JP2021528138A

JP2021528138A - 架橋ポリマーを含むヒドロゲル組成物

Info

Publication number: JP2021528138A
Application number: JP2020569861A
Authority: JP
Inventors: プリンツ，マルティン; ホラース，ラルフ; ザクセンホーファー，ロベルト
Original assignee: クロマ−ファーマゲゼルシャフトエム．ベー．ハー．
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-10-21
Also published as: EP3806917B1; US12297346B2; BR112020024654B1; MX2020013006A; KR20210021361A; US20210261760A1; BR112020024654A2; IL279447B1; CN112334166A; IL279447A; CA3101408A1; EP3806917A1; WO2019238953A1; IL279447B2; MA52876A; AR115549A1; AR117592A1

Abstract

架橋ポリマーを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、架橋ポリマーがチオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物であり、チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約８０μｍｏｌ超のチオール部分によるヒアルロナンの修飾度を有し、チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約２８０μｍｏｌ未満のチオール部分によるヒアルロナンの修飾度を有し、チオール修飾ヒアルロナンが、少なくとも４００ｋＤａの平均分子量を有する、組成物。【選択図】図１

Description

本発明は、架橋ポリマーを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、架橋ポリマーがチオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物である、組成物、ならびにその使用およびそれを製造する方法に関する。

ヒアルロン酸およびその塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムとも称される、ＨＡと省略されるヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる繰り返し二糖を含む、天然に存在するアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。

高分子量のヒアルロナンは、皮膚に天然に存在し、その粘弾性の特性について、またその非常に高い水を吸収する傾向について知られている。その特性は、皮膚の弾性に大きく貢献する。生体適合性、耐性および毒性の欠如のその特性およびその品質を考えると、この化合物は、したがって、医療および美容分野、特に審美的手技における多くの用途で１０年以上も利用されてきた。例えば、ヒアルロナンは、検討中の領域の真皮への直接注射によりしわを充填するために用いられる（真皮充填剤としての使用）。

生物発酵由来の高度に精製された非修飾ＨＡは完全に生体適合性であり、内因性ヒアルロナンと同一である。しかし、ＨＡは、生体組織と高度に適合性であり、水に対して高い親和性を有し、強力な保湿機能を果たすという利点を有するにもかかわらず、十分な生体力学的特性を有していない。ＨＡが皮膚組織に注射されると、生体組織に存在するヒアルロニダーゼ（酵素分解）と遊離ラジカル（化学分解）の両方による急速なインビボ分解が起こる。

ＨＡのインビボ分解を減速するため、ならびにその化学的、物理的および生物学的特性を修正し、さらに、貯蔵中の分解、加熱およびしたがって滅菌に対する製剤の抵抗性を高めるために、数多くの解決策が提案された。

これらの手法は、典型的には、例えば、化学的、酵素的または光化学的手段によるＨＡの架橋を含む、ＨＡの化学修飾を伴う。これらの架橋ヒアルロナンゲルは、様々な調製方法により得ることができる。一般に、これらの方法は、２つの主工程を必要とし、第１の工程は、ヒアルロナンを水和して、これを水溶液（ヒドロゲル）に変換することからなり、第２の工程は、その架橋を誘導することができる作用剤(「架橋剤」とも称される)の存在下で、前記水溶液のＨＡ分子を架橋させることを目的とする。架橋剤の例としては、ホルムアルデヒド、ジビニルスルホン、ビスカルボジイミドおよびエポキシドが挙げられる。

真皮充填剤の製造のため、架橋剤は、最も一般的にはエポキシド、例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）または１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、アルデヒド、またはポリビニルスルホン、例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）から選択され、したがって本質的に合成物質である。

残念なことに、化学修飾は、当然ながら免疫原性が低く、毒性のない非修飾ＨＡでは観察されない副作用および異物反応をもたらす。市販のＨＡの大部分において、軟部組織充填剤ＢＤＤＥが架橋剤として用いられる。ＢＤＤＥ中に存在するエポキシド基の反応性により、真皮充填剤に残留する未反応ＢＤＤＥは遺伝毒性効果を有し得る。したがって、真皮充填剤中のＢＤＤＥはわずかな量（百万分の２未満）で維持されねばならず、したがって高価な追加の精製および試験手順が製造時に必要とされる。ＢＤＤＥ架橋充填剤の安全プロファイルは、長期間の臨床経験によって支持されているが（ＤｅＢｏｕｌｌｅ、Ｇｌｏｇａｕら、２０１３、Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆ１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌｅｔｈｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｄｅｒｍａｌｆｉｌｌｅｒｓ、ＤｅｒｍａｔｏｌＳｕｒｇ（３９）：１７５８〜１７６６）、ＢＤＤＥは、依然としていくつかの安全性の懸念を提起し得る（Ｃｈｏｉ，Ｙｏｏら、２０１５、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｂｙｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇａｇｅｎｔｓ、ＪＢｉｏｍｅｄＭａｔｅｒＲｅｓＰａｒｔＡ（１０３Ａ）：３０７２〜３０８０）。

ＢＤＤＥと関連する遺伝毒性リスクにより、患者の生涯にわたって投与され得る、Ｊｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）などの真皮充填剤製品の年間用量は、年間２０ｍＬに制限される。市販の真皮充填剤製品Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）の投与は、１投与あたり６ｍＬの量に制限される。同様の制限がＤＶＳ架橋ヒアルロナンを含む真皮充填剤に適用される。

化学修飾の別の問題は、所望の架橋度を得るために架橋反応中にヒアルロナンを曝露しなければならない過酷な反応条件、例えば、アルカリ性ｐＨ値および高温（５０℃超）の必要性である。酸性（ｐＨ４未満）またはアルカリ性ｐＨ（ｐＨ１０超）への曝露中の加水分解による分解により、ＨＡの分子量が低下することが知られている。さらに、ヒアルロナンは、４０℃超の高温で分解される（Ｔｒｏｎｃｏｓｏら、２０１６、ＡｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＨｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄａｔｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ＳｔｕｄｅｎｔＴｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐ：／／ｕｕ．ｄｉｖａ−ｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｓｍａｓｈ／ｇｅｔ／ｄｉｖａ２：９５４３７２／ＦＵＬＬＴＥＸＴ０１．ｐｄｆからオンラインでアクセス；Ｓｔｅｒｎら、２００７．Ｔｈｅｍａｎｙｗａｙｓｔｏｃｌｅａｖｅｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ（２５）：５３７〜５５７；ＴｏｋｉｔａおよびＯｋａｍｏｔｏ、１９９６、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ−ｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｙａｎｄｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．（３２）：１０１１〜１０１４）。約２００ｋＤａ未満の分子量を有する低分子量ヒアルロナンフラグメントは炎症誘発作用を有することがさらに知られている（Ｎａｏｒ、２０１６、論説：ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＢｅｔｗｅｅｎＨｙａｌｕｒｏｎｉｃＡｃｉｄａｎｄＩｔｓＲｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＤ４４，ＲＨＡＭＭ）ＲｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄＣａｎｃｅｒ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７：３９；Ｍｏｎｓｌｏｗら、２０１５、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｗｅｅｔｓｐｏｔｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：２３１）。

ジスルフィド架橋ヒアルロナンヒドロゲルは、最初にＳｈｕら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ３、１３０４〜１３１１、２００２）により記載された。

チオール修飾ヒアルロナン（ＨＡ−ＳＨ）のジスルフィド架橋誘導体は、自己架橋機構により得られ得る。架橋ヒアルロナンポリマーのネットワークは、チオール基間のジスルフィド結合の形成に基づき確立する（ＨＡ−Ｓ−Ｓ−ＨＡ）。ジスルフィド結合を形成するチオール基は、共通のＨＡ骨格分子または隣接するＨＡ分子のペンダント基を結合し得る。すなわち、架橋は、各々分子内または分子間架橋であり得る。遊離チオール基からのジスルフィド結合の形成は、遍在する酸素により、または酸化剤を添加すると自然に生じ得る酸化反応である。

ＷＯ２００４／０３７１６４では、３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）（ＤＴＰ）または４，４’−ジチオビス（酪酸ジヒドラジド）（ＤＴＢ）で修飾したヒアルロナンがさらに研究された。架橋のための、ジスルフィド形成およびジメタクリル酸ポリエチレングリコールなどのチオール反応剤の使用により得られるゲルを、組織工学におけるその可能性について、すなわち移植のための細胞増殖および培養のための足場として評価した。ＷＯ２００５／０５６６０８においては、チオール化ヒドラジド修飾カルボキシメチルヒアルロナンを架橋させてマクロ分子細胞足場を得るために、同じ技術が採用された。Ｓｅｒｂａｎらは、２−チオエチルエーテルヒアルロナン誘導体の合成について記載しているが（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２９、１３８８〜１３９９；２００８）、これは調査された架橋剤による架橋には適さなかった。ＥＰ２１０３６３１は、チオール基がヒドラジドカップリング方法によって導入される、ヒアルロン酸を含むチオール修飾マクロ分子、およびその架橋生成物について記載している。架橋生成物は、架橋剤を用いてまたはジスルフィド形成のいずれかにより得られる。

チオール化ヒアルロン酸の合成、ならびに薬物送達、創傷治癒および組織修復におけるその潜在的な使用も、Ｋａｆｅｄｊｉｓｋｉら（ＩｎｔＪＰｈａｒｍ３４３、４８〜５８；２００７）に記載された。ＣＮ１０１３６７８８４Ａは、遊離チオール基とジスルフィド基の両方を含む、ＨＡ−システアミンコンジュゲートの合成について開示している。ＥＰ２６１４８２８は、修飾度の低いチオール修飾生体適合性ポリマー誘導体およびその架橋材料について記載している。ＷＯ２００８／０７７１７２は、組織増強のためのチオール化ヒアルロン酸について記載している。一例において、ＷＯ２００８／０７７１７２は、２ｇのチオール基含有ヒアルロン酸（チオール修飾ヒアルロナン）を含む滅菌ヒドロゲル製剤の皮内投与について記載しており、チオール基含有ヒアルロン酸により形成されるデポーは、２週間にわたって触覚によって検知可能であったが、文書では、この例で使用したチオール修飾ヒアルロナンの具体的な特徴については言及されていない。

高度に架橋されたヒアルロナンおよび／もしくは大粒子を含み、かつ／または高分子量ヒアルロナンで作られており、かつ／または高濃度で架橋ヒアルロナンを含有する、高弾性（剛性または厚さとも称される）のヒアルロナンベースの軟部組織充填剤が体内で長持ちする（最大６カ月以上）傾向にあることは周知の事実である。高剛性（弾性）の軟部組織充填剤は、鼻唇溝のような顔の領域を補正するため、顔のボリュームを回復するためおよび顔の輪郭を整えるため、深いしわおよび溝を補正するため、ならびに、例えば、顔面脂肪委縮、衰弱性瘢痕または形態学的非対称性の治療に良好に用いられる。これらの軟部組織充填剤は、皮下、骨膜上または真皮深層部に注射される。高弾性の「硬い」ヒドロゲルの注射には、高いルーメンを有する針、すなわち、低ゲージ値（例えば、２１Ｇ、２３Ｇまたは２６Ｇ）を特徴とする太い針が一般に必要とされる。

また、ヒアルロナンベースの軟部組織充填剤は、以下の特徴：
− 低粘度および／または低弾性、
− ゼロまたは適度な架橋度、
− 粒子が全く存在しない、または小粒子のみ、
− 低分子量ヒアルロナン
− 低濃度の架橋ヒアルロナン
の１つまたは複数を示す場合、体内滞留時間が短いことが一般に認められている。

