JP2022061114A - Material for regenerating tissue, and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a material for tissue regeneration containing bone marrow-derived mesenchymal stem cells and a method for producing the same.
間葉系幹細胞は、骨髄組織、脂肪組織等に存在し、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有しているため、再生医療等の分野での利用が期待されている。しかしながら、骨髄液に含まれる間葉系幹細胞は、その量が十分ではないため、臨床治療に用いる際には、間葉系幹細胞を培養して増殖する場合があった。 Mesenchymal stem cells are present in bone marrow tissue, adipose tissue, etc., and have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system such as osteoblasts, chondrocytes, and muscle cells. Is expected to be used. However, since the amount of mesenchymal stem cells contained in the bone marrow fluid is not sufficient, the mesenchymal stem cells may be cultured and proliferated when used for clinical treatment.
例えば、特許文献１には、骨髄液に含まれる細胞を、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で培養する、骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法が記載されている。これによれば、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することができるとされている。しかしながら、不織布上で少なくとも数日から１週間程度は培養する必要があるため、その間の感染リスクがあることや培養の維持に費用を要し、更なる改善が望まれていた。
For example,
一方、特許文献２には、骨基質を主成分とする骨組織部分であって骨髄とは区別される組織である骨質を材料とし、間葉系幹細胞を分離する方法が記載されている。これによれば、間葉系幹細胞を効率的に分離することができるため、容易に大量の間葉系幹細胞を調製することができるとされている。しかしながら、特許文献２で得られる骨質由来の間葉系幹細胞と、骨髄由来の間葉系幹細胞の細胞群は異なるため、骨質からレプチン受容体陽性細胞を必ずしも効率的に得られる訳ではなかった。また、骨質を材料とする場合、骨組織部分を乳鉢等で粉砕する手間がかかるため、簡便かつ効率的な間葉系幹細胞の分離方法が望まれていた。 On the other hand, Patent Document 2 describes a method for separating mesenchymal stem cells using bone quality, which is a bone tissue portion containing bone matrix as a main component and is a tissue distinct from bone marrow, as a material. According to this, since mesenchymal stem cells can be efficiently separated, it is said that a large amount of mesenchymal stem cells can be easily prepared. However, since the mesenchymal stem cells derived from bone marrow and the mesenchymal stem cells derived from bone marrow are different from each other in Patent Document 2, it is not always possible to efficiently obtain leptin receptor-positive cells from bone marrow. Further, when bone quality is used as a material, it takes time and effort to crush the bone tissue portion with a mortar or pestle, so a simple and efficient method for separating mesenchymal stem cells has been desired.
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、骨髄組織から短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができる組織再生用材料を提供することを目的とするものである。 The present invention has been made to solve the above problems, and is for tissue regeneration capable of obtaining bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a certain number of leptin receptor-positive cells or more by a simple treatment in a short time from bone marrow tissue. It is intended to provide materials.
上記課題は、骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とする組織再生用材料を提供することによって解決される。 The above object is a tissue regeneration material obtained by separating bone marrow-derived mesenchymal stem cells from bone marrow tissue, and includes bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a leptin receptor-positive number of 5.0 × 104 or more. It is solved by providing a material for tissue regeneration characterized by the above.
このとき、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことが好適な実施態様であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞が、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液で骨髄組織を酵素処理して得られたものであることが好適な実施態様である。 At this time, it is a preferable embodiment to include bone marrow-derived mesenchymal stem cells showing a leptin receptor-positive number of 96 × 10 4 / g or more per 1 g of bone, and the bone marrow-derived mesenchymal stem cells are 0. A preferred embodiment is obtained by enzymatically treating bone marrow tissue with a buffer solution containing 5.5 to 1.5 mg / mL collagenase and 0.5 to 1.5 mg / mL dispase.
また、上記課題は、骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料の製造方法であって、骨髄組織に対し、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理する組織再生用材料の製造方法を提供することによって解決される。 Further, the above-mentioned problem is a method for producing a material for tissue regeneration obtained by separating bone marrow-derived mesenchymal stem cells from bone marrow tissue, and 0.5 to 1.5 mg / mL of collagenase and 0. It is solved by providing a method for producing a tissue regeneration material which is enzymatically treated at 36 ° C. or higher and 38 ° C. or lower for 5 minutes or more and less than 30 minutes using a buffer solution containing 5 to 1.5 mg / mL dispase.
さらに、上記課題は、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットを提供することによっても解決される。 Further, the above-mentioned problem is a tissue regeneration material kit composed of a powder material (X) and a liquid agent (Y), in which a powder material (X) containing collagenase and dispase and a liquid agent (Y) containing a buffer solution are used. , Collagenase and dispase are mixed so that the concentrations of each are 0.5 to 1.5 mg / mL, and the bone marrow tissue is enzymatically treated to increase the number of leptin receptor-positive cells to 5.0 × 104 or more. It is also solved by providing a tissue regeneration material kit comprising a powder material (X) and a liquid agent (Y), which comprises obtaining a tissue regeneration material containing the bone marrow-derived mesenchymal stem cells shown.
本発明により、骨髄組織から短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができる。こうして得られた骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料は、移植後の細胞の生着が良好であり、骨髄由来の骨・軟骨形成を誘導させることが可能となるため、再生医療の分野に特に適している。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a certain number of leptin receptor-positive cells or more can be obtained from bone marrow tissue by a simple treatment in a short time. The tissue regeneration material containing bone marrow-derived mesenchymal stem cells thus obtained has good cell engraftment after transplantation and can induce bone marrow-derived bone / cartilage formation, and thus is used in regenerative medicine. Especially suitable for the field.
