JP2022047038A - 脳血管攣縮抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】くも膜下出血における脳動脈瘤の破裂後、脳動脈が攣縮し、脳障害に至る原因となるメカニズムを解明し、さらに該メカニズムに基づく脳血管攣縮抑制剤を提供することを課題とする。さらには、新規脳血管攣縮抑制剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題手段】「脳動脈瘤の破裂によりできた血腫からデンジャーシグナル（DAMPs）が放出され、骨髄又は血液中の好中球及び／又はマクロファージがRAGEを介してDAMPsと結合することにより活性化し、さらに脳血管へ遊走し、脳血管攣縮を引き起こすメカニズム」を見出し、該メカニズムを標的とした本発明の脳血管攣縮抑制剤を完成した。
【選択図】なし
【課題手段】「脳動脈瘤の破裂によりできた血腫からデンジャーシグナル（DAMPs）が放出され、骨髄又は血液中の好中球及び／又はマクロファージがRAGEを介してDAMPsと結合することにより活性化し、さらに脳血管へ遊走し、脳血管攣縮を引き起こすメカニズム」を見出し、該メカニズムを標的とした本発明の脳血管攣縮抑制剤を完成した。
【選択図】なし
Description
本発明は、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤、くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤、くも膜下出血の治療剤、並びに、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法に関する。
（SAH）
くも膜下出血（SAH）は、主に脳動脈瘤の破裂により発症する脳卒中であり、多くのSAH患者は脳血管攣縮と呼ばれる脳動脈の攣縮を起こし脳障害に至ることが知られている。しかしSAH後の脳血管攣縮の原因は不明であった。脳血管攣縮に対してRhoキナーゼ阻害剤が臨床現場で使用されているが、有意な治療予後改善には至っていない。
くも膜下出血（SAH）は、主に脳動脈瘤の破裂により発症する脳卒中であり、多くのSAH患者は脳血管攣縮と呼ばれる脳動脈の攣縮を起こし脳障害に至ることが知られている。しかしSAH後の脳血管攣縮の原因は不明であった。脳血管攣縮に対してRhoキナーゼ阻害剤が臨床現場で使用されているが、有意な治療予後改善には至っていない。
（RAGE）
終末糖化産物受容体（receptor for advanced glycation endproducts; RAGE）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する１回膜貫通型受容体である。同RAGEは、炎症や疾患に関連する様々なリガンドに結合するマルチリガンド受容体である（非特許文献１）。
くも膜下出血のラットモデルにて脳の神経細胞と脳内免疫細胞であるマイクログリア（中枢神経系グリア細胞）でRAGEの発現が上昇することが報告されている（非特許文献２）。
くも膜下出血ラットモデルにてRAGE阻害剤であるFPS-ZM1を腹腔内投与すると1日目は症状が改善したが3日目はその効果が無くなった。NF-kBに依存する脳内炎症は軽減する一方で、神経細胞が死にやすくなることが報告されている（非特許文献３）。
終末糖化産物受容体（receptor for advanced glycation endproducts; RAGE）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する１回膜貫通型受容体である。同RAGEは、炎症や疾患に関連する様々なリガンドに結合するマルチリガンド受容体である（非特許文献１）。
くも膜下出血のラットモデルにて脳の神経細胞と脳内免疫細胞であるマイクログリア（中枢神経系グリア細胞）でRAGEの発現が上昇することが報告されている（非特許文献２）。
くも膜下出血ラットモデルにてRAGE阻害剤であるFPS-ZM1を腹腔内投与すると1日目は症状が改善したが3日目はその効果が無くなった。NF-kBに依存する脳内炎症は軽減する一方で、神経細胞が死にやすくなることが報告されている（非特許文献３）。
くも膜下出血患者において、脳血管攣縮により重症化した群では、血液中の内在性RAGE阻害剤レベルが少なかったことから患者重症度とRAGEシグナルの関与が示唆されたが（非特許文献４）、本発明の脳血管攣縮抑制剤に含まれている有効成分は知られていない。
Daffu et al, Int J Mol Sci. 2013,14(10):19891-910. doi:10.3390/ijms141019891.
Li et al, Brain Res. 2014;1543:315-323. doi:10.1016/j.brainres.2013.11.023.
Li et al, Mol Neurobiol. 2017;54(1):755-767. doi:10.1007/s12035-016-9703-y.
Aida et al, J Neurosurg. 2019, 1.aop: 1-9. doi:10.3171/2019.8.JNS191269.
くも膜下出血における脳動脈瘤の破裂後、脳動脈が攣縮し、脳障害に至る原因となるメカニズムは不明であった。
本発明は、これらのメカニズムを解明し、さらに該メカニズムに基づく脳血管攣縮抑制剤を提供することを課題とする。さらには、新規脳血管攣縮抑制剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明は、これらのメカニズムを解明し、さらに該メカニズムに基づく脳血管攣縮抑制剤を提供することを課題とする。さらには、新規脳血管攣縮抑制剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、「脳動脈瘤の破裂によりできた血腫からデンジャーシグナルであるdamage-associated molecular patterns (DAMPs)が放出され、骨髄又は血液中の好中球及び／又はマクロファージがRAGEを介してDAMPsと結合することにより活性化し、さらに脳血管へ遊走し、脳血管攣縮を引き起こすメカニズム」を見出し、該メカニズムを標的とした本発明の脳血管攣縮抑制剤を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．くも膜下出血後の脳血管攣縮における骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する化合物を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
２．前記脳血管攣縮がくも膜下出血後24時間以内の脳血管攣縮である、前項１に記載のくも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
３．下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
４．前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の脳血管攣縮である、前項３に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
５．前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化に起因する、前項４に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
６．前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの脳動脈への遊走に起因する、前項４に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
７．下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤。
８．下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、くも膜下出血の治療剤。
９．好中球エラスターゼ阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
１０．以下のいずれか１以上の物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
（１）Pyrazole-5-carboxamides
（２）soluble RAGE（可溶性RAGE, sRAGE）
（３）FPS-ZM1
（４）4,6-bisphenyl-2-(3-alkoxyanilino)pyrimidine
（５）Azeliragon
１１．以下のいずれか１以上の物質を判定することを特徴とする、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法。
