JP2021519790A - エレヌマブ組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、エレヌマブ並びに異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、及びＨＭＷ種を含む１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物に関する。エレヌマブ組成物を含む医薬製剤並びに組成物を使用及び特徴付けする方法もまた記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体を本明細書に援用する、２０１８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，６５１号の利益を主張する。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、全体として参照により本明細書に援用される。２０１９年３月１日に作成されたコンピューターで読み取り可能なフォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ−２１９０−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５であり、サイズが１５キロバイトである。

本発明は、バイオ医薬品の分野に関する。特に、本発明は、エレヌマブの機能活性に影響するエレヌマブバリアントの同定及び特徴付けに関する。本発明はまた、エレヌマブ及び１つ以上のエレヌマブバリアントを含む組成物、その組成物を含む医薬製剤、並びにその組成物を使用する方法及び特徴付けする方法に関する。

エレヌマブは、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体に特異的に結合し、ＣＧＲＰリガンドが受容体に結合し且つ受容体を活性化するのを妨げる完全ヒトモノクローナル抗体である。ＣＧＲＰは、片頭痛の病理発生において関係づけられてきた（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３５０：１０７３−１０７５，２００４；Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７：１６４−１７５，２０１０）。第２相及び第３相臨床試験において、エレヌマブで治療された慢性又は反復性片頭痛を有する患者は、プラセボを受容している患者と比較して、１ヶ月の片頭痛の日数の減少を経験した（Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１６：４２５−４３４，２０１７；Ｇｏａｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７７：２１２３−２１３２，２０１７）。

モノクローナル抗体などの複雑な治療用生物製剤は、生物製剤の安全性及び／又は有効性に影響し得る多数の製品品質属性を有し得る。そのような属性を同定し、分子の特性に対するそれらの影響を理解するために、通常、分子の包括的な構造及び機能評価が必要となる。分子の属性の理解は、一貫した製品の製造を保証するために重要である。

生物製剤のバリアントは、製造プロセス中又は保管条件下で生じる可能性がある。そのような製品バリアントは、製品関連物質又は製品関連不純物として分類され得る。製品関連物質は、製品の製造又は保管中に形成される所望の製品の分子バリアントであり、所望の製品のものに匹敵する特性を有し、不純物とはみなされない。逆に、製品関連不純物は、所望の製品の分子バリアントであり、これらは製品の有効性及び患者の安全性に関して所望の製品のものに匹敵する特性を有しない。したがって、製品関連不純物の同定及び特徴付けは、特に、生物製剤の薬物製品の製造及び品質管理に有用である。

本発明は、エレヌマブの製品関連不純物、特に、機能活性が低減したエレヌマブのバリアントの同定及び特徴付けに部分的に基づく。治療用エレヌマブ組成物中のこれらのバリアントの量の管理及びモニタリングは、エレヌマブ組成物が所望の臨床効果をもたらすのに必要な効力を有することを保証する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含むエレヌマブ組成物であって、エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ジスルフィドアイソフォームバリアント、高分子量（ＨＭＷ）種、又はこれらの組合せを含み、組成物中のエレヌマブバリアントの量が、特定の範囲内に制御されるエレヌマブ組成物を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物であって、１種以上のエレヌマブバリアントが、異性化バリアント及び脱アミドバリアントを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、異性化バリアントは、エレヌマブの一方又は両方の重鎖（配列番号１又は配列番号３）におけるアミノ酸位置１０５でイソアスパラギン酸残基又はスクシンイミドを有する。これら及び他の実施形態では、脱アミドバリアントは、アスパラギン酸残基、スクシンイミド、又はイソアスパラギン酸残基に変換されたエレヌマブの一方又は両方の重鎖（配列番号１又は配列番号３）におけるアミノ酸位置１０２でアスパラギン残基を有する。組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって決定されるとおり、約３０％未満、約１５％未満、約８％未満、又は約４％未満であり得る。

本発明はまた、エレヌマブ及びエレヌマブの１種以上の酸性バリアントの組成物を提供する。組成物中の酸性バリアントの量は、約４０％未満、例えば、約２５％〜約３８％又は約２６％〜約３４％であり得る。いくつかの実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量は、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって決定される。エレヌマブの酸性バリアントは、ジスルフィドアイソフォームバリアント、脱アミドバリアント、断片化バリアント、非コンセンサスグリコシル化バリアント、ＨＭＷ種、及びこれらの組合せを含む。ある種の実施形態では、酸性バリアントは、ジスルフィドアイソフォームバリアント、断片化バリアント、又はこれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、エレヌマブ及びエレヌマブのジスルフィドアイソフォームバリアントの組成物を提供する。エレヌマブのジスルフィドアイソフォームバリアントは、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォーム及び／又はＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含み得る。組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約２０％未満、例えば、約１０％未満、又は約８％未満、例えば、約４％〜約６％であり得る。組成物中のＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの量は、約２０％〜約４０％、約２６％〜約３８％、又は約３４％〜約３７％であり得る。ある種の実施形態では、ジスルフィドアイソフォームの量は、非還元逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって決定される。

本発明はまた、エレヌマブ及びエレヌマブの１種以上のサイズバリアント、例えば、低分子量（ＬＭＷ）種、中分子量（ＭＭＷ）種、及び高分子量（ＨＭＷ）種を含む組成物を含む。ある種の実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約３．０％未満、例えば、約２．５％又はそれ未満、約２．１％又はそれ未満、約１．８％又はそれ未満、約１．４％又はそれ未満、又は約１．２％又はそれ未満である。１つの特定の実施形態では、エレヌマブのＨＭＷ種は、主にエレヌマブの共有結合された二量体で構成される。エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量は、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＨＰＬＣ）によって決定され得る。

いくつかの実施形態では、本発明はまた、エレヌマブ組成物の品質を評価又は査定する方法を提供する。一実施形態では、方法は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物を得ること；組成物中の１種以上のエレヌマブの量を測定すること；既定の参照基準に対して１種以上のエレヌマブバリアントの測定された量を比較すること；及び比較が、既定の参照基準を満たすことを示す場合に、エレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製することを含む。方法は、以下のうちの１つ、２つ、又は３つを含み得る：（１）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定すること（例えば、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークのピーク面積パーセンテージによる）、（２）組成物中の酸性バリアントの量を測定すること（例えば、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークのピーク面積パーセンテージによる）、及び／又は（３）組成物中のＨＭＷ種の量を測定すること（例えば、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークのピーク面積パーセンテージによる）。ある種の実施形態では、３つ全ての測定が、エレヌマブ組成物に対して実施される。

本明細書に記載されるエレヌマブ組成物を含む医薬製剤もまた、本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物及び１種以上の薬学的に許容される賦形剤、例えば、緩衝剤、糖、及び界面活性剤を含む。医薬製剤は、プレフィルドシリンジ又は自動注入装置などの注射デバイスに取り込まれ得る。そのような実施形態では、プレフィルドシリンジ又は自動注入装置のための注射体積は、約２ｍＬ未満、例えば、約１ｍＬである。

本発明はまた、本発明のエレヌマブ組成物及び医薬製剤を使用して、必要とする患者における頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減する方法を含む。一実施形態では、方法は、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物を含む医薬製剤を患者に投与することを含む。頭痛は、片頭痛、群発頭痛、又は他の種類の頭痛障害、例えば、緊張型頭痛、片麻痺性片頭痛、月経関連片頭痛、及び網膜性片頭痛であり得る。ある種の実施形態では、本発明の方法又は使用に従って治療されることになる患者は、反復性片頭痛又は慢性片頭痛などの片頭痛を有するか、又はそれと診断される。

本明細書に記載される方法のいずれかにおける又は本明細書に開示される方法のいずれかによる投与のための医薬の作製のためのエレヌマブ組成物の使用が、具体的に検討される。例えば、本発明は、必要とする患者において頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための方法における使用のための本明細書に記載されるエレヌマブ組成物又は医薬製剤を含む。本発明はまた、必要とする患者において頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための医薬の作製における本明細書に記載されるエレヌマブ組成物又は医薬製剤の使用を包含する。

エレヌマブに関する重鎖（図１Ａ；配列番号１）及び軽鎖（図１Ｂ；配列番号２）のアミノ酸配列を示す。各鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）は、太字にされ且つ下線が引かれている。重鎖は、３０６位のアスパラギン残基にＮ結合グリコシル化部位を含有する。 エレヌマブに関してＮ及びＣ末端に共通の翻訳後修飾を有する重鎖（図１Ｃ；配列番号３）及び軽鎖（図１Ｄ；配列番号４）のアミノ酸配列を示す。各鎖におけるＣＤＲは、太字にされ且つ下線が引かれている。ｐＥは、ピログルタミン酸を表す。 エレヌマブに関する重鎖可変領域（図１Ｅ；配列番号５）及び軽鎖可変領域（図１Ｆ；配列番号６）のアミノ酸配列を示す。各可変領域におけるＣＤＲは、太字にされ且つ下線が引かれている。 原寸（図２Ａ）及び拡大スケール（図２Ｂ）でのエレヌマブ原体の代表的なＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。エレヌマブ原体は、硫酸アンモニウムの線形の減少勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともに酢酸ナトリウムｐＨ５．５の移動相を使用して、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって分析された。 ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより分析されたＨＩＣ−ＨＰＬＣ回収画分及びエレヌマブ原体の重ね合わせを示す。エレヌマブ原体及びセミ分取ＨＩＣ−ＨＰＬＣから回収された画分（Ｆ１〜Ｆ７）は、硫酸アンモニウムの線形の減少勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともに酢酸ナトリウムｐＨ５．５の移動相を使用して、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって分析された。各パネルは、数分間の溶出時間に対する２８０ｎｍでの吸光度のプロットである。エレヌマブ原体を伴う全部で７つのＨＩＣ−ＨＰＬＣ画分の重ね合わせが、パネル８において示される。 濃縮されたＨＩＣ−ＨＰＬＣ画分（Ｆ２〜Ｆ６）及び分画されていないエレヌマブ原体（ＤＳ）に関するエレヌマブ重鎖ＣＤＲ３内のペプチドについての溶出領域の還元トリプシンペプチドマップの重ね合わせである。ＴＨ１２Ｈ１３ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基９９〜１１３に相当し、ＴＨ１３は、配列番号１のアミノ酸残基１０１〜１１３に相当する。 熱ストレスに暴露されたエレヌマブ原体の、ＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルである。５０℃で１４日間インキュベートされたエレヌマブ原体は、硫酸アンモニウムの線形勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともに酢酸ナトリウムｐＨ５．５の移動相を使用して、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって分析された。上部のトレースは、１４日目の時点に相当する。 ５０℃で１４日間ストレスを与えられたエレヌマブ原体に関する拡大スケールでの還元トリプシンペプチドマッププロファイルを示す。ＴＨ１２Ｈ１３ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基９９〜１１３に相当し、ＴＨ１３は、配列番号１のアミノ酸残基１０１〜１１３に相当する。ＴＨ２６ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基３１１〜３２６に相当し、検出された断片は、Ｌ^３１５とＴ^３１６の間の非特異的切断に起因する。 ｐＨ７．４及び３７℃でストレスを与えられたエレヌマブ原体のＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルである。ＰＢＳ、ｐＨ７．４で１０ｍｇ／ｍＬに希釈され、３７℃で１４日間インキュベートされたエレヌマブ原体が、硫酸アンモニウムの線形勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともに酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５移動相を使用して、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって分析された。対照試料は、生理的ｐＨストレス条件試料とともに、製剤緩衝液、ｐＨ５．２中で希釈され、３７℃で１４日間インキュベートされた。 ｐＨ８．０及び２５℃でストレスを与えられたエレヌマブ原体のＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルである。トリス塩基、ｐＨ８．０で１０ｍｇ／ｍＬに希釈され、２５℃で１４日間インキュベートされたエレヌマブ原体が、硫酸アンモニウムの線形勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともに酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５移動相を使用して、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって分析された。対照試料は、高ｐＨストレス条件試料とともに、製剤緩衝液、ｐＨ５．２中で希釈され、２５℃で１４日間インキュベートされた。 ４種の異なる保管条件に関する同じロットのＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析におけるプレピークのピーク面積のパーセントの関数としての、エレヌマブのロットの相対的な効力のパーセントのプロットである。データの線形回帰分析からフィットさせた回帰線が、各温度について示される。４０℃の条件に関して、回帰線の傾きは、統計的にゼロから異なり、相対的な効力のパーセントがＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピークの面積パーセントの増加とともにどのように減少するかを示す。 ７０％の相対的な効力閾値と交差するように延長されたフィットさせた線を有する図９における４０℃の保管条件からのデータに関する、プロット及びフィットさせた回帰線を示す。７０％の相対的な効力の閾値線は、２８．８５％のＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピーク面積あたりで回帰線と交差する。 エレヌマブ原体の代表的なＣＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。エレヌマブ原体は、塩化ナトリウムの線形勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともにリン酸ナトリウムｐＨ６．６の移動相を使用して、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析された。 ＣＥＸ−ＨＰＬＣにより分析されたＣＥＸ−ＨＰＬＣ回収画分及びエレヌマブ原体の重ね合わせを示す。エレヌマブ原体及びセミ分取ＣＥＸ−ＨＰＬＣから回収された画分（Ｆ１〜Ｆ９）は、塩化ナトリウムの線形勾配による溶出及び２８０ｎｍ吸光度での検出とともにリン酸ナトリウムｐＨ６．６の移動相を使用して、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析された。各パネルは、数分間の溶出時間に対する２８０ｎｍでの吸光度のプロットである。 ＣＥＸ−ＨＰＬＣの酸性及びメインピーク画分（図１３Ａ）並びにＣＥＸ−ＨＰＬＣの塩基性ピーク画分（図１３Ｂ）のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。エレヌマブ原体（ＤＳ）及びＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分（Ｆ１〜Ｆ９）は、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（１．７μｍ粒径、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって分析され、２１５ｎｍでの検出とともに７５℃で０．１％のＴＦＡ含有移動相及び１−プロパノールの勾配を使用して溶出された。ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、及びＩｇＧ２−Ｂは、エレヌマブの各種ジスルフィドアイソフォームに相当する。各種ジスルフィドアイソフォームの構造は、図１５Ａ〜１５Ｃにおいて模式的に示される。 非還元（上部のトレース）及び還元（下部のトレース）エレヌマブのＬｙｓ−Ｃペプチドマップを示す。エレヌマブ原体が、変性され、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化された。還元のマップにおける標識されたピークは、還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップにおいて存在するが非還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップにおいては存在しないペプチドを同定する。標識されたペプチドの各々に関する説明は、表１８及び１９において列挙される。 非還元及び還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップによって同定されたエレヌマブジスルフィドアイソフォームＩｇＧ２−Ａ構造の模式図である。 非還元及び還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップによって同定されたエレヌマブジスルフィドアイソフォームＩｇＧ２−Ａ／Ｂ構造の模式図である。 非還元及び還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップによって同定されたエレヌマブジスルフィドアイソフォームＩｇＧ２−Ｂ構造の模式図である。 拡大スケールでのエレヌマブ原体の非還元ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルである。エレヌマブ原体は、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（１．７μｍ粒径、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって分析され、２１５ｎｍでの検出とともに７５℃で０．１％のＴＦＡ含有移動相及び１−プロパノールの勾配を使用して溶出された。ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、及びＩｇＧ２−Ｂは、エレヌマブの各種ジスルフィドアイソフォームに相当する。各種ジスルフィドアイソフォームの構造は、図１５Ａ〜１５Ｃにおいて模式的に示される。 エレヌマブ原体に対するジスルフィドアイソフォームバリアント濃縮ＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルの重ね合わせである。エレヌマブ原体及びＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分は、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（１．７μｍ粒径、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって分析され、２１５ｎｍでの検出とともに７５℃で０．１％のＴＦＡ含有移動相及び１−プロパノールの勾配を使用して溶出された。 原寸（図１７Ａ）及び拡大スケール（図１７Ｂ）でのエレヌマブ原体の代表的なＳＥ−ＵＨＰＬＣプロファイルを示す。エレヌマブ原体は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８移動相及び２８０ｎｍ吸光度での検出を使用して、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって分析された。緩衝液のピークは、アスタリスク（＊）で表した。 ＳＥ−ＵＨＰＬＣにより分析されたＳＥ−ＵＨＰＬＣ回収画分及びエレヌマブ原体の重ね合わせを示す。エレヌマブ原体及びセミ分取ＳＥ−ＨＰＬＣから回収された画分は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８移動相及び２８０ｎｍ吸光度での検出を使用して、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって分析された。各パネルは、エレヌマブ原体に関するＳＥ−ＵＨＰＬＣプロファイル上に重層された各画分についての分単位の溶出時間に対する２８０ｎｍでの吸光度のプロットである。エレヌマブ原体を伴う全部で３つのＳＥ−ＵＨＰＬＣ画分の重ね合わせが、パネル４において示される。 拡大スケールでのＳＥ−ＵＨＰＬＣ回収画分及びエレヌマブ原体のｒＣＥ−ＳＤＳプロファイルである。エレヌマブ原体（ＤＳ）及びＳＥ−ＵＨＰＬＣ画分（メイン、ＨＭＷ１、ＨＭＷ２）は、２５℃のＳＤＳゲル緩衝液で充填されたベアフューズドシリカキャピラリーへの動電学的注入の前に変性され、還元された。吸光度は、２２０ｎｍでモニターされた。系のピークは、アスタリスク（＊）で表した。ＬＭＷ＝低分子量種；ＭＭＷ＝中分子量種；ＨＭＷ＝高分子量種；ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖；ＮＧＨＣ＝非グリコシル化重鎖；ポスト−ＨＣ＝ポスト重鎖。 熱ストレスに暴露されたエレヌマブ原体のＳＥ−ＵＨＰＬＣプロファイルである。５０℃で最大１４日間インキュベートされたエレヌマブ原体は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８移動相及び２８０ｎｍ吸光度での検出を使用して、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって分析された。上部のトレースは、１４日目の時点に相当する。