本発明の組織再生用材料は、骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とするものである。 The tissue regeneration material of the present invention is a tissue regeneration material obtained by separating bone marrow-derived mesenchymal stem cells from bone marrow tissue, and is a bone marrow-derived material having a leptin receptor-positive cell count of 5.0 × 104 or more. It is characterized by containing foliar stem cells.
レプチン受容体陽性細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞等の間葉系に属する細胞への分化において最も有用な細胞と考えられているが、骨髄液に含まれる間葉系幹細胞の量が十分ではないため、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を得ることは困難であった。後述する実施例と比較例との対比から分かるように、コラゲナーゼとディスパーゼの少なくとも一方が特定の濃度範囲を満たさない場合、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上とならず、これに対し、コラゲナーゼとディスパーゼが特定の濃度範囲にあることで、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞が得られることが本発明者らの検討により明らかとなった。このように、骨髄組織を酵素処理する条件によりレプチン受容体陽性細胞数が大きく異なることは本発明者らにより初めて確認されたものである。 Leptin receptor-positive cells are considered to be the most useful cells for differentiation into cells belonging to the mesenchymal system such as osteoblasts, chondrocytes, and muscle cells, but the amount of mesenchymal stem cells contained in the bone marrow fluid. However, it was difficult to obtain bone marrow-derived mesenchymal stem cells in which the number of leptin receptor-positive cells was above a certain level. As can be seen from the comparison between Examples and Comparative Examples described later, when at least one of collagenase and dispase does not meet a specific concentration range, the number of leptin receptor-positive cells does not exceed a certain level, whereas with coragenase. According to the studies by the present inventors, it has been clarified that when the dispase is in a specific concentration range, bone marrow-derived mesenchymal stem cells showing a certain number of leptin receptor-positive cells can be obtained. As described above, it was confirmed for the first time by the present inventors that the number of leptin receptor-positive cells greatly differs depending on the conditions for enzymatically treating myeloid tissue.
本発明の組織再生用材料は、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むものであり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞等の間葉系に属する細胞へ分化させるために好適に用いることができる。特に、骨髄組織から短時間で簡便な処理により骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、本発明の組織再生用材料を移植材料として好適に用いることができる。後述する実施例から明らかなように、本発明の組織再生用材料を移植することにより、移植後の細胞の生着が良好であり、骨髄由来の骨・軟骨形成を誘導させることが可能となるため、再生医療の分野に特に適しており、本発明の組織再生用材料を骨・軟骨形成剤として好適に用いることができる。 The material for tissue regeneration of the present invention contains mesenchymal stem cells derived from bone marrow showing a leptin receptor-positive number of 5.0 × 104 or more, and is a mesenchymal of osteoblasts, chondrocytes, muscle cells and the like. It can be suitably used for differentiating into cells belonging to the system. In particular, since bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be obtained from bone marrow tissue by simple treatment in a short time, the tissue regeneration material of the present invention can be suitably used as a transplant material. As will be clear from the examples described later, by transplanting the tissue regeneration material of the present invention, the engraftment of cells after transplantation is good, and it becomes possible to induce bone and cartilage formation derived from bone marrow. Therefore, it is particularly suitable for the field of regenerative medicine, and the tissue regeneration material of the present invention can be suitably used as a bone / cartilage forming agent.
本発明におけるレプチン受容体陽性細胞数は、フローサイトメトリーにより計測された細胞数であり、骨髄細胞の全細胞数を予め計測し、緩衝液０．２ｍＬ中の全細胞数が一定数となるように調製された組織再生用材料における細胞数を表すものである。フローサイトメトリーは、蛍光標識された細胞を含む懸濁液を細管に通し、一定波長のレーザー光を照射して光学的に検出する方法であり、レプチン受容体陽性細胞数を定量的に測定することが可能である。フローサイトメトリーに用いられる装置はフローサイトメーターである。各社から販売されているフローサイトメーターを用い、取扱説明書に従って測定することができる。また、骨髄細胞の全細胞数は、各社から販売されているセルカウンターを用いて定量的に測定することが可能である。セルカウンターとしては、前述のフローサイトメトリーに用いられるフローサイトメーターであってもよいし、細胞が開口部を通る際の電気抵抗の変化を測定することにより細胞数を計測するセルカウンターであってもよいし、オートフォーカスによる顕微鏡画像を画像処理して細胞数を計測するセルカウンターであってもよい。これらセルカウンターは、取扱説明書に従って測定することができる。 The number of leptin receptor-positive cells in the present invention is the number of cells measured by flow cytometry, and the total number of bone marrow cells is measured in advance so that the total number of cells in 0.2 mL of the buffer is constant. It represents the number of cells in the material for tissue regeneration prepared in. Flow cytometry is a method in which a suspension containing fluorescently labeled cells is passed through a capillary tube and irradiated with a laser beam of a certain wavelength for optical detection, and the number of leptin receptor-positive cells is quantitatively measured. It is possible. The device used for flow cytometry is a flow cytometer. It can be measured according to the instruction manual using the flow cytometer sold by each company. In addition, the total number of bone marrow cells can be quantitatively measured using a cell counter sold by each company. The cell counter may be a flow cytometer used for the above-mentioned flow cytometry, or a cell counter that measures the number of cells by measuring a change in electrical resistance when cells pass through an opening. Alternatively, it may be a cell counter that processes a microscope image by autofocus and measures the number of cells. These cell counters can be measured according to the instruction manual.