同時に、これらの比較的「滑らか」で低粘度のヒドロゲルは、細い針、すなわち高ゲージ値（例えば、２７Ｇ〜３２Ｇ）の針から注射できる。敏感な皮膚領域（例えば、眼窩周囲領域、外陰膣領域、口周囲領域および唇）または全皮膚領域（例えば、手の甲）における小じわ、しわおよび表皮の欠陥の治療には、これらの領域における塊または隆起の形成を回避するために「滑らかな」真皮充填剤製品の使用が必要とされる。複数回の少量の注射が、結果を得るのに必要とされ得るため、ヒドロゲルは、細い針（例えば、２９Ｇ、３０Ｇまたは３２Ｇ針）から容易に注射されて、患者の不快感、出血および皮下出血を最小限に抑える必要がある（Ｌｉｍ，ＡｄｒｉａｎＣ．、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｆｉｌｌｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈａ３１−ｇａｕｇｅｉｎｓｕｌｉｎｓｙｒｉｎｇｅ、ＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１０）５１、７４〜７５）。

効果の持続時間が短いため、小じわの外観を改善するための現在の注射可能な治療の選択肢では、複数回の治療セッション（例えば、３週間隔で３回の治療セッションまたは４週間隔で２回の治療セッション、次いで２カ月ごとの治療の継続）が必要とされる。高いゲージの針（すなわち、細い針）から容易に注射され、また体内で長時間の持続時間を有するヒアルロナンベースの軟部組織充填剤の開発は困難であることが証明された。

本発明の発明者らは、軟部組織充填剤としての自己架橋チオール修飾ヒアルロナンの可能性を試験した。しかし、自己架橋チオール修飾ヒアルロナンベースのヒドロゲル製剤の初期インビボ試験では、移植物の２カ月未満の短い滞留時間が示された。小じわの治療のための２つの市販の真皮充填剤製品を試験した場合にも、同様の知見が得られた。

したがって、本発明の目的は、とりわけ滑らかな軟部組織充填剤としての投与に関して改善された特性を有し、細い針から注射可能である、架橋ポリマーを含む組成物であって、架橋ポリマーが、チオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物である、組成物を提供することである。

本発明は、架橋ポリマーを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、
架橋ポリマーが、チオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物であり、
チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約８０μｍｏｌ超、好ましくはポリマー１ｇあたり約１０５μｍｏｌ超、より好ましくはポリマー１ｇあたり約１２０μｍｏｌ超のチオール基による修飾度を有し、
チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約２８０μｍｏｌ未満、好ましくはポリマー１ｇあたり約２４０未満、より好ましくはポリマー１ｇあたり２００μｍｏｌ未満のチオール基による修飾度を有し、
チオール修飾ヒアルロナンが、少なくとも約４００ｋＤａ、好ましくは少なくとも約５００ｋＤａ、より好ましくは少なくとも約６００ｋＤａの平均分子量（ＭＭＷ）を有する、
組成物を提供する。

本発明による滅菌ヒドロゲル組成物は、チオール基を有する修飾ヒアルロナンベースのヒドロゲルであり（ＨＡ−ＳＨ）、ヒアルロナンは、修飾ヒアルロナンのチオール基間のジスルフィド結合により架橋されている（チオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物）。酸化生成物は、非修飾ヒアルロナン部分および修飾ヒアルロナン部分からなるコポリマーであり、後者は、ジスルフィド結合により結合される。ヒドロゲルは、任意の追加の外部二官能性架橋剤、例えば、ジビニルスルホンを含まない。ヒドロゲル組成物は、ポリマー１ｇあたりチオール基約８０μｍｏｌからポリマー１ｇあたりチオール基約２８０μｍｏｌの初期修飾度を有するチオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物を含むことを特徴とする。

本発明者らは、チオール基によるヒアルロナンの修飾度が、滅菌ヒドロゲルのインビボ滞留時間に影響を与える重要な特徴であることを見出した。軟部組織充填剤について、移植されたヒドロゲルが、移植部位に長時間にわたって残留し、したがって徐々に分解することで持続的な効果を得ることが所望される。架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物は、軟部組織充填剤として、単一の治療セッションのみの後、長時間の持続時間、例えば、少なくとも約３カ月間作用するので、効果の持続時間を維持するために治療を複数回繰り返す必要がなくなる。

滅菌ヒドロゲル組成物のインビボ性能を特徴付ける試験を、以下の実施例８および９に例示する。出発点に対する％でのデポー体積は、投与量における潜在的な差異を補正するように計算される。ｔ＝０（移植直後）のデポー体積は、１００％に相当する。デポー体積は、例えば、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンによってモニターされ得る。好ましくは動物モデルにおいて決定された生物学的パラメーターとしてのデポー体積は、個人差が大きいことが理解されるであろう。したがって、個々のデータ点は情報価値が低く、平均値（複数の投与部位および／または複数の研究対象を検討）からしか決定的なデータが得られない。当然ながら、性能は、移植部位の組織型、デポー体積を測定するために使用した方法、および被験生物の種などの要因にさらに依存する。例えば、ヒトにおける投与についてのデータの定量的転送性は制限され得る。しかし、ラットのデータに匹敵する結果が、マウスにおける別のインビボ試験で観察された（データは図示せず）。したがって、インビボ特性評価は、個々のヒドロゲル組成物を互いに対して評価および比較するのに有用な手段を提供する。滞留時間は、期間中検出可能なデポーの存在、好ましくは、期間中約５０％（またはさらにそれ以上）の平均相対デポー体積の存在を示すパラメーターとして用いられ得る。好ましくは、約５０％（またはそれ以上）の相対デポー体積は、単回投与後最初の３〜４週間、より好ましくは最大３カ月以上検出可能である。本発明によるヒドロゲル組成物は、例示した試験条件下で注射後７週間（５２日目に測定）の滞留時間を示した。したがって、本発明によるヒドロゲル組成物は、所望されるインビボ性能を示し、例えば、ヒトにおける軟部組織充填剤としての適用性が期待できる。さらに、架橋ポリマーの性質は、好ましい毒性学的に安全なプロファイルを提供し、他の安定化されたヒアルロナン充填剤と比較して大量（１投与あたり５０ｍＬ超）に投与できる。

ヒドロゲル組成物のインビボ性能に影響を与える最も重大なパラメーターは、「チオール基による修飾度」であり、これは、チオール修飾ヒアルロナン１グラム（ｇ）あたりのチオール基の初期量（典型的にはμｍｏｌで示される）を示し、ＤｏＭと省略される。このチオール基の量は、チオール修飾ヒアルロナン原料の特徴であり、組成物の製造プロセスで架橋に利用できるチオール基の量を示す。チオール基またはチオール部分は、メルカプトまたはスルフヒドリル基とも称され得る。様々な実施例に基づき、本発明者らは、修飾度の最適な範囲をポリマー１ｇあたり約８０μｍｏｌ〜ポリマー１ｇあたり約２８０μｍｏｌと同定した。一方で、ボリューム増大効果を移植後１２週間超有する組成物を製造するためには、ポリマー１ｇあたり８０μｍｏｌ超の修飾度が必要であった。驚くべきことに、他方では、高い修飾度を有するチオール修飾ヒアルロナンを使用すると、８４日後、デポー体積が減少した（例えば、実施例９、ＩＤ１０に示すようにポリマー１ｇあたり約３５０μｍｏｌ）。したがって、チオール基によるチオール修飾ヒアルロナンの初期修飾度は、ポリマー濃度とポリマー分子量との相互関係において、滅菌ヒドロゲル組成物のレオロジーおよびインビボ特性に影響を与える、重大な要因として同定された。軟部組織への移植後所望される滞留時間は、ポリマー１ｇあたりチオール基８０〜２８０、好ましくは１００〜２４０、より好ましくは１２０〜２００μｍｏｌの狭い範囲で初期修飾度を有する架橋チオール修飾ヒアルロナンを含む組成物でのみ得られた。

修飾度以外に、ヒドロゲルのレオロジーおよびインビボ特性に顕著な影響を与えるパラメーターは、架橋チオール修飾ヒアルロナンの濃度、およびヒアルロナン鎖の分子量分布である。

架橋ポリマーは、約２００ｋＤａ超、例えば、約２５０ｋＤａ超、好ましくは約３００ｋＤａ超、より好ましくは約３５０ｋＤａ超の還元、滅菌後の平均分子量を有し、還元、滅菌後の平均分子量は、前記架橋ポリマーを還元条件に曝露した後の前記滅菌ヒドロゲル組成物からの還元されたチオール修飾ヒアルロナンの平均分子量として定義されることが好ましい。架橋ポリマーの「還元、滅菌後の平均分子量」は、移植後のヒドロゲルの滞留時間に影響を与える追加の重要な要因として同定され、以下ＭＲＰＭＷと省略される。ＭＲＰＭＷは、ヒドロゲル組成物の架橋ポリマーが還元条件に曝露される調製の工程後の架橋チオール修飾ヒアルロナン（架橋ポリマー）の分子量として決定される。ヒドロゲルにおいて、架橋ポリマーは、分子量を決定できない複雑なネットワークを表す。したがって、架橋ポリマーを還元する、すなわち、架橋ジスルフィド結合を分子量の決定前に切断する必要がある。ＭＲＰＭＷは、ヒドロゲル組成物中の架橋ポリマーのポリマー鎖の平均分子量に関係する値である。ＭＲＰＭＷは、滅菌ヒドロゲル組成物からの還元されたチオール修飾ヒアルロナンの平均分子量（ＭＭＷ）、すなわち、滅菌後および還元後の組成物において決定されるか、またはこの組成物から得られるチオール修飾ヒアルロナンの画分のＭＭＷとして定義される。通常、滅菌ヒドロゲル組成物からのチオール修飾ヒアルロナンに対して決定されるＭＲＰＭＷは、原料、すなわち、対応する組成物の製造のために用いられるチオール修飾ヒアルロナンの平均分子量（ＭＭＷ）と比較して低い（表１を参照のこと）。原料のＭＭＷと比較したＭＲＰＭＷの低下は、滅菌を含むヒドロゲル製造手順の結果であると想定される。したがって、架橋ポリマーのＭＲＰＭＷを使用することは、原料のＭＭＷを使用するよりもヒドロゲル組成物を特徴付けるのに適している。

しかし、本発明者らは、少なくとも約４００ｋＤａ、好ましくは少なくとも約５００ｋＤａ、より好ましくは少なくとも約６００ｋＤａ、例えば、約７００ｋＤａの平均分子量（ＭＭＷ）を有するチオール修飾ヒアルロナンをヒドロゲル組成物の製造に用いたとき、ヒドロゲル組成物中の架橋ポリマーのＭＲＰＭＷが約２５０ｋＤａ以上であることを見出した。例えば、約６００ｋＤａのチオール修飾ヒアルロナンから出発する実施例に概説される製造手順では、架橋ポリマーのＭＲＰＭＷが約３５０ｋＤａ以上の最も好ましい領域にあるヒドロゲル組成物が得られた。逆もまた同様に、約２００または２５０ｋＤａ以上のＭＲＰＭＷは、各チオール修飾ヒアルロナンのＭＭＷが少なくとも約４００ｋＤａであることの証拠であるが、定量的関係は製造手順に依存する。

本発明による組成物において、架橋ポリマーのＭＲＰＭＷは好ましくは約２５０ｋＤａ以上である。１００ｋＤａ未満、例えば、９０ｋＤａのＭＲＰＭＷを有する架橋ポリマーを含む組成物による例では、十分長時間にわたる皮内滞留時間が示されなかったが、約４１０ｋＤａのＭＲＰＭＷおよび同じ程度のチオール基による初期修飾度を有する架橋ポリマーを含む例示的組成物は、１７０日間で５０％超の平均相対デポー体積を示した。本発明者らの知識によれば、軟部組織への移植後のヒドロゲルのインビボ性能に影響を与えるＭＲＰＭＷおよびその役割、またはチオール修飾ヒアルロナンのＭＭＷについては、技術の現状では言及されていない。

