JP2021510540A - 修飾細胞の増幅およびその応用 - Google Patents

Abstract

本開示は、インビボおよび／またはインビトロでＴ細胞応答および／またはＣＡＲ細胞増幅を強化するための組成物および方法に関する。例えば、細胞は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを含み得、前記第１のＣＡＲの結合ドメインは第１の抗原に結合し、前記第２のＣＡＲの結合ドメインは第２の抗原に結合する。前記第１の抗原は前記第２の抗原と異なる。実施形態では、前記第１のＣＡＲは血球の表面分子を認識し得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２８日に提出された米国出願１６／１４６，２１８、２０１８年８月２３日に提出された米国仮出願６２／７２１，７９１、２０１８年６月２７日に提出された米国仮出願６２／６９０，８９２、２０１８年４月１８日に提出された米国仮出願６２／６５９，２３３、２０１８年６月１９日に提出された米国仮出願６２／６８７，０５９、２０１８年５月３１日に提出された米国仮出願６２／６７８，８３６、２０１８年４月１７日に提出された米国仮出願６２／６５９，１１４、２０１８年２月６日に提出された米国仮出願６２／６２６，７８１、２０１８年１月２６日に提出された米国仮出願６２／６２２，６０１、および２０１８年１月１２日に提出された米国仮出願６２／６１６，６０９、２０１８年１月１１日に提出された米国仮出願６２／６１６，０７９の優先権の利益を主張し、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の情報
２０１８年１２月１８日頃に作成された、ファイルサイズが約９４９ ＫＢの「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題するコンピューターで読み取り可能なテキストファイルには、本出願の配列表が含まれており、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、修飾細胞（修飾Ｔ細胞を含む）を増幅するための組成物および方法、ならびに癌を含む疾患の治療におけるそれらの応用に関する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、Ｂ−ＡＬＬ／ＣＬＬ／リンパ腫などの癌において優れた臨床効果を達成している。しかしながら、固形腫瘍に対する治療は比較的ゆっくりと進んでいる。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を効果的にするために、腫瘍治療において患者のＣＡＲ−Ｔ細胞を長時間維持することは、患者の予後にとって重要である。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞を長時間維持できれば、この技術は腫瘍の再発を効果的に減らすことができる。

癌は悪性腫瘍と呼ばれ、異常な細胞増殖を伴い、体の他の部分に侵入または転移することがある。ヒトでは、１００種類以上の癌がある。一例は、乳房上皮組織に存在する乳癌である。乳癌細胞が正常な細胞の特性を失うと、乳癌細胞間のつながりが消えた。癌細胞が脱落すると、それらは血液および／またはリンパ系を介して全身に転移し、従って、生命を脅かす可能性がある。現在、乳癌は女性の心身の健康に対する一般的な脅威の一つとなっている。免疫療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）は癌の治療に効果的であることが証明されているが、固形腫瘍などの特定の癌をより効果的に治療するために、免疫療法を改善する必要がある。

患者はＢ細胞枯渇の状態でも生きられるため、患者のＢ細胞は、第１の抗原結合ドメインを使用して患者におけるＣＡＲ−Ｔ細胞を増幅するために使用され得る。従って、患者のより多くのＣＡＲ−Ｔ細胞を適時に増幅し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を高めることができる。患者の適時に増幅したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍細胞、特に第２のＣＡＲに結合する抗原を有する固形腫瘍細胞と接触する可能性を高めることができる。

本開示は、２つの異なる抗原結合ドメイン、すなわち、修飾細胞を増幅するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞（例えば腫瘍細胞）を殺すための第２の抗原結合ドメインを含む、Ｔ細胞などの遺伝子修飾細胞について説明している。例えば、第１の抗原結合ドメインはＢ細胞の表面抗原などの表面マーカーに結合し、かつ第２の抗原結合ドメインは腫瘍細胞の標的抗原に結合する。２つの抗原結合ドメインは、同じＣＡＲ分子、異なるＣＡＲ分子、またはＣＡＲとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に存在できる。実施形態では、第１の結合ドメインは白血球の細胞表面分子に結合するが、第２の結合ドメインは白血球の細胞表面分子と異なる抗原である腫瘍抗原に結合する。

２つの抗原結合ドメインは、単一の核酸または２つ以上の核酸によってコードされ得る。実施形態では、細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞などの修飾Ｔ細胞を含む。実施形態では、標的細胞は固形腫瘍細胞を含む。

本開示はさらに、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲをコードする１つ以上の核酸について説明している。第１のＣＡＲは第１の抗原結合ドメインを含み、かつ第２のＣＡＲまたはＴＣＲは第２の抗原結合ドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、個別のポリペプチドとして発現され、かつ少なくとも２つの個別の核酸によってコードされる。実施形態では、単一のＣＡＲは少なくとも２つの抗原結合ドメインを含み、単一の核酸によってコードされる。本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載の核酸を含むベクターに関し、かつ本明細書に記載の核酸を含む細胞に関する。

さらに、本開示は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲの導入に応答したサイトカイン放出について説明している。実施形態では、サイトカインはＩＬ−６およびＩＦＮ−γである。

本発明の概要は、主張された主題の主な特徴または必要な特徴を特定することを意図しておらず、主張された主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。

図面と組み合わせて具体的な実施形態について説明する。異なる図面で使用される同じ参照番号は、類似または同一の項目を示す。

例示的なＣＡＲ分子および細胞膜の一部の概略図である。 ２つのＣＡＲ分子を含む核酸構築物と、２つの異なるＣＡＲ分子を含むＴ細胞の構造の概略図である。 ２つのＣＡＲ分子を含む細胞膜の例示的な部分を示す概略図である。 二重特異性ＣＡＲ分子を含む細胞膜の例示的な部分を示す概略図である。 二重特異性ＣＡＲ分子およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む細胞膜の例示的な部分を示す概略図である。 抗ＣＤ１９ ＣＡＲおよび抗ＭＵＣ１ ＣＡＲを発現するＴ細胞のフローサイトメトリーによる検出結果を示す。 抗ＣＤ１９ ＣＡＲおよび抗ＭＵＣ１ ＣＡＲを発現するＴ細胞の機能分析を示す。 様々な基底細胞との共培養に対するＴ細胞の応答を示すヒストグラムである。 様々な基底細胞との共培養に対するＴ細胞の応答を示すヒストグラムである。 Ｔ細胞における抗ＴＳＨＲ ＣＡＲ分子の発現のフローサイトメトリー分析（単一の生細胞によってゲートされる）を示す。抗ＴＳＨＲ ＣＡＲ Ｔ細胞を構築し、フローサイトメトリーによりＣＡＲ分子の発現を検出した。非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ分子の発現が観察された。 Ｔ細胞におけるＴＳＨＲの過剰発現のフローサイトメトリー分析（単一の生細胞によってゲートされる）を示す。レンチウイルスベクターは、抗原過剰発現Ｔ細胞（ＴＳＨＲ）を構築するために使用された。Ｔ細胞表面におけるＴＳＨＲ分子の発現（左側はＩｇＧ、右側は抗ＴＳＨＲ ＦＩＴＣ）が観察された。 マウス末梢血におけるサイトカイン放出（ＩＬ−２）を示す。 マウス末梢血におけるサイトカイン放出（ＩＦＮ−γ）を示す。 マウス末梢血におけるサイトカイン放出（ＩＬ−４）を示す。 マウス末梢血におけるＣＡＲ／ＣＤ３の細胞比が対照と比較して増加したことを示す。 ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者Ａに注入した後のＣＡＲ分子のコピー数の経時的変化（日数）を示す。 ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者Ｂに注入した後のＣＡＲ分子のコピー数の経時的変化（日数）を示す。 ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者Ｃに注入した後のＣＡＲ分子のコピー数の経時的変化（日数）を示す。 ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者Ｄに注入した後のＣＡＲ分子のコピー数の経時的変化（日数）を示す。 ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者Ｅに注入した後のＣＡＲ分子のコピー数の経時的変化（日数）を示す。 遺伝子の例示的なエクソンを標的とする１対のＺＦＮの例を示す。 様々な遺伝子フラグメントを標的とし、ＰＣＲによって増幅されるＺＦＮの配列決定結果を示す。ＺＦＮの二重配列決定信号が観察され、かつ二重配列決定信号の下部が黒い枠で囲まれることは、標的遺伝子に突然変異が導入されたことを示す。二重配列決定信号の密度が高いほど、編集効率が高くなる。 様々な遺伝子フラグメントを標的とし、ＰＣＲによって増幅されるＺＦＮの配列決定結果を示す。ＺＦＮの複数の配列決定信号が観察され、かつ複数の配列決定信号の下部が黒い枠で囲まれることは、標的遺伝子に突然変異が導入されたことを示す。複数の配列決定信号の密度が高いほど、編集効率が高くなる。配列決定結果の上のラベルは、対応するＺＦＮの組み合わせを表し、ＺＦＮによって識別された標的配列は黒い枠で囲まれた。 ｇＲＮＡ治療の使用または非使用状態での２９３Ｔ細胞のＢ２ｍ発現のフローサイトメトリーを示す。 異なるグループにおけるヒト白血球／マウス白血球のフローサイトメトリーによる検出結果を示す。これらの細胞は、マウス末梢血溶解後のすべての生細胞に由来した。横軸はｈＣＤ４５の対応する染色の蛍光強度を表し、縦軸はｍＣＤ４５の対応する染色の蛍光強度を表す。 Ｔ細胞／ヒト白血球のフローサイトメトリーによる検出結果を示す。これらの細胞は図３２−３５のヒト白血球ｈＣＤ４５に由来し、横軸はＣＤ３の対応する染色の蛍光強度を表し、縦軸はＣＤ１９の対応する染色の蛍光強度を表す。 各マウスのサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γの放出を示す。末梢血サンプルはマウスから得られ、かつ上清は表１３に提供された。 マウス末梢血Ｔ細胞におけるＣＤ８／ＣＤ４比を示す４。これらの細胞は図３６−３９のＣＤ３に由来し、横軸はＣＤ４の対応する染色の蛍光強度を表し、縦軸はＣＤ８の対応する染色の蛍光強度を表す。具体的な結果を表１４に示す。 Ｔ細胞／マウス白血球の結果を示す。表１９の統計とデータから、グループＮＴ、グループ２４０７およびグループＮａｌｍ６＋２４０７＋１２０４のＴ細胞／マウスにおける白血球の比率は類似しており、グループ２４０７＋１２０４のＴ細胞／マウスにおける白血球の比率は他の４つのグループよりも高いということが分かる。 ＣＤ８／ＣＤ４の結果を示す。表２０の統計データから、ＣＤ８／ＣＤ４の４つのグループの比率に有意差がないことが分かる。 マウスからの末梢血サンプルと上清のサイトカインデータを示す。 異なる細胞で注入したグループに応答したマウスの腫瘍体積の変化を示す。 ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者Ｆに注入した後のＣＡＲ分子のコピー数の経時的変化（日数）を示す。ＣＡＲ分子のコピー数には、ＣＡＲの合計コピー数と各ＣＡＲ（つまり、抗ＣＤ１９ ＣＡＲおよび抗ｔＭＵＣ１ ＣＡＲ）のコピー数が含まれる。 患者Ｆのサイトカイン放出結果を示す。 患者Ｃと患者Ｆとの間のＩＬ−６放出の比較を示す。 患者Ｃと患者Ｆとの間のＩＦＮ−γ放出の比較を示す。

特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解しているものと同じ意味である。本開示の実施または試験において本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料も依然として記載されている。本開示の目的のために、以下の用語は次のように定義される。

冠詞「１つ（ａ／ａｎ）」は、１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の文法的目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。

「約」とは、参照数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの変化が２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％に達することを意味する。

本明細書で使用されるように、「活性化」という用語は、検出可能な細胞の増殖を誘導するのに十分に刺激されている細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能と関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、特に、細胞分裂しているＴ細胞を指す。

「抗体」という用語は最も広く使用されており、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを指し、望ましい生物学的活性または機能を示せばよい。本開示における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂとＦ（ａｂ）_２、および一本鎖抗体とヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗら，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）を含む様々な形態で存在し得る。

「抗体フラグメント」という用語は、全長抗体の一部、例えば、抗体の抗原結合または可変領域を指す。抗体フラグメントの他の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２とＦｖフラグメント、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。

「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントを指す。このフラグメントは、緊密で、非共有結合される１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインを折り畳むことにより、６つの超可変ループ（Ｈ鎖からの３つのループとＬ鎖からの３つのループ）が生成され、抗原結合に使用されるアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの相補的決定領域（ＣＤＲ）のみを含むＦｖの半分）であっても、その親和性が結合部位全体（二量体）よりも低いが、抗原を認識して結合する能力がある。

本明細書で使用される「抗体重鎖」は、自然に存在するコンフォメーションですべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、自然に存在するコンフォメーションですべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。Κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

「合成抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージによって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。前記用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成、および抗体を得るためまたは抗体をコードするアミノ酸を得るためのＤＮＡ分子の発現によって生成された抗体を含む。合成ＤＮＡは、当技術分野で利用可能でよく知られている技術を使用して得られる。

「抗原」という用語は、抗体産生、または特異的免疫機能を持つ細胞の活性化、またはその両方を含み得る、免疫応答を誘発する分子を指す。抗原は、すべてのタンパク質やペプチドを含む任意の高分子、または組換えやゲノムＤＮＡに由来する分子を含む。例えば、ＤＮＡは、免疫応答を誘発するタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列または一部のヌクレオチド配列を含むため、本明細書で使用される用語「抗原」をコードする。抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液を含む生体サンプルから生成、合成、または誘導することができる。

本明細書で使用されるように、「抗腫瘍作用」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存数の減少、腫瘍細胞を有する対象の平均余命の増加または癌性病態に関連する様々な生理学的症状の改善に関連する生物学的作用を指す。「抗腫瘍作用」は、そもそも腫瘍の発生を予防する際のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにすることができる。

「自己抗原」という用語は、免疫系によって外来であると誤認される抗原を指す。自己抗原には、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が含まれる。

「自己の」という用語は、その後同じ被検者に再導入される、被検者に由来する材料を説明するために使用される。

「同種異系の」という用語は、同じ種の異なる被検者に由来する移植片を説明するために使用される。一例として、ドナー被検者は、関連または非関連またはレシピエント被験体であり得るが、ドナー被検者はレシピエント被験体と同様の免疫系マーカーを有する。

「異種の」という用語は、異なる種に由来する被検者の移植片を説明するために使用される。一例として、ドナー被検者はレシピエント被験体とは異なる種に由来し、ドナー被検者およびレシピエント被験体は遺伝的および免疫学的に不適合であり得る。

「癌」という用語は、異常な細胞の急速で制御されない成長を特徴とする疾患を指すために使用される。癌細胞は、局所的に転移し、または血流とリンパ系を介して体の他の部分に転移する可能性がある。様々な癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが含まれる。

明細書全体において、文脈によって別段の要求をしていない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という言葉は、前記ステップや要素或いはステップや要素の群を含むことを示唆するが、他のステップや要素或いはステップや要素の群を除外しないように理解される。

「・・・からなる」という語句は、「・・・からなる」という語句の後のあらゆるものを含み、かつそれに限定されることを意味する。従って、「・・・からなる」という語句は、リストされた要素が必須または必要であり、他の要素が存在しないことを示す。

「基本的には・・・からなる」という語句は、語句の後にリストされた任意の要素を含み、かつ本開示においてリストされた要素に対して指定された活動または動作に妨害または影響しない他の要素を含み得ることを意味する。従って、「基本的には・・・からなる」という語句は、リストされた要素が必須または必要であるが、他の要素は選択可能であり、リストされた要素の活動または動作に影響するかどうかに応じて、存在する場合と存在しない場合があることを示す。

「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は、核酸の一部の塩基のみが塩基対合規則に従って一致する「部分的な」相補性であってもよく、核酸間に存在する「完全な」または「全体的な」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に大きな影響を与える。

「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」という用語は、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に実質的に同一または相補的なヌクレオチド配列を有するか、ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と実質的に同じのアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチド、を意味する。

「共刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を指し、それがＴ細胞上の相同の共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが担持されたＭＨＣ分子との結合によって提供される一次信号以外の信号を提供し、前記信号は、増殖、活性化、分化および他の細胞応答の少なくとも１つを含むＴ細胞応答を媒介する。共刺激リガンドは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、ＣＤ７のリガンド、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得る。 共刺激リガンドは、特に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど、Ｔ細胞に存在する共刺激分子と特異的に結合するアゴニストまたは抗体、をさらに含む。

「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の相同結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣ クラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌ様受容体を含む。

「共刺激信号」という用語は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次信号と組み合わせて、Ｔ細胞の増殖および／または主要分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを引き起こす信号を指す。「疾患」および「病状」という用語は、互換的に使用されてもよいし、特定の疾患または病状の病原性物質が分からない（従って、病因がまだ解明されていない）可能性があるため、疾患としてまだ周知されておらず、臨床医によって多かれ少なかれ特定の症状が特定されている望ましくない状態または症候群としてのみ認識されているという点で、異なる場合がある。「疾患」とは、被検者の健康状態が恒常性を維持できない状態であり、疾患が改善されなければ、被検者の健康が悪化し続ける状態をいう。対照的に、被検者の「病症」とは、動物が恒常性を維持できる健康状態であるが、その動物の健康状態が、病症がない場合よりも好ましくない状態である。無治療のまま放置しても、病症があるからといって、動物の健康状態がさらに低下するとは限らない。

「有効」という用語は、望ましい、期待された、または意図された結果を達成するのに十分であることを意味する。例えば、治療設定における「有効量」は、治療上または予防上の有益性をもたらすのに十分な化合物の量であり得る。

「エンコード」という用語は、決定されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）、または決定されたアミノ酸配列およびその結果として生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能するために、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける特定ヌクレオチド配列の固有特性を指す。従って、遺伝子は、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合に、前記タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一のヌクレオチド配列（「Ｕ」で「Ｔ」が置換されていることを除き、通常は配列表に記載されている）を有するコード化鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡ転写のテンプレートとして使用される非コード化鎖は、いずれも、前記遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするものとして参照することができる。

「外因性」という用語は、野生型の細胞または生物体に自然に存在しないが、通常は分子生物学的技術によって細胞内に導入される分子を指す。外因性ポリヌクレオチドの一例として、ベクター、プラスミドおよび／または所望のタンパク質をコードする人工核酸構築物が含まれる。ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関して、「内因性」または「自然的」という用語は、与えられた野生型の細胞または生物体内に見出され得る自然に存在するポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。同様に、分子生物学的技術によって、第１の生物体から単離して第２の生物体に転移された特定のポリヌクレオチド配列は、第２の生物体に対して「外因性」のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列と見なされる。具体的な実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、分子生物学的技術によって、そのようなポリヌクレオチド配列を含んでいる微生物に「導入」することができ、それによって、例えば、自然に存在するポリヌクレオチド配列の１つ以上の他のコピーを作成し、コードされたポリペプチドの過剰発現を促進する。

