプチド画分の粗精製を実施する。高速液体クロマトグラフィーに導入後、分離された各ペプチドは質量分析装置内でイオン化され、その後コリジョンセル内で断片化、得られたペプチドフラグメントをmultiple reaction monitoring法により定量する。この際、安定同位体標識ペプチドを内部標準として用いることでCV値が5%以下の実測データを取得できる。安定同位体標識ペプチドは、Cambridge Isotope Laboratory（MA, USA）等の供給業者より購入した安定同位体標識アミノ酸（例えばアミノ酸a(13C6,15N2)は、安定同位体炭素（原子量13）6個と、安定同位体窒素（原子量15）2個で置換された質量数が元のアミノ酸より８原子量増加したアミノ酸aを例示）を元のアミノ酸の配列位置に置換する既存の合成法（たとえばF-mocによる固相反応）により得られる。 In order to obtain highly accurate mass spectrometry results, analysis is performed using a mass spectrometer such as a triple quadrupole type connected to high performance liquid chromatography. A stable isotope-labeled peptide of the target molecule is synthesized, mixed with a test sample as a known amount of an internal standard, and the peptide fraction is roughly purified using a reverse phase solid phase carrier or the like. After introduction into high performance liquid chromatography, each separated peptide is ionized in a mass spectrometer, then fragmented in a collision cell, and the obtained peptide fragment is quantified by a multiple reaction monitoring method. At this time, by using a stable isotope-labeled peptide as an internal standard, it is possible to obtain actual measurement data having a CV value of 5% or less. Stable isotope-labeled peptides are stable isotope-labeled amino acids purchased from suppliers such as the Cambridge Isotope Laboratory (MA, USA) (for example, amino acids a ( 13 C 6 , 15 N 2 ) are stable isotope carbons (atomic weight 13)). An existing synthetic method (for example, exemplifying amino acid a in which the mass number substituted with 6 and 2 stable isotopes nitrogen (atomic weight 15) is 8 atomic weights higher than that of the original amino acid) is replaced with the sequence position of the original amino acid (for example). It is obtained by solid phase reaction with F-moc).
本発明の方法において測定されるトリプシン消化物であるTTRペプチドは、タンパク質分解産物からなるため、未分解のタンパク質や、切断部位が共通の類似ペプチド等様々な分子が測定値に影響を与える可能性がある。そこで、第１工程において、体液を抗体により免疫アフィニティ精製し、抗体に結合したフラクションを、第２工程において質量分析に付し、精緻な分子量を基準に同定、定量する、いわゆる免疫質量分析法を利用することができる（例えば、Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21: 352-358を参照）。免疫質量分析法によれば、未分解のタンパク質も類似ペプチドも、質量分析計で完全に分離され、バイオマーカーの正確な分子量を基準に高い特異性と感度で定量が可能となる。 Since the TTR peptide, which is a trypsin digested product measured by the method of the present invention, is composed of proteolytic products, various molecules such as undegraded proteins and similar peptides having a common cleavage site may affect the measured values. There is. Therefore, in the first step, the body fluid is immunoaffinished with an antibody, and the fraction bound to the antibody is subjected to mass spectrometry in the second step, and identified and quantified based on a precise molecular weight, a so-called immunomass spectrometry method. Available (see, for example, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21: 352-358). According to immunomass spectrometry, undegraded proteins and similar peptides are completely separated by mass spectrometry, and can be quantified with high specificity and sensitivity based on the accurate molecular weight of the biomarker.
CysTTR／TTR×100（％）で表される酸化ストレスレベルは、数値が大きいほど酸化ストレスのレベルが高いことを表す。酸化ストレスレベルはCysTTR／TTRの百分率であるため、CysTTR／TTRと互換的に説明することができる。 The oxidative stress level expressed by CysTTR / TTR × 100 (%) indicates that the larger the value, the higher the oxidative stress level. Since the oxidative stress level is a percentage of CysTTR / TTR, it can be explained interchangeably with CysTTR / TTR.
一般に、健常者、MCI患者、及び認知症患者の酸化ストレスレベルの値から、例えば、酸化ストレスレベルの値が健常者の平均値以下であると酸化ストレスが低いと評価することができる。また、酸化ストレスレベルの値が認知症患者の平均値以上であると酸化ストレスが高いと評価することができる。 In general, from the values of oxidative stress levels of healthy subjects, MCI patients, and dementia patients, for example, when the oxidative stress level value is equal to or less than the average value of healthy subjects, it can be evaluated that the oxidative stress is low. Further, when the value of the oxidative stress level is equal to or higher than the average value of the dementia patients, it can be evaluated that the oxidative stress is high.
驚くべきことに、本発明のCysTTR／TTR比すなわち酸化ストレスレベルを指標として用いると、MCIの患者をCysTTR／TTR比が高い群とCysTTR／TTR比が低い群の２群に有意に区別することができ、CysTTR／TTR比はMCIから認知症への移行し易さの指標とすることができる。 Surprisingly, when the CysTTR / TTR ratio of the present invention, that is, the oxidative stress level, is used as an index, patients with MCI are significantly divided into two groups, a group having a high CysTTR / TTR ratio and a group having a low CysTTR / TTR ratio. The CysTTR / TTR ratio can be used as an index of the ease of transition from MCI to dementia.
被検者の体液の酸化ストレスレベルの測定値を基準値と比較することによりMCI又は認知症の発症リスクを検査することができる。 The risk of developing MCI or dementia can be examined by comparing the measured value of the oxidative stress level of the body fluid of the subject with the reference value.
上記基準値は、MCIの検査の場合、健常者とMCI患者とを分ける酸化ストレスレベル値のカットオフ値又は閾値、MCI患者の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者の酸化ストレスレベル値の中央値、MCI患者群を酸化ストレスレベル値が高い群と低い群に分けるカットオフ値などであってよい。MCI患者の酸化ストレスレベル値の平均値又は中央値は、MCI患者群を酸化ストレスレベル値が高い群と低い群の２群にさらに分けたときの酸化ストレスレベル値が低い群の平均値又は中央値であってもよいし、酸化ストレスレベル値が高い群の平均値又は中央値であってもよいし、MCI患者を２群に分けない場合の酸化ストレスレベル値平均値又は中央値であってもよい。 In the case of MCI examination, the above reference value is the center of the cutoff value or threshold value of the oxidative stress level value that separates healthy subjects and MCI patients, the average value of the oxidative stress level value of MCI patients, and the oxidative stress level value of MCI patients. The value may be a cutoff value that divides the MCI patient group into a group with a high oxidative stress level value and a group with a low oxidative stress level value. The average or median oxidative stress level of MCI patients is the average or median of the group with low oxidative stress level when the MCI patient group is further divided into two groups, a group with high oxidative stress level and a group with low oxidative stress level. It may be the average value or the median value of the group having a high oxidative stress level value, or it may be the average value or the median value of the oxidative stress level value when the MCI patients are not divided into two groups. May be good.