本発明において、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４未満を示す骨髄由来間葉系幹細胞の場合、生体に生着するには不十分な量となり、組織再生用材料としての使用には適さない。かかる観点から、本発明の組織再生用材料におけるレプチン受容体陽性細胞数としては、５．２×１０４以上が好ましく、５．５×１０４以上がより好ましく、５．８×１０４以上がさらに好ましい。なお、本発明において、レプチン受容体陽性細胞数は、通常、９．９×１０４以下である。 In the present invention, in the case of bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a leptin receptor - positive number of less than 5.0 × 104, the amount is insufficient for engraftment in a living body, and the amount is insufficient for use as a material for tissue regeneration. Is not suitable. From this point of view, the number of leptin receptor-positive cells in the tissue regeneration material of the present invention is preferably 5.2 × 10 4 or more, more preferably 5.5 × 10 4 or more, and 5.8 × 10 4 or more. More preferred. In the present invention, the number of leptin receptor-positive cells is usually 9.9 × 104 or less.
また、本発明の組織再生用材料は、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことが好ましい。骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ未満を示す骨髄由来間葉系幹細胞の場合、生体に生着するには不十分な量となるおそれがある。かかる観点から、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１００×１０４／ｇ以上がより好ましく、１０５×１０４／ｇ以上がさらに好ましく、１１０×１０４／ｇ以上が特に好ましい。なお、本発明において、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、通常、１９０×１０４以下である。 Further, the tissue regeneration material of the present invention preferably contains bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a leptin receptor-positive cell count of 96 × 10 4 / g or more per 1 g of bone. In the case of bone marrow-derived mesenchymal stem cells showing a leptin receptor-positive cell count of less than 96 × 10 4 / g per 1 g of bone, the amount may be insufficient for engraftment in a living body. From this point of view, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of bone is more preferably 100 × 10 4 / g or more, further preferably 105 × 10 4 / g or more, and particularly preferably 110 × 10 4 / g or more. In the present invention, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of bone is usually 190 × 104 or less.
本発明の組織再生用材料は、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液で骨髄組織を酵素処理することにより好適に得られるものである。本発明者らの検討により、コラゲナーゼとディスパーゼが特定の濃度範囲にあることで、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞が得られることが明らかとなった。後述する実施例と比較例との対比から分かるように、コラゲナーゼ濃度とディスパーゼ濃度の両方が上記濃度範囲を満たさない比較例１、３、４及び５、コラゲナーゼ濃度は上記濃度範囲を満たすがディスパーゼ濃度が上記濃度範囲を満たさない比較例２及び６、ディスパーゼ濃度は上記濃度範囲を満たすがコラゲナーゼ濃度が上記濃度範囲を満たさない比較例７では、いずれもレプチン受容体陽性細胞数が一定以上とならないため、生体に生着するには不十分な量となる。これに対し、コラゲナーゼとディスパーゼが上記濃度範囲にある実施例１では、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、移植材料として好適に用いることができる。コラゲナーゼ濃度の下限値としては、０．６ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．８ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．９ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。一方、コラゲナーゼ濃度の上限値としては、１．４ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１．３ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、１．２ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。また、ディスパーゼ濃度の下限値としては、０．６ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．８ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．９ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。一方、ディスパーゼ濃度の上限値としては、１．４ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１．３ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、１．２ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。 The tissue regeneration material of the present invention is suitably obtained by enzymatically treating myeloid tissue with a buffer solution containing 0.5 to 1.5 mg / mL collagenase and 0.5 to 1.5 mg / mL dispase. Is. The studies by the present inventors have revealed that the presence of collagenase and dispase in a specific concentration range can provide bone marrow-derived mesenchymal stem cells in which the number of leptin receptor-positive cells is above a certain level. As can be seen from the comparison between Examples and Comparative Examples described later, Comparative Examples 1, 3, 4, and 5 in which both the collagenase concentration and the dispase concentration do not satisfy the above concentration range, and the colagenase concentration satisfies the above concentration range but the dispase concentration. In Comparative Examples 2 and 6 in which the above concentration range is not satisfied, and in Comparative Example 7 in which the dispase concentration satisfies the above concentration range but the collagenase concentration does not satisfy the above concentration range, the number of leptin receptor-positive cells does not exceed a certain level. , The amount is insufficient to engraft in the living body. On the other hand, in Example 1 in which collagenase and dispase are in the above concentration range, bone marrow-derived mesenchymal stem cells showing a certain number of leptin receptor-positive cells can be obtained, and therefore, they can be suitably used as a transplant material. can. The lower limit of the collagenase concentration is preferably 0.6 mg / mL, more preferably 0.8 mg / mL, and even more preferably 0.9 mg / mL. On the other hand, the upper limit of the collagenase concentration is preferably 1.4 mg / mL, more preferably 1.3 mg / mL, and even more preferably 1.2 mg / mL. The lower limit of the dispase concentration is preferably 0.6 mg / mL, more preferably 0.8 mg / mL, and even more preferably 0.9 mg / mL. On the other hand, the upper limit of the dispase concentration is preferably 1.4 mg / mL, more preferably 1.3 mg / mL, and even more preferably 1.2 mg / mL.
前記コラゲナーゼと前記ディスパーゼを含む緩衝液としては、細胞内液等と同等の浸透圧を有するものであれば特に限定されないが、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、リンゲル液、細胞培養液等を好適に用いることができる。中でも、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、細胞培養液がより好適に用いられる。 The buffer solution containing the collagenase and the dispase is not particularly limited as long as it has the same osmotic pressure as the intracellular fluid, but Hanks balanced salt solution (HBSS), phosphate buffered saline (PBS), and the like. Phosphate saline solution, Ringer's solution, cell culture solution and the like can be preferably used. Among them, Hanks balanced salt solution (HBSS) and cell culture medium are more preferably used.