（１）RAGEとDIAPH1の結合を阻害する物質を判定する
（２）好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する物質を判定する
（３）好中球のエラスターゼ活性を阻害する物質を判定する
（４）RAGEの活性を阻害する物質を判定する
（５）DAMPsとRAGEの結合を阻害する物質を判定する
（６）RAGEからRhoの活性化を阻害する物質を判定する
（７）RAGEに依存したNETosisを抑制する物質を判定する
（８）Racの活性化を阻害する物質を判定する
（９）Cdc42の活性化を阻害する物質を判定する
１．くも膜下出血後の脳血管攣縮における骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する化合物を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
２．前記脳血管攣縮がくも膜下出血後24時間以内の脳血管攣縮である、前項１に記載のくも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
３．下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
５．前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化に起因する、前項４に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
６．前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの脳動脈への遊走に起因する、前項４に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
７．下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤。
１０．以下のいずれか１以上の物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
（１）Pyrazole-5-carboxamides
（２）soluble RAGE（可溶性RAGE, sRAGE）
（３）FPS-ZM1
（４）4,6-bisphenyl-2-(3-alkoxyanilino)pyrimidine
（５）Azeliragon
１１．以下のいずれか１以上の物質を判定することを特徴とする、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法。
（１）RAGEとDIAPH1の結合を阻害する物質を判定する
（２）好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する物質を判定する
（３）好中球のエラスターゼ活性を阻害する物質を判定する
（４）RAGEの活性を阻害する物質を判定する
（５）DAMPsとRAGEの結合を阻害する物質を判定する
（６）RAGEからRhoの活性化を阻害する物質を判定する
（７）RAGEに依存したNETosisを抑制する物質を判定する
（８）Racの活性化を阻害する物質を判定する
（９）Cdc42の活性化を阻害する物質を判定する
本発明のくも膜下出血後の脳血管攣縮における骨髄又は血液中由来の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用を有する物質を有効成分とする脳血管攣縮抑制剤は、くも膜下出血後の脳血管攣縮を抑制し、さらに神経機能を改善する効果を有する。
また、好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用は、脳血管攣縮抑制効果及び神経機能改善効果を有する。よって、該作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、新規脳血管攣縮抑制剤を得ることができる。
また、好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用は、脳血管攣縮抑制効果及び神経機能改善効果を有する。よって、該作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、新規脳血管攣縮抑制剤を得ることができる。
（本発明の対象）
本発明の対象は、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤、くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤、くも膜下出血の治療剤、並びに、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法である。
本発明の対象は、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤、くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤、くも膜下出血の治療剤、並びに、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法である。
米国ニューヨーク大学のSchmidt教授によりRAGEの細胞内シグナル伝達因子として細胞骨格関連分子DIAPH1が同定された（Hudson et al, J Biol Chem. 2008, 283(49):34457-68. doi:10.1074/jbc.M801465200.）。更にRAGEとDIAPH1の結合を阻害する化合物の探索により、C末端RAGEへの直接結合を示す１３種類のRAGE/DIAPH1阻害化合物が発見された（Manigrasso et al, Sci Rep. 2016, 6:22450. doi:10.1038/srep22450.）。
本発明は、Schmidt教授が開発した１３種類のRAGE/DIAPH1阻害化合物のうち予備実験から最も効果が期待された下記式（１）で表される化合物について、後述する実施例により骨髄又は血液中由来の好中球及び／若しくはマクロファージのRAGEシグナルの抑制を介して脳血管攣縮を抑制・軽減し、神経機能を改善することを確認した。
本発明は、Schmidt教授が開発した１３種類のRAGE/DIAPH1阻害化合物のうち予備実験から最も効果が期待された下記式（１）で表される化合物について、後述する実施例により骨髄又は血液中由来の好中球及び／若しくはマクロファージのRAGEシグナルの抑制を介して脳血管攣縮を抑制・軽減し、神経機能を改善することを確認した。
（くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤）
本発明のくも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤（以後、「本発明の抑制剤」と略する場合がある）は、くも膜下出血後のいかなる時期の脳血管攣縮も対象とするが、例えば、くも膜下出血後24時間以内、くも膜下出血後0～24時間後、3～24時間後若しくは12～24時間後、又は、24時間後以降、48時間後以降の脳血管攣縮を対象とする。
なお、抑制とは、脳血管攣縮を治療、予防、再発予防、軽減、完治等を含む。
本発明のくも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤（以後、「本発明の抑制剤」と略する場合がある）は、くも膜下出血後のいかなる時期の脳血管攣縮も対象とするが、例えば、くも膜下出血後24時間以内、くも膜下出血後0～24時間後、3～24時間後若しくは12～24時間後、又は、24時間後以降、48時間後以降の脳血管攣縮を対象とする。
なお、抑制とは、脳血管攣縮を治療、予防、再発予防、軽減、完治等を含む。
（骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージ）
本発明の抑制剤における「好中球及び／若しくはマクロファージ」は、下記の実施例に示すように、脳血管攣縮に関与する好中球及び／若しくはマクロファージは、骨髄又は血液由来であることを確認している。
また、好中球及び／若しくはマクロファージの活性化の阻害とは、これらの増殖、遊走、炎症、攻撃を抑制することを意味する。増殖、遊走、炎症及び攻撃は、公知の方法により測定することができる。
本発明の抑制剤における「好中球及び／若しくはマクロファージ」は、下記の実施例に示すように、脳血管攣縮に関与する好中球及び／若しくはマクロファージは、骨髄又は血液由来であることを確認している。
また、好中球及び／若しくはマクロファージの活性化の阻害とは、これらの増殖、遊走、炎症、攻撃を抑制することを意味する。増殖、遊走、炎症及び攻撃は、公知の方法により測定することができる。
（本発明の抑制剤の有効成分）
本発明の抑制剤の有効成分は、骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用を有するのであれば、高分子化合物であってもよいし低分子化合物であってもよい。