上記基準値は、認知症の検査の場合、健常者とMCI患者とを分ける酸化ストレスレベル値のカットオフ値又は閾値、MCI患者と認知症患者とを分ける酸化ストレスレベル値のカットオフ値又は閾値、MCI患者群を酸化ストレスレベル値が高い群と低い群に分けるカットオフ値、MCI患者の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者の酸化ストレスレベル値の中央値、認知症患者の酸化ストレスレベル値の平均値、認知症患者の酸化ストレスレベル値の中央値などであってよい。MCI患者の酸化ストレスレベル値の平均値又は中央値は、MCI患者群を酸化ストレスレベル値が高い群と低い群の２群にさらに分けたときの酸化ストレスレベル値が低い群の平均値又は中央値であってもよいし、酸化ストレスレベル値が高い群の平均値又は中央値であってもよいし、MCI患者を２群に分けない場合の酸化ストレスレベル値の平均値又は中央値であってもよい。 In the case of a dementia test, the above reference values are the cutoff value or threshold of the oxidative stress level value that separates healthy subjects and MCI patients, and the cutoff value or threshold of the oxidative stress level value that separates MCI patients and dementia patients. , Cut-off value that divides the MCI patient group into high and low oxidative stress level values, average oxidative stress level value of MCI patients, median oxidative stress level value of MCI patients, oxidative stress level of dementia patients It may be the average value of the values, the median value of the oxidative stress level of the dementia patient, and the like. The average or median oxidative stress level of MCI patients is the average or median of the group with low oxidative stress level when the MCI patient group is further divided into two groups, a group with high oxidative stress level and a group with low oxidative stress level. It may be the average value or the median value of the group having a high oxidative stress level value, or it may be the average value or the median value of the oxidative stress level value when the MCI patients are not divided into two groups. You may.
一つの実施形態において、酸化ストレスレベル値が基準値よりも低い場合に、MCIからアルツハイマー型認知症を含む認知症へ移行する可能性が低いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が低い患者群の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が低い患者群の酸化ストレスレベル値の中央値等が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In one embodiment, when the oxidative stress level value is lower than the reference value, it can be determined that the possibility of transition from MCI to dementia including Alzheimer-type dementia is low. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value, and a group of MCI patients with a low oxidative stress level value. The average value of the oxidative stress level value, the median value of the oxidative stress level value of the group of patients with the low oxidative stress level value among the MCI patients, etc. are mentioned, and the reference value is preferably the patient with the high oxidative stress level value among the MCI patients. A cutoff value or threshold that separates the group from the group of patients with low oxidative stress level values.
別の実施形態において、酸化ストレスレベル値が基準値以上である場合に、MCIからアルツハイマー型認知症を含む認知症へ移行する可能性が高いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が高い患者群の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が高い患者群の酸化ストレスレベル値の中央値、認知症患者の酸化ストレスレベル値の平均値、認知症患者の酸化ストレスレベル値の中央値等が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In another embodiment, when the oxidative stress level value is equal to or higher than the reference value, it can be determined that there is a high possibility of transition from MCI to dementia including Alzheimer-type dementia. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value, and a group of MCI patients with a high oxidative stress level value. Average oxidative stress level value, median oxidative stress level value of patients with high oxidative stress level among MCI patients, average oxidative stress level value of dementia patients, oxidative stress level value of dementia patients The reference value is preferably a cut-off value or a threshold value that separates a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value.
本発明の上記検査又は評価に、他の従来の検査又は評価、及び／又は医師による従来のMCI及び認知症（特にはAD）の診断を組み合わせることにより、アルツハイマー型認知症を含む認知症への移行の可能性又は発症リスクをより早期に、及び／又はより精密に評価又は判定することができる。 By combining the above tests or evaluations of the present invention with other conventional tests or evaluations and / or the diagnosis of conventional MCI and dementia (particularly AD) by a physician, to dementia including Alzheimer's disease. The likelihood of transition or the risk of developing it can be assessed or determined earlier and / or more precisely.
例えば、バイオマーカーを用いてMCIの発症リスクの可能性を判定する従来の検査に、例えばMCIリスクインデックスに基づく判定方法がある（Journal of Alzheimer's Disease 73, 217-227 (2019)）。この文献の方法では、4種類のペプチド（Table 2参照）を用いて回帰式を構築し、診断性能が最良となる最適式から計算された値をMCIリスクインデックス値としている。かかるMCIリスクインデックス値は認知障害が進むにつれて増大するため、認知障害の進行の程度を反映している。一方で、MCIの患者では、3年間の追跡期間中にMCIだった人の64％が認知症に進むことが知られているが（Alzheimers Dement. 2018 Aug;14(8):1077-1087.）、これまでMCIの進行度（ステージ）と各ステージの基準については検討されていなかった。 For example, conventional tests that use biomarkers to determine the potential risk of developing MCI include, for example, a determination method based on the MCI risk index (Journal of Alzheimer's Disease 73, 217-227 (2019)). In the method of this document, a regression equation is constructed using four types of peptides (see Table 2), and the value calculated from the optimal equation with the best diagnostic performance is used as the MCI risk index value. Such MCI risk index values increase as cognitive impairment progresses, thus reflecting the degree of progression of cognitive impairment. On the other hand, among patients with MCI, 64% of those who had MCI during the 3-year follow-up period are known to develop dementia (Alzheimers Dement. 2018 Aug; 14 (8): 1077-1087. ), The progress (stage) of MCI and the criteria for each stage have not been examined so far.
本明細書において、MCIリスクインデックスは、被検者の体液中の配列番号4～15で表されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチドの測定値の関数である。これらのペプチドは表１に示されているが、詳細については例えば特開2019-156539を参照されたい。好ましくはMCIリスクインデックスは配列番号4～15で表されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチドの測定値を用いて回帰式を構築し、診断性能が最良となる最適式から計算された値であって、そのような値を当業者は通常の技能で求めることができる。例えば前掲のAlzheimers Dement. 2018 Aug;14(8):1077-1087を参照されたい。好ましい一実施形態では、上記ペプチドは、配列番号4,5,15のうちの１つ、２つ又は３である。 As used herein, the MCI risk index is a function of measurements of one or more peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4-15 in the body fluids of a subject. These peptides are shown in Table 1, but for details, refer to, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-156539. Preferably, the MCI risk index is calculated from the optimal formula that gives the best diagnostic performance by constructing a regression equation using the measured values of one or more peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 15. Such a value can be obtained by a person skilled in the art with ordinary skill. See, for example, Alzheimers Dement. 2018 Aug; 14 (8): 1077-1087, supra. In a preferred embodiment, the peptide is one, two or three of SEQ ID NOs: 4,5,15.
