JP2021500008A - 幹細胞由来外胚葉系統前駆体を分化する方法 - Google Patents

Abstract

本開示の主題は、幹細胞の神経堤、頭蓋プラコードまたは非神経外胚葉の前駆体への分化を誘導するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、およびこのような方法によって生成される細胞を提供する。本開示の主題は、神経変性障害および下垂体障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。例えば、幹細胞は、細胞を有効量の１種または複数のＷｎｔ活性化剤とさらに接触させることによってＮＣに分化させることができ、ＣＰは、幹細胞を有効量の１種または複数のＦＧＦの活性化剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができ、ＮＮＥは、幹細胞を有効量の１種または複数のＦＧＦの阻害剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができる。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年９月７日に出願された米国仮出願第６２／５５５，６２９号に基づく優先権を主張する（この内容は、これによりその全体が参考として本明細書に援用される）。

１．序論
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導される４つの主要な外胚葉系統、ＣＮＳ、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉の細胞、ならびに神経障害の細胞ベースの処置および薬物発見のためのそれらの使用に関する。

２．発明の背景
ヒトにおいて、初期発生細胞型は単離および研究するのが困難である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）の方向付けられた分化によって、基礎生物学およびトランスレーショナルバイオロジーに適用するための体系的手法において、初期運命決定にアクセスするモデル系が提供される。ｉｎ ｖｉｖｏでの発生の間に作用することが公知である発生経路のｉｎ ｖｉｔｒｏでのモジュレーションに基づき、自然分化パラダイムおよび方向付けられた分化ストラテジーなどの初期系統へＰＳＣを分化させるためのいくつかのストラテジーが存在する。様々な分化プラットホームにわたって帰結に大きく影響を及ぼす因子として、フィーダー細胞の使用、単層に基づくストラテジー対胚葉体に基づくストラテジー、または複合培地組成が挙げられる。例えば、多くの公開されたプロトコルには、血清または所望の運命を誘導するためのＫＳＲなどの血清置換因子を含有する培地が関与する。これらの試薬の製造におけるバッチ間変動は、分化の再現性に影響を及ぼし、目的の特異的細胞型を生成するために骨の折れるロット試験の遂行を必須とすることが多い（Blauwkampら、２０１２年）。ＫＳＲなどの複雑な試薬に対するこのような広範な品質管理ストラテジーは、任意の単一のプロトコルについては実行可能であるが、これらは、モジュール形式で何十もの、またはおそらく何百もの定義された細胞型を生成することを目的とする、より意欲的なストラテジーの開発を妨げる。

それぞれＢＭＰおよびＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害し、それによりＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する小分子であるＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ４３１５４２の添加に基づいて、神経系の複数の細胞型を誘導するプロトコルが確立されてきた。ＳＭＡＤ二重阻害（ｄＳＭＡＤｉ）と称されるこの阻害カクテルの組合せは、転写因子Ｐａｘ６の発現によって特徴付けられる前部神経外胚葉（ＮＥ）へと初期化する中枢神経系（ＣＮＳ）における細胞の効率的な生成を可能とする（Chambersら、２００９年）。ｄＳＭＡＤｉへの改変により、前脳、中脳および脊髄前駆細胞を含む胚の脳脊髄軸に沿った多くの異なる神経亜型を得ることができる。さらに、ｄＳＭＡＤｉは、神経堤（ＮＣ）（Micaら、２０１３年）、頭蓋プラコード（ＣＰ）および非神経外胚葉（ＮＮＥ）（Dincerら、２０１３年）などの非ＣＮＳ細胞型を生成するように適応させることもできる。総体的に、ｄＳＭＡＤｉは、Ｐａｘ６＋ＮＥのほぼ均一な層を生成する堅固かつ広く使用されるプラットホームである。しかし、ｄＳＭＡＤｉ下でＰａｘ６＋ＮＥを誘導するためにさえ、Ｐａｘ６＋細胞における最も前部の終脳マーカーＦＯＸＧ１＋の獲得は、ＫＳＲバッチ変動によって影響を受けうる。したがって、スケーラブルかつ十分なモジュール分化プラットホームは、ＫＳＲまたは他の複雑な培地因子を避けるべきである。

Blauwkamp, T.A., Nigam, S., Ardehali, R., Weissman, I.L., and Nusse, R. (2012). Endogenous Wnt signalling in human embryonic stem cells generates an equilibrium of distinct lineage-specified progenitors. Nature communications 3, 1070. Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 27, 275-280. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S.M., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2013). Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell reports 3, 1140-1152. Dincer, Z., Piao, J., Niu, L., Ganat, Y., Kriks, S., Zimmer, B., Shi, S.H., Tabar, V., and Studer, L. (2013). Specification of functional cranial placode derivatives from human pluripotent stem cells. Cell reports 5, 1387-1402.

３．発明の要旨
本開示の主題は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化によって、ヒト幹細胞から誘導される神経堤（ＮＣ）、頭蓋プラコード（ＣＰ）、および非神経外胚葉（ＮＮＥ）前駆体に関する。

本開示の主題は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化を伴う、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害（例えば、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害）であって、ＢＭＰシグナル伝達が、細胞の有効量の１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤および１種または複数のＢＭＰ活性化剤への最初の接触の少なくとも２日後に活性化され、細胞を有効量の１種または複数のＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ系統に特異的な活性化剤および阻害剤とさらに接触させる阻害によって、神経堤、頭蓋プラコードおよび非神経外胚葉の非ＣＮＳ外胚葉系統をヒト幹細胞から分化させることができるという発見に、少なくとも部分的に基づく。例えば、幹細胞は、細胞を有効量の１種または複数のＷｎｔ活性化剤とさらに接触させることによってＮＣに分化させることができ、ＣＰは、幹細胞を有効量の１種または複数のＦＧＦの活性化剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができ、ＮＮＥは、幹細胞を有効量の１種または複数のＦＧＦの阻害剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができる。

ある特定の実施形態では、細胞を有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に少なくとも約１２日間接触させる。ある特定の実施形態では、有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を細胞の集団に同時に接触させる。

ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ ＮＣ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ヒト幹細胞の集団を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および有効量のウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と少なくとも約２日間、または少なくとも約３日間接触させ、ＴＦＡＰ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３ａおよび／またはＭＡＳＨ１から選択される１種または複数のマーカーの検出可能なレベルを発現する細胞の集団を生成する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤およびＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を細胞に同時に接触させ、Ｗｎｔ活性化剤の濃度は、細胞をＷｎｔ活性化剤と最初に接触させてから約２日後に増加し、細胞をレベルの上昇したＷｎｔと約１０、１１、もしくは１２日またはそれより多い日数までの間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、検出可能なレベルのＳＯＸ１０を発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くがＳＯＸ１０の検出可能なレベルを発現する。

ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ ＣＰ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ヒト幹細胞の集団を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および有効量の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と少なくとも約２日間、または少なくとも約３日間接触させ、ＴＦＡＰ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３ａおよび／またはＭＡＳＨ１から選択される１種または複数のマーカーの検出可能なレベルを発現する細胞の集団を生成する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも２日後に、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、検出可能なレベルのＳＩＸ１および／またはＥＬＡＶＬ４を発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから約１２日後に、ＳＩＸ１、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、および／またはクリスタリンアルファＢから選択される１種または複数の水晶体プラコード前駆体マーカーの検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。

ある特定の実施形態では、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも２日後に、有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤とさらに接触させ、細胞を有効量の１種または複数のＷｎｔ活性化剤と約２日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞のＷｎｔの活性剤との接触中または接触後には細胞をＦＧＦの活性化剤と接触させない。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、三叉神経プラコード前駆体マーカーであるＰＡＸ３の検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くがＳＩＸ１および／またはＰＡＸ３の検出可能なレベルを発現する。

ある特定の実施形態では、本開示の主題は、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、有効量のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種、２種またはそれより多い活性化剤と接触させることによって、ヒト幹細胞の下垂体細胞、またはその頭蓋プラコード前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と少なくとも約２日間、または少なくとも約３日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも４日後に、有効量のＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤および有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種、２種またはそれより多い活性化剤と接触させ、細胞を１種または複数のＳＨＨ活性化剤および１種、２種またはそれより多いＦＧＦ活性化剤と少なくとも２６日またはそれより多い日数までの間接触させる。

ある特定の実施形態では、下垂体細胞、またはその頭蓋プラコード前駆体の集団を生成する前述の方法は、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＵＸ、ＬＨＸ４、ＨＥＳＸ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、ＰＡＸ６、またはこれらの組合せから選択される１種または複数のマーカーの検出可能なレベルを発現する細胞の集団を生成する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。

ある特定の実施形態では、細胞を有効量の１種または複数の背方化剤、例えば、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤；有効量の１種または複数の腹方化剤、例えば、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤；またはこれらの組合せとさらに接触させ、ここで、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも３０日後に、薬剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の薬剤と少なくとも３０日またはそれより多い日数の間接触させる。

ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ ＮＮＥ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ヒト幹細胞の集団を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、検出可能なレベルのＴＦＡＰ２Ａを発現し、検出可能なレベルのＳＩＸ１および／またはＳＯＸ１０を発現しない。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くがＴＦＡＰ２Ａの検出可能なレベルを発現する。

ある特定の実施形態では、方法は、前記ヒト幹細胞の集団を前記有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と同時に接触させるステップを含む。

ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞の集団を、前記有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１２日目またはその後に、１種または複数の神経堤、頭蓋プラコードまたは非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団へと分化させる。

本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された１種または複数の神経堤、頭蓋プラコードまたは非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団も提供する。ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞の集団から誘導される。本開示の主題は、このような分化細胞集団を含む組成物を、さらに提供する。

ある特定の実施形態では、この場合、細胞の集団は、本明細書に記載されているように外胚葉系統に分化され、細胞の集団の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２％または１％未満が、本明細書に記載されているように、他の外胚葉系統の１種または複数のマーカーの検出可能な発現レベルを発現する。

さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および（ｄ）幹細胞の、１種または複数の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および（ｄ）幹細胞の、１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。ある特定の実施形態では、キットは、任意選択で、（ｅ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｄ）幹細胞の、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤、および（ｅ）幹細胞の、１種または複数の下垂体細胞、または下垂体細胞前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された幹細胞由来の前駆体を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の細胞は、成熟した分化細胞である。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記活性化剤は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤は、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、Ｃ２５ＩＩおよび平滑化（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト、例えば、パルモルファミン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。

ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ
ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群より選択される。

ある特定の実施形態では、方法は、分化細胞の前記集団を、前記分化細胞のＮＣ由来ニューロン、ＣＰ由来ニューロンまたはＮＮＥ由来細胞の集団への成熟に好ましい条件に供するステップを含む。

本開示の主題は、ＳＯＸ１０を含む少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を、さらに提供する。本開示の主題は、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を、さらに提供する。

本開示の主題は、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される１種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を、さらに提供する。

本開示の主題は、ＴＦＡＰ２Ａを含む少なくとも１種のｏｒｅ非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を、さらに提供する。

ある特定の実施形態では、細胞は、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。ある特定の実施形態では、細胞は、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。ある特定の実施形態では、細胞は、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。ある特定の実施形態では、細胞は、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ誘導体、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤は、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。

本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を、さらに提供する。

本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を、さらに提供する。

本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を、さらに提供する。

本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を、さらに提供する。

ある特定の実施形態では、細胞は、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。ある特定の実施形態では、細胞は、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。ある特定の実施形態では、細胞は、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露される。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤は、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。

ある特定の実施形態では、少なくとも１種の神経堤系統マーカーは、ＳＯＸ１０を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーは、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーは、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびそれらの組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーは、ＴＦＡＰ２Ａを含む。ある特定の実施形態では、分化細胞の集団の約２０％未満は、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する。

本開示の主題は、本明細書に記載されている分化細胞集団を含む組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。