高分子化合物の例としては、例えばタンパク質、核酸物質が挙げられ、具体的には抗体、抗体断片、ペプチド、siRNA又はshRNAなどが挙げられる。低分子化合物と高分子化合物を含む物質であってもよい。
好ましい有効成分の一例として、式（１）で表される化合物を確認している。加えて、式（１）で表される化合物の効果を阻害しない式（１）の薬理学的に許容される塩（例、付加塩、塩酸塩）も好ましい。
本発明の抑制剤の有効成分は、骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用を有するのであれば、高分子化合物であってもよいし低分子化合物であってもよい。
高分子化合物の例としては、例えばタンパク質、核酸物質が挙げられ、具体的には抗体、抗体断片、ペプチド、siRNA又はshRNAなどが挙げられる。低分子化合物と高分子化合物を含む物質であってもよい。
好ましい有効成分の一例として、式（１）で表される化合物を確認している。加えて、式（１）で表される化合物の効果を阻害しない式（１）の薬理学的に許容される塩（例、付加塩、塩酸塩）も好ましい。
（対象）
本発明の抑制剤の投与対象は、ヒト及び非ヒト哺乳動物である。好ましい非ヒト哺乳動物として、ペットや家畜等が挙げられる。
本発明の抑制剤の投与対象は、ヒト及び非ヒト哺乳動物である。好ましい非ヒト哺乳動物として、ペットや家畜等が挙げられる。
（投与方法、剤形）
本発明の抑制剤の投与経路に特に制限はないが、好ましい投与経路として、経静脈、経口、経皮、経粘膜（口腔、直腸、膣等）が挙げられる。
経口投与用製剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤（ドライシロップ剤）、経口ゼリー剤などが挙げられる。経皮投与用又は経粘膜投与用製剤としては、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び散剤等は、腸溶性製剤とすることができる。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤に腸溶性のコーティングを施す。腸溶性コーティング剤としては、胃難溶性腸溶性コーティング剤を用いることができる。
本発明の抑制剤は、有効成分の他に、投与形態に応じて、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。
本発明の抑制剤の投与経路に特に制限はないが、好ましい投与経路として、経静脈、経口、経皮、経粘膜（口腔、直腸、膣等）が挙げられる。
経口投与用製剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤（ドライシロップ剤）、経口ゼリー剤などが挙げられる。経皮投与用又は経粘膜投与用製剤としては、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び散剤等は、腸溶性製剤とすることができる。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤に腸溶性のコーティングを施す。腸溶性コーティング剤としては、胃難溶性腸溶性コーティング剤を用いることができる。
本発明の抑制剤は、有効成分の他に、投与形態に応じて、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。
本発明の抑制剤の投与量及び投与回数は、投与対象、その年齢、体重、性別、目的（予防用か治療用か等）、症状の重篤度、剤形、投与経路等の条件によって適宜変化しうる。ヒトに投与する場合、式（１）で表される化合物の投与量は、例えば、１日当たり、約0.0001 mg/kg体重～10 mg/kg体重投与される。また、投与回数は、１日当たり１回又は複数回、又は数日に1回であってもよい。例えば、１日当たり１～３回、１～２回、又は１回であってよい。
本発明の抑制剤は、医薬品、医薬部外品、医療機器、衛生用品、食品、飲料、サプリメントにすることができる。
本発明の抑制剤は、医薬品、医薬部外品、医療機器、衛生用品、食品、飲料、サプリメントにすることができる。
（治療方法）
本発明は、本発明の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用を有する化合物を有効成分とする脳血管攣縮抑制剤を用いることによる、くも膜下出血後の脳血管攣縮の予防方法及び／又は治療方法も対象とする。
本発明は、本発明の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する作用を有する化合物を有効成分とする脳血管攣縮抑制剤を用いることによる、くも膜下出血後の脳血管攣縮の予防方法及び／又は治療方法も対象とする。
（くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤）
本発明のくも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤は、上記述べた本発明の抑制剤と同様の有効成分、対象、投与方法、剤形、治療方法を採用することができる。
本発明のくも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤は、上記述べた本発明の抑制剤と同様の有効成分、対象、投与方法、剤形、治療方法を採用することができる。
（くも膜下出血後の神経機能治療剤）
本発明のくも膜下出血後の神経機能治療剤は、上記述べた本発明の抑制剤と同様の有効成分、対象、投与方法、剤形、治療方法を採用することができる。
なお、神経機能の治療とは、改善、予防、再発予防、軽減、完治等を含むが特に限定されない。
本発明のくも膜下出血後の神経機能治療剤は、上記述べた本発明の抑制剤と同様の有効成分、対象、投与方法、剤形、治療方法を採用することができる。
なお、神経機能の治療とは、改善、予防、再発予防、軽減、完治等を含むが特に限定されない。
（くも膜下出血治療剤）
本発明のくも膜下出血治療剤は、上記述べた本発明の抑制剤と同様の有効成分、対象、投与方法、剤形、治療方法を採用することができる。
なお、くも膜下出血の治療とは、改善、予防、再発予防、軽減、完治等を含むが特に限定されない。
本発明のくも膜下出血治療剤は、上記述べた本発明の抑制剤と同様の有効成分、対象、投与方法、剤形、治療方法を採用することができる。
なお、くも膜下出血の治療とは、改善、予防、再発予防、軽減、完治等を含むが特に限定されない。
（好中球エラスターゼ阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤）
本発明における「好中球エラスターゼ阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤」は、好中球のエラスターゼ活性を阻害する効果を有する物質が含まれていれば特に限定されない。好中球のエラスターゼ活性を阻害する効果を有する物質として、例えば、シベレスタットナトリウム水和物、trypsin Inhibitor、soybean、3,4 dichloroisocoumarin、elastatinal、N-(Methoxysuccinyl)-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketone、SSR 69071、Sivelestat sodium tetrahydrate、1-(3-methylbenzoyl)-1H-indazole-3-carbonitrile、sirtinol等が挙げられる。
本発明における「好中球エラスターゼ阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤」は、好中球のエラスターゼ活性を阻害する効果を有する物質が含まれていれば特に限定されない。好中球のエラスターゼ活性を阻害する効果を有する物質として、例えば、シベレスタットナトリウム水和物、trypsin Inhibitor、soybean、3,4 dichloroisocoumarin、elastatinal、N-(Methoxysuccinyl)-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketone、SSR 69071、Sivelestat sodium tetrahydrate、1-(3-methylbenzoyl)-1H-indazole-3-carbonitrile、sirtinol等が挙げられる。
（RAGE阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤）
本発明における「RAGE阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤」は、RAGEの活性を阻害する効果を有する物質が含まれていれば特に限定されない。RAGEを阻害する効果を有する物質として、例えば、sRAGE、FPS-ZM1、Pyrazole-5-carboxamides、4,6-bisphenyl-2-(3-alkoxyanilino)pyrimidine、Azeliragon (TTP488)等が挙げられる。