表１に示された配列番号4～15で表されるアミノ酸配列からなる各ペプチドは、単独で又は２種以上を組み合わせて、MCI又はアルツハイマー病（AD）の検査又は診断マーカーとして使用することができる。このため、被検者の体液中の配列番号4～15で表されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチドを測定し、該測定値の関数として求めた被検者のMCIリスクインデックス値を、基準値と比較することによりMCI又は認知症の発症リスクを検査することができる。体液には血液、血漿、血清等が含まれる。 Each peptide consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 15 shown in Table 1 can be used alone or in combination of two or more as a test or diagnostic marker for MCI or Alzheimer's disease (AD). can. Therefore, the MCI risk index of the subject obtained by measuring one or more kinds of peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 15 in the body fluid of the subject and obtaining it as a function of the measured values. The risk of developing MCI or dementia can be tested by comparing the values with the reference values. Body fluids include blood, plasma, serum and the like.
上記基準値は、MCIの発症リスクの検査の場合、健常者とMCI患者とを分けるMCIリスクインデックス値のカットオフ値又は閾値、MCI患者のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のMCIリスクインデックス値の中央値、MCI患者群をMCIリスクインデックス値が高い群と低い群に分けるカットオフ値、などであってよい。MCI患者のMCIリスクインデックス値の平均値又は中央値は、MCI患者群をMCIリスクインデックス値が高い群と低い群の２群にさらに分けたときのMCIリスクインデックス値が低い群の平均値又は中央値であってもよいし、MCIリスクインデックス値が高い群の平均値又は中央値であってもよいし、MCI患者を２群に分けない場合のMCIリスクインデックス値の平均値又は中央値であってもよい。 The above reference values are the cutoff value or threshold of the MCI risk index value that separates healthy subjects and MCI patients, the average value of the MCI risk index values of MCI patients, and the MCI risk index of MCI patients in the case of testing the risk of developing MCI. It may be the median value, the cutoff value that divides the MCI patient group into a group with a high MCI risk index value and a group with a low MCI risk index value, and the like. The mean or median MCI risk index of MCI patients is the mean or median of the group with the lowest MCI risk index when the MCI patient group is further divided into two groups, a group with a high MCI risk index and a group with a low MCI risk index. It may be a value, it may be the mean or median of the group with a high MCI risk index value, or it may be the mean or median of the MCI risk index values when the MCI patients are not divided into two groups. You may.
上記基準値は、認知症の発症リスクの検査の場合、健常者と認知症患者とを分けるMCIリスクインデックス値のカットオフ値又は閾値、MCI患者と認知症患者とを分けるMCIリスクインデックス値のカットオフ値又は閾値、MCI患者群を MCIリスクインデックス値が高い群と低い群に分けるカットオフ値、MCI患者のMCIリスクインデックス値の平均値、認知症患者のMCIリスクインデックス値の平均値、認知症患者のMCIリスクインデックス値の中央値などであってよい。MCI患者のMCIリスクインデックス値の平均値又は中央値は、MCI患者群をMCIリスクインデックスが高い群と低い群の２群にさらに分けたときのMCIリスクインデックス値が低い群の平均値又は中央値であってもよいし、MCIリスクインデックス値が高い群の平均値又は中央値であってもよいし、MCI患者を２群に分けない場合のMCIリスクインデックス値の平均値又は中央値であってもよい。 In the case of testing the risk of developing dementia, the above standard values are the cutoff value or threshold of the MCI risk index value that separates healthy subjects and dementia patients, and the cut of the MCI risk index value that separates MCI patients and dementia patients. Off-value or threshold, cut-off value that divides the MCI patient group into high and low MCI risk index values, average MCI risk index value for MCI patients, average MCI risk index value for dementia patients, dementia It may be the median MCI risk index value of the patient. The mean or median MCI risk index of MCI patients is the mean or median of the group with the lowest MCI risk index when the MCI patient group is further divided into two groups, a group with a high MCI risk index and a group with a low MCI risk index. It may be the mean or median of the group with the higher MCI risk index value, or it may be the mean or median of the MCI risk index values when the MCI patients are not divided into two groups. May be good.
一つの実施形態において、MCIリスクインデックス値が基準値よりも低い場合に、MCIからアルツハイマー型認知症を含む認知症へ移行する可能性が低いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が低い患者群のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が低い患者群のMCIリスクインデックス値の中央値等が挙げられ、好ましくはMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In one embodiment, when the MCI risk index value is lower than the reference value, it can be determined that the possibility of transition from MCI to dementia including Alzheimer-type dementia is low. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high MCI risk index value and a group of patients with a low MCI risk index value, and a group of patients with a low MCI risk index value among MCI patients. The average value of the MCI risk index value, the median value of the MCI risk index value of the patients with the low MCI risk index value among the MCI patients, etc. can be mentioned, and preferably the patient group with the high MCI risk index value and the MCI among the MCI patients. A cutoff value or threshold that divides the patient group with a low risk index value.
別の実施形態において、MCIリスクインデックス値が基準値以上である場合に、MCIからアルツハイマー型認知症を含む認知症へ移行する可能性が高いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が高い患者群のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が高い患者群のMCIリスクインデックス値の中央値等が挙げられ、好ましくはMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In another embodiment, when the MCI risk index value is equal to or higher than the reference value, it can be determined that there is a high possibility of transition from MCI to dementia including Alzheimer-type dementia. Such reference values include, for example, a cutoff value that separates a group of MCI patients with a high MCI risk index value from a group of patients with a low MCI risk index value, and an MCI risk of a group of patients with a high MCI risk index value among MCI patients. The average value of the index value, the median value of the MCI risk index value of the patient group with the high MCI risk index value among the MCI patients, etc. can be mentioned, and the patient group with the high MCI risk index value and the MCI risk index among the MCI patients are preferable. A cutoff value or threshold that separates low-value patient groups.
驚くべきことに、MCIリスクインデックスを指標として用いると、MCI群の患者を、高MCIリスクインデックス値群と低MCIリスクインデックス値群の２群に、高いAUC、高感度、及び高特異度で有意に区別することができる。この結果、MCIリスクインデックス値の増減が酸化ストレスレベル値の増減に強く相関していることが判明した。 Surprisingly, using the MCI risk index as an indicator, patients in the MCI group were significantly divided into two groups, a high MCI risk index value group and a low MCI risk index value group, with high AUC, high sensitivity, and high specificity. Can be distinguished. As a result, it was found that the increase / decrease in the MCI risk index value strongly correlates with the increase / decrease in the oxidative stress level value.
これは、これまで酸化ストレスの高い状態が続くと、とりわけ脳組織では、活性酸素種(ROS)の産生増加、抗酸化システム機能の低下、及び修復メカニズムの効率低下が、アルツハイマー型認知症の発症と増悪につながるとされてきた説を支持し、酸化ストレスレベルの上昇がMCIリスクの増強に強く影響を与えた証左といえる。 This is because when oxidative stress continues to be high, especially in brain tissue, increased production of reactive oxygen species (ROS), decreased antioxidant system function, and decreased efficiency of repair mechanism lead to the onset of Alzheimer's disease. It can be said that the increase in oxidative stress level has strongly influenced the increase in MCI risk, supporting the theory that it has been said to lead to exacerbation.