ＭＲＰＭＷは、かなり間接的な尺度によりヒドロゲル組成物中の架橋ポリマー、すなわち、不均一ネットワークを特徴付けている。したがって、結果が、典型的には、±１０％または時にはこれよりさらに高い偏差を示すことは驚くべきことではない。実施例５には、ＭＲＰＭＷを決定する例示的な方法が指定されている。当業者は、他の手法で、このパラメーターに匹敵する値に到達できることを理解するであろう。例えば、アガロースゲル電気泳動法は、横型ゲルチャンバーおよびヒアルロナン分子量ラダーをマーカーとして用いて、アガロースゲル中のヒアルロナンの異なるＭＷ画分を分離するために用いられ得る。この場合には、染色されたゲルが濃度測定で分析され、次いで、分子質量が計算される。

別の実施形態において、架橋チオール修飾ヒアルロナンは、最大１４ｍｇ／ｍＬ、好ましくは最大１３ｍｇ／ｍＬの濃度、すなわち、滅菌ヒドロゲル組成物の体積に対する重量で好ましくは組成物中に含まれる。濃度は、好ましくは、塩、例えば、架橋チオール修飾ヒアルロナンのナトリウム塩の濃度を指す。したがって、当量のチオール修飾ヒアルロナンが、ヒドロゲルの調製のために提供される。高い濃度は、弾性が高く、かつ許容される注射可能性を有さないヒドロゲル組成物になるため適しているとみなされない。３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度は、このようなヒドロゲル組成物に対して観察される低い弾性係数Ｇ’により適しているとみなされない。約４ｍｇ／ｍＬ〜約１４ｍｇ／ｍＬの範囲内、例えば、５または９または１２ｍｇ／ｍＬで、良好なレオロジー特性が観察された。

本発明はまた、本発明による滅菌ヒドロゲル組成物を製造する方法であって、
ａ）チオール修飾ヒアルロナンを水溶液中に得る工程であり、
チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約８０μｍｏｌ超、好ましくはポリマー１ｇあたり約１０５μｍｏｌ超、より好ましくはポリマー１ｇあたり約１２０μｍｏｌ超のチオール基による修飾度を有し、
チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約２８０μｍｏｌ未満、好ましくはポリマー１ｇあたり約２４０未満、より好ましくはポリマー１ｇあたり２００μｍｏｌ未満のチオール基による修飾度を有し、
チオール修飾ヒアルロナンが、少なくとも４００ｋＤａ、好ましくは少なくとも５００ｋＤａ、より好ましくは少なくとも６００ｋＤａの平均分子量を有する、
工程と、
ｂ）先に得られた水溶液を、チオール修飾ヒアルロナンにジスルフィド架橋ポリマーを形成させる条件に曝露することにより、チオール修飾ヒアルロナンを酸化する工程であり、そこでまたはそれにより水溶液がヒドロゲルになる、工程と、
任意選択で、ｃ）生体適合性多糖の群から選択される非修飾ポリマーを、先に得られたヒドロゲルまたは先に得られた溶液に添加する工程と、
任意選択で、ｄ）先に得られたヒドロゲルをふるい分けして、特定の粒度分布を有するヒドロゲルを得る工程と、
ｅ）先に得られたヒドロゲルを容器、好ましくはシリンジに充填し、充填された容器をヒドロゲルの滅菌を可能にする条件に曝露する工程と、
ｆ）滅菌ヒドロゲル組成物を、架橋ポリマーを含む容器中に得る工程と
を含む、方法を提供する。

滅菌ヒドロゲルを製造する方法において、工程は、様々な順序で行われ得る。とりわけ、架橋（酸化）、非修飾ポリマーの添加およびふるい分けの工程は、ヒドロゲルの品質に必要以上に影響を与えずに様々な順序で行われ得る。好ましくは、工程は、ａ）、ｃ）、ｂ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）の順序で行われ、溶液の調製（工程ａ）および非修飾ポリマーの添加（工程ｃ）は、同時に行われてもよく、それと同時に、任意選択でさらなる成分（例えば、局所麻酔薬）が添加されてもよい。

別の態様において、本発明は、薬剤としての使用のため、特に軟部組織状態の治療および予防における使用のための本発明による組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明による組成物の美容的使用に関する。このような使用（治療的または美容的）は、軟部組織充填剤としてまたは組織増強のための本発明による組成物の使用を指し得る。このような使用は、好ましくは、ヒトへの、例えば、注射または移植による投与を含み、適用性はヒトに限定されない。

別の態様において、本発明は、本発明による組成物を、特定の軟部組織部位で、好ましくはシリンジから注射により導入することを含む方法に関する。方法は、軟部組織充填剤としての、または治療および美容目的での小じわの治療のための組成物の使用に関する。

一実施形態において、これらの態様による使用または方法は、ヒドロゲル組成物が、シリンジからヒトの皮内、骨膜上または皮下への注射により組織部位に導入されることを含む。

さらに、本発明は、シリンジおよび少なくとも１つの皮下針を含む、注射のための投与ユニットであって、本発明によるヒドロゲル組成物がシリンジに充填される、前記投与ユニットを提供する。

ヒアルロナン−システアミンの部分構造を示す図式的表示である。例示的なチオール修飾ヒアルロナン、すなわち、ヒアルロナン−ホモシステインの部分構造（Ａ）、ヒアルロナン−グリシル−システアミンの部分構造（Ｂ）およびＮ−メルカプト−ｎ−ブチルヒアルロンアミドの部分構造（Ｃ）およびＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの部分構造（Ｄ）を示す、さらなる図式的表示である。

本発明による滅菌ヒドロゲルの特性は、チオール修飾ヒアルロナン、とりわけその修飾度に大いに影響される。修飾度を決定するための確立された方法としては、Ｅｌｌｍａｎ法、または２，２’−ジチオジピリジンとチオールを有する作用剤とを反応させたときの発色団チオンの放出の測定が挙げられる（実施例１を参照のこと）。当業者は、同様の値が得られる代替法も把握しているであろう。本明細書において、修飾度は、ポリマー１ｇあたりチオール基μｍｏｌで示される。あるいは、修飾度はパーセンテージで示され得、その場合は、修飾された繰り返し単位の量を、ポリマー中のＨＡの繰り返し単位（Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）の総量で割る。ポリマー１ｇあたりチオール基μｍｏｌによる修飾度は、ＨＡの繰り返し単位の４００ｇ／ｍｏｌの分子量を考慮して、パーセンテージに変換され得る。この変換において、修飾により導入された分子量の変化は、典型的には無視される。したがって、本発明による組成物中のチオール修飾ヒアルロナンについて指定される修飾度は、３．２％〜１２．０％、好ましくは４．０％〜１１．２％または４．８％〜１０％の範囲として示され得る。

「チオール修飾ヒアルロナン」（ＨＡ−ＳＨ）は、ヒアルロン酸（ＨＡ）のチオール基含有誘導体である。これは、上記に指定した修飾度を特徴とし、様々な分子量（または分子量範囲）で得られるヒアルロナンから出発する公知の合成手法によって入手できる。チオール基を有するリガンドによるＨＡ修飾の数多くの例は、科学および特許文献中に見出され得る。Ｇｒｉｅｓｓｅｒらは、チオール化ヒアルロン酸ポリマーについて報告している（Ｇｒｉｓｓｅｒら、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ１０（２０１８）２４３）。Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ（ＥＰ１１１５４３３Ｂ１）は、ＨＡの分子量を損なわず、さらにまたインビボで十分に許容されかつ生分解性であるＨＡ分子をもたらす、ＨＡの官能化方法を記載している。該方法は、チオール基などの、架橋のための様々な末端官能基を有するＨＡを生成するために用いられる。これらの側鎖は、第１級（保護）チオール基含有アミンまたはジスルフィド結合含有ジアミノもしくはジヒドラジドリガンドと、グルクロン酸部分のカルボキシル基とを、活性エステル中間体を用いて、カルボジイミド媒介カップリングすることにより、ＨＡに導入される。次いで、ジスルフィド結合を有する中間体生成物を還元した後、保護チオール基を有する中間体生成物を、保護基を除去することにより脱保護する。ＨＡカルボキシル基とジスルフィド結合含有カルボジイミド（例えば、２，２’−ジチオビス（Ｎ−エチル−（Ｎ’−エチルカルボジイミド）との直接反応、次いで、還元剤によるジスルフィド結合の還元を含む、別の方法がＢｕｌｐｉｔｔら（ＵＳ６，８８４，７８８）により記載されている。ＷＯ２００８／００８８５７Ａ２は、２−チオエチルエーテル誘導ヒアルロナンの合成方法を開示している。ＥＰ０５８７７１５は、少なくとも１種のポリアニオン性多糖（例えば、ＨＡ）を水性混合物に溶解させ、ポリアニオン性多糖を活性化剤、例えば、ジイミド、例えば、ＥＤＣもしくはＥＴＣ、またはＢＯＰで活性化し、活性化したポリアニオン性多糖を修飾化合物、例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物で修飾し、活性化したポリアニオン性多糖を好適な求核試薬（例えば、アミノチオール）と反応させて、所望の不溶性組成物を形成することにより、水不溶性アニオン性多糖を合成する方法を開示している。該発明者らは、ポリアニオン性多糖のＢＯＰ活性化の１つの主な利点は、ポリアニオン性多糖の分子量が、求核試薬とのカップリングにより低下しないことであると言及している。ＥＰ１７９０６６５Ｂ１は、非プロトン性極性溶媒中ＢＯＰ縮合剤を用いたアミド結合により、置換基をヒアルロン酸のグルクロン酸のカルボキシ基に導入することにより製造される、水溶性修飾ヒアルロン酸について記載している。ジスルフィド結合を有するジアミンは、列挙された置換基の一つである。システアミンによるヒアルロン酸の効率的かつ制御された官能化のためのＤＭＴ−ＭＭによるトリアジン媒介アミド化が、Ｂｏｒｋｅらに記載されており、そこで、多糖鎖の穏やかな反応条件および最小限の分解が、ＥＤＣ媒介置換などの他のカップリング試薬と比較してこのグループのカップリング剤を使用する利点として列挙されている（Ｂｏｒｋｅら、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ１１６（２０１５）４２〜５０）。Ｌｉａｎｇらは、ＣＤＭＴおよびＮＭＭの存在下での側カルボキシレートの、シスタミンによるアミド化反応、次いでＤＴＴによる還元反応によるＨＡへのチオール基の導入について記載している（Ｌｉａｎｇら、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ１３２（２０１５）４７２〜４８０）。カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの二重触媒系を用いたＬ−システインエチルエステル塩酸塩によるＨＡのチオール修飾は、Ｋａｆｅｄｊｉｉｓｋｉら（ＩｎｔＪＰｈａｒｍ３４３、４８〜５８；２００７）に記載された。ＷＯ２００４/０３７１６４においては、ヒアルロナンが、３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）（ＤＴＰ）または４，４’−ジチオビス（酪酸ジヒドラジド）（ＤＴＢ）で修飾された。ＤＴＴなどの還元剤による還元後、対応するチオール化ＨＡ誘導体ＨＡ−ＤＴＰＨおよびＨＡ−ＤＴＢＨが得られた。ＥＰ２１０３６３１はまた、ヒドラジドカップリング方法によるＨＡのカルボキシル基を介したチオール基を有するリガンドの導入について記載している。異なるチオール化ＨＡポリマー（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ、ＨＡ−ＤＰＤＴＰＤＨ、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ）が合成された。

本発明によれば、チオール修飾ヒアルロナンは、好ましくはヒアルロナンに連結した修飾剤のコンジュゲートである。

ヒアルロナンのグルクロン酸部分のカルボキシル基と修飾剤との間のエステル結合、アミド結合またはヒドラジド結合の形成による修飾剤の導入が好ましい。修飾剤は、合成プロセスでジスルフィド結合の形態でまたは保護チオール基としてチオール基を含み得る。

１つの好ましい実施形態において、修飾剤は、アミド結合によりヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基に連結している。したがって、修飾剤は、ヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基とのアミド結合を形成できる少なくとも１つのアミノ基を含み、また修飾剤はチオール基を含む。例えば、チオール修飾ヒアルロナンは、システアミンがアミド結合によりヒアルロナンに連結している、ヒアルロナン−システアミンコンジュゲートである（図１を参照のこと）。