「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。

「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって提供され、またはインビトロ発現系において提供され得る。発現ベクターは、当技術分野で知られている、組換えポリヌクレオチドを組み込んだすべてのもの、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸、またはリポソームに含まれている）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。

「相同」という用語は、２つの比較される配列の１つの位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド間の配列類似性または配列同一性を意味し、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有されている場合、分子は前記位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列が共有している一致するまたは相同な位置の数を、比較された位置の数で割ったもの×１００の関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個の位置が一致しまたは相同であれば、２つの配列は６０％の相同性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有する。相同性が最大になるように、２つの配列をアラインメントしたときに比較が行われる。

「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指す。このようなタンパク質に含まれるメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの５つである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、消化管分泌物、呼吸器や生殖器の粘液分泌物などの体内分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの被検者における一次免疫応答で産生される主な免疫グロブリンである。凝集、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌やウイルスからの防御に重要な役割を果たしている。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有しないが、抗原受容体として機能できる免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露時に、肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことにより、即時型の過敏症を媒介する免疫グロブリンである。

「単離」という用語は、基本的または実質的には、その本来の状態でそれに通常付随する成分に含まれない材料を指す。前記材料は、細胞、またはタンパク質や核酸などの高分子であり得る。例えば、本明細書で使用される「単離ポリヌクレオチド」は、自然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から除去されたＤＮＡフラグメントを指す。あるいは、本明細書で使用される「単離ペプチド」または「単離たポリペプチド」などは、ペプチドまたはポリペプチド分子を、その自然な細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、インビトロで単離および／または精製したものを指す。

「基本的に精製された」という用語は、その本来の状態でそれに通常会合する成分に基本的に含まれない材料を指す。例えば、基本的に精製された細胞は、その自然に発生した状態または本来の状態で通常会合している他の細胞種類から単離された細胞を指す。いくつかの実施形態では、基本的に精製された細胞集団は均質な細胞集団を指す。他の実施形態では、この用語は、単に、その本来の状態でそれと自然に会合している細胞から単離された細胞を指す。実施形態では、細胞はインビトロで培養される。実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。

本開示の文脈では、一般的に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを表す。

特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮退版であり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、さらに、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がある形態で１つ以上のイントロンを含んでもよい程度でイントロンを含み得る。

「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも独特であり、非分裂細胞に感染することができ、また、大量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送り込むことができるため、遺伝子送達ベクターとしては最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、有意なレベルの遺伝子導入をインビボで達成する手段を提供する。

「調節」という用語は、治療をしないまたは化合物を使用しない場合の被検者における応答レベルと比較して、および／または他の同様であるが未治療の被検者における応答レベルと比較して、被検者における応答レベルの検出可能な増加または減少を媒介することを指す。前記用語は、本来の信号や応答を干渉し、および／または影響を与え、それによって被検者、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを含む。

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに、「操作可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合には、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合には、コード化配列に操作可能に連結されており、または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合には、コード化配列に操作可能に連結されている。

「転写制御下」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに操作可能に連結され、且つポリヌクレオチドに対して正しい位置および配向にあることを指す。

「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、特定の組織または器官からの正常な細胞における発現レベルに対する、患者の前記組織または器官の固形腫瘍などの疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の異常な発現レベルを示すことを意図する。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって確定することができる。

固形腫瘍は、通常、嚢胞や液状の部分を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍には、良性のものと悪性のものがある。様々な種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される（肉腫、癌腫やリンパ腫など）。肉腫や癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫およびＣＮＳ（中枢神経系）腫瘍（神経膠腫など（脳幹神経膠腫や混合神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫とも呼ばれる）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫や脳転移）が含まれる。

固形腫瘍抗原は、固形腫瘍で発現される抗原である。実施形態では、固形腫瘍抗原はまた、健康な組織において低レベルで発現される。固形腫瘍抗原およびその関連する疾患腫瘍の例を表１に提供する。

組成物の「非経口投与」という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、胸骨内注射または注入技術を含む。

「患者」、「被検者」や「個体」などの用語は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載された方法に適合する任意のヒト、動物または生体を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、被検者または個体は、ヒトまたは動物である。実施形態では、「被検者」という用語は、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被検者の例としては、ヒト、および犬、猫、マウス、ラットおよびそれらの遺伝子組み換え種などの動物が含まれる。

治療を必要とする被検者またはその必要性がある被検者には、治療を必要とする疾患、病状または病症を有する被検者が含まれる。その必要性がある被検者は、疾患、病状または病症の予防のために治療を必要とする被検者も含まれる。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。前記用語は、通常、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態の、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態を指す。前記用語は、一本鎖や二本鎖形態を含む核酸のすべての形態を含む。

「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下に定義される厳しい条件で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、さらに少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを含む。従って、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが付加または欠失されたか、異なるヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関して、当技術分野でよく理解されるように、参照ポリヌクレオチドに対して、突然変異、付加、欠失および置換を含む特定の改変を行うことができ、それにより、改変されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持するか、参照ポリヌクレオチドに対して活性が増加する（すなわち、最適化される）。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、本明細書に記載された参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％（少なくとも５１％〜少なくとも９９％およびその間のすべての整数パーセンテージ、例えば、９０％、９５％または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、自然に存在する対立遺伝子変異体およびオーソログを含む。

「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用でき、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成類似体を指す。従って、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の非自然に存在するアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、例えば、対応する自然に存在するアミノ酸の化学類似体、および自然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様において、ポリペプチドは、通常、様々な化学反応を触媒する（すなわち、その速度を上げる）酵素ポリペプチドまたは「酵素」を含み得る。

「ポリペプチド変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチド配列と区別されるポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は、保存的または非保存的であり得る１つ以上の置換によって参照ポリペプチドと区別される。特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は保存的置換したものを含み、この点において、いくつかのアミノ酸は、ポリペプチド活性の性質を変えることなく、略類似する特性を有する他のアミノ酸に変更され得ることは、当技術分野でよく理解されている。ポリペプチド変異体はまた、１つ以上のアミノ酸が付加または欠失されたか、異なるアミノ酸残基によって置換されたポリペプチドを含む。

「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構が認識され、または合成機構の導入によって、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を指す。「発現制御配列」という用語は、特定の宿主生物において操作可能に連結されたコード化配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的なオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。

「結合（ｂｉｎｄ）」、「結合（ｂｉｎｄｓ）」または「・・・と互いに作用する」という用語は、サンプルまたは生物中の第２の分子を認識して付着するが、サンプル中の他の構造的に無関係な分子を基本的に認識または付着しない分子を指す。抗体に関して、本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を基本的に認識または結合しない抗体を指す。例えば、１つの種からの抗原と特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からのその抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体が抗体の特異的な分類を変更しない。別の例では、抗原と特異的に結合する抗体は、異なる対立遺伝子型の抗原に結合してもよい。しかしながら、このような交差反応性は、それ自体が抗体の特異的な分類を変更しない。いくつかの実施形態では、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、抗体、タンパク質またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを暗示する；例えば、抗体は、任意のタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」および抗体を含む反応で、エピトープＡ（または遊離の非標識Ａ）を含む分子が存在すると、抗体に結合する標識Ａの量が減少する。

「統計的に有意」とは、その結果が偶然に発生した可能性が低いことを意味する。統計的に有意性は、当技術分野で知られている任意の方法で決定することができる。一般的に使用される有意性の尺度は、帰無仮説が真である場合に観察された事象が発生する頻度または確率であるｐ値を含む。得られたｐ値が有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純な場合に、有意性レベルは０．０５以下のｐ値で定義される。「減少した」または「低下した」または「より少ない」量は、通常、「統計的に有意な」または生理学的に有意な量であり、本明細書に記載されている量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０倍以上（例えば、１００、５００、１０００倍）の減少を含む（１以上のすべての整数および小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）。

「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその相同リガンドとの結合によって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した信号伝達などの信号伝達イベントを媒介して、誘導された一次応答を指す。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えば、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーションおよび／または細胞骨格構造の再編成を媒介することができる。

「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞に存在する相同刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。例えば、来刺激分子に由来する機能的信号伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体に会合するζ鎖である。

「刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞などの細胞上の相同結合パートナー（本明細書で「刺激分子」をいう）に特異的に結合でき、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖および類似のプロセスを含む、Ｔ細胞の一次応答を媒介するリガンドを指す。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、特に、ペプチド、抗ＣＤ３抗体、超アゴニスト抗ＣＤ２８抗体および超アゴニスト抗ＣＤ２抗体が負荷されたＭＨＣ クラスＩ分子を包含する。

「治療の」という用語は、治療および／または予防を指す。治療效果は、病状の抑制、寛解または根絶または病状の緩和によって得られる。

「治療上有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織、系または被検者の生物学的または医学的応答を誘発する化合物の量を指す。「治療上有効な量」という用語は、投与されたときに、治療される病症または疾患の１つ以上の徴候または症状の発展を防止するか、またはある程度軽減するのに十分である化合物の量を含む。治療上有効な量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される被検者の年齢、体重などによって変化する。

「疾患を治療する」という用語は、被検者が経験する疾患または病症の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度の軽減を指す。

「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転移または導入されたプロセスを指す。「トランスフェクトの」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。前記細胞は、一次被験細胞およびその子孫を含む。

「ベクター」という用語は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞内部に送達し得るポリヌクレオチドを指す。線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と会合するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む、多数のベクターが当技術分野で知られている。従って、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。前記用語はまた、細胞への核酸の転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含む。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、腺伴随ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。例えば、レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構成機能を持つ他の遺伝子をさらに含む。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒化することによって生成され、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させることで、生物学的に安全なベクターとなる。

範囲：本開示全体を通して、本開示の様々な態様を範囲形式で提示することができる。理解されるように、範囲形式の説明は、単に便宜上および簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではない。従って、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能なすべてのサブ範囲を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１から６までのような範囲の説明は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までのサブ範囲と、その範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３および６が具体的に開示されていると考えるべきである。範囲の広さに関係なく適用される。

「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）分子は、少なくとも細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインまたは細胞内ドメインを含む組換えポリペプチドである。実施形態では、ＣＡＲのドメインは、同じポリペプチド鎖、例えばキメラ融合タンパク質上にある。実施形態では、前記ドメインは、異なるポリペプチド鎖にあり、例えばドメインは隣接していない。

ＣＡＲ分子の細胞外ドメインは抗原結合ドメインを含む。実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ細胞表面上の抗原、例えば細胞表面分子またはマーカーに結合する。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子はＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３を含む。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである。具体的な実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子はＣＤ１９である。

実施形態では、抗原結合ドメインは腫瘍表面上の抗原、例えば腫瘍抗原または腫瘍マーカーに結合する。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞を介した免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、例えば腫瘍関連ＭＵＣ１、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸溶性カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、前立腺酵素（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、前立腺特異的タンパク質（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、生存、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメソセリンを含む。例えば、腫瘍抗原がＣＤ１９である場合、そのＣＡＲはＣＤ１９ＣＡＲと呼ぶことができる。

実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも１つのｓｃＦｖまたは少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む。一例として、ＣＡＲに２つのｓｃＦｖが存在する場合がある。ｓｃＦｖは、柔軟なリンカによって連結された標的抗原特異性モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。一本鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いて軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を連結することにより調製することができる（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８）。連結ペプチドの例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号２７８）を有するＧＳリンカであり、１つの可変領域のカルボキシ末端と別の可変領域のアミノ末端の間を約３．５ｎｍ架橋する。他の配列のリンカが設計および使用されている（Ｂｉｒｄら，１９８８，上記と同様）。通常、リンカは、短く、柔軟なポリペプチドであり得、好ましくは約２０以下のアミノ酸残基を含む。一本鎖変異体は、組換えまたは合成によって生産することができる。ｓｃＦｖの合成生産のためには、自動合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え生産のためには、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適当なプラスミドを適当な宿主細胞、例えば、酵母、植物、昆虫や哺乳類細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物のいずれかに導入することができる関心のあるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結などの通常の操作によって調製することができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。

本明細書に記載されるＣＡＲ分子の細胞質ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインおよび１つ以上の信号伝達ドメインを含む。共刺激ドメインおよび信号伝達ドメインは、抗原結合に応答して信号を伝達し、Ｔ細胞などの分子を活性化するように機能する。１つ以上の共刺激ドメインは、刺激分子および／または共刺激分子に由来し、信号伝達ドメインは、ＣＤ３ ζドメインなどの一次信号伝達ドメインに由来する。実施形態では、信号伝達ドメインはまた、共刺激分子に由来する１つ以上の機能的信号伝達ドメインを含む。実施形態では、共刺激分子は、抗原に対する細胞応答を活性化するために必要な細胞表面分子（抗原受容体またはそのリガンド以外のもの）である。

実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの細胞内ドメインを含む。実施形態では、信号伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体に由来するＣＤ３ ζドメインを含む。

実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、１つ以上の刺激ドメインのみを含み、信号伝達ドメインを含まない。

ＣＡＲ分子はまた、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインをＣＡＲ分子に組み込むことで、分子を安定化にする。実施形態では、ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ分子の膜貫通ドメインである。

ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間には、スペーサードメインが組み込まれる場合がある。本明細書で使用されるように、「スペーサードメイン」という用語は、通常、ポリペプチド鎖上の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインに膜貫通ドメインを連結するために機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。

本開示は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインをコードする単離核酸を記載している。実施形態では、ＷＢＣの表面上の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインがあり、且つ、ＷＢＣの表面上の抗原とは異なる腫瘍上の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインがある。第１の抗原結合ドメインは、導入された細胞を増幅する機能を有し、第２の抗原結合ドメインは、標的抗原に結合した後、標的腫瘍抗原を含む腫瘍細胞の増殖を抑制または前記腫瘍細胞を殺傷する機能を有する。実施形態では、本明細書に記載される単離核酸は、同じ核酸分子上の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインをコードする。実施形態では、２つの抗原結合ドメインは、２つの個別の核酸分子によってコードされる。例えば、第１の核酸は第１の抗原結合ドメインをコードし、第２の核酸は第２の抗原結合ドメインをコードする。

実施形態では、本開示は、結合分子の第１の抗原結合ドメインおよび結合分子の第２の抗原結合ドメインをコードする核酸を記載しており、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する。実施形態では、第２の結合ドメインはＢ細胞マーカーに結合しない。実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号２６４または２６５のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む。例えば、第２の抗原結合ドメインは、配列番号２７１−２７７のアミノ酸配列の１つを有するＣＡＲ上にある。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲなどの２つの異なる結合分子（第１の結合分子および第２の結合分子）にあってよい。一例として、第１のＣＡＲは、Ｂ細胞表面上のマーカーに結合する細胞外結合ドメインを含み、第２のＣＡＲは、腫瘍細胞の標的抗原に結合する細胞外結合ドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なる核酸によってコードされる。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、２つの異なる結合分子であるが、単一の核酸によってコードされる。

実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインは、例えば、二重特異性ＣＡＲ上の同じ結合分子上にあり、且つ単一の核酸によってコードされ得る。実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、リンカによって連結された２つの異なるｓｃＦｖ分子を有することができる。

実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインは、ＣＡＲおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）上にあり、かつ個別の核酸によってコードされ得る。ＴＣＲの結合ドメインは、腫瘍細胞上の特異的な腫瘍抗原または腫瘍マーカーを標的とすることができる。実施形態では、ＴＣＲ結合ドメインは、特異的な腫瘍抗原を標的とするＴＣＲα結合ドメインまたはＴＣＲβ結合ドメインである。実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖またはＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を含む。

本開示はまた、上記の単離核酸を含むベクターについて説明している。実施形態では、単一のベクターは、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲをコードする単離核酸を含む。実施形態では、第１のベクターは第１のＣＡＲをコードする第１の核酸を含み、第２のベクターは第２のＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸を含む。実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲを含む。

さらに、本開示は、上記の単離核酸またはベクターを含む細胞について説明している。細胞には本明細書に記載の単離核酸またはベクターが導入され、少なくとも２つ以上の異なる結合ドメインを発現する。実施形態では、細胞は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子とは異なる抗原に結合する。さらに、本開示は、本明細書に記載されたＴ細胞集団の組成物を記載している。実施形態では、細胞はリンパ球である。具体的な実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である。

本開示はまた、上記細胞を培養する方法について説明している。本明細書に記載の方法は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインからなる細胞を得ること、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、および、ＷＢＣの細胞表面分子または第２の抗原結合ドメインが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養すること、を含む。実施形態では、試薬は、ＷＢＣの細胞表面分子の細胞外ドメインである。

本開示は、インビトロで細胞を調製するための方法を記載しており、前記方法は、細胞を提供することと、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインをコードする１つ以上の核酸を細胞に導入すること、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、および、ＷＢＣの細胞表面分子または第２の抗原結合ドメインが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養すること、を含む。

本開示は、癌を有する被検者においてＴ細胞増幅を強化するために調製された細胞調製品を使用することを記載している。実施形態では、方法は、複数の核酸をＴ細胞に導入すること、ここで、複数の核酸は、固形腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、かつＢ細胞抗原に結合するＣＡＲをコードし、Ｔ細胞の少なくとも一部は、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲおよびＢ細胞抗原に結合するＣＡＲを含み、および、被検者にＴ細胞の有効量を投与すること、を含む。

また、本開示は、被検者においてリンパ球（Ｔ細胞）応答を導入および／または強化するための方法を記載している。本明細書に記載される実施形態は、リンパ球を増幅するメカニズム、およびＣＡＲ上の抗原の腫瘍細胞への結合メカニズムに関する。実施形態では、第１のメカニズムは、被検者におけるリンパ球の増幅に関与する信号に関連する分子に関し、別のメカニズムは、被検者における腫瘍細胞の結合、腫瘍細胞の増殖の抑制または腫瘍細胞の殺傷に向けられた信号に関連する分子に関する。例えば、第１のメカニズムは、血球や血漿などの血液、または非必須組織に関連する抗原に結合するＣＡＲを含み、別のメカニズムは、腫瘍細胞に関連する抗原を標的とするＣＡＲまたはＴＣＲを含む。非必須組織の例としては、乳腺、結腸、胃腺、卵巣、ＷＢＣなどの血液成分および甲状腺が含まれる。実施形態では、第１のメカニズムは分子の第１の結合ドメインに関するものであり、別のメカニズムは分子の第２のドメインに関するものである。実施形態では、第１のメカニズムおよび別のメカニズムは、同じ分子によって、または個別の分子によって実行される。具体的な実施形態では、一方のメカニズムは、腫瘍細胞に関連する抗原を発現する細胞に関するものであり、他方のメカニズムは、抗原結合ドメインを有するリンパ球に関するものである。

本明細書に記載される方法は、増幅分子および機能分子を含むリンパ球に関する。実施形態では、増幅分子は、被検者のリンパ球を増幅し、および／または機能分子は被検者の腫瘍細胞の増殖を抑制するか、腫瘍細胞を殺す。実施形態では、増幅分子および機能分子は、単一のＣＡＲ分子、例えば、二重特異性ＣＡＲ分子上にある。実施形態では、増幅分子および機能分子は、個別の分子、例えば、ＣＡＲおよびＴＣＲまたは２つの異なるＣＡＲ上にある。増幅分子は、血球や血漿などの血液、または非必須組織に関連する抗原に結合するＣＡＲを含むことができ、機能分子は、腫瘍細胞に関連する抗原を標的とするＣＡＲまたはＴＣＲを含むことができる。