骨髄組織に対し、前記コラゲナーゼと前記ディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理することが本発明の好適な実施態様である。このように短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を骨髄組織から分離して得ることができる。特に、酵素処理する時間が短時間であることにより、医療現場において酵素処理して組織再生用材料を得て、その場で当該組織再生用材料を移植材料として用いることができる利点を有する。かかる観点から、酵素処理する時間は２５分以下であることがより好ましく、２０分以下であることがさらに好ましい。 A preferred embodiment of the present invention is to enzymatically treat myeloid tissue with a buffer solution containing the collagenase and the dispase at 36 ° C. or higher and 38 ° C. or lower for 5 minutes or more and less than 30 minutes. By such a simple treatment in a short time, bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a certain number of leptin receptor-positive cells can be separated from the myeloid tissue. In particular, since the enzyme treatment time is short, there is an advantage that the tissue regeneration material can be obtained by enzyme treatment in the medical field and the tissue regeneration material can be used as a transplant material on the spot. From this point of view, the enzyme treatment time is more preferably 25 minutes or less, and further preferably 20 minutes or less.
骨髄組織は、骨の内部から好適に採取することができる。例えば、骨を切断して、骨の内部を緩衝液等で洗い流すことにより骨髄組織を採取する方法が挙げられる。より簡便に行う観点から、前記コラゲナーゼと前記ディスパーゼを含む緩衝液で骨の内部を洗い流すことにより骨髄組織を採取する方法が好適に採用される。骨の種類としては、骨髄組織が含まれる骨であれば特に限定されず、大腿骨、脛骨、腓骨、顎骨、上腕骨等が挙げられ、中でも大腿骨又は脛骨が好適に用いられ、大腿骨がより好適に用いられる。 Bone marrow tissue can be suitably collected from the inside of bone. For example, a method of collecting bone marrow tissue by cutting the bone and washing the inside of the bone with a buffer solution or the like can be mentioned. From the viewpoint of simpler operation, a method of collecting bone marrow tissue by washing the inside of the bone with a buffer solution containing the collagenase and the dispase is preferably adopted. The type of bone is not particularly limited as long as it is a bone containing bone marrow tissue, and examples thereof include femur, tibia, peritoneum, jawbone, humeral bone, etc. Among them, femur or tibia is preferably used, and femur is used. It is more preferably used.
上記説明したように、本発明では短時間で簡便な処理により骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、医療現場において酵素処理して組織再生用材料を得て、その場で当該組織再生用材料を移植材料として用いることも可能である。かかる観点から、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであることが本発明の実施態様の一つである。また、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、コラゲナーゼを含む粉材（Ｘ）と、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼの濃度が０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであることも本発明の実施態様の一つである。さらに、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、ディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含む緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、ディスパーゼの濃度が０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであることも本発明の実施態様の一つである。 As described above, in the present invention, bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be obtained by simple treatment in a short time. Therefore, in the medical field, enzyme treatment is performed to obtain a tissue regeneration material, and the tissue regeneration is performed on the spot. It is also possible to use the material as a transplant material. From this point of view, a tissue regeneration material kit composed of a powder material (X) and a liquid agent (Y), wherein the powder material (X) containing collagenase and dispase and the liquid agent (Y) containing a buffer solution are used as collagenase. Bone marrow showing a leptin receptor-positive cell count of 5.0 × 104 or higher by mixing and enzymatically treating the bone marrow tissue so that the concentration of dispase and dispase is 0.5 to 1.5 mg / mL, respectively. One of the embodiments of the present invention is a tissue regeneration material kit comprising a powder material (X) and a liquid agent (Y), which comprises obtaining a tissue regeneration material containing derived mesenchymal stem cells. .. Further, a tissue regeneration material kit composed of a powder material (X) and a liquid agent (Y), which comprises a powder material (X) containing collagenase and a buffer solution containing 0.5 to 1.5 mg / mL dispase. The number of leptin receptor-positive cells was 5.0 × by mixing the liquid agent (Y) contained in the mixture so that the concentration of collagenase was 0.5 to 1.5 mg / mL and treating the bone marrow tissue with an enzyme. It is also an embodiment of the present invention that it is a tissue regeneration material kit comprising a powder material (X) and a liquid agent (Y), which comprises obtaining a tissue regeneration material containing bone marrow - derived mesenchymal stem cells showing 104 or more. It is one of the embodiments. Further, a tissue regeneration material kit consisting of a powder material (X) and a liquid agent (Y), which comprises a powder material (X) containing dispase and a buffer solution containing 0.5 to 1.5 mg / mL collagenase. The number of leptin receptor-positive cells was 5.0 × by mixing the liquid agent (Y) contained in the mixture so that the concentration of dispase was 0.5 to 1.5 mg / mL and treating the bone marrow tissue with an enzyme. It is also an embodiment of the present invention that it is a tissue regeneration material kit comprising a powder material (X) and a liquid agent (Y), which comprises obtaining a tissue regeneration material containing bone marrow - derived mesenchymal stem cells showing 104 or more. It is one of the embodiments.