同様に、他のチオール基を有する修飾剤が、修飾剤のアミノ基（第１級または第２級アミノ基、好ましくは第１級アミノ基）とヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基との間のアミド結合の形成によるチオール修飾ヒアルロナンの合成ために用いられ得る。

ヒアルロナン−ホモシステインコンジュゲート(図２Ａ)は、ヒアルロン酸ナトリウムの、チオラクトンとしてその特有のチオール保護を利用するホモシステインチオラクトンによるアミド化により合成された。遊離チオール基は、その後、ジスルフィド形成により生じる不要なゲル化を回避するために、還元剤の存在下でアルカリ加水分解によって良好に遊離された。

さらなる修飾剤としては、例えば、システアミン、システインまたはホモシステインの誘導体が挙げられ、そこで、システアミン、システインまたはホモシステインのＮ末端は、アミノ酸のカルボキシル基とカップリングしている。これらの誘導体は、好ましくは、慣用のペプチドカップリング試薬、好ましくは、例えば、反応の後処理時の水性抽出による反応物および副生成物の除去による簡易な生成物の精製を可能にする試薬を用いた、Ｎ保護アミノ酸の、システアミン、システインまたはホモシステインによるアミド化により合成される（チオール基を有する修飾剤の合成については実施例１４Ａを参照のこと）。あるいは、システアミン、システインまたはホモシステインを、有機溶媒中でＮ−保護アミノ酸の対応する活性エステル、例えば、スクシンイミジルエステルと反応させる。ヒアルロナン−グリシル−システアミンコンジュゲート（図２Ｂ）は、この手法により合成されたチオール修飾ヒアルロナンの一例である。

ヒアルロナン特有の物理化学的特性をできる限り保つために、低分子量の修飾剤が好ましい。本発明による組成物に有用な架橋可能なチオール修飾ヒアルロナンを得るのに好適な低分子量修飾剤は、グルタチオン、システイン、直鎖または分岐Ｃ_２〜Ｃ_６アルキル鎖を含むアミノアルキルチオール、ホモシステイン、ホモシステインのカルボン酸エステル（例えば、ホモシステイン、好ましくはエチルホモシステインのＣ_２〜Ｃ_６アルキルエステル)、およびシステインのカルボン酸エステル（例えば、システイン、好ましくはエチルシステインのＣ_２〜Ｃ_６アルキルエステル）を含む群からさらに選択される。

アミノアルキルチオールリンカーは、ヒアルロナンとのアミド合成時に利用される一種の固有の保護基としてジスルフィド連結基を含有する、対応する対称性ジアミンを介して好都合に導入され得る。次いで、ジスルフィドは、Ｎ−保護アミノアルコールから出発して到達され得る。チオエステル部分の導入後、例えば、光延プロトコルに従って、酸化条件下でのチオエステルのけん化により、所望の標的化合物となる（例えば、実施例１４Ｃ）。Ｎ−メルカプト−ｎ−ブチルヒアルロンアミド（図２Ｃ）は、この手法により合成されるチオール修飾ヒアルロナンの一例である（実施例１５）。

別の好ましい実施形態において、修飾剤は、ヒドラジド結合によりヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基に連結している。したがって、修飾剤は、ヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基とのアミド結合を形成できる少なくとも１つのヒドラジド基を含み、また修飾剤はチオール基を含む。例えば、チオール修飾ヒアルロナンは、ヒアルロナン−３−メルカプトプロピオン酸ヒドラジドコンジュゲート（ＨＡ−ＤＴＰＨ）またはヒアルロナン−２−メルカプト−エチル−カルボニル−アミノ酢酸ヒドラジドコンジュゲート（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ；実施例１４Ｂ、図２Ｄを参照のこと）である。

ジスルフィド結合の形成（架橋）は、（例えば、周囲空気から供給された、または水溶液に溶解された）酸素の存在下において生理的ｐＨ値で自然に生じる。さらなる酸化剤の添加は、ジスルフィド形成を促進するのに有益であり得る。好適かつ十分に確立された酸化剤としては、例えば、過酸化水素（または他の過酸化物）、アスコルビン酸、ジメチルスホキシドおよび次亜塩素酸（次亜塩素酸ナトリウム）がある。過剰な圧力条件下で、純酸素ガスまたは高酸素ガス混合物を使用して、ポリマー水溶液中の酸化剤としてこの場合には利用できる酸素の濃度を高めることができる。

再生可能かつ安定な特性、例えば、レオロジー特性を有するヒドロゲルを製造するために、ヒドロゲルがさらに処理される（すなわち、ふるい分け、均質化、シリンジへの充填および滅菌などのさらなる処理工程を経る）前に、チオール修飾ヒアルロナンの架橋（すなわち、ジスルフィド結合の形成）はほぼ完了していなくてはならない。しかし、一定の少量のチオール基は、立体障害のような要因により、ジスルフィド形成に利用できない場合がある。架橋ポリマー中の非架橋チオール基の画分は、ポリマー１ｇあたりμｍｏｌで表される残留チオール含有量から決定され得る。高い架橋度（チオール基の酸化による）は、軟部組織充填剤に適した弾性特性を有するヒドロゲルを得るのに有益とみなされる。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるヒドロゲル組成物は、チオール修飾ヒアルロナンの修飾度に関して２０％未満、好ましくは１５％未満の残留チオール含有量を有する。これは、チオール修飾ヒアルロナンのチオール基の８０％超、好ましくは８５％超がヒドロゲル製造プロセスで酸化されることに対応する。

本明細書で使用する用語「滅菌」は、例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）または他の国家基準において化粧品または医薬品について定義されるように、微生物学的基準に従って組成物を規定する当該技術分野に従って理解されるべきである。伝統的に、ヒアルロナンゲルは、シリンジに充填された後に滅菌される。オートクレーブによる加熱湿熱滅菌は、標準的な方法の１つであり、これは、ＨＡゲルを１２１℃の高圧飽和蒸気に約１５〜２０分間曝露することを含む。短時間（例えば、約１分〜５分）および高温（例えば、約１３０℃〜１３５℃）のオートクレーブ処理は、ゲル中のＨＡ分子の分子量の良好な維持につながり得る（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｎｕｚｚｉ、Ａ．Ｇｉｏｒｉ、「Ａｎｉｎｎｏｖａｔｉｖｅｗａｙｔｏｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｔｅｒｉｌｉｚｅｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄｓｙｒｉｎｇｅｓ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｅｄｅｇａｒｉ．ｃｏｍ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１９／０３／ＷＰ−Ｆｅｄｅｇａｒｉ−Ｔｈｅｒｍａｌ−ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ＰＦＳ−ｗｉｔｈ−Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄｖ−２．ｐｄｆから入手できる２０１６白書、ＵＳ２０１６／０２２０７２９を参照のこと）。他のオートクレーブ処理パラメーターの最適化（例えば、生成物の急速冷却を確実にする）は、ポリマーの分子量を維持するのにさらに有利であり得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｒｉｆｌｏｗ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｎｅｗｓ／Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−ａｃｉｄ）。

本明細書で使用する用語「ヒドロゲル」は、固体特性と流体(液体)特性の両方を有する組成物を示すものとして理解されるべきである。一方で、ヒドロゲルは注射可能であり得る。すなわち、ヒドロゲルは、流体様挙動を示す。他方で、ヒドロゲルは、特定の形態を維持するために十分剛性（または、硬性）であり得る。例えば、ヒドロゲルは、予め形成された移植物、スレッドまたはフィラメントの形態で提供され得る。したがって、用語ヒドロゲルは単独では、組成物のレオロジー特性を量的に制限しない。

しかし、一実施形態において、ヒドロゲルは、１Ｈｚのせん断速度のレオメーターを用いて２５℃で測定した場合、少なくとも５０Ｐａ（５０，０００ｍＰａ）の弾性係数Ｇ’を有する。ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’は、
− 架橋度（重要な修飾度、すなわち本発明の特性により定義される）、
− 架橋ポリマーの濃度、および
− ＭＲＰＭＷ（チオール修飾ヒアルロナンの平均分子量に依存する）
の要因に直接影響される。

少なくとも１，０００Ｐａの弾性係数Ｇ’を有するヒドロゲルは、ボリューム増大効果および長期滞留時間を示した。他方で、低い弾性係数Ｇ’は、滑らかな充填剤としての投与に好ましい場合がある。実施例からは、長期の滞留が、約９０Ｐａまたは４００ＰａのＧ’を有するヒドロゲル組成物ＩＤ５およびＩＤ６でも達成されることが分かる。したがって、本発明によるヒドロゲルは、少なくとも８０Ｐａ、または少なくとも３５０Ｐａ、またはさらには少なくとも６００Ｐａの弾性係数Ｇ’を有し得る。また、いくつかの実施形態において、ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’は、最大１，６００Ｐａ、好ましくは最大１，０００Ｐａ、より好ましくは最大９００Ｐａである。

好ましい実施形態において、本発明による注射可能なヒドロゲル組成物の押出力は、標準的な１ｍＬのガラスシリンジを用いて、１２ｍｍ／分の押出速度で３０Ｇ針で測定した場合、好ましくは３０Ｎ未満である。

別の好ましい実施形態において、組成物はさらに、生体適合性多糖の群から選択される非修飾ポリマーを含む。好ましくは、非修飾多糖は、非修飾ヒアルロナン（ＨＡ）である。非修飾（非架橋）または遊離とも称されるヒアルロナンはヒドロゲル組成物を補完し得る。非修飾ＨＡは、一般に、軟部組織充填剤に潤滑剤として添加され、針またはカニューレから生成物を注射するのに必要な押出力を低減することにより、容易な注射可能性を確保する。好ましくは、組成物の製造に用いられる遊離ヒアルロナン原料は、約５００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａの範囲の分子量を有する。しかし、非安定化ヒアルロナンの急速な分解により、当業者は、軟部組織充填剤としての組成物のインビボ性能が、架橋ポリマーおよび根底にあるチオール修飾ヒアルロナンの特性から主として誘導されることを理解するであろう。組成物の総ポリマー含有量における非修飾多糖の画分は、好ましくは２／３未満である。非修飾多糖は、架橋ポリマー濃度以下の濃度で含まれることが好ましい。例示的には、非修飾ヒアルロナンは、３ｍｇ／ｍＬ〜９ｍｇ／ｍＬ、例えば、５または７ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に含まれ、濃度は好ましくは塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度を指す。

ヒドロゲル組成物は、局所麻酔薬および／または様々な他の成分、例えば、成長因子、ビタミン、ポリアルコール、アルカリ金属ハロゲン化物、ミネラル、抗酸化剤、アミノ酸、補酵素、セラミック粒子（例えば、カルシウムヒドロキシアパタイト粒子）、ポリマー粒子、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、グリコサミノグリカン、潤滑剤、多糖およびこれらの誘導体）、タンパク質（例えば、エラスチン、コラーゲン、ケラチン、シルクフィブロイン）、抗セルライト薬、抗瘢痕薬、抗炎症薬、抗刺激薬、血管収縮薬、抗出血薬（例えば、止血薬および抗線維素溶解薬）、テンショニング剤、抗ニキビ薬、色素沈着剤、抗色素沈着剤、消炎薬、抗リウマチ薬、抗ウイルス薬、抗感染薬、消毒薬、化学療法薬、細胞分裂阻害薬、抗アレルギー薬、抗静脈瘤薬、鎮痛薬、抗生物質、抗真菌薬、鎮痙薬、抗ヒスタミン薬、痔核の治療のための薬剤、皮膚の治療のための治療薬および保湿剤から選択される１つもしくは複数の成分を含み得る。

ヒドロゲル組成物への局所麻酔薬の添加は、注射時の疼痛を軽減するその能力を考えると特に望ましい。好ましくは、麻酔薬は、例えば、酸付加塩の形態のリドカイン、例えば、リドカインＨＣｌである。