本開示の主題は、対象における神経変性障害または下垂体障害を処置する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に対する有効量の本明細書に記載されている分化細胞集団または本明細書に記載されている組成物を対象に投与するステップを含む。

本開示の主題は、対象における神経変性障害または下垂体障害を処置するための本明細書に記載されている分化細胞集団または本明細書に記載されている組成物をさらに提供する。

本開示の主題は、神経変性障害または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載されている分化細胞集団または本明細書に記載されている組成物の使用をさらに提供する。

ある特定の実施形態では、下垂体障害は、下垂体機能低下障害である。
４．図面の簡単な説明

図１Ａ〜１Ｆは以下を示す。（Ａ）ＫＳＲ培地でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から神経外胚葉（ＮＥ）、神経堤（ＮＣ）、頭蓋プラコード（ＣＰ）、非神経外胚葉（ＮＮＥ）を分化させるためのプロトコル。（Ｂ）ＫＳＲで分化したＮＥ、ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥにおけるＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＴＦＡＰ２Ａ、ＳＯＸ１０の発現。（Ｃ、Ｄ）ＫＳＲ培地のヒト多能性幹細胞の特定の細胞型への分化によって、それぞれ、平均９５％、５０％および５８％のＮＥ、プラコードおよびＮＣが生成された。（Ｅ）ＰＡＸ６を発現する細胞のパーセンテージは、Ｅ６培地で培養されたヒト多能性幹細胞へのＳＢ４３１５４２（ＳＢ）またはｄＳＭＡＤｉ（すなわち、ＳＢおよびＬＤＮ１９３１８９）の添加により改善され、ＰＡＸ６陽性細胞のパーセンテージは、それぞれ、ほぼ９０％および８０％まで増加した。（Ｆ）Ｅ６培地に対してＫＳＲ培地でＮＣ運命に向かって分化したｈＰＳＣの比較遺伝子発現分析により、Ｅ６培地で培養した場合に非神経マーカーの発現が欠如することが明らかとなった。 図１Ａ〜１Ｆは以下を示す。（Ａ）ＫＳＲ培地でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から神経外胚葉（ＮＥ）、神経堤（ＮＣ）、頭蓋プラコード（ＣＰ）、非神経外胚葉（ＮＮＥ）を分化させるためのプロトコル。（Ｂ）ＫＳＲで分化したＮＥ、ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥにおけるＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＴＦＡＰ２Ａ、ＳＯＸ１０の発現。（Ｃ、Ｄ）ＫＳＲ培地のヒト多能性幹細胞の特定の細胞型への分化によって、それぞれ、平均９５％、５０％および５８％のＮＥ、プラコードおよびＮＣが生成された。（Ｅ）ＰＡＸ６を発現する細胞のパーセンテージは、Ｅ６培地で培養されたヒト多能性幹細胞へのＳＢ４３１５４２（ＳＢ）またはｄＳＭＡＤｉ（すなわち、ＳＢおよびＬＤＮ１９３１８９）の添加により改善され、ＰＡＸ６陽性細胞のパーセンテージは、それぞれ、ほぼ９０％および８０％まで増加した。（Ｆ）Ｅ６培地に対してＫＳＲ培地でＮＣ運命に向かって分化したｈＰＳＣの比較遺伝子発現分析により、Ｅ６培地で培養した場合に非神経マーカーの発現が欠如することが明らかとなった。

図２Ａ〜２Ｊは以下を示す。（Ａ）ＢＭＰシグナル伝達は、ニワトリ胚の発生におけるＮＮＥおよびプラコードの形成にとって重要であることが示された（GrovesおよびLaBonne、２０１４年）。（Ｂ、Ｃ）ＴＦＡＰ２Ａの発現は、Ｅ６培地でＳＢ４３１５４２と組み合わせて、用量依存的にＢＭＰで処置した３日以内に速やかに上方調節される。（Ｄ）２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰで、細胞は、ＴＦＡＰ２Ａ陽性となり、ＮＮＥが強力なＢＭＰシグナル伝達の活性化によって誘発されることを示すＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の発現を欠如する。（Ｅ）ｈＰＳＣをＳＢ、ＢＭＰおよびＳＵ５４０２と共に培養することにより、ＮＮＥ前駆体が生成し、ＮＮＥ前駆体は、未成熟（Ｋ１４陽性）および成熟（Ｋ１８陽性）上皮細胞のマーカーを発現した。（Ｆ）３日目のＳＢ４３１５４２と組み合わせたＢＭＰパルスにより、ｈＰＳＣのＳＩＸ１陽性ＣＰ前駆体への分化が生じた。（Ｇ）ｈＰＳＣの分化中のＳＢ４３１５４２およびＢＭＰを含むＥ６培地へのＦＧＦ８ではないＦＧＦ２の添加によって、ＳＩＸ１陽性ＣＰ細胞の形成は、ほぼ５０％まで増強される。（Ｈ、Ｉ）ＳＩＸ１陽性ＣＰ前駆体の（細胞を３０日間培養することによる）終末分化によって、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡおよびＢなどの水晶体特異的因子の増加が生じた。（Ｊ）Ｅ６培地でｈＰＳＣをＳＢ４３１５４２、ＢＭＰおよびＦＧＦ２と組み合わせてＷｎｔ活性化に曝露することにより、細胞は、三叉神経プラコード運命を示すＳＩＸ１およびＰＡＸ３を発現するＣＰ前駆体へと分化した。 図２Ａ〜２Ｊは以下を示す。（Ａ）ＢＭＰシグナル伝達は、ニワトリ胚の発生におけるＮＮＥおよびプラコードの形成にとって重要であることが示された（GrovesおよびLaBonne、２０１４年）。（Ｂ、Ｃ）ＴＦＡＰ２Ａの発現は、Ｅ６培地でＳＢ４３１５４２と組み合わせて、用量依存的にＢＭＰで処置した３日以内に速やかに上方調節される。（Ｄ）２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰで、細胞は、ＴＦＡＰ２Ａ陽性となり、ＮＮＥが強力なＢＭＰシグナル伝達の活性化によって誘発されることを示すＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の発現を欠如する。（Ｅ）ｈＰＳＣをＳＢ、ＢＭＰおよびＳＵ５４０２と共に培養することにより、ＮＮＥ前駆体が生成し、ＮＮＥ前駆体は、未成熟（Ｋ１４陽性）および成熟（Ｋ１８陽性）上皮細胞のマーカーを発現した。（Ｆ）３日目のＳＢ４３１５４２と組み合わせたＢＭＰパルスにより、ｈＰＳＣのＳＩＸ１陽性ＣＰ前駆体への分化が生じた。（Ｇ）ｈＰＳＣの分化中のＳＢ４３１５４２およびＢＭＰを含むＥ６培地へのＦＧＦ８ではないＦＧＦ２の添加によって、ＳＩＸ１陽性ＣＰ細胞の形成は、ほぼ５０％まで増強される。（Ｈ、Ｉ）ＳＩＸ１陽性ＣＰ前駆体の（細胞を３０日間培養することによる）終末分化によって、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡおよびＢなどの水晶体特異的因子の増加が生じた。（Ｊ）Ｅ６培地でｈＰＳＣをＳＢ４３１５４２、ＢＭＰおよびＦＧＦ２と組み合わせてＷｎｔ活性化に曝露することにより、細胞は、三叉神経プラコード運命を示すＳＩＸ１およびＰＡＸ３を発現するＣＰ前駆体へと分化した。

図３Ａ〜３Ｃは、以下を示す。（Ａ）ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）およびＳＢ４３１５４２のショートパルスと組み合わせたＷｎｔシグナル伝達の活性化によって、ほぼ均質なＳＯＸ１０陽性ＮＣ集団を生成することが可能となる。（Ｂ）Ｅ６培地へのＳＢ４３１５４２を伴うＷｎｔおよびＢＭＰの添加により、非神経外胚葉運命の別のマーカーであるＤＬＸ３だけでなくＴＦＡＰ２Ａの発現も活性化された。（Ｃ）ＳＯＸ１０陽性ＮＣ前駆体の分化により、Ｉｓｌ１およびＭａｓｈ１陽性発現によってマークされた自律および感覚神経が生じた。

図４Ａ〜４Ｆは以下を示す。（Ａ、Ｂ）４つのヒト外胚葉系統すべての転写発現特性。ＮＥは、ｈＥＳＣと接近してクラスター化し、一方、ＮＮＥは、他の外胚葉系統のすべてから最も離れてクラスター化した。ＮＣとＣＰは、互いに接近してクラスター化した。（Ｃ、Ｄ）４つの外胚葉前駆体は、遺伝子オントロジー分析に供された様々な遺伝子の発現を上方調節および下方調節する（Edgarら、２０１３年）。細胞外マトリックス認識に関連する遺伝子は、非ＣＮＳ分化細胞型のすべてにおいて有意に濃縮された。ＮＥに関連するオントロジーは、シナプス伝達および神経系の発達に関与する。（Ｅ）ＣＮＳと非ＣＮＳの運命間で共有される外胚葉分化中に特異的に上方調節された遺伝子には、ＡＮＸＡ１、ＬＧＩ１、ＮＲ２Ｆ２およびＺＮＦ５０３が含まれる。細胞をＣＮＳ前駆体から区別する非ＣＮＳ細胞前駆体によって発現された因子には、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＴＦＡＰ２ＡおよびＴＦＡＰ２Ｂが含まれる。（Ｆ）４つの外胚葉系統の細胞は、遺伝子発現における差も示した。ＮＥでは、ＳＯＸ１、Ｈｅｓ５およびＰＡＸ６が上方調節され、一方、低レベルのＰＡＸ６の転写を他の系統のすべてにおいて見出すことができた。具体的には、高レベルのジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ２２９がＮＣ系統で観察された。ＥＬＡＶＬ４およびＳＭＹＤ１は、それぞれ、プラコードおよびＮＮＥにおいて優先的に発現された。 図４Ａ〜４Ｆは以下を示す。（Ａ、Ｂ）４つのヒト外胚葉系統すべての転写発現特性。ＮＥは、ｈＥＳＣと接近してクラスター化し、一方、ＮＮＥは、他の外胚葉系統のすべてから最も離れてクラスター化した。ＮＣとＣＰは、互いに接近してクラスター化した。（Ｃ、Ｄ）４つの外胚葉前駆体は、遺伝子オントロジー分析に供された様々な遺伝子の発現を上方調節および下方調節する（Edgarら、２０１３年）。細胞外マトリックス認識に関連する遺伝子は、非ＣＮＳ分化細胞型のすべてにおいて有意に濃縮された。ＮＥに関連するオントロジーは、シナプス伝達および神経系の発達に関与する。（Ｅ）ＣＮＳと非ＣＮＳの運命間で共有される外胚葉分化中に特異的に上方調節された遺伝子には、ＡＮＸＡ１、ＬＧＩ１、ＮＲ２Ｆ２およびＺＮＦ５０３が含まれる。細胞をＣＮＳ前駆体から区別する非ＣＮＳ細胞前駆体によって発現された因子には、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＴＦＡＰ２ＡおよびＴＦＡＰ２Ｂが含まれる。（Ｆ）４つの外胚葉系統の細胞は、遺伝子発現における差も示した。ＮＥでは、ＳＯＸ１、Ｈｅｓ５およびＰＡＸ６が上方調節され、一方、低レベルのＰＡＸ６の転写を他の系統のすべてにおいて見出すことができた。具体的には、高レベルのジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ２２９がＮＣ系統で観察された。ＥＬＡＶＬ４およびＳＭＹＤ１は、それぞれ、プラコードおよびＮＮＥにおいて優先的に発現された。 図４Ａ〜４Ｆは以下を示す。（Ａ、Ｂ）４つのヒト外胚葉系統すべての転写発現特性。ＮＥは、ｈＥＳＣと接近してクラスター化し、一方、ＮＮＥは、他の外胚葉系統のすべてから最も離れてクラスター化した。ＮＣとＣＰは、互いに接近してクラスター化した。（Ｃ、Ｄ）４つの外胚葉前駆体は、遺伝子オントロジー分析に供された様々な遺伝子の発現を上方調節および下方調節する（Edgarら、２０１３年）。細胞外マトリックス認識に関連する遺伝子は、非ＣＮＳ分化細胞型のすべてにおいて有意に濃縮された。ＮＥに関連するオントロジーは、シナプス伝達および神経系の発達に関与する。（Ｅ）ＣＮＳと非ＣＮＳの運命間で共有される外胚葉分化中に特異的に上方調節された遺伝子には、ＡＮＸＡ１、ＬＧＩ１、ＮＲ２Ｆ２およびＺＮＦ５０３が含まれる。細胞をＣＮＳ前駆体から区別する非ＣＮＳ細胞前駆体によって発現された因子には、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＴＦＡＰ２ＡおよびＴＦＡＰ２Ｂが含まれる。（Ｆ）４つの外胚葉系統の細胞は、遺伝子発現における差も示した。ＮＥでは、ＳＯＸ１、Ｈｅｓ５およびＰＡＸ６が上方調節され、一方、低レベルのＰＡＸ６の転写を他の系統のすべてにおいて見出すことができた。具体的には、高レベルのジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ２２９がＮＣ系統で観察された。ＥＬＡＶＬ４およびＳＭＹＤ１は、それぞれ、プラコードおよびＮＮＥにおいて優先的に発現された。