本発明における「RAGE阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤」は、RAGEの活性を阻害する効果を有する物質が含まれていれば特に限定されない。RAGEを阻害する効果を有する物質として、例えば、sRAGE、FPS-ZM1、Pyrazole-5-carboxamides、4,6-bisphenyl-2-(3-alkoxyanilino)pyrimidine、Azeliragon (TTP488)等が挙げられる。
（スクリーニング方法）
本発明の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法は、以下を対象とする。
〇RAGEとDIAPH1の結合を阻害する物質を判定する
〇好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する物質を判定する
〇好中球のエラスターゼ活性を阻害する物質を判定する
〇RAGEの活性を阻害する物質を判定する
〇HMGB1を始めとするDAMPsとRAGEの結合を阻害する物質を判定する
〇RAGEからRhoの活性化を阻害する物質を判定する
〇RAGEに依存したNETosisを抑制する物質を判定する
〇Racの活性化を阻害する物質を判定する
〇Cdc42の活性化を阻害する物質を判定する
なお、好中球細胞外トラップ（NET、NETs）は活性化した好中球が細菌や組織に対して自己のDNAと消化酵素等蛋白質の複合体を攻撃対象に対して投じる細胞外繊維のネットワークを意味する。加えて、NET、NETsに際する細胞死をNETosisと称する。
本発明の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法は、以下を対象とする。
〇RAGEとDIAPH1の結合を阻害する物質を判定する
〇好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する物質を判定する
〇好中球のエラスターゼ活性を阻害する物質を判定する
〇RAGEの活性を阻害する物質を判定する
〇HMGB1を始めとするDAMPsとRAGEの結合を阻害する物質を判定する
〇RAGEからRhoの活性化を阻害する物質を判定する
〇RAGEに依存したNETosisを抑制する物質を判定する
〇Racの活性化を阻害する物質を判定する
〇Cdc42の活性化を阻害する物質を判定する
なお、好中球細胞外トラップ（NET、NETs）は活性化した好中球が細菌や組織に対して自己のDNAと消化酵素等蛋白質の複合体を攻撃対象に対して投じる細胞外繊維のネットワークを意味する。加えて、NET、NETsに際する細胞死をNETosisと称する。
「RAGEとDIAPH1の結合を阻害する物質を判定する」とは、例えば下記のいずれか1以上の工程を含んでもよい。
（ａ－１）被験物質の存在下において、被験者の生物学的試料由来のDIAPH1のRAGEに対する結合能又はRAGEのDIAPH1に対する結合能（RAGE/DIAPH1結合能）を測定する工程、及び
（ａ－２）上記（ａ－１）の結果に基づいて、RAGEとDIAPH1の結合を阻害する作用（RAGE/DIAPH1結合阻害作用）を有する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ－１）における結合能の測定は、自体公知の方法、例えば、バインディングアッセイ、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の使用）により行われ得る。
上記方法の工程（ａ－１）は、さらに、被験物質の存在下において測定した結合能と、RAGE/DIAPH1結合阻害作用を有しない対照物質存在下において測定したRAGE/DIAPH1結合能とを比較すること、及び／又は、複数の被験物質について測定した結合能を比較することを含んでもよい。
（ａ－１）被験物質の存在下において、被験者の生物学的試料由来のDIAPH1のRAGEに対する結合能又はRAGEのDIAPH1に対する結合能（RAGE/DIAPH1結合能）を測定する工程、及び
（ａ－２）上記（ａ－１）の結果に基づいて、RAGEとDIAPH1の結合を阻害する作用（RAGE/DIAPH1結合阻害作用）を有する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ－１）における結合能の測定は、自体公知の方法、例えば、バインディングアッセイ、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の使用）により行われ得る。
上記方法の工程（ａ－１）は、さらに、被験物質の存在下において測定した結合能と、RAGE/DIAPH1結合阻害作用を有しない対照物質存在下において測定したRAGE/DIAPH1結合能とを比較すること、及び／又は、複数の被験物質について測定した結合能を比較することを含んでもよい。
「好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する物質を判定する」とは、例えば下記のいずれか1以上の工程を含んでもよい。
（ｂ－１）被験物質の存在下において、被験者の生物学的試料由来の好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化を測定する工程、及び
（ｂ－２）上記（ｂ－１）の結果に基づいて、好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する作用を有する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ｂ－１）における血腫への遊走又は活性化の測定は、自体公知の方法、例えば、細胞遊走アッセイ（例えば、transwell（Corning（登録商標））を用いた遊走アッセイ）により行われ得る。
上記方法の工程（ｂ－１）は、さらに、被験物質の存在下において測定した好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化と、好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する作用を有しない対照物質存在下において測定した好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化とを比較すること、及び／又は、複数の被験物質について測定した好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化を比較することを含んでもよい。
（ｂ－１）被験物質の存在下において、被験者の生物学的試料由来の好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化を測定する工程、及び
（ｂ－２）上記（ｂ－１）の結果に基づいて、好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する作用を有する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ｂ－１）における血腫への遊走又は活性化の測定は、自体公知の方法、例えば、細胞遊走アッセイ（例えば、transwell（Corning（登録商標））を用いた遊走アッセイ）により行われ得る。
上記方法の工程（ｂ－１）は、さらに、被験物質の存在下において測定した好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化と、好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する作用を有しない対照物質存在下において測定した好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化とを比較すること、及び／又は、複数の被験物質について測定した好中球又はマクロファージの血腫への遊走又は活性化を比較することを含んでもよい。
（被験物質）
上記スクリーニングで使用する治療剤候補物質となる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物（例えばsiRNA）でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。
被験物質は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー及びコンビナトリアルライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