ヒドロゲルを製造する方法において、局所麻酔薬および／または１つもしくは複数の成分は、様々な製造工程中に添加され得る。すなわち、一実施形態において、局所麻酔薬および／または１つもしくは複数の成分は、任意選択の工程ｃ）中に添加されるか、あるいは、別の実施形態において、非修飾ポリマーの添加とは別に、例えば、工程ａ）中に溶液に、または工程ｃ）もしくはｄ）で得られるヒドロゲルに添加される。好ましい実施形態において、麻酔薬、例えば、リドカインＨＣｌは、工程ａ）中または工程ｃ）中に添加される。一実施形態において、工程ｃ）が工程ｂ）に先行する、すなわち、非修飾ヒアルロナンが架橋前に添加される場合、局所麻酔薬および／または１つもしくは複数のさらなる成分が架橋工程前に含まれることも好ましい。

さらに、ヒドロゲル組成物の主成分が水であることが理解されるであろう。好ましくは、注射用水または精製水が、組成物を製造するために用いられる。加えて、組成物は、６．７〜７．８の範囲の生理学的に許容されるｐＨを示すように緩衝化され得ることが認められる。好適な緩衝液は、当業者に知られており、例えば、リン酸緩衝液が挙げられる。組成物はまた、生理学的に許容されるオスモル濃度を示し、これは、治療される対象の（例えば、ヒトの）細胞外液の正常なオスモル濃度に類似している。したがって、組成物は、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有し得、オスモル濃度を調整するための追加の溶質、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよび／または塩化カリウムを含み得る。

安定化ヒアルロナンなどの生体材料を含む軟部組織充填剤は、注射可能なヒドロゲル組成物による増強が所望される組織部位に送達される。軟部組織充填を示す使用または方法の目的は、軟部（真皮）組織を増強すること、先天的な奇形、後天的な欠陥または美容的欠陥を補正することを含む。

ヒドロゲル組成物は、移植物の元の体積と膨張に基づく充填効果を有するため、その主な効果は、純粋に物理的である。したがって、生理学的または薬理学的相互作用の非存在下で、使用は美容として分類され得、組成物は美容または医療デバイスとみなされ得る。本発明によるヒドロゲル組成物の使用が美容とみなされ得る場合の投与は、例えば、
− 女性生殖器の非外科的若返りのための外陰部および膣の組織への投与、
− 真皮、皮下への投与または骨膜上投与、
などの老化の徴候の低減を含む。

例示的には、ヒドロゲル組成物は、美容目的、例えば、しわを充填するため、皮膚の欠陥を治療するため、顔または体（例えば、胸、耳たぶ）の失われたボリュームを回復するため、蜂巣炎における凹みを低減するため、鼻頬溝奇形を治療するため、顔または体の輪郭を整えるため（例えば、臀部の増大、股関節の増強、ふくらはぎの増強）、陰茎を増大するため（例えば、陰茎周囲の増大、陰茎亀頭の増強）（の方法において）に用いられ得る。

他の場合では、軟部組織の充填および増強は、疾患の治療または予防につながり得る。すなわち、疾患の症状が、低減されるか、緩和されるか、および／またはその（再）発症が予防される。軟部組織の欠陥により生じる疾患は、投与されたヒドロゲルによる周辺組織の一時的および／または局所的な構造的充填、減衰、支持または増強から恩恵を受け得る。ヒドロゲル組成物が治療または予防のために用いられ得る疾患としては、例えば、以下が挙げられる：
− 中足骨痛症、母指球の脂肪体の疼痛疾患、この使用については、本発明によるヒドロゲルが、母指球の軟部組織の脂肪体に投与され得る、
− 尿または大便失禁、この適応症については、本発明によるヒドロゲルが、括約筋を規定する組織に投与され得る、
− 外陰膣委縮（また、閉経後泌尿生殖器症候群）、この適応症については、本発明によるヒドロゲルが、膣粘膜および前庭への注射により外陰膣領域にならびに／または大陰唇の増強のために投与され得、そこで大陰唇の再建は、外陰部の内部構造を保護するための両大陰唇間の密接な接触を確実にする、
− 声帯機能障害、
− 静脈弁不全症、あるいは
− 顔面脂肪委縮、衰弱性瘢痕、または形態学的非対称性もしくは奇形（先天的、または例えば、胸部もしくは顔の外傷もしくは手術の結果として生じる）、この適応症については、ヒドロゲルが、再建のために投与される。

本発明によるヒドロゲル組成物を充填したシリンジを含む投与ユニットについて、ユニットは、例えば、美容または医療用途（複数可）を記載した使用説明書を含むことが好ましい。好ましくは、皮下針は、少なくとも２７Ｇ、好ましくは２７Ｇ〜３２Ｇのゲージ（ｇ）で測定されたルーメンを有する。一実施形態において、投与ユニットは、そのルーメンが互いに異なる少なくとも２本の皮下針を含む。後者は、医療スタッフなどの使用者が、意図される用途に応じて様々な針の中から選択できる、キットの提供を可能にする。この実施形態において、好ましくは、使用説明書には、異なる美容または医療用途（例えば、異なる注射部位）には異なる針が適していることが記載される。

実施例１−修飾度の決定
ヒドロゲル組成物の調製のための原料として用いられるチオール修飾ヒアルロナン（ＨＡ−ＳＨ）中のチオール基の定量は、２，２’−ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）を使用する湿式化学法に基づくものである。ポリマー骨格に共有結合している遊離チオール部分は、ＤＴＤＰとのチオール−ジスルフィド交換反応を経るが、発色団チオンの１つの等価物が放出される。緩衝酸性媒体（ｐＨ＝４）において、得られたチオンの吸収は３４３ｎｍで測光により測定され得る。

約４２０ｍｇのチオール修飾ヒアルロナンを正確に秤量し、２〜３時間連続磁気撹拌しながら、３０ｇの０．０１ＮＨＣｌに溶解させて、貯蔵液を調製した。次いで、約３１０ｍｇの貯蔵液を正確に秤量し、エッペンドルフチューブ中４２００ｍｇの酢酸緩衝液ｐＨ４と混合して、試料液を調製した。３つの試料液を各貯蔵液から調製した。２５．０ｍｇのＮ−アセチルシステインを正確に秤量し、２５．０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４）に溶解させた。次いで、較正曲線の作成のために、この溶液を酢酸緩衝液（ｐＨ４）でさらに希釈した。酢酸緩衝液を空試験値に使用した。酢酸緩衝液（ｐＨ４）中０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＴＤＰを含有する５００μＬの溶液を５００μＬの各試料液（較正曲線、試料液および空試験値）に添加した。溶液を、室温で３０分間簡単に均質化およびインキュベートした。最後に、各試料（較正曲線、試料液および空試験値）をマイクロキュベットに移し、空試験値に対して分光光度計で３４２ｎｍで測定した。

実施例２−残留チオール含有量の決定
ヒドロゲル組成物中の架橋ポリマー（すなわち、組成物の架橋および製造後のＨＡ−ＳＨポリマー）の残留チオール含有量の決定のために、上記と同様の方法を使用した。

約５０ｍｇの各試料ヒドロゲルを正確に秤量し、酢酸緩衝液（ｐＨ４）中０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＴＤＰを含有する１．３ｍＬの溶液と混合した。２５．０ｍｇのＮ−アセチルシステインを正確に秤量し、２００．０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４）に溶解させた。次いで、較正曲線の作成のために、この溶液を酢酸緩衝液（ｐＨ４）でさらに希釈した。酢酸緩衝液を空試験値に使用した。酢酸緩衝液（ｐＨ４）中０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＴＤＰを含有する５００μＬの溶液を５００μＬの較正曲線および空試験値の各試料に添加した。すべての試料を室温で１２０分間連続撹拌しながらインキュベートした。すべての試料の遠心分離後、５００μＬの各上清を、５００μＬの酢酸緩衝液でさらに希釈し、空試験値に対して分光光度計で３４２ｎｍで測定した。

実施例３−ヒドロゲル組成物を製造する方法
方法Ａ
溶解：チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを水溶液に同時に溶解させる。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：任意選択で、架橋チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｂ
溶解：チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを酸性水溶液に同時に溶解させる。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：任意選択で、架橋チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｃ
溶解：チオール修飾ヒアルロナンを水溶液に溶解させる；リン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．６）中非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含む別の溶液を調製する。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
均質化：架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル、ならびに非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含む溶液を均質化し、任意選択で、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｄ
溶解：チオール修飾ヒアルロナンを水溶液に溶解させる；リン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．６）中非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含む別の溶液を調製する。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
均質化：架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル、ならびに非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含む溶液を均質化し、任意選択で、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｅ
溶解：チオール修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを水溶液に溶解させる；リン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．６）中非修飾ヒアルロナンを含む別の溶液を調製する。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
均質化：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲル、ならびに非修飾ヒアルロナンを含む溶液を均質化し、任意選択で、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｆ
溶解：チオール修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを酸性水溶液に溶解させる；リン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．６）中非修飾ヒアルロナンを含む別の溶液を調製する。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
均質化：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲル、ならびに非修飾ヒアルロナンを含む溶液を均質化し、任意選択で、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｇ
溶解：チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを水溶液に同時に溶解させる。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：任意選択で、架橋チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｈ
溶解：チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを酸性水溶液に同時に溶解させる。
架橋：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：任意選択で、架橋チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｉ
溶解液１：チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを水に同時に溶解させる。
架橋液１：ｐＨを約６．８〜７．６に調整した後、酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
溶解液２：チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよび任意選択でリドカインＨＣｌを水に同時に溶解させる。
架橋：溶解液２のｐＨを約６．８〜７．６に調製した直後に、架橋液１と溶解液２を等量で混合する。酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：任意選択で、架橋チオール修飾ヒアルロナン、非修飾ヒアルロナンおよびリドカインＨＣｌを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｊ
溶解：チオール修飾ヒアルロナンおよび非修飾ヒアルロナンを水溶液に溶解させる；リドカインＨＣｌを含む別の溶液を調製する。
架橋：ｐＨを約６．７〜７．８に調整した後、酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよび非修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
均質化：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよび非修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル、ならびにリドカインＨＣｌを含む溶液を均質化し、任意選択で、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

方法Ｋ
溶解：チオール修飾ヒアルロナンおよび非修飾ヒアルロナンを水溶液に溶解させる；リドカインＨＣｌを含む別の溶液を調製する。
架橋：ｐＨを約６．７〜７．８に調整した後、酸化剤および酸素によるジスルフィド架橋へのチオール基の酸化により、チオール修飾ヒアルロナンを架橋させる。
ふるい分け：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよび非修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲルを、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
均質化：架橋チオール修飾ヒアルロナンおよび非修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル、ならびにリドカインＨＣｌを含む溶液を均質化し、任意選択で、定義されたメッシュサイズのフィルタープレートを通して圧縮する（１回または複数回）。
滅菌：ヒドロゲルをシリンジに充填した後オートクレーブ処理する。

実施例４−弾性係数Ｇ’の決定
すべての組成物の振動レオロジー測定を、ＡｎｔｏｎＰａａｒＭＣＲ１０２レオメーターを用いてコーンプレートシステムで行った。組成物を、２７Ｇ針から（または、指定されている場合、針なしで）の注入によりレオメーターに移した。２５℃の温度および１Ｈｚの周波数でのヒドロゲルの線形粘弾性領域内の一定の変形による周波数試験中に、弾性係数を得た。

実施例５−分子量の決定
直列に高感度検出器−フォトダイオードアレイＵＶ、光散乱（ＲＡＬＳとＬＡＬＳの両方）、屈折率および粘度計を備えるＶｉｓｃｏｔｅｋＴＤＡｍａｘ温度制御マルチ検出器ＳＥＣシステムを、測定に使用した。屈折率検出器で、試料の濃度を記録し、各分布曲線を得た。光散乱検出器と組み合わせて、分子量（ＭＷ）を決定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のために、試料をＰＢＳで希釈し、０．１ｍｇ／ｍＬの最終ポリマー濃度を得た。