被検者におけるリンパ球またはＴ細胞の応答とは、補助、殺傷、調節、および他のタイプのＴ細胞に関連する細胞媒介性免疫を指す。例えば、Ｔ細胞応答は、免疫学的プロセスにおいて他のＷＢＣを補助すること、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を同定して破壊することなどの活動を含み得る。被検者におけるＴ細胞応答は、Ｔ細胞が殺すウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞の数、Ｔ細胞がインビトロおよび／またはウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞との共培養において放出するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ）の量、被検者におけるＴ細胞の増殖レベル、Ｔ細胞の表現型の変化（例えば記憶Ｔ細胞の改変）および被検者におけるＴ細胞の長寿または寿命レベルなどの様々な指標を介して検出することができる。

実施形態では、Ｔ細胞応答を強化する方法は、それを必要とする被検者、例えば、腫瘍があると診断された被検者を治療することができる。腫瘍という用語は腫瘤を指し、これは血液などの体液の集まり、または固形の腫瘤であり得る。腫瘍は、悪性（癌性）または良性であり得る。血液癌の例としては、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および多発性骨髄腫が含まれる。

固形腫瘍は、通常、嚢胞や液状の部分を含まない。悪性固形腫瘍の主な種類には、肉腫および癌腫がある。肉腫は、血管、骨骼、脂肪組織、靭帯リンパ管、神経、軟骨、筋肉、靭帯または腱に存在可能な間質細胞と呼ばれる軟部組織細胞に発生する腫瘍で、癌腫は、皮膚や粘膜に存在する上皮細胞に発生する腫瘍である。最も一般的な肉腫には、軟部組織および骨細胞が関与する未分化多形肉腫、血管、消化管や子宮に行き渡る平滑筋細胞が関与する平滑筋肉腫、骨細胞が関与する骨肉腫、および脂肪細胞が関与する脂肪肉腫が含まれる。肉腫のいくつかの例としては、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫、中皮腫、線維肉腫、線維肉腫および神経膠腫が含まれる。

最も一般的な５つの癌腫には、体液または粘液を生成する器官（乳房や前立腺など）が関与する副腎癌、皮膚の最外層の細胞が関与する基底細胞癌（例えば皮膚癌）、皮膚基底細胞が関与する扁平上皮癌、および膀胱、腎臓や尿管を含む尿路の移行細胞に影響を及ぼす移行上皮癌が含まれる。癌腫の例としては、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、腸癌、皮膚癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌および膀胱癌および胆管癌が含まれる。

本明細書に記載の方法は、癌があると診断された被検者を治療するために使用することができる。癌は、血液癌であってもいし、肉腫や癌腫などの固形腫瘍であってもよい。治療方法は、Ｔ細胞応答を提供するために、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインからなるＴ細胞の有効量を被検者に投与することを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する。実施形態では、被検者におけるＴ細胞応答を強化することは、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを発現するＴ細胞の増殖をインビボで選択的に強化することを含む。

実施形態では、被検者におけるＴ細胞応答を強化するための方法は、２つの異なる結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲからなるＴ細胞を被検者に投与することと、またはそれぞれ異なる抗原結合ドメインを含む第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲからなるＴ細胞を投与することと、を含む。

実施形態では、被検者におけるＴ細胞応答を強化するための方法は、ＣＡＲ分子およびＴＣＲ分子からなるＴ細胞を投与することを含む。ＣＡＲ分子は、白血球の表面マーカーを標的とするか結合し、ＴＣＲ分子は、腫瘍細胞表面または内部に発現する腫瘍マーカーまたは抗原に結合する。

本開示は、抗原結合ドメインを発現する細胞をインビボで増幅する方法を記載している。この方法は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインからなるＴ細胞の有効量を、それを必要とする被検者に投与することを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する。この方法は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞の増幅に有用である。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインは第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）上にあり、第２の抗原結合ドメインは第２のＣＡＲまたはＴＣＲ上にある。例えば、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。第１のＣＡＲの細胞質ドメインは、細胞応答の活性化のための信号を伝達するための共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲの細胞質ドメインは、第１のＣＡＲの活性化または刺激が、ＷＢＣの殺傷機能を導入および／または活性化することなく、リンパ球などのＷＢＣを増幅するように、ＣＤ３ζドメインの非存在下で１つ以上の共刺激ドメインを含む。実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じＣＡＲ（第１のＣＡＲ）、例えば細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する二重特異性ＣＡＲ上にある。細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも２つのｓｃＦｖを含み、少なくとも１つのｓｃＦｖは、ＷＢＣの細胞表面分子に結合するための第１の抗原結合ドメインとして機能する。

実施形態では、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１３、Ｂ７、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢ Ｔ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＦＳＨ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ−１ Ｈ／ＨＬＡ− Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ｚｅｔａｋｉｎｅ）、Ｋａｐｐａ、白血病、ＬｅｗｉｓＹ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１、ＴＲＡＩＬ受容体１またはＶＥＧＦＲ２である。

実施形態では、ＭＵＣ１は、ヒトＭＵＣ１の腫瘍専用エピトープであり、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、個別のポリペプチドとして発現される。実施形態では、ＭＵＣ１は、ヒトＭＵＣ１の腫瘍形態（ｔＭＵＣ１）である。

実施形態では、第１のＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインなどの信号伝達ドメインなしの共刺激ドメインを含み、ＭＵＣ１ ＣＡＲ（第２のＣＡＲ）は、ＭＵＣ１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激およびＣＤ３ζドメインを含む。

本明細書で使用されるように、「ＭＵＣ１」という用語は、以下のように定義される分子を指す。ＭＵＣ１は、上皮ムチンファミリー分子の１つである。ＭＵＣ１は通常、主要な器官のすべての腺上皮細胞上に発現する膜貫通型ムチン糖タンパク質である。正常な細胞では、ＭＵＣ１は先端表面でのみ発現し、かつ炭水化物によって隔離されたコアタンパク質で高度にグリコシル化される。細胞が悪性表現型に形質転換すると、ＭＵＣ１の発現は数倍増加し、その発現はもはや先端表面に限定されるものではなく、細胞表面全体および細胞質中に見られるようになる。また、腫瘍関連ＭＵＣ１のグリコシル化は異常になり、ペプチドコアの露出量が正常組織で発現しているＭＵＣ１での存在量よりも大きい。この異常なグリコシル化の詳細については、ほとんど知られていない。

ＭＵＣ１は、多数の上皮癌で広く発現しており、異常にグリコシル化されているため、非悪性細胞で発現しているものとは構造的および抗原的に異なる（例えばＢａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ，１９９６；Ｐｒｉｃｅら，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，１９９１を参照）。ＭＵＣ１の主要な形態は、多数の２０個のアミノ酸タンデムリピートユニットを有する免疫原性の高い細胞外ムチン様ドメイン、膜貫通領域および細胞質尾部からなる高分子量分子である（Ｑｕｉｎら，２０００；ＭｃＧｕｃｋｅｎら，１９９５；Ｄｏｎｇら，１９９７）。

乳房や膵臓を含むほとんどの上皮腺癌では、ＭＵＣ１が過剰発現し、異常にグリコシル化している。乳房や膵臓の腺癌では、ＭＵＣ１が過剰発現するだけでなく、ＭＵＣ１を循環させる。高いＭＵＣ１の血清レベルは、進行性疾患に関連している。ＭＵＣ１は、抗原内で発現するエピトープが複雑かつ非均一であるため、将来のバイオマーカーとして利用される。癌組織によって合成されたＭＵＣ１（例えば、腫瘍関連ＭＵＣ１）は通常、異常なオリゴ糖の特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）を示し、これは、シアリル化−Ｌｅａ （ＣＡ１９−９試験で測定）、シアリル化−Ｌｅｘ、およびシアリル化−Ｔｎ（ＴＡＧ−７２）などのネオマーカー、ならびにＴｎなどの潜在性エピトープの発現をもたらす可能性がある。

ＭＵＣ１に対するいくつかの抗体が治療用に開発されている。ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（ＨＭＦＧ１とも呼ばれる）は、放射性同位元素のイットリウム−９０を卵巣癌の腫瘍に送達するベクターとして第ＩＩＩ期臨床試験中である（Ｓｃｏｔｔらが検討したもので， ２０１２）。ＣＡ１５−３（ＨＭＦＧ１抗体とも呼ばれる）、ＣＡ２７−２９およびＣＡ１９−９は、すべてＭＵＣ１に対する抗体であり、癌患者における循環ＭＵＣ１のレベルを評価するために使用される。しかしながら、これらの抗体は、正常な上皮細胞と形質転換した腫瘍上皮細胞で発現しているＭＵＣ１を効果的に区別できないため、治療薬またはバイオマーカーとしての有用性は限定される。換言すれば、これらの抗体はいずれも腫瘍特異的ＭＵＣ１エピトープを標的とするように見えない。

腫瘍特異的形態のＭＵＣ１（ｔＭＵＣ）に対して高度に特異的な新規抗体は、ＴＡＢ−００４と命名され、かつ米国特許第８，５１８，４０５号に記載されている（Ｃｕｒｒｙら，２０１３も参照）。ペムツモマブ（ＨＭＦＧ１）が抗原（Ｐａｒｈａｍら，１９８８）としてヒト乳脂肪球を用いて開発されたのに対し、ＴＡＢ−００４は、ＭＵＣ１の改変型を発現する腫瘍を用いて開発された（Ｔｉｎｄｅｒら，２００８）。ＴＡＢ−００４は、ＭＵＣ１のタンデムリピート配列内の改変されたグリコシル化エピトープを認識することができる。この領域は、ｔＭＵＣにおける抗原検出に用いることができるが、グリコシル化の大きな分岐によって、正常なＭＵＣ１において抗原検出を行うことができない（Ｇｅｎｄｌｅｒ，２００１；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，２００３ｂ；Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ Ｓｗａｎｓｏｎ，２００４；Ｋｕｆｅ，２００９）。重要なこととして、ＴＡＢ−００４は、他のＭＵＣ１抗体によって認識されるエピトープとは異なり、かつ重鎖および軽鎖の独特な相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する。この抗体は、３ｎｇ／ｍｌ（２０ｐＭ）の高い結合親和性で標的抗原に結合し、無関係な抗原に結合しない（Ｃｕｒｒｙら，２０１３）。従って、ＴＡＢ−００４は、ＭＵＣ１の正常形態と腫瘍形態を区別するが、ＨＭＦＧ１（ペムツモマブ）は区別することができない（米国特許第８，５１８，４０５号を参照）。

実施形態では、ＷＢＣは、顆粒球、単球および／またはリンパ球である。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞である。

実施形態では、第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。

実施形態では、抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖである。実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号５、６および５３−５８のいずれかのアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲは、配列番号５−１７、２９、３３、３７、７１および７２のいずれかのアミノ酸配列または配列番号４１、４５、６３、６７および６８の核酸配列のうちの１つによってコードされるアミノ酸配列を含む。実施形態では、第１のＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号５９または６０の核酸配列を含み、第２のＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号６１の核酸配列を含む。実施形態では、単離核酸は、配列番号６２−６９の核酸配列のうちの１つを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、個別のポリペプチドとして発現される。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインはＣＡＲ上にあり、第２の抗原結合ドメインはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）上にある。実施形態では、ＴＣＲは修飾ＴＣＲである。実施形態では、ＴＣＲは、患者において自然に発生する腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する。実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原に結合する。実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１を含む。

実施形態では、標的抗原に対して高い親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞クローンを単離することができる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または末梢血単球（ＰＢＭＣ）は、ＨＬＡ対立遺伝子が定義された場合に提示を行うとき優性Ｔ細胞応答を誘発することが知られているエピトープを表すペプチドでパルス化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養することができる。高親和性クローンは、ＭＨＣ−ペプチドテトラマー染色および／または低滴定濃度の同族ペプチド抗原でパルス化された標的細胞を認識および溶解する能力に基づいて選択可能である。クローンを選択した後、分子クローニングにより、ＴＣＲαおよび ＴＣＲβ鎖またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖を同定して単離する。例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖について、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子配列を用いて、ヒトＴ細胞における両ＴＣＲ鎖の安定した高レベルの発現を理想的に促進する発現構築物を生成する。次に、形質導入媒体（例えばγレトロウイルスまたはレンチウイルス）を生成して、その機能性（抗原特異性および機能親和性）について試験を行い、且つ臨床用ベクターを多く生成するために使用され得る。さらに、最終製品のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（通常、患者のＰＢＭＣから精製）に形質導入することができ、前記標的Ｔ細胞集団は、患者への注入前に増幅される。

腫瘍反応性ＴＣＲをコードする遺伝子を得るために、様々な方法を実行することができる。詳細は、Ｋｅｒｓｈａｗら，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４年５月；３（５）：ｅ１６で提供される。実施形態では、特異的ＴＣＲは、患者において自然に発生する腫瘍特異的Ｔ細胞に由来し得る。このカテゴリーに含まれる抗原は、メラノサイト分化抗原ＭＡＲＴ−１とｇｐ１００、およびＭＡＧＥ抗原とＮＹ−ＥＳＯ−１を含み、それらはより広範囲の癌で発現する。ウイルス関連悪性腫瘍に対して特異的なＴＣＲは、ウイルスタンパク質が形質転換細胞によって発現される限り、分離することもできる。このカテゴリーに含まれる悪性腫瘍は、肝炎とパピローマウイルスに関連する肝臓癌と子宮頸癌、およびエプスタインバーウイルスに関連する悪性腫瘍を含む。実施形態では、ＴＣＲの標的抗原は、ＣＥＡ（例えば、結腸直腸癌用）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ｐ５３（例えば、黒色腫用）、ＭＡＧＥ−Ａ３（例えば、黒色腫、食管肉腫および滑膜肉腫）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、黒色腫、肉腫および多発性骨髄腫用）を含み得る。

実施形態では、第１のＣＡＲの結合ドメインがＣＤ１９に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する。実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、（ｉ）配列番号７６または８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、配列番号７７または８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、配列番号７８または８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）配列番号７３または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＳＥＲ（ＷＡＳ）または配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、配列番号７５または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む。

実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：７７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＳＥＲ（ＷＡＳ）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む。

実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む。実施形態では、第１のＣＡＲの結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ：５または６のアミノ酸配列を含む。実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ：７０−７２および７９−８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む。

実施形態では、第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。

実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、個別のポリペプチドとして発現される。

実施形態では、第２のＣＡＲの細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインは、第２のＣＡＲが、ＣＤ１９を発現する細胞を損傷することなく、ＣＤ１９を発現する細胞を介して修飾Ｔ細胞を活性化することができるように修飾される。

本明細書に記載の実施形態は、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体に関し、ここで、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原を認識し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原を認識し、第１の抗原が第２の抗原と異なる。

実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、同じ細胞で発現しない。実施形態では、第１の抗原が血液成分の抗原であり、第２の抗原が固形腫瘍の抗原である。

血球は、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板または他の血球を指す。例えば、ＲＢＣは、循環系を通る血流を介して体組織に酸素（Ｏ２）を供給する血球である。血小板は、止血に関与する細胞であり、血栓の形成につながる。ＷＢＣは、感染症および異物から身体を守ることに関与する免疫系の細胞である。ＷＢＣには様々なタイプとサブタイプがあり、それぞれ異なる役割を果たす。例えば、顆粒球、単球およびリンパ球は、３つの主要なタイプの白血球である。顆粒球には、好中球、好酸球、好塩基球の３つの異なる形態がある。

ＷＢＣの細胞表面分子は、ＷＢＣ表面に発現する分子を指す。例えば、リンパ球の細胞表面分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ３０を含み得る。Ｂ細胞の細胞表面分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡを含み得る。単球の細胞表面分子は、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９およびＣＤ１ｃを含み得る。顆粒球の細胞表面分子は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８およびＣＤ１３を含み得る。

実施形態では、第１の抗原がＣＤ１９であり、第２の抗原が腫瘍関連ＭＵＣ１である。実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ：５および６のアミノ酸配列のうちの１つを含む。実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ：７０−７２および７９−８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む。

実施形態では、本開示は、被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法を記載しており、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する細胞を介して被検者の血液中で増幅するように、Ｔ細胞応答を提供するために修飾Ｔ細胞の有効量を被検者に投与することを含む。実施形態では、方法は、Ｂ細胞を被検者に注入して、ＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化および／または増幅し続けることをさらに含み得る。例えば、被検者のＢ細胞または健康なドナーからの遺伝子修飾Ｂ細胞を、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の前に入手して保存してもよい。実施形態では、方法は、ＣＤ１９を発現する細胞、またはＣＤ１９の少なくとも細胞外ドメインからなるポリペプチド、またはＣＡＲ−Ｔ細胞が認識する抗原を投与することをさらに含み得る。例えば、ＣＤ１９を発現する細胞は、ＣＤ１９をコードする核酸配列で形質導入されるＫ５６２およびＮＫ９２などの細胞株を含み得る。実施形態では、方法は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を同定すること、ならびに識別子ＣＡＲ−Ｔ細胞を被検者に投与することをさらに含み得る。例えば、ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞がタイムリーに同定され得るように、ソートマーカーと関連付けられてもよい。

実施形態では、腫瘍関連ＭＵＣ１は、腫瘍細胞で発現するが、対応する非悪性細胞で発現しない。実施形態では、腫瘍関連ＭＵＣ１に対するｓｃＦｖは、ｏ−グリコシル化のＧＳＴＡモチーフ（配列番号８８）と直接相互作用する。

本明細書に記載の実施形態は、二重特異性ＣＡＲからなる細胞に関し、かつ二重特異性ＣＡＲをコードする単離核酸に関する。

実施形態では、本開示は、細胞をインビボで増幅する方法を記載している。実施形態では、方法は、Ｔ細胞応答を提供するために、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を被検者に投与することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識可能な可溶性試薬を発現する提示細胞（例えば、Ｔ細胞）の有効量を投与することと、を含み得る。実施形態では、方法は、被検者におけるＴ細胞応答を強化するために実施され得る。方法は、Ｔ細胞応答を提供するために、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を被検者に投与することと、被検者におけるＴ細胞応答を強化するために、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識可能な可溶性試薬を発現する提示細胞の有効量を投与することと、を含み得る。特定の実施形態では、提示細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞および／または抗原提示細胞である。特定の実施形態では、被検者におけるＴ細胞応答の強化は、ＣＡＲを含むＴ細胞の増殖を選択的に強化することを含み得る。実施形態では、方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して被検者病状の治療を強化するために用いることができる。方法は、試薬を発現するＴ細胞集団を投与すること、またはワクチンとして配合される試薬を投与することを含み得る。この場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を含み、ＣＡＲの細胞外ドメインは前記試薬を認識する。実施形態では、方法は、疾患を有する被検者におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を強化するために実施され得る。方法は、ＣＡＲを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を調製することと、有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞を被検者に投与することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識可能な試薬をコードする核酸を細胞に導入することと、有効量の細胞（前記試薬をコードする核酸によって導入される）を被検者に投与することと、を含み得る。実施形態では、Ｔ細胞増幅は、Ｔ細胞ゲノムＤＮＡにおけるＣＡＲ分子のコピー数の増加に基づいて測定され得る。実施形態では、Ｔ細胞増幅は、Ｔ細胞で発現された分子に関するフローサイトメトリー分析に基づいて測定され得る。