上記スクリーニングで使用する治療剤候補物質となる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物（例えばsiRNA）でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。
被験物質は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー及びコンビナトリアルライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
（被験者・生物学的試料）
本発明において、被験者は、哺乳類全般（ヒト、ネコ、イヌ、ウマを含む）を含み、さらに、健常者、くも膜下出血の患者、くも膜下出血の疑いがある人、くも膜下出血が将来発生する人も含む。
また、生物学的試料は、特に限定されないが、脾臓、リンパ節、末梢血、血液成分（血清、血漿、血球、白血球、好中球など）、間葉細胞、幹細胞、生検試料、iPS細胞、初代培養細胞、唾液、尿、髄液、涙液、汗、毛髪、組織由来の成分を含む。
本発明において、被験者は、哺乳類全般（ヒト、ネコ、イヌ、ウマを含む）を含み、さらに、健常者、くも膜下出血の患者、くも膜下出血の疑いがある人、くも膜下出血が将来発生する人も含む。
また、生物学的試料は、特に限定されないが、脾臓、リンパ節、末梢血、血液成分（血清、血漿、血球、白血球、好中球など）、間葉細胞、幹細胞、生検試料、iPS細胞、初代培養細胞、唾液、尿、髄液、涙液、汗、毛髪、組織由来の成分を含む。
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、以下の実施例は、金沢大学の遺伝子組換え実験安全管理委員会及び動物実験委員会の承認を受けた。実施例に使用した材料及び方法は以下の通りである。
（くも膜下出血マウスモデルの作製）
C57BL/6Jバックグラウンドマウスを用いマイクロフィラメントを左外頸動脈スタンプより挿入、内頸動脈を経由して前大脳動脈-中大脳動脈分岐部で穿破させることによりくも膜下出血を作製した。
C57BL/6Jバックグラウンドマウスを用いマイクロフィラメントを左外頸動脈スタンプより挿入、内頸動脈を経由して前大脳動脈-中大脳動脈分岐部で穿破させることによりくも膜下出血を作製した。
（マウス神経学スコアの計測方法）
神経行動機能は修正Garcia神経学スコアを用い計測した。評価は6項目の検査よりなりそれぞれ3点満点とし、点数が高いほど機能が良いとした。6項目は、四肢の自発活動、自発運動、前肢の差し伸ばし、登り運動、固有受容感覚、そして髭刺激反応から構成している（参考: Liu et al, Mol Neurobiol. 2015, 53(7):4529-38. doi:10.1007/s12035-015-986-9.）。
神経行動機能は修正Garcia神経学スコアを用い計測した。評価は6項目の検査よりなりそれぞれ3点満点とし、点数が高いほど機能が良いとした。6項目は、四肢の自発活動、自発運動、前肢の差し伸ばし、登り運動、固有受容感覚、そして髭刺激反応から構成している（参考: Liu et al, Mol Neurobiol. 2015, 53(7):4529-38. doi:10.1007/s12035-015-986-9.）。
（RAGE阻害剤 Compound 11）
RAGE/DIAPH1阻害化合物は、米国ニューヨーク大学Schmidt教授がRAGEの細胞内シグナル伝達因子として細胞骨格関連分子DIAPH1を同定し（参考: Hudson et al, J Biol Chem. 2008, 283(49):34457-68. doi:10.1074/jbc.M801465200.）、更にRAGEとDIAPH1の結合を阻害する化合物を探索することにより発見したものである（参考: Manigrasso et al, Sci Rep. 2016, 6:22450. doi:10.1038/srep22450.）。
本発明者らは、開発者のSchmidt教授に許可を得て金沢大学山本靖彦教授が合成したRAGE/DIAPH1阻害化合物の１つであるCompound 11（C11：式（１）で表される化合物）の分与を受けた。
RAGE/DIAPH1阻害化合物は、米国ニューヨーク大学Schmidt教授がRAGEの細胞内シグナル伝達因子として細胞骨格関連分子DIAPH1を同定し（参考: Hudson et al, J Biol Chem. 2008, 283(49):34457-68. doi:10.1074/jbc.M801465200.）、更にRAGEとDIAPH1の結合を阻害する化合物を探索することにより発見したものである（参考: Manigrasso et al, Sci Rep. 2016, 6:22450. doi:10.1038/srep22450.）。
本発明者らは、開発者のSchmidt教授に許可を得て金沢大学山本靖彦教授が合成したRAGE/DIAPH1阻害化合物の１つであるCompound 11（C11：式（１）で表される化合物）の分与を受けた。
（共培養実験）
上層の底に3μmの小さなポアを持つ隔壁培養皿であるtranswell（Corning（登録商標））を用い、下層の皿に血腫を、上層の皿にLPS刺激をした好中球を撒き、37℃にて45分間培養した。
上層の底に3μmの小さなポアを持つ隔壁培養皿であるtranswell（Corning（登録商標））を用い、下層の皿に血腫を、上層の皿にLPS刺激をした好中球を撒き、37℃にて45分間培養した。
本発明者らは、以下の確認を行った。
（RAGEノックアウトマウスの神経学的症状）
RAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）及び対照の野生型マウス（WT）のくも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製し、前述の修正Garcia神経学スコアを算出した。
該算出結果により、RAGEノックアウトマウスでは、SAH12時間後及び24時間後において、顕著に神経学症状が改善することが確認できた（図１）。
（RAGEノックアウトマウスの神経学的症状）
RAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）及び対照の野生型マウス（WT）のくも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製し、前述の修正Garcia神経学スコアを算出した。
該算出結果により、RAGEノックアウトマウスでは、SAH12時間後及び24時間後において、顕著に神経学症状が改善することが確認できた（図１）。
（脳血管攣縮の改善）
RAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）及び対照の野生型マウス（WT）のくも膜下出血（SAH）マウスモデル、並びに野生型マウスの偽手術（sham）個体をそれぞれSAH24時間後に、4%PFAによる心臓灌流固定後に、墨汁入りゼラチンを灌流することで脳底部の主幹脳動脈の攣縮血管を評価した。
該評価により、脳血管攣縮及び細動脈の総距離がRAGEノックアウトマウスにおいて顕著に改善していることが確認できた（図２）。
さらに、左側内頸動脈（ICA）の直径や左側大脳細動脈の総距離（total vascular length of left cortex）を定量化した結果、RAGEノックアウトマウスにおいて血管攣縮および細動脈走行の改善を示した（図３）。
RAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）及び対照の野生型マウス（WT）のくも膜下出血（SAH）マウスモデル、並びに野生型マウスの偽手術（sham）個体をそれぞれSAH24時間後に、4%PFAによる心臓灌流固定後に、墨汁入りゼラチンを灌流することで脳底部の主幹脳動脈の攣縮血管を評価した。
該評価により、脳血管攣縮及び細動脈の総距離がRAGEノックアウトマウスにおいて顕著に改善していることが確認できた（図２）。
さらに、左側内頸動脈（ICA）の直径や左側大脳細動脈の総距離（total vascular length of left cortex）を定量化した結果、RAGEノックアウトマウスにおいて血管攣縮および細動脈走行の改善を示した（図３）。
（SAH後のRAGE mRNA発現の評価）
野生型マウスのくも膜下出血（SAH）マウスモデル、並びに野生型マウスの偽手術（sham）個体をそれぞれSAH12時間後にRAGE mRNA発現レベルを評価した。
該評価結果により、RAGE mRNA発現は、SAH12時間後に脳動脈と大脳皮質・海馬で上昇した（図４）。
野生型マウスのくも膜下出血（SAH）マウスモデル、並びに野生型マウスの偽手術（sham）個体をそれぞれSAH12時間後にRAGE mRNA発現レベルを評価した。
該評価結果により、RAGE mRNA発現は、SAH12時間後に脳動脈と大脳皮質・海馬で上昇した（図４）。
（血管特異的RAGEノックアウトマウスにおける評価）