この試験中に生じるエラーまたは変動は典型的には偏差約１０％になる。

約２００ｍｇの調査した滅菌ヒドロゲル組成物を１．８ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散し、室温で２時間インキュベートすることにより、還元、滅菌後の平均分子量（ＭＲＰＭＷ）の決定のための試料を調製した。架橋チオール修飾ヒアルロナンを遊離ヒアルロナンから遠心分離により分離した。残留物をＰＢＳに再分散させた。繰り返しの抽出／遠心分離の工程後、残留ゲルを還元剤（ＴＣＥＰ．ＨＣＬ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）で３時間処理し、ジスルフィド架橋を切断し、次いで、得られた溶液を５ＮＨＣｌで酸性化した（還元）。還元されたチオール修飾ヒアルロナンをエタノールで沈殿させ、遠心分離により回収した（滅菌ヒドロゲル組成物からのチオール修飾ヒアルロナン）。沈殿物を２ｍｇ／ｍＬの濃度で遊離チオール部分のキャッピング剤（２−（２−アミノエチルジスルファニル）ピリジン−３−カルボン酸）を含有する水溶液４ｍＬに溶解させた。室温で３時間インキュベートした後、試料をさらにＰＢＳで希釈した。

あるいは、架橋ポリマーのＭＲＰＭＷを減算法で決定した。両方の手法で同様の値が得られる。架橋ポリマーおよび遊離ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物の滅菌後、還元剤をヒドロゲルに添加して、ジスルフィド結合を定量的に切断した。次いで、その還元型のチオール修飾ヒアルロナンおよび遊離ヒアルロナンのＭＷ分布を同時に決定した（Ｍｗ（合計））。さらに、遊離ヒアルロナンのＭＷを決定した。２００ｍｇの調査した滅菌ヒドロゲル組成物を１．８ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散し、室温で２時間インキュベートした。遠心分離後、上清を、遊離ヒアルロナンのＭＷのＳＥＣ分析に使用した（Ｍｗ（ＨＡ））。

遊離ヒアルロナンの分子量（Ｍｗ（ＨＡ））および遊離ヒアルロナンと還元されたチオール修飾ヒアルロナンとの組み合わせた分子量（Ｍｗ（合計））を決定することにより、ＭＲＰＭＷ(本明細書ではＭｗ（ＨＡ−ＳＨ）)を方程式（Ｉ）

（式中、Ｃ_ＨＡおよびＣ_{ＨＡ−ＳＨ}は、遊離ヒアルロナンおよび還元されたチオール修飾ヒアルロナン各々の画分を表す）
に従って計算できる。

ヒドロゲル製造のために使用したＨＡ−ＳＨ原料の対応する平均分子量（ＭＭＷ）と共に比較結果を表１に示す。典型的には、ＭＲＰＭＷはＭＭＷを下回る。ヒドロゲル組成物の製造は、分子量分布に影響を与える。

実施例６−押出力の測定
３０Ｇ針を、ヒドロゲル組成物を含有する１ｍＬのシリンジに取り付けた。押出力を、Ｍｅｃｍｅｓｉｎ力試験システムおよび１２ｍｍ／分の押出速度で測定した。測定を少なくとも三重反復で行った。各試験したヒドロゲル組成物および他のヒドロゲル組成物の計算された平均押出力（ＥＦ）を表１に列挙する。

実施例７−滅菌ヒドロゲル組成物
様々な組成物およびその特性が表１に列挙されており、そこで組成物間の主な違いは、ＨＡ−システアミンの酸化生成物である架橋ポリマーの濃度および特性にある。架橋ＨＡ−システアミン、非修飾ヒアルロン酸ナトリウムおよび３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌを含む滅菌ヒドロゲル組成物を同様の方法で製造した（上記の方法Ａ、ＢおよびＩを比較）。

ヒドロゲル組成物ＩＤ１〜ＩＤ４を、１５０ｋＤａのＭＭＷおよび１１８μｍｏｌ／ｇの修飾度を有するヒアルロナン−システアミンポリマーを用いて製造した。ヒドロゲル組成物ＩＤ１〜ＩＤ３は、３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムおよび６ｍｇ／ｍＬ（ＩＤ１）、９ｍｇ／ｍＬ（ＩＤ２）および１３ｍｇ／ｍＬ（ＩＤ３）の架橋ヒアルロナン−システアミンを各々含んでいた。ヒドロゲル組成物ＩＤ４は、４ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムおよび１３ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミンを含んでいた。

ヒドロゲル組成物ＩＤ５およびＩＤ６を、７３０ｋＤａのＭＭＷおよび１５１μｍｏｌ／ｇの修飾度を有するヒアルロナン−システアミンポリマーを用いて製造した。ヒドロゲルＩＤ５およびＩＤ６は、３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウム（ＭＭＷ２．４１ＭＤａ）、ならびに５ｍｇ／ｍＬ（ＩＤ５）および９ｍｇ／ｍＬ（ＩＤ６）の架橋ヒアルロナン−システアミンナトリウム塩を各々含んでいた。

ヒドロゲル組成物ＩＤ７およびＩＤ８を、７８０ｋＤａのＭＭＷおよび１４９μｍｏｌ／ｇの修飾度を有するヒアルロナン−システアミンポリマーを用いて製造した。ヒドロゲル組成物ＩＤ７は、３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウム（ＭＭＷ１．９４ＭＤａ）および７ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミンナトリウム塩を含んでいた。ヒドロゲル組成物ＩＤ８は、３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウム（ＭＭＷ１．９４ＭＤａ）および１３ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミンナトリウム塩を含んでいた。

チオール修飾ヒアルロナンのＭＭＷおよびその修飾度（ＤｏＭ）、滅菌ヒドロゲル組成物の弾性係数Ｇ’および押出力（ＥＦ）、滅菌ヒドロゲル組成物中の架橋ポリマーのＭＲＰＭＷおよび残留チオール含有量を上記のように決定した。

滅菌ヒドロゲル組成物はすべて、６．７〜７．８の範囲のｐＨおよび２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有していた。

ジスルフィド結合の形成を、架橋ポリマーの残留チオール含有量の測定、およびチオール修飾ヒアルロナンの初期修飾度との比較によりモニターした。本発明によるヒドロゲル組成物はすべて、チオール修飾ヒアルロナンの修飾度に関して１５％未満の残留チオール含有量を有することが見出された。

架橋ポリマーの濃度とＭＲＰＭＷの両方が、ヒドロゲルの弾性特性に影響を与えた。約４００ｋＤａ超のＭＲＰＭＷを有する架橋ポリマーを含む組成物（例えば、ヒドロゲル組成物ＩＤ６）は、同じ濃度であるが１００ｋＤａ未満の低いＭＲＰＭＷを有する架橋ポリマーを含む組成物（例えば、ヒドロゲル組成物ＩＤ２）と比較して弾性特性が増加した。架橋ポリマーのＭＲＰＭＷに関係なく、９〜１３ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で架橋ポリマーを含む組成物は、５または６ｍｇ／ｍＬの濃度で架橋ポリマーを含む組成物と比較して弾性特性が増加した。ヒドロゲル組成物ＩＤ３^＊およびＩＤ８の弾性係数の比較から、架橋に使用したチオール修飾ヒアルロナンのＭＭＷが滅菌組成物の弾性特性に好ましい影響を与えたことが分かる。ヒドロゲル組成物ＩＤ３^*のチオール修飾ヒアルロナンは１５０ｋＤａのＭＭＷを有していたが、ヒドロゲル組成物ＩＤ８のチオール修飾ヒアルロナンは７８０ｋＤａのＭＭＷを有していた。それ以外に、いずれのヒドロゲル組成物も１３ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミン、３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムおよび３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌを含み、いずれのヒドロゲル組成物も同じ製造方法で製造された。

実施例８−移植されたヒドロゲル組成物のインビボ特性評価
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて、注射による皮内移植後の経時的な平均デポー体積の展開について、本発明による様々な組成物および比較組成物を調査した。

８つの異なる滅菌ヒドロゲル組成物（ヒドロゲルの特性については表１を参照のこと）および小じわの治療のための２つの市販の真皮充填剤Ｂｅｌｏｔｅｒｏ（登録商標）ソフト（ＣＯＭＰ１）およびＰｒｏｆｈｉｌｏ（登録商標）（ＣＯＭＰ２）を試験した。ＣＯＭＰ１は、リン酸緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬのＢＤＤＥ架橋ヒアルロナンおよび３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌを含有する。ＣＯＭＰ２は、リン酸緩衝液中１６ｍｇ／ｍＬの高ＭＷヒアルロナンおよび１６ｍｇ／ｍＬの低ＭＷヒアルロナンを含有する。

組成物をメスＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの背中の皮膚に皮内注射した。注射量は約５０μＬであった。ラット１匹あたり最大８デポーを、組成物ＩＤ５、ＩＤ６、ＩＤ７およびＩＤ８あたり１２回の投与と、組成物ＩＤ１、ＩＤ２およびＣＯＭＰ１あたり１４回の投与と、組成物ＩＤ３およびＩＤ４あたり５回の投与と、ＣＯＭＰ２あたり８回の投与との合計で投与した。皮内ヒドロゲルデポーの体積を、ＭＲＩ（ＳｉｅｍｅｎｓＥｓｐｒｅｅ１．５ＴＭＲＴデバイス）により、最大１７０日間の合計時間様々な時点でモニターした。個々のデポー体積（ｍｍ^３）をＭＲＩスキャンに従って計算し、経時的にモニターした。計算された体積を、０日目（投与直後）に得られた結果に正規化した。これはパーセント（％）で示される。様々な時点での様々な組成物の平均相対デポー体積を表２に列挙する。各時点に対して一定の日数範囲が許容された。各ヒドロゲル組成物のデポー体積をすべて同じ日に決定した。

比較ヒドロゲル組成物は、投与後２カ月未満内に非常に急速に分解された。場合によっては、ヒドロゲルデポーは、移植の２週間後（ＣＯＭＰ１および組成物ＩＤ１）および約３週間後（ＣＯＭＰ２および組成物ＩＤ２）検出できなかった。７３０〜７８０ｋＤａの範囲の初期ＭＭＷを有するチオール修飾ヒアルロナンを架橋させることにより調製したヒドロゲル組成物ＩＤ５、ＩＤ６、ＩＤ７およびＩＤ８は、１カ月超および最大５カ月の長期滞留時間を示した。ヒドロゲル組成物ＩＤ５およびＩＤ６の架橋チオール修飾ヒアルロナンは、４００ｋＤａ超のＭＲＰＭＷを有していた。ヒドロゲル組成物ＩＤ３^＊およびＩＤ８の滞留時間の比較から、架橋に使用したチオール修飾ヒアルロナンのＭＭＷが、滅菌組成物の滞留時間に好ましい影響を与えたことが分かる。ヒドロゲル組成物ＩＤ３^＊のチオール修飾ヒアルロナンは、１５０ｋＤａのＭＭＷを有し、ヒドロゲル組成物ＩＤ３^＊のデポーは、移植の３カ月後検出できなかった。組成物ＩＤ８のチオール修飾ヒアルロナンは、７８０ｋＤａのＭＭＷを有し、ヒドロゲル組成物ＩＤ８のデポーは、全試験期間を通して検出された。いずれのヒドロゲル組成物もその他の点では同等であった。これらは１３ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミン、３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムおよび３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌを含み、いずれの組成物も同じ製造方法で製造された。

実施例９−様々な修飾度およびＭＲＰＭＷの架橋チオール修飾ヒアルロナンを含む移植されたヒドロゲル組成物のインビボ特性評価
架橋チオール修飾ヒアルロナンを含む様々な滅菌ヒドロゲル組成物を、表３に列挙する。組成物間の主な違いは、チオール修飾ヒアルロナンの特性、すなわち、架橋ポリマーの修飾度およびＭＲＰＭＷにある。ヒドロゲルを同様の方法で製造した（上記の方法ＢおよびＨを比較）。滅菌ヒドロゲル組成物はすべて、１７ｍｇ／ｍＬの濃度で架橋ヒアルロナン−システアミン、５ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウム（遊離ＨＡ）および３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌを含んでいた。ヒドロゲル組成物中の架橋ポリマーのＭＲＰＭＷおよび残留チオール含有量、ならびにチオール修飾ヒアルロナン原料のＭＭＷおよび修飾度（ＤｏＭ）を上記のように決定した。