さらには、MCIの進行度（ステージ）と各ステージの基準については本願出願前には検討されていなかったが、期せずして、本発明の酸化ストレスレベルと、MCIリスクインデックスとを組み合わせると、MCIの３つのステージ（病期）と、各ステージの基準が提供されることが判明した。 Furthermore, the degree of progression (stage) of MCI and the criteria for each stage were not examined prior to the filing of the present application, but unexpectedly, when the oxidative stress level of the present invention is combined with the MCI risk index, , MCI's three stages (stages) and criteria for each stage were found to be provided.
まず、MCIをMCIリスクインデックス値の閾値と酸化ストレスレベル値の閾値によって３グループに分けることができ、この３グループはMCIの進行度（３ステージ）を反映している。具体的には、ステージ１は、被検者の酸化ストレスレベル値が健常者の値から有意に上昇する段階である。ステージ１では、被検者のMCIリスクインデックス値は閾値よりも低く、酸化ストレスレベル値も閾値よりも低い。次にステージ２は、被検者の酸化ストレスレベル値はほぼ変動せずに、MCIリスクインデックス値が上昇する段階である。ステージ２では、被検者のMCIリスクインデックス値は閾値以上であり、酸化ストレスレベル値は閾値よりも低い。次にステージ３は、被検者の酸化ストレスレベル値がさらに有意に上昇する段階である。ステージ３では、MCIリスクインデックス値は閾値以上であり、酸化ストレスレベル値も閾値以上である。ステージ３に達した後にアルツハイマー型認知症の発症に至る。MCIのステージ３の患者とアルツハイマー型認知症の患者では、酸化ストレスレベル値に有意差は認められなかったが、MCIリスクインデックス値では認知症で有意に低かった。酸化ストレスレベルとMCIリスクインデックスの両方をMCI又は認知症の検査又は評価に用いれば、認知障害の進行度をより正確に捉えることができ、検査精度が向上する。
First, MCI can be divided into 3 groups according to the threshold of MCI risk index value and the threshold of oxidative stress level value, and these 3 groups reflect the progress of MCI (3 stages). Specifically,
このため、一つの実施形態において、酸化ストレスレベルが基準値以上であり、かつMCIリスクインデックス値が基準値以上である場合に、認知症へ移行する可能性が高いと判定することができる。酸化ストレスレベルの基準値及びMCIリスクインデックス値の基準値は上述の通りである。 Therefore, in one embodiment, when the oxidative stress level is equal to or higher than the reference value and the MCI risk index value is equal to or higher than the reference value, it can be determined that there is a high possibility of transition to dementia. The reference values for the oxidative stress level and the MCI risk index values are as described above.
別の実施形態において、酸化ストレスレベル及びMCIリスクインデックス値の一方又は両方が基準値未満である場合に、認知症へ移行する可能性が低いと判定することができる。 In another embodiment, if one or both of the oxidative stress level and the MCI risk index value are below the reference value, it can be determined that the possibility of developing dementia is low.
また本発明は、認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置のスクリーニング方法であって、措置を施したMCIに罹患している被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチン総量に対する比（CysTTR／TTR比）又は酸化ストレスレベルを測定することを含む方法を提供する。認知症はアルツハイマー型認知症であり得るが、これに限定されない。 Further, the present invention is a screening method for effective measures for preventing or delaying the onset of dementia, in which cysteine is added to cysteine at position 10 in the body fluid of a subject suffering from MCI to which the measures have been taken. Provided are methods comprising measuring the ratio of cysteinylated transthyretin to the total amount of transthyretin (CysTTR / TTR ratio) or oxidative stress level. Dementia can be, but is not limited to, Alzheimer's disease.
一実施形態において、措置後の酸化ストレスレベル値が、基準値又は措置前の酸化ストレスレベル値と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が低い患者群の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が低い患者群の酸化ストレスレベル値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In one embodiment, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of dementia if the post-treatment oxidative stress level value is lower than the reference value or the pre-treatment oxidative stress level value. Can be determined to be high. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value, and a group of MCI patients with a low oxidative stress level value. The average value of the oxidative stress level value and the median value of the oxidative stress level value of the patient group having the low oxidative stress level value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group having the high oxidative stress level value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates the group of patients with low oxidative stress level values.
上記措置としては、物質の投与又は摂取、酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目等が挙げられる。投与又は摂取される物質としては、医薬、サプリメントを初めとする食品等が挙げられる。酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目としては、脳機能活性化トレーニング、食事療法、運動療法、音楽療法、睡眠療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被検者に施すことができる。 Examples of the above measures include administration or ingestion of substances, reduction of oxidative stress and / or various items aimed at improving dementia. Examples of the substance to be administered or ingested include foods such as pharmaceuticals and supplements. Various items aimed at reducing oxidative stress and / or improving dementia include brain function activation training, diet therapy, exercise therapy, music therapy, sleep therapy, lifestyle improvement guidance, and the like. The subject may be given one or more of the measures listed above.
別の実施形態において、措置後の酸化ストレスレベル値が、基準値又は措置前の酸化ストレスレベル値と比べて同じか又は上昇している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が低いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が高い患者群の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が高い患者群の酸化ストレスレベル値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In another embodiment, the measure is effective in preventing or delaying the onset of dementia when the post-treatment oxidative stress level value is the same as or higher than the reference value or the pre-treatment oxidative stress level value. It can be determined that the possibility is low. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for dividing a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value, and a group of MCI patients with a high oxidative stress level value. The average value of the oxidative stress level value and the median value of the oxidative stress level value of the patient group having the high oxidative stress level value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group having the high oxidative stress level value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates the group of patients with low oxidative stress level values.
上記措置としては、医薬、サプリメントを初めとする食品等が挙げられる。酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目としては、脳機能活性化トレーニング、食事療法、運動療法、音楽療法、睡眠療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。 Examples of the above measures include foods such as pharmaceuticals and supplements. Various items aimed at reducing oxidative stress and / or improving dementia include brain function activation training, diet therapy, exercise therapy, music therapy, sleep therapy, lifestyle improvement guidance, and the like.
本発明の認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置のスクリーニング方法においても、MCIリスクインデックス値による検査に、MCIリスクインデックス値による検査をさらに組み合わせることができる。 In the screening method for measures effective for preventing or delaying the onset of dementia of the present invention, the test based on the MCI risk index value can be further combined with the test based on the MCI risk index value.
一実施形態において、措置後のMCIリスクインデックス値が、基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が低い患者群のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が低い患者群のMCIリスクインデックス値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In one embodiment, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of dementia if the post-measure MCI risk index value is lower than the reference value or pre-measure MCI risk index value. Can be determined to be high. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high MCI risk index value and a group of patients with a low MCI risk index value, and a group of patients with a low MCI risk index value among MCI patients. The average value of the MCI risk index value and the median value of the MCI risk index value of the patients with the low MCI risk index value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group with the high MCI risk index value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates patients with low MCI risk index values.