本発明は、機能活性の低減を示すエレヌマブのバリアントの同定及び特徴付けに関する。特に、一定の構造改変を有するエレヌマブのバリアントは、ＣＧＲＰリガンドによるＣＧＲＰ受容体の活性化を遮断する際にエレヌマブよりはるかに効力が低い。各々が本明細書においてより詳細に記載されるこのようなバリアントは、異性化バリアント、脱アミドバリアント、ジスルフィドアイソフォームバリアント、酸性バリアント、及びＨＭＷ種を含む。エレヌマブ原体及びエレヌマブ薬物製品においてこれらのバリアントの量を制限することによって、エレヌマブ組成物の全体的な効力が維持され得るか、又は臨床試験中に利用され且つ臨床的有効性を有すると観察されたエレヌマブ組成物に匹敵し得る。したがって、本発明は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物であって、組成物中のエレヌマブバリアントの量が、本明細書に記載されるとおりの特定の範囲又は限度内に制御される組成物を提供する。

エレヌマブという用語は、配列番号５の重鎖可変領域配列及び配列番号６の軽鎖可変領域配列を含むＩｇＧ２抗体を指す。一実施形態では、エレヌマブは、配列番号１の配列を含む重鎖及び配列番号２の配列を含む軽鎖を含む。そのような実施形態では、エレヌマブは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体であって、重鎖の各々が、配列番号１の配列を含み、且つ軽鎖の各々が、配列番号２の配列を含む抗体である。組換えにより作製される場合、エレヌマブは、重鎖の４５６位でのＣ末端リジン残基の除去並びに軽鎖及び重鎖におけるＮ末端グルタミン残基のピログルタミン酸への環化などの、重鎖及び軽鎖の末端での共通の翻訳後修飾を経る場合がある。したがって、エレヌマブという用語は、重鎖の一方若しくは両方におけるＣ末端リジン残基を欠き、且つ／又は軽鎖の一方若しくは両方及び／又は重鎖の一方若しくは両方におけるグルタミン残基の代わりにＮ末端残基としてピログルタミン酸残基を含むＩｇＧ２抗体を指してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、エレヌマブは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体であって、重鎖の各々が、配列番号３の配列を含み、且つ軽鎖の各々が、配列番号４の配列を含む抗体である。他の実施形態では、エレヌマブは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体であって、重鎖の各々が、配列番号１又は配列番号３の配列を含み、且つ軽鎖の各々が、配列番号２又は配列番号４の配列を含む抗体である。

ある種の実施形態では、本発明の組成物中に存在するエレヌマブバリアントは、電荷バリアントである。電荷バリアントは、とりわけ、抗体の実効電荷を直接的に変えるか、立体構造変化を誘導するか、又は局所的な電荷分布に影響を及ぼす翻訳後修飾に起因する様々な電荷プロファイルを有するエレヌマブのバリアントを指す。このような翻訳後修飾は、脱アミド、異性化、糖化、酸化、及びシアル酸付加グリコシル化を含み得る。電荷バリアントは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、エレヌマブから分離され、且つ検出され得る。エレヌマブの電荷バリアントは、異性化バリアント、脱アミドバリアント、ジスルフィドアイソフォームバリアント、酸性バリアント、及びグリコシル化バリアントを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、エレヌマブの電荷バリアントは、異性化バリアントである。エレヌマブの異性化バリアントは、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドにおける１つ以上のアスパラギン酸残基が、イソアスパラギン酸又はスクシンイミドに変換されているエレヌマブのバリアントを指す。一実施形態では、エレヌマブの異性化バリアントは、エレヌマブの一方又は両方の重鎖（配列番号１又は配列番号３）におけるアミノ酸位置１０５でイソアスパラギン酸残基又はスクシンイミドを有する。実施例１において記載されるとおり、重鎖可変領域のＣＤＲ３における１０５位でのアスパラギン酸残基からイソアスパラギン酸への変換は、エレヌマブの阻害性の効力を著しく低減する。

他の実施形態では、エレヌマブの電荷バリアントは、脱アミドバリアントである。エレヌマブの脱アミドバリアントは、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドにおける１つ以上のアスパラギン残基が、アスパラギン酸に変換され、そして次に、スクシンイミド又はイソアスパラギン酸に変換され得るエレヌマブのバリアントを指す。一実施形態では、脱アミドバリアントは、アスパラギン酸、スクシンイミド、又はイソアスパラギン酸に変換されたエレヌマブの一方又は両方の重鎖（配列番号１又は配列番号３）におけるアミノ酸位置１０２でアスパラギン残基を有する。実施例１において記載されるとおり、重鎖可変領域のＣＤＲ３における１０２位でのアスパラギン残基の脱アミドは、エレヌマブの阻害性の効力を著しく低減する。別の実施形態では、脱アミドバリアントは、アスパラギン酸、スクシンイミド、又はイソアスパラギン酸に変換されたエレヌマブの一方又は両方の重鎖におけるアミノ酸位置３９３及び／又は３９８でアスパラギン残基を有する。

エレヌマブの異性化バリアント及び脱アミドバリアントを検出し、且つ定量化する方法としては、実施例１において記載される疎水性相互作用クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）法などの疎水性相互作用クロマトグラフィー、実施例１において記載されるＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳペプチドマッピング法などのペプチドマッピング、実施例３において記載されるカチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）法などのイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び当業者に知られる他の方法、例えば、Ｋａｍｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３４：１２９−１３５，２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．３０：１４７９−１４９０，２００３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．３１：１７６４−１７７２，２０１０；Ｆａｓｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．１４９８：２１５−２２３，２０１７；及びＬｅｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，Ｖｏｌ．１０４８：１３０−１３９，２０１７において記載されるものが挙げられる。

本発明の組成物は、エレヌマブ組成物の全体的な効力が臨床的有効性を有すると観察されるレベルで維持されるような、制御された量のエレヌマブの異性化バリアント及び脱アミドバリアントを含む。実施例１及び２を参照されたい。例えば、ある種の実施形態では、本発明は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物であって、１種以上のエレヌマブバリアントが、異性化バリアント及び脱アミドバリアントを含み、且つ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、約３０％未満である組成物を提供する。組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約２５％未満、約２０％未満、約１７％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、又は約４％未満であり得る。一実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約１５％未満である。別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約８％未満である。さらに別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約４％未満である。いくつかの実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約０．５％〜約３０％、約１％〜約２０％、約１％〜約１７％、約１％〜約１５％、約１％〜約１２％、約１％〜約１０％、約０．５％〜約８％、約０．５％〜約６％、約１％〜約４％、約０．５％〜約３．５％、約１．５％〜約２．５％、又は約１．７％〜約２．１％であり得る。一実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約１％〜約１０％である。別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約１％〜約４％である。さらに別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、約０．５％〜約３．５％である。

本発明の組成物中のエレヌマブの異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、これらのバリアントを検出し、且つ定量化するための上記の方法のいずれかによって決定され得る。ある種の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって決定される。異性化バリアント（例えば、重鎖中のＡｓｐ１０５の異性化）及び脱アミドバリアント（例えば、重鎖中のＡｓｎ１０２の脱アミド）は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣのプレピーク画分において支配的な種である。実施例１及び２を参照されたい。したがって、エレヌマブ組成物中のこれらのバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプレピークのピーク面積のパーセンテージから決定され得る。ＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムのプレピークは、通常、最大のピークの高さを有するクロマトグラムにおけるピークであるメインピークに関する保持時間より短い保持時間を有する、検出限界を超えるピークの高さを有するピークを指す。図２Ａ、２Ｂ、５、７、及び８を参照されたい。メインピークは、エレヌマブ（例えば、配列番号１又は３の配列を有する２つの重鎖及び配列番号２又は４の配列を有する２つの軽鎖を含む抗体）に相当し、これは、組成物中の抗体分子の主要な形態である。プレピークのピーク面積のパーセンテージは、以下の式に従って計算され得る：

（式中、総積分ピーク面積は、検出限界を超えるピークの高さを有するクロマトグラム中の全てのピークについて合わせた面積である）。同様に、メインピークのピーク面積のパーセンテージは、以下の式に従って計算され得る：

（式中、総積分ピーク面積は、検出限界を超えるピークの高さを有するクロマトグラム中の全てのピークについて合わせた面積である）。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法は、実施例１において記載されるとおりに実施される。

ある種の実施形態では、本発明の組成物中の異性化バリアント（例えば、重鎖におけるＡｓｐ１０５の異性化）及び脱アミドバリアント（例えば、重鎖におけるＡｓｎ１０２の脱アミド）は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約１５％又はそれ未満である。一実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約１０％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約８％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約６％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約４％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約３．２％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約２．７％又はそれ未満である。いくつかの実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約１％〜約１０％である。他の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約１％〜約４％である。さらに他の実施形態では、組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約０．５％〜約３．５％である。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含み、エレヌマブバリアントは、異性化バリアント及び脱アミドバリアントを含み、且つ
（ｉ）組成物中のエレヌマブの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９０％又はそれ超、約９２％又はそれ超、約９３．９％又はそれ超、約９４．４％又はそれ超、約９６．２％又はそれ超、約９６．８％又はそれ超、又は約９７．３％又はそれ超であり；且つ
（ｉｉ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約１０％又はそれ未満、約８％又はそれ未満、約６．１％又はそれ未満、約５．６％又はそれ未満、約３．８％又はそれ未満、約３．２％又はそれ未満、又は約２．７％又はそれ未満である。

一実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９２％又はそれ超であり、且つ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約８％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９６．８％又はそれ超であり、且つ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約３．２％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９７．３％又はそれ超であり、且つ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約２．７％又はそれ未満である。これら及び他の実施形態では、ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、実施例１において記載されるとおりに実施され、且つ量は、メインピーク及びプレピークに関するピーク面積のパーセンテージから決定される。

実施例２において記載されるとおり、重鎖ＣＤＲ３におけるＡｓｐ１０５の異性化は、強制的な熱ストレス条件に対して高度に感受性であり、且つ重鎖ＣＤＲ３（Ａｓｎ１０２）及びＦｃ領域（Ａｓｎ３９３及びＡｓｎ３９８）の両方における脱アミドは、高いｐＨ（例えば、ｐＨ７．４又はそれ超）に暴露されたときに増加した。したがって、エレヌマブの異性化バリアント及び脱アミドバリアントの生成は、エレヌマブ組成物の室温を超える温度及び塩基性溶液、例えば、７．０を超えるｐＨを有する溶液への暴露時間を制限することによって、製造プロセス及び保管の間制御され得る。例えば、いくつかの実施形態では、製造中のプールでの保持又はエレヌマブ組成物の保管は、１４日以下の間室温で保たれる。他の実施形態では、エレヌマブ組成物の長期間の保管は、１５℃未満、例えば、２℃〜８℃の間の温度で実施される。エレヌマブの異性化バリアント及び脱アミドバリアントはまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどの精製プロセスを通してエレヌマブ組成物から除去され得る。エレヌマブの異性化バリアント及び脱アミドバリアントの両方が、ＨＩＣにおいてエレヌマブより早く溶出し、したがって、これらのバリアントは、これらの早期の溶出画分を回収し、且つ廃棄することによってエレヌマブ組成物から除去され得る。エレヌマブの脱アミドバリアントは一般に、エレヌマブより多くの負の電荷を有するため、カチオン交換クロマトグラフィーにおいてエレヌマブより早く溶出することになるか、又はアニオン交換クロマトグラフィーにおいてエレヌマブより遅く溶出することになる。したがって、より酸性の脱アミドバリアントは、カチオン交換又はアニオン交換レジンから溶出する画分の回収の時間を適切に調節することによって、エレヌマブ組成物から除去され得る。

ある種の実施形態では、本発明の組成物中のエレヌマブの電荷バリアントは、酸性バリアントである。酸性バリアントは、負の電荷を得たか若しくは正の電荷を失ったか、又は立体構造変化による表面電荷プロファイルの変化を有し、それによりエレヌマブと比較してより酸性の性質を有するエレヌマブのバリアントを指す。エレヌマブの酸性バリアントは、エレヌマブと比較して低減した阻害性の効力を示す。実施例３及び表１４を参照されたい。酸性バリアントは、等電点ゲル電気泳動、キャピラリー等電点ゲル電気泳動、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）及びアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）などの電荷特性に基づいてタンパク質を分離する任意の方法を使用して、エレヌマブから分離され、検出され、且つ定量化され得る。イオン交換クロマトグラフィーによって分析される場合、酸性バリアントは、エレヌマブに相当するメインピークに対するそれらの保持時間によって同定され得る。例えば、酸性バリアントは、ＣＥＸからのメインピークより早く溶出する、すなわち、酸性バリアントは、ＣＥＸにおけるメインピークについての保持時間より短い保持時間を有する。ＡＥＸを使用する場合、酸性バリアントは、メインピークより遅く溶出し、したがって、ＡＥＸにおけるメインピークについての保持時間より長い保持時間を有する。

いくつかの実施形態では、本発明は、エレヌマブ組成物の全体的な効力が臨床的有効性を有すると観察されるレベルで維持されるような、制御された量のエレヌマブの酸性バリアントを含む組成物を提供する。実施例３を参照されたい。したがって、ある種の実施形態では、本発明は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブ酸性バリアントを含む組成物を提供し、組成物中の酸性バリアントの量は、約４０％未満である。組成物中の酸性バリアントの量は、約３８％未満、約３７％未満、約３６％未満、約３５％未満、約３４％未満、約３３％未満、約３２％未満、約３１％未満、約３０％未満、約２９％未満、約２８％未満、約２７％未満、又は約２６％未満であり得る。一実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約３８％未満である。別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約３５％未満である。別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約３２％未満である。さらに別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約３０％未満である。いくつかの実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約２０％〜約４０％、約２５％〜約３８％、約２４％〜約３５％、約２８．５％〜約３７．５％、約２６％〜約３４％、約２８％〜約３２％、約３２．５％〜約３７．５％、約２８．７％〜約３１．３％、又は約２６．５％〜約３３．６％であり得る。一実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約２５％〜約３８％である。別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約２６％〜約３４％である。さらに別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、約２８％〜約３２％である。

本発明の組成物中のエレヌマブの酸性バリアントの量は、これらのバリアントを検出し、且つ定量化するための上記の方法のいずれかによって決定され得る。ある種の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、イオン交換クロマトグラフィーによって決定される。１つの特定の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、実施例３において記載される方法などの、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって決定される。エレヌマブの酸性バリアントは、ＣＥＸによって分離される場合、エレヌマブ（メインピーク）よりも早く溶出し、エレヌマブの塩基性バリアントは、エレヌマブ（メインピーク）よりも遅く溶出する。図１１を参照されたい。エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおける酸性ピークのピーク面積のパーセンテージから決定され得る。酸性ピークは、メインピークについての保持時間より短い保持時間を有する、検出限界を超えるピークの高さを有するそれらのピークである。塩基性ピークは、メインピークについての保持時間より長い保持時間を有する、検出限界を超えるピークの高さを有するそれらのピークである。所望の成分（例えば、酸性ピーク、メインピーク、又は塩基性ピーク）に関するピーク面積のパーセンテージは、所望の成分（例えば、酸性ピーク、メインピーク、又は塩基性ピーク）に関するピーク面積を、総積分ピーク面積で割り、その結果に１００を乗ずることによって計算され得る。ある種の実施形態では、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ法は、実施例３において記載されるとおりに実施される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含み、エレヌマブバリアントは、酸性バリアントを含み、且つ組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって測定されるとおり、約４０％又はそれ未満、約３８％又はそれ未満、約３６％又はそれ未満、約３５％又はそれ未満、約３４％又はそれ未満、又は約３２％又はそれ未満である。一実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって測定されるとおり、約２５％〜約３８％である。別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって測定されるとおり、約２６％〜約３４％である。さらに別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって測定されるとおり、約２６．５％〜約３３．６％である。さらに別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって測定されるとおり、約２８．７％〜約３１．３％である。別の実施形態では、組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって測定されるとおり、約３２．５％〜約３７．５％である。これら及び他の実施形態では、ＣＥＸ−ＨＰＬＣは、実施例３において記載されるとおりに実施され、酸性バリアントの量は、酸性ピークに関するピーク面積のパーセンテージから決定される。

酸性バリアントは、ジスルフィドアイソフォームバリアント、脱アミドバリアント、断片化バリアント、非コンセンサスグリコシル化バリアント、高分子量（ＨＭＷ）種、及びこれらの組合せを含み得る。ある種の実施形態では、酸性バリアントは、ジスルフィドアイソフォームバリアント（本明細書でより詳細に記載される）、断片化バリアント、又はこれらの組合せを含む。実施例３において記載されるとおり、断片化バリアント又はジスルフィドアイソフォームバリアント、特に、ＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームにおいて濃縮された酸性画分は、エレヌマブと比較して低減した効力を示す。

いくつかの実施形態では、酸性バリアントは、断片化バリアントを含む。断片化バリアントは、軽鎖ポリペプチド及び／又は重鎖ポリペプチドの切断をもたらすペプチド結合の加水分解によって形成され得る。したがって、エレヌマブの断片化バリアントは、全長鎖より少ないアミノ酸からなるエレヌマブ軽鎖（配列番号２又は４）の断片又はエレヌマブ重鎖（配列番号１又は３）の断片を指す。断片化バリアントは、低分子量（ＬＭＷ）及び中分子量（ＭＭＷ）種としてこれらの断片化されたバリアントを分離する、実施例３において記載されるｒＣＥ−ＳＤＳ法などのドデシル硫酸ナトリウムによる還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して測定され得る。エレヌマブのＬＭＷ種は、約２２，７９０Ｄａの分子量を有する、インタクトなエレヌマブ軽鎖のもの未満の分子量を有する断片である。エレヌマブのＭＭＷ種は、約５０，１６５Ｄａ（脱グリコシル化）の分子量を有する、インタクトなエレヌマブ軽鎖のものより大きいが、インタクトなエレヌマブ重鎖のもの未満の分子量を有する断片である。ｒＣＥ−ＳＤＳで分離すると、エレヌマブのＬＭＷ種は、エレヌマブ軽鎖ピークの前に移動し、エレヌマブのＭＭＷ種は、エレヌマブ軽鎖ピークとエレヌマブ重鎖ピークの間に移動する。例えば、図１９を参照されたい。

エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又は混合形式のクロマトグラフィーなどの、電荷特性に基づいてタンパク質を分離するクロマトグラフィー法を使用して還元され得る。例えば、米国特許第８，９４６，３９５号明細書；同第９，０６７，９９０号明細書；同第９，２４９，２１８号明細書；及び同第９，３４６，８７９号明細書において記載される方法を参照されたい。上記のとおり、エレヌマブの酸性バリアントは、カチオン交換クロマトグラフィーにより分離するとエレヌマブ（メインピーク）より早く溶出する。したがって、酸性バリアントは、エレヌマブメインピークの溶出の前に回収され、且つ廃棄され得るか、又はエレヌマブ画分の回収は、酸性バリアントの溶出後に開始され得る。アニオン交換クロマトグラフィーによって分離される場合、エレヌマブの酸性バリアントは、エレヌマブ（メインピーク）より遅く溶出し、したがって、酸性バリアントは、酸性バリアントの溶出前にエレヌマブ画分の回収を止めることによってエレヌマブ組成物から減少され得るか又は除去され得る。

ある種の実施形態では、酸性バリアントは、ジスルフィドアイソフォームバリアントを含む。ＩｇＧ２抗体は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の配置に基づいて異なる構造アイソフォームを示し得る。ＩｇＧ２−Ａとして知られる古典的なジスルフィドアイソフォームにおいて、Ｆａｂアームは、ヒンジ領域にジスルフィド結合を介して連結されず、１つの重鎖のヒンジ領域における４つのシステイン残基（例えば、配列番号１又は３のＣ２３２、Ｃ２３３、Ｃ２３６、及びＣ２３９）はそれぞれ、他の重鎖のヒンジ領域における対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成する。図１５Ａを参照されたい。ジスルフィドアイソフォームバリアントは、古典的なＩｇＧ２−Ａアイソフォームにおいて見出されるものとは異なるジスルフィド結合の結合性を有するＩｇＧ２抗体のバリアントを指す。いくつかの実施形態では、ジスルフィドアイソフォームバリアントは、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームである。ＩｇＧ２−Ｂアイソフォーム構造において、両方のＦａｂアームは、重鎖定常ＣＨ１領域及び／又は軽鎖定常ＣＬ領域におけるシステイン残基とジスルフィド結合を形成するヒンジ領域において１つ以上のシステイン残基によってヒンジ領域に連結される。図１５Ｃを参照されたい。例えば、一実施形態では、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームは、重鎖に関する配列番号１又は３及び軽鎖に関する配列番号２又は４に対するアミノ酸位置を有する第１の重鎖（ＨＣ１）、第１の軽鎖（ＬＣ１）、第２の重鎖（ＨＣ２）、及び第２の軽鎖（ＬＣ２）の間で以下のジスルフィド結合の結合性を含む：
・ＨＣ２のＣ１５７に対するＨＣ１のＣ２３２
・ＬＣ１のＣ２１５に対するＨＣ１のＣ２３３
・ＨＣ１のＣ１５７に対するＨＣ２のＣ２３２
・ＬＣ２のＣ２１５に対するＨＣ２のＣ２３３
・ＨＣ２のＣ２３６に対するＨＣ１のＣ２３６
・ＨＣ２のＣ２３９に対するＨＣ１のＣ２３９

他の実施形態では、ジスルフィドアイソフォームバリアントは、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームである。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォーム構造において、一方のみのＦａｂアームが、重鎖定常ＣＨ１領域及び／又は軽鎖定常ＣＬ領域におけるシステイン残基とジスルフィド結合を形成するヒンジ領域において１つ以上のシステイン残基によってヒンジ領域に連結される。図１５Ｂを参照されたい。一実施形態では、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームは、重鎖に関する配列番号１又は３及び軽鎖に関する配列番号２又は４に対するアミノ酸位置を有するＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２の間で以下のジスルフィド結合の結合性を含む：
・ＨＣ２のＣ１５７に対するＨＣ１のＣ２３２
・ＬＣ２のＣ２１５に対するＨＣ２のＣ２３２
・ＨＣ２のＣ２３３に対するＨＣ１のＣ２３３
・ＨＣ２のＣ２３６に対するＨＣ１のＣ２３６
・ＨＣ２のＣ２３９に対するＨＣ１のＣ２３９

本発明は、エレヌマブ及びその１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントを含む組成物を含む。ジスルフィドアイソフォームバリアントは、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォーム、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォーム、又はこの２つの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、エレヌマブ及びその１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントを含み、１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントは、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含み、且つ組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約２０％未満である。組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、又は約６％未満であり得る。一実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約１０％未満である。別の実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約８％未満である。ある種の実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１６％、約３％〜約１２％、約０．５％〜約８％、約１％〜約６％、約４％〜約６％、約４．４％〜約５．９％、又は約４．６％〜約５．２％であり得る。一実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約０．５％〜約８％である。別の実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約４％〜約６％である。

ある種の実施形態では、本発明の組成物は、エレヌマブ及びその１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントを含み、１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントは、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約１０％〜約５６％、約２０％〜約４０％、約２６％〜約３８％、約２７％〜約３２％、約３２％〜約３８％、約３４％〜約３７％、又は約３４．２％〜約３５．５％であり得る。一実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの量は、約３２％〜約３８％である。別の実施形態では、組成物中のＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの量は、約３４％〜約３７％である。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、エレヌマブＩｇＧ２−Ａアイソフォーム、エレヌマブＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォーム、及びエレヌマブＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含み、
（ｉ）組成物中のＩｇＧ２−Ａアイソフォームの量は、約５０％〜約７０％、約５２％〜約６６％、約５６％〜約６０％、又は約５７．４％〜約５９．３％であり、
（ｉｉ）組成物中のＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの量は、約２６％〜約３８％、約３２％〜約３８％、約３４％〜約３７％、又は約３４．２％〜３５．５％であり；且つ
（ｉｉｉ）組成物中のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、約３％〜約１２％、約１％〜約１０％、約４％〜約８％、又は約４．６％〜約５．２％である。

ジスルフィドアイソフォームを検出し、定量化する方法としては、実施例３及び４並びにＷｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８３（２３）：１６１９４−１６２０５，２００８において記載されるＲＰ−ＨＰＬＣ法などの非還元逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）；実施例４において記載されるＬｙｓ−Ｃペプチドマッピング法などのペプチドマッピング；並びにＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．８２（３）：１０９０−１０９９，２０１０及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５４：１９５６−１９６２，２０１５において記載されるものなどの質量分析に基づく方法が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の組成物中のジスルフィドアイソフォーム（例えば、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、及びＩｇＧ２−Ｂ）の量は、非還元ＲＰ−ＨＰＬＣ、必要に応じて、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルにおけるアイソフォームの各々についてのピーク面積パーセンテージを使用することによって決定される（例えば、図１６Ａを参照のこと）。

ジスルフィドアイソフォームの比率は、全体が参照により本明細書によって援用されるＤｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８３（２３）：１６２０６−１６２１５，２００８、国際公開第２００６／０４７３４０号パンフレット、又は国際公開第２００６／０６００８３号パンフレットに記載される方法を使用して、還元−酸化（酸化還元）剤単独又はカオトロピック薬剤との組合せに対して、異なるアイソフォームを含む組成物を暴露することによって変化させられ得る。例えば、ＩｇＧ２−Ａアイソフォームの比率は、酸化還元剤（例えば、システイン／シスチン又はグルタチオン／酸化グルタチオン）及びカオトロピック薬剤（例えば、グアニジン塩酸塩）に対して、異なるアイソフォームを含む組成物を暴露することによって増加され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ａアイソフォームより著しく低い効力であるエレヌマブのＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量は、必要に応じて、Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；国際公開第２００６／０４７３４０号パンフレット；又は国際公開第２００６／０６００８３号パンフレットにおいて記載される方法に従って、カオトロピック薬剤と組み合わせた酸化還元剤に対して組成物を暴露することによって減少され得るか又は組成物から除去され得る。

ある種の実施形態では、本発明の組成物中に存在するエレヌマブバリアントは、サイズバリアントである。エレヌマブのサイズバリアントは、エレヌマブ単量体より低い分子量又はエレヌマブ単量体より高い分子量のいずれかを有するバリアントを指す。本明細書で使用する場合、エレヌマブ単量体という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むインタクトな抗体を指し、単量体は、Ｎ又はＣ末端修飾を伴わない脱グリコシル化重鎖及び軽鎖を測定するとき、約１４６，１９４Ｄａの分子量を有する。サイズバリアントは、上記のＬＭＷ種及びＭＭＷ種、並びに高分子量（ＨＭＷ）種などの断片化バリアントを含む。エレヌマブのＨＭＷ種は、エレヌマブ単量体より大きい分子量を有する種を指す。ＨＭＷ種は、共有結合性及び非共有結合性の自己会合により形成される二量体、多量体、及びエレヌマブの他の凝集体形態を含み得る。いくつかの実施形態では、エレヌマブのＨＭＷ種は、エレヌマブの共有結合された二量体（すなわち、２つの共有結合されたエレヌマブ単量体）を含む。ある種の実施形態では、共有結合されたエレヌマブ二量体は、還元及び変性条件下で二量体が個々の重鎖及び軽鎖に還元している、還元できる二量体である。

エレヌマブのサイズバリアントを検出し、定量化する方法としては、実施例５に記載されるサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＨＰＬＣ）法などのサイズ排除クロマトグラフィー、実施例３に記載されるｒＣＥ−ＳＤＳ及びｎｒＣＥ−ＳＤＳ法などの還元又は非還元条件下で実施されるドデシル硫酸ナトリウムによるキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）、沈降速度超遠心分離法、並びにモル質量を決定するための静的光散乱検出を伴うＳＥ−ＵＨＰＬＣが挙げられる。

ＨＭＷ種において濃縮される画分は、エレヌマブと比較して、ＣＧＲＰ受容体のリガンド誘導性活性化を阻害することにおいて大幅に効力が低い。実施例５及び表２６を参照されたい。したがって、本発明は、エレヌマブ組成物の全体的な効力が臨床的有効性を有すると観察されるレベルで維持されるような、制御された量のＨＭＷ種を含有するエレヌマブ組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、エレヌマブ及びエレヌマブのＨＭＷ種を含み、組成物中のＨＭＷ種の量は、約３．０％未満である。組成物中のＨＭＷ種の量は、約２．５％又はそれ未満、約２．４％又はそれ未満、約２．３％又はそれ未満、約２．２％又はそれ未満、約２．１％又はそれ未満、約２．０％又はそれ未満、約１．８％又はそれ未満、約１．６％又はそれ未満、約１．４％又はそれ未満、約１．２％又はそれ未満、約１．０％又はそれ未満、約０．８％又はそれ未満、約０．６％又はそれ未満、又は約０．４％又はそれ未満であり得る。一実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約１．８％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約１．４％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約１．２％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約０．６％又はそれ未満である。いくつかの実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約０．３％〜約２．４％、約０．４％〜約１．２％、約０．６％〜約２．１％、約０．３％〜約１．８％、約１．０％〜約１．６％、又は約０．６％〜約１．４％であり得る。一実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約０．４％〜約１．２％である。別の実施形態では、組成物中のＨＭＷ種の量は、約０．６％〜約２．１％である。

本発明の組成物中のサイズバリアントの量は、これらのバリアントを検出し、且つ定量化するための上記の方法のいずれかによって決定され得る。ある種の実施形態では、サイズバリアント（例えば、ＨＭＷ種）の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって決定される。エレヌマブのＨＭＷ種は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣ中のエレヌマブ単量体（メインピーク）より早く溶出し、したがって、ＳＥ−ＵＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプレピークに相当するが、ＬＭＷ及びＭＭＷ種は、エレヌマブ単量体より遅く溶出し、したがって、ＳＥ−ＵＨＰＬＣクロマトグラムにおけるポストピークに相当する。実施例５並びに図１７Ａ及び１７Ｂを参照されたい。したがって、エレヌマブ組成物中のこれらのサイズバリアントの量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプレピーク（ＨＭＷ種）又はポストピーク（ＬＭＷ及びＭＭＷ種）のピーク面積のパーセンテージから決定され得る。いくつかの実施形態では、ＳＥ−ＵＨＰＬＣ法は、実施例５において記載されるとおりに実施される。

ある種の実施形態では、本発明の組成物は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブサイズバリアントを含み、エレヌマブサイズバリアントは、エレヌマブのＨＭＷ種を含み、且つ
（ｉ）組成物中のエレヌマブの量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９７．５％又はそれ超、約９７．９％又はそれ超、約９８．２％又はそれ超、約９８．４％又はそれ超、約９８．６％又はそれ超、約９８．８％又はそれ超、約９９．２％又はそれ超、又は約９９．４％又はそれ超であり；且つ
（ｉｉ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約２．５％又はそれ未満、約２．１％又はそれ未満、約１．８％又はそれ未満、約１．６％又はそれ未満、約１．４％又はそれ未満、約１．２％又はそれ未満、約０．８％又はそれ未満、又は約０．６％又はそれ未満である。

一実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９７．９％又はそれ超であり、且つ組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約２．１％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９８．２％又はそれ超であり、且つ組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約１．８％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９８．８％又はそれ超であり、且つ組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約１．２％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物中のエレヌマブの量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるメインピークによって測定されるとおり、約９８．６％又はそれ超であり、且つ組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約１．４％又はそれ未満である。これら及び他の実施形態では、ＳＥ−ＵＨＰＬＣは、実施例５において記載されるとおりに実施され、且つ量は、メインピーク及びプレピークに関するピーク面積のパーセンテージから決定される。

エレヌマブ組成物中のサイズバリアント（例えば、ＨＭＷ種）の量は、サイズ排除クロマトグラフィー及び濾過工程などのサイズ又は流体力学的体積に基づいてタンパク質を分離する方法を使用して減少され得る。加えて、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び混合形式のクロマトグラフィーもまた、効率的にＨＭＷ種を減少させることができる。例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，Ｖｏｌ．８４８：２８−３９，２００７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．１２１７：２１６−２２４，２０１０；米国特許第６，６２０，９１８号明細書；同第９，５０５，８０３号明細書；及び同第９，７８３，５７０号明細書に記載される方法を参照されたい。上記のとおり、エレヌマブのＨＭＷ種は、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離するとエレヌマブ（メインピーク）より早く溶出する。したがって、ＨＭＷ種は、エレヌマブメインピークの溶出の前に回収され、且つ廃棄され得るか、又はエレヌマブ画分の回収は、ＨＭＷ種の溶出後に開始され得る。

本発明のエレヌマブ組成物は、本明細書に記載されるエレヌマブバリアントのうちの１種以上に関して分析され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物を含み、エレヌマブバリアントは、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含み、且つ組成物は、制御された量のこれらのバリアントの各々を有する。一実施形態では、組成物は、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含み、エレヌマブバリアントは、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含み、且つ組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２５％〜約３８％である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２．１％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約８．０％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約３８％未満である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２．５％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約１０％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約３２．５％〜約３７．５％である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約１．８％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約６．１％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２６．５％〜約３３．６％である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約１．２％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約３．２％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２６．５％〜約３３．６％である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約１．２％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約２．７％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２６．５％〜約３３．６％である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約１．４％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約３．２％又はそれ未満である。別の実施形態では、組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上又は全てを有する：（ａ）組成物中の酸性バリアントの量は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２８．７％〜約３１．３％である；（ｂ）組成物中のＨＭＷ種の量は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約０．６％又はそれ未満である；及び（ｃ）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって測定されるとおり、約２．１％又はそれ未満である。

本発明のエレヌマブ組成物は、宿主細胞において重鎖及び軽鎖をコードする核酸を組換えにより発現すること、宿主細胞培養物又は宿主細胞可溶化物からエレヌマブを部分的に精製するか又は精製すること、及び以下に詳細に記載される方法に従って本明細書に詳述されるエレヌマブバリアントのうちの１種以上に関して得られた組成物を分析することによって作製され得る。

エレヌマブの組換え産生のために、重鎖（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド）及び軽鎖（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド）をコードする１種以上の核酸が、１種以上の発現ベクターに挿入される。重鎖をコードする核酸及び軽鎖をコードする核酸が、単一の発現ベクターに挿入され得るか、又はそれらは、別々の発現ベクターに挿入され得る。本明細書で使用される用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要である、所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得る。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列、リボソーム結合部位及び場合により他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー並びに終結及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。目的のコード配列に作動可能に連結された分泌シグナルペプチド配列も、任意選択的に発現ベクターによってコードされ得、その結果、必要に応じて細胞から目的ポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。ベクターはまた、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する１種以上の選択マーカー遺伝子を含み得る。エレヌマブの重鎖及び軽鎖並びに好適なシグナルペプチド配列及びエレヌマブを組換えにより発現するための発現ベクターのための他の成分をコードする例示的な核酸は、全体として参照により本明細書によって援用される国際公開第２０１０／０７５２３８号パンフレットにおいて記載される。

発現ベクターが構築され、エレヌマブの重鎖及び軽鎖成分をコードする１つ以上の核酸分子がベクターの適当な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入され得る。選択された宿主細胞へのエレヌマブのための発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の既知の技術を含む、よく知られる方法によって行われ得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型に応じることになる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）において記載される。

宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、エレヌマブを合成し、これは、続いて、培養培地（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）から、又はそれを産生する宿主細胞（それが分泌されない場合）から直接回収され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）のために所望されるか又は必要であるポリペプチドの改変及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の因子によるであろう。

例示的な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。真核生物の微生物、例えば糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適な適切なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュヴァンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュヴァンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのいくつかの他の属、種及び株が一般に利用可能であり、本明細書において有用である。

グリコシル化抗体の発現のための宿主細胞は、多細胞生物由来であり得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモ虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。このような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニアＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶ）のＬ−１変異体及びカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶ）のＢｍ−５株が公に入手可能である。

脊椎動物宿主細胞もまた好適な宿主であり、このような細胞からの抗体の組換え産生は常法となっている。発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野でよく知られており、限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中の増殖用としてサブクローニングされた２９３又は２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞及び多くの他の細胞株が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、エレヌマブを発現するためのいくつかの実施形態において好ましい宿主細胞である。