組成物を、メスＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの背中の皮膚に２５Ｇ針を用いて皮内注射により移植した。注射量は約５０μＬであった。ラット１匹あたり最大８デポーを、試験した組成物あたり１２回の投与で投与した。ヒドロゲルデポーの分解動態を、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により投与日（０日目）、次いで一定の時間間隔でモニターした。個々のデポー体積（ｍｍ^３）を、各時点のＭＲＩスキャンに従って計算した。計算された体積を、０日目（１００％に相当）に得られた結果に正規化した。様々なヒドロゲル組成物の８４日目の平均相対デポー体積を表４に列挙する。

中程度の範囲（１１９〜１３０μｍｏｌ／ｇ）のＤｏＭを有する架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物ＩＤ９およびＩＤ１１のみが、８４日目に１００％超の平均相対デポー体積を有していた。これらのヒドロゲル組成物の高いポリマー濃度を考慮すると、これらの知見は、実施例７および実施例８のヒドロゲル組成物ＩＤ５およびＩＤ６について測定された滞留時間に対応している。

架橋のために使用したチオール修飾ヒアルロナンが４３μｍｏｌ／ｇのＤｏＭを有していたヒドロゲル組成物ＩＤ１０^＊は、８４日目に著しく分解された。ＭＲＰＭＷがヒドロゲル組成物ＩＤ９とＩＤ１１の値の中間であったため、急速な分解は、低いＤｏＭ（および結果的に低い架橋度）に起因すると考えられる。驚くべきことに、３５０μｍｏｌ／ｇの高いＤｏＭ（および結果的に高い架橋度）を有する架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物ＩＤ１２^＊のデポーも、投与後１２週間以内に６０％超分解された。５ｍｇ／ｍＬの濃度で架橋チオール修飾ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物ＩＤ５は、投与の８０日後の相対デポー体積に関してこのヒドロゲル組成物より優れていた（実施例８を参照のこと）。

実施例１０−滅菌ヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
１１ｍｇ／ｍＬの架橋ＨＡ−システアミン、３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌおよび９ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムを含む滅菌ヒドロゲル組成物を、方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、１６５０ｍｇのＨＡ−システアミン（乾燥重量、ＭＭＷ７００ｋＤａ、修飾度１３２μｍｏｌ／ｇポリマー）、４５０ｍｇのリドカインＨＣｌ（乾燥重量）および１３５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＷ２２３８ｋＤａ）を、室温で約１７時間機械的に撹拌しながら、１３０ｇの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１（８８ｍＭＮａＣｌを含む）に溶解させた。１Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ約７．１に調整した後、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１（８８ｍＭＮａＣｌを含む）を最終量１５０ｇの組成物に添加した。溶液を約６０分間均質化した。次いで、１．２ｍＬの０．３０７％（ｖ／ｖ）の過酸化水素溶液を添加した。室温で一晩インキュベートした後、架橋ゲルを、１ｍＬのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。滅菌ヒドロゲル組成物は、６．９７のｐＨおよび２６６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有していた。

修飾度（ＤｏＭ）、ＭＭＷ、ＭＲＰＭＷ、押出力および弾性係数Ｇ’を上記のように決定した。これらを表５に要約する。

実施例１１−滅菌ヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
１１ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミン、３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌおよび５ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムを含む滅菌ヒドロゲル組成物を、方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、１６５０ｍｇのＨＡ−システアミン（乾燥重量、ＭＭＷ７００ｋＤａ、修飾度１３２μｍｏｌ／ｇポリマー）、４５０ｍｇのリドカインＨＣｌ（乾燥重量）および７５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＷ２２３８ｋＤａ）を、室温で約１７時間機械的に撹拌しながら、１３０ｇの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１（８８ｍＭＮａＣｌを含む）に溶解させた。１Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ約７．１に調整した後、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１（８８ｍＭＮａＣｌを含む）を最終量１５０ｇの組成物に添加した。溶液を約６０分間均質化した。次いで、１．２ｍＬの０．３０７％（ｖ／ｖ）の過酸化水素溶液を添加した。室温で一晩インキュベートした後、架橋ゲルを１ｍＬのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。滅菌ヒドロゲル組成物は６．９４のｐＨおよび２５２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有していた。

修飾度（ＤｏＭ）、ＭＭＷ、ＭＲＰＭＷ、押出力および弾性係数Ｇ’を上記のように決定した。これらを表６に要約する。

実施例１２−滅菌ヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
７ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミンナトリウム塩（ＭＭＷ７９０ｋＤａ、修飾度１４０μｍｏｌ／ｇ）、３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌおよび３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウム（ＭＭＷ２．４４ＭＤａ）、１０５ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液を含む滅菌ヒドロゲル組成物（ＩＤ１５）を、方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、ＨＡ−システアミンナトリウム塩、ヒアルロン酸ナトリウム、リドカインＨＣｌおよび塩化ナトリウムを含む水溶液を調製した。過酸化水素を含むリン酸緩衝液の添加により、架橋を開始した。室温で２日間インキュベートした後、残留チオール含有量を測定すると、初期修飾度の１０％未満になり、これは、チオール修飾ヒアルロナンのチオール基の９０％超が、ヒドロゲル製造プロセスで酸化されたことを示している。ふるい分け後、ヒドロゲルをシリンジに充填し、１２１℃で１５分間滅菌した。

滅菌ヒドロゲル組成物は、７．０８のｐＨおよび２９３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有していた。弾性係数Ｇ’および押出力を上記のように決定した。弾性係数Ｇ’の決定のために、ヒドロゲル組成物をシリンジから（針を取り付けずに）直接レオメーターに加えた。弾性係数は１４７，８７７ｍＰａであった。押出力は６Ｎであった。

実施例１３−滅菌ヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
１３ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−システアミンナトリウム塩（ＭＭＷ７２０ｋＤａ、修飾度１４８μｍｏｌ／ｇ）、３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌおよび３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウム（ＭＭＷ１．９４ＭＤａ）、１００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液を含む滅菌ヒドロゲル組成物（ＩＤ１６）を、方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、ＨＡ−システアミンナトリウム塩、ヒアルロン酸ナトリウム、リドカインＨＣｌおよび塩化ナトリウムを含む１６０ｇの水溶液を、成分を０．０１ＭＨＣｌに溶解させることにより調製した。ｐＨを７．３に調整するために２０ｇの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１１．９）を添加し、次いで、２０ｇの注射用水中１９．６μＬの３０％（ｖ／ｖ）過酸化水素溶液で調製した２０ｇの溶液を添加することにより、架橋を開始した。室温で２２時間インキュベートした後、残留チオール含有量を測定すると、３μｍｏｌ／ｇになり、これは、初期修飾度の５％未満に相当し、チオール修飾ヒアルロナンのチオール基の９５％超が、ヒドロゲル製造プロセスで酸化されたことを示している。３５０μｍのフィルタープレートを通してふるい分けした後、ヒドロゲルを１ｍｌのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。

滅菌ヒドロゲル組成物は、７．３のｐＨおよび２８７ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有していた。滅菌ヒドロゲル組成物の弾性係数Ｇ’および押出力を上記のように決定した。弾性係数Ｇ’の決定のために、ヒドロゲルをシリンジから（針を取り付けずに）直接レオメーターに加えた。弾性係数は７０１，５８３ｍＰａであった。押出力は１６．４Ｎであった。

実施例１４−チオール基を有する修飾剤の合成
Ａ．ビス（グリシル）−シスタミン二塩酸塩の調製
乾燥ジクロロメタン：ＴＨＦ＝１：１（２０ｍＬ）中のシスタミン二塩酸塩（１ｇ、４．４４ｍｍｏｌ）とＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシン（１．５９ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）との混合物に、最初にトリエチルアミン（１２７０μＬ、９．１６ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジクロロメタン中のＥＤＣ^＊ＨＣｌ（１．７５ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応溶液を周囲温度で５時間撹拌し、次いで、揮発物を減圧下で蒸発させた。残留物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解させ、１ｎＨＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＨＣＯ_３（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で半飽和した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で脱水し、揮発物を減圧下で蒸発させて、Ｎ−Ｂｏｃ保護ビス（グリシル）−シスタミンを無色の油として得た。収率：１．５７５ｇ（８８％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.97 (s, 1H, NH), 5.53 (s, 1H, NH), 3.81 (d, J=5.8 Hz, 2H, α-CH ₂), 3.58 (aq, J=6.3 Hz, 2H, -CH ₂-NH-), 2.82 (t, 2H, -CH ₂-S- ), 1.45 (s, 9H, -CH ₃t-Bu); m/z = 467.1 [M+H]⁺, 489.1 [M+Na]⁺.

ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ保護ビス（グリシル）−シスタミン（３００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（３００μＬ、４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。発熱反応が停止した後、混合物を密封フラスコ中、周囲温度で５時間撹拌し、次いで、トルエン（２ｍＬ）を添加して、生成物が沈殿するまで揮発物を蒸発させた。白色固体を吸引濾過により単離して、ｎ−ペンタン（２×５ｍＬ）で洗浄した。収率：１４６ｍｇ（６７％）。ｍ．ｐ．＝１８４℃（分解）；¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 3.81 (s, 2H, α-CH ₂), 3.59 (at, J=6.3 Hz, 2H, -CH ₂-NH), 2.88 (at, 2H, -CH ₂-S- ); m/z = 266.9 [M+H]⁺, 288.9 [M+Na]⁺.

この修飾剤は、ヒアルロナン−グリシル−システアミンコンジュゲートの調製を可能にする（図２Ｂ）。

Ｂ．ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジヒドラジド（ＤＧＤＴＰＤＨ）の調製
乾燥ジクロロメタン：ＴＨＦ＝１：１（２０ｍＬ）中の３，３’−ジチオジプロピオン酸（２ｇ、９．５ｍｍｏｌ）とグリシンエチルエステル塩酸塩（２．６６ｇ、１９．０ｍｍｏｌ）との混合物に、トリエチルアミン（２．７８μＬ、２０．０ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、ジクロロメタン中のＥＤＣ^＊ＨＣｌ（３．８３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を周囲温度で５時間撹拌し、次いで、酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈した。有機層を、１ｎＨＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＨＣＯ_３（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で半飽和し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で脱水し、揮発物を減圧下で蒸発して、白色固体としてジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジエチルエステルを得た。収率：１．６９ｇ（４７％）。ｍ．ｐ．＝１２１℃；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.50 (s, 1H, NH), 4.21 (q, J=7.1 Hz, 2H, -O-CH ₂-), 4.04 (d, J=5.3 Hz, 2H, α-CH ₂-N), 2.99 (t, J=7.0 Hz, 2H, -CH ₂-S-), 2.67 (t, 2H, α-CH ₂-CH₂-), 1.28 (t, 3H, -CH ₃); m/z = 381.0 [M+H]⁺, 403.0 [M+Na]⁺.

９６％ＥｔＯＨ中のジエチルエステル（５００ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）および８０％水性ヒドラジン水和物（０．５ｍＬ、１２．７ｍｍｏｌ）の混合物を５時間還流させた。生成物は周囲温度まで冷却すると結晶化し、これを吸引濾過により収集し、冷ＥｔＯＨ（２×１５ｍＬ）で十分に洗浄した。収率：３３５ｍｇ（７２％）、白色針状結晶。ｍ．ｐ．＝１９７℃（分解）；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (s, 1 H, -NH), 8.20 (t, J=5.7 Hz, 1 H, -NH), 4.19 (s, 2H, -NH₂), 3.64 (d, J=5.8 Hz, 2H, α-CH ₂-N), 2.87 (t, J=7.2 Hz, 2H, -CH ₂-S-), 2.53 (t, 2H, α-CH ₂-CH₂-); m/z = 353.1 [M+H]⁺, 375.1 [M+Na]⁺.