本発明の組織再生用材料は、ヒトだけでなく、ヒト以外の哺乳動物に対しても好適に用いることができる。本発明の組織再生用材料を骨、軟骨、血管、脂肪細胞等の組織の再生を目的とする部位に対して直接投与するように用いてもよいし、静脈注射により投与するように用いてもよい。特に、短時間で簡便な処理により骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、医療現場において酵素処理して組織再生用材料を得て、その場で当該組織再生用材料を投与するように用いてもよく、滅菌処理や再手術等を行わずに当該組織再生用材料を投与できる利点を有する。投与する際に、他の医薬を併用しても構わない。例えば、骨欠損部位に対してＢＭＰ－２を投与しつつ、本発明の組織再生用材料を投与するように用いることも好適な実施態様である。また、本発明の組織再生用材料を培養して投与するように用いることも好適な実施態様であり、さらに本発明の組織再生用材料を分化させてから投与するように用いることも好適な実施態様である。本発明では、短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料が得られるため、再生医療や実験等において幅広い応用が可能となる。 The tissue regeneration material of the present invention can be suitably used not only for humans but also for mammals other than humans. The tissue regeneration material of the present invention may be used to be directly administered to a site for tissue regeneration such as bone, cartilage, blood vessel, adipocyte, or may be administered by intravenous injection. good. In particular, since bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be obtained in a short time and by simple treatment, the tissue regeneration material should be obtained by enzymatic treatment in the medical field, and the tissue regeneration material should be administered on the spot. It may be used and has an advantage that the tissue regeneration material can be administered without performing sterilization treatment, reoperation and the like. Other drugs may be used in combination at the time of administration. For example, it is also a preferable embodiment to administer BMP-2 to a bone defect site while administering the tissue regeneration material of the present invention. Further, it is also a preferable embodiment to use the material for tissue regeneration of the present invention by culturing and administering it, and it is also preferable to use the material for tissue regeneration of the present invention after differentiating it. It is an aspect. In the present invention, a material for tissue regeneration including bone marrow-derived mesenchymal stem cells showing a certain number of leptin receptor-positive cells or more can be obtained by a simple treatment in a short time, so that it can be widely applied in regenerative medicine and experiments. Become.
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
［試薬］
（１）１０×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）
ＮａＣｌ（１３７０ｍＭ）８０ｇ、ＫＣｌ（２７ｍＭ）２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（８１ｍＭ）１１．５ｇ、及びＫＨ２ＰＯ４（１４．７ｍＭ）２ｇを滅菌水で１Ｌにメスアップして調製した。
（２）１×ＰＢＳ
上記（１）１０×ＰＢＳを滅菌水で１０倍希釈した。
[reagent]
(1) 10 × PBS (Phosphate Buffer Salone)
80 g of NaCl (1370 mM), 2 g of KCl (27 mM), 11.5 g of Na 2 HPO 4 (81 mM), and 2 g of KH 2 PO 4 (14.7 mM) were prepared by measuring up to 1 L with sterile water.
(2) 1 x PBS
The above (1) 10 × PBS was diluted 10-fold with sterile water.
［実験動物］
７週齢雌性ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ/６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ））と７週齢雌性同系野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ）を使用した。
[Experimental animals]
A 7-week-old female GFP transgenic mouse (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP)) and a 7-week-old female allogeneic wild-type mouse (C57BL / 6J) were used.
［骨髄細胞の全細胞数］
採取された骨髄細胞の細胞数を、セルカウンター（ＴＣ２０ＴＭ 全自動セルカウンター、ＢＩＯ ＲＡＤ）でカウントした。計測方法は下記のとおりである。シャーレ状に流し出した骨髄細胞が含まれたＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒから１０μＬを採取し、同量のトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ ＃１４５００２１、ＢＩＯ ＲＡＤ）で染色を行い、直ちに前記セルカウンターを用いて１０μＬ中の細胞数の計測を行った。ここから得られた情報を元に、骨髄細胞の全細胞数を算出した。
[Total number of bone marrow cells]
The number of collected bone marrow cells was counted by a cell counter (TC20 TM fully automatic cell counter, BIO RAD). The measurement method is as follows. 10 μL was collected from the Decision Buffer containing the bone marrow cells that had been flushed out in a petri dish, stained with the same amount of trypan blue (Tripan Blue # 1450021, BIO RAD), and immediately used the cell counter to contain the cells in 10 μL. The number was measured. Based on the information obtained from this, the total number of bone marrow cells was calculated.
［レプチン受容体陽性細胞数］
実施例及び比較例において、酵素処理後の骨髄細胞をフローサイトメーター（和研薬株式会社製「ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０」）を用いてレプチン受容体陽性細胞数を計測した。
[Number of leptin receptor-positive cells]
In Examples and Comparative Examples, the number of leptin receptor-positive cells was measured using a flow cytometer (“MACSQuant Analyzer 10” manufactured by Waken Yakuhin Co., Ltd.) for bone marrow cells after enzyme treatment.
［組織再生用材料の移植］
野生型マウス（Ｃ５７ＢＪ／６）にＸ線照射装置（株式会社日立メディコ製「ＭＢＲ－１５２０Ｒ」）を用いて総量１０ＧｙのＸ線照射を行い、２７Ｇ注射器により０．５ｍＬ／匹で組織再生用材料を経尾静脈投与した。
[Transplantation of tissue regeneration material]
A wild-type mouse (C57BJ / 6) was irradiated with X-rays in a total volume of 10 Gy using an X-ray irradiation device (“MBR-1520R” manufactured by Hitachi Medical Corporation), and 0.5 mL / animal was used as a material for tissue regeneration with a 27 G syringe. Was administered by the tail vein.