図５Ａ〜５Ｄは、以下を示す。（Ａ）ｈＥＳＣにおけるＴＦＡＰ２Ａの発現のノックアウトにより、高ＢＭＰの存在下で短い３日の誘導後にＴＦＡＰ２Ａの発現の損失が生じた。（Ｂ）野生型ｈＥＳＣは、ＣＰまたはＮＮＥ条件下でＥ−カドヘリンを発現しなかったＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞と比較して、ＣＰまたはＮＮＥ条件下で分化の６日目にＥ−カドヘリンの堅固な上方調節を示した。（Ｃ、Ｄ）ＮＥの分化は、ＰＡＸ６およびＳＯＸ１の発現によって明らかなように、ＴＦＡＰ２Ａノックアウトによって影響を受けなかった。ＮＣおよびＣＰプロトコルによって、野生型細胞に対してＴＦＡＰ２ＡノックアウトにおけるＳＯＸ１およびＰＡＸ６の発現レベルは上昇したが、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の発現も検出され、ＴＦＡＰ２Ａの発現を消失させることは、非ＣＮＳ細胞型を抑制するのに十分ではないことを示す。

図６Ａ〜６Ｅは以下を示す。（Ａ）ＣＰ誘導を増強する化合物を識別するために、Ｓｉｘ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰレポーター株を使用するＬｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＬＯＰＡＣ）を使用する小分子スクリーニング。（Ｂ、Ｃ）対照の分化で観察されたレベルを超えてＳＩＸ１の発現を増加させた３つの候補化合物が特定された：ＢＲＬ−５４４３、セロトニン受容体アゴニスト；パルテノライド、ＮＦ−ｋＢおよびＳＴＡＴが媒介するコンフォメーション転写を阻害する能力を有する植物ホルモン；ならびにフェナントロリン（Phenanthroline）、メタロプロテアーゼ阻害剤。（Ｄ）ＣＰへの分化は、他の系統マーカー、例えば、Ｓｏｘ１０、Ｔ、ＭｙｏＤまたはＳｏｘ１７の発現を誘導することなく、対照に対して、フェナントロリンの存在下で、ＳＩＸ１の発現の５倍の増加を示した。（Ｅ）ＦＧＦ２の非存在下で、ＣＰプロトコルへのフェナントロリンの添加によりＳＩＸ１陽性細胞がほぼ４倍増加した（１８％に対して６９％）。ＦＧＦ２、またはＦＧＦ２とフェナントロリンの添加後、ＳＩＸ１陽性細胞の濃縮度は、それぞれ、３４％および４６％まで低下した。

図７Ａ〜７Ｂは、Ｅ６培地で、用量依存ＢＭＰ曝露を含むＮＥ、ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥ前駆体のモジュール生成のための培養プロトコルを示す。（Ａ）ＮＥの生成は、改変されないＫＳＲおよびＥ６系の両方で堅固であった。（Ｂ）初期のＢＭＰパルスにより、ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥの運命の分化が増大した。

図８Ａ〜８Ｆは、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ ｈＥＳＣレポーター細胞株の生成を示す。規定の分化培地の下でこれらの種々の外胚葉系統マーカーの獲得をモニタリングするために、本実施例は、３種のＧＦＰレポーター株、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）を使用した。 図８Ａ〜８Ｆは、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ ｈＥＳＣレポーター細胞株の生成を示す。規定の分化培地の下でこれらの種々の外胚葉系統マーカーの獲得をモニタリングするために、本実施例は、３種のＧＦＰレポーター株、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）を使用した。

図９Ａ〜９Ｅは以下を示す。（Ａ）Ｅ６培地の存在下で使用されたＫＳＲ分化プロトコル。（Ｂ）ｈＥＳＣは、いかなる小分子の添加もなくＥ６中でＮＥ前駆体へと分化することができるが、ＰＡＸ６を発現する細胞のパーセンテージはＳＢ４３１５４２またはｄＳＭＡＤｉを添加すると、それぞれ、ほぼ９０％および８０％までさらに改良された。（Ｃ、Ｄ）ＮＣ誘導によって、Ｅ６培地でＰＡＸ６またはＳＯＸ１０陽性細胞のいずれも生じず、これは、Ｗｎｔ活性化は、ＮＣを誘導するよりもむしろ細胞を分化させることの領域同一性を変更する可能性があることを示した。（Ｅ）ＰＡＸ６陽性ＮＥは、Ｅ６培地で、Ｔｂｒ１陽性皮質ニューロンへとさらに効率的に分化した。

図１０は、ＳＢ４３１５４２と組み合わせた、３日のＢＭＰシグナル伝達のパルスは、Ｅ６培地でＳＩＸ１陽性ＣＰ前駆体を生成するのに十分であったことを示す。用量応答研究により、中程度の濃度のＢＭＰ４（およそ５ｎｇ／ｍｌ）によってＣＰ誘導が生じることが示された。

図１１は、ＳＢ４３１５４２と組み合わせた、３日のＢＭＰシグナル伝達のパルスは、Ｅ６培地でＳＯＸ１０陽性ＮＣ前駆体を生成するのに十分であったことを示す。用量応答研究により、低濃度のＢＭＰ４（およそ１ｎｇ／ｍｌ）によって強いＮＣ誘導が生じることが示された。

図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣの生成を示す。（Ａ、Ｂ）２種のガイドＲＮＡを使用してＴＦＡＰ２Ａにおけるフレームシフト欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして欠失の程度および性質を決定した。（Ｃ）ＴＦＡＰ２Ａの発現の消失は、野生型細胞と比較して、ＴＦＡＰ２Ａの発現を誘引できなかった、高いＢＭＰの存在下での短い３日の誘導を使用して確認した。 図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣの生成を示す。（Ａ、Ｂ）２種のガイドＲＮＡを使用してＴＦＡＰ２Ａにおけるフレームシフト欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして欠失の程度および性質を決定した。（Ｃ）ＴＦＡＰ２Ａの発現の消失は、野生型細胞と比較して、ＴＦＡＰ２Ａの発現を誘引できなかった、高いＢＭＰの存在下での短い３日の誘導を使用して確認した。

図１３Ａ〜１３Ｂは、（Ａ）ＢＲＬ−５４４３および（Ｂ）パルテノライドが、ＣＰプロトコルを使用してｈＥＳＣから分化したＳＩＸ１を発現するＣＰ前駆細胞のレベルを増加させたことを示す。

図１４Ａ〜１４Ｃは、以下を示す。（Ａ）マトリゲル基質（数千ものタンパク質から構成されたコーティング基質）およびビトロネクチン基質（単一の組換えタンパク質から構成されたコーティング基質）の両方によって、非常に堅固な誘導効率が得られた。マトリゲル（Ｂ）およびビトロネクチン（Ｃ）の両方を使用する、１ｃｍ^２当たり５０，０００〜３００，０００個の細胞を使用する分化は、細胞運命の決定に影響を及ぼさなかった。 図１４Ａ〜１４Ｃは、以下を示す。（Ａ）マトリゲル基質（数千ものタンパク質から構成されたコーティング基質）およびビトロネクチン基質（単一の組換えタンパク質から構成されたコーティング基質）の両方によって、非常に堅固な誘導効率が得られた。マトリゲル（Ｂ）およびビトロネクチン（Ｃ）の両方を使用する、１ｃｍ^２当たり５０，０００〜３００，０００個の細胞を使用する分化は、細胞運命の決定に影響を及ぼさなかった。

図１５Ａ〜１５Ｃは、化学的に定義された条件を使用するｈＰＳＣの頭蓋プラコードへの分化を示す。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏで発生する頭蓋プラコードの略図およびヒト多能性幹細胞の誘導された分化のためのプロトコル。（Ｂ）重要な頭蓋プラコード（ＳＩＸ１、ＥＹＡ１）の遺伝子、非神経外胚葉（ＴＦＡＰ２Ａ、ＤＬＸ３／５、ＧＡＴＡ３）の遺伝子、および潜在的夾雑物（ＳＯＸ１０、Ｔ、ＳＯＸ１７、ＭＹＯＤ）をプロービングする遺伝子のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の時間経過。値は、分化０日目（分化培地への切り替えの直前）のＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、４つの独立した分化からの平均±ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｃ）頭蓋プラコード誘導プロトコルおよびＬＳＢ（神経外胚葉）の１１日目のタンパク質の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。 図１５Ａ〜１５Ｃは、化学的に定義された条件を使用するｈＰＳＣの頭蓋プラコードへの分化を示す。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏで発生する頭蓋プラコードの略図およびヒト多能性幹細胞の誘導された分化のためのプロトコル。（Ｂ）重要な頭蓋プラコード（ＳＩＸ１、ＥＹＡ１）の遺伝子、非神経外胚葉（ＴＦＡＰ２Ａ、ＤＬＸ３／５、ＧＡＴＡ３）の遺伝子、および潜在的夾雑物（ＳＯＸ１０、Ｔ、ＳＯＸ１７、ＭＹＯＤ）をプロービングする遺伝子のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の時間経過。値は、分化０日目（分化培地への切り替えの直前）のＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、４つの独立した分化からの平均±ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｃ）頭蓋プラコード誘導プロトコルおよびＬＳＢ（神経外胚葉）の１１日目のタンパク質の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。 図１５Ａ〜１５Ｃは、化学的に定義された条件を使用するｈＰＳＣの頭蓋プラコードへの分化を示す。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏで発生する頭蓋プラコードの略図およびヒト多能性幹細胞の誘導された分化のためのプロトコル。（Ｂ）重要な頭蓋プラコード（ＳＩＸ１、ＥＹＡ１）の遺伝子、非神経外胚葉（ＴＦＡＰ２Ａ、ＤＬＸ３／５、ＧＡＴＡ３）の遺伝子、および潜在的夾雑物（ＳＯＸ１０、Ｔ、ＳＯＸ１７、ＭＹＯＤ）をプロービングする遺伝子のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の時間経過。値は、分化０日目（分化培地への切り替えの直前）のＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、４つの独立した分化からの平均±ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｃ）頭蓋プラコード誘導プロトコルおよびＬＳＢ（神経外胚葉）の１１日目のタンパク質の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。