脳血管攣縮及びこれによる脳障害は、脳血管が発現するRAGEによるものと仮説を立てた。この仮説を検証するために、血管特異的RAGEノックアウトマウスを用いて評価した。詳しくは、対照群マウス（野生型マウスに対応するRAGEfl/fl）及び血管内皮細胞特異的RAGEノックアウトマウス（Tie2Cre RAGEfl/fl）において神経学スコアを算出し、左側内頸動脈（ICA）の直径を定量化した。
該評価結果により、意外なことに神経学的スコアと脳血管攣縮の程度に差異はないものであった。つまり、脳血管に発現するRAGEは、くも膜下出血の病態に関わらないことを確認した（図５）。
脳血管攣縮及びこれによる脳障害は、脳血管が発現するRAGEによるものと仮説を立てた。この仮説を検証するために、血管特異的RAGEノックアウトマウスを用いて評価した。詳しくは、対照群マウス（野生型マウスに対応するRAGEfl/fl）及び血管内皮細胞特異的RAGEノックアウトマウス（Tie2Cre RAGEfl/fl）において神経学スコアを算出し、左側内頸動脈（ICA）の直径を定量化した。
該評価結果により、意外なことに神経学的スコアと脳血管攣縮の程度に差異はないものであった。つまり、脳血管に発現するRAGEは、くも膜下出血の病態に関わらないことを確認した（図５）。
（炎症細胞及び免疫系における解析）
RAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）及び対照の野生型マウス（WT）のくも膜下出血（SAH）マウスモデル、並びに野生型マウスの偽手術（sham）個体において、抹消血中の白血球及び免疫系臓器においてRAGE mRNA発現レベルを評価した。
RT-qPCRによりSAH後の抹消血中の好中球及びマクロファージを含む白血球、および免疫系の臓器である脾臓、リンパ節においてRAGE mRNA発現が上昇し、また白血球において細胞骨格制御蛋白質であるRhoA及びRock1のmRNA発現も上昇することを確認した（図６）。
免疫染色したSAH後の炎症・免疫細胞を観察した。超急性期の3時間において、好中球が内頸動脈の管腔内外に集積したが、RAGEノックアウトマウスでは集積を確認できなかった（図７）。また、24時間において、内頸動脈外壁に大量の好中球が集積しているのに対して、RAGEノックアウトマウスでは殆ど集積を確認できなかった（図７）。
RAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）及び対照の野生型マウス（WT）のくも膜下出血（SAH）マウスモデル、並びに野生型マウスの偽手術（sham）個体において、抹消血中の白血球及び免疫系臓器においてRAGE mRNA発現レベルを評価した。
RT-qPCRによりSAH後の抹消血中の好中球及びマクロファージを含む白血球、および免疫系の臓器である脾臓、リンパ節においてRAGE mRNA発現が上昇し、また白血球において細胞骨格制御蛋白質であるRhoA及びRock1のmRNA発現も上昇することを確認した（図６）。
免疫染色したSAH後の炎症・免疫細胞を観察した。超急性期の3時間において、好中球が内頸動脈の管腔内外に集積したが、RAGEノックアウトマウスでは集積を確認できなかった（図７）。また、24時間において、内頸動脈外壁に大量の好中球が集積しているのに対して、RAGEノックアウトマウスでは殆ど集積を確認できなかった（図７）。
（免疫系RAGEの評価）
ドナーとして、RAGE遺伝子自体は野生型であるGFPマウス由来の骨髄細胞を、レシピエントとして野生型（WT）或いはRAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）に移植してから、くも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製した。
RAGEノックアウトマウスにおいて、神経学的スコア及び脳血管攣縮の程度が野生型と同程度まで悪化したために、炎症・免疫細胞におけるRAGEがくも膜下出血後の病態を司るということが分かった（図８、図９）。
さらに、GFPマウス由来の骨髄細胞を移植したRAGEノックアウトマウスは、免疫染色にてSAH後に好中球の集積を引き起こしたことを確認した（図１０）。
本実施例の結果により、脳血管攣縮及びこれによる脳障害は、骨髄由来の免疫細胞のRAGEに起因することを確認した。
ドナーとして、RAGE遺伝子自体は野生型であるGFPマウス由来の骨髄細胞を、レシピエントとして野生型（WT）或いはRAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）に移植してから、くも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製した。
RAGEノックアウトマウスにおいて、神経学的スコア及び脳血管攣縮の程度が野生型と同程度まで悪化したために、炎症・免疫細胞におけるRAGEがくも膜下出血後の病態を司るということが分かった（図８、図９）。
さらに、GFPマウス由来の骨髄細胞を移植したRAGEノックアウトマウスは、免疫染色にてSAH後に好中球の集積を引き起こしたことを確認した（図１０）。
本実施例の結果により、脳血管攣縮及びこれによる脳障害は、骨髄由来の免疫細胞のRAGEに起因することを確認した。
（parabiosisにおける評価）
野生型（WT）及びRAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）に野生型GFPマウスを並体接合即ちparabiosisを行うことで末梢循環を共有した上でくも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製し、解析した。該解析結果では、RAGEノックアウトマウスは脳血管攣縮の改善が認められなかった（図１１）。これは骨髄移植実験の結果（図９）に合致した。
本実施例の結果により、免疫系のRAGEがSAH後の脳血管攣縮に関与することを確認した。
野生型（WT）及びRAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）に野生型GFPマウスを並体接合即ちparabiosisを行うことで末梢循環を共有した上でくも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製し、解析した。該解析結果では、RAGEノックアウトマウスは脳血管攣縮の改善が認められなかった（図１１）。これは骨髄移植実験の結果（図９）に合致した。
本実施例の結果により、免疫系のRAGEがSAH後の脳血管攣縮に関与することを確認した。
（好中球特異的RAGEノックアウトマウスにおける評価）
好中球特異的RAGEノックアウトマウスを用いてくも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製し、神経学的症状を評価した。
対照群マウス（野生型マウスに対応するRAGEfl/fl）及び好中球特異的RAGEノックアウトマウス（LysMCre RAGEfl/fl）において神経学スコアを算出し、左側内頸動脈（ICA）の直径を定量化した。
該評価結果により、好中球特異的RAGEノックアウトマウスは、対称群と比較して神経症状及び脳血管攣縮が改善した（図１２）。
以上により、SAH後の脳血管攣縮及びこれによる脳障害は、免疫系細胞の中でも特に好中球のRAGEに起因することを確認した。尚、攣縮血管に集積する細胞の殆どは好中球である（図７）が、LysMはマクロファージにも発現するためマクロファージのRAGEも同病態に関わる可能性がある。
好中球特異的RAGEノックアウトマウスを用いてくも膜下出血（SAH）マウスモデルを作製し、神経学的症状を評価した。
対照群マウス（野生型マウスに対応するRAGEfl/fl）及び好中球特異的RAGEノックアウトマウス（LysMCre RAGEfl/fl）において神経学スコアを算出し、左側内頸動脈（ICA）の直径を定量化した。
該評価結果により、好中球特異的RAGEノックアウトマウスは、対称群と比較して神経症状及び脳血管攣縮が改善した（図１２）。
以上により、SAH後の脳血管攣縮及びこれによる脳障害は、免疫系細胞の中でも特に好中球のRAGEに起因することを確認した。尚、攣縮血管に集積する細胞の殆どは好中球である（図７）が、LysMはマクロファージにも発現するためマクロファージのRAGEも同病態に関わる可能性がある。
（好中球の血餅へのトランスウェル遊走アッセイ）
上層の皿にLPS刺激をした野生型（WT）マウス及びRAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）由来の1×105個の好中球、又はIgG、抗HMGB1中和抗体(αHMGB1、HMGB1に対する阻害効果を持った抗体)、溶媒（Vehicle）若しくはCompound 11（RAGEi C11）を添加した1×105個の野生型好中球を撒き、下層の皿に血腫を置き、トランスウェル遊走アッセイを行った。
RAGEノックアウトマウスの好中球の血腫への遊走は、野生型マウスの好中球とは異なり、抑制された（図１３）。