［ＩＢＭ（不溶性骨基質）の移植］
後述する実施例１と比較例１の組織再生用材料をそれぞれ上記「組織再生用材料の移植」に記載の方法にしたがってマウスに移植し、骨髄生着期間として２８日間設けた。その後、マウスの背部皮下にＩＢＭ（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ）を１５０ｍｇとＢＭＰ－２（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ社製）を１０μｇ移植し、強制的に背部皮下に異所性の骨組織を誘導させた。なお、ＩＢＭは、脱水したラットの大腿骨と脛骨を粉砕機により粉砕して０．５ＭのＨＣｌで脱灰したものを使用した。背部皮下への移植から２８日後、マウスを屠殺し、背部皮下の異所性骨組織を摘出してホルマリン固定、ＥＤＴＡ脱灰後、通法にしたがって組織切片を作成した。
[IBM (Insoluble Osteon) Transplantation]
The tissue regeneration materials of Example 1 and Comparative Example 1, which will be described later, were transplanted into mice according to the method described in the above-mentioned "Transplantation of tissue regeneration material", respectively, and a bone marrow engraftment period of 28 days was provided. Then, 150 mg of IBM (Insoluble Bone Matrix) and 10 μg of BMP-2 (manufactured by PEPRO TECH) were transplanted subcutaneously into the back of the mouse to forcibly induce ectopic bone tissue under the skin of the back. As IBM, the femur and tibia of dehydrated rats were pulverized with a pulverizer and decalcified with 0.5 M HCl. Twenty-eight days after subcutaneous transplantation to the back, mice were sacrificed, ectopic bone tissue under the back was removed, formalin-fixed, EDTA decalcified, and tissue sections were prepared according to the conventional method.
［ヘマトキシリン（ＨＥ）染色］
得られた上記組織切片をキシレンにて脱パラフィンし、１００％から７０％エタノール（１００％、９０％、８０％、７０％の順）、及び精製水を用いて再水和後、ＨＥ染色を行った。７０％から１００％エタノール（７０％、８０％、９０％、１００％の順）、及びキシレンを用いて脱水・透徹を行った後、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）にて封入し、システム生物顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＢＸ５３」）により組織学的観察を行った。
[Hematoxylin (HE) staining]
The obtained tissue section is deparaffinized with xylene, rehydrated with 100% to 70% ethanol (in the order of 100%, 90%, 80%, 70%) and purified water, and then stained with HE. gone. After dehydration and permeation with 70% to 100% ethanol (in the order of 70%, 80%, 90%, 100%) and xylene, the mixture was sealed with Entellan (manufactured by Millipore Corporation) and system biological microscope (manufactured by Millipore Corporation). Histological observation was performed with "BX53" manufactured by Olympus.
［免疫組織化学的染色］
得られた上記組織切片の脱パラフィン後、室温（２５℃）で３０分間０．３％過酸化水素メタノール溶液にて内因性ペルオキシダーゼをブロックし、精製水で洗浄した。抗体として、ＧＦＰ（ａｂｃａｍ）、ＲＵＮＸ２（ａｂｃａｍ）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ（ａｂｃａｍ）のモノクローナル抗体を用い、システム生物顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＢＸ５３」）により観察を行った。陰性対照は二次抗体のみで行い、すべて陰性であった。
[Immunohistochemical staining]
After deparaffinizing the obtained tissue section, the endogenous peroxidase was blocked with a 0.3% hydrogen peroxide methanol solution at room temperature (25 ° C.) for 30 minutes, and the tissue was washed with purified water. As the antibody, monoclonal antibodies of GFP (abcam), RUNX2 (abcam), and Osteocalcine (abcam) were used, and observation was performed with a system biomicroscope (“BX53” manufactured by Olympus). Negative control was performed only with the secondary antibody, and all were negative.
［蛍光免疫二重染色］
ＧＦＰ（ａｂｃａｍ）、ＲＵＮＸ２（ａｂｃａｍ）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ（ａｂｃａｍ）のモノクローナル抗体を用いて、蛍光免疫二重染色を行った。各抗体の希釈はＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で行った。二次抗体反応終了後、対比染色としてＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）１μｇ／ｍｌを３分間反応させた。洗浄後にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ社製）で封入し、オールインワン蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製「ＢＺ７００」）で観察した。
[Fluorescent immune double staining]
Fluorescent immune double staining was performed using monoclonal antibodies of GFP (abcam), RUNX2 (abcam), and Osteocalcine (abcam). Each antibody was diluted with TBS (Tris Buffered Saline). After completion of the secondary antibody reaction, DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 1 μg / ml was reacted for 3 minutes as a counterstain. After washing, the cells were encapsulated with a Fluorescense monitoring medium (manufactured by Dako) and observed with an all-in-one fluorescence microscope (“BZ700” manufactured by Keyence).
実施例１
［Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ］
Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させて調製した。
Example 1
[Digestion Buffer]
It was prepared by dissolving 10 mg of Collagenase Type IV (Life Technologies, 17104-019) and 10 mg of Dispase (Life Technologies, 17105-041) in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-095).