図１６Ａ〜１６Ｃは、前頭蓋プラコードに誘導されるｈＰＳＣの下垂体への特異化を示す。（Ａ）脳下垂体のｉｎ ｖｉｖｏでの発生およびヒト多能性幹細胞の下垂体前葉様細胞への誘導された分化のためのプロトコルの略図。（Ｂ）ＬＳＢ、下垂体条件および視床下部神経外胚葉によって馴化された培地（視床下部ＣＭ）における、それぞれの培地での分化１５日後の、下垂体発生に関与する重要な遺伝子の発現を比較するリアルタイムＰＣＲ分析。値は、水晶体の分化１５日目（Ｅ６のみ）のＧＡＰＤＨおよび遺伝子の発現に対して正規化され、少なくとも４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。１５日目のＥ６のみの条件と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。（Ｃ）水晶体または下垂体条件下で分化１５日後のＰＩＴＸ１、ＬＨＸ３の発現、ならびに下垂体分化１５日目のＨＥＳＸ１およびＳＩＸ３／６の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。 図１６Ａ〜１６Ｃは、前頭蓋プラコードに誘導されるｈＰＳＣの下垂体への特異化を示す。（Ａ）脳下垂体のｉｎ ｖｉｖｏでの発生およびヒト多能性幹細胞の下垂体前葉様細胞への誘導された分化のためのプロトコルの略図。（Ｂ）ＬＳＢ、下垂体条件および視床下部神経外胚葉によって馴化された培地（視床下部ＣＭ）における、それぞれの培地での分化１５日後の、下垂体発生に関与する重要な遺伝子の発現を比較するリアルタイムＰＣＲ分析。値は、水晶体の分化１５日目（Ｅ６のみ）のＧＡＰＤＨおよび遺伝子の発現に対して正規化され、少なくとも４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。１５日目のＥ６のみの条件と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。（Ｃ）水晶体または下垂体条件下で分化１５日後のＰＩＴＸ１、ＬＨＸ３の発現、ならびに下垂体分化１５日目のＨＥＳＸ１およびＳＩＸ３／６の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。

図１７Ａ〜１７Ｃは、パターン化されていないＳＩＸ１精製細胞からの下垂体プラコードの誘導を示す。（Ａ）実験概要の略図。ｈＥＳＣは、デフォルト条件下で６日間分化した。パターン化されていないＳＩＸ１＋細胞をＦＡＣＳで精製し、様々な条件でさらに９日間培養した。細胞を１５日目に分析した。（Ｂ）Ａで説明した３つの条件での細胞成長において重要な下垂体遺伝子の遺伝子発現分析。値は、水晶体の分化１５日目（Ｅ６のみ）のＧＡＰＤＨおよび遺伝子の発現に対して正規化され、少なくとも４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。１５日目のＥ６のみの条件と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。（Ｃ）それぞれの培地条件での分化９日後のＳＩＸ１で選別された細胞の免疫蛍光分析。矢印は、共培養条件におけるＳＩＸ１＋細胞でＬＨＸ３発現がないことを示す。スケールバー：５０μｍ。 図１７Ａ〜１７Ｃは、パターン化されていないＳＩＸ１精製細胞からの下垂体プラコードの誘導を示す。（Ａ）実験概要の略図。ｈＥＳＣは、デフォルト条件下で６日間分化した。パターン化されていないＳＩＸ１＋細胞をＦＡＣＳで精製し、様々な条件でさらに９日間培養した。細胞を１５日目に分析した。（Ｂ）Ａで説明した３つの条件での細胞成長において重要な下垂体遺伝子の遺伝子発現分析。値は、水晶体の分化１５日目（Ｅ６のみ）のＧＡＰＤＨおよび遺伝子の発現に対して正規化され、少なくとも４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。１５日目のＥ６のみの条件と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。（Ｃ）それぞれの培地条件での分化９日後のＳＩＸ１で選別された細胞の免疫蛍光分析。矢印は、共培養条件におけるＳＩＸ１＋細胞でＬＨＸ３発現がないことを示す。スケールバー：５０μｍ。

図１８Ａ〜１８Ｅは、下垂体前葉細胞の機能的特徴を示す。（Ａ）分化３０日後の下垂体前葉の免疫蛍光分析。３０日目には、培地は、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞（ＡＣＴＨ）、成長ホルモン分泌細胞（ＧＨ）および性腺刺激ホルモン分泌細胞（ＦＳＨ、ＬＨ）を含有する。スケールバー：５０μｍ。（Ｂ）ＥＬＩＳＡで評価された分化３０日目のｉｎ ｖｉｔｒｏでの基礎的なホルモン放出。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。細胞なし（分化培地のみ）と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊＊：ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。（Ｃ〜Ｅ）ホルモン放出を誘発する化合物を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激の２４時間後のホルモンレベルの定量化。具体的には、ＡＣＴＨの放出は、ＣＲＦ、ストレシン（stressin）またはウロコルチンによって誘導され、ソマトクリニンまたはグレリンによっては誘導されず（Ｃ）、ＧＨの放出は、ソマトクリニンによって誘導されたが、ＣＲＦによっては誘導されず（Ｄ）かつＦＳＨの放出は、ナファレリンによって誘導された（Ｅ）。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。溶媒対照と比較した^＊：ｐ＜０．０５。

図１９Ａ〜１９Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体前葉発生の一時的単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。（Ａ、Ｂ）分化３０日目（黒）および６０日目（緑）の単一細胞の主成分分析により、２つの異なる細胞集団が明らかとされる。（Ｃ）３４種の異なるプライマー対を使用する、３０日目および６０日目の細胞の教師なし階層的クラスタリング（unsupervised hierarchical clustering）により、非常に少ない先導細胞（３０日目の細胞は６０日目の細胞と類似する）および遅れて欠如する細胞（６０日目の細胞は３０日目となおさらよく似ている）を有する２つの細胞クラスターが特定される。（Ｄ）３０日目および６０日目のホルモン発現細胞の定量化、ならびに細胞当たりの１つより多いホルモンの転写を発現する細胞のパーセンテージ。（Ｅ）それぞれ、３０日目および６０日目の単一細胞当たりの個々のホルモンの発現。 図１９Ａ〜１９Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体前葉発生の一時的単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。（Ａ、Ｂ）分化３０日目（黒）および６０日目（緑）の単一細胞の主成分分析により、２つの異なる細胞集団が明らかとされる。（Ｃ）３４種の異なるプライマー対を使用する、３０日目および６０日目の細胞の教師なし階層的クラスタリング（unsupervised hierarchical clustering）により、非常に少ない先導細胞（３０日目の細胞は６０日目の細胞と類似する）および遅れて欠如する細胞（６０日目の細胞は３０日目となおさらよく似ている）を有する２つの細胞クラスターが特定される。（Ｄ）３０日目および６０日目のホルモン発現細胞の定量化、ならびに細胞当たりの１つより多いホルモンの転写を発現する細胞のパーセンテージ。（Ｅ）それぞれ、３０日目および６０日目の単一細胞当たりの個々のホルモンの発現。 図１９Ａ〜１９Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体前葉発生の一時的単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。（Ａ、Ｂ）分化３０日目（黒）および６０日目（緑）の単一細胞の主成分分析により、２つの異なる細胞集団が明らかとされる。（Ｃ）３４種の異なるプライマー対を使用する、３０日目および６０日目の細胞の教師なし階層的クラスタリング（unsupervised hierarchical clustering）により、非常に少ない先導細胞（３０日目の細胞は６０日目の細胞と類似する）および遅れて欠如する細胞（６０日目の細胞は３０日目となおさらよく似ている）を有する２つの細胞クラスターが特定される。（Ｄ）３０日目および６０日目のホルモン発現細胞の定量化、ならびに細胞当たりの１つより多いホルモンの転写を発現する細胞のパーセンテージ。（Ｅ）それぞれ、３０日目および６０日目の単一細胞当たりの個々のホルモンの発現。

図２０Ａ〜２０Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体のホルモン細胞の特異化を示す。（Ａ）ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２またはＢＭＰ２で３０日間パターン化された６０日目の細胞のバルクｑＲＴ−ＰＣＲ分析。ＢＭＰ２によるパターン化により、腹側細胞の特定がより誘導されたが（ＰＩＴ１、ＧＡＴＡ２、ＧＨ１、ＦＳＨＢおよびＬＨＢ）、ＦＧＦ８は背側細胞型を抑制した（ＦＳＨＢ）。データは、２〜４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。６０日目の「デフォルト」下垂体分化と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。（Ｂ）３４種のプライマー対を使用する、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２およびＢＭＰ２によりパターン化された細胞の教師なし階層的クラスタリングにより、ＦＧＦ８（またはＦＧＦ８／ＢＭＰ２）によってパターン化された細胞から主に構成されたクラスター２およびＢＭＰ２（またはＦＧＦ８／ＢＭＰ２）によってパターン化された細胞から主に構成されたクラスター３を有する３つのより大きな細胞のクラスターが特定された。（Ｃ）異なるパターンニング条件における細胞当たりのホルモン転写の定量化。データは、それぞれの転写を発現する細胞のパーセンテージとしてプロットされている（適当な融解曲線と組み合わせたｃｔ＜３５サイクル）。（Ｄ）分化６０日目のＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２またはＢＭＰ２でパターン化された細胞におけるホルモン発現の免疫蛍光分析（代表的な画像）。スケールバー：５０μｍ。（Ｅ）分化６０日目の異なるパターンニング条件におけるホルモン発現細胞（亜型当たり）の定量化。高レベルのＦＧＦ８は、腹側運命（ＡＣＴＨ）を誘導したが、一方、中間レベルのＦＧＦ８およびＢＭＰ２は、デフォルト条件（Ｅ６のみ）と比較して背側／腹側運命を誘導した（ＰＲＬおよびＧＨ）。データは、２つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。６０日目の「デフォルト」（Ｅ６のみ）下垂体分化と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。 図２０Ａ〜２０Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体のホルモン細胞の特異化を示す。（Ａ）ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２またはＢＭＰ２で３０日間パターン化された６０日目の細胞のバルクｑＲＴ−ＰＣＲ分析。ＢＭＰ２によるパターン化により、腹側細胞の特定がより誘導されたが（ＰＩＴ１、ＧＡＴＡ２、ＧＨ１、ＦＳＨＢおよびＬＨＢ）、ＦＧＦ８は背側細胞型を抑制した（ＦＳＨＢ）。データは、２〜４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。６０日目の「デフォルト」下垂体分化と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。（Ｂ）３４種のプライマー対を使用する、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２およびＢＭＰ２によりパターン化された細胞の教師なし階層的クラスタリングにより、ＦＧＦ８（またはＦＧＦ８／ＢＭＰ２）によってパターン化された細胞から主に構成されたクラスター２およびＢＭＰ２（またはＦＧＦ８／ＢＭＰ２）によってパターン化された細胞から主に構成されたクラスター３を有する３つのより大きな細胞のクラスターが特定された。（Ｃ）異なるパターンニング条件における細胞当たりのホルモン転写の定量化。データは、それぞれの転写を発現する細胞のパーセンテージとしてプロットされている（適当な融解曲線と組み合わせたｃｔ＜３５サイクル）。（Ｄ）分化６０日目のＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２またはＢＭＰ２でパターン化された細胞におけるホルモン発現の免疫蛍光分析（代表的な画像）。スケールバー：５０μｍ。（Ｅ）分化６０日目の異なるパターンニング条件におけるホルモン発現細胞（亜型当たり）の定量化。高レベルのＦＧＦ８は、腹側運命（ＡＣＴＨ）を誘導したが、一方、中間レベルのＦＧＦ８およびＢＭＰ２は、デフォルト条件（Ｅ６のみ）と比較して背側／腹側運命を誘導した（ＰＲＬおよびＧＨ）。データは、２つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。６０日目の「デフォルト」（Ｅ６のみ）下垂体分化と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。 図２０Ａ〜２０Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体のホルモン細胞の特異化を示す。（Ａ）ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２またはＢＭＰ２で３０日間パターン化された６０日目の細胞のバルクｑＲＴ−ＰＣＲ分析。ＢＭＰ２によるパターン化により、腹側細胞の特定がより誘導されたが（ＰＩＴ１、ＧＡＴＡ２、ＧＨ１、ＦＳＨＢおよびＬＨＢ）、ＦＧＦ８は背側細胞型を抑制した（ＦＳＨＢ）。データは、２〜４つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。６０日目の「デフォルト」下垂体分化と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。（Ｂ）３４種のプライマー対を使用する、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２およびＢＭＰ２によりパターン化された細胞の教師なし階層的クラスタリングにより、ＦＧＦ８（またはＦＧＦ８／ＢＭＰ２）によってパターン化された細胞から主に構成されたクラスター２およびＢＭＰ２（またはＦＧＦ８／ＢＭＰ２）によってパターン化された細胞から主に構成されたクラスター３を有する３つのより大きな細胞のクラスターが特定された。（Ｃ）異なるパターンニング条件における細胞当たりのホルモン転写の定量化。データは、それぞれの転写を発現する細胞のパーセンテージとしてプロットされている（適当な融解曲線と組み合わせたｃｔ＜３５サイクル）。（Ｄ）分化６０日目のＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２またはＢＭＰ２でパターン化された細胞におけるホルモン発現の免疫蛍光分析（代表的な画像）。スケールバー：５０μｍ。（Ｅ）分化６０日目の異なるパターンニング条件におけるホルモン発現細胞（亜型当たり）の定量化。高レベルのＦＧＦ８は、腹側運命（ＡＣＴＨ）を誘導したが、一方、中間レベルのＦＧＦ８およびＢＭＰ２は、デフォルト条件（Ｅ６のみ）と比較して背側／腹側運命を誘導した（ＰＲＬおよびＧＨ）。データは、２つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。６０日目の「デフォルト」（Ｅ６のみ）下垂体分化と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。