宿主細胞はエレヌマブの産生のために、上記の発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。エレヌマブを産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；同第４，６５７，８６６号明細書；同第４，９２７，７６２号明細書；同第４，５６０，６５５号明細書；若しくは同第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０／０３４３０号パンフレット；又は国際公開第８７／００１９５号パンフレットにおいて記載される培地のいずれかが、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬剤など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な栄養補助物質も、当業者に知られる適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。

宿主細胞を培養すると、抗体は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１の工程として、宿主細胞が溶解され（例えば、機械的剪断、浸透圧ショック、又は酵素的方法により）、粒状の細片（例えば、宿主細胞及び溶解断片）が、例えば、遠心分離、精密濾過、又は限外濾過によって除去される。抗体が培養培地に分泌される場合、抗体は、遠心分離又は精密濾過により宿主細胞から分離されてもよく、続いて必要に応じて、限外濾過により濃縮されてもよい。エレヌマブはさらに、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又は混合形式のクロマトグラフィーなどの１種以上のクロマトグラフィー工程を使用して精製され得るか又は部分的に精製され得る。

エレヌマブ組成物が精製されるか又は得られると、組成物は、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、及びサイズバリアント（例えば、ＨＭＷ種）を含む本明細書に記載される１種以上のエレヌマブバリアントの存在及び量について評価され得る。したがって、本発明は、エレヌマブ組成物の品質を査定するための方法であって、エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物を得ること；組成物中の１種以上のエレヌマブバリアントの量を測定すること；既定の参照基準に対して１種以上のエレヌマブバリアントの測定された量を比較すること；及び比較が、既定の参照基準を満たすことを示す場合に、エレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製することを含む方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（１）組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定すること、（２）組成物中の酸性バリアントの量を測定すること、及び／又は（３）組成物中のＨＭＷ種の量を測定することのうちの１つ、２つ、又は３つを含む。ある種の実施形態では、３つ全ての測定が、エレヌマブ組成物に対して実施される。

各エレヌマブバリアントに関する既定の参照基準は、ＣＧＲＰ受容体のリガンド誘導性の活性化を阻害するためのエレヌマブ組成物の効力に著しく影響を及ぼさないバリアントの閾値量又は量の範囲であり得る。例えば、各エレヌマブバリアントに関する既定の参照基準は、バリアントのこれらの限度／範囲を有するエレヌマブ組成物が、臨床試験において評価され、且つ臨床的有効性を有すると示されたエレヌマブ組成物に匹敵する効力を有したため、バリアントの各々に関して本明細書で開示される限度又は範囲のいずれかであり得る。

方法のある種の実施形態では、組成物中のエレヌマブバリアントの測定された量が既定の参照基準を満たす場合、エレヌマブ組成物は、許容できるものとして分類され、例えば、組成物の医薬製剤を作製することによる（例えば、１種以上の賦形剤又は希釈剤と組み合わせることにより）；組成物の医薬製品を作製することによる（例えば、バイアル、シリンジ、自動注入装置、又は他の容器若しくは送達デバイスに充填することにより）；使用のための指示書、希釈剤、及び／又は送達デバイスとともに組成物をパッケージ化すること；又は市販又は販売業者への配送のために組成物をリリースすることなどの、製造又は分配プロセスにおける次の工程に進められ得る。方法のいくつかの実施形態では、組成物中のエレヌマブバリアントの測定された量が既定の参照基準を満たす場合、エレヌマブ組成物の医薬製剤が作製される。方法の他の実施形態では、組成物中のエレヌマブバリアントの測定された量が既定の参照基準を満たす場合、エレヌマブ組成物の医薬製品が作製される。エレヌマブ組成物の医薬製剤及び医薬製品を作製する方法は、下により詳細に記載される。組成物中のエレヌマブバリアントの測定された量が既定の参照基準を満たさない場合、方法のいくつかの実施形態では、エレヌマブ組成物は、許容できないものとして分類され、且つ廃棄され得るか、消失させられ得るか、又は既定の参照基準が満たされるように組成物中のエレヌマブバリアントの量を除去するか又は減少させるための追加の精製などの、追加の製造工程にかけられ得る。

一実施形態では、エレヌマブ組成物の品質を査定するための方法は、エレヌマブ及びエレヌマブ異性化バリアント及び脱アミドバリアントを含有するエレヌマブ組成物を得ること；組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定すること；異性化バリアント及び脱アミドバリアントの測定された量を既定の参照基準と比較すること；並びに比較が、既定の参照基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製することを含む。エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約３０％未満、例えば、約２５％又はそれ未満、約２０％又はそれ未満、約１７％又はそれ未満、約１５％又はそれ未満、約１２％又はそれ未満、約１０％又はそれ未満、約８％又はそれ未満、約６％又はそれ未満、又は約４％又はそれ未満であり得る。一実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約１５％又はそれ未満である。別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約１０％又はそれ未満である。別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約８％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約６％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約４％又はそれ未満である。ある種の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約３．２％又はそれ未満である。他の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、約２．７％又はそれ未満である。いくつかの実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量に関する既定の参照基準は、ある範囲の量、例えば、エレヌマブ組成物の約１％〜約１０％、エレヌマブ組成物の約１％〜約４％、又はエレヌマブ組成物の約０．５％〜約３．５％であり得る。ある種の実施形態では、エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量は、例えば、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークのピーク面積のパーセンテージにより、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって測定される。そのような実施形態では、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法は、実施例１において記載されるとおりに実施され得る。

別の実施形態では、エレヌマブ組成物の品質を査定するための方法は、エレヌマブ及びエレヌマブ酸性バリアントを含有するエレヌマブ組成物を得ること；組成物中の酸性バリアントの量を測定すること；酸性バリアントの測定された量を既定の参照基準と比較すること；及び比較が、既定の参照基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製することを含む。エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約４０％未満、例えば、約３８％又はそれ未満、約３７％又はそれ未満、約３６％又はそれ未満、約３５％又はそれ未満、約３４％又はそれ未満、約３３％又はそれ未満、約３２％又はそれ未満、約３１％又はそれ未満、約３０％又はそれ未満、約２９％又はそれ未満、約２８％又はそれ未満、約２７％又はそれ未満、又は約２６％又はそれ未満であり得る。一実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約３８％又はそれ未満である。別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約３５％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約３２％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約３０％又はそれ未満である。いくつかの実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、ある範囲の量、例えば、エレヌマブ組成物の約２５％〜約３８％、エレヌマブ組成物の約３２．５％〜約３７．５％、エレヌマブ組成物の約２６％〜約３４％、又はエレヌマブ組成物の約２６．５％〜約３３．６％である。１つの特定の実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約２５％〜約３８％である。別の特定の実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量に関する既定の参照基準は、約２６．５％〜約３３．６％である。ある種の実施形態では、エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量は、例えば、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークのピーク面積のパーセンテージにより、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定される。そのような実施形態では、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ法は、実施例３において記載されるとおりに実施され得る。

別の実施形態では、エレヌマブ組成物の品質を査定するための方法は、エレヌマブ及びエレヌマブのＨＭＷ種を含有するエレヌマブ組成物を得ること；組成物中のＨＭＷ種の量を測定すること；ＨＭＷ種の測定された量を既定の参照基準と比較すること；及び比較が、既定の参照基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製することを含む。エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、約３．０％未満、例えば、約２．５％又はそれ未満、約２．４％又はそれ未満、約２．３％又はそれ未満、約２．２％又はそれ未満、約２．１％又はそれ未満、約２．０％又はそれ未満、約１．８％又はそれ未満、約１．６％又はそれ未満、約１．４％又はそれ未満、約１．２％又はそれ未満、約１．０％又はそれ未満、約０．８％又はそれ未満、約０．６％又はそれ未満、又は約０．４％又はそれ未満であり得る。一実施形態では、エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、約２．５％又はそれ未満である。別の実施形態では、エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、約１．８％又はそれ未満である。別の実施形態では、エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、約１．４％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、約１．２％又はそれ未満である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、約０．６％又はそれ未満である。エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量に関する既定の参照基準は、いくつかの実施形態では、ある範囲の量、例えば、エレヌマブ組成物の約０．３％〜約２．４％、エレヌマブ組成物の約０．６％〜約２．１％、エレヌマブ組成物の約０．４％〜約１．２％、又はエレヌマブ組成物の約０．６％〜約１．４％であり得る。ある種の実施形態では、エレヌマブ組成物中のＨＭＷ種の量は、例えば、ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークのピーク面積のパーセンテージにより、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定される。そのような実施形態では、ＳＥ−ＵＨＰＬＣ法は、実施例５において記載されるとおりに実施され得る。

本発明の方法のある種の実施形態では、方法は、
（ａ）エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物であって、エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含むエレヌマブ組成物を得ること；
（ｂ）以下の：
（ｉ）ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定し、且つ測定された量を約１０％又はそれ未満の既定の参照基準と比較すること；
（ｉｉ）ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって組成物中の酸性バリアントの量を測定し、且つ測定された量を約２５％〜約３８％の既定の参照基準と比較すること；及び／又は
（ｉｉｉ）ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中のＨＭＷ種の量を測定し、且つ測定された量を約２．５％又はそれ未満の既定の参照基準と比較することのうちの１つ、２つ、又は３つ全てを実施することによってエレヌマブ組成物を評価すること；並びに
（ｃ）工程（ｂ）における比較が、既定の参照基準／判定基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製すること
を含む。いくつかの実施形態では、３つの工程（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、及び（ｂ）（ｉｉｉ）全てが実施される。他の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の工程のみが実施される。さらに他の実施形態では、（ｂ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。ある種の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。

本発明の方法のある種の他の実施形態では、方法は、
（ａ）エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物であって、エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含むエレヌマブ組成物を得ること；
（ｂ）以下の：
（ｉ）ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定し、且つ測定された量を約３．２％又はそれ未満の既定の参照基準と比較すること；
（ｉｉ）ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって組成物中の酸性バリアントの量を測定し、且つ測定された量を約２６．５％〜約３３．６％の既定の参照基準と比較すること；及び／又は
（ｉｉｉ）ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中のＨＭＷ種の量を測定し、且つ測定された量を約１．２％又はそれ未満の既定の参照基準と比較することのうちの１つ、２つ、又は３つ全てを実施することによってエレヌマブ組成物を評価すること；並びに
（ｃ）工程（ｂ）における比較が、既定の参照基準／判定基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製すること
を含む。いくつかの実施形態では、３つの工程（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、及び（ｂ）（ｉｉｉ）全てが実施される。他の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の工程のみが実施される。さらに他の実施形態では、（ｂ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。ある種の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、方法は、
（ａ）エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物であって、エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含むエレヌマブ組成物を得ること；
（ｂ）以下の：
（ｉ）ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定し、且つ測定された量を約２．７％又はそれ未満の既定の参照基準と比較すること；
（ｉｉ）ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって組成物中の酸性バリアントの量を測定し、且つ測定された量を約２６．５％〜約３３．６％の既定の参照基準と比較すること；及び／又は
（ｉｉｉ）ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中のＨＭＷ種の量を測定し、且つ測定された量を約１．２％又はそれ未満の既定の参照基準と比較することのうちの１つ、２つ、又は３つ全てを実施することによってエレヌマブ組成物を評価すること；並びに
（ｃ）工程（ｂ）における比較が、既定の参照基準／判定基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製すること
を含む。いくつかの実施形態では、３つの工程（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、及び（ｂ）（ｉｉｉ）全てが実施される。他の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の工程のみが実施される。さらに他の実施形態では、（ｂ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。ある種の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。

本発明の方法の他の実施形態では、方法は、
（ａ）エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物であって、エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含むエレヌマブ組成物を得ること；
（ｂ）以下の：
（ｉ）ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量を測定し、且つ測定された量を約３．２％又はそれ未満の既定の参照基準と比較すること；
（ｉｉ）ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける酸性ピークによって組成物中の酸性バリアントの量を測定し、且つ測定された量を約２６．５％〜約３３．６％の既定の参照基準と比較すること；及び／又は
（ｉｉｉ）ＳＥ−ＵＨＰＬＣにおけるプレピークによって組成物中のＨＭＷ種の量を測定し、且つ測定された量を約１．４％又はそれ未満の既定の参照基準と比較することのうちの１つ、２つ、又は３つ全てを実施することによってエレヌマブ組成物を評価すること；並びに
（ｃ）工程（ｂ）における比較が、既定の参照基準／判定基準を満たすことを示す場合にエレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製すること
を含む。いくつかの実施形態では、３つの工程（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、及び（ｂ）（ｉｉｉ）全てが実施される。他の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の工程のみが実施される。さらに他の実施形態では、（ｂ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。ある種の実施形態では、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉｉ）の工程のみが実施される。

品質を査定するか又は上記のエレヌマブ組成物を評価するための本発明の方法は、様々な状況において採用され得る。例えば、この方法は、エレヌマブのための製造プロセスの各種工程での品質管理法として（例えば、製造中の管理法として）使用され得る。いくつかの実施形態では、方法は、製造プロセスの大部分又は全ての完了時に、例えば、エレヌマブ原体（例えば、有効活性成分又はＡＰＩ）又はエレヌマブ薬物製品（例えば、ヒトへの使用のための１種以上の賦形剤で製剤化されたＡＰＩ）のためのロットリリース方法として使用され得る。方法はまた、様々な期間で保管されたエレヌマブ組成物を評価するために使用されて、薬物の有効期限の決定を容易にし得る。方法はまた、既定の参照基準が、初めは満たされず、再処理された（例えば、追加の精製操作にかける）エレヌマブ組成物を再評価するために使用され得る。

したがって、方法において採用されるエレヌマブ組成物は、エレヌマブ及び場合によっては１種以上のエレヌマブバリアントを含む任意の組成物であり得る。いくつかの実施形態では、エレヌマブ組成物は、配列番号１の重鎖をコードする核酸及び配列番号２の軽鎖をコードする核酸を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から得られる。そのような実施形態では、エレヌマブ組成物は、細胞培養収集物（例えば、清澄化された細胞培養上清又は清澄化された細胞可溶化物）である。他のそのような実施形態では、エレヌマブ組成物は、１つ以上の精製操作（例えば、１つ以上のクロマトグラフィー又は濾過工程に由来するプール又は画分）にかけられたエレヌマブの部分的に精製された調製物である。一実施形態では、エレヌマブ組成物は、カチオン交換クロマトグラフィー材料からの溶出プールである。別の実施形態では、エレヌマブ組成物は、エレヌマブ原体（例えば、有効活性成分又はＡＰＩ）である。さらに別の実施形態では、エレヌマブ組成物は、エレヌマブ薬物製品（例えば、ヒトへの使用のための１種以上の賦形剤で製剤化されたエレヌマブ原体又はＡＰＩ）である。

エレヌマブ組成物の生物活性は、上記の品質評価法の一部として評価され得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒトＣＧＲＰ受容体のＣＧＲＰリガンド誘導性の活性化を阻害するエレヌマブ組成物の能力を査定することを含む。ＣＧＲＰ受容体の活性化を査定するための様々なアッセイは、当該技術分野において知られており、ＣＧＲＰリガンド誘導性カルシウム動員及びｃＡＭＰ生成を測定する細胞系アッセイを含む。例示的な細胞系ｃＡＭＰアッセイが、実施例１に記載される。他の好適なＣＧＲＰ受容体活性化アッセイは、全てが全体として参照により本明細書により援用される、Ａｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１９７：１７９−１８５，１９９９；Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７７：７−１６，２００７；米国特許第８，１６８，５９２号明細書、及び国際公開第２０１０／０７５２３８号パンフレットに記載される。

本発明は、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物のいずれか１つ及び１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤を含む。「薬学的に許容される」は、使用する用量及び濃度でヒトレシピエントに対して毒性がなく、且つ／又はヒトに投与したときにアレルギー又は有害な反応を生じない分子、化合物及び組成物を指す。ある種の実施形態では、医薬製剤は、エレヌマブ組成物の、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸収性、又は透過性の改変、維持、又は保存のための材料を含有し得る。そのような実施形態では、好適な材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（酢酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）；充填剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性促進剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張化促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。治療的使用のための分子を製剤化するための方法及び好適な材料は、薬学分野において知られており、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬製剤は、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約４．５〜約６．５の範囲内に溶液のｐＨを維持する緩衝剤、安定剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む。好適な緩衝剤としては、グルタミン酸塩、酢酸塩、トリス、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、及びリン酸塩緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、医薬製剤は、酢酸塩緩衝剤を含む。酢酸塩緩衝剤は、酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムから作製され得る。例えば、酢酸塩のカリウム、アンモニウム、カルシウム又はマグネシウム塩などの他の塩が使用され得る。酢酸緩衝剤を含む医薬製剤は通常、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、及び約５．５を含む、約４．５〜約５．５のｐＨ又は約４．８〜約５．２のｐＨを有する。

安定剤は、抗体の天然の立体構造を安定化し、且つ／又は抗体の物理的又は化学的分解を防ぐか若しくは低減する賦形剤を指す。好適な安定剤としては、ポリオール（例えば、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、エリスリトール及びトレイトール）、糖（例えば、フルクトース、グルコース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース、マンノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、ソルボース、スクラロース、メレチトース及びラフィノース）、並びにアミノ酸（例えば、グリシン、メチオニン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はグルタミン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、安定剤として糖を含む。これら及び他の実施形態では、糖は、スクロースである。