トランスウェルアッセイの結果、血腫（clot）への移動が、RAGEノックアウトマウス、抗HMGB1中和抗体（αHMGB1）を添加した野生型マウス、Compound 11を添加した野生型マウスの好中球（多形核細胞（PMN））では阻害された（図１４）。
また、移動した好中球（多形核細胞）における好中球細胞外トラップによる細胞死（Netosis）が、RAGEノックアウトマウス、抗HMGB1中和抗体（αHMGB1）を添加した野生型マウス、Compound 11を添加した野生型マウスの好中球において阻害された（図１５）。
これらの結果から、好中球はRAGEに依存して血腫に遊走し、Netosisを起こし、この好中球の遊走およびNetosisはRAGEのリガンドであるHMGB1の阻害、及びRAGE阻害剤Compound 11により抑制されることを確認した。
上層の皿にLPS刺激をした野生型（WT）マウス及びRAGEノックアウトマウス（RAGE-/-）由来の1×105個の好中球、又はIgG、抗HMGB1中和抗体(αHMGB1、HMGB1に対する阻害効果を持った抗体)、溶媒（Vehicle）若しくはCompound 11（RAGEi C11）を添加した1×105個の野生型好中球を撒き、下層の皿に血腫を置き、トランスウェル遊走アッセイを行った。
RAGEノックアウトマウスの好中球の血腫への遊走は、野生型マウスの好中球とは異なり、抑制された（図１３）。
トランスウェルアッセイの結果、血腫（clot）への移動が、RAGEノックアウトマウス、抗HMGB1中和抗体（αHMGB1）を添加した野生型マウス、Compound 11を添加した野生型マウスの好中球（多形核細胞（PMN））では阻害された（図１４）。
また、移動した好中球（多形核細胞）における好中球細胞外トラップによる細胞死（Netosis）が、RAGEノックアウトマウス、抗HMGB1中和抗体（αHMGB1）を添加した野生型マウス、Compound 11を添加した野生型マウスの好中球において阻害された（図１５）。
これらの結果から、好中球はRAGEに依存して血腫に遊走し、Netosisを起こし、この好中球の遊走およびNetosisはRAGEのリガンドであるHMGB1の阻害、及びRAGE阻害剤Compound 11により抑制されることを確認した。
本実施例では、Compound 11（C11）のくも膜下出血（SAH）後の神経機能の改善の確認、脳血管攣縮抑制作用の確認、さらには該作用の機構を確認した。
C11を5 mg/kgの量にて、野生型マウスにSAHを作製と同時に、そしてSAH作製後12時間と２回腹腔内投与した。対照群の野生型マウスには溶媒のエタノール・ピーナッツオイル混合液を腹腔内投与した。そして同マウスの評価を行った結果、C11の投与がSAH後の神経学スコア及び脳血管攣縮を改善することを確認した（図１６）。
以上図１３～図１６の結果により、C11は、RAGEシグナルの抑制を介し、くも膜下出血の軽減効果、脳血管攣縮の軽減効果及び神経機能の改善効果を有することを確認した。
C11を5 mg/kgの量にて、野生型マウスにSAHを作製と同時に、そしてSAH作製後12時間と２回腹腔内投与した。対照群の野生型マウスには溶媒のエタノール・ピーナッツオイル混合液を腹腔内投与した。そして同マウスの評価を行った結果、C11の投与がSAH後の神経学スコア及び脳血管攣縮を改善することを確認した（図１６）。
以上図１３～図１６の結果により、C11は、RAGEシグナルの抑制を介し、くも膜下出血の軽減効果、脳血管攣縮の軽減効果及び神経機能の改善効果を有することを確認した。
（骨髄由来好中球及びマクロファージを用いたRhoプルダウンアッセイ）
C57BL/6Jバックグラウンドの野生型およびRAGEノックアウトマウスを用い、骨髄からヒストパック（メルク）による濃度勾配遠心分離により好中球及びマクロファージを分離した。そして分離した好中球およびマクロファージにLPS刺激を1時間加え、Rhoプルダウンアッセイキット（メルク）を用いて活性化型Rhoシグナルを検出した。
LPS刺激を加えた好中球及びマクロファージの活性化型RhoをRhotekin RBD Agarose Beasds（Rhoと結合する蛋白質であるRhotekinのRho結合領域RBDが付いたアガロースビーズ）を用いたウェスタンブロットで検出したところ、図１７に示すように野生型（WT）好中球（PMN）で発現上昇していたのに対して、RAGEノックアウト（RAGE-/-）好中球では発現が顕著に低下していた。
また同様の傾向をマクロファージ（MN）でも認めたが野生型の発現自体は好中球より低かった。これらのことから活性化好中球及びマクロファージでは、RAGEの下流シグナル分子として細胞内のRhoが活性化されていると考えられる。
現在くも膜下出血（SAH）後の脳血管攣縮予防薬として臨床において頻用されている塩酸ファスジルがある。この薬剤は、血管平滑筋のRhoの上流分子Rhoキナーゼを標的とすると考えられている。実際にはSAH発症数日後に投与される塩酸ファスジルだが、顕著に患者予後を改善するという結論は得られていない。
本実施例では、従来の脳血管攣縮予防薬の治療機序とは異なる早い病日（特に、５時間以内、１５時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、６２時間以内）での好中球のRAGE/Rhoシグナルを標的とすることができるので、従来の予防薬と比較して優れた脳血管攣縮治療法となり得ることができる。
加えて、Rhoと同じくRhoファミリー低分子G蛋白質であるRac及びCdc42もRhoと同じ挙動を示すと考えられるので、好中球及び／若しくはマクロファージのRac及びCdc42のシグナルも脳血管攣縮の治療標的となりうる。
C57BL/6Jバックグラウンドの野生型およびRAGEノックアウトマウスを用い、骨髄からヒストパック（メルク）による濃度勾配遠心分離により好中球及びマクロファージを分離した。そして分離した好中球およびマクロファージにLPS刺激を1時間加え、Rhoプルダウンアッセイキット（メルク）を用いて活性化型Rhoシグナルを検出した。
LPS刺激を加えた好中球及びマクロファージの活性化型RhoをRhotekin RBD Agarose Beasds（Rhoと結合する蛋白質であるRhotekinのRho結合領域RBDが付いたアガロースビーズ）を用いたウェスタンブロットで検出したところ、図１７に示すように野生型（WT）好中球（PMN）で発現上昇していたのに対して、RAGEノックアウト（RAGE-/-）好中球では発現が顕著に低下していた。
また同様の傾向をマクロファージ（MN）でも認めたが野生型の発現自体は好中球より低かった。これらのことから活性化好中球及びマクロファージでは、RAGEの下流シグナル分子として細胞内のRhoが活性化されていると考えられる。
現在くも膜下出血（SAH）後の脳血管攣縮予防薬として臨床において頻用されている塩酸ファスジルがある。この薬剤は、血管平滑筋のRhoの上流分子Rhoキナーゼを標的とすると考えられている。実際にはSAH発症数日後に投与される塩酸ファスジルだが、顕著に患者予後を改善するという結論は得られていない。
本実施例では、従来の脳血管攣縮予防薬の治療機序とは異なる早い病日（特に、５時間以内、１５時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、６２時間以内）での好中球のRAGE/Rhoシグナルを標的とすることができるので、従来の予防薬と比較して優れた脳血管攣縮治療法となり得ることができる。
加えて、Rhoと同じくRhoファミリー低分子G蛋白質であるRac及びCdc42もRhoと同じ挙動を示すと考えられるので、好中球及び／若しくはマクロファージのRac及びCdc42のシグナルも脳血管攣縮の治療標的となりうる。
（好中球エラスターゼ阻害剤のマウス投与実験）
好中球エラスターゼ阻害剤（NE(=neutrophil elastase)阻害剤）であるSivelestat (sodium salt hydrate) (既に全身性炎症反応症候群に伴う急性肺障害の治療目的にて臨床適応されている)(Cayman Chemical Companyより購入) を25 mg/kgの量にて野生型マウスにくも膜下出血（SAH）作製と同時に、そしてSAH作製後6時間と2回腹腔内投与した。対照群の野生型マウスには溶媒のPBSのみを腹腔内投与した。そしてSAH後12時間、24時間の神経学スコアを計測し、24時間後に4%PFAを心臓灌流して固定し、墨汁入りゼラチンを引き続き灌流して脳底部の主幹脳動脈の攣縮を観察、評価した。
NE阻害剤を投与したマウス群では、Vehicle(溶媒)投与群に比べて神経学スコアが改善し（図１８左図）、脳血管攣縮の程度が軽減された（図１８右図）。したがって、好中球のNEを介して、脳血管攣縮および脳損傷を誘導していることが示唆された。
これにより、NE阻害作用を有する物質（NE阻害剤）は、くも膜下出血の治療剤（軽減剤）、脳血管攣縮の抑制剤および神経機能の改善剤となる。