図２１Ａ〜２１Ｇは、ｈＰＳＣから誘導された下垂体前葉細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生存および機能を示す。（Ａ）実験レイアウトの略図。下垂体腺の外科手術による除去および下垂体機能低下症のコンフォメーション後にマトリゲル中に包埋された細胞を皮下移植した。（Ｂ〜Ｅ）ＡＣＴＨ（Ｂ）、ＧＨ（Ｃ）、ＬＨ（Ｄ）およびコルチコステロン（Ｅ）レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して、細胞の移植後７週間までの間に血清において定量化した。データは、個々の動物を表す各ドットで平均±ＳＥＭとしてプロットされている。対応する偽対照と比較した^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。（Ｆ）移植７週間後の移植片の免疫組織学分析。下垂体前葉腺の６つのホルモン系統のそれぞれに対する細胞は、移植片内で検出可能である。スケールバー：５０μｍ。（Ｇ）移植７週間後のＡＣＴＨを発現する細胞および対応する移植片の定量化。データは、それぞれの動物（合計３頭の動物）を表す各ドットに関する平均±ＳＥＭとしてプロットされている。

図２２Ａ〜２２Ｃは、化学的に定義された培地における「デフォルト」条件により、水晶体プラコードの特異化が生じることを示す。（Ａ）「デフォルト」条件（Ｅ６のみ）下での分化の３０日後に、水晶体マーカーＰＡＸ６について陽性に染色するレントイドボディ（明視野画像の丸で囲んだ構造）がはっきりと特定可能である。スケールバー：５０μｍ。さらなる９０日間の分化の後（１２０日目）、大半の細胞は、水晶体において優勢な構造タンパク質であるクリスタリンを発現している。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ）水晶体分化中のｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の時間経過。１２０日間分化した細胞は、水晶体に特徴的な転写物であるＰＩＴＸ３、ＣＲＹＡＡおよびＣＲＹＡＢを発現する。値は、未分化ＥＳ細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、４つの独立した連続実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。

図２３Ａ〜２３Ｂは、レポーター細胞株を使用する下垂体分化内の外胚葉亜型の定量化を示す。（Ａ）デフォルトプラコードまたは下垂体条件のいずれかで６および１１日間分化した細胞（異なるレポーター細胞株）をＳＯＸ１０、ＰＡＸ６またはＳＩＸ１の発現に対するフローサイトメトリーを使用して分析した。パーセンテージによる代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。（Ｂ）（Ａ）からのデータの定量化は、細胞の前頭蓋プラコードの特徴（ＳＩＸ１＋、ＰＡＸ６＋）を確認しつつ、神経堤細胞（ＳＯＸ１０＋）の夾雑が非常に少ないことを明らかとする。データは、２〜８つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。 図２３Ａ〜２３Ｂは、レポーター細胞株を使用する下垂体分化内の外胚葉亜型の定量化を示す。（Ａ）デフォルトプラコードまたは下垂体条件のいずれかで６および１１日間分化した細胞（異なるレポーター細胞株）をＳＯＸ１０、ＰＡＸ６またはＳＩＸ１の発現に対するフローサイトメトリーを使用して分析した。パーセンテージによる代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。（Ｂ）（Ａ）からのデータの定量化は、細胞の前頭蓋プラコードの特徴（ＳＩＸ１＋、ＰＡＸ６＋）を確認しつつ、神経堤細胞（ＳＯＸ１０＋）の夾雑が非常に少ないことを明らかとする。データは、２〜８つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてプロットされている。

図２４Ａ〜２４Ｂは、ｈＥＳＣの視床下部外胚葉への分化を示す。（Ａ）下垂体または視床下部条件のいずれかの下で、１５日間分化した細胞の免疫蛍光比較。細胞をＦＯＸＧ１（下垂体）またはＮＫＸ２．１（視床下部）のいずれかについて染色した。スケールバー：５０μｍ。（Ｂ）ＮＫＸ２．１およびＦＯＸＧ１をプロービングする下垂体または視床下部外胚葉の条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、６日目のプラコード細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、２〜４つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。

図２５Ａ〜２５Ｅは、ＳＩＸ１ノックインレポーター株の生成を示す。（Ａ）ｅＧＥＰ含有レポーターカセットを使用する内因性ＳＩＸ１ストップコドンのＴＡＬＥＮベースの標的化の略図。（Ｂ）ＳＩＸ１ホモロジーアームのすぐ外側のゲノム領域にアニーリングするプライマーを使用する標的化クローンのＰＣＲスクリーニング。クローン番号６を選択し、この研究に使用した。（Ｃ）正常なメス（ＸＸ）核型を示すＨ９ ＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰクローン番号６の核型。（Ｄ）ＧＦＰに対して陽性および陰性を選別したプラコード条件下で６日間分化したＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ細胞におけるＳＩＸ１の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、同じ実験からのＧＡＰＤＨおよび無選別細胞に対して正規化され、２つの技術的反復データを有する単一実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）内因性ＳＩＸ１（赤）および内因性ＳＩＸ１プロモーター（緑）の制御下でのＧＦＰについて染色する１１日目の下垂体細胞の免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。 図２５Ａ〜２５Ｅは、ＳＩＸ１ノックインレポーター株の生成を示す。（Ａ）ｅＧＥＰ含有レポーターカセットを使用する内因性ＳＩＸ１ストップコドンのＴＡＬＥＮベースの標的化の略図。（Ｂ）ＳＩＸ１ホモロジーアームのすぐ外側のゲノム領域にアニーリングするプライマーを使用する標的化クローンのＰＣＲスクリーニング。クローン番号６を選択し、この研究に使用した。（Ｃ）正常なメス（ＸＸ）核型を示すＨ９ ＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰクローン番号６の核型。（Ｄ）ＧＦＰに対して陽性および陰性を選別したプラコード条件下で６日間分化したＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ細胞におけるＳＩＸ１の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、同じ実験からのＧＡＰＤＨおよび無選別細胞に対して正規化され、２つの技術的反復データを有する単一実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）内因性ＳＩＸ１（赤）および内因性ＳＩＸ１プロモーター（緑）の制御下でのＧＦＰについて染色する１１日目の下垂体細胞の免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。

図２６は、単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する単一細胞におけるホルモン転写物の定量化を示す。「デフォルト」下垂体分化プロトコルの３０日目および６０日目からの単細胞ＰＣＲデータを少なくとも１つのホルモン転写物を発現する細胞について発掘した。データは、それぞれの転写物を発現する細胞のパーセンテージとしてプロットされている（適当な融解曲線と組み合わせたｃｔ＜３５サイクル）。

図２７は、実施例２の単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ実験で使用されたプライマーのリストを示す。 図２７は、実施例２の単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ実験で使用されたプライマーのリストを示す。

図２８は、実施例２で使用された抗体のリストを示す。

図２９Ａ〜２９Ｂは、多能性細胞の神経堤から誘導された細胞の分化を示す。（Ａ）多能性細胞は、ＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ４およびＣＨＩＲ９９０２１を補充したＥ６培地（すなわち、Ｅ６培地おける０日目〜２日目の培養）で２日間、ならびにＳＢ４３１５４２およびＣＨＩＲを補充したＥ６培地で２日目〜１１日目にわたって培養され、神経堤前駆細胞へと分化した。（Ｂ）神経堤前駆体は、２５日目に、ＭＡＳＨ１およびＩＳＬ１を発現する細胞へと自然に分化した。

図３０Ａ〜３０Ｂは、伝統的なＫＳＲベースの下垂体誘導の新たなｃＧＭＰにより利用可能な誘導との比較を示す。ＫＳＲベースの培地中のフィーダーで成長した細胞は、古いＤｉｎｃｅｒらのプロトコル（ＰＩＰ−ＫＳＲ）を使用して分化した。ＫＳＲのロット間変動を補うために、２種の濃度のＬＤＮ−１９３１８９を使用した。ＰＩＰ−Ｅ６プロトコルを使用するフィーダーを有さないＥｓｓｅｎｔｉａｌ８条件下で成長した細胞は並行して分化した。（Ａ）ＳＩＸ１、ＴＦＡＰ２Ａ、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＰＩＴＸ３およびＰＩＴＸ４をプロービングするＰＩＰ−ＫＳＲおよびＰＩＰ−Ｅ６条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、１５日目のＰＩＰ−Ｅ６細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、２つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｂ）ＰＩＰ−ＫＳＲまたはＰＩＰ−Ｅ６のいずれかの条件下で１５日間分化した細胞の免疫蛍光による比較。細胞をＳＩＸ１（全プラコード）またはＬＨＸ３（全下垂体）のいずれかについて染色した。スケールバー：５０μｍ。