［組織再生用材料］
ＧＦＰトランスジェニックマウス（約１８．９ｇ）を安楽死させ、大腿骨と脛骨を採取した。大腿骨１本の重量は約０．０５２ｇであった。大腿骨の両端をブレードで切断し、シャーレに入れた。１ｍＬシリンジ（２１Ｇ針）を用いてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ４ｍＬを骨の両側から流すことにより、骨髄組織をシャーレ上に流し出した。上述のとおりに骨髄細胞の全細胞数を算出したところ、１．０×１０７ｃｅｌｌｓであった。シャーレ上のＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを１５ｍＬのチューブ（Ａ）に回収した。シャーレ上に残った骨髄組織を新たなＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ２ｍＬで洗い、チューブ（Ａ）に回収した。３７℃のウォータバスに１０分間チューブ（Ａ）を静置して酵素処理を行った。チューブ（Ａ）を転倒混和し、氷上に２分間静置した。溶け残った骨髄組織を沈殿させて、上清を新たな１５ｍＬチューブ（Ｂ）に入れて氷上で保管した。新たなＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ４ｍＬをチューブ（Ａ）に入れて、３７℃のウォータバスに１０分間チューブ（Ａ）を静置して酵素処理を行った。チューブ（Ａ）を転倒混和し、チューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）を１５００ｒｐｍで５分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＨ４Ｃｌ（１５０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ２Ｎａ（１ｍＭ））を１ｍＬずつチューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）を加え、ピペッティングにて懸濁後、チューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）の中身をチューブ（Ａ）の方にまとめた。１分後、２％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）／ＰＢＳを５ｍＬ加えて懸濁後、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、０．１Ｍ ＰＢＳ／ＨＢＳＳで希釈し、約１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬに調製して組織再生用材料を得た。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、６．０×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１１５．４×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。また、マウスの背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、組織学的解析を行った結果を図４、５（右側）、６、７、８（右側）、９及び１０にそれぞれ示す。
[Material for tissue regeneration]
GFP transgenic mice (about 18.9 g) were euthanized and femurs and tibias were harvested. The weight of one femur was about 0.052 g. Both ends of the femur were cut with blades and placed in a petri dish. Bone marrow tissue was flushed onto a petri dish by flushing 4 mL of Digestion Buffer from both sides of the bone using a 1 mL syringe (21 G needle). When the total number of bone marrow cells was calculated as described above, it was 1.0 × 107 cells. The Digestion Buffer on the petri dish was collected in a 15 mL tube (A). The myeloid tissue remaining on the petri dish was washed with 2 mL of fresh Digestion Buffer and collected in a tube (A). The tube (A) was allowed to stand in a water bath at 37 ° C. for 10 minutes for enzyme treatment. The tube (A) was inverted and mixed and allowed to stand on ice for 2 minutes. The undissolved myeloid tissue was precipitated and the supernatant was placed in a new 15 mL tube (B) and stored on ice. 4 mL of fresh digestion buffer was placed in the tube (A), and the tube (A) was allowed to stand in a water bath at 37 ° C. for 10 minutes for enzyme treatment. The tube (A) was inverted and miscible, and the tube (A) and the tube (B) were centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant with an ejector, add 1 mL each of Cell Lysis Buffer (NH 4 Cl (150 mM), NaHCO 3 (10 mM), EDTA2Na (1 mM)), tube (A) and tube (B), and suspend by pipetting. Later, the contents of the tube (A) and the tube (B) were put together toward the tube (A). After 1 minute, 5 mL of 2% FBS (Fetal Bovine Serum, manufactured by Thermo Fisher Science) / PBS was added, suspended, and then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed with an aspirator, diluted with 0.1 M PBS / HBSS, and prepared to about 1.0 × 107 cells / 0.2 mL to obtain a material for tissue regeneration. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 6.0 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 115.4 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1. In addition, the results of histological analysis of the tissue sections obtained by inducing ectopic bone tissue under the skin of the back of the mouse are shown in FIGS. 4, 5 (right side), 6, 7, 8 (right side), and 9. And 10 respectively.
比較例１
実施例１において、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒの代わりにＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、０．３×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、５．８×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。また、マウスの背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、組織学的解析を行った結果を図３、５（左側）及び８（左側）にそれぞれ示す。
Comparative Example 1
In Example 1, a material for tissue regeneration was prepared in the same manner as in Example 1 except that 10 mL of HBSS (manufactured by Thermo Fisher Science, 14175-095) was used instead of Digestion Buffer. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 0.3 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 5.8 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1. In addition, the results of histological analysis of the tissue sections obtained by inducing ectopic bone tissue under the skin of the back of the mouse are shown in FIGS. 3, 5 (left side) and 8 (left side), respectively.
比較例２
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇのみをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１．０×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１９．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
Comparative Example 2
In Example 1, the same as in Example 1 except that only 10 mg of Collagenase Type IV (Life Technologies, 17104-019) was dissolved in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-059) to prepare a digestion buffer. A material for tissue regeneration was prepared in. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 1.0 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 19.2 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1.
比較例３
実施例１において、Ｄｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２０ｍｇのみをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、２．４×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、４６．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
Comparative Example 3
In Example 1, the organization was the same as in Example 1 except that only 20 mg of Dispase (17105-041) was dissolved in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-059) to prepare a digestion buffer. Materials for regeneration were prepared. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 2.4 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 46.2 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1.
比較例４
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、４．６×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、８８．５×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
Comparative Example 4
In Example 1, 1 mg of Collagenase Type IV (Life Technologies, 17104-019) and 2 mg of Dispase (Life Technologies, 17105-041) were dissolved in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-095). A material for tissue regeneration was prepared in the same manner as in Example 1 except that the Dispase Buffer was prepared. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 4.6 × 104. That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 88.5 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1.
比較例５
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）２ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１．２×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、２３．１×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
Comparative Example 5
In Example 1, 2 mg of Collagenase Type IV (Life Technologies, 17104-019) and 1 mg of Dispase (Life Technologies, 17105-041) were dissolved in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-095). A material for tissue regeneration was prepared in the same manner as in Example 1 except that the Dispase Buffer was prepared. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 1.2 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 23.1 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1.