本明細書に記載の実施形態は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲからなる単離Ｔ細胞に関し、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４およびＢＣＭＡなどの抗原に結合し、かつ第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは腫瘍関連ＭＵＣに結合する。実施形態では、腫瘍関連ＭＵＣはＭＵＣ１またはＭＵＣ２である。本明細書に記載の実施形態は、単離Ｔ細胞集団からなる組成物、および被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法に関するものであり、前記方法は、単離Ｔ細胞の有効量を投与することを含む。

実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲは、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号２０３、２０７、２１６または２１９のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲは、配列番号２０２または２０５のアミノ酸配列を含む、実施形態１５９に記載のＴ細胞。実施形態では、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、実施形態１８１に記載の修飾細胞または方法。実施形態では、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。実施形態では、単離Ｔ細胞は、配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２１５、２１７、２１８または２２０の核酸配列を含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのそれぞれは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

実施形態では、細胞質ドメインは、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。

実施形態では、単離Ｔ細胞は、プログラム死の受容体１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アッテネーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）またはＣＤ １６０、の優性ネガティブ変異体を含む。実施形態では、単離Ｔ細胞は、対応する野生型Ｔ細胞と比較して、減少した量のＴＣＲを含む。優性ネガティブ突然変異は、野生型対立遺伝子に対して拮抗的に作用する変化した遺伝子産物を有する。これらの突然変異は通常、分子機能の変化（通常は不活性）を引き起こし、優性または半優性表現型を特徴とする。

本開示は医薬組成物を記載している。医薬組成物は、上記のＣＡＲ分子、ＴＣＲ分子、修飾ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲまたはＴＣＲを含む修飾細胞、修飾細胞、核酸およびベクターの１つ以上を含む。医薬組成物は、治療（または予防）する疾患に適切な方法で投与される。適切な投与量は臨床試験により決定されるが、投与の数量や頻度は、患者の病状、患者の疾患の種類や重症度などの要因によって決定される。

「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍効果のある量」、「腫瘍抑制効果のある量」または「治療量」が指示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（被検者）の病状の個人差を考慮して、医師によって決定することができる。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９個の細胞／キログラム体重、好ましくは１０５〜１０６個の細胞／キログラム体重（それらの範囲内のすべての整数値を含める）の投与量で投与し得ることと述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用して投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。当業者は、患者の疾患徴候をモニタリングし、それに応じて治療方法を調整することにより、特定の患者に対する最適な投与量および治療レジームを容易に決定することができる。特定の実施形態では、被検者に活性化のＴ細胞を投与してから、血液を採取し（またはアフェレーシスを実施する）、活性化および増幅されたＴ細胞を収集し、これらの活性化および増幅されたＴ細胞を患者に再注入する必要がある場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施することができる。特定の実施形態では、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。特定の実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。理論に縛られることなく、このような複数回の採血／複数回の再注入の手段を採用すれば特定のＴ細胞集団を選択することができる。

本明細書に記載の医薬組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、植入または移植を含む、任意の便利な方法で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髓内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹腔内で患者に投与することができる。実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって被検者に投与される。実施形態では、本開示のＴ細胞組成物は、静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注入することができる。実施形態では、本明細書に記載された方法、または当技術分野で知られている他の方法を用いて活性化および増幅された細胞は、以下の任意数の関連する治療を組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与され、ここで、細胞がＴ細胞である場合治療レベルまで増幅する必要があり、前記任意数の関連する治療は、抗ウイルス治療用試薬のシドフォビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとも呼ばれる）による治療、ＭＳ患者のためのナタリズマブ治療、または乾癬患者のためのエファリズマブ治療、またはＰＭＬ患者のための他の治療を含むが、それらに限定されない。さらなる実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、マイコフェノレートおよびＦＫ５０６）、抗体、または他の免疫除去剤（例えば、ＣＡＭ ＰＡＴＨ）、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用することができる。これらの薬剤は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を抑制するか、または成長因子誘導信号の伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を抑制する。（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ ６６：８０７−８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ ５：７６３−７７３，１９９３；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記と同様））。実施形態では、本明細書に記載の細胞組成物は、骨髓移植、Ｔ細胞切除療法（フルダラビンなどの化学治療薬を使用）、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたは抗体（例えば、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨ）と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）被検者に投与される。実施形態では、Ｂ細胞焼灼療法の後に、本明細書に記載の細胞組成物が投与される。例えば、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）などの、ＣＤ２０と反応する試薬を患者に投与してもよい。実施形態では、被検者は、高用量化学療法による標準的な治療に続いて、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後に、被検者は、本開示の増幅された免疫細胞の注入を受ける。実施形態では、増幅された細胞は、手術の前または後に投与される。

それを必要とする被検者に投与される上記の治療の投与量は、治療される病状の正確な性質および治療レシピエントの状況によって変化する。ヒトへの投与のための投与量のスケーリングは、様々な要因に応じて、医師が当技術分野で周知される慣行に従って行うことができる。

米国特許号ＵＳ８，９０６，６８２は、工学的または修飾Ｔ細胞を用いた癌治療の方法の追加情報を提供しており、参照によりその全体が組み込まれている。

本明細書に記載の実施形態は、インビトロで修飾細胞を調製するための方法に関する。この方法は、被検者から細胞サンプルを取得することを含み得る。例えば、サンプルは、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含み得る。この方法は、少なくともＣＡＲをコードするＤＮＡで細胞サンプルをトランスフェクトすることと、ＣＡＲを発現するＴ細胞増殖を選択的に強化する培地でＣＡＲＴ細胞集団をエクスビボで培養することをさらに含み得る。

実施形態では、サンプルは、凍結保存されたサンプルである。実施形態では、細胞サンプルは、臍帯血または被検者からの末梢血サンプルから得られる。実施形態では、細胞サンプルは、アフェレシスまたは静脈穿刺によって得られる。実施形態では、細胞サンプルはＴ細胞亜集団である。

本開示の実施形態は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質からなるＤＮＡ結合ドメインと、開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメインからなるＤＮＡ開裂ドメインとを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に関する。

ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーは、いずれも標的遺伝子中の標的サブ部位に結合する認識スパイラルを有する。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、３、４、５または６本のフィンガー（ここで、フィンガーがＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６と指定され、かつＮ末端からＣ末端までＦ１からＦ３、Ｆ４、Ｆ５またはＦ６の順序で配列される）を含み、フィンガーは、表６に示される認識領域のアミノ酸配列を含む。

開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメインの例としては、野生型または工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインが含まれる。実施形態では、ＤＮＡ開裂ドメインは、野生型開裂ドメインまたは開裂ハーフドメイン（例えば、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメイン）を含み得る。実施形態では、開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメインは、工学的に設計された（非自然に存在する）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメイン、例えば、偏性ヘテロダイマーを形成する工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む。

実施形態では、遺伝子はヒト遺伝子である。実施形態では、開裂ドメインは、野生型または工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ドメインを含む。

実施形態は、上記の単離ＺＦＮをコードするポリヌクレオチドに関する。実施形態は、ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。実施形態では、ベクターは、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクターである。実施形態は、上記の単離ＺＦＮを含む単離細胞または細胞株に関する。

実施形態では、単離細胞は、幹細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。実施形態では、細胞は、ヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である。実施形態では、細胞は、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＦＯＸＰ３、ＳＩＶＡ１およびＬＧＡＬＳ９の内因性遺伝子への発現が減少した。

ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞応答の主要な負の調節因子として作用する抑制性受容体である。Ｔリンパ球受容体ＣＴＬＡ−４は、刺激性共受容体ＣＤ２８よりも高い親和性で共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）に結合し、Ｔ細胞の活性化に対して負の調節を行う。ＬＡＧ３は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現する。ＬＡＧ３は、Ｂ細胞、樹状細胞、ＴＩＬおよびＴｒｅｇの表面にも検出される。ＬＡＧ３を遮断すると、Ｔ細胞増殖および機能が有意に増加する。ＴＩＭ３は、ＣＤ４^＋ Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞傷害性１細胞（Ｔｃ１）およびＴｈ１７細胞によって構成的に発現する免疫チェックポイント受容体である。ＴＩＭ３とそのリガンドであるガレクチン−９ ＬＧＡＬＳ９との相互作用は、Ｔ細胞応答の抑制につながると考えられる。ＦＯＸＰ３は、転写調節因子のフォークヘッド／翼状螺旋ファミリーのメンバーであり、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発達および抑制機能に重要な役割を果たしている。ＳＩＶＡ１は、ＣＤ２７媒介性アポトーシスを誘導し、ＢＣＬ２Ｌ１アイソフォームＢｃｌ−ｘ（Ｌ）の抗アポトーシス活性を抑制し、ＮＦ−κＢの活性化を抑制し、Ｔ細胞受容体媒介性アポトーシスを促進する。

実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列からなる単離細胞に関するものであり、ここで、内因性遺伝子は、上記のＺＦＮの使用により不活性化される。

実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ信号伝達ドメインを含む。

実施形態では、初代ヒトＴ細胞の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）への応答と比較して、前記細胞は、生体適合性のないヒト受容体においてＧＶＨＤ応答が減少した。

実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ１７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する。

実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ７、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢ Ｔ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ−１ Ｈ／ＨＬＡ− Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ｚｅｔａｋｉｎｅ）、Ｋａｐｐａ、ＬｅｗｉｓＹ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１、ＴＲＡＩＬ−受容体１またはＶＥＧＦＲ２のうちの１つに結合する。

実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。

実施形態では、単離細胞または細胞株は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、またはＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含むＴ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、およびＳＶ４０ＬＴをコードする核酸を含む。実施形態では、ｈＴＥＲＴの発現は、誘導性発現系によって調節される。実施形態では、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子の発現は、誘導性発現系によって調節される。実施形態では、誘導性発現系は、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子もしくはｈＴＥＲＴ遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現を増加または活性化するｒＴＴＡ−ＴＲＥである。実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む。実施形態では、自殺遺伝子は、ＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子系を含む。

実施形態は、被検者の癌を治療する方法に関するものであり、前記方法は、遺伝子修飾細胞を被検者に投与することを含み、ここで、癌が肺癌、膵臓癌、肝臓癌、骨癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、卵巣癌、リンパ腫および脳癌からなる群から選択される。

実施形態は、対応する野生型細胞と比較して、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＬＲＢＡ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＩＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、Ｆｏｘｐ３、ＣＣＲ４、ＰＶＲＩＧ、ＣＤ１６Ｂ、ＳＩＶＡ１、ＣＤ３３、ＬＡＧＬＳ９、ＣＤ１２２、ＩＤＯ１、ＣＤ４５、Ｃｖｐ１ｂ１、ＴＮＦＡＩＰ８Ｌ２、ＩＤ０２、ＴＤ０２、ＤＮＭＴ３Ａおよび／または癌胎児性抗原細胞接着分子−１（Ｃｅａｃａｍ−１）（リスト１）を含む１つ以上の減少した量のペプチドを含むＴ／ＮＫ細胞に関する。実施形態では、Ｔ細胞を被検者に投与すると、Ｔ／ＮＫ細胞はＴ／ＮＫ細胞応答が強化する。

実施形態は、対応する野生型細胞と比較して、Ｒｕｎｘ３、ｌｅｘｍ、ＰＩＬＲＡ、Ｐｔｎｎｓ１Ｌ３、Ｆｃｇｒ３ａ、Ｎａｔ８、Ｃｃｌ９、Ｈｃｋ、Ｔｒｅｍ２、Ｃｃｌ６、Ｃｄ３６、Ｉｇｆ１、Ｃｔｓｓ、Ｇｚｍｃ、Ｂａｔｆ、Ｃｘｃｌ２、ＴＮＦＡＩＰ８Ｌ３、Ｉｌ１ｂ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、Ｒｇｓ１、ＰＬＳＣＲ１、ＩＴＧＢ２、Ｃ３ＡＲ１、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＬ、ｂａｔｆ、ｂａｔｆ３、Ｃｘｃｌ２、ＣＡＲＤ１１および／またはＣＤ８３（リスト２）を含む１つ以上の増加した量のペプチドを含むＴ／ＮＫ細胞である。実施形態では、Ｔ／ＮＫ細胞を被検者に投与すると、Ｔ／ＮＫ細胞はＴ細胞応答が強化する。

実施形態では、様々遺伝子編集技術または過剰発現技術（例えば、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮ）は、１つ以上の遺伝子をノックアウト／ノックダウン／過剰発現／挿入することにより、Ｔ／ＮＫ細胞機能を調節するために使用することができる。例えば、修飾細胞は、対応する野生型細胞と比較して、リスト１およびリスト２（上記を参照）におけるペプチドの生合成または輸送経路の１つ以上の遺伝子の発現が減少または増加する。

実施形態では、標的遺伝子はＲｕｎｘ３である。例えば、修飾Ｔ／ＮＫ細胞は、対応する野生型細胞と比較して、Ｒｕｎｘ３の発現が増加する。この場合、Ｒｕｎｘ３の増加した発現は、例えば、Ｔ細胞の腫瘍細胞での浸潤または長期滞留に寄与することができ、従って、Ｔ細胞の殺傷作用が増加する。

例えば、被検者におけるＴ細胞応答とは、補助、殺傷、調節および他のタイプのＴ細胞に関連する細胞媒介性免疫を指す。例えば、Ｔ細胞応答は、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助すること、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を同定して破壊することなどの活動を含み得る。被検者におけるＴ細胞応答は、Ｔ細胞が殺すウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞の数、ウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞との共培養においてＴ細胞が放出するサイトカインの量、被検者におけるＴ細胞の増殖レベル、Ｔ細胞の表現型の変化（例えば、記憶Ｔ細胞への改変）、および被検者におけるＴ細胞の寿命または寿命のレベルなどの様々な指標を介して検出することができる。

Ｔ細胞応答はまた、サイトカイン放出を含む。サイトカインの放出は、全身の炎症および疾患の合併症に関連していることが多いが、サイトカインの放出はＣＡＲ−Ｔ細胞療法の治療効果にも関連しているようである。サイトカインの放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法などにおける、養子移入された細胞の増幅および進行性免疫活性化に関連してもよい。本開示は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、特に第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの存在に応答して行われたＩＦＮ−γなどのエフェクターサイトカイン、およびＩＬ−６などの炎症促進性と抗炎症性サイトカインの放出を記載している。実施形態では、本開示は、本明細書に記載の第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが導入された被検者におけるＩＬ−６およびＩＦＮ−γの放出を記載している。実施形態では、被検者は、癌治療を必要としており、癌治療は膵臓癌治療である。実施形態では、本開示は、サイトカイン放出のレベルを測定することによって、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の治療効果を決定するか、またはその治療効果をモニタリングすることを記載している。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞を用いたＣＡＲ−Ｔ細胞療法に応答して、被検者に行われたサイトカイン（例えば、ＩＬ−６および／またはＩＦＮ−γ）の放出は、第１のＣＡＲなしで第２のＣＡＲを含むＴ細胞を用いた場合よりも多い。

以下の例示的な実施形態および実施例を参照して、本開示をさらに説明する。これらの例示的な実施形態および実施例は、例示のみを目的として提供され、特に指定されていない限り、本発明を限定することを意図しない。従って、本開示は、以下の例示的な実施形態および実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される示唆の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形を包含するように解釈されるべきである。

例示的な実施形態
例示的な実施形態は以下のとおりである。

１．第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲをコードする核酸であって、第１のＣＡＲの結合ドメインが白血球（ＷＢＣ）の細胞表面分子に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する、核酸。

２．実施形態１に記載の核酸を含む、ベクター。

３．実施形態１に記載の核酸を含む、細胞。

４．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む細胞であって、第１のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する、細胞。

５．細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態１−４のいずれか一項に記載の細胞。

６．実施形態３−５のいずれか一項に記載のＴ細胞集団を含む、組成物。

７．実施形態３−５のいずれか一項に記載の細胞を得ること、ここで、第１のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、および、
ＷＢＣ細胞の細胞表面分子または第２のＣＡＲが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養することを含む、実施形態３−５のいずれか一項に記載の細胞を培養する方法。

８．試薬がＷＢＣの細胞表面分子の細胞外ドメインである、実施形態７に記載の方法。

９．細胞を提供することと、
第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること、ここで、第１のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、および、
ＷＢＣの細胞表面分子または第２のＣＡＲが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養することを含む、インビトロでＣＡＲ細胞を調製するための方法。

１０．Ｔ細胞応答を提供するために第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を被検者に投与することを含み、ここで、第１のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、ＣＡＲのコピー数および／または放出のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ）の量によってＴ細胞応答を測定する、被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法。実施形態では、前記Ｔ細胞応答は、第１のＣＡＲなしで第２のＣＡＲを含むＴ細胞と比較して強化される。

１１．被検者におけるＴ細胞応答を強化することは、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞の増殖をインビボで選択的に強化することを含む、実施形態１０に記載の方法。

１２．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を被検者に投与することを含み、ここで、第１のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２のＣＡＲの結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、前記細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、ＣＡＲを発現する細胞をインビボで増幅する方法。

１３．ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１３、Ｂ７、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢ Ｔ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＦＳＨ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ−１ Ｈ／ＨＬＡ− Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ｚｅｔａｋｉｎｅ）、Ｋａｐｐａ、白血病、ＬｅｗｉｓＹ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１、ＴＲＡＩＬ受容体１またはＶＥＧＦＲ２である、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

１４．ＭＵＣ１がヒトＭＵＣ１の腫瘍専用エピトープであり、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが個別のポリペプチドとして発現される、実施形態１３に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

１５．ＭＵＣ１がヒトＭＵＣ１の腫瘍形態（ｔＭＵＣ１）である、実施形態１３に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

１６．ＷＢＣが顆粒球、単球またはリンパ球である、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

１７．ＷＢＣがＢ細胞である、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

１８．ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

１９．ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２０．ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９である、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２１．第１のＣＡＲが第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲが第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２２．共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組み合わせの細胞内ドメインを含む、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２３．抗原結合ドメインがＦａｂまたはｓｃＦｖである、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２４．第１のＣＡＲが、配列番号５、６、５３および５４、５５および５６、または５７および５８のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲが、配列番号５−１７、２９、３３、３７、７１または７２のアミノ酸配列、または配列番号４１、４５、６３、６７または６８のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２５．第１のＣＡＲをコードする核酸が、配列番号５９または６０の核酸配列を含み、第２のＣＡＲをコードする核酸配列が、配列番号６１の核酸配列を含む、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２６．核酸が、配列番号６２−６９の核酸配列のうちの１つを含む、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２７．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが個別のポリペプチドとして発現される、実施形態１−１２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。