図３１Ａ〜Ｅは、Ｅ８／Ｅ６における下垂体誘導プロトコルの細胞株の比較および組換えＳＨＨの小分子であるスムーズンドアゴニスト（smoothened agonist）による置きかえを示す。４つの異なるｈＥＳＣ株（Ｈ９ ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰクローン番号６を含む）および１つのｈｉＰＳＣ細胞株は、ｃＧＭＰにより利用可能な下垂体誘導プロトコルを使用して並行して分化した。（Ａ）頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１および全下垂体前葉遺伝子であるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３およびＬＨＸ４をプロービングする下垂体条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、３０日目の野生型Ｈ９細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、２〜４つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｂ）２つの下垂体前葉ホルモン転写物であるＰＯＭＣおよびＧＨ１をプロービングする、１５日目の選別なしで、下垂体条件下で分化した３０日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、３０日目の野生型Ｈ９細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｃ）異なるｈＰＳＣ株にわたる下垂体プラコード誘導の１５日目のタンパク質の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。ＳＨＨを小分子によって置きかえることができるかどうかを調査するために、組換えＳＨＨまたはＦＧＦ８およびＦＧＦ１０と組み合わせた小分子アゴニストであるパルモルファミンもしくはＳＡＧのいずれかを使用するｃＧＭＰにより利用可能な下垂体プラコード誘導プロトコルを使用して、細胞を分化させた。水晶体プラコードの分化を並行して実施し、陰性対照とした。（Ｄ）全下垂体遺伝子であるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＨＥＳＸ１およびホルモン転写物ＰＯＭＣ１および水晶体マーカーＰＩＴＸ３をプロービングする４日目からのＳＨＨ、パルモルファミンまたはＳＡＧのいずれかを使用する下垂体条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、１５日目の水晶体プラコードにおけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）ＳＨＨならびに小分子代替物であるパルモルファミンおよびＳＡＧを使用する、１５日目の下垂体プラコードのタンパク質の発現と水晶体誘導を比較する免疫蛍光分析。初期のレントイドボディ（まるで囲んだ構造）が頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１の発現を下方調節しはじめる一方、下垂体プラコードはＬＨＸ３の発現と組み合わせた高いＳＩＸ１発現を保持する。スケールバー：５０μｍ。 図３１Ａ〜Ｅは、Ｅ８／Ｅ６における下垂体誘導プロトコルの細胞株の比較および組換えＳＨＨの小分子であるスムーズンドアゴニスト（smoothened agonist）による置きかえを示す。４つの異なるｈＥＳＣ株（Ｈ９ ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰクローン番号６を含む）および１つのｈｉＰＳＣ細胞株は、ｃＧＭＰにより利用可能な下垂体誘導プロトコルを使用して並行して分化した。（Ａ）頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１および全下垂体前葉遺伝子であるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３およびＬＨＸ４をプロービングする下垂体条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、３０日目の野生型Ｈ９細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、２〜４つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｂ）２つの下垂体前葉ホルモン転写物であるＰＯＭＣおよびＧＨ１をプロービングする、１５日目の選別なしで、下垂体条件下で分化した３０日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、３０日目の野生型Ｈ９細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｃ）異なるｈＰＳＣ株にわたる下垂体プラコード誘導の１５日目のタンパク質の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。ＳＨＨを小分子によって置きかえることができるかどうかを調査するために、組換えＳＨＨまたはＦＧＦ８およびＦＧＦ１０と組み合わせた小分子アゴニストであるパルモルファミンもしくはＳＡＧのいずれかを使用するｃＧＭＰにより利用可能な下垂体プラコード誘導プロトコルを使用して、細胞を分化させた。水晶体プラコードの分化を並行して実施し、陰性対照とした。（Ｄ）全下垂体遺伝子であるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＨＥＳＸ１およびホルモン転写物ＰＯＭＣ１および水晶体マーカーＰＩＴＸ３をプロービングする４日目からのＳＨＨ、パルモルファミンまたはＳＡＧのいずれかを使用する下垂体条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、１５日目の水晶体プラコードにおけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）ＳＨＨならびに小分子代替物であるパルモルファミンおよびＳＡＧを使用する、１５日目の下垂体プラコードのタンパク質の発現と水晶体誘導を比較する免疫蛍光分析。初期のレントイドボディ（まるで囲んだ構造）が頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１の発現を下方調節しはじめる一方、下垂体プラコードはＬＨＸ３の発現と組み合わせた高いＳＩＸ１発現を保持する。スケールバー：５０μｍ。 図３１Ａ〜Ｅは、Ｅ８／Ｅ６における下垂体誘導プロトコルの細胞株の比較および組換えＳＨＨの小分子であるスムーズンドアゴニスト（smoothened agonist）による置きかえを示す。４つの異なるｈＥＳＣ株（Ｈ９ ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰクローン番号６を含む）および１つのｈｉＰＳＣ細胞株は、ｃＧＭＰにより利用可能な下垂体誘導プロトコルを使用して並行して分化した。（Ａ）頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１および全下垂体前葉遺伝子であるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３およびＬＨＸ４をプロービングする下垂体条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、３０日目の野生型Ｈ９細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、２〜４つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｂ）２つの下垂体前葉ホルモン転写物であるＰＯＭＣおよびＧＨ１をプロービングする、１５日目の選別なしで、下垂体条件下で分化した３０日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、３０日目の野生型Ｈ９細胞におけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｃ）異なるｈＰＳＣ株にわたる下垂体プラコード誘導の１５日目のタンパク質の発現を比較する免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。ＳＨＨを小分子によって置きかえることができるかどうかを調査するために、組換えＳＨＨまたはＦＧＦ８およびＦＧＦ１０と組み合わせた小分子アゴニストであるパルモルファミンもしくはＳＡＧのいずれかを使用するｃＧＭＰにより利用可能な下垂体プラコード誘導プロトコルを使用して、細胞を分化させた。水晶体プラコードの分化を並行して実施し、陰性対照とした。（Ｄ）全下垂体遺伝子であるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＨＥＳＸ１およびホルモン転写物ＰＯＭＣ１および水晶体マーカーＰＩＴＸ３をプロービングする４日目からのＳＨＨ、パルモルファミンまたはＳＡＧのいずれかを使用する下垂体条件下で分化した１５日目の細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、１５日目の水晶体プラコードにおけるＧＡＰＤＨおよび発現に対して正規化され、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）ＳＨＨならびに小分子代替物であるパルモルファミンおよびＳＡＧを使用する、１５日目の下垂体プラコードのタンパク質の発現と水晶体誘導を比較する免疫蛍光分析。初期のレントイドボディ（まるで囲んだ構造）が頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１の発現を下方調節しはじめる一方、下垂体プラコードはＬＨＸ３の発現と組み合わせた高いＳＩＸ１発現を保持する。スケールバー：５０μｍ。

図３２は、単一細胞のｑ−ＲＴ ＰＣＲによって得られた各細胞および遺伝子の生のｃｔ値のヒートマップを示す。あらゆる単一細胞ＰＣＲの実行について得られたあらゆる細胞および遺伝子に対する生のｃｔ値が未処理のヒートマップとして示されている。 図３２は、単一細胞のｑ−ＲＴ ＰＣＲによって得られた各細胞および遺伝子の生のｃｔ値のヒートマップを示す。あらゆる単一細胞ＰＣＲの実行について得られたあらゆる細胞および遺伝子に対する生のｃｔ値が未処理のヒートマップとして示されている。 図３２は、単一細胞のｑ−ＲＴ ＰＣＲによって得られた各細胞および遺伝子の生のｃｔ値のヒートマップを示す。あらゆる単一細胞ＰＣＲの実行について得られたあらゆる細胞および遺伝子に対する生のｃｔ値が未処理のヒートマップとして示されている。 図３２は、単一細胞のｑ−ＲＴ ＰＣＲによって得られた各細胞および遺伝子の生のｃｔ値のヒートマップを示す。あらゆる単一細胞ＰＣＲの実行について得られたあらゆる細胞および遺伝子に対する生のｃｔ値が未処理のヒートマップとして示されている。 図３２は、単一細胞のｑ−ＲＴ ＰＣＲによって得られた各細胞および遺伝子の生のｃｔ値のヒートマップを示す。あらゆる単一細胞ＰＣＲの実行について得られたあらゆる細胞および遺伝子に対する生のｃｔ値が未処理のヒートマップとして示されている。

図３３は、単一細胞ｑ−ＲＴ ＰＣＲの結果および単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する単一細胞におけるホルモン転写物の定量化についての免疫蛍光検証を示す。下垂体条件下で分化した１５日目および３０日目の免疫蛍光分析。細胞は、前駆体マーカーであるＨＥＳＸ１および一過的副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞マーカーであるＮＥＵＲＯＤ１について共染色された。スケールバー：５０μｍ。

図３４Ａ〜３４Ｂは、ホルモンのサブクラスに特異的なマーカーを特定するための表面マーカーによるスクリーニングを示す。（Ａ）実験手順の略図。（Ｂ）スクリーニング結果のヒートマップ。パーセンテージは、それぞれのマーカーに対して陽性に染色する細胞を示す。 図３４Ａ〜３４Ｂは、ホルモンのサブクラスに特異的なマーカーを特定するための表面マーカーによるスクリーニングを示す。（Ａ）実験手順の略図。（Ｂ）スクリーニング結果のヒートマップ。パーセンテージは、それぞれのマーカーに対して陽性に染色する細胞を示す。

図３５は、損傷していない動物における内因性ラットホルモンと損傷した動物の移植片から誘導されたヒトホルモンの比較を示す。図２１Ａ〜Ｇで示された移植片から誘導されたホルモンのレベル（５週目）を損傷していないラットの内因性ホルモンのレベルと比較する。

図３６は、本開示の主題のある特定の実施形態に従って分化機序を示す。

図３７Ａ〜３７Ｇは、ＢＭＰシグナル伝達が、ＮＮＥを得るために必須であることを示す。（Ａ）ＫＳＲをＥ６に置換することによる分化ストラテジーの略図。（Ｂ）ｈＰＳＣの外胚葉系統への分化中の特定の系統マーカーの代表的な免疫蛍光染色。（Ｃ）神経板境界モデルおよび特定の細胞運命に影響を及ぼす重要なシグナル伝達経路の表示。（Ｄ）様々な濃度のＢＭＰ４で３日間処理した、分化する細胞の免疫蛍光染色。（Ｅ）３日の処理後の様々なＢＭＰ４濃度でのＴＦＡＰ２Ａ＋細胞の定量化。値は、平均±ＳＥＭを表す。（Ｆ）ＴＦＡＰ２Ａ＋、ＰＡＸ６−、ＳＩＸ１−、およびＳＯＸ１０−ＮＮＥの誘導が、高濃度のＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）を使用することにより達成される。（Ｇ）２つの異なる時点におけるＮＮＥのさらなる分化に基づくケラチノサイトマーカーＫ１８およびＫ１４の免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。 図３７Ａ〜３７Ｇは、ＢＭＰシグナル伝達が、ＮＮＥを得るために必須であることを示す。（Ａ）ＫＳＲをＥ６に置換することによる分化ストラテジーの略図。（Ｂ）ｈＰＳＣの外胚葉系統への分化中の特定の系統マーカーの代表的な免疫蛍光染色。（Ｃ）神経板境界モデルおよび特定の細胞運命に影響を及ぼす重要なシグナル伝達経路の表示。（Ｄ）様々な濃度のＢＭＰ４で３日間処理した、分化する細胞の免疫蛍光染色。（Ｅ）３日の処理後の様々なＢＭＰ４濃度でのＴＦＡＰ２Ａ＋細胞の定量化。値は、平均±ＳＥＭを表す。（Ｆ）ＴＦＡＰ２Ａ＋、ＰＡＸ６−、ＳＩＸ１−、およびＳＯＸ１０−ＮＮＥの誘導が、高濃度のＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）を使用することにより達成される。（Ｇ）２つの異なる時点におけるＮＮＥのさらなる分化に基づくケラチノサイトマーカーＫ１８およびＫ１４の免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。