好中球エラスターゼ阻害剤（NE(=neutrophil elastase)阻害剤）であるSivelestat (sodium salt hydrate) (既に全身性炎症反応症候群に伴う急性肺障害の治療目的にて臨床適応されている)(Cayman Chemical Companyより購入) を25 mg/kgの量にて野生型マウスにくも膜下出血（SAH）作製と同時に、そしてSAH作製後6時間と2回腹腔内投与した。対照群の野生型マウスには溶媒のPBSのみを腹腔内投与した。そしてSAH後12時間、24時間の神経学スコアを計測し、24時間後に4%PFAを心臓灌流して固定し、墨汁入りゼラチンを引き続き灌流して脳底部の主幹脳動脈の攣縮を観察、評価した。
NE阻害剤を投与したマウス群では、Vehicle(溶媒)投与群に比べて神経学スコアが改善し（図１８左図）、脳血管攣縮の程度が軽減された（図１８右図）。したがって、好中球のNEを介して、脳血管攣縮および脳損傷を誘導していることが示唆された。
これにより、NE阻害作用を有する物質（NE阻害剤）は、くも膜下出血の治療剤（軽減剤）、脳血管攣縮の抑制剤および神経機能の改善剤となる。
（esRAGEマウスを用いた実験）
内在性のRAGE阻害タンパク質である分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE; esRAGE)を強制発現するトランスジェニックマウスのesRAGEマウスを金沢大学山本靖彦教授から分与を受けた。野生型マウスとesRAGEマウスを用いてくも膜下出血（SAH）を作製した。そしてSAH後12時間、24時間の神経学スコアを計測し、24時間後に4%PFAを心臓灌流して固定し、墨汁入りゼラチンを引き続き灌流して脳底部の主幹脳動脈の攣縮を観察、評価した。
esRAGEマウス群では、野生型マウス群に比べて神経学スコアが改善し（図１９左図）、脳血管攣縮の程度が軽減された（図１９右図）。すなわち、分泌型RAGEによりRAGEを阻害することでマウスにおける治療効果があることが確認された。
これにより、RAGE阻害作用を有する物質（RAGE阻害剤）は、くも膜下出血の治療剤（軽減剤）、脳血管攣縮の抑制剤および神経機能の改善剤となる。
内在性のRAGE阻害タンパク質である分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE; esRAGE)を強制発現するトランスジェニックマウスのesRAGEマウスを金沢大学山本靖彦教授から分与を受けた。野生型マウスとesRAGEマウスを用いてくも膜下出血（SAH）を作製した。そしてSAH後12時間、24時間の神経学スコアを計測し、24時間後に4%PFAを心臓灌流して固定し、墨汁入りゼラチンを引き続き灌流して脳底部の主幹脳動脈の攣縮を観察、評価した。
esRAGEマウス群では、野生型マウス群に比べて神経学スコアが改善し（図１９左図）、脳血管攣縮の程度が軽減された（図１９右図）。すなわち、分泌型RAGEによりRAGEを阻害することでマウスにおける治療効果があることが確認された。
これにより、RAGE阻害作用を有する物質（RAGE阻害剤）は、くも膜下出血の治療剤（軽減剤）、脳血管攣縮の抑制剤および神経機能の改善剤となる。
（総論）
本実施例１～７の結果により、くも膜下出血後の脳血管攣縮の起因は、以下であると考える（参照：図２０）。
１）DAMPsは脳動脈瘤の破裂によりできた血腫から放出される。
２）骨髄又は血液中の好中球及び／又はマクロファージのRAGEがDAMPsと結合する。
３）DAMPsと結合した好中球及び／又はマクロファージは活性化し、脳血管へ遊走する。
４）脳血管へ遊走した好中球及び／又はマクロファージは脳血管攣縮を引き起こす。
これにより、上記１）～４）のいずれかの工程を阻害する物質は、くも膜下出血の抑制剤又は治療剤、くも膜下出血後の脳血管攣縮の抑制剤又は治療剤、及び、くも膜下出血後の神経機能の改善剤又は治療剤となり得る。
本実施例１～７の結果により、くも膜下出血後の脳血管攣縮の起因は、以下であると考える（参照：図２０）。
１）DAMPsは脳動脈瘤の破裂によりできた血腫から放出される。
２）骨髄又は血液中の好中球及び／又はマクロファージのRAGEがDAMPsと結合する。
３）DAMPsと結合した好中球及び／又はマクロファージは活性化し、脳血管へ遊走する。
４）脳血管へ遊走した好中球及び／又はマクロファージは脳血管攣縮を引き起こす。
これにより、上記１）～４）のいずれかの工程を阻害する物質は、くも膜下出血の抑制剤又は治療剤、くも膜下出血後の脳血管攣縮の抑制剤又は治療剤、及び、くも膜下出血後の神経機能の改善剤又は治療剤となり得る。
Claims (11)
- くも膜下出血後の脳血管攣縮における骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化又は脳動脈への遊走を阻害する化合物を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 前記脳血管攣縮がくも膜下出血後24時間以内の脳血管攣縮である、請求項１に記載のくも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の脳血管攣縮である、請求項３に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化に起因する、請求項４に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 前記脳血管攣縮はくも膜下出血後の骨髄又は血液中の好中球及び／若しくはマクロファージの脳動脈への遊走に起因する、請求項４に記載の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、くも膜下出血後の好中球及び／若しくはマクロファージの活性化抑制剤又は脳動脈への遊走抑制剤。
- 下記式（１）で表される化合物又は薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、くも膜下出血の治療剤。
- 好中球エラスターゼ阻害作用を有する物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
- 以下のいずれか１以上の物質を有効成分として含む、くも膜下出血後の脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤。
（１）Pyrazole-5-carboxamides
（２）soluble RAGE
（３）FPS-ZM1
（４）4,6-bisphenyl-2-(3-alkoxyanilino)pyrimidine
（５）Azeliragon
- 以下のいずれか１以上の物質を判定することを特徴とする、脳血管攣縮抑制剤又は神経機能治療剤のスクリーニング方法。
（１）RAGEとDIAPH1の結合を阻害する物質を判定する
（２）好中球及び／若しくはマクロファージの遊走又は活性化を阻害する物質を判定する
（３）好中球のエラスターゼ活性を阻害する物質を判定する
（４）RAGEの活性を阻害する物質を判定する
（５）DAMPsとRAGEの結合を阻害する物質を判定する
（６）RAGEからRhoの活性化を阻害する物質を判定する
（７）RAGEに依存したNETosisを抑制する物質を判定する
（８）Racの活性化を阻害する物質を判定する
（９）Cdc42の活性化を阻害する物質を判定する
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| WO2017184547A1 (en) * | 2016-04-18 | 2017-10-26 | New York University | Quinoline compounds as modulators of rage activity and uses thereof |
-
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM, 第62回 日本脳循環代謝学会学術集会プログラム・抄録号, vol. 31, no. 1, JPN6025017044, 2019, pages 131, ISSN: 0005583093 * |
| SCI. REP., vol. 6, JPN6024037271, 2016, pages 37755, ISSN: 0005583097 * |
| SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, no. 22450, JPN6025017045, 2016, pages 1 - 13, ISSN: 0005583094 * |
| 岐歯学誌, vol. 44, no. 2, JPN6025017048, 2018, pages 145 - 158, ISSN: 0005583095 * |
| 日薬理誌, vol. 151, [1], JPN6024037270, 2018, pages 4 - 8, ISSN: 0005583096 * |
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