２８．第１のＣＡＲの結合ドメインがＣＤ１９に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む修飾Ｔ細胞。

２９．第２のＣＡＲの結合ドメインが、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７６または８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：７７または８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７８または８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７３または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＳＥＲ（ＷＡＳ）またはＳＥＱ ＩＤ：８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７５または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

３０．第２のＣＡＲの結合ドメインが、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：７７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＳＥＲ（ＷＡＳ）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

３１．第２のＣＡＲの結合ドメインが、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

３２．第１のＣＡＲの結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：５または６のアミノ酸配列を含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

３３．第２のＣＡＲの結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：７０−７２および７９−８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

３４．第１のＣＡＲが第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲが第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態２８−３３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

３５．共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組み合わせの細胞内ドメインを含む、実施形態３４に記載の修飾Ｔ細胞。

３６．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが、個別のポリペプチドである遺伝子産物として発現される、実施形態２８−３５のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

３７．第２のＣＡＲの細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインは、第２のＣＡＲが、ＣＤ１９を発現する細胞を損傷することなく、ＣＤ１９を発現する細胞を介して修飾Ｔ細胞を活性化することができるように修飾される、実施形態２８−３５のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

３８．第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原を認識し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原を認識し、第１の抗原が第２の抗原と異なる、二重特異性ＣＡＲ。

３９．第１の抗原および第２の抗原が同じ細胞で発現しない、実施形態３８に記載の二重特異性ＣＡＲ。

４０．第１の抗原が血液成分の抗原であり、第２の抗原が固形腫瘍の抗原である、実施形態３８に記載の二重特異性ＣＡＲ。

４１．第１の抗原がＣＤ１９であり、第２の抗原が腫瘍関連ＭＵＣ１である、実施形態３８に記載の二重特異性ＣＡＲ。

４２．第１の抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：５または６のアミノ酸配列を含む、実施形態３８に記載の二重特異性ＣＡＲ。

４３．第２の抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：７０−７２および７９−８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

４４．修飾Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する細胞を介して被検者の血液中で増幅するように、Ｔ細胞応答を提供するために実施形態２８−３７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞の有効量を被検者に投与することを含む、被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法。

４５．腫瘍関連ＭＵＣ１は、腫瘍細胞で発現するが、対応する非悪性細胞で発現しない、実施形態２８−３７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

４６．第２のＣＡＲの結合ドメインが、ｏ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフ（配列番号８８）と直接相互作用する腫瘍関連ＭＵＣ１に対するｓｃＦｖを含む、実施形態２８−３７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

４７．実施形態３８−４３のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲを含む細胞。

４８．実施形態３８−４３のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲをコードする核酸。

４９．第１のＣＡＲの結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４およびＢＣＭＡからなる群から選択される抗原に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする核酸。

５０．第１のＣＡＲの結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４およびＢＣＭＡからなる群から選択される抗原に結合し、第２のＣＡＲの結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞。

５１．第１のＣＡＲの結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４およびＢＣＭＡからなる群から選択される抗原に結合し、第２のＣＡＲの結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸および第２のＣＡＲをコードする第２の核酸を含むＴ細胞。

５２．実施形態５０または５１に記載のＴ細胞集団を含む、組成物。

５３．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが、個別のポリペプチドとして発現される、実施形態５０または５１に記載のＴ細胞。

５４．核酸が、配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２０９、２１１、２１３−２１５、２１７、２１８、２２０−２２５、２２７、２２８、２３０−２３５、２３７、２３８、２４０−２４４、２４７、２４９−２５４、２５６、２５７、２５９および２６０−２６３の核酸配列のうちの１つを含む、実施形態１に記載の核酸または実施形態５０または５１に記載のＴ細胞。

５５．核酸が、配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２１５、２１７、２１８および２２０の核酸配列のうちの１つを含む、実施形態４９に記載の核酸または実施形態５０または５１に記載のＴ細胞。

５６．第１のＣＡＲが、配列番号２０３、２０７、２１６、２１９、２２６、２２９、２３６、２３９、２４５、２４８、２５５または２５８のアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲが、ＳＥＱ ＩＤ：２０２、２０５、２１０または２１２のアミノ酸配列を含む、実施形態４９に記載の核酸または実施形態５０または５１に記載の細胞。

５７．第１のＣＡＲが、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲが、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、実施形態４９に記載の核酸または実施形態５０または５１に記載の細胞。

５８．第１のＣＡＲが、配列番号２０３、２０７、２１６または２１９のアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲが、配列番号２０２または２０５のアミノ酸配列を含む、実施形態４９に記載の核酸または実施形態５０または５１に記載の細胞。

５９．実施形態４９に記載の核酸を含む、ベクター。

６０．実施形態４９に記載の核酸を含む、細胞。

６１．実施形態６０に記載の細胞集団を含む、組成物。

６２．細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態６０または６１に記載の細胞。

６３．ＣＡＲをコードする１つ以上の核酸と、１本以上のＴＣＲ鎖または生来のＴ細胞のＴＣＲとを含む、遺伝子修飾Ｔ細胞。

６４．１本以上のＴＣＲ鎖または生来Ｔ細胞のＴＣＲをコードする核酸が、標的ゲノム遺伝子座内の核酸挿入物である、実施形態６３に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞。

６５．核酸挿入物の統合が、標的ゲノム遺伝子座における遺伝子の少なくとも一部の置換を引き起こす、実施形態６３に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞。

６６．核酸がヌクレアーゼ剤を用いてＴ細胞に導入される、実施形態６３に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞。

６７．標的ゲノム遺伝子座内の一本鎖または二本鎖を切断するヌクレアーゼ剤をＴ細胞に導入することと、１本以上のＴＣＲ鎖または生来Ｔ細胞のＴＣＲをコードする核酸を含む核酸挿入物をＴ細胞に導入することと、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた核酸挿入物を含むＴ細胞を選択することと、を含む、Ｔ細胞における標的ゲノム遺伝子座を修飾する方法。

６８．核酸挿入物が５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれ、核酸挿入物の３’ホモロジーアームおよび核酸挿入物の５’ホモロジーアームが、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムフラグメントと相同性を有する、実施形態６７に記載の方法。

６９．核酸挿入物を対応するゲノムフラグメント間に統合することによって標的ゲノム遺伝子を修飾する、実施形態６７に記載の方法。

７０．ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはメガヌクレアーゼである、実施形態６７に記載の方法。

７１．ヌクレアーゼ剤が、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態６７に記載の方法。

７２．Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態７１に記載の方法。

７３．生来Ｔ細胞がγδ Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞またはＭＡＩＴ細胞を含む、実施形態６３−７２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

７４．生来Ｔ細胞がγδ Ｔ細胞を含む、実施形態６３−７２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

７５．生来Ｔ細胞がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を含む、実施形態６３−７２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

７６．１本以上のＴＣＲ鎖をコードする１つ以上の核酸が、ＴＣＲ γ鎖およびＴＣＲ δ鎖をコードする、実施形態７５に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

７７．１本以上のＴＣＲ鎖をコードする１つ以上の核酸が、内因性ＴＣＲ γ鎖および内因性ＴＣＲ δ鎖をコードする、実施形態７５に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

７８．核酸挿入物が、配列番号９９および１８５の１つ以上のアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせに対応する核酸を含む、実施形態７５に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

７９．生来Ｔ細胞がｉＮＫＴ細胞を含む、実施形態６３−７２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８０．生来Ｔ細胞のＴＣＲをコードする核酸が、ｉＮＫＴ α鎖および／またはｉＮＫＴ β鎖をコードする、実施形態７９に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８１．生来Ｔ細胞のＴＣＲをコードする核酸が、内因性ｉＮＫＴ α鎖または内因性ｉＮＫＴ β鎖をコードする、実施形態７９に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８２．生来Ｔ細胞がＭＡＩＴ細胞を含む、実施形態６３−７２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８３．生来Ｔ細胞のＴＣＲをコードする核酸が、ＭＡＩＴ α鎖および／またはＭＡＩＴ β鎖をコードする、実施形態８２に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８４．生来Ｔ細胞のＴＣＲをコードする核酸が、内因性ＭＡＩＴ α鎖または内因性ＭＡＩＴ β鎖をコードする、実施形態８２に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８５．標的ゲノム遺伝子座がαβ Ｔ細胞のαまたはβ ＴＣＲ遺伝子座である、実施形態６３−８４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８６．核酸挿入物の統合が、全体的な内因性ＴＣＲの発現が低下しないように、αβ Ｔ細胞のαまたはβ ＴＣＲ遺伝子座での配列の置換を引き起こす、実施形態６３−８４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８７．標的ゲノム遺伝子座の対応するゲノムフラグメントがＴＣＲ α鎖のアミノ酸配列を含む、実施形態６３−８４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８８．遺伝子修飾細胞が、核酸配列を含まない対応する細胞と比較して、同種異形細胞に対する減少した移植片対宿主病応答を誘発する、実施形態６３−８４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

８９．Ｔ細胞が、ヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である、実施形態６３−８４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

９０．Ｔ細胞がＣＡＲを含む、実施形態６３−８４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞または方法。

９１．遺伝子修飾細胞が、１本以上のＴＣＲ鎖を含む機能性ＴＣＲを含む、実施形態６３−９０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細胞または方法。

９２．生来Ｔ細胞のＴＣＲおよびαβ ＴＣＲがドナーに由来する、実施形態６３−９０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細胞または方法。

９３．生来Ｔ細胞が抗原認識のための非ＭＨＣ クラスＩまたはクラスＩＩ制限要件を示す、実施形態６３−９２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細胞または方法。

９４．実施形態６３−９２のいずれか一項に記載のＴ細胞の有効量を投与することを含む、被検者におけるＴ細胞応答を引き起こすか、または被検者の腫瘍を治療する方法。

９５．第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが抗原に結合する、第１のドメインおよび第２の結合ドメインを含む結合分子をコードする核酸。

９６．第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの１つ以上の標的抗原結合部位が異なり、かつ結合分子が、第１の結合ドメイン、リンカ、第２の結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインおよび／またはＣＤ３ζドメインを含むＣＡＲである、実施形態９５に記載の核酸。

９７．抗原が表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、表皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、人表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、ムチン１７（ＭＵＣ１７）、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ４である、実施形態９５に記載の核酸。

９８．第１の結合ドメインが腫瘍関連Ｍｕｃ１、ＴＳＨＲ、ＦＺＤ１０、ＰＲＬＲ、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６またはＳＩＧＬ１Ｃに結合する、実施形態９５に記載の核酸。

９９．核酸が、配列番号２６４および２６５のアミノ酸配列のうちの１つを含むポリペプチドをコードする、実施形態９５に記載の核酸。

１００．実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。

１０１．実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸または実施形態１００に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトする、宿主細胞。

１０２．実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の結合分子の発現を許容する条件下で実施形態１０１に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から結合分子を回収することと、を含む、実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる結合分子を産生する方法。

１０３．実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるか、または実施形態１０２に記載の方法に従って生成される結合分子を含む、医薬組成物。

１０４．実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる結合分子、実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸、実施形態１００に記載のベクターおよび／または実施形態１０１に記載の宿主細胞を含む、キット。

１０５．実施形態９５−９９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる結合分子を、それを必要とする被検者に投与することを含む、疾患を治療または改善するための方法。

１０６．第１の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる固形腫瘍抗原に結合する、第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子をコードする核酸。

１０７．実施形態１０６に記載の核酸を含む、ベクター。

１０８．実施形態１０６に記載の核酸を含む、細胞。

１０９．第１の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる固形腫瘍抗原に結合する、第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子を含む細胞。

１１０．実施形態１０８−１０９のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、組成物。

１１１．細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態１０８−１０９のいずれか一項に記載の細胞。

１１２．第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子を含む細胞を取得すること、ここで、第１の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる固形腫瘍抗原に結合し、および、ＷＢＣの細胞表面分子または第２の抗原結合分子が結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養すること、を含む、細胞を培養する方法。

１１３．試薬がＷＢＣの細胞表面分子の細胞外ドメインである、実施形態１１２に記載の方法。

１１４．細胞を用意することと、第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子をコードする核酸を細胞に導入すること、ここで、第１の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、および、ＷＢＣの細胞表面分子または第２の抗原結合分子が結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養すること、を含む、インビトロで細胞を調製する方法。

１１５．Ｔ細胞応答を提供するために、第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子を含むＴ細胞の有効量を被検者に投与することを含み、ここで、第１の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する、被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法。

１１６．被検者におけるＴ細胞応答を強化することは、第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子を含むＴ細胞の増殖をインビボで選択的に強化することを含む、実施形態１１５に記載の方法。

１１７．第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子を含むＴ細胞の有効量を被検者に投与することを含み、ここで、第１の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子に結合し、かつ第２の抗原結合分子の結合ドメインがＷＢＣの細胞表面分子と異なる固形腫瘍抗原に結合し、細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、抗原結合分子を発現する細胞をインビボで増幅する方法。

１１８．第１の抗原結合分子が第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、かつ第２の抗原結合分子が第２のＣＡＲである、実施形態１０６−１１７のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１１９．ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原がＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１３、Ｂ７、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢ Ｔ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＦＳＨ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ−１ Ｈ／ＨＬＡ− Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ｚｅｔａｋｉｎｅ）、Ｋａｐｐａ、白血病、ＬｅｗｉｓＹ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１、ＴＲＡＩＬ受容体１またはＶＥＧＦＲ２である、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法である。

１２０．ＭＵＣ１がヒトＭＵＣ１の腫瘍専用エピトープであり、かつ第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがポリペプチドとして発現される、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２１．ＭＵＣ１がヒトＭＵＣ１の腫瘍形態（ｔＭＵＣ１）である、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２２．ＷＢＣが顆粒球、単球またはリンパ球である、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２３．ＷＢＣがＢ細胞である、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２４．ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３、またはＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２５．ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９である、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２６．第１のＣＡＲが第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲが第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２７．共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態１１０に記載の核酸、細胞または方法。

１２８．抗原結合ドメインがＦａｂまたはｓｃＦｖである、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１２９．第１のＣＡＲが、配列番号５、６、５３および５４、５５および５６、または５７および５８のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲが、配列番号５−１７、２９、３３、３７、７１および７２のいずれかのアミノ酸配列、または配列番号４１、４５、６３、６７または６８の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３０．第１のＣＡＲをコードする核酸が、配列番号５９または６０の核酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲをコードする核酸が、配列番号６１の核酸配列を含む、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３１．核酸が、配列番号６２−６９の核酸配列のうちの１つを含む、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３２．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが、個別のポリペプチドである遺伝子産物として発現される、実施形態１１８に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３３．第１の抗原結合分子がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、かつ第２の抗原結合分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、実施形態１０６−１３２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３４．ＴＣＲが修飾ＴＣＲである、実施形態１３３に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３５．ＴＣＲが患者において自然に発生する腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する、実施形態１３３に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３６．ＴＣＲが腫瘍抗原に結合する、実施形態１３３に記載の核酸、細胞または方法。

１３７．腫瘍抗原がＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１を含み、もしくはＴＣＲがＴＣＲγとＴＣＲδ鎖またはＴＣＲαとＴＣＲβ鎖、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１３３に記載の核酸、ベクター、細胞または方法。

１３８．第１のＣＡＲの結合ドメインがＣＤ１９に結合し、かつ第２のＣＡＲの結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む修飾Ｔ細胞。

１３９．第２のＣＡＲの結合ドメインが、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７６または８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：７７または８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７８または８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７３または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＳＥＲ（ＷＡＳ）またはＳＥＱ ＩＤ：８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７５または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む、実施形態１３８に記載の修飾Ｔ細胞。

１４０．第２のＣＡＲの結合ドメインが、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：７７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：７３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＳＥＲ（ＷＡＳ）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

１４１．第２のＣＡＲの結合ドメインが、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ：８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ：８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、ＳＥＱ ＩＤ：８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、ＳＥＱ ＩＤ：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域３と、を含む、実施形態１３８に記載の修飾Ｔ細胞。

１４２．第１のＣＡＲの結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：５または６のアミノ酸配列を含む、実施形態１３８に記載の修飾Ｔ細胞。

１４３．第２のＣＡＲの結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：７０−７２および７９−８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

１４４．第１のＣＡＲが第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲが第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１３８−１４３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

１４５．共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態１４４に記載の修飾Ｔ細胞。

１４６．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが、個別のポリペプチドである遺伝子産物として発現される、実施形態１３８−１４５のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

１４７．第２のＣＡＲの細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインは、第２のＣＡＲが、ＣＤ１９を発現する細胞を損傷することなく、ＣＤ１９を発現する細胞を介して修飾Ｔ細胞を活性化することができるように修飾される、実施形態１３８−１４６のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

１４８．第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原を認識し、かつ第２の抗原結合ドメインが第２の抗原を認識し、第１の抗原が第２の抗原と異なる、二重特異性キメラ抗原受容体。

１４９．第１の抗原および第２の抗原が同じ細胞で発現しない、実施形態１４８に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１５０．第１の抗原が血液成分の抗原であり、かつ第２の抗原が固形腫瘍の抗原である、実施形態１４８または１４９に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１５１．第１の抗原がＣＤ１９であり、かつ第２の抗原が腫瘍関連ＭＵＣ１である、実施形態１４８−１５０のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１５２．第１の抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：５および６のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１４８−１５１のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１５３．第２の抗原結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ：７０−７２および７９−８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１３８−１４７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

１５４．ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する細胞を介して被検者の血液中で増幅するように、Ｔ細胞応答を提供するために実施形態１３８−１４７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞の有効量を被検者に投与することを含む、被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法。

１５５．腫瘍関連ＭＵＣ１は、腫瘍細胞で発現するが、対応する非悪性細胞で発現しない、実施形態１３８−１４７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

１５６．腫瘍関連ＭＵＣ１に対するｓｃＦｖが、ｏ−グリコシル化のＧＳＴＡモチーフ（配列番号８８）と直接相互作用する、実施形態１３８−１４７のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞。

１５７．実施形態１４８−１５２のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲを含む、細胞。

１５８．実施形態１４８−１５２のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲをコードする、核酸。

１５９．第１のＣＡＲの抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４およびＢＣＭＡからなる群から選択される抗原に結合し、かつ第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが腫瘍関連ＭＵＣ１に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞。

１６０．第１のＣＡＲが、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲが、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、実施形態１５９に記載のＴ細胞。

１６１．第１のＣＡＲが、配列番号２０３、２０７、２１６または２１９のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＣＡＲは、ＳＥＱ ＩＤ：２０２または２０５のアミノ酸配列を含む、実施形態１５９に記載のＴ細胞。

１６２．第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、実施形態１８１に記載の修飾細胞または方法。

１６３．第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。

１６４．単離Ｔ細胞が、配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２１５、２１７、２１８および２２０の核酸配列のうちの１つを含む、実施形態１５９に記載のＴ細胞。

１６５．第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのそれぞれが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、実施形態１５９−１６４のいずれか一項に記載のＴ細胞。