この修飾剤は、ヒアルロナン−２−メルカプト−エチル−カルボニル−アミノ−酢酸ヒドラジドコンジュゲートの調製を可能にする（図２Ｄ）。

Ｃ．４，４’ −ジチオビス［１−ブタンアミン］二塩酸塩の調製
文献（Ａｕｆｏｒｔ，Ｍ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、１２（４）、５８３〜５９２、２０１１）に報告されたプロトコルに従って、４，４’−ジチオビス［１−ブタンアミン］二塩酸塩を４−アミノブタン−１−オールから調製した。メタノール（６ｍＬ）中のジカルバメート（５５０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（０．６ｍＬ、８．４ｍｍｏｌ）を滴下で添加する代わりに、最後のＮ−Ｂｏｃ脱保護を採用し、これをＭｅＯＨ／ＨＣｌで行って、二塩酸塩として生成物を得た。発熱反応が停止したら、混合物を５時間還流させた。次いで、トルエン（６ｍＬ）を添加し、混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をトルエン（６ｍＬ）と繰り返し共沸混合し、次いで、吸引濾過により単離し、ｎ−ペンタン（２×６ｍＬ）で洗浄した。収率：３４０ｍｇ（９０％）、白色固体；ｍ．ｐ．＝２４９℃（分解）；¹H NMR (400 MHz, D2O+DSS) δ 3.02 (t, J=7.1 Hz, 4H, CH ₂-N), 2.78 (t, J=6.7 Hz, 4H, -CH ₂-S-), 1.83-1.71 (m, 8H, C-CH ₂-CH ₂-C). m/z = 209.0 [M+H]⁺.

この修飾剤は、Ｎ−メルカプト−ｎ−ブチルヒアルロンアミドの調製を可能にする（図２Ｃ）。

実施例１５−架橋Ｎ−メルカプト−ｎ−ブチルヒアルロンアミドの滅菌ヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
９ｍｇ／ｍＬの架橋Ｎ−メルカプト−ｎ−ブチルヒアルロンアミドおよび３ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムを含む滅菌ヒドロゲル組成物を、リドカインＨＣｌを添加せずに方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、４５０ｍｇのＮ−メルカプト−ｎ−ブチルヒアルロンアミド（乾燥重量、ＭＭＷ７６７ｋＤａ、修飾度９８μｍｏｌ／ｇポリマー、図２Ｃ）および１５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＭＷ２．４ＭＤａ）を、室温で約５時間機械的に撹拌しながら、４４ｇの０．０１ＭＨＣｌ（ＮａＣｌを含む）に溶解させた。４１．４８ｇのこの溶液に、０．０１５％Ｈ_２Ｏ_２を含有する４．６０９ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ１１．８１を添加し、ｐＨをｐＨ約７．４に調整した。混合物を周囲温度で１５分間均質化し、次いで一晩放置して完全に架橋させた。架橋ゲルを、１ｍＬのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、約７．２のｐＨおよび３０５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有していた。

修飾度（ＤｏＭ）、ＭＭＷ、残留チオール含有量、ヒドロゲル組成物の押出力および弾性係数Ｇ’を上記のように決定した。弾性係数Ｇ’の決定のために、滅菌ヒドロゲルをシリンジから（針を取り付けずに）直接レオメーターに加えた。平均残留チオール含有量は１μｍｏｌ／ｇであり、弾性係数Ｇ’は２５２，５６９ｍＰａであった。平均押出力は１１．９Ｎであった。

実施例１６−架橋ヒアルロナン−グリシル−システアミンを含むヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
１７．９ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−グリシル−システアミンナトリウム塩（ＨＡ−ＧＬＹＣ）および５ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムを含むヒドロゲル組成物を、リドカインＨＣｌを添加せずに方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、５３７ｍｇのＨＡ−ＧＬＹＣ（乾燥重量、ＭＭＷ６１０ｋＤａ、修飾度１６２μｍｏｌ／ｇポリマー、図２Ｂ）および１５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＭＷ２．４ＭＤａ）を、室温で約５時間機械的に撹拌しながら、２６ｇの０．０１ＭＨＣｌ（ＮａＣｌを含む）に溶解させた。１９．０２ｇのこの溶液に、２．１１５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ１１．８５を添加し、ｐＨをｐＨ約７．４に調整した。次いで、２７３μＬの０．３％Ｈ_２Ｏ_２溶液を添加し、混合物を周囲温度で１５分間均質化し、次いで一晩放置して架橋させた。架橋ヒドロゲルを、１ｍＬのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。滅菌ヒドロゲルは約７．２のｐＨを有していた。

残留チオール含有量および弾性係数Ｇ’を上記のように決定した。弾性係数Ｇ’の決定のために、ヒドロゲルをシリンジから（針を取り付けずに）直接レオメーターに加えた。弾性係数Ｇ’は１，２６０，４６７ｍＰａであった。平均残留チオール含有量は０μｍｏｌ／ｇであった。

実施例１７−架橋ヒアルロナン−ホモシステインを含むヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
１７．９ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−ホモシステインナトリウム塩（ＨＡ−ＨＣＹＳ）および５ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムを含むヒドロゲル組成物を、リドカインＨＣｌを添加せずに方法Ａに従って製造した。簡単に言うと、５３７ｍｇのＨＡ−ＨＣＹＳ（乾燥重量、ＭＭＷ６１０ｋＤａ、修飾度１３６μｍｏｌ／ｇポリマー、図２Ａ）および１５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＭＷ２．４ＭＤａ）を、室温で約５時間機械的に撹拌しながら、２６ｇの０．０１ＭＨＣｌ（ＮａＣｌを含む）に溶解させ、次いで１時間休息させて、気泡を除去した。２３．６８ｇの溶液に、２．６３ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ１２．０４を添加し、溶液のｐＨをｐＨ約７．２に調整した。混合物を室温で４８時間放置して架橋させ、次いで、架橋ヒドロゲルを、１ｍＬのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。滅菌ヒドロゲルは約７．０のｐＨを有していた。

残留チオール含有量および弾性係数Ｇ’を上記のように決定した。弾性係数Ｇ’の決定のために、ヒドロゲルをシリンジから（針を取り付けずに）直接レオメーターに加えた。弾性係数Ｇ’は１，７５９，９００ｍＰａであった。平均残留チオール含有量は０μｍｏｌ／ｇであった。

実施例１８−架橋ヒアルロナン−２−メルカプト−エチル−カルボニル−アミノ酢酸ヒドラジドを含むヒドロゲル組成物の製剤化および特性評価
１７．９ｍｇ／ｍＬの架橋ヒアルロナン−２−メルカプト−エチル−カルボニル−アミノ−酢酸ヒドラジドナトリウム塩（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）および５ｍｇ／ｍＬの非修飾ヒアルロン酸ナトリウムを含むヒドロゲルを、リドカインＨＣｌを添加せずに方法Ｂに従って製造した。簡単に言うと、５３７ｍｇのＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ（乾燥重量、ＭＭＷ７７０ｋＤａ、修飾度１３４μｍｏｌ／ｇポリマー、図２Ｄ）および１５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＭＷ２．４ＭＤａ）を、室温で約５時間機械的に撹拌しながら、２６ｇの０．０１ＭＨＣｌ（１９２ｍｇのＮａＣｌを含む）に溶解させた。２０．２０ｇのこの溶液に、０．０４１％Ｈ_２Ｏ_２を含有する２．２５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ１２．０７を添加し、溶液のｐＨをｐＨ約７．０に調整した。混合物を室温で１８時間放置して架橋させた。次いで、架橋ヒドロゲルを、１ｍＬのガラスシリンジに充填し、オートクレーブ処理により滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、約７．０のｐＨおよび３２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有していた。

残留チオール含有量および弾性係数Ｇ’を上記のように決定した。弾性係数Ｇ’の決定のために、ヒドロゲルをシリンジから（針を取り付けずに）直接レオメーターに加えた。弾性係数Ｇ’は６９８，８６０ｍＰａであった。平均残留チオール含有量は０μｍｏｌ／ｇであった。

Claims

架橋ポリマーを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、
前記架橋ポリマーが、チオール修飾ヒアルロナンの酸化生成物であり、
前記チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約８０μｍｏｌ超、好ましくはポリマー１ｇあたり約１０５μｍｏｌ超、より好ましくはポリマー１ｇあたり約１２０μｍｏｌ超のチオール基による修飾度を有すること、
前記チオール修飾ヒアルロナンが、ポリマー１ｇあたり約２８０μｍｏｌ未満、好ましくはポリマー１ｇあたり約２４０μｍｏｌ未満、より好ましくはポリマー１ｇあたり２００μｍｏｌ未満のチオール基による修飾度を有すること、および
前記チオール修飾ヒアルロナンが、少なくとも４００ｋＤａ、好ましくは少なくとも５００ｋＤａ、より好ましくは少なくとも６００ｋＤａの平均分子量を有すること
を特徴とする、組成物。
架橋ポリマーが、約２５０ｋＤａ超、好ましくは約３００ｋＤａ超、より好ましくは約３５０ｋＤａ超の還元、滅菌後の平均分子量を有し、前記還元、滅菌後の平均分子量が、前記架橋ポリマーを還元条件に曝露した後の前記滅菌ヒドロゲル組成物からの還元されたチオール修飾ヒアルロナンの平均分子量として定義される、請求項１に記載の組成物。
チオール修飾ヒアルロナンが、最大１４ｍｇ／ｍＬ、好ましくは最大１２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは最大１０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に含まれる、請求項１または２に記載の組成物。
チオール修飾ヒアルロナンが、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に含まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
局所麻酔薬、好ましくはリドカインをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
チオール修飾ヒアルロナンが、アミド結合によりヒアルロナンに連結した修飾剤のコンジュゲートであって、前記修飾剤が、グルタチオン、直鎖または分岐Ｃ_２〜Ｃ_６アルキル鎖を含むアミノアルキルチオール、システイン、ホモシステイン；システアミン、システインおよびホモシステインのアミノ酸誘導体；ホモシステインのカルボン酸エステルおよびシステインのカルボン酸エステルを含む群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
チオール修飾ヒアルロナンが、ヒアルロナン−システアミンコンジュゲート（ＨＡ−システアミン）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
生体適合性多糖、好ましくは非修飾ヒアルロナンの群から選択される非修飾ポリマーをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
チオール修飾ヒアルロナンの修飾度に関して２０％未満、好ましくは１５％未満の残留チオール含有量を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
３０Ｎ以下の特定の押出力を特徴とし、特定の押出力が、１２ｍｍ／分の押出速度で、３０Ｇのゲージ（Ｇ）で測定されたルーメンによる皮下針を有する標準的な１ｍＬのガラスシリンジから組成物を押し出す間に測定される、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
シリンジおよび少なくとも１つの皮下針を含む注射用の投与ユニットであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物が前記シリンジに充填される、投与ユニット。
少なくとも１つの皮下針が、少なくとも２７Ｇ、好ましくは２７Ｇ〜３２Ｇのゲージ（Ｇ）で測定されたルーメンを特徴とする、請求項１１に記載の投与ユニット。
ルーメンが互いに異なる少なくとも２つの皮下針を含む、請求項１１または１２に記載の投与ユニット。
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の投与ユニットの美容的使用。
組成物が軟部組織充填剤として投与される、請求項１４に記載の組成物の美容的使用。
しわ、皮膚の欠陥を充填するため、顔または体の失われたボリュームを回復するため、蜂巣炎における凹みを低減するため、顔または体の輪郭を整えるための請求項１４または１５に記載の美容的使用。
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物を皮内、骨膜上または皮下に注射する工程を含む、美容方法。
医薬品としての使用のための請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
軟部組織充填剤として投与される、請求項１８に記載の使用のための組成物。
組織増強のために投与される、請求項１８に記載の使用のための組成物。
中足骨痛、尿または大便失禁、外陰膣委縮、声帯機能障害、静脈弁不全症、顔面脂肪委縮、衰弱性瘢痕、または形態学的非対称性もしくは奇形からなる群から選択される疾患の治療または予防における使用のための、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。