ある種の実施形態では、医薬製剤は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、溶解した液体の表面張力を低下させる働きをする物質である。界面活性剤は、例えば、液体製剤中の凝集、粒子形成及び／又は表面吸着を防ぐか若しくは制御するか、又は凍結乾燥の間及び／又は凍結乾燥製剤における再構成プロセスの間にこれらの現象を防ぐか若しくは制御することを含む、様々な目的のために医薬製剤中に含まれ得る。界面活性剤としては、例えば、有機溶媒及び水溶液の両方において粒子溶解性を呈する両親媒性有機化合物が挙げられる。界面活性剤の一般的な特徴は、水の表面張力を低下させ、油と水の間の界面張力を低下させ、且つミセルをも形成するそれらの能力を含む。本発明の医薬製剤に組み込まれ得る界面活性剤は、非イオン性及びイオン性界面活性剤の両方を含む。好適な非イオン性界面活性剤としては、アルキルポリ（エチレンオキシド）、オクチルグルコシド及びデシルマルトシドなどのアルキルポリグルコシド、セチルアルコール及びオレイルアルコールなどの脂肪アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、及びコカミドＴＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の特定の例としては、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート２８、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５などを含むポリソルベート；例えば、ポロキサルコール又はポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）としても知られるポロクサマー１８８、ポロクサマー４０７又はポリエチレン−ポリプロピレングリコ−ルなど、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。好適なイオン性界面活性剤としては、例えば、アニオン性、カチオン性及び双性イオン界面活性剤が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、石鹸、脂肪酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム及び他のアルキル硫酸塩などのスルホン酸塩系又はカルボン酸塩系界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシル・タロウ・アミン（ＰＯＥＡ）及び塩化ベンザルコニウムなどの第四級アンモニウム系界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。双性イオン又は両性界面活性剤としては、例えば、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン及びココアンホグリシン塩が挙げられる。ある種の実施形態では、医薬製剤は、非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０である。別の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

ある種の実施形態では、医薬製剤は、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物（例えば、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約１４０ｍｇ／ｍＬのエレヌマブ組成物）、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭの酢酸塩、約６％〜約９％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．００８％〜約０．０１２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０又はポリソルベート２０のいずれか１つを含む。これらの製剤のｐＨは、約４．９〜約５．５（例えば、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、又は約５．４のｐＨ）の範囲である。１つの特定の実施形態では、医薬製剤は、７０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約２５ｍＭの酢酸塩、約７．３％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、医薬製剤は、約５．２±０．２のｐＨを有する。別の特定の実施形態では、医薬製剤は、１４０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約３４ｍＭの酢酸塩、約６．５％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、医薬製剤は、約５．２±０．２のｐＨを有する。

医薬製剤は、非経口の注射（例えば、静脈内又は皮下注射）に好適であることが好ましい。非経口の注射に好適な代表的な医薬品形態は、滅菌水溶液又は分散液及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。好ましくは、医薬製剤は、無菌であり、且つシリンジ又は他の注射デバイスを介する送達を可能にするために十分に流動性を有する（すなわち、製剤は、シリンジ又は他の注射デバイスの通過を妨げるような過度に粘性のあるものではない）。滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過により達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この濾過方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後のいずれに行われてもよい。非経口投与用医薬組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液中に貯蔵することができる。非経口製剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグ又はバイアルに入れられてもよい。非経口製剤は、シリンジ、自動注入装置、又はペン注射デバイス又はそのような注射デバイスとの使用のために適合されたカートリッジ中に貯蔵され得る。

上記の医薬製剤は、バイアル、シリンジ、自動注入装置、又は他の容器若しくは送達デバイスに充填されてもよく、必要に応じて、医薬製品を調製するための使用のための指示書（例えば、頭痛、例えば、片頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための医薬製剤を使用するための指示書を含む処方情報）とともにパッケージ化されてもよい。ある種の実施形態では、本明細書に記載される医薬製剤は、自己投与注射デバイスに組み込まれる。そのようなデバイスは、市販されており、自動注入装置、投与ペン、微量注入ポンプ、及びプレフィルドシリンジが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬製剤が組み込まれ得る例示的なデバイスとしては、自動注入装置（例えば、ＳｕｒｅＣｌｉｃｋ（登録商標）、ＥｖｅｒＧｅｎｔｌｅ（登録商標）、Ａｖａｎｔｉ（登録商標）、ＤｏｓｅＰｒｏ（登録商標）、Ｍｏｌｌｙ（登録商標）、及びＬｅｖａ（登録商標））、ペン注射デバイス（例えば、Ｍａｄｉｅ（登録商標）ペン注射器、ＤＣＰ（商標）ペン注射器、ＢＤ Ｖｙｓｔｒａ（商標）ディスポーザブルペン、ＢＤ（商標）再利用可能ペン）、並びにプレフィルドシリンジ（ＢＤ Ｓｔｅｒｉｆｉｌｌ（商標）、ＢＤ Ｈｙｐａｋ（商標）、Ｂａｘｔｅｒからのプレフィルドシリンジ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、プレフィルドシリンジを製造するために、シリンジ内に組み込まれ、且つ貯蔵される。他の実施形態では、医薬製剤は、自動注入装置内に組み込まれる。プレフィルドシリンジ又は自動注入装置の注射体積は、約２ｍＬ又はそれ未満、約１．５ｍＬ又はそれ未満、又は約１ｍＬ又はそれ未満であり得る。ある種の実施形態では、本明細書に記載される医薬製剤は、約１ｍＬの注射体積でシリンジ又は自動注入装置内に組み込まれる。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、約４．５〜約５．５のｐＨで約７０ｍｇ／ｍＬ〜約１４０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭの酢酸塩、約６％〜約９％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．００８％〜約０．０１２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０又はポリソルベート２０を含むプレフィルドシリンジを提供する。一実施形態では、プレフィルドシリンジは、約５．２±０．２のｐＨで７０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約２５ｍＭの酢酸塩、約７．３％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。別の実施形態では、プレフィルドシリンジは、約５．２±０．２のｐＨで１４０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約３４ｍＭの酢酸塩、約６．５％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、プレフィルドシリンジの注射体積は、約１ｍＬであり得る。

他の実施形態では、本発明は、約４．５〜約５．５のｐＨで約７０ｍｇ／ｍＬ〜約１４０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭの酢酸塩、約６％〜約９％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．００８％〜約０．０１２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０又はポリソルベート２０を含む自動注入装置を提供する。一実施形態では、自動注入装置は、約５．２±０．２のｐＨで７０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約２５ｍＭの酢酸塩、約７．３％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。別の実施形態では、自動注入装置は、約５．２±０．２のｐＨで１４０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物、約３４ｍＭの酢酸塩、約６．５％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、自動注入装置の注射体積は、約１ｍＬであり得る。

本明細書に記載されるエレヌマブ組成物及びそのような組成物を含む医薬製剤は、頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するために使用され得る。したがって、本発明は、必要とする患者において頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための方法であって、患者に本明細書に記載されるエレヌマブ組成物又はエレヌマブ組成物を含む医薬製剤のいずれかを投与することを含む方法を含む。ある種の実施形態では、本発明は、必要とする患者において頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減する際の使用のための本明細書に記載されるエレヌマブ組成物又はエレヌマブ組成物を含む医薬製剤を提供する。他の実施形態では、本発明は、必要とする患者において頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための医薬の作製における本明細書に記載されるエレヌマブ組成物又はエレヌマブ組成物を含む医薬製剤の使用を含む。「頭痛の発生を予防するか又は低減する」は、組成物／製剤の投与の前の頭痛の頻度、持続時間、若しくは重症度と比較して又は組成物／製剤が投与されていない患者（すなわち、対照対象）における頭痛の頻度、持続時間、若しくは重症度と比較して、頭痛の頻度、持続時間、若しくは重症度における低減を指す。

ある種の実施形態では、本発明の方法又は使用は、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物又はエレヌマブ組成物を含む医薬製剤のいずれかを患者に投与することによって、必要とする患者における片頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減する。「片頭痛」は、吐き気若しくは嘔吐又は光若しくは音に対する過敏と関連する頭痛及び／又は以下の痛みの特徴：片側性の痛み、ズキズキする痛み、中度〜重度の痛みの強さ又は身体活動によって悪化する痛みの少なくとも２つを特徴とする頭痛である。いくつかの実施形態によれば、７０ｍｇ又は１４０ｍｇの本明細書に記載されるエレヌマブ組成物を含む医薬製剤は、患者における片頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するために１ヶ月に１回患者に投与される。そのような実施形態では、医薬製剤は、例えば、上記の注射デバイス（例えば、プレフィルドシリンジ又は自動注入装置）の１つを使用して、皮下注射によって送達され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、反復性片頭痛を有するか、患っているか又は診断されている。片頭痛歴（例えば、これまでに少なくとも５回の片頭痛の発作）を有する患者が１ヶ月に１４日以下の片頭痛日を有する場合、反復性片頭痛と診断される。「片頭痛日」は、前兆の有無に関わらず、患者が３０分を超えて続く「片頭痛」の発症、継続又は再発を経験する任意の暦日を含む。いくつかの実施形態では、反復性片頭痛を有するか、患っているか又は診断された患者は、平均して１ヶ月あたり少なくとも４日で１５日未満の片頭痛日を有する。関連する実施形態では、反復性片頭痛を有するか、患っているか又は診断された患者は、平均して１ヶ月あたり１５日未満の頭痛日を有する。本明細書で使用される場合、「頭痛日」は、患者が片頭痛又は３０分を超えて持続するか、若しくは急性頭痛治療を必要とする任意の頭痛を経験するいずれかの暦日である。ある種の実施形態では、患者は、高頻度反復性片頭痛を有するか又は患っていると分類され得る。高頻度反復性片頭痛患者は、１ヶ月あたり８〜１４日の片頭痛日を有する患者である。他の実施形態では、患者は、低頻度反復性片頭痛を有するか又は患っていると分類され得る。低頻度反復性片頭痛患者は、１ヶ月あたり８日未満の片頭痛日を有する患者である。

いくつかの実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、慢性片頭痛を有するか、患っているか又は診断されている。慢性片頭痛は、片頭痛患者（すなわちこれまでに少なくとも５回の片頭痛の発作を有する患者）のある患者が１ヶ月に１５日以上の頭痛を有し、且つ少なくとも８日の頭痛日が片頭痛日である場合に診断される。いくつかの実施形態では、慢性片頭痛を有するか、患っているか又は診断された患者は、平均して１ヶ月あたり１５日以上の頭痛日を有する。

ある種の実施形態では、本発明の方法により治療される片頭痛患者は、予防的な片頭痛療法を以前に受けていなかった。他の実施形態では、本発明の方法により治療される片頭痛患者は、１つ以上の予防的な片頭痛療法に失敗したか又はそれに対して不耐性である。１つのそのような実施形態では、患者は、以前の少なくとも１つの片頭痛予防薬による療法に対して応答できなかった。「応答できない」又は「治療失敗」は、薬剤の標準治療レジメン後の患者において片頭痛の頻度、持続時間、及び／又は重症度を低減する際の予防薬の有効性の欠如を指す。例えば、一実施形態では、片頭痛予防薬による以前の治療に失敗した患者は、その薬剤による治療の前の１ヶ月間の片頭痛日数と比較して、片頭痛予防薬の投与後に同じ又はより多い１ヶ月間の片頭痛日数を経験した患者である。片頭痛予防薬による以前の治療に応答できないことはまた、片頭痛予防薬に耐容性を示すことができないことも含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、片頭痛予防薬による以前の治療に失敗した患者は、薬剤に関連した副作用に耐容性を示すことができない患者である。そのような実施形態では、薬剤に関連した副作用は、患者が有する別の医学的状態を悪化させる場合があるか、又はそれと適合しない場合がある。ある種の実施形態では、患者は、β遮断薬（例えば、プロプラノロール、チモロール、アテノロール、メトプロロール、及びナドロール）、抗てんかん薬（例えば、ジバルプロエクス、バルプロ酸ナトリウム、バルプロ酸、トピラマート、及びガバペンチン）、三環系抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ドキセピン、及びフルオキセチン）、並びにオナボツリナムトキシンＡから選択される１種以上の薬剤による治療に失敗したか又は耐容性を示さない。

本明細書に記載されるエレヌマブ組成物及びそのような組成物を含む医薬製剤はまた、緊張型頭痛、群発頭痛、片麻痺性片頭痛、月経性片頭痛、及び網膜性片頭痛などの他の種類の頭痛障害の発生を治療するか、予防するか、又は低減するために使用され得る。ＣＧＲＰ／ＣＧＲＰ受容体シグナル伝達に関連した他の疾患又は状態はまた、本明細書に記載されるエレヌマブ組成物及びそのような組成物を含む医薬製剤により治療又は改善され得る。ＣＧＲＰ／ＣＧＲＰ受容体シグナル伝達に関連した疾患又は状態としては、慢性疼痛（例えば、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛、線維筋痛症、関節炎疼痛）、アロディニア、炎症（例えば、神経因性炎症、乾癬、変形性関節症）、ＩＩ型糖尿病、過活動膀胱、及び喘息が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の医薬製剤は、非経口的に患者に投与されることが好ましい。非経口投与としては、腹腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、皮下、脳内、脳室内、及び髄腔内投与が挙げられる。ある種の実施形態では、医薬製剤は、患者に静脈内投与される。他の実施形態では、医薬製剤は、例えば、皮下注射によって、患者に皮下投与される。注射は、本明細書に記載されるデバイス（例えば、プレフィルドシリンジ及び自動注入装置）のうちの１つ以上を使用して、患者に送達され得る。

実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１．ＨＩＣ−ＨＰＬＣによるエレヌマブ電荷バリアントの同定及び特徴付け
エレヌマブは、ＩｇＧ２サブクラスの完全ヒトモノクローナル抗体である。抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換えにより産生され、２つの重鎖及びラムダサブクラスの２つの軽鎖からなる。各重鎖は、４つの鎖内ジスルフィドを伴う４５６個のアミノ酸を含有する。各軽鎖は、２つの鎖内ジスルフィドを伴う２１６個のアミノ酸を含有する。エレヌマブは、合計で１８個の鎖内及び鎖間ジスルフィド結合のための６個の鎖間ジスルフィドを含有する。エレヌマブの重鎖及び軽鎖のためのアミノ酸配列は、それぞれ図１Ａ及び１Ｂにおいて示される。各重鎖は、配列番号１の３０６位のアスパラギン残基のコンセンサスグリコシル化部位でＮ結合グリカンを含有する。哺乳動物細胞によって産生される抗体について頻繁に観察されるとおり、重鎖における４５６位のＣ末端リジン残基は、細胞培養における産生の間に存在するカルボキシペプチダーゼによって大部分が除去される。加えて、重鎖及び軽鎖の両方におけるＮ末端グルタミン残基は頻繁に、産生の間にピログルタミン酸に変換される。これらのＮ末端及びＣ末端修飾を伴うエレヌマブの重鎖及び軽鎖に関するアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｃ及び１Ｄにおいて示される。両方の重鎖から除去されたＣ末端リジン並びに完全な重鎖及び軽鎖のＮ末端ピログルタミン酸構造を伴う脱グリコシル化エレヌマブの計算質量は、１４５，８７２ダルトンである。

エレヌマブは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＣＧＲＰの受容体への結合及び受容体の活性化を妨げる。ＣＧＲＰは、侵害受容性シグナル伝達を調節する神経ペプチドであり、且つ片頭痛の病態生理と関連してきた血管拡張薬である。エレヌマブは、強力且つ特異的にＣＧＲＰのＣＧＲＰ受容体に対する結合と競合し、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）シグナル伝達カスケードのＣＧＲＰ誘導性活性化を阻害する。エレヌマブは、アドレノメデュリン受容体、カルシトニン受容体、又はアミリン受容体でいずれの著しい薬理学的活性も呈さず、ＣＧＲＰ受容体でのアゴニスト活性を欠く。

商業スケールの製造プロセスによって産生されるエレヌマブ原体の生化学的、生物物理学的、及び生物学的特徴付けを実施して、原体の構造及び機能特性を解明した。この実施例は、低減したＣＧＲＰ受容体阻害機能を呈したエレヌマブの電荷バリアントの同定及び特徴付けを記載する。この実施例におけるエレヌマブの電荷不均一性は、疎水性相互作用クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって評価された。

ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、主に分子の表面疎水性に基づいてタンパク質を分離し、構造不均一性及びカラムマトリックスとの分子相互作用に影響する他の修飾によって影響される場合もある。ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるピーク溶出は、比較的低い表面疎水性を有する分子より遅く溶出する比較的高い表面疎水性を有する分子との正味の表面疎水性に応じたものである。

エレヌマブ原体の試料は、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（ＰｒｏＰａｃ ＨＩＣ−１０、５μｍ粒径、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にロードされた。移動相Ａは、ｐＨ５．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有し、移動相Ｂは、ｐＨ５．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウムからなった。タンパク質は、０分から５２分まで２５％〜１００％の移動相Ｂで生成される減少性の塩勾配、及び５５．５分から７５分までに２５％の移動相Ｂに戻すことによって分離された。溶出液は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。カラムは３５℃で操作され、移動相は、０．５ｍＬ／分の流速でカラムにアプライされた。

ＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルは、プレピーク、メインピーク、及びポストピークを含む３つの特徴的な領域を含有した（図２Ａ及び２Ｂ）。プレピーク、メインピーク、及びポストピーク領域にわたる７つの画分が単離された。回収された画分は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって再分析され、画分が特徴付けのための十分な純度であることが実証された。単離された画分のＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイル及び純度は、それぞれ図３及び表１において示される。

図３及び表１におけるプレピーク、メインピーク、及びポストピーク画分は、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＨＰＬＣ）、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる還元トリプシンペプチドマッピング、及び細胞系バイオアッセイを含む様々な分析技術によって特徴付けされた。

分画されていない原体及び７つのＨＩＣ−ＨＰＬＣ画分は、ＢＥＨ２００分析ＵＨＰＬＣカラム（１．７μｍ粒径、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８を含む移動相を使用して、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって分析された。ＳＥ−ＵＨＰＬＣ分析により、全てのプレピーク及びポストピーク画分は、高分子量（ＨＭＷ）種において濃縮されたが、最も早いプレピーク画分（Ｆ１）及び最も遅いポストピーク画分（Ｆ７）のみが、分画されていない原体と比較して低分子量（ＬＭＷ）種において濃縮されたことが明らかになった（表２）。