図３８Ａ〜３８Ｉは、ＢＭＰ勾配がＮＣおよびＣＰ細胞を誘導するのに十分であることを示す。（Ａ）ＢＭＰ４の勾配を使用するＳＩＸ１：：ＧＦＰ＋プラコードの発現。群内のそれぞれのバーは、独立した反復を表す。（Ｂ）分化中のＦＧＦ２またはＦＧＦ８での細胞の処理後のＳＩＸ：：ＧＦＰの定量化。（Ｃ）分化に沿った２つの異なる時点中の前部マーカーＰＡＸ６およびＳＩＸ３の定量的ＰＣＲ。値は、平均±ＳＥＭを表す。（Ｄ）３０日目の水晶体プラコード培養物におけるＣＲＹＡＡおよびＣＲＹＡＢの免疫蛍光染色。（Ｅ）ＷＮＴシグナルの添加後のＷＮＴおよびＰＡＸ３＋三叉神経プラコードの非存在下でのＰＡＸ６＋水晶体プラコードの免疫蛍光染色。（Ｆ）ＢＭＰ４の勾配を使用するＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋ＮＣの発現。群内のそれぞれのバーは、独立した反復を表す。（Ｇ）６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するまたは含有しない様々な濃度のＢＭＰ４で３日間処理した、分化する細胞の免疫蛍光染色。（Ｈ）自然に分化したＮＣ細胞の、自律および感覚ニューロンをそれぞれ表すＡＳＣＬ１およびＩＳＬ１ニューロンを生成するそれらの能力についての、免疫蛍光染色。（Ｉ）分化した感覚および自律ニューロンを用いてグルタミン酸に対する応答についてのカルシウムイメージングを行った。値は、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー、５０ｍｍ。 図３８Ａ〜３８Ｉは、ＢＭＰ勾配がＮＣおよびＣＰ細胞を誘導するのに十分であることを示す。（Ａ）ＢＭＰ４の勾配を使用するＳＩＸ１：：ＧＦＰ＋プラコードの発現。群内のそれぞれのバーは、独立した反復を表す。（Ｂ）分化中のＦＧＦ２またはＦＧＦ８での細胞の処理後のＳＩＸ：：ＧＦＰの定量化。（Ｃ）分化に沿った２つの異なる時点中の前部マーカーＰＡＸ６およびＳＩＸ３の定量的ＰＣＲ。値は、平均±ＳＥＭを表す。（Ｄ）３０日目の水晶体プラコード培養物におけるＣＲＹＡＡおよびＣＲＹＡＢの免疫蛍光染色。（Ｅ）ＷＮＴシグナルの添加後のＷＮＴおよびＰＡＸ３＋三叉神経プラコードの非存在下でのＰＡＸ６＋水晶体プラコードの免疫蛍光染色。（Ｆ）ＢＭＰ４の勾配を使用するＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋ＮＣの発現。群内のそれぞれのバーは、独立した反復を表す。（Ｇ）６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するまたは含有しない様々な濃度のＢＭＰ４で３日間処理した、分化する細胞の免疫蛍光染色。（Ｈ）自然に分化したＮＣ細胞の、自律および感覚ニューロンをそれぞれ表すＡＳＣＬ１およびＩＳＬ１ニューロンを生成するそれらの能力についての、免疫蛍光染色。（Ｉ）分化した感覚および自律ニューロンを用いてグルタミン酸に対する応答についてのカルシウムイメージングを行った。値は、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー、５０ｍｍ。

図３９Ａ〜３９Ｂは、新規分化ストラテジーが、様々なヒト胚性および誘導ＰＳＣに適用可能であることを示す。（Ａ）異なる外胚葉系統をマークするために有効な抗体のハイコンテントイメージングに使用した代表的画像。（Ｂ）特定の分化中の陽性細胞のパーセンテージの定量化。生物学的反復（ｎ＝４）および技術的反復（１生物学的反復当たりｎ＝２）を行い、定量化した。スケールバー、５０ｍｍ。 図３９Ａ〜３９Ｂは、新規分化ストラテジーが、様々なヒト胚性および誘導ＰＳＣに適用可能であることを示す。（Ａ）異なる外胚葉系統をマークするために有効な抗体のハイコンテントイメージングに使用した代表的画像。（Ｂ）特定の分化中の陽性細胞のパーセンテージの定量化。生物学的反復（ｎ＝４）および技術的反復（１生物学的反復当たりｎ＝２）を行い、定量化した。スケールバー、５０ｍｍ。

図４０Ａ〜４０Ｊは、血清代替条件での４種の外胚葉系統へのｈＰＳＣの分化が領域パターン化に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）ノックアウト血清代替物を使用する４種の外胚葉系統への分化のための一般的ストラテジーの概略図。（Ｂ）分化の終了時（すなわち、１２日目）の細胞アイデンティティを識別する転写因子発現の組合せ。（Ｃ）ドナープラスミドのＰａｘ６遺伝子座への標的化の概略図。（Ｄ）レポーター導入遺伝子を有するクローンを特定するためのゲノムＤＮＡのＰＣＲ。Ｅ．神経外胚葉形成中のＰａｘ６およびＧＦＰについての細胞内ＦＡＣＳ。（Ｆ）無選別のＳｉｘ１−ＧＦＰ陽性およびＳｉｘ１−ＧＦＰ陰性細胞におけるＳｉｘ１についての定量的ＰＣＲ。（Ｇ）分化の１２日目のＧＦＰのＰＡＸ６、ＳＩＸ１およびＳＯＸ１０ ＧＦＰレポーター株の発現。（Ｈ）特異的系統に分化されるＧＦＰのパーセンテージの定量化。（Ｉ）いくつかのノックアウト血清代替物ロットを、神経外胚葉を生成する能力について試験し（３つを提示する）、ＰＡＸ６の発現、および幹細胞因子ＯＣＴ４の下方調節について判定した。（Ｊ）Ｉと同様に、ＳＯＸ１の発現は、ＫＳＲのロット間で一貫しているが、前部マーカーＦＯＸＧ１は、ＷＮＴ阻害剤であるＸＡＶ−９３９の存在下でも可変的である。スケールバー ５０μｍ。 図４０Ａ〜４０Ｊは、血清代替条件での４種の外胚葉系統へのｈＰＳＣの分化が領域パターン化に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）ノックアウト血清代替物を使用する４種の外胚葉系統への分化のための一般的ストラテジーの概略図。（Ｂ）分化の終了時（すなわち、１２日目）の細胞アイデンティティを識別する転写因子発現の組合せ。（Ｃ）ドナープラスミドのＰａｘ６遺伝子座への標的化の概略図。（Ｄ）レポーター導入遺伝子を有するクローンを特定するためのゲノムＤＮＡのＰＣＲ。Ｅ．神経外胚葉形成中のＰａｘ６およびＧＦＰについての細胞内ＦＡＣＳ。（Ｆ）無選別のＳｉｘ１−ＧＦＰ陽性およびＳｉｘ１−ＧＦＰ陰性細胞におけるＳｉｘ１についての定量的ＰＣＲ。（Ｇ）分化の１２日目のＧＦＰのＰＡＸ６、ＳＩＸ１およびＳＯＸ１０ ＧＦＰレポーター株の発現。（Ｈ）特異的系統に分化されるＧＦＰのパーセンテージの定量化。（Ｉ）いくつかのノックアウト血清代替物ロットを、神経外胚葉を生成する能力について試験し（３つを提示する）、ＰＡＸ６の発現、および幹細胞因子ＯＣＴ４の下方調節について判定した。（Ｊ）Ｉと同様に、ＳＯＸ１の発現は、ＫＳＲのロット間で一貫しているが、前部マーカーＦＯＸＧ１は、ＷＮＴ阻害剤であるＸＡＶ−９３９の存在下でも可変的である。スケールバー ５０μｍ。 図４０Ａ〜４０Ｊは、血清代替条件での４種の外胚葉系統へのｈＰＳＣの分化が領域パターン化に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）ノックアウト血清代替物を使用する４種の外胚葉系統への分化のための一般的ストラテジーの概略図。（Ｂ）分化の終了時（すなわち、１２日目）の細胞アイデンティティを識別する転写因子発現の組合せ。（Ｃ）ドナープラスミドのＰａｘ６遺伝子座への標的化の概略図。（Ｄ）レポーター導入遺伝子を有するクローンを特定するためのゲノムＤＮＡのＰＣＲ。Ｅ．神経外胚葉形成中のＰａｘ６およびＧＦＰについての細胞内ＦＡＣＳ。（Ｆ）無選別のＳｉｘ１−ＧＦＰ陽性およびＳｉｘ１−ＧＦＰ陰性細胞におけるＳｉｘ１についての定量的ＰＣＲ。（Ｇ）分化の１２日目のＧＦＰのＰＡＸ６、ＳＩＸ１およびＳＯＸ１０ ＧＦＰレポーター株の発現。（Ｈ）特異的系統に分化されるＧＦＰのパーセンテージの定量化。（Ｉ）いくつかのノックアウト血清代替物ロットを、神経外胚葉を生成する能力について試験し（３つを提示する）、ＰＡＸ６の発現、および幹細胞因子ＯＣＴ４の下方調節について判定した。（Ｊ）Ｉと同様に、ＳＯＸ１の発現は、ＫＳＲのロット間で一貫しているが、前部マーカーＦＯＸＧ１は、ＷＮＴ阻害剤であるＸＡＶ−９３９の存在下でも可変的である。スケールバー ５０μｍ。

図４１Ａ〜４１Ｇは、外胚葉への分化が化学的に規定したシステムにおいてＣＮＳへの偏りを生じることを示す。（Ａ）小分子の非存在下、ＳＢの添加下、およびＬＤＮとＳＢの添加下での、Ｐａｘ６：：ＧＦＰ陽性細胞の定量化。（Ｂ）ロゼット段階の細胞を示す、ＺＯ−１およびＳＯＸ２の免疫蛍光染色。（Ｃ）ＴＵＪ−１およびＴＢＲ１で染色したニューロンへのロゼットの分化。（Ｄ）皮質ニューロン（分化の５０日目）は、グルタミン酸に対する応答を示す。（Ｅ）神経堤およびプラコードへの分化それぞれにおけるＰＡＸ６でのＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の免疫蛍光染色。（Ｆ）ＥにおけるＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ発現の定量化。（Ｇ）ＫＳＲおよびＥ６における神経堤の分化中の一般的な最初期遺伝子の定量的ＰＣＲ。 図４１Ａ〜４１Ｇは、外胚葉への分化が化学的に規定したシステムにおいてＣＮＳへの偏りを生じることを示す。（Ａ）小分子の非存在下、ＳＢの添加下、およびＬＤＮとＳＢの添加下での、Ｐａｘ６：：ＧＦＰ陽性細胞の定量化。（Ｂ）ロゼット段階の細胞を示す、ＺＯ−１およびＳＯＸ２の免疫蛍光染色。（Ｃ）ＴＵＪ−１およびＴＢＲ１で染色したニューロンへのロゼットの分化。（Ｄ）皮質ニューロン（分化の５０日目）は、グルタミン酸に対する応答を示す。（Ｅ）神経堤およびプラコードへの分化それぞれにおけるＰＡＸ６でのＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の免疫蛍光染色。（Ｆ）ＥにおけるＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ発現の定量化。（Ｇ）ＫＳＲおよびＥ６における神経堤の分化中の一般的な最初期遺伝子の定量的ＰＣＲ。

図４２Ａ〜４２Ｄは、外胚葉系統への分化ストラテジーが、他の多能性幹細胞株に適用可能であることを示す。（Ａ）外胚葉の分化に関する免疫蛍光染色の代表的画像。（Ｂ）分化中の特定のマーカーに対して陽性の細胞のパーセンテージに関する定量化。（Ｃ）本研究における精製ヒト神経堤細胞と比較した精製ニワトリ神経堤のデータセットの比較分析。超幾何分布を使用して重なりの有意性を試験した。（Ｄ）Ｃにおけるベン図からの共通している遺伝子のリスト。スケールバー ５０μｍ。 図４２Ａ〜４２Ｄは、外胚葉系統への分化ストラテジーが、他の多能性幹細胞株に適用可能であることを示す。（Ａ）外胚葉の分化に関する免疫蛍光染色の代表的画像。（Ｂ）分化中の特定のマーカーに対して陽性の細胞のパーセンテージに関する定量化。（Ｃ）本研究における精製ヒト神経堤細胞と比較した精製ニワトリ神経堤のデータセットの比較分析。超幾何分布を使用して重なりの有意性を試験した。（Ｄ）Ｃにおけるベン図からの共通している遺伝子のリスト。スケールバー ５０μｍ。 図４２Ａ〜４２Ｄは、外胚葉系統への分化ストラテジーが、他の多能性幹細胞株に適用可能であることを示す。（Ａ）外胚葉の分化に関する免疫蛍光染色の代表的画像。（Ｂ）分化中の特定のマーカーに対して陽性の細胞のパーセンテージに関する定量化。（Ｃ）本研究における精製ヒト神経堤細胞と比較した精製ニワトリ神経堤のデータセットの比較分析。超幾何分布を使用して重なりの有意性を試験した。（Ｄ）Ｃにおけるベン図からの共通している遺伝子のリスト。スケールバー ５０μｍ。

図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０ ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー ５０μｍ。 図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０ ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー ５０μｍ。 図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０ ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー ５０μｍ。 図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０ ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー ５０μｍ。 図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０ ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー ５０μｍ。