別の実施形態において、措置後のMCIリスクインデックス値が、基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて同じか又は上昇している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が低いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が高い患者群のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が高い患者群のMCIリスクインデックス値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In another embodiment, the measure is effective in preventing or delaying the onset of dementia when the MCI risk index value after the measure is the same as or higher than the reference value or the MCI risk index value before the measure. It can be determined that the possibility is low. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high MCI risk index value and a group of patients with a low MCI risk index value, and a group of patients with a high MCI risk index value among MCI patients. The average value of the MCI risk index value and the median value of the MCI risk index value of the patients with the high MCI risk index value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group with the high MCI risk index value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates patients with low MCI risk index values.
このため、一つの実施形態において、措置後の酸化ストレスレベルが基準値又は措置前の酸化ストレスレベルと比べて低下しており、かつ措置後のMCIリスクインデックス値が基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。 Therefore, in one embodiment, the oxidative stress level after the measure is lower than the reference value or the oxidative stress level before the measure, and the MCI risk index value after the measure is the reference value or the MCI risk before the measure. If it is lower than the index value, it can be determined that the measure is likely to be effective in preventing or delaying the onset of dementia.
別の実施形態において、措置後の酸化ストレスレベル及びMCIリスクインデックス値のうちの少なくとも一方が基準値又は措置前の酸化ストレスレベル及びMCIリスクインデックス値のうちの少なくとも一方と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。 In another embodiment, when at least one of the post-treatment oxidative stress level and the MCI risk index value is lower than the reference value or at least one of the pre-treatment oxidative stress level and the MCI risk index value. In addition, it can be determined that the measures are likely to be effective in preventing or delaying the onset of dementia.
別の実施形態において、措置後の酸化ストレスレベルが基準値又は措置前の酸化ストレスレベルと比べて同じか上昇しており、かつ措置後のMCIリスクインデックス値が基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて同じか上昇している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が低いと判定することができる。 In another embodiment, the post-measure oxidative stress level is the same as or higher than the reference value or pre-treatment oxidative stress level, and the post-measure MCI risk index value is the reference value or pre-measure MCI risk index. If it is the same as or higher than the value, it can be determined that the measure is unlikely to be effective in preventing or delaying the onset of dementia.
また本発明は、認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置の評価方法であって、措置を施したMCIに罹患している被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチン総量に対する比（CysTTR／TTR比）又は酸化ストレスレベルを測定することを含む方法を提供する。 Further, the present invention is a method for evaluating measures effective for preventing or delaying the onset of dementia, in which cysteine is added to cysteine at position 10 in the body fluid of a subject suffering from MCI to which the measures have been taken. Provided are methods comprising measuring the ratio of cysteinylated transthyretin to the total amount of transthyretin (CysTTR / TTR ratio) or oxidative stress level.
一実施形態において、措置を施した後の酸化ストレスレベル値が、基準値又は措置を施す前の酸化ストレスレベル値と比べて低下している場合に、前記措置はMCIの進行の抑制又は認知症の発症予防若しくは発症遅延に有効である可能性が高いと判定又は評価することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が低い患者群の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が低い患者群の酸化ストレスレベル値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In one embodiment, if the oxidative stress level value after the treatment is lower than the reference value or the oxidative stress level value before the treatment, the measure suppresses the progression of MCI or dementia. It can be determined or evaluated that there is a high possibility that it is effective in preventing or delaying the onset of dementia. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value, and a group of MCI patients with a low oxidative stress level value. The average value of the oxidative stress level value and the median value of the oxidative stress level value of the patient group having the low oxidative stress level value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group having the high oxidative stress level value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates the group of patients with low oxidative stress level values.
上記措置としては、物質の投与又は摂取、酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目又はメニュー等が挙げられる。投与又は摂取される物質としては、医薬、サプリメントを初めとする食品等が挙げられる。酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目又はメニューとしては、脳機能活性化トレーニング、食事療法、運動療法、音楽療法、睡眠療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被検者に施すことができる。 Examples of the above measures include administration or ingestion of substances, reduction of oxidative stress and / or various items or menus aimed at improving dementia. Examples of the substance to be administered or ingested include foods such as pharmaceuticals and supplements. Various items or menus aimed at reducing oxidative stress and / or improving dementia include brain function activation training, diet therapy, exercise therapy, music therapy, sleep therapy, lifestyle improvement guidance, and the like. The subject may be given one or more of the measures listed above.
別の実施形態において、措置を施した後の酸化ストレスレベル値比が、基準値又は措置を施す前の酸化ストレスレベル値と比べて同じか又は増大している場合に、前記措置はMCIの進行の抑制又は認知症の発症予防若しくは発症遅延に有効である可能性が低いと判定又は評価することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が高い患者群の酸化ストレスレベル値の平均値、MCI患者のうちの酸化ストレスレベル値が高い患者群の酸化ストレスレベル値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうち酸化ストレスレベル値が高い患者群と酸化ストレスレベル値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In another embodiment, the measure is MCI progression if the oxidative stress level ratio after the measure is the same as or higher than the reference value or the oxidative stress level value before the measure. It can be determined or evaluated that it is unlikely to be effective in suppressing the onset of dementia or preventing or delaying the onset of dementia. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for dividing a group of MCI patients with a high oxidative stress level value and a group of patients with a low oxidative stress level value, and a group of MCI patients with a high oxidative stress level value. The average value of the oxidative stress level value and the median value of the oxidative stress level value of the patient group having the high oxidative stress level value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group having the high oxidative stress level value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates the group of patients with low oxidative stress level values.
上記措置としては、物質の投与又は摂取、酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目又はメニュー等が挙げられる。投与又は摂取される物質としては、医薬、サプリメントを初めとする食品等が挙げられる。酸化ストレス低減及び／又は認知症の改善を目指した各種項目又はメニューとしては、脳機能活性化トレーニング、食事療法、運動療法、音楽療法、睡眠療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被検者に施すことができる。 Examples of the above measures include administration or ingestion of substances, reduction of oxidative stress and / or various items or menus aimed at improving dementia. Examples of the substance to be administered or ingested include foods such as pharmaceuticals and supplements. Various items or menus aimed at reducing oxidative stress and / or improving dementia include brain function activation training, diet therapy, exercise therapy, music therapy, sleep therapy, lifestyle improvement guidance, and the like. The subject may be given one or more of the measures listed above.
本発明の認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置の評価方法においても、MCIリスクインデックス値による検査に、MCIリスクインデックス値による検査をさらに組み合わせることができる。 In the evaluation method of measures effective for preventing or delaying the onset of dementia of the present invention, the test based on the MCI risk index value can be further combined with the test based on the MCI risk index value.