濃縮されたプレピーク、メインピーク、及びポストピーク画分、並びに分画されていない原体に存在するエレヌマブの生化学的修飾は、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）による検出を伴う還元トリプシンペプチドマッピングによって査定された。原体及び７つのＨＩＣ−ＨＰＬＣ画分は、７．５Ｍのグアニジン塩酸塩溶液中で変性され、０．５Ｍの還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理され、全てのシステイン残基が、０．５Ｍのヨード酢酸ナトリウム（ＩＡＡ）の添加によってアルキル化された。還元及びアルキル化試料は、ゲル濾過によって脱塩された後、トリプシンにより３７℃で３５分間消化された。消化された試料は、Ｃ１８カラム（１．８μｍ粒径、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）及び０．３ｍＬ／分の流速のアセトニトリル勾配を有する０．１％のＴＦＡ移動相を使用して、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離された。ペプチドの検出は、２１５ｎｍでの紫外線（ＵＶ）光吸光度によるものであり、オンラインＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるピークの同定を伴った。次に、各ペプチドイオンの断片化パターンが、その予測されるＭＳ／ＭＳスペクトルに対して調べられた。

原体と濃縮された画分の重ね合わせは、図４において示され、重鎖ＣＤＲ３：ＴＨ１２Ｈ１３（配列番号１のアミノ酸残基９９〜１１３）及びＴＨ１３（配列番号１のアミノ酸残基１０１〜１１３）内の２つのペプチドに関する溶出領域を示す。プレピーク画分Ｆ２、Ｆ３及びＦ４並びにポストピーク画分Ｆ６は全て、原体に対してＣＤＲ３ペプチド（ＴＨ１３）において多様性を示した。ＴＨ１３ペプチドにおける相違は、画分Ｆ１及びＦ７については観察されなかった。プレピーク画分Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４並びにポストピーク画分Ｆ６は、重鎖ＣＤＲ３ペプチドＴＨ１３内の脱アミド及び異性化バリアント（イソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）及びスクシンイミド中間体）の両方において濃縮された。１０２位のアスパラギン残基の脱アミド及び１０５位のアスパラギン酸残基の異性化（両方ともに配列番号１に関する位置）が観察された。異なる保持時間で溶出するＩｓｏＡｓｐ１０５として同定された２つの別々のペプチドが観察された。これらのペプチドは、アスパラギン酸の異性化の間に生成された構造的エナンチオマーである可能性がある。天然のペプチドの後に溶出する１０５位のスクシンイミド中間体に相当するさらなるＴＨ１３ペプチドバリアントもまた観察された。修飾レベルは、修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）のピーク面積を未修飾ペプチドから生成されたものと比較することによって近似された。質量分析は、プレピーク及びポストピーク領域内の増加した脱アミド及びＩｓｏＡｓｐバリアントの存在を確証した（表３）。

プレピーク画分Ｆ１は、ｒＣＥ−ＳＤＳによるこの画分の分析が以前に、ＬＭＷ及び中分子量（ＭＭＷ）種の著しいレベルを示したため、還元され、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析された。合計６つの切断断片が、プレピーク画分Ｆ１において同定され、そのうちの４つの切断部位（Ｌｅｕ^３１５／Ｔｈｒ^３１６；Ｓｅｒ^１９７／Ｖａｌ^１９８；Ｌｅｕ^１９５／Ｓｅｒ^１９６；及びＬｅｕ^１９２／Ｔｙｒ^１９３）は、重鎖ＣＨ１及びＣＨ２ドメイン内にあった。２つの切断部位（Ｇｌｙ^１０８／Ｔｙｒ^１０９及びＡｓｐ^１０５／Ｓｅｒ^１０６）もまた、重鎖のＣＤＲ３において同定された。全ての種に関して、Ｃ末端断片のみが検出された。Ｌｅｕ^１９５／Ｓｅｒ^１９６切断部位のレベルの上昇は、原体に対してプレピーク画分Ｆ１内で観察された（表３）。

エレヌマブ原体と比較される濃縮されたＨＩＣ−ＨＰＬＣ画分の生物活性は、細胞系バイオアッセイによって評価された。細胞系バイオアッセイは、エレヌマブのヒトＣＧＲＰ受容体のリガンド誘導性活性化を阻害する能力を測定することによってエレヌマブの効力を査定する。ＣＧＲＰ受容体はＧタンパク質共役型受容体であり、このファミリーの受容体は、そのシグナル伝達機構の一部として細胞内でｃＡＭＰを生成することが示されている。ヒトＣＧＲＰ受容体を発現する安定なチャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１ ｈｕＣＧＲＰ）を、ＣＧＲＰリガンド並びに様々な濃度のエレヌマブ標準品及び試験試料とともにインキュベートした。エレヌマブ標準品及び試験試料の存在下又は非存在下でＣＧＲＰとのインキュベーション後に細胞により生成されたｃＡＭＰの量は、競合的ホモジニアス時間分解蛍光エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを使用して測定され、検出シグナルは、標識されたアッセイ成分（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素で標識されたｃＡＭＰ及び抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体−クリプテート）が互いに結合するときに生成される。ｃＡＭＰが、ＣＧＲＰによるＣＧＲＰ受容体の活性化によって細胞内で生成されるとき、細胞によって生成された天然のｃＡＭＰは、クリプテート標識された抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体への結合についてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素標識ｃＡＭＰと競合し、検出シグナルが低減される。したがって、ＴＲ−ＦＲＥＴ ｃＡＭＰアッセイの競合的性質により、生成されるシグナルは、細胞中のｃＡＭＰの濃度に反比例する。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、プレートリーダーによって測定された。試験試料の活性は、試験試料により生成されるシグナルとエレヌマブ標準品により生成されるシグナルを比較することによって決定され、相対的な効力として報告される。

下の表４において示されるとおり、全てのプレピーク画分は、効力の著しい低減を示した。これらの低減は、上記のとおりのプレピーク画分において優勢なバリアントである、高いレベルの断片化（Ｆ１画分に関する）又は重鎖ＣＤＲ３領域における脱アミド及び異性化（画分Ｆ２〜Ｆ４に関する）のいずれかに起因する。ポストピーク画分もまた、上記のとおりのポストピーク画分において優勢なバリアントである増加したＨＭＷ種及び低いレベルの重鎖ＣＤＲ３アスパラギン酸（Ａｓｐ^１０５）異性化の結果の可能性がある効力の低減を示した。

この実施例において記載された分析の結果は、エレヌマブ原体のＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルが、プレピーク、メインピーク及びポストピークを含む３種の異なる領域を含有することを実証した。ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって検出される主要なエレヌマブバリアントとしては、プレピーク及びポストピーク領域の両方における重鎖ＣＤＲ３アスパラギン酸異性化（例えば、配列番号１のＡｓｐ^１０５の異性化）及び脱アミド（例えば、配列番号１のＡｓｎ^１０２の脱アミド）バリアントが挙げられる。断片化された種はプレピーク群において観察され、ＨＭＷ種のレベルの上昇は、ポストピーク群において観察された。全てのエレヌマブＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピーク及びポストピーク画分の効力は、細胞系バイオアッセイによって評価されるとおり、原体より低かった。プレピークは、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアスパラギン酸異性化及び脱アミド並びに高いレベルの断片化バリアントの結果として効力の著しい低減を示した。ポストピークもまた、高いレベルのＨＭＷ種及び重鎖ＣＤＲ３異性化バリアントの結果として効力の低減を示した。

エレヌマブの重鎖ＣＤＲ３アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミドバリアントの存在が組成物の阻害性の効力に影響したため、商業スケールで製造されたエレヌマブ原体（１４０ｍｇ／ｍＬ）のいくつかのロットは、ＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプレピークのピーク面積のパーセンテージによって測定される異性化及び脱アミドバリアントの存在及び量を査定するために、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって分析された。原体のロットの効力はまた、上記の細胞系効力アッセイによっても評価され、第ＩＩ相／第ＩＩＩ相臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の標本であるロット番号７８１３７の効力と比較された。データの概要は、下の表５において提供される。

表５におけるデータによって示されるとおり、商業スケールで製造されたエレヌマブ原体は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピークによって測定されるとおり、１．７％〜２．１％の範囲の一貫したレベルの異性化及び脱アミドバリアントを含有した。この範囲の脱アミド／異性化バリアントのレベルを含有した原体は、臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の効力に匹敵する効力を呈した。

実施例２．様々な保管条件下でのエレヌマブ異性化及び脱アミドの評価
Ａｓｎ^１０２の脱アミド及びＡｓｐ^１０５のイソアスパラギン酸への変換は、原体の製造中のエレヌマブ重鎖のＣＤＲ３において観察された（実施例１）。これらの修飾を有するエレヌマブバリアントは、エレヌマブの未修飾形態と比較して効力の低減を呈した（実施例１）。エレヌマブ原体の効力に対するＡｓｎ^１０２脱アミド及びＡｓｐ^１０５異性化バリアントの影響をさらに評価するために、エレヌマブ原体は、脱アミド及び異性化バリアントの形成を増加させるためにストレス条件にかけられ、ストレスを与えられた原体の効力が査定された。特に、エレヌマブ原体は、脱アミド及び異性化バリアントの生成を容易にするために以下の３つのストレス条件にかけられた：
・熱暴露（５０℃で１４日間）
・生理的ｐＨ及び温度（ｐＨ７．４ ３７℃で１４日間）
・高ｐＨ暴露（ｐＨ８．０ ２５℃で１４日間）

経時的に各ストレス条件によって誘導された脱アミド及び異性化バリアントの形成は、実施例１において記載されるＨＩＣ−ＨＰＬＣ及び還元トリプシンペプチドマッピング法によってモニターされた。各ストレス条件に関して、試料は、試験及び凍結の持続時間にわたる様々な時点で取り出された。最終の時点の後、全ての試料は、分析による可変性を最小化するために並行して分析された。

熱暴露
５０℃でストレスを与えられたエレヌマブ原体のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の結果は、プレピークにおいて著しい増加を示した（図５及び表６）。プレピークにおけるこの増加は、下に詳細が説明される還元トリプシンペプチドマッピング分析によって明らかにされるとおり、熱ストレスに対する暴露の１４日後のアスパラギン酸異性化の増加に主に起因する。ポストピークにおける増加もまた、実施例１において表２に示されるとおり、比較的遅く溶出するポストピークの一部としてこれらが溶出するため、おそらくＨＭＷ種のレベルの増大に起因して観察された。

ペプチドマップのクロマトグラムは、新しいピークの存在又は暴露時間にわたって存在するピークのピーク面積における著しい変化について評価された。相違が観察された領域を強調している０日目と１４日目の試料の拡大スケールの重ね合わせは、図６において示される。重鎖ＣＤＲ３（ペプチドＴＨ１２Ｈ１３及びＴＨ１３）におけるＡｓｐ^１０５でのアスパラギン酸異性化は、ペプチドマップの重ね合わせにおいて観察された主な分解物であった。Ｆｃ領域におけるＬｅｕ^３１５とＴｈｒ^３１６の間のペプチドＴＨ２６（配列番号１のアミノ酸残基３１１〜３２６に相当する）の加水分解断片もまた、１４日目の試料のクロマトグラムにおいて観察された。

熱ストレス条件に暴露されたエレヌマブ原体の生物活性は、実施例１において記載される細胞系バイオアッセイによって評価された。表７において示されるとおり、熱ストレスは、１４日間５０℃に暴露した後、エレヌマブ原体の相対的な効力に負の影響を及ぼした。熱ストレス後の効力の低減は、Ａｓｐ^１０５異性化バリアント及び高分子量種の増加に起因し、この両方が効力に影響することが示された（実施例１及び実施例５を参照のこと）。

生理的ｐＨ及び温度
エレヌマブ原体は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液によるおよそ１０ｍｇ／ｍＬへの希釈によって生理的ｐＨに暴露され、３７℃（生理的温度）で１４日間インキュベートされた。製剤緩衝液（１５ｍＭの酢酸ナトリウム、８．２％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０）、ｐＨ５．２中で希釈された原体であったｐＨ対照は、３７℃で１４日間インキュベートされた。したがって、「生理的ｐＨストレス試料」は、ｐＨ及び熱ストレスの両方に暴露されたが、「ｐＨ対照試料」は、熱ストレスのみに暴露された。

１４日目の生理的ｐＨストレス試料と０日目の試料に関するＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルの比較は、プレピーク及びポストピークの両方における増加を示した（図７及び表８）。生理的ｐＨストレス試料及びｐＨ対照試料に由来する１４日目のトレースは、およそ３０分で溶出する同様のレベルのプレピークを示したが、これはＡｓｐ^１０５異性化バリアントに相当し、このイソアスパラギン酸バリアントが、主にｐＨストレスではなく熱ストレスによって促進されることを示唆している。Ａｓｐ^１０２脱アミドバリアントに相当するおよそ３４分で溶出するプレピークは、ｐＨ対照ではなく１４日目の生理的ｐＨストレス試料において増加したが、これはＡｓｐ^１０２の脱アミドが、主に熱ストレスではなくｐＨストレスによって促進されることを示している。ポストピークの増加もまた、０日目の試料と１４日目のｐＨ対照試料の両方と比較して、１４日目の生理的ｐＨストレス試料において観察されたが、これは、その変化が主にｐＨストレスによって促進されることを示している。

生理的ｐＨ及び温度でストレスを与えられたエレヌマブ原体の生化学的修飾は、トリプシンによる消化後の質量分析（ＭＳ）による還元ペプチドマッピングによってモニターされた。ＭＳデータの分析は、重鎖ＣＤＲ３（Ａｓｎ^１０２）及びＦｃ領域（Ａｓｎ^３９３及びＡｓｎ^３９８）の両方における脱アミドの増加並びに重鎖ＣＤＲ３ Ａｓｐ^１０５異性化の量の増加を示した（データは示さず）。重鎖ＣＤＲ３ Ａｓｐ^１０５異性化及びＡｓｎ^１０２脱アミドのレベルの増加は、図７及び表８において示されるＨＩＣ−ＨＰＬＣによるプレピーク及びポストピークにおいて観察された増加と一致している。

生理的ｐＨ及び温度でストレスを与えられたエレヌマブ原体の生物活性は、細胞系バイオアッセイによって評価された。表９において示されるとおり、生理的ｐＨ及び温度ストレスは、暴露の１４日後のエレヌマブ原体の効力における低減をもたらした。Ａｓｎ^１０２脱アミド及びＡｓｐ^１０５異性化バリアントのレベルの増加がこれらのストレス条件下で観察されたが、わずかな効力の低減のみが観察された。この結果は、細胞系バイオアッセイによって測定されるとおり、あまりに低すぎて効力に著しく影響しない、原体の約６％を占めたこれらの脱アミド及び異性化バリアントの全体的なレベルに起因している可能性がある。

高ｐＨ暴露
エレヌマブ原体は、ｐＨ８．０のトリス塩基溶液によるおよそ１０ｍｇ／ｍＬへの希釈によって高ｐＨに暴露され、２５℃で１４日間インキュベートされた。製剤緩衝液（１５ｍＭの酢酸ナトリウム、８．２％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０）、ｐＨ５．２中で希釈された原体であったｐＨ対照は、２５℃で１４日間インキュベートされた。

ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の結果は、０日目の試料及びｐＨ対照試料と比較して、Ａｓｎ^１０２脱アミドに起因するプレピークの増加及び１４日目の高ｐＨストレス試料におけるポストピークの増加を示した（図８及び表１０）。

高ｐＨでストレスを与えられたエレヌマブ原体の生化学的修飾は、トリプシンによる消化後のＭＳによる還元ペプチドマッピングによってモニターされた。生理的ｐＨストレス条件と同様に、Ａｓｎ^１０２での重鎖ＣＤＲ３並びにＡｓｎ^３９３及びＡｓｎ^３９８でのＦｃ領域内の脱アミドの増加が、０日目及びｐＨ対照試料に対して、１４日目のストレス試料について観察された。高ｐＨでストレスを与えられたエレヌマブ原体の生物活性は、細胞系バイオアッセイによって評価された。表１１において示されるとおり、高ｐＨストレスは、暴露の１４日後のエレヌマブ原体の効力に中程度の影響を及ぼした。生理的ｐＨ及び温度ストレス条件で得られた結果と同様に、ストレスを与えられた原体において存在するＡｓｎ^１０２脱アミドバリアントの全体的なレベルは、細胞系バイオアッセイによって測定されるとおり、あまりに低すぎて効力に著しい影響を及ぼさなかった。

エレヌマブ原体の効力を著しく低減するのに必要なＡｓｎ^１０２脱アミド及びＡｓｐ^１０５異性化バリアントのレベルをより良好に確認するために、効力とＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピーク面積のパーセンテージの間の関連性をモデル化する統計分析が、異なる温度で保管された各種エレヌマブロットから利用可能なデータで実施された。エレヌマブロットは、５℃（１３ロット）、２５℃（４ロット）、３０℃（４ロット）、又は４０℃（５ロット）で保管された。５℃の保管条件からのデータに関して、ただ１つの時点の６ロット、及びただ２つの時点の９ロットがあった。他の全ての保管条件は、少なくとも３つの異なる時点からのデータを有した。

細胞系バイオアッセイによって測定されるとおりの％相対的な効力は、４つの異なる保管条件に関するＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプレピークについての％ピーク面積の関数としてプロットされ、回帰分析が実施された（図９）。フィットした回帰線の傾きの推定値は、試験に関する調整済みｐ値とともに各温度に関して決定されて、傾きが０とは異なるかどうかが決定された（表１２）。４０℃の保管条件からのデータに関する回帰線の傾きは、０．０５の有意レベルでゼロから統計的に有意であった。４０℃の保管条件からのデータの回帰分析に基づいて、ＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピーク面積における１％の増加は、相対的な効力における１．１４％の減少をもたらした。

臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の相対的な効力は、細胞系バイオアッセイによって測定されるとおり、７０％を超えた。臨床試験のために許容できたレベル（７０％）未満にエレヌマブ原体の効力を低減することになるＡｓｎ^１０２脱アミド及びＡｓｐ^１０５異性化バリアント（ＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピークによって表される）のレベルを推定するために、図９に示される４０℃の保管条件に関するフィットした回帰線が外挿されて、７０％の相対的な効力のためのＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピークの％面積を示した。図１０において示されるとおり、フィットした回帰線に基づく７０％の相対的な効力のための％ＨＩＣ−ＨＰＬＣプレピーク面積の予測値は、約２８．８５％である。