１６６．細胞質ドメインが共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１６５に記載のＴ細胞。

１６７．共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組み合わせの細胞内ドメインを含む、実施形態１６６に記載のＴ細胞。

１６８．Ｔ細胞が、プログラム死の受容体１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アッテネーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）またはＣＤ １６０、の優性ネガティブ変異体を含む、実施形態１５９に記載のＴ細胞。

１６９．Ｔ細胞が、対応する野生型Ｔ細胞と比較して、減少した量のＴＣＲを含む、実施形態１５９に記載のＴ細胞。

１７０．実施形態１５９−１６９のいずれか一項に記載のＴ細胞集団を含む、組成物。

１７１．実施形態１５９−１６９のいずれか一項に記載のＴ細胞の有効量を投与することを含む、被検者におけるＴ細胞応答を強化するか、または被検者の腫瘍を治療する方法。

１７２．腫瘍抗原が固形腫瘍抗原である、実施形態１−１７１のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞（Ｔ細胞および修飾Ｔ細胞を含む）、二重特異性ＣＡＲ、組成物または方法。

１７３．固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ １、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ １７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３−Ｒα２、メソセリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ−ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ−α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲであり、かつＢ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態１−１７２のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、細胞（Ｔ細胞および修飾Ｔ細胞を含む）、二重特異性ＣＡＲ、組成物または方法。

１７４．複数の核酸をＴ細胞に提供すること、ここで、前記複数の核酸が固形腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、かつＢ細胞抗原に結合するＣＡＲをコードし、および、Ｔ細胞の有効量を被検者に投与すること、を含む、癌を有する被検者にけるＴ細胞の増幅および／またはサイトカイン放出（例えば、ＩＬ−６およびＩＮＦ−γ）を強化するための方法。

１７５．複数の核酸をＴ細胞に提供すること、ここで、前記複数の核酸が、固形腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲ、および機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠く修飾ＰＤ−１をコードし、および、Ｔ細胞の有効量を被検者に投与すること、を含む、癌を有する被検者におけるＴ細胞応答および／またはサイトカイン放出（例えば、ＩＬ−６およびＩＮＦ−γ）を強化するための方法。

１７６．複数の核酸を含み、前記複数の核酸が、被検者の腫瘍関連固形腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲ、および機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠く修飾ＰＤ−１をコードする、修飾細胞。

１７７．Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲだけでなく、修飾ＰＤ−１Ｄも有さないＣＡＲ−Ｔ細胞の有効量が投与された被検者と比較して、前記被検者が、より高いレベルのＴ細胞増幅およびより高い量の記憶Ｔ細胞を有する、実施形態１７５または１７６に記載の修飾細胞または方法。

１７８．修飾ＰＤ−１Ｄが、配列番号８９−９５のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１７５または１７６に記載の修飾細胞または方法。

１７９．固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ １、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ １７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３−Ｒα２、メソセリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ−ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ−α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲであり、かつＢ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態１７４−１７８のいずれか一項に記載の修飾細胞または方法

１８０．Ｂ細胞抗原がＣＤ１９を含む、実施形態１７４−１７８のいずれか一項に記載の修飾細胞または方法。

１８１．固形腫瘍抗原が腫瘍関連ＭＵＣ１を含む、実施形態１８０に記載の修飾細胞または方法。

１８２．Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲの結合ドメインが、配列番号５または６のアミノ酸配列を含み、かつ固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲの結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、実施形態１８１に記載の修飾細胞または方法。

１８３．Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲが、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み、かつ固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲが、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、実施形態４９に記載の核酸または実施形態５０または５１に記載の細胞。

１８４．Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインを含み、かつ固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、実施形態１８１に記載の修飾細胞または方法。

１８５．ＣＡＲの細胞質ドメインが、共刺激ドメインまたはＣＤ３ζドメインまたはそれらの組み合わせを含む、実施形態１８４に記載の修飾細胞または方法。

１８６．Ｔ細胞の増幅が、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲの非存在下で固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲを有するＴ細胞を投与することによって得られるＴ細胞の増幅よりも大きい、実施形態１８０に記載の修飾細胞または方法。

１８７．Ｔ細胞増幅が、Ｔ細胞のゲノムＤＮＡにおけるＣＡＲ分子のコピー数の増加に基づいて測定される、実施形態１８６に記載の修飾細胞または方法。

１８８．核酸の少なくとも１つが、配列番号２０１の核酸配列を含む、実施形態１８０に記載の修飾細胞または方法。

１８９．Ｂ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡを含む、実施形態１７８に記載の修飾細胞または方法。

１９０．固形腫瘍抗原がＢ７、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢ Ｔ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＦＳＨ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ−１ Ｈ／ＨＬＡ− Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ｚｅｔａｋｉｎｅ）、Ｋａｐｐａ、白血病、ＬｅｗｉｓＹ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１、ＴＲＡＩＬ−受容体１またはＶＥＧＦＲ２を含む、実施形態１８８に記載の修飾細胞または方法。

１９１．Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲが、配列番号２０３、２０７、２１６または２１９のアミノ酸配列を含む、実施形態１７８に記載の修飾細胞または方法。

１９２．固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲが、配列番号２０２または２０５のアミノ酸配列を含む、実施形態１７８に記載の修飾細胞または方法。

１９３．核酸の少なくとも１つが、配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２１５、２１７、２１８または２２０の核酸配列を含む、実施形態１７８に記載の修飾細胞または方法。

１９４．Ｔ細胞を含む組成物の有効量を被検者に投与することと、ここで、前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および修飾ＰＤ−１を含み、前記修飾ＰＤ−１が機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠き、被検者におけるＴ細胞応答をモニタリングすることと、ここで、免疫細胞亜集団がナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞、幹細胞記憶Ｔ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞を含み、かつ、修飾ＰＤ−１を含まない対応するＴ細胞と比較して、被検者における免疫細胞亜集団の数または比率が増加し、または、被検者における免疫細胞亜集団の持続性が、修飾ＰＤ−１を含まない対応するＴ細胞と比較して、向上または延長しているかどうかをモニタリングすること、を含む、癌を有する被検者において、免疫細胞亜集団の数または比率を増加させるための、および／または免疫細胞亜集団の持続性を向上または延長させるための方法。

１９５．被検者におけるＴ細胞応答をモニタリングすることは、修飾ＰＤ−１のｍＲＮＡを検出すること、１つ以上の白血球の数を検出すること、ナイーブＴ細胞、幹細胞記憶Ｔ細胞および中央記憶Ｔ細胞の少なくとも１つの数を検出すること、ＣＡＲコピー数を検出すること、ＣＤ３陽性細胞数を検出すること、ＣＡＲを発現するＴ細胞の数を検出すること、１つ以上のサイトカインのレベルを検出すること、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１９４に記載の方法。

１９６．ＣＡＲが導入されるが修飾ＰＤ−１を含まないＴ細胞と比較して、前記Ｔ細胞が被検者においてより多くの記憶Ｔ細胞を有する、請求項１９４に記載の方法。

１９７．修飾ＰＤ−１がＳＥＱ ＩＤ：８９−９３の配列の１つを含み、または修飾ＰＤ−１がＳＥＱ ＩＤ：９４または９５を含まない、請求項１９４に記載の方法。

１９８．Ｔ細胞がＰＤ−１の優性ネガティブ変異体を含み、かつＴ細胞のＰＤ−１の内因性遺伝子が破壊されない、請求項１９４に記載の方法。

１９９．ＣＡＲが細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインが抗原に結合する、請求項１９４に記載の方法。

２００．細胞内ドメインが共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項１９９に記載の方法。

２０１．抗原が、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、表皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、人表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ４である、請求項１９９に記載の方法。

２０２．Ｔ細胞が、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲおよび白血球抗原に結合するＣＡＲを含む、請求項１９４に記載の方法。

２０３．固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ １、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ １７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３−Ｒα２、メソセリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ−ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ−α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲであり、かつＢ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、請求項２０２に記載の方法。

２０４．白血球抗原がＢ細胞抗原である、請求項２０２に記載の方法。

２０５．Ｂ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、請求項２０２に記載の方法。

２０６．Ｔ細胞に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を提供することと、Ｔ細胞に、修飾ＰＤ−１をコードする核酸配列、機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠く修飾ＰＤ−１、及び、ナイーブＴ細胞と幹細胞記憶Ｔ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞を含む免疫細胞亜集団を提供することと、ここで、修飾ＰＤ−１を含まない対応するＴ細胞と比較して、免疫細胞亜集団の数または比率が増加し、または、免疫細胞亜集団の持続性が、修飾ＰＤ−１を含まない対応するＴ細胞と比較して、向上または延長しているかどうかをモニタリングすることと、を含む、免疫細胞亜集団の数または比率を増加させるための、および／または免疫細胞亜集団の持続性を向上または延長させるための方法。

２０７．ＣＴＬＡ４遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＣＴＬＡ４遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０１、３０２および３０３のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０５、３０６および３０７のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２０８．ＣＴＬＡ４遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号３０４のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２０９．ＬＡＧ３遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＬＡＧ３遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０８、３０９および３１０のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０９、３０８および３１２のアミノ酸配列からなり、または第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３１３、３１４および３１５のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３１６、３１７および３１８のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２１０．ＬＡＧ３遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号３１１または３１９のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２１１．ＢＴＬＡ遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＢＴＬＡ遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３２０、３２１および３２２のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３２３、３２４および３２５のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２１２．ＢＴＬＡ遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号３２６のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２１３．ＴＩＭ３遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＴＩＭ３遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３２７、３２８および３２９のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３３０、３３１および３３２のアミノ酸配列からなり、または第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３３４、３３５および３３６のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３３７、３３８および３３９のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２１４．ＴＩＭ３遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号３３３または３４０のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２１５．ＦＯＸＰ３遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＦＯＸＰ３遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３４１、３２８および３４２のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３４３、３４４および３４５のアミノ酸配列からなり、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３４７、３４８および３４９のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３５０、３４４および３５１のアミノ酸配列からなり、または第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号２８８、３１０および３１４のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０８、３０８および２８４のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２１６．ＦＯＸＰ３遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号３４６、３５２または２８３のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２１７．ＳＩＶＡ１遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＳＩＶＡ１遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３５３、３３１および３５４のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３５５、３００および２９９のアミノ酸配列からなり、または第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０８、３１４および３１２のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号２８８、２８７および２８６のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）

２１８．ＳＩＶＡ１遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号２９６または２８５のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２１９．ＬＧＡＬＳ９遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＬＧＡＬＳ９遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号２９８、３２４および２９７のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号２９５、３００および２９４のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２２０．ＣＤ３３遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号２９３のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２２１．ＣＤ３３遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＣＤ３３遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが第１のＺＦＰのＮ末端から第１のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号３０１、２９２および３１２のアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが第２のＺＦＰのＮ末端から第２のＺＦＰのＣ末端までの順序で配列された配列番号２９１、２９０および３１０のアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２２２．ＬＧＡＬＳ９遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が配列番号２８９のヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２２３．遺伝子がヒト遺伝子である、実施形態２０７−２２２のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮ。

２２４．開裂ドメインが野生型または工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ドメインを含む、実施形態２０７−２２２のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮ。

２２５．実施形態２０７−２２２のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮをコードする、ポリヌクレオチド。

２２６．実施形態２２５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

２２７．ベクターがアデノウイルスまたはレンチウイルスベクターである、実施形態２２６に記載のベクター。

２２８．実施形態２０７−２２２のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮを含む、単離細胞または細胞株。

２２９．単離細胞が幹細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態２２８に記載の単離細胞または細胞株。

２３０．細胞が、ヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である、実施形態２２８に記載の単離細胞または細胞株。

２３１．細胞が、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＦＯＸＰ３、ＳＩＶＡ１およびＬＧＡＬＳ９の内因性遺伝子への発現が減少した、実施形態２２８に記載の単離細胞または細胞株。

２３２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含み、ここで、内因性遺伝子が、実施形態２０７−２２２のいずれか一項に記載のＺＦＮの使用により不活性化される、単離細胞。

２３３．ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ信号伝達ドメインを含む、実施形態２３２に記載の単離細胞または細胞株。

２３４．前記細胞は、初代ヒトＴ細胞の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）への応答と比較して、生体適合性のないヒト受容体においてＧＶＨＤ応答が減少した、実施形態２３３に記載の単離細胞または細胞株。

２３５．ＣＡＲの抗原結合ドメインがＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ１７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する、実施形態２３２に記載の単離細胞または細胞株。

２３６．ＣＡＲの共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態２３２に記載の単離細胞または細胞株。

２３７．単離細胞または細胞株が、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、またはＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含むＴ細胞である、実施形態２２８に記載の単離細胞または細胞株。

２３８．Ｔ細胞が、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、およびＳＶ４０ＬＴをコードする核酸を含む、実施形態２３７に記載の単離細胞または細胞株。

２３９．ｈＴＥＲＴの発現が、誘導性発現系によって調節される、実施形態２３７に記載の単離細胞または細胞株。

２４０．ＳＶ４０ＬＴ遺伝子の発現が、誘導性発現系によって調節される、実施形態２３７に記載の単離細胞または細胞株。

２４１．誘導性発現系が、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子もしくはｈＴＥＲＴ遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現を増加または活性化する、ｒＴＴＡ−ＴＲＥである、実施形態２４０に記載の単離細胞または細胞株。

２４２．Ｔ細胞が自殺遺伝子をコードする核酸配列を含み、および／または自殺遺伝子がＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子系を含む、実施形態２３７に記載の単離細胞または細胞株。

２４３．実施形態２３２に記載の遺伝子修飾細胞を被検者に投与することを含み、ここで、癌が肺癌、膵臓癌、肝臓癌、骨癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、卵巣癌、リンパ腫および脳癌からなる群から選択される、被検者の癌を治療する方法。

２４４．Ｂ２Ｍ遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、Ｂ２Ｍ遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰが表８に示されるアミノ酸配列からなり、かつ第２のＺＦＰが表８に示されるアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２４５．Ｂ２Ｍ遺伝子における標的部位に結合し、前記標的部位が表８に示されるヌクレオチド配列を含む、単離ＺＦＮ。

２４６．ＣＩＩＴＡ遺伝子における第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ここで、前記第１のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、ＣＩＩＴＡ遺伝子における第２の標的部位に結合する第２のＺＦＰと、ここで、前記第２のＺＦＰが３つ以上のジンクフィンガードメインからなり、開裂ドメインとを含み、ここで、第１のＺＦＰおよび第２のＺＦＰが表８に示されるアミノ酸配列からなる、単離ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

２４７．遺伝子がヒト遺伝子である、実施形態２４４−２４６のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮ。

２４８．開裂ドメインが野生型または工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ドメインを含む、実施形態２４４−２４６のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮ。

２４９．実施形態２４４−２４８のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮをコードする、ポリヌクレオチド。

２５０．実施形態２４９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

２５１．ベクターがアデノウイルスまたはレンチウイルスベクターである、実施形態２５０に記載のベクター。

２５２．実施形態２４４−２４８のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮを含む、単離細胞または細胞株。

２５３．単離細胞が幹細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態２５２に記載の単離細胞または細胞株。

２５４．細胞が、ヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である、実施形態２５３に記載の単離細胞または細胞株。

２５５．細胞はＢ２ＭまたはＣＩＩＴＡの内因性遺伝子への発現が減少した、実施形態２５４に記載の単離細胞または細胞株。

２５６．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含み、ここで、ＣＡＲの内因性遺伝子が、実施形態２４４−２５６のいずれか一項に記載のＺＦＮの使用により不活性化される、単離細胞。

２５７．ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ信号伝達ドメインを含む、実施形態２５６に記載の単離細胞または細胞株。

２５８．前記細胞は、初代ヒトＴ細胞の宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）への応答と比較して、生体適合性のないヒト受容体においてＨＶＧＤ応答が減少した、実施形態２５７に記載の単離細胞または細胞株。

２５９．ＣＡＲの抗原結合ドメインがＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ１７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する、実施形態２５８に記載の単離細胞または細胞株。

２６０．ＣＡＲの共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態２５８に記載の単離細胞または細胞株。

２６１．単離細胞または細胞株が、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、またはＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含むＴ細胞である、実施形態２６０に記載の単離細胞または細胞株。

２６２．Ｔ細胞が、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、およびＳＶ４０ＬＴをコードする核酸を含む、実施形態２６１に記載の単離細胞または細胞株。

２６３．ｈＴＥＲＴの発現が、誘導性発現系によって調節される、実施形態２６２に記載の単離細胞または細胞株。

２６４．ＳＶ４０ＬＴ遺伝子の発現が、誘導性発現系によって調節される、実施形態２６２に記載の単離細胞または細胞株。

２６５．誘導性発現系が、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子もしくはｈＴＥＲＴ遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現を増加または活性化する、ｒＴＴＡ−ＴＲＥである、実施形態２６４に記載の単離細胞または細胞株。

２６６．Ｔ細胞が自殺遺伝子をコードする核酸配列を含み、および／または自殺遺伝子がＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子系を含む、実施形態２６２に記載の単離細胞または細胞株。

２６７．実施形態２５に記載の遺伝子修飾細胞を被検者に投与することを含み、ここで、癌が肺癌、膵臓癌、肝臓癌、骨癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、卵巣癌、リンパ腫および脳癌からなる群から選択される、被検者の癌を治療する方法。

２６８．対応する野生型細胞と比較して減少した量の主要組織適合性複合体ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）を含み、ここで、修飾細胞は、対応する野生型細胞と比較して免疫原性が低下している、修飾細胞。

２６９．培地で修飾細胞を培養することを含み、前記修飾細胞が、対応する野生型細胞と比較して減少した量の主要組織適合性複合体ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）を有し、ここで、修飾細胞は、対応する野生型細胞と比較して免疫原性が低下している、移植用の修飾細胞を生成する方法。

２７０．治療上有効な量の修飾細胞を被検者に投与することを含み、前記修飾細胞が、対応する野生型細胞と比較して減少した量の主要組織適合性複合体ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）を有し、ここで、修飾細胞は、対応する野生型細胞と比較して免疫原性が低下している、病状を治療するための方法。

２７１．修飾細胞は、対応する野生型細胞と比較して、ＭＨＣ ＩＩの生合成経路または輸送経路の１つ以上の遺伝子の発現が低下している、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７２．修飾細胞が、修飾細胞上において、対応する野生型細胞と比較して、減少した量のＭＨＣ ＩＩを蓄積する、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７３．修飾細胞が、ＭＨＣ ＩＩの生合成経路または輸送経路に関連する内因性遺伝子破壊機能を有する、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７４．破壊がＭＨＣ クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の破壊を含む、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７５．破壊がＣＩＩＴＡの少なくとも一部の欠失に起因する、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７６．ＭＨＣ ＩＩがヒト白血球抗原ＩＩ（ＨＬＡ ＩＩ）を含む、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７７．免疫原性の低下が、対応する野生型細胞と比較して、修飾細胞によって誘導される炎症反応レベルの低下を含む、実施形態２６８−２７０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２７８．対応する野生型細胞と比較して減少した量の主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）を含み、ここで、修飾細胞は、対応する野生型細胞と比較して免疫原性が低下している、修飾細胞。