一実施形態において、措置後のMCIリスクインデックス値が、基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が低い患者群のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が低い患者群のMCIリスクインデックス値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In one embodiment, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of dementia if the post-measure MCI risk index value is lower than the reference value or pre-measure MCI risk index value. Can be determined to be high. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high MCI risk index value and a group of patients with a low MCI risk index value, and a group of patients with a low MCI risk index value among MCI patients. The average value of the MCI risk index value and the median value of the MCI risk index value of the patients with the low MCI risk index value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group with the high MCI risk index value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates patients with low MCI risk index values.
別の実施形態において、措置後のMCIリスクインデックス値が、基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて同じか又は上昇している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が低いと判定することができる。かかる基準値としては、例えばMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が高い患者群のMCIリスクインデックス値の平均値、MCI患者のうちのMCIリスクインデックス値が高い患者群のMCIリスクインデックス値の中央値が挙げられ、好ましくは基準値はMCI患者のうちMCIリスクインデックス値が高い患者群とMCIリスクインデックス値が低い患者群を分けるカットオフ値又は閾値である。 In another embodiment, the measure is effective in preventing or delaying the onset of dementia when the MCI risk index value after the measure is the same as or higher than the reference value or the MCI risk index value before the measure. It can be determined that the possibility is low. Such reference values include, for example, a cutoff value or threshold for separating a group of MCI patients with a high MCI risk index value and a group of patients with a low MCI risk index value, and a group of patients with a high MCI risk index value among MCI patients. The average value of the MCI risk index value and the median value of the MCI risk index value of the patients with the high MCI risk index value among the MCI patients can be mentioned, and the reference value is preferably the patient group with the high MCI risk index value among the MCI patients. And a cutoff value or threshold that separates patients with low MCI risk index values.
このため、一つの実施形態において、措置後の酸化ストレスレベルが基準値又は措置前の酸化ストレスレベルと比べて低下しており、かつ措置後のMCIリスクインデックス値が基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。 Therefore, in one embodiment, the oxidative stress level after the measure is lower than the reference value or the oxidative stress level before the measure, and the MCI risk index value after the measure is the reference value or the MCI risk before the measure. If it is lower than the index value, it can be determined that the measure is likely to be effective in preventing or delaying the onset of dementia.
別の実施形態において、措置後の酸化ストレスレベル及びMCIリスクインデックス値のうちの少なくとも一方が基準値又は措置前の酸化ストレスレベル及びMCIリスクインデックス値のうちの少なくとも一方と比べて低下している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いと判定することができる。 In another embodiment, when at least one of the post-treatment oxidative stress level and the MCI risk index value is lower than the reference value or at least one of the pre-treatment oxidative stress level and the MCI risk index value. In addition, it can be determined that the measures are likely to be effective in preventing or delaying the onset of dementia.
別の実施形態において、措置後の酸化ストレスレベルが基準値又は措置前の酸化ストレスレベルと比べて同じか上昇しており、かつ措置後のMCIリスクインデックス値が基準値又は措置前のMCIリスクインデックス値と比べて同じか上昇している場合に、措置は認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が低いと判定することができる。 In another embodiment, the post-measure oxidative stress level is the same as or higher than the reference value or pre-treatment oxidative stress level, and the post-measure MCI risk index value is the reference value or pre-measure MCI risk index. If it is the same as or higher than the value, it can be determined that the measure is unlikely to be effective in preventing or delaying the onset of dementia.
本発明の評価又は検査方法は、患者から時系列で体液を複数回採取（サンプリング）し、各試料におけるCysTTR／TTR比の経時変化を調べることによっても行うことができる。体液の採取間隔は特に限定されないが、例えば、約1日～約3月間の間隔や、1年ごと又は数年ごとの間隔で体液を採取（例えば採血）を行うことができる。 The evaluation or examination method of the present invention can also be performed by collecting (sampling) body fluids from a patient multiple times in time series and examining the change over time in the CysTTR / TTR ratio in each sample. The interval for collecting body fluid is not particularly limited, but for example, body fluid can be collected at intervals of about 1 day to about 3 months, or at intervals of 1 year or several years (for example, blood collection).
以上説明してきたように、現在知られる認知障害の発症を予防したり認知障害の進行を遅延する様々な方法には、酸化ストレスの減少を目標にしているものがあるが、本発明によれば、CysTTR／TTR比を指標として用いることにより、認知症の将来のリスクを発見し、又は認知障害の発症予防若しくは認知障害の進行遅延の効果を測定することができるため、今後認知症の予防医療の発達に資するものである。 As described above, various currently known methods for preventing the onset of cognitive impairment and delaying the progression of cognitive impairment are aimed at reducing oxidative stress, but according to the present invention. , CysTTR / TTR ratio can be used as an index to discover future risks of dementia, or to measure the effect of preventing the onset of cognitive impairment or delaying the progression of cognitive impairment. It contributes to the development of.
このように、酸化ストレスレベルに基づく検査と、MCIリスクインデックスに基づく検査により、少量の体液から、MCI又は認知症のリスクを早期に高い確率で判定することができる。 Thus, a test based on the oxidative stress level and a test based on the MCI risk index can determine the risk of MCI or dementia at an early stage with a high probability from a small amount of body fluid.
本明細書中に引用されているすべての特許出願及び文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。 The disclosures of all patent applications and documents cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
以下、本発明を実施例を挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１ 検体サンプルの調製と修飾型トランスサイレチンの測定
（Ａ）検体サンプルからのTTRの免疫沈降
岡山大学脳神経内科学教室で診断された健常者(NC)（120名）、軽度認知障害(MCI)患者（50名）、及びアルツハイマー型認知症(AD)患者（60名）から血清を5μL採取し、Kishikawaら（J. Mass Spectrom. 1996 31: 112-114）に記載の方法により、ウサギ抗TTR抗体（RayBiotech, 119-13077）と混合し、TTRを含む沈殿を回収した。
Example 1 Preparation of sample sample and measurement of modified transthyretin (A) Immunoprecipitation of TTR from sample sample Healthy subjects (NC) (120 persons) diagnosed in the Department of Neurology, Okayama University, mild cognitive impairment ( 5 μL of serum was collected from MCI) patients (50 patients) and Alzheimer-type dementia (AD) patients (60 patients), and rabbits were collected by the method described in Kishikawa et al. (J. Mass Spectrom. 1996 31: 112-114). It was mixed with an anti-TTR antibody (RayBiotech, 119-13077) and the precipitate containing TTR was recovered.
（Ｂ）免疫沈降により得られたTTRのトリプシン消化手順
得られた沈殿を10μLの6M塩酸グアニジンにて溶解後、In-Solution Tryptic Digestion and Guanidination Kitを用いて、マニュアルに従いトリプシンによる酵素消化を37℃、18時間行った。システイン化修飾を保護するため、還元アルキル化は行わなかった。
(B) Procedure for trypsin digestion of TTR obtained by immunoprecipitation Dissolve the obtained precipitate in 10 μL of 6M guanidine hydrochloride, and then use the In-Solution Tryptic Digestion and Guanidination Kit to perform enzymatic digestion with trypsin at 37 ° C according to the manual. , Went for 18 hours. No reduction alkylation was performed to protect the cysteineization modification.