この実施例において記載される実験の結果は、エレヌマブ原体におけるＡｓｎ^１０２脱アミドバリアントのレベル及び／又はＡｓｐ^１０５異性化バリアントのレベルにおける増加が、エレヌマブのＣＧＲＰ受容体のＣＧＲＰ誘導性活性化を阻害する能力の減少をもたらすことを実証している。脱アミド及び異性化バリアントのレベルは、モニターされるべきであり、且つ臨床試験において採用されたエレヌマブ原体と同様のレベルに原体の効力を維持するために原体の約３０％未満に制御されるべきである。いくつかの実施形態では、原体におけるＡｓｎ^１０２脱アミド及び／又はＡｓｐ^１０５異性化バリアントの比較的低いレベル（例えば、約１５％未満）が、原体における約１７％のこれらのバリアントがエレヌマブ原体の効力の著しい低減をもたらしたため所望される（表６及び７を参照のこと）。

実施例３．ＣＥＸ−ＨＰＬＣによるエレヌマブ電荷バリアントの同定及び特徴付け
この実施例は、低減したＣＧＲＰ受容体阻害機能を呈したエレヌマブのさらなる電荷バリアントの同定及び特徴付けを記載する。この実施例におけるエレヌマブの電荷不均一性は、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって評価された。

ＣＥＸ−ＨＰＬＣは、主に表面電荷の不均一性に基づいてタンパク質を分離するが；構造不均一性及びイオン交換レジンとの分子相互作用に影響する他の修飾によって影響される場合もある。この方法におけるピークの溶出は、早く溶出する負に荷電した種及び遅く溶出する正に荷電した種による実効表面電荷に応じたものである。

エレヌマブ原体の試料は、分析的ＣＥＸ−ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ−Ｆ、５μｍ粒径、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、ＹＭＣ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）上にロードされた。移動相Ａは、ｐＨ６．６の２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有し、移動相Ｂは、ｐＨ６．６の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウムからなった。タンパク質は、０分から４分まで５％〜１２％の移動相Ｂで生成される線形の塩勾配、１８分で２３％の移動相Ｂ、１８．５分から２０．５分までに１００％の移動相Ｂを使用し、且つ２１分から２５分までに５％の移動相Ｂに戻すことによって分離された。溶出液は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。カラムは２８℃で操作され、移動相は、０．６ｍＬ／分の流速でカラムにアプライされた。

ＣＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルは、酸性ピーク、メインピーク、及び塩基性ピークを含む３つの特徴的な領域を含有した（図１１）。酸性ピーク、メインピーク、及び塩基性ピーク領域にわたる９つの画分が単離された。回収された画分は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって再分析され、画分が特徴付けのための十分な純度であることが実証された。単離された画分のＣＥＸ−ＨＰＬＣプロファイル及び純度は、それぞれ図１２及び表１３において示される。

エレヌマブ原体と比較される濃縮されたＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分の各々の生物活性は、実施例１に記載される細胞系バイオアッセイによって評価された。表１４において示されるとおり、酸性ピーク画分Ｆ１及びＦ２の両方が、原体と比較して効力の低減を示したが、残りの酸性、メイン、及び塩基性ピーク画分は、有意差を示さなかった。

酸性画分中のどのバリアントが効力に対する影響を有したかをより完全に理解するために、濃縮されたＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分が、非還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）、還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ｒＣＥ−ＳＤＳ）、及び非還元逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む様々な分析技術によって特徴付けされた。

分画されていない原体及び９つのＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分が、ｎｒＣＥ−ＳＤＳによって分析された。試料は、２５℃のＳＤＳゲル緩衝液で充填されたベアフューズドシリカキャピラリーへの動電学的注入の前に、ｐＨ６．５のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びＮ−エチルマレイミドの存在下で加熱することによって変性された。吸光度は、２２０ｎｍでモニターされた。下の表１５において示されるとおり、酸性画分Ｆ１は、原体と比較して、プレピーク及びポストピーク種の両方において濃縮された。プレピーク種は、インタクトなエレヌマブ（メインピーク）より低い分子量の種を含み、ペプチド加水分解又は部分的な分子会合のいずれかからもたらされるが、ポストピーク種は、メインピークと比較してサイズが大きい。全体として、プレピーク種の相対的な量は、残りの酸性、メイン及び塩基性ピーク画分（すなわち、Ｆ２からＦ９）並びに原体の間で一貫していたが、プレピーク群内の分布においてわずかな相違が観察された。

エレヌマブ原体及び９つのＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分もまた、ｒＣＥ−ＳＤＳによって分析された。ｒＣＥ−ＳＤＳに関する方法は、試料が、キャピラリーへの注入の前にＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールの存在下で加熱することによって還元され、変性されることを除いて、ｎｒＣＥ−ＳＤＳについてのものと同様であった。ｒＣＥ−ＳＤＳ分析の結果は、酸性ピーク画分Ｆ１を除く全ての画分が分画されていない原体対照と同様であることを示した。酸性ピーク画分Ｆ１は、ペプチド加水分解断片に相当する可能性が非常に高いＬＭＷ及びＭＭＷ種において有意に濃縮された（データは示さず）。酸性ピーク画分Ｆ１、及びより少ない量の画分Ｆ２は、非コンセンサスグリコシル化バリアントに相当する重鎖の後に濃縮された。

次に、原体及びＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分は、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（１．７μｍ粒径、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって分析され、７５℃で０．１％のＴＦＡ含有移動相及び１−プロパノールの勾配を使用して溶出された。２１５ｎｍでの吸光度がモニターされた。ＣＥＸ−ＨＰＬＣプロファイル全体にわたって、酸性画分において濃縮されたＩｇＧ２−Ｂ及びＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームによるジスルフィドアイソフォームの濃縮の観測傾向があったが、ＩｇＧ２−Ａジスルフィドアイソフォームは、メイン及び塩基性ピーク画分において濃縮される（図１３及び表１６）。実施例４においてより詳細に記載されるとおり、ＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームは、エレヌマブ原体又はＩｇＧ２−Ａ及びＩｇＧ２−Ａ／Ｂジスルフィドアイソフォームより著しく効力が低かった。酸性ピーク画分Ｆ１のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルは、原体のクロマトグラムと一致しなかったが、これは、上記のとおり、それぞれｒＣＥ−ＳＤＳ及びｎｒＣＥ−ＳＤＳによって観察される、著しいレベルの還元できる共有結合性の断片化の結果である可能性が非常に高かった。

この実施例において記載される分析の結果は、ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおける酸性ピークに相当する断片化バリアント及びジスルフィドアイソフォームバリアントなどのエレヌマブのある種の酸性バリアントが、エレヌマブ原体より効力が低いことを示す。特に、酸性画分Ｆ１は、ｒＣＥ−ＳＤＳ及びｎｒＣＥ−ＳＤＳによって検出される高レベルの断片化の結果として効力の著しい低減を示した。酸性画分Ｆ２もまた、非分画原体と比較して、この画分において濃縮されるＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームのレベルの上昇に起因する効力の低減を示した。全体として、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって検出される主要なエレヌマブバリアントは、酸性ピークにおいて濃縮されるＩｇＧ２−Ｂ及びＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを伴うジスルフィドアイソフォームバリアントを含む。脱アミド、断片化（ＬＭＷ及びＭＭＷ）、ＨＭＷ種及び非コンセンサスグリコシル化バリアントもまた、酸性ピーク画分において検出された。

商業スケールで製造されたエレヌマブ原体（１４０ｍｇ／ｍＬ）のいくつかのロットを、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析して、ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおける酸性ピークのピーク面積パーセンテージによって測定されるとおり、酸性バリアント（例えば、ＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォーム）の存在及び量を査定した。原体のロットの効力はまた、細胞系効力アッセイによっても評価され、第ＩＩ相／第ＩＩＩ相臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の標本であるロット番号７８１３７の効力と比較された。データの概要は、下の表１７において提供される。

表１７におけるデータによって示されるとおり、商業スケールで製造されたエレヌマブ原体は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ酸性ピークによって測定されるとおり、２８．７％〜３１．３％の範囲の一貫したレベルの酸性バリアントを含有した。この範囲の酸性バリアントのレベルを含有した原体は、臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の効力に匹敵する効力を呈した。

実施例４．エレヌマブのジスルフィドアイソフォームバリアント
エレヌマブは、ＩｇＧ２サブクラスの抗体であり、したがって、ＩｇＧ２分子について記載されてきたジスルフィドアイソフォームバリアントを示す場合がある（Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．，Ｖｏｌ．１１２０（１−２）：１１２−１２０，２００６；Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８３（２３）：１６１９４−１６２０５，２００８；Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８３（２３）：１６２０６−１６２１５，２００８）。エレヌマブにおいて検出されるジスルフィド結合の結合性は、同定のためのエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせた非還元及び還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップを使用して解明された。この手法を通して、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ｂ構造に相当するジスルフィド結合だけでなく、古典的なＩｇＧ２−Ａ構造の予測されるジスルフィド結合が解明された。

ジスルフィド連結ペプチドは、図１４に示されるとおりの非還元及び還元条件下でエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを使用するペプチドマッピングによって原体において同定された。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離の放出口は、吸光度検出に加えて直交性の質量分析のためのエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）に結合された。非還元消化の一部は、還元剤のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で処理され、同じＲＰ−ＨＰＬＣ条件を使用して分析された。

非還元Ｌｙｓ−Ｃマップ（図１４、上部のトレース）は、ピーク「Ａ」〜「Ｇ」及び還元条件下で消失する「ａ」〜「ｉ」で標識される。還元後のこれらのペプチドの消失は、それらが未変性タンパク質中のジスルフィド結合に関与することを示す。非還元Ｌｙｓ−Ｃ消化においてジスルフィド結合を含有するペプチド及び還元Ｌｙｓ−Ｃ消化における対応する還元ペプチドは、吸光度クロマトグラム中のそれらの有無によって決定され、インタクトなペプチド質量精度及び特徴的なＭＳ／ＭＳ産物イオンの存在によって確認された。ジスルフィド連結ペプチドを検証するために使用されるペプチドイオンの全てについての理論質量及び観測質量は、非還元及び還元ペプチドマップに関して、それぞれ表１８及び表１９において示される。同定された非還元及び還元ペプチドは、図１５Ａにおいて模式的に示される、予想されるＩｇＧ２−Ａジスルフィドアイソフォーム構造を説明する。

Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングにより、ヒンジペプチドと分子の他の領域の間のジスルフィド対形成の不均一性に相当する軽微なジスルフィド連結ペプチドピークが明らかになった。図１４において標識される主要なジスルフィド連結ペプチドピークに加えて、還元マップには存在しない非還元マップにおける軽微な溶出の遅いピーク（「ａ」〜「ｉ」）が存在し、それらが未変性タンパク質においてジスルフィド結合に関与することを示している。これらの遅く溶出するペプチドは、ＩｇＧ２の既知の構造アイソフォームに関する鎖間ジスルフィド結合ペプチドとして質量分析によって同定された（Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８３（２３）：１６１９４−１６２０５，２００８；Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８３（２３）：１６２０６−１６２１５，２００８；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．８２（３）：１０９０−１０９９，２０１０）。ペプチド「ａ」、「ｂ」、「ｄ」、及び「ｅ」は、構造アイソフォームＩｇＧ２−Ｂに相当するが、ペプチド「ｃ」、「ｆ」、及び「ｉ」は、構造アイソフォームＩｇＧ２−Ａ／Ｂに相当する。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォーム構造の略図は、それぞれ図１５Ｂ及び１５Ｃにおいて示される。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ｂジスルフィド連結ペプチドを検証するために使用されるペプチドイオンの全てについての理論質量及び観測質量は、表１８において示される。分析は、エレヌマブのジスルフィド結合が、ＩｇＧ２抗体について以前に観察されたものと一致することを示唆する（Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

上に詳述されるとおり、ペプチドマッピングにより、優勢なＩｇＧ２−Ａ構造に関するジスルフィド結合ペプチド、並びにさらなるＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ｂジスルフィド構造アイソフォームと関連した結合性を有するペプチドの存在が明らかになった。図１５に示されるとおり、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームにおいては両方のＦａｂアームがヒンジ領域に連結されるが、ＩｇＧ２−Ａアイソフォームにおいては、どちらのＦａｂアームもヒンジに連結しない。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームは、これらの２つの形態の間の複合型であり、１つのＦａｂアームのみがヒンジにジスルフィド連結する。非還元逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの分離は、以前に報告されている（Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８及びＤｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これらの研究において、ジスルフィドアイソフォームＡ、Ａ／Ｂ及びＢに相当するペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣピーク画分において同定された（Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８及びＤｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。非還元ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析されたエレヌマブ原体に関する代表的なプロファイルは、図１６Ａにおいて示され、Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８によって報告された溶出順序と一致して標識されるジスルフィドアイソフォームピークを有する。遅く溶出するピークは、ＩｇＧ２−Ａアイソフォームとして同定され、相対的なパーセントの報告のためにＩｇＧ２−Ａピークとともにグループ化される。エレヌマブ原体におけるジスルフィドアイソフォームの相対的なレベルは、およそ５９．５％のＩｇＧ２−Ａ、３４．７％のＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、及び４．４％のＩｇＧ２−Ｂであり、およそ１．５％の早く溶出するプレピーク種を伴う。

非還元ＲＰ−ＨＰＬＣは、ジスルフィドアイソフォームバリアントの相対的な量の決定のための有効な方法であるが、移動相及び分離条件は、エレヌマブの阻害性の効力を決定するために使用される細胞系バイオアッセイと両立しない。したがって、ジスルフィドアイソフォームが濃縮された画分は、実施例３に記載されるとおりのセミ分取ＣＥＸ−ＨＰＬＣから回収され、実施例１に記載される細胞系バイオアッセイを使用して効力に関して試験された。原体に対するジスルフィドアイソフォームＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂ、及びＩｇＧ２−Ｂにおいて濃縮された３つのＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分（表１６及び図１３Ａ）は、下により詳細に記載されるとおりに効力に関して分析された。濃縮されたＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−Ｂ、及びＩｇＧ２−Ａ／ＢジスルフィドアイソフォームＣＥＸ−ＨＰＬＣ画分を、非還元ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析して、効力の評価の前に十分な純度を確認した。分画されていない原体に対する３つのＣＥＸ−ＨＰＬＣ回収画分のＲＰ−ＨＰＬＣの重ね合わせは、図１６Ｂにおいて示され、ＲＰ−ＨＰＬＣジスルフィドアイソフォーム分布データは、表２０において提供される。

表２１に示されるとおり、ＩｇＧ２−Ａ及びＩｇＧ２−Ａ／Ｂが濃縮されたアイソフォーム画分の相対的な効力は、エレヌマブ原体の相対的な効力と同様である。しかしながら、ＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームについて濃縮された画分は、原体及び濃縮されたＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ａアイソフォーム画分と比較して著しく低減した効力を示した。

これらのデータは、エレヌマブのヒンジ領域におけるジスルフィド結合の立体構造が、抗体の生物活性に重要であることを示唆する。特に、原体におけるＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームのレベルの上昇は、阻害性の効力に著しく影響する。商業スケールで製造されたエレヌマブ原体のいくつかのロットの分析により、原体におけるＩｇＧ２−Ｂジスルフィドアイソフォームの一貫したレベルが明らかになり、その範囲は、非還元ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、４．６％〜５．２％であった。これらのエレヌマブ原体ロットにおけるＩｇＧ２−Ａ／Ｂ及びＩｇＧ２−Ａジスルフィドアイソフォームのレベルもまた、３４．２％〜３５．５％の範囲のＩｇＧ２−Ａ／Ｂレベル及び５７．４％〜５９．３％の範囲のＩｇＧ２−Ａレベルと一致した。

実施例５．エレヌマブサイズバリアントの同定及び特徴付け
この実施例は、低減したＣＧＲＰ受容体阻害機能を呈したエレヌマブのサイズバリアントの同定及び特徴付けを記載する。エレヌマブのサイズバリアントは、高分子量（ＨＭＷ）種及び低分子量（ＬＭＷ）種を含み得る。単量体より大きい種（例えば、二量体及びより高次のオリゴマー種）であるＨＭＷ種は、非共有結合性の会合、還元できる共有結合性の会合、及び／又は還元できない共有結合性の会合により形成され得る。ＬＭＷ種は、ポリペプチド骨格の断片化及び／又は軽鎖及び重鎖などのサブユニット成分の不完全な集合により生じる可能性がある。

この実施例において、エレヌマブのサイズの不均一性は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって評価された。ＳＥ−ＵＨＰＬＣは、主に流体力学的体積の違いに基づいて、タンパク質を分離する。ＳＥ−ＵＨＰＬＣ法を、非還元、非変性条件下で実施して、未変性条件下でのエレヌマブのサイズ分布を査定した。エレヌマブ原体の試料は、分析的ＳＥ−ＵＨＰＬＣカラム（ＢＥＨ２００カラム、１．７μｍ粒径、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上にロードされ、タンパク質は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む移動相を使用して均一濃度で分離された。溶出液は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニターされた。カラムは周囲温度で操作され、移動相は、０．４ｍＬ／分の流速でカラムにアプライされた。

３つの別々の領域は、エレヌマブ原体のＳＥ−ＵＨＰＬＣプロファイルにおいて明白であり、図１７Ａ及び１７Ｂに示されるとおり優勢な単量体（メイン）ピーク並びに低レベルのＨＭＷ（プレピーク）及びＬＭＷ（ポストピーク）を含む。プレピーク、メインピーク及びポストピーク領域に由来する画分が回収され、画分において分離されたバリアントが特徴付けされた。ＳＥ−ＵＨＰＬＣによるＨＭＷピーク（図１７Ｂ）は、２つの不完全に分解された種から構成されており、そのため、それぞれＨＭＷピークのリーディングエッジとテーリングエッジを表す２つの別々の画分として回収された。２つのＨＭＷピーク及びメインピークは、セミ分取ＳＥ−ＨＰＬＣを使用して単離された後、分析的ＳＥ−ＨＰＬＣによってさらに濃縮された。回収されたＨＭＷ及びメインピーク画分は、分子量カットオフフィルターを使用して濃縮され、特徴付けの分析の前にｐＨ５．２の１５ｍＭ酢酸ナトリウムに緩衝液交換された。ＳＥ−ＵＨＰＬＣによるＬＭＷピーク群（図１７Ｂ）は、２つの小さなピークで構成されており、その合計は原体中の０．３％のアッセイ定量限界未満である。ＬＭＷピーク群が単離され、分析的ＳＥ−ＵＨＰＬＣを使用して濃縮され、下により詳細に記載されるとおりの限定的な特徴付け試験にかけられた。