２７９．修飾細胞が、ＭＨＣ Ｉの生合成経路または輸送経路に関連する内因性遺伝子破壊機能を有する、実施形態２７８に記載の修飾細胞。

２８０．破壊が、抗原提示１（ＴＡＰ１）遺伝子に関連するトランスポーターの１つ以上のエクソンの破壊、またはＴＡＰ関連糖タンパク質（ＴＡＰＢＰ）遺伝子の１つ以上のエクソンの破壊を含む、実施形態２７９に記載の修飾細胞。

２８１．ＴＡＰ１遺伝子の１つ以上のエクソンの破壊が、ＴＡＰ１遺伝子の１つのエクソンの破壊を含む、実施形態２８０に記載の修飾細胞。

２８２．ＴＡＰＢＰ遺伝子の破壊がＴＡＰ１遺伝子のヘテロ接合破壊を含み、かつ修飾細胞が野生型ＴＡＰＢＰ遺伝子を発現する、実施形態２８０に記載の修飾細胞。

２８３．ＴＡＰＢＰ遺伝子の１つ以上のエクソンの破壊がＴＡＰＢＰ遺伝子の１つのエクソンの破壊を含む、実施形態２８０に記載の修飾細胞。

２８４．免疫原性の低下が、対応する野生型細胞と比較して、修飾細胞によって誘導される炎症反応レベルの低下を含む、実施形態２８０に記載の修飾細胞。

２８５．修飾細胞の核型が対応する野生型細胞の核型と同じである、実施形態２８０に記載の修飾細胞。

２８６．修飾細胞の多能性レベルが対応する野生型細胞の多能性レベルと基本的に同じである、実施形態２８０に記載の修飾細胞。

２８７．細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、実施形態２６８−２８６のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２８８．修飾細胞がＣＡＲを含む、実施形態２６８−２８６のいずれか一項に記載の修飾細胞。

２８９．ＣＡＲが細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、かつ細胞外ドメインが腫瘍抗原に結合する、請求項２８８に記載の修飾細胞。

２９０．腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κまたは軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α ２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２ ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１またはＴＥＭ８を含む、実施形態２８９に記載の修飾細胞。

２９１．細胞内ドメインが共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態２８９に記載の修飾細胞。

２９２．細胞内ドメインがＣＤ３ζ信号伝達ドメインを含む、実施形態２８９に記載の修飾細胞。

２９３．実施形態２４６に記載の修飾細胞を培地で培養すること、および修飾細胞を含む組成物を被検者に投与することを含み、ここで、注入に応答した被検者の免疫応答が野生型細胞を使用した注入よりも少ない、細胞または細胞に由来する細胞の注入を改善するための方法。

２９４．注入が同種異形注入である、実施形態２９３に記載の方法。

２９５．ＣＡＲをコードする核酸配列と、ＴＣＲ遺伝子の破壊と、ＭＨＣ クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子の破壊と、抗原提示１（ＴＡＰ１）遺伝子に関連するトランスポーターの破壊またはＴＡＰ関連糖タンパク質（ＴＡＰＢＰ）遺伝子の破壊と、ここで、修飾ヒトＴ細胞が、破壊のないヒトＴ細胞と比較して、減少した量のＴＣＲ、減少した量のＭＨＣ Ｉまたは減少した量のＭＨＣ ＩＩを有し、または初代ヒトＴ細胞の宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）への応答と比較して、生体適合性のないヒト受容体におけるＨＶＧＤ応答の低下と、を含む、修飾ヒトＴ細胞。

２９６．ＣＡＲが細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、かつ細胞外ドメインが腫瘍抗原に結合する、実施形態２９５に記載の修飾細胞。

２９７．腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κまたは軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α ２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２ ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１またはＴＥＭ８を含む、実施形態２９６に記載の修飾細胞。

２９８．細胞内ドメインが共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態２９６に記載の修飾細胞。

２９９．細胞内ドメインがＣＤ３ζ信号伝達ドメインを含む、実施形態２９６に記載の修飾細胞。

３００．標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖または二本鎖を切断するヌクレアーゼ剤をリンパ球に導入することと、内因性Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１および／またはＴＡＰＢＰ遺伝子が破壊されているリンパ球を選択することと、を含む、リンパ球における標的ゲノム遺伝子座を修飾する方法。

３０１．内因性Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１および／またはＴＡＰＢＰ遺伝子を標的とするヌクレアーゼ剤を含む、遺伝子修飾リンパ球。

３０２．ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはメガヌクレアーゼである、実施形態３００−３０１のいずれか一項に記載の方法または遺伝子修飾リンパ球。

３０３．ヌクレアーゼ剤が、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態３００−３０１のいずれか一項に記載の方法または遺伝子修飾リンパ球。

３０４．Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態３０３に記載の方法。

３０５．ヌクレアーゼ剤が表９−１０に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、実施形態３００−３０１のいずれか一項に記載の方法または遺伝子修飾リンパ球。

３０６．ヌクレアーゼ剤が、抗原提示１（ＴＡＰ１）遺伝子に関連するトランスポーターの１つ以上のエクソンまたはＴＡＰ関連糖タンパク質（ＴＡＰＢＰ）遺伝子の１つ以上のエクソンの破壊、またはＴＡＰ１遺伝子の１つのエクソンを標的とする１つ以上のＺＦＮと、または実施形態１−４のいずれか一項に記載の単離ＺＦＮと、を含む、実施形態３００−３０１のいずれか一項に記載の方法または遺伝子修飾リンパ球。

３０７．リンパ球がＮＫ細胞またはＴ細胞である、実施形態３００−３０６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３０８．遺伝子修飾細胞が、核酸配列を含まない対応する細胞と比較して、同種異形細胞に対する減少した移植片対宿主病応答を誘発する、実施形態３００−３０６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３０９．リンパ球が、ヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である、実施形態３００−３０６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１０．Ｔ細胞がＣＡＲを含む、実施形態３００−３０６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１１．ＣＡＲが細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、かつ細胞外ドメインが腫瘍抗原に結合する、実施形態３１０に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１２．腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κまたは軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α ２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２ ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１またはＴＥＭ８を含む、実施形態３１１に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１３．細胞内ドメインが共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、実施形態３１１に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１４．細胞内ドメインがＣＤ３ζ信号伝達ドメインを含む、実施形態３１１に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１５．Ｔ細胞が修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、実施形態３００−３０６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１６．ＴＣＲが患者において自然に発生する腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する、実施形態３１５に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１７．ＴＣＲが腫瘍抗原に結合する、実施形態３１５に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１８．腫瘍抗原がＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１を含む、実施形態３１７に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３１９．ＴＣＲが、ＴＣＲγとＴＣＲδ鎖またはＴＣＲαとＴＣＲβ鎖、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３１７に記載の遺伝子修飾リンパ球または方法。

３２０．実施形態３０１−３１９のいずれか一項に記載のＴ細胞の有効量を投与することを含む、被検者におけるＴ細胞応答を引き起こすか、または被検者の腫瘍を治療する方法。

３２１．実施形態１−６、１４−４３、４５および４６のいずれか一項に記載の核酸、細胞、組成物、修飾Ｔ細胞または二重特異性ＣＡＲを、それらを必要とする被検者に投与することと、ＣＡＲ−Ｔ細胞を被検者に導入した後の一定時間内においてサイトカイン放出のレベルを測定することと、を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の治療効果を決定する方法。

３２２．実施形態１−６および１４−２７のいずれか一項に記載の核酸、細胞または組成物を、それらを必要とする被検者に投与することと、ＣＡＲ−Ｔ細胞を被検者に導入した後の一定時間内においてサイトカイン放出のレベルを測定することと、を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の治療効果をモニタリングする方法。

３２３．前記方法が、サイトカイン放出のレベルを対照被検者と比較することをさらに含み、ここで対照被検者は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を導入していない被検者、または単一のＣＡＲ分子（例えば、抗固形腫瘍ＣＡＲ）を含むＴ細胞を投与している被検者を含む、実施形態３２１または３２２に記載の方法。

３２４．サイトカインがＩＬ−６、ＩＦＮ−γまたはそれらの組み合わせである、実施形態３２１−３２３のいずれか一項に記載の方法。

３２５．前記方法が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を導入する０日目（ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を導入する１日前）から１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目、または１日目までのサイトカイン放出を測定することを含む、実施形態３２１−３２４のいずれか一項に記載の方法。

３２６．被検者が甲状腺癌、胆管癌、乳癌または膵臓癌を有する、実施形態３２１−３２５のいずれか一項に記載の方法。

３２７．被検者が哺乳動物である、実施形態３２１−３２６のいずれか一項に記載の方法。

３２８．哺乳動物がヒトである、実施形態３２１−３２７のいずれか一項に記載の方法。

実施例１．Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現
図１に示すように、ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲ：配列番号２０７およびｓｃＦｖ：配列番号６）および腫瘍関連ＭＵＣ１ ＣＡＲ（ＣＡＲ：配列番号２０２およびｓｃＦｖ：配列番号７０）をコードするレンチウイルスベクター（「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ１３７ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９年８月，第１７巻第８号，１４５３-１４６４を参照し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる」）を生成した。

患者から初代Ｔ細胞を得た。得られた初代Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで導入し、修飾Ｔ細胞を得た。フローサイトメトリーを実施し、分析し、初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を決定した（図６を参照）。細胞培養、レンチウイルスベクターの構築およびフローサイトメトリーに関連する技術は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ」， ＰＮＡＳ ２００９年３月３日，第１０６巻第９号，３３６０−３３６５に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例２．共培養測定におけるＩＦＮ−γ放出
Ｔ細胞を、デュアルＣＡＲ（ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＴＡ−ＭＵＣ１ ＣＡＲ、図８および図９のデュアルＣＡＲを参照）をコードするレンチウイルスベクターおよびシングルＣＡＲ（ＴＡ−ＭＵＣ１ ＣＡＲ、図８および図９の５Ｅ５ ＣＡＲを参照）をコードするレンチウイルスベクターでそれぞれトランスフェクションした。２種類のＴ細胞および異なる単一型または複数型の基底細胞（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｅｌｌ）を共培養し、ＩＦＮ−γの放出を観察した。基底細胞は、ＭＵＣ１陽性腫瘍細胞（ＭＣＦ−７）、ＭＵＣ１陰性腫瘍細胞（２３１）およびＣＤ１９陽性腫瘍細胞（ＲＫ１９）を含む。Ｅ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）の比率が１：１／３：１／１０：１／３０：１（すなわち、ＣＡＲ−Ｔ細胞：標的腫瘍細胞）であるＣＡＲ−Ｔ細胞と標的腫瘍を２４時間共培養した。その後、上清を回収し、ＩＦＮ−γの放出を測定した。ＣＡＲ−Ｔ細胞および基底細胞を共培養したとき、様々なレベルのＩＦＮ−γ放出が観察された（図７を参照）。図８および図９にさらに示すように、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞およびＭＵＣ１陽性腫瘍細胞との共培養に応答して、ＩＦＮ−γを放出し、一方、シングルＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞との共培養に応答して、少量のＩＦＮ−γを放出した。さらに、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞およびＭＵＣ１陽性腫瘍細胞との共培養に応答して、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、シングルＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してより多くのＩＦＮ−γを放出した。細胞培養、細胞傷害性Ｔリンパ球測定の構築に関連する技術は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ」，ＰＮＡＳ ２００９年３月３日、第１０６巻第９号、３３６０−３３６５に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例３．初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ／抗原の発現
患者から初代Ｔ細胞を得た。得られた初代Ｔ細胞を２つのグループに分けた。グループ１の初代Ｔ細胞は、抗ＴＳＨＲ ＣＡＲをコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ：８）を含むレンチウイルスベクターで形質導入した。グループ２の初代Ｔ細胞は、ＴＳＨＲをコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ：２０）を含むレンチウイルスベクターで形質導入した。フローサイトメトリーを実施し、分析して、それぞれ初代Ｔ細胞におけるＣＡＲおよびＴＳＨＲの発現を決定した（図８および図９）。細胞培養、レンチウイルスベクターの構築およびフローサイトメトリーに関連する技術は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ， ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ」，ＰＮＡＳ ２００９年３月３日， 第１０６巻第９号，３３６０−３３６５に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例４．インビボサイトカイン放出の測定
グループ１およびグループ２の初代Ｔ細胞をマウスに注入した（実験グループ）。対照として、グループ１の初代Ｔ細胞のみまたは緩衝液をマウスに注入した（対照グループ１および対照グループ２）。細胞注入に関するいくつかのパラメータを以下の表１に示す。ＮＰＧＴＭ（ＮＯＤ Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ）マウスに放射線を照射し、一定数のＣＡＲ−Ｔ細胞および対応するコントロール剤をマウスに注入した。対照グループ２について、３回連続で緩衝液をマウスに戻した。対照グループ１について、抗原を発現しないＴ細胞を３回連続で戻した。実験グループについて、抗原を発現するＴ細胞を３回連続で注入した。注入終了後、輪部静脈から採血し、マウス末梢血中のＴ細胞および因子放出（例えば、サイトカイン放出）を分析した。その後、マウスを死なせて、各器官のＴ比率／ＣＡＲ−Ｔ細胞比率／ＣＡＲ−Ｔコピーなどのデータを収集した。次に、サイトカイン放出測定を行った。実験グループおよび対照グループについて、マウス末梢血中の様々なサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ４、ＩＬ２）を測定した。図１０−１３に示すように、実験グループの方が対照グループよりもサイトカインの放出量が多かった。これらの結果は、抗原を発現する細胞の注入が、対応するＣＡＲ−Ｔ細胞のＴ細胞応答を強化することを示している。表２はマウスへのＴ細胞の注入をまとめて説明したものであり、表３はサイトカイン放出のインビボ分析のスケジュールを示している。

以下の表（表４）は、様々なポリペプチドドメインおよび核酸構築物とそれらの配列識別子（配列番号）を示している。（ＣＤ１９はＣＤ１９ ＣＡＲを指し、ＭＵＣ１はｔＭＵＣ１ ＣＡＲを指し、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは対応するＣＡＲのヒンジおよび／または膜貫通ドメインの特定の配列を指す）

実施例５．インビボ細胞の増幅
これらの臨床試験は、いくつかの固形腫瘍マーカーの特異的なＣＡＲ／４−１ＢＢ／ＣＤ３−ζを発現するように修飾された自己Ｔ細胞を患者に注入することの安全性および治療効果を評価することを目的とする。研究のグループ１（ａｒｍ）では、患者は固形腫瘍マーカーの特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞のみを受けた。固形腫瘍マーカーはＴＳＨＲおよびｔＭｕｃ１を含む。グループ２では、患者はＣＤ１９およびｔＭｕｃ１に向けられたＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた。患者のＴ細胞を取得し、修飾して、患者に注入した。グループ１およびグループ２からの患者のＴ細胞応答を測定し、試験が実施された病院によって承認された以下の手段を用いて比較した。すべての患者には書面によるインフォームドコンセントが与えられた。

ＴＳＨＲ−４−１ＢＢベクター、ｔＭｕｃ１−４−１ＢＢベクター、ＣＡＲｔＭｕｃ１／ＣＡＲ１９−４−１ＢＢベクターおよびウイルスパッケージングプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより、レンチウイルスを産生し、前記ベクターは−８０℃で冷凍し、形質導入の直前に解凍した。レンチウイルス上清を得た。説明するように、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を単離および活性化した（Ｋａｌｏｓ Ｍら，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１１；３：９５ｒａ７３を参照）。次に、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、１００ Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含むＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養し、２４−４８時間以内に、５：１〜１０：１の高倍数感染（ＭＯＩ）で、レンチウイルス上清で形質導入した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（ＴＳＨＲ−ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｔＭｕｃ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞またはｔＭｕｃ１−ＣＡＲ／ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞、以下「デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞」という）を約１１日間培養した。投与の３日前に、新鮮な培地を交換した。その後、注入のための輸送まで細胞を操作しなかった。レンチウイルス形質導入後の５−７日目に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により形質導入効率を評価した。以下の抗ヒト抗体を使用した：抗ｈＣＤ４５ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ｈＣＤ３ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと特異的なビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃ １１５−０６５−０７２）およびＰＥストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。データ収集は、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて行った。

本実施例および実施例１と２に記載するように、各患者に対して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入効率およびインビトロ細胞傷害性測定のＦＡＣＳ分析を実施した。さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞培養物を、真菌、細菌、マイコプラズマ、クラミジアおよびエンドトキシンによる汚染の可能性についてを２回チェックした。

８日目に、ＣＡＲ−Ｔ細胞調製のための末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、白血球アフェレシスにより患者から取得し、ＣＡＲ−Ｔ注入の１日目を研究の０日目とした。患者には、リンパ球除去のためのコンディショニング治療（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を行った。フルダラビンおよびシクロホスファミドを用いたコンディショニング治療は、骨髓（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）の腫瘍負担に応じて変化した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者に注入した。毎日、ＣＡＲ−Ｔ細胞を病院に運び、洗浄し、カウントし、生存率をチェックし、次に、患者への投与のために準備を行い、その後、患者を少なくとも２時間注意深く観察した。ＣＲＳは、改訂された評定システムに従って評定した（Ｌｅｅ ＤＷら， Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２４：１８８−９５を参照）。治療中および治療後の他の毒性は、米国国立衛生研究院の有害事象共通用語規準４．０バージョン（ｈｔｔｐ：／／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）に従って評定した。治療反応はフローサイトメトリーおよび形態学的分析により評価した。可能な場合、患者はキメラ遺伝子発現レベルで評価した。反応タイプは、最小残存病変（ＭＲＤ）陰性、完全な反応、不完全なカウント回復を伴う完全な反応、安定疾患および進行性疾患と定義された。

ＣＡＲ−Ｔ細胞注入後の一連のＢＭおよびＰＢサンプルをＫ２ＥＤＴＡ ＢＤ採血管（ＢＤ）に収集した。ＦＡＣＳにより、患者の新鮮なＰＢおよびＢＭのＣＡＲ１９ Ｔ細胞の持続性を決定した。測定された絶対ＣＤ３＋ Ｔリンパ球数に基づいて、マイクロリットルあたりの循環ＣＡＲ−Ｔ細胞数を計算した。同時に、ＣＡＲ ＤＮＡコピーは、ＣＡＲ−Ｔ細胞増幅および持続性を決定する別の方法として評価された。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、凍結保存されたＰＢおよびＢＭからゲノムＤＮＡを抽出した。補足資料に説明するように、ＣＡＲ ＤＮＡコピーは、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価された。血清およびＣＳＦ中のサイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７などのレベルを、製造者の指示に従ってマルチプレックス形態で測定した。

ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、凍結保存された末梢血および骨髓からゲノムＤＮＡを抽出した。ＡＢＩ ２×ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘとＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を３回繰り返してアルタイムで実施した。１０２−１０８のコピー／マイクロリットルを含む精製ＣＡＲプラスミドの１０倍連続希釈液の標準曲線からゲノムＤＮＡのマイクログラムあたりのコピー数を計算した。ＤＮＡ量の正規化には、内部標準遺伝子の増幅を使用した。ＣＡＲ１９形質転換遺伝子および内部標準遺伝子と特異的なプライマー／プローブは、（Ｇoｋｂｕｇｅｔ Ｎら，Ｂｌｏｏｄ ２０１２；１２０：２０３２−４１およびＯ’Ｂｒｉｅｎ Ｓら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１３；３１：６７６−８３を参照）前述の通りであった。

これらの患者のＣＡＲ−Ｔ細胞増幅およびサイトカイン放出は図１６−２０および図４９−５２に示されている。これらの結果は、ＣＤ１９ ＣＡＲおよび腫瘍マーカーの特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞が、腫瘍マーカーの特異的なＣＡＲのみを発現するＴ細胞よりも多く増幅しており、より多くのサイトカイン（例えば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ）を放出したことを示している。患者およびその対応するＴ細胞の情報を以下の表５に提供している。

図５１−５２は、１つのＣＡＲのみ投与された患者Ｃと比較して、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが投与された患者ＦにおけるサイトカインＩＬ−６およびＩＦＮ−γの放出が上昇したことを示している。サイトカインＩＬ−６およびＩＦＮ−γの放出の上昇によって、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲ分子（各ＣＡＲ分子が異なる抗原に結合する）を用いたＣＡＲ−Ｔ細胞療法の治療効果が確認された。

実施例６．ＺＦＮの設計Ｉ
様々な遺伝子特異的ＺＦＮを構築することによって、これらの遺伝子に突然変異を部位特異的に導入できるようにする。基本的には、Ｍａｌａら（２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３５（２）：４４７−５７，Ｌｉｕら（２００２） Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７７（６）：３８５０−６，Ｓａｎｄｅｒら（２０１１） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ８（１）：６７−９，Ｕｒｎｏｖら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１および米国特許公開２００８／０１３１９６２に記載しているように、様々なＺＦＮを設計して、プラスミドベクターに組み込まれた。ＺＦＮは、表６および表７に記載された、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ左結合ドメインおよびＺＦＮ右結合ドメイン）の様々な組み合わせを含んでいた。ＺＦＮの開裂ドメインは、工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ドメイン（配列番号２８０、２８１または２８２）を含んでいた。

表６：例示的なＺＦＮ対および標的配列（標的部位：ＺＦＮの標的配列は、２つの９−ｂｐ認識部位（すなわち、大文字）が６−ｂｐのスペーサーによって分離されたものを含む）。

実施例７．インビトロＺＦＮ活性Ｉ
ＺＦＮ左腕プラスミドベクターおよびＺＦＮ右腕プラスミドベクターを、それぞれｆｕｇｅｎｅトランスフェクト試薬を用いてＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクト後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンでＨｅｌａ細胞を４８時間処理し、ＺＦＮを豊富に含む細胞を得た。次に、Ｈｅｌａ細胞を収集し、様々な遺伝子（すなわち、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＦＯＸＰ３、ＳＩＶＡ１、または ＬＧＡＬＳ９）と特異的なプライマーおよびテンプレートとしてのＨｅｌａ細胞ゲノムを使用して、ＺＦＮを含む溶解したＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅した。フォワードプライマーを使用してＤＮＡフラグメントを配列決定し、その結果を図２１−２５に示す。

ＤＮＡフラグメントをベクターにクローニングした。約３０個のモノクローナル細胞を有するＤＮＡフラグメントを配列決定し、そのＤＮＡフラグメントに突然変異が含まれているかどうかを決定した。配列決定の結果を表７に示した。

表７：遺伝子フラグメントを標的としてＰＣＲで増幅したＺＦＮのモノクローナル配列決定結果

実施例８．ＺＦＮの設計ＩＩ
様々な遺伝子特異的ＺＦＮを構築することによって、これらの遺伝子に突然変異を部位特異的に導入できるようにする。基本的には、Ｍａｌａら（２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３５（２）：４４７−５７、Ｌｉｕら（２００２） Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７７（６）：３８５０−６、Ｓａｎｄｅｒら（２０１１） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．８（１）：６７−９，Ｈａｎｄｅｌら（２００９） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．Ｊａｎ；１７（１）：１０４−１１、Ｕｒｎｏｖら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１および米国特許公開２００８／０１３１９６２に記載しているように、様々なＺＦＮを設計して、プラスミドベクターに組み込まれた。ＺＦＮは、表８に記載された、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ左結合ドメインおよびＺＦＮ右結合ドメイン）の様々な組み合わせを含んでいた。ＺＦＮの開裂ドメインは、工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ドメイン（配列番号９６、９７または９８）を含んでいた。

表８：例示的なＺＦＮ対および標的配列（標的部位：ＺＦＮの標的配列は、２つの９−ｂｐ認識部位（すなわち、大文字）が６−ｂｐスペーサーによって分離されたものを含む）

実施例９．インビトロＺＦＮ活性ＩＩ
ＺＦＮ左腕プラスミドベクターおよびＺＦＮ右腕プラスミドベクターを、それぞれｆｕｇｅｎｅトランスフェクト試薬を用いてＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクト後、１ μｇ／ｍｌのピューロマイシンでＨｅｌａ細胞を４８時間処理し、ＺＦＮを豊富に含む細胞を得た。次に、Ｈｅｌａ細胞を収集し、様々な遺伝子（すなわち、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ）と特異的なプライマーおよびテンプレートとしてのＨｅｌａ細胞ゲノムを使用して、ＺＦＮを含む溶解したＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅した。フォワードプライマーを使用してＤＮＡフラグメントを配列決定し、その結果を図２７−３０に示す。

ＤＮＡフラグメントをベクターにクローニングした。約３０個のモノクローナル細胞を有するＤＮＡフラグメントを配列決定し、そのＤＮＡフラグメントに突然変異が含まれているかどうかを決定した。配列決定の結果を表１０に示した。

実施例１０．ＺＦＮの設計ＩＩＩ
Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子での部位特異的変異導入を可能にするように構築されたＴＲＡＣ特異的ＺＦＮで導入された。基本的には、Ｕｒｎｏｖら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１，Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２５（１１）：１２９８−３０６および米国特許公開２００８／０１３１９６２に記載しているように、様々なＺＦＮを設計して、プラスミドベクターに組み込まれた。ＺＦＮは、表９に記載された、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ左結合ドメインおよびＺＦＮ右結合ドメイン）の様々な組み合わせを含んでいた。ＺＦＮの開裂ドメインは、ＦｏｋＩ開裂ドメイン（配列番号９６、９７または９８）を含んでいた。１対のＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（表９を参照）を形質導入細胞に導入し、ＴＣＲ鎖に関連する標的ゲノム遺伝子座を修飾した。

実施例１１．ＴＡＬＥＮの効率検出
ＣＩＩＴＡのＴＡＬＥＮは、エクソン２（２Ｌ１：ｇｃｔｇａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔ（配列番号４２６）；２Ｌ２：ｇａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｃｔ（配列番号４２７）；２Ｒ１：ｃｔｃｃａｇｃｃａｇｇｔｃｃａｔｃｔ（配列番号４１９）；２Ｒ２：ｔｃｔｃｃａｇｃｃａｇｇｔｃｃａｔ（配列番号４２０））およびエクソン３（３Ｌ１：ｔｃａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｇｔ（配列番号４２１）；３Ｌ２：ｔｃａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｇｔｇｔ（配列番号４２２）；３Ｒ１：ｃｃｃｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃａｔ（配列番号４２３）；３Ｒ２：ａａｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｔｃｔｔ（配列番号４２４）；３Ｒ３：ａａｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｔｃｔ（配列番号４２５））を標的とするように設計された。前述したように、ＦａｓｔＴＡＬＥ ＴＡＬＥＮアセンブリキット（Ｓｉｄａｎｓａｉ）でＴＡＬＥＮを構築し、それらの活性は２９３Ｔ細胞で確認された。構築されたＴＡＬＥＮを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で選択した。選択後に２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを採取した。次に、ＴＡＬＥＮの効率をチェックするために、ＰＣＲおよび配列決定を行った。

表１０：様々な遺伝子フラグメントを標的とし、ＰＣＲで増幅されたＺＦＮのモノクローナル配列決定結果

実施例１２．Ｃａｓ９設計および分析
ｆｕｇｅｎｅトランスフェクト試薬を使用し、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。７２時間後、２９３Ｔ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＢ２ｍおよびＨＬＡタンパク質の発現を検出した（図３１）。

実施例１３．ＭＣＦ−７およびデュアルＣＡＲ再注入Ｉ
８匹のＮＰＧ雌マウスを使用し、それらは６週齢であった。０日目に、各マウスに３５０ｗ ＭＣＦ−７細胞を接種し、同所性腫瘍モデルを確立した。３５日目に、表１１に示すように、各マウスに対応する細胞を注入した。

表１１：実験プロトコル

４２日目に、眼窩静脈叢から一匹マウスあたり約１５０ｕｌの血液を採取した。４９日目に、マウスの血液を眼窩静脈叢からそれぞれ約１５０ｕｌ採取した。各末梢血を遠心分離して血漿を単離し、血漿を使用してサイトカインを測定した。破砕赤血球処理（ｒｅｄ−ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を行った後に、末梢血で沈殿した細胞を抗体で染色し、次に、フローサイトメトリーを行った。

マウス末梢血中のＴ細胞／マウス白血球の割合を測定した。結果を図３２−３９および表１２に提供する。

図３２−３５は、異なるグループにおけるヒト白血球／マウス白血球のフローサイトメトリーによる検出結果を示している。これらの細胞は、マウス末梢血溶解後のすべての生細胞に由来した。横軸はｈＣＤ４５の対応する染色の蛍光強度を表し、縦軸はｍＣＤ４５の対応する染色の蛍光強度を表す。

図３６−３９は、Ｔ細胞／ヒト白血球のフローサイトメトリーによる検出結果を示している。これらの細胞は図３２−３５のヒト白血球ｈＣＤ４５に由来し、横軸はＣＤ３の対応する染色の蛍光強度を表し、縦軸はＣＤ１９の対応する染色の蛍光強度を表す。

表１２：白血球／マウス白血球％

上記のように、モックグループにおけるＴ細胞（Ｎ／Ａ注入細胞）の比率は０％であり、グループＮＴにおけるＴ細胞は少なく、これは予期通りであった。グループ２４０７におけるＴ細胞の比率は、グループ１２０４＋２４０７よりも多かったが、マウスの数が少ないため、さらなる実験が必要であった。従って、デュアルＣＡＲ細胞は、シングルＣＡＲ細胞のように活性化することができる。

図４０は、各マウスのサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γの放出を示している。末梢血サンプルはマウスから取得され、上清の提供は以下の表１３に示されている（単位：ｐｇ／ｍＬ）。

表１３：サイトカインデータ

上記のように、ＩＬ−２：２４０７および１２０４＋２４０７のＩＬ−２放出レベルは、ＮＴおよびモック（Ｎ／Ａ注入細胞）よりもわずかに高かった。グループＮＴおよびモックグループにおけるＩＦＮ−γは基本的には０であり、グループ１２０４＋２４０７におけるＩＦＮ−γ放出はグループ２４０７よりもはるかに多かった。従って、デュアルＣＡＲ細胞は、シングルＣＡＲ細胞と同様にサイトカインを放出することができる。

図４１−４４は、マウス末梢血Ｔ細胞におけるＣＤ８／ＣＤ４比を示している。これらの細胞は図３６−３９のＣＤ３陽性細胞に由来し、横軸はＣＤ４の対応する染色の蛍光強度を表し、縦軸はＣＤ８の対応する染色の蛍光強度を表す。具体的な結果を表１４に示す。

表１４：Ｔ細胞におけるＣＤ８／ＣＤ４

上記のように、モックグループ（Ｎ／Ａ注入細胞）はＣＤ８およびＣＤ４がない。グループ２４０７およびグループ１２０４＋２４０７は基本的には横ばいで、グループＮのＴＣＤ８／ＣＤ４比はこの両グループを大きく上回った。

実施例１４．ＭＣＦ−７およびデュアルＣＡＲ再注入ＩＩ
１７匹のＮＰＧ雌マウスを使用し、それらは８週齢であった。動物が到着した後、それらを滅菌し、動物室に移した。実験動物を７日間順応させた。順応期間中、ケージ内の動物を毎日観察した。順応期間終了後、実験モデル化の前日に動物に放射線を照射した。照射量は１Ｇｙであった。

照射後の２日目にマウスをモデル化した。ＭＣＦ−７細胞を、マウスの乳腺脂肪パッドにｉｎ ｓｉｔｕ接種することにより注入し、腫瘍モデルを確立した。モデル化の日を０日目とする。

表１５：マウスモデル化プロトコル

表１６に示すように、ランダムなグループ分けに従って、モデル化した１７匹のマウスを４つのグループに分けた。

表１６：実験プロトコル

モデル化した後、明らかな腫瘍が目に見えた時点で、マウス腫瘍の体積測定を開始した。Ｎａｌｍ６細胞刺激は以下のように行った。９日目に、グループ２４０７＋１２０４（Ｎａｌｍ６刺激）における５匹のマウスにＮａｌｍ６細胞を注入して刺激を行った。表１７のプロトコルを用いて尾静脈注射によりＮａｌｍ６細胞をマウスに注入した。

表１７：実験プロトコル

１０日目に、表１８に示すように、各マウスに対応する細胞を注入（尾静脈注射）した。

表１８：実験プロトコル

細胞再注入した１週間後、マウスの末梢血を採取し、眼窩静脈叢から採血を行った。１７日目に、１回目の採血を行った。

末梢血を遠心分離して血漿を単離し、血漿を使用してサイトカインを測定した。破砕赤血球処理後に、末梢血で沈殿した細胞を抗体で染色し、次に、フローサイトメトリーを行った。データを分析して図４５−４７（末梢血流データ）に示した。

図４５は、Ｔ細胞／マウス白血球の結果を示している。表１９の統計とデータから、グループＮＴ、グループ２４０７およびグループＮａｌｍ６＋２４０７＋１２０４のＴ細胞／マウスにおける白血球の比率は類似しており、グループ２４０７＋１２０４のＴ細胞／マウスにおける白血球の比率は他の４つのグループよりも高いということが分かる。

表１９：Ｔ細胞／マウス白血球

図４６は、ＣＤ８／ＣＤ４の結果を示している。表２０の統計データから、ＣＤ８／ＣＤ４の４つのグループの比率に有意差がないことが分かる。

表２０：ＣＤ８／ＣＤ４比

マウスからの末梢血サンプルと上清（単位：ｐｇ／ｍＬ）およびサイトカインデータを分析し（表２１）、かつ図４７に示した。統計グラフおよび表のデータから、グループ２４０７におけるＩＬ−２放出は他の３つのグループよりも多いことが分かる。さらに、統計グラフおよび表のデータから、グループ２４０７におけるＩＦＮ放出は他の３つのグループよりも有意に多かったことが分かる。グループ２４０７＋１２０４およびグループＮａｌｍ６＋２４０７＋１２０４から放出されたＩＦＮ量は比較的近かった。

表２１：サイトカインデータ

図４８は、異なる細胞で注入したグループに応答したマウスの腫瘍体積の変化を示している。様々な細胞を注入した後、一定時間経過した時点での異なるマウスの腫瘍体積（単位、ｍｍ３、Ｖ＝長径＊短径＊短径＊０．５という体積式に基づく）を測定し、その結果を図に示している。上図から分かるように、再注入後、グループ２４０７＋１２０４の腫瘍体積は基本的には変化がなく、グループＮａｌｍ６＋２４０７＋１２０４およびグループ２４０７では腫瘍体積が減少し、グループＮＴでは腫瘍体積が増加した。従って、デュアルＣＡＲおよびシングルＣＡＲは同様の抗腫瘍機能を有する。

本明細書で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれたことが明確かつ個別的に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。上記のことを様々な実施形態で説明したが、当業者は、その精神から逸脱することなく、様々な修正、置換、省略および変更が可能であることを理解するべきである。

Claims (19)

1. 固形腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、かつＢ細胞抗原に結合するＣＡＲをコードする複数の核酸を含む、修飾細胞。
2. 前記固形腫瘍抗原がｔＭＵＣ １、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３−Ｒα２、メソセリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ−ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ−α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、またはＥＧＦＲであり、かつ前記Ｂ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＢＣＭＡである、請求項１に記載の修飾細胞。
3. 前記Ｂ細胞抗原がＣＤ１９を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
4. 前記固形腫瘍抗原が腫瘍関連ＭＵＣ１を含む、請求項３に記載の修飾細胞。
5. 前記Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲの結合ドメインが配列番号５または６のアミノ酸配列を含み、かつ前記固形腫瘍抗原に結合する前記ＣＡＲの結合ドメインが配列番号７０のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の修飾細胞。
6. 前記Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲが配列番号２０７のアミノ酸配列を含み、かつ前記固形腫瘍抗原に結合する前記ＣＡＲが配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の細胞。
7. 前記Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインを含み、かつ前記固形腫瘍抗原に結合する前記ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項４に記載の修飾細胞。
8. 前記細胞質ドメインが共刺激ドメインもしくはＣＤ３ζドメイン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の修飾細胞。
9. 前記修飾細胞によるＴ細胞の増幅が、前記Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲの非存在下で、前記固形腫瘍抗原に結合する前記ＣＡＲを有するＴ細胞を投与することによって得られるＴ細胞の増幅よりも大きい、請求項３に記載の修飾細胞。
10. 前記Ｔ細胞の増幅が、前記Ｔ細胞のゲノムＤＮＡにおけるＣＡＲ分子のコピー数の増加に基づいて測定される、請求項９に記載の修飾細胞。
11. 前記核酸の少なくとも１つが配列番号２０１の核酸配列を含む、請求項３に記載の修飾細胞。
12. 前記Ｂ細胞抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＢＣＭＡを含む、請求項１に記載の修飾細胞。
13. 前記固形腫瘍抗原がＢ７、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＥＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢ Ｔ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＦＳＨ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ−１ Ｈ／ＨＬＡ− Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ｚｅｔａｋｉｎｅ）、Ｋａｐｐａ、白血病、ＬｅｗｉｓＹ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１、ＴＲＡＩＬ−受容体１、又はＶＥＧＦＲ２を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
14. 前記Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲが配列番号２０３、２０７、２１６、または２１９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
15. 前記固形腫瘍抗原に結合する前記ＣＡＲが配列番号２０２または２０５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
16. 前記核酸の少なくとも１つが配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２１５、２１７、２１８、または２２０の核酸配列を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の修飾細胞集団を含む、医薬組成物。
18. 請求項１７に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与することを含む、必要とする被検者におけるＴ細胞応答を促進する方法および／または前記被検者の腫瘍を治療する方法。
19. 請求項１７に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与することを含み、前記被検者は、前記Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲを持たない前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効量が投与された被検者と比較して、より高いレベルのＴ細胞増幅を有する、必要とする被検者におけるＴ細胞増幅を強化する方法。

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