（Ｃ）消化ペプチドのSID-SRM-MS/MSによる測定方法
得られたトリプシン消化ペプチドに対し、安定同位体標識したシステイン化部位ペプチドTTR10-15(配列：C(-Cys)P{Leu(13C6,15N)}MVK、配列番号２)及びTTR総量を定量するための全TTRペプチドTTR81-103（配列：ALGISPFHEHAEVVFTANDSGP{Arg(13C6,15N4)、配列番号３}、各1pmolを混合した。0.1% v/vとなるようトリフルオロ酢酸を添加した。得られた溶液5uLを三連四重極型質量分析計 Waters Xevo TQ-S micro を接続したマイクロ高速液体クロマトグラフィーACQUITY UPLC I-Classにて分析した。溶離液Aを0.1% ギ酸溶液、溶離液Bを0.1%ギ酸を含むアセトニトリルとした。溶離液Bが1%から60%までのリニアグラジエントによりサンプル3μLを分離し、選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring: SRM）により血中のTTR由来のペプチドの測定を行った。
(C) Measurement method of digested peptide by SID-SRM-MS / MS Stable isotope-labeled cysteinylated site peptide TTR 10-15 (sequence: C (-Cys) P {Leu (Sequence: C (-Cys) P {Leu (sequence)) 13 C 6 , 15 N)} MVK, SEQ ID NO: 2) and total TTR peptide TTR 81-103 for quantifying total TTR (sequence: ALGISPFHEHAEVVFTANDSGP {Arg ( 13 C6, 15 N 4 ), SEQ ID NO: 3}, each 1 pmol was mixed. Trifluoroacetic acid was added to a concentration of 0.1% v / v. 5 uL of the obtained solution was connected to a triple quadrupole mass spectrometer Waters Xevo TQ-S micro to micro high-speed liquid chromatography ACQUITY. Analyzed by UPLC I-Class. Eluent A was 0.1% formic acid solution and eluent B was acetonitrile containing 0.1% formic acid. 3 μL of sample was separated by linear polypeptide with eluent B from 1% to 60%. , TTR-derived peptides in blood were measured by Selected Reaction Monitoring (SRM).
（Ｄ）統計解析、検出性能の評価
得られた各ペプチドのピーク強度から、酸化ストレスレベル値として、10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化TTR（図１参照）のTTR総量に対する比（CysTTR／TTR比）を算出した。各群の比較はMann-Whitney U test検定を用い、p<0.05を統計学的に有意とした。
(D) Statistical analysis and evaluation of detection performance From the peak intensity of each peptide obtained, the ratio of the cysteineized TTR (see FIG. 1) to which cysteine was added to the cysteine at the 10th position as the oxidative stress level value (see FIG. 1) ( CysTTR / TTR ratio) was calculated. The Mann-Whitney U test test was used for comparison of each group, and p <0.05 was considered statistically significant.
（Ｅ）健常者、MCI患者、及びAD患者のそれぞれの群のMCIリスクインデックスは、配列番号４，５，１５の３つのペプチドを用いて、Journal of Alzheimer's Disease 73, 217-227 (2019)に従って回帰式を構築し、診断性能が最良となる最適式から計算した。 (E) The MCI risk index for each group of healthy, MCI, and AD patients was according to the Journal of Alzheimer's Disease 73, 217-227 (2019) using the three peptides of SEQ ID NOs: 4, 5, and 15. A regression equation was constructed and calculated from the optimal equation with the best diagnostic performance.
（Ｆ）結果
図２に示されるように、健常者、MCI患者、及びAD患者のそれぞれの群のMCIリスクインデックスは症状が進行するにつれて増大することが確認された。健常者とMCI患者のカットオフ値は0.465（MCI/健常者のペプチド強度比, 3.86、p<0.001,Mann-Whitney's U-test)であり、健常者とAD患者のカットオフ値は0.489であった(AD/健常者のペプチド強度比4.63、p<0.001、Mann-Whitney's U-test)
図３に示されるように、修飾トランスサイレチンのTTR総量に対する比（CysTTR／TTR比）×100（％）で表される酸化ストレスレベル値は、それぞれ健常群（45.6±3.7％）、MCI群（49.8±4.5％）及びAD群（49.5±5.9％）であり、MCI群とAD群はともに、健常群と比較して酸化ストレスレベル値が有意に上昇した（それぞれp=2.232E-07, 1.161E-06）。
(F) Results As shown in FIG. 2, it was confirmed that the MCI risk index of each group of healthy subjects, MCI patients, and AD patients increased as the symptoms progressed. The cut-off value for healthy subjects and MCI patients was 0.465 (MCI / healthy peptide intensity ratio, 3.86, p <0.001, Mann-Whitney's U-test), and the cut-off value for healthy subjects and AD patients was 0.489. (AD / Healthy person peptide intensity ratio 4.63, p <0.001, Mann-Whitney's U-test)
As shown in FIG. 3, the oxidative stress level values expressed by the ratio of modified transsiletin to the total amount of TTR (CysTTR / TTR ratio) × 100 (%) are the healthy group (45.6 ± 3.7%) and the MCI group, respectively. (49.8 ± 4.5%) and AD group (49.5 ± 5.9%), both the MCI group and the AD group had significantly higher oxidative stress levels compared to the healthy group (p = 2.232E-07, respectively). 1.161E-06).
さらに、MCI群の患者をMCIリスクインデックス値に基づいて分類すると、高MCIリスクインデックス値群（インデックス値>=0.5、N=27）の酸化ストレスレベル値は52.1±4.3％であり、低MCIリスクインデックス値群（インデックス値<0.5、N=23）の酸化ストレスレベル値は48.2±1.7％であり、高MCIリスクインデックス値群は低MCIリスクインデックス値群に比べると酸化ストレスレベル値が有意に高く（p=0.0013）、また両群とも健常群に比べると酸化ストレスレベル値が有意に高かった（それぞれp=2.259E-06, 4.445E-06）。 Furthermore, when patients in the MCI group were classified based on the MCI risk index value, the oxidative stress level value in the high MCI risk index value group (index value> = 0.5, N = 27) was 52.1 ± 4.3%, and the low MCI risk. The oxidative stress level value of the index value group (index value <0.5, N = 23) was 48.2 ± 1.7%, and the high MCI risk index value group had a significantly higher oxidative stress level value than the low MCI risk index value group. (P = 0.0013), and the oxidative stress level values were significantly higher in both groups than in the healthy group (p = 2.259E-06, 4.445E-06, respectively).
この結果から、MCI患者の中でも、CysTTR／TTR比が高い被検者は、CysTTR／TTR比が低い被検者よりもMCIリスクインデックス値が有意に高く、認知症へ移行するリスクが高いと言える。 From this result, it can be said that among MCI patients, subjects with a high CysTTR / TTR ratio have a significantly higher MCI risk index value than subjects with a low CysTTR / TTR ratio, and are at higher risk of developing dementia. ..