比較例６
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、３．８×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、７３．１×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
Comparative Example 6
In Example 1, 10 mg of Collagenase Type IV (Life Technologies, 17104-019) and 20 mg of Dispase (Life Technologies, 17105-041) were dissolved in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-095). A material for tissue regeneration was prepared in the same manner as in Example 1 except that the Dispase Buffer was prepared. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 3.8 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 73.1 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1.
比較例７
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）２０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、３．６×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、６９．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
Comparative Example 7
In Example 1, 20 mg of Collagenase Type IV (Life Technologies, 17104-019) and 10 mg of Dispase (Life Technologies, 17105-041) were dissolved in 10 mL of HBSS (Thermo Fisher Science, 14175-095). A material for tissue regeneration was prepared in the same manner as in Example 1 except that the Dispase Buffer was prepared. The number of leptin receptor-positive cells per femur (about 0.052 g) was 3.6 × 104 . That is, the number of leptin receptor-positive cells per 1 g of femur was 69.2 × 10 4 / g. The results obtained are summarized in Table 1.
比較例１と実施例１とを対比した図３～５の結果から、比較例１では骨芽細胞、軟骨細胞、骨細胞のいずれもＧＦＰ陰性であることが確認され、実施例１では異所性骨と異所性軟骨においてＧＦＰ陽性の骨髄由来骨芽細胞、軟骨細胞及び骨細胞が確認されており、移植後の細胞の生着が良好であった。なお、比較例１と実施例１のいずれもＧＦＰ陽性の炎症細胞が確認された。また、図６の結果から、ＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞においてＲＵＮＸ２の発現が確認され、図７の結果から、ＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞においてＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅの発現が確認され、実施例１のＧＦＰ陽性細胞は骨髄由来骨細胞と軟骨細胞であることが確認された。また、異所性骨周囲の間質を観察した図８の結果から、比較例１では間質細胞はＧＦＰ陰性であったが、実施例１では異所性骨周囲の間質細胞にＧＦＰ陽性細胞が多数存在していることが確認された。そして、図９及び１０の結果から、間質に存在するＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞においてＲＵＮＸ２の発現が確認されており、異所性骨周囲の間質におけるＧＦＰ陽性細胞は、ＲＵＮＸ２陽性の骨髄由来の骨前駆細胞であることが確認された。以上のことから、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を移植することにより、移植後の細胞の生着が良好であり、骨髄由来の骨・軟骨形成を誘導させることが可能となることが分かる。
From the results of FIGS. 3 to 5 comparing Comparative Example 1 and Example 1, it was confirmed that all of osteoblasts, chondrocytes, and bone cells were GFP negative in Comparative Example 1, and ectopic in Example 1. GFP-positive bone marrow-derived osteoblasts, chondrocytes and osteoblasts were confirmed in sexual bone and ectopic cartilage, and the engraftment of cells after transplantation was good. In addition, GFP-positive inflammatory cells were confirmed in both Comparative Example 1 and Example 1. Further, from the results of FIG. 6, the expression of RUNX2 was confirmed in the GFP-positive bone marrow-derived cells, and from the results of FIG. 7, the expression of Osteocalcine was confirmed in the GFP-positive bone marrow-derived cells. It was confirmed that they were bone marrow-derived bone cells and chondrocytes. In addition, from the results of FIG. 8 in which the stromal cells around the ectopic bone were observed, the stromal cells in Comparative Example 1 were GFP negative, but in Example 1, the stromal cells around the ectopic bone were GFP positive. It was confirmed that a large number of cells were present. From the results of FIGS. 9 and 10, the expression of RUNX2 was confirmed in the GFP-positive bone marrow-derived cells present in the stroma, and the GFP-positive cells in the ectopic peri-bone stroma were derived from the RUNX2-positive bone marrow. It was confirmed that it was a bone marrow progenitor cell. From the above, by transplanting a tissue regeneration material containing bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a certain number of leptin receptor-positive cells or more, the engraftment of cells after transplantation is good, and bone marrow-derived bone and bone marrow. It can be seen that it is possible to induce cartilage formation.
Claims (5)
レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とする組織再生用材料。 It is a tissue regeneration material obtained by separating bone marrow-derived mesenchymal stem cells from myeloid tissue.
A material for tissue regeneration, which comprises bone marrow-derived mesenchymal stem cells having a leptin receptor-positive number of 5.0 × 104 or more.
骨髄組織に対し、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理する請求項１～３のいずれかに記載の組織再生用材料の製造方法。 A method for producing a tissue regeneration material obtained by separating bone marrow-derived mesenchymal stem cells from bone marrow tissue.
Bone marrow tissue treated with a buffer containing 0.5-1.5 mg / mL collagenase and 0.5-1.5 mg / mL dispase at 36 ° C or higher and 38 ° C or lower for 5 minutes or more and less than 30 minutes. The method for producing a tissue regeneration material according to any one of claims 1 to 3.
コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キット。
A tissue regeneration material kit consisting of a powder material (X) and a liquid agent (Y).
The powder material (X) containing collagenase and dispase and the liquid preparation (Y) containing a buffer solution are mixed so that the concentrations of collagenase and dispase are 0.5 to 1.5 mg / mL, respectively, to the bone marrow tissue. A powder material (X) and a liquid agent (X), which comprises a bone marrow-derived mesenchymal stem cell having a leptin receptor - positive cell count of 5.0 × 104 or more, can be obtained by enzymatic treatment. A material kit for tissue regeneration consisting of Y).
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| INT. J. MOL. SCI., vol. Vol. 20, 3639, JPN7024002509, 2019, ISSN: 0005446831 * |
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