ＳＥ−ＵＨＰＬＣ ＨＭＷ画分の特徴付け
それぞれ図１８及び表２２に示される単離されたＨＭＷ及びメインピーク画分のＳＥ−ＵＨＰＬＣプロファイル及び純度は、それらの画分が特徴付けのために十分な純度であったことを実証している。

図１８及び表２２における濃縮されたＨＭＷ及びメインピーク画分は、静的光散乱検出を伴うＳＥ−ＵＨＰＬＣ、還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ｒＣＥ−ＳＤＳ）、非還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）、及び細胞系バイオアッセイを含む、様々な分析技術によって特徴付けされた。

分画されていない原体を伴うＨＭＷ及びメインピーク画分を、静的光散乱検出を伴うＳＥ−ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ−ＳＬＳ）により分析して、各クロマトグラムにおける支配的なピークのモル質量を決定した。ＳＥ−ＨＰＬＣ−ＳＬＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して実施された。カラムは、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷｘｌ、５μｍ粒径、７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍカラム長（Ｔｏｓｈｏ Ｂｉｏｓｅｐ）であった。使用された検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｈｅｌｅｏｓ ＩＩ光散乱検出器、Ｗｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＲＩ検出器、及び２８０ｎｍの波長設定によるＡｇｉｌｅｎｔ ＵＶ検出器であった。ＳＥ−ＨＰＬＣの行程は、移動相として使用される１００ｍＭのリン酸カリウム、２５０ｍＭの塩化カリウム、ｐＨ６．８の緩衝液により室温で実施され、流速は０．５ｍＬ／分であった。注入体積は４．３μＬであり、３００μｇのタンパク質を注入した。分子量（ＭＷ）計算に関して、ＬＳ（光散乱）及びＲＩ（屈折率）シグナル及び０．１８５の試料屈折率増加（ｄｎ／ｄｃ）値が使用された。

メインピーク画分からの単量体（２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むインタクトな抗体）の測定質量は１４９ｋＤａであり、原体対照は１４３ｋＤａであったが、これらの両方は、エレヌマブ単量体（１４８．８ｋＤａ）の理論分子質量と一致する（表２３）。両方のＨＭＷが濃縮された画分（ＨＭＷ１及びＨＭＷ２）に関するＨＭＷピークの測定質量はそれぞれ、２９２ｋＤａ及び２７９ｋＤａであり、これらの両方は、エレヌマブ二量体（２９７．６ｋＤａ）の分子質量と一致する（表２３）。これらのデータは、ＨＭＷ１及びＨＭＷ２の両方が濃縮された画分が、主にエレヌマブ二量体で構成されることを実証している。

実施例３に記載される方法に従うｎｒＣＥ−ＳＤＳにより濃縮された画分及び分画されていない原体の分析により、両方のＨＭＷ画分が、単量体（メインピーク）より大きい共有結合性の高分子量種に相当するポストピークにおいて濃縮され、対照に匹敵するプレピーク面積を有することが明らかになった（表２４）。

非共有結合性及び共有結合性の二量体の比率は、未変性条件下で濃縮された画分の純度を変性条件下のものと比較することによって近似され得る。未変性条件下の二量体のレベル（ＳＥ−ＵＨＰＬＣ：表２２における％ＨＭＷ）を変性条件下の共有結合性の二量体のレベル（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ：表２４における％ポストピーク）と比較すると、共有結合性の二量体のレベルが、未変性の原体において推定され得る。この比較に基づいて、エレヌマブ原体中の未変性の二量体種の大部分は共有結合性であり、ＨＭＷ１二量体種の約６８％とＨＭＷ２二量体のほぼ全てが変性試験条件下で残存している。

エレヌマブ原体並びに濃縮されたＨＭＷ種及びメインピーク画分もまた、実施例３に記載される方法に従ってｒＣＥ−ＳＤＳによって分析された。図１９において示されるとおり、ｒＣＥ−ＳＤＳ分析の結果は、ＨＭＷ１及びＨＭＷ２の両方の画分が、原体に対して中分子量（ＭＭＷ）及び高分子量（ＨＭＷ）種において濃縮されることを示した。共有結合性及び非共有結合性の二量体種のレベルの評価と同様に、ｒＣＥ−ＳＤＳを使用して、原体における還元できる二量体種及び還元できない二量体種のレベルを近似できる。未変性条件下の二量体のレベル（ＳＥ−ＵＨＰＬＣ：％ＨＭＷ）を還元及び変性条件下の非共有結合性の二量体のレベル（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ：％ＨＭＷ）と比較すると、非共有結合性の二量体のレベルが、未変性の原体において推定され得る。表２５において示されるとおりの比較に基づいて、エレヌマブ原体中の未変性の二量体種の大部分は還元することができ、ＨＭＷ１二量体種の約８７％とＨＭＷ２二量体種の約９３％が還元及び変性試験条件下で個々の成分に還元している。

エレヌマブ原体と比較される濃縮されたＳＥ−ＵＨＰＬＣ画分の生物活性は、実施例１に記載される細胞系バイオアッセイによって評価された。表２６において示されるとおり、ＨＭＷ１及びＨＭＷ２が濃縮された画分の両方が、原体及び濃縮されたメインピークと比較して効力の低減を呈した。これらの画分におけるＨＭＷ種のかなりの部分が、上記のとおり共有結合により連結され、且つ分離できない。自己会合は、立体構造変化をもたらし得る立体障害を負わせ、これはＣＧＲＰ受容体標的に対する分子の結合に影響を及ぼす可能性があるため、観察された効力の低減を説明している。

ＳＥ−ＵＨＰＬＣ ＬＭＷ画分の特徴付け
ＬＭＷピーク（図１７Ｂ）は、単一の画分においてＳＥ−ＵＨＰＬＣによって回収され、特徴付けの分析の前に分子量カットオフフィルターを使用して濃縮された。ＳＥ−ＵＨＰＬＣに対するＬＭＷ画分の再注入は、約３４．４％までのＬＭＷ種の濃縮を示した（データは示さず）。回収され濃縮されたＬＭＷ画分を、非還元条件下での全体の質量分析によって分析して、ＬＭＷ種の性質を特徴付けた。

濃縮されたＬＭＷ画分の質量は、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析に連結されたＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、未変性の非還元条件下での質量分析によって決定された。分析からの結果は、回収されたＬＭＷ画分が、分画されていない原体と比較して共有結合された軽鎖二量体（ＬＣ−ＬＣ）において濃縮されることを示す。

この実施例に記載される分析の結果は、エレヌマブが、非変性条件下でのＳＥ−ＵＨＰＬＣによって、２つの重鎖及び２つの軽鎖（原体の約９９．２％）を含むインタクトな抗体として予想されるその単量体形態において主に存在することが示されたことを示す。残りの部分は、二量体で主に構成されるＨＭＷ種（原体の０．５％）及び痕跡レベルのＬＭＷ種からなる。より高次のオリゴマーは観察されなかった。ＨＭＷ種において濃縮されたエレヌマブ原体のＳＥ−ＵＨＰＬＣ画分は、エレヌマブの単量体形態と比較して阻害性の効力の低減を呈した。

エレヌマブ二量体は、主に共有結合された単量体サブユニットで構成され、変性条件下で解離しない。二量体の大部分は還元することができ、還元及び変性条件下で重鎖及び軽鎖成分に変換され、したがって、ジスルフィド結合により結合される。還元できない種は、共有結合性の二量体の微量成分として存在し、ｒＣＥ−ＳＤＳによって重鎖ピークの後に移動する。ＳＥ−ＵＨＰＬＣ ＬＭＷピークの特徴付けは、軽鎖二量体が濃縮されるピークであることを示した。

商業スケールで製造されたエレヌマブ原体（１４０ｍｇ／ｍＬ）のいくつかのロットを、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって分析して、ＳＥ−ＵＨＰＬＣクロマトグラムにおけるＨＭＷ及びＬＭＷピークのピーク面積パーセンテージによって測定されるとおり、サイズバリアント（例えば、ＨＭＷ及びＬＭＷ種）の存在及び量を査定した。原体のロットの効力はまた、細胞系効力アッセイによっても評価され、第ＩＩ相／第ＩＩＩ相臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の標本であるロット番号７８１３７の効力と比較された。データの概要は、下の表２７において提供される。

表２７におけるデータによって示されるとおり、商業スケールで製造されたエレヌマブ原体は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、一貫したレベルの約０．６％のＨＭＷ種を含有した。このレベルのＨＭＷ種を含有した原体は、臨床試験において採用されたエレヌマブ原体の効力に匹敵する効力を呈した。

表２７からの原体バッチのうちの３つ（６３１３１、６３１３２、及び６３１３３）は、２５℃で３ヶ月間保管され、試料はＳＥ−ＵＨＰＬＣ分析及び効力試験にかけられて、経時的なサイズバリアントのレベルの変化に起因する原体の効力に対するいずれかの影響が査定された。この安定性試験の結果は、表２８において示される。

ＨＭＷ種を１．６％の高いレベルで含有した原体は、臨床試験で採用されたエレヌマブ原体に匹敵する効力を有した。

熱ストレス条件下でサイズバリアントを形成するエレヌマブの感受性を評価するため、エレヌマブ原体を、５０℃で１４日間インキュベートされた。試料は、試験及び凍結の持続時間にわたる様々な時点で取り出された。最終の時点の後、全ての試料は、分析による可変性を最小化するために並行して分析された。試料は、上記の方法に従うＳＥ−ＵＨＰＬＣ及び実施例１に記載される細胞系バイオアッセイによって査定された。

５０℃でストレスを与えられたエレヌマブ原体の０日目及び１４日目の未変性のＳＥ−ＵＨＰＬＣプロファイルは、図２０において示される。図２０において示されるピークに関する相対的なピーク面積％は、細胞系バイオアッセイによって評価されるとおりの試料の％相対的な効力とともに表２９において提示される。ＨＭＷ種は、メインピークにおける対応する減少とともに１４日間にわたって増加を示す支配的な分解物であった。生成されたＨＭＷ種は、主により高次の凝集物（二量体より大きいＨＭＷ種）で構成された。また、１４日目にはＬＭＷ種の増加が観察された。エレヌマブ原体の熱ストレスを与えられた試料は、効力の著しい低減を呈した。効力の低減は主に、ＨＭＷ種の増加及びＡｓｐ^１０５異性化バリアントの増加に起因し、これらはまた、エレヌマブ原体の熱ストレスを与えられた試料においても増加した（実施例２を参照のこと）。

さらなる熱ストレス試験は、商業スケールで製造されたさらなるエレヌマブ原体バッチに対して実施された。表２７からの原体バッチのうちの３つ（６３１３１、６３１３２、及び６３１３３）は、４０℃で最大３０日間保管され、試料はＳＥ−ＵＨＰＬＣ分析及び細胞系効力試験にかけられて、経時的なサイズバリアントのレベルの変化に起因する原体の効力に対するいずれかの影響がさらに査定された。この熱ストレス試験の結果は、表３０において示される。

この試験の結果は、ＨＭＷ及びＬＭＷ種の増加とともに効力の低減の全般的な傾向を示す。特に、原体中における約２．５％を超えるＨＭＷ種のレベルは、原体の効力の低減と関連した。６３１３２ロットの３０日目の試料は効力の低減を示さなかったが、これはおそらく、細胞系バイオアッセイの可変性に起因することが認められる。

本明細書において議論され及び引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。

当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (48)

1. エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物であって、前記１種以上のエレヌマブバリアントが、異性化バリアント及び脱アミドバリアントを含み、且つ前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が約３０％未満である、組成物。
2. 前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、約１５％未満である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、約８％未満である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、約４％未満である、請求項１に記載の組成物。
5. 前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、約１％〜約１０％である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、約１％〜約４％である、請求項１に記載の組成物。
7. 前記異性化バリアントが、エレヌマブの一方又は両方の重鎖（配列番号１又は配列番号３）におけるアミノ酸位置１０５でイソアスパラギン酸残基又はスクシンイミドを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記脱アミドバリアントが、アスパラギン酸残基、スクシンイミド、又はイソアスパラギン酸残基に変換されたエレヌマブの一方又は両方の重鎖（配列番号１又は配列番号３）におけるアミノ酸位置１０２でアスパラギン残基を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記組成物中の前記異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、疎水性相互作用クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブ酸性バリアントを含む組成物であって、前記組成物中の酸性バリアントの量が、約４０％未満である組成物。
11. 前記組成物中の酸性バリアントの量が、約３５％未満である、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記組成物中の酸性バリアントの量が、約２５％〜約３８％である、請求項１０に記載の組成物。
13. 前記組成物中の酸性バリアントの量が、約２６％〜約３４％である、請求項１０に記載の組成物。
14. １種以上の酸性バリアントが、ジスルフィドアイソフォームバリアント、断片化バリアント、又はこれらの組合せを含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記組成物中の酸性バリアントの量が、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって決定される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. エレヌマブ及びその１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントを含む組成物であって、前記１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントが、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含み、且つ前記組成物中の前記ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量が、約２０％未満である組成物。
17. 前記組成物中の前記ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量が、約１０％未満である、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記組成物中の前記ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームの量が、約４％〜約６％である、請求項１６に記載の組成物。
19. 前記１種以上のジスルフィドアイソフォームバリアントがさらに、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記組成物中の前記ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの量が、約３４％〜約３７％である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記組成物中のジスルフィドアイソフォームバリアントの量が、非還元逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって決定される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. エレヌマブ及びエレヌマブの高分子量（ＨＭＷ）種を含む組成物であって、前記組成物中の前記ＨＭＷ種の量が、約２．５％未満である組成物。
23. 前記組成物中の前記ＨＭＷ種の量が、約１．８％又はそれ未満である、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記組成物中の前記ＨＭＷ種の量が、約１．２％又はそれ未満である、請求項２２に記載の組成物。
25. 前記ＨＭＷ種が、エレヌマブの共有結合された二量体を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記組成物中の前記ＨＭＷ種の量が、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＨＰＬＣ）によって決定される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含む組成物であって、前記エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含み、前記組成物が、以下の特徴：
    （ａ）前記組成物中の酸性バリアントの量が、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２５％〜約３８％である；
    （ｂ）前記組成物中のＨＭＷ種の量が、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２．１％又はそれ未満である；及び
    （ｃ）前記組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約８％又はそれ未満である
    のうちの１つ以上を有する組成物。
28. 前記組成物が、以下の特徴：
    （ａ）前記組成物中の酸性バリアントの量が、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定されるとおり、約２６．５％〜約３３．６％である；
    （ｂ）前記組成物中のＨＭＷ種の量が、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定されるとおり、約１．２％又はそれ未満である；及び
    （ｃ）前記組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおけるプレピークにより測定されるとおり、約３．２％又はそれ未満である
    のうちの１つ以上を有する、請求項２７に記載の組成物。
29. エレヌマブが、配列番号１の重鎖及び配列番号２の軽鎖を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
30. エレヌマブが、配列番号３の重鎖及び配列番号４の軽鎖を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
31. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物及び１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤。
32. 必要とする患者において頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための方法であって、前記患者に請求項３１に記載の医薬製剤を投与することを含む、方法。
33. 前記頭痛が、片頭痛である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記片頭痛が、反復性片頭痛又は慢性片頭痛である、請求項３３に記載の方法。
35. 必要とする患者における頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための方法における使用のための請求項１〜３０のいずれか一項に記載のエレヌマブ組成物。
36. 前記頭痛が、片頭痛である、請求項３５に記載のエレヌマブ組成物。
37. 前記片頭痛が、反復性片頭痛又は慢性片頭痛である、請求項３６に記載のエレヌマブ組成物。
38. 必要とする患者における頭痛の発生を治療するか、予防するか、又は低減するための医薬の作製における請求項１〜３０のいずれか一項に記載のエレヌマブ組成物の使用。
39. 前記頭痛が、片頭痛である、請求項３８に記載の使用。
40. 前記片頭痛が、反復性片頭痛又は慢性片頭痛である、請求項３９に記載の使用。
41. エレヌマブ組成物の品質を査定するための方法であって、
    エレヌマブ及び１種以上のエレヌマブバリアントを含有するエレヌマブ組成物を得ること；
    前記エレヌマブバリアントが、異性化バリアント、脱アミドバリアント、酸性バリアント、ＨＭＷ種、又はこれらの組合せを含む、前記組成物中の１種以上のエレヌマブバリアントの量を測定すること；
    前記１種以上のエレヌマブバリアントの測定された量を既定の参照基準と比較すること；及び
    前記比較が前記既定の参照基準を満たすことを示す場合に、前記エレヌマブ組成物の医薬製剤又は医薬製品を作製すること
    を含む、方法。
42. 異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が測定され、且つ前記既定の参照基準が約１０％又はそれ未満である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記エレヌマブ組成物中の異性化バリアント及び脱アミドバリアントの量が、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって測定される、請求項４２に記載の方法。
44. 酸性バリアントの量が測定され、且つ前記既定の参照基準が約３８％又はそれ未満である、請求項４１に記載の方法。
45. 前記エレヌマブ組成物中の酸性バリアントの量が、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定される、請求項４４に記載の方法。
46. ＨＭＷ種の量が測定され、且つ前記既定の参照基準が約２．５％又はそれ未満である、請求項４１に記載の方法。
47. ＨＭＷ種の量が、ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって測定される、請求項４６に記載の方法。
48. 前記エレヌマブ組成物が、配列番号１の重鎖をコードする核酸及び配列番号２の軽鎖をコードする核酸を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から得られる、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。

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