次に、MCIリスクインデックス値に基づいて、図３のMCI群（N＝50）を高MCIリスクインデックス値群（インデックス値>=0.5、N=27）と低MCIリスクインデックス値群（インデックス値<0.5、N=23）に分類したのち、両群を酸化ストレスレベルの値でROC解析を行った結果、図４に示されるように、カットオフ値51.2%、AUC（0.744）、感度（54.2%）、特異度（100%）、有意差（p=0.0008）でMCI群を有意に区別することができるという驚くべき結果が得られた。 Next, based on the MCI risk index value, the MCI group (N = 50) in FIG. 3 is divided into the high MCI risk index value group (index value> = 0.5, N = 27) and the low MCI risk index value group (index value < After classifying into 0.5, N = 23), ROC analysis was performed on both groups based on the oxidative stress level. As shown in Fig. 4, the cutoff value was 51.2%, AUC (0.744), and sensitivity (54.2%). ), Specificity (100%), and significant difference (p = 0.0008) gave surprising results that the MCI group could be significantly distinguished.
以上の成績から図５に示したように、MCIをMCIリスクインデックス値の閾値(0.5)と酸化ストレスレベル値の閾値(51.2%)によって３グループに分けることができる。この３グループはMCIの進行度（３ステージ）を反映している。まず健常者が、酸化ストレスレベル値が有意に上昇してMCIステージ１（MCI Stg 1：MCIリスクインデックス値 < 0.5かつ酸化ストレスレベル値 < 51.2%を満たす状態）に至り、次に酸化ストレスレベル値は変動せずにMCIリスクインデックス値が上昇するステージであるMCIステージ２（MCI Stg 2：MCIリスクインデックス値 >= 0.5 かつ酸化ストレスレベル値 < 51.2%)を満たす状態）を経た後、酸化ストレスレベル値がさらに有意に上昇することでMCIステージ３（MCI Stg 3：MCIリスクインデックス値 >=0.5かつ酸化ストレスレベル値 >=51.2%)を満たす状態）に達した後に、アルツハイマー型認知症の発症に至るステージを示している。MCIステージ３(N=27)とアルツハイマー型認知症(N=60)を比較すると、酸化ストレスレベル値に有意差は認められなかったが、MCIリスクインデックス値は認知症で有意に低かった。 From the above results, as shown in FIG. 5, MCI can be divided into three groups according to the threshold value of the MCI risk index value (0.5) and the threshold value of the oxidative stress level value (51.2%). These three groups reflect the progress of MCI (three stages). First, healthy subjects have a significantly increased oxidative stress level value and reach MCI stage 1 (MCI Stg 1: MCI risk index value <0.5 and oxidative stress level value <51.2%), and then oxidative stress level value. Is the stage where the MCI risk index value rises without fluctuation, and after passing through MCI stage 2 (MCI Stg 2: MCI risk index value> = 0.5 and oxidative stress level value <51.2%)), the oxidative stress level Onset of Alzheimer-type dementia after reaching MCI stage 3 (MCI Stg 3: MCI risk index value> = 0.5 and oxidative stress level value> = 51.2%) by further significant increase in the value. It shows the stages leading up. Comparing MCI stage 3 (N = 27) and Alzheimer's disease (N = 60), there was no significant difference in oxidative stress level values, but the MCI risk index value was significantly lower in dementia.
従って、本発明により世界で初めてMCIの３つのステージ（病期）と、各ステージの基準が提供された。それによりステージの特性に対応した最適な認知症の発症予防又は発症遅延に有効な措置の開発が可能になる。
本実施例は、CysTTR／TTR比が、患者の血中酸化ストレスの指標として、MCIに対する酸化ストレスの影響の検証に使用できることを示唆している。
このCysTTR／TTR比の測定により、抗酸化物質を含むサプリメント等の物質の服用による血中酸化ストレス低減効果を判定したり、さらにProtoKey（登録商標）認知症リスク検査との併用により、酸化ストレスレベル値の低減がMCIに与える影響を検証できる可能性が示唆され、今後の認知症予防法における予防効果の確認への利用が期待される。
Therefore, the present invention provides the world's first three stages (stages) of MCI and criteria for each stage. This makes it possible to develop effective measures for preventing or delaying the onset of dementia that are optimal for the characteristics of the stage.
This example suggests that the CysTTR / TTR ratio can be used to examine the effect of oxidative stress on MCI as an indicator of blood oxidative stress in patients.
By measuring this CysTTR / TTR ratio, it is possible to determine the effect of reducing blood oxidative stress by taking supplements containing antioxidants, and by using it in combination with the ProtoKey® dementia risk test, the oxidative stress level. It is suggested that the effect of the decrease in the value on MCI can be verified, and it is expected to be used for confirming the preventive effect in the future dementia prevention method.
Claims (11)
措置を施した被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチンに対する比（CysTTR／TTR比）を測定することを含み、
前記措置後のCysTTR／TTR比が、基準値又は前記措置前のCysTTR／TTR比と比べて低下している場合に、前記措置はアルツハイマー型認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いことを示す、方法。 It is a screening method for effective measures to prevent or delay the onset of dementia.
Including measuring the ratio (CysTTR / TTR ratio) of cysteine-added cysteine-added cysteine to transthyretin at position 10 in the body fluid of the treated subject to transthyretin.
If the CysTTR / TTR ratio after the measure is lower than the reference value or the CysTTR / TTR ratio before the measure, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of Alzheimer's disease. How to show that is high.
措置を施した被検者の体液中の10位のシステインにシステインが付加されたシステイン化トランスサイレチンのトランスサイレチンに対する比（CysTTR／TTR比）を測定することを含み、
前記措置後のCysTTR／TTR比が、基準値又は前記措置前のCysTTR／TTR比と比べて低下している場合に、前記措置はアルツハイマー型認知症の発症予防又は発症遅延に有効である可能性が高いことを示す、方法。 It is an evaluation method of effective measures for preventing or delaying the onset of dementia.
Including measuring the ratio (CysTTR / TTR ratio) of cysteine-added cysteine-added cysteine to transthyretin at position 10 in the body fluid of the treated subject to transthyretin.
If the CysTTR / TTR ratio after the measure is lower than the reference value or the CysTTR / TTR ratio before the measure, the measure may be effective in preventing or delaying the onset of Alzheimer's disease. How to show that is high.
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| "Distinct Transthyretin Oxidation Isoform Profile in Spinal Fluid from Patients with Alzheimer's Dise", CLINICAL PROTEOMICS, vol. Vol.11, AN12, JPN7024002260, 2014, pages 1 - 9, ISSN: 0005338067 * |
| "血液検査で酸化ストレスを測定！ プロトキー 酸化ストレス検査", 株式会社プロトセラ社資料, JPN6024021386, 15 September 2020 (2020-09-15), JP, ISSN: 0005446840 * |
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