図４４Ａ〜４４Ｂは、化学的スクリーニングからの他のヒットの検証がＳＩＸ１：：ＧＦＰ発現の有意差を生じさせなかったことを示す。（Ａ）分化するプラコード細胞のＢＲＬ−５４４４３での処理後のＳＩＸ１発現の定量化。（Ｂ）Ａの場合と同様だが、パルテノライドを用いる。

５．発明の詳細な説明
本開示の主題は、ヒト幹細胞の、１つまたは複数の神経外胚葉、神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する細胞への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、およびこのような方法によって生成される細胞、およびこのような細胞を含む組成物に関する。また、神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。

限定としてではなく、開示の明確性を目的として、詳細な説明は以下の小項目に分割される：
５．１．定義；
５．２．幹細胞を分化させる方法；
５．３ 分化した細胞集団を含む組成物；
５．４ 神経変性および下垂体障害を処置する方法；
５．５．キット
５．６ 治療用化合物をスクリーニングする方法；および
５．７ ＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥの運命を増加させる化合物についてスクリーニングする方法。

５．１ 定義
この明細書において使用される用語は、一般に、この発明の文脈の中で、および各用語が使用される具体的な文脈で、当技術分野における通常の意味を有する。ある特定の用語については、本発明の組成物および方法ならびに本発明の組成物の作製方法および使用方法を説明する際に、専門家にさらなるガイダンスを与えるために、以下で、または本明細書の他の場所で論じられる。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、部分的に特定の値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に応じて、当業者によって決定されるその値に対する許容される誤差範囲を意味する。例えば、「約」は、当技術分野の実施によって、３または３超の標準偏差内を意味する場合がある。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、例えば１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味する場合がある。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスについて、この用語は、例えば値の５倍以内または２倍以内といった１桁内を意味する。

本明細書で使用する場合、「シグナルトランスダクションタンパク質」に関する用語「シグナル伝達」は、活性化されるかまたはそうでなければ、膜受容体タンパク質へのリガンド結合もしくはいくつかの他の刺激によって影響を受けるタンパク質を指す。シグナルトランスダクションタンパク質の例として、これらに限定されないが、ＳＭＡＤ、ベータ−カテニンを含むウィングレス（Ｗｎｔ）複合体タンパク質、ＮＯＴＣＨ、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が挙げられる。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質に関して、リガンド−受容体相互作用は、細胞の応答に直接的には結び付かない。リガンドによって活性化された受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理学的効果が生じる前に、細胞の内部で他のタンパク質とまず相互作用しうる。いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動はしばしば、受容体活性化または阻害後に変更される。受容体活性化によって誘導される細胞変化一式が、シグナルトランスダクション機構またはシグナル伝達経路と称される。

本明細書で使用される場合、用語「シグナル」は、細胞構造および機能における変化を制御する内部および外部因子を指す。これらは、本質的に化学的であっても物理的であってもよい。

本明細書で使用される場合、用語「リガンド」は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば形質転換成長因子−ベータ（ＴＦＧβ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。

「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げる（例えば、低減させる、減少させる、抑制する、排除する、または遮断する）化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。阻害剤は、特定のタンパク質（シグナル伝達分子、特定のシグナル伝達分子に関与する任意の分子、特定の関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、本明細書に記載されているシグナル伝達分子が挙げられるがこれに限定されない）の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子でありうる。例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、一例として、ＳＭＡＤシグナル伝達に直接接触すること、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡに接触すること、ＳＭＡＤのコンフォメーションを変化させること、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、またはＳＭＡＤのシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されているものを含む）との相互作用を妨げること、およびＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されているもの）の発現に影響を及ぼすことによって、機能し得る。阻害剤は、シグナル伝達分子を上流で（例えば、細胞外ドメイン内で）妨害することによって、例えばＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子も含む。ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤分子と効果の例として以下が挙げられる：骨形成タンパク質を捕捉するノギンは、ＡＬＫ受容体１、２、３、および６の活性化を阻害し、したがって下流でＳＭＡＤ活性化を防止する。さらに、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎは、同様に、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化剤を捕捉する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を捕捉する偽受容体として作用する。他のＳＭＡＤ阻害剤としては、ドルソモルフィンが挙げられる。アクチビン、ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβおよびＢＭＰを遮断する抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化剤などを中和するために使用することが企図される。前述の例はＳＭＡＤシグナル伝達の阻害に関するが、同様または類似する機構を使用して他のシグナル伝達分子を阻害することができる。阻害剤の例として、これらに限定されないが、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害に対するＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）（ＬＳＢ）、Ｗｎｔ阻害に対するＸＡＶ９３９（Ｘ）、ならびにＦＧＦシグナル伝達阻害に対するＳＵ５４０２（Ｓ）が挙げられる。

阻害剤は、特定のシグナル伝達分子の上流で分子に結合して影響を及ぼし、順次、特定の分子の阻害を引き起こすことによって誘導される阻害に加えて、競合阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除するかまたは低減させるように活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（タンパク質のコンフォメーションを変化させるようにタンパク質に結合して、そのタンパク質の活性部位への化合物の結合を妨げる）に関して記載されている。阻害剤は、シグナル伝達の標的と実際に接触することによって、シグナル伝達の標的またはシグナル伝達の標的経路を阻害する「直接阻害剤」でありうる。

「活性化剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能、例えばＷｎｔシグナル伝達、ＢＭＰシグナル伝達、ＦＧＦシグナル伝達などの活性化を増大させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、または増強する化合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「誘導体」は、類似するコア構造を有する化学化合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」または「細胞集団」は、少なくとも２個の細胞の群を指す。非限定例では、細胞集団は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００の細胞、少なくとも約５，０００の細胞または少なくとも約１０，０００の細胞または少なくとも約１００，０００の細胞または少なくとも約１，０００，０００の細胞を含むことができる。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団、例えばＮＥ、ＣＰ、ＮＣまたはＮＮＥ前駆体の集団、または未分化幹細胞の集団であってもよい。あるいは、集団は、２種以上の細胞型を含んでもよい（例えば、混合細胞集団）。

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、培養下で無期限に分裂して、特化した細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞とは、ヒト由来の幹細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」および「ＥＳＣ」は、培養下で長期間分化せずに分裂することができる移植前の段階の胚から誘導され、３つの一次胚葉の細胞および組織に発生することが知られている原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトに由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」は、培養下で長期間分化せずに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発生することが知られている、初期段階のヒト胚から胚盤胞期までおよび胚盤胞期を含む胚から誘導される１種の多能性幹細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞株」は、数日、数カ月から数年までの間、分化せずに増殖可能であるｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。

本明細書で使用される場合、用語「全能性」は、体の全ての細胞型、および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じる能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「多分化能」（multipotent）は、体の２種以上の細胞型に発生する能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「多能性」（pluripotent）は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む生物の発生における３つの胚葉に発生する能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、胚性幹細胞と同様に、ある特定の胚性遺伝子（例えば、これらに限定されないが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年）を参照のこと）を体細胞（例えば、ＣＩ ４、Ｃ７２など）に導入することによって形成された１種の多能性幹細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「体細胞」は、配偶子（卵子または精子）以外の体内の任意の細胞を指し、「成体」細胞と称されることもある。

本明細書で使用される場合、用語「体性（成体）幹細胞」は、自己再生（実験室における）と分化の両方に対する能力が制限された多くの器官および分化した組織において見られる比較的稀な未分化細胞を指す。このような細胞は、これらの分化能において変化するが、通常、起源となる器官の細胞型に限定される。

本明細書で使用される場合、用語「ニューロン」は神経系の主な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体とその突起、すなわち軸索と１つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって、情報を他のニューロンまたは細胞に伝達する。

本明細書で使用される場合、用語「増殖」は、細胞数の増加を指す。

本明細書で使用される場合、用語「未分化」は、特化した細胞型に未だ発生していない細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特化していない胚性細胞が、ニューロン、心臓、肝臓、または筋肉細胞などの特化した細胞の特徴を獲得する工程を指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれたタンパク質に関与するシグナル伝達経路を通って、細胞の遺伝子と細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御されている。

本明細書で使用される場合、用語「誘導された分化」は、神経、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉の前駆体などの特定の（例えば、所望の）細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。

本明細書で使用される場合、幹細胞に関する用語「誘導された分化」は、多能性状態からより成熟したまたは特化した細胞運命への幹細胞の遷移を促進する小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。

本明細書で使用される場合、細胞に関する用語「分化を誘導する」は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって、「幹細胞における分化を誘導すること」は、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子解析によって決定される遺伝子発現における変化）および／または表現型（例えばＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ３およびＴＦＡＰ２Ａのタンパク質の発現における変化）を有する子孫細胞へ分裂するように幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を誘導することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「細胞培養」は、研究または医学的処置のための人工培地におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。

本明細書で使用される場合、用語「培養培地」は、培養容器、例えばペトリ皿、マルチウェルプレートなどにおいて細胞を覆い、細胞を養い、支持する栄養物を含有する液体を指す。培養培地は、細胞において所望の変化をもたらすために添加される成長因子も含む。

本明細書で使用する場合、用語、細胞を化合物（例えば、１種または複数の阻害剤、活性化剤、および／または誘導剤）と「接触させること」は、細胞を化合物に曝露すること、例えば、細胞に接触させることが可能な位置に化合物を置くことを指す。接触させることは、任意の適切な方法を使用して達成されてもよい。例えば、接触させることは、細胞の管に化合物を添加することによって達成することができる。また、接触させることは、細胞を含む培養培地に化合物を添加することによって達成されてもよい。化合物（例えば、本明細書で開示されている阻害剤および活性化剤）のそれぞれを、溶液（例えば、濃縮溶液）として細胞を含む培養培地に添加することができる。あるいはまたはさらに、化合物（例えば、本明細書で開示されている阻害剤および活性化剤）および細胞は、配合された細胞培養培地中に存在することができる。

有効量は、所望の効果を生じる量である。

本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。例示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、これらに限定されないが、試験管および細胞培養である。

本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で起こるプロセスまたは反応、例えば胚発生、細胞分化、神経管形成などを指す。

本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する用語「発現すること」は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察することができるｍＲＮＡまたはタンパク質を作製することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「マーカー」または「細胞マーカー」は、特定の細胞または細胞型を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞に対するマーカーは、１種のマーカーに限定されず、マーカーは、指定されたマーカー群が、別の細胞または細胞型からある細胞または細胞型を特定することができるようなマーカーの「パターン」を指す場合がある。

本明細書で使用される場合、本明細書で開示されている任意の細胞に言及した場合の用語「から誘導される」または「から確立される」または「から分化させる」は、任意の操作、例えば、限定せずに、単細胞単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルス感染、ＤＮＡ配列を用いる、例えばモルフォゲンなどを用いるトランスフェクション、培養された親細胞に含有される任意の細胞の選択（例えば、連続培養による）を使用する処置および／または変異誘発を使用して、細胞株、組織（例えば、解離させた胚）、または体液における親細胞から得られた（例えば、単離された、精製されたなど）細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子に対する応答、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などにより、混合集団から選択されうる。

本明細書における「個体」または「被験体」は、脊椎動物、例えばヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物として、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技動物、げっ歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定例として、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、細胞、組織、または器官の通常の機能に損傷を与えるかまたはそれらを妨げる任意の状態または障害を指す。

本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」は、処置される個体または細胞の疾患経過を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防としてかまたは臨床病理の経過中かのいずれかで実施されうる。処置の治療効果として、限定されず、疾患の発生または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的なまたは間接的な病理学的帰結の減弱、転移を予防すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）または軽減、および寛解または改善された予後が挙げられる。疾患または障害の進行を予防することによって、処置によって、罹患したもしくは診断された被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害に起因する悪化が予防されうるが、処置によって、障害のリスクを有する被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害または障害の症状の発症も予防することができる。

５．２ 幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定例として、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化の可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。

本開示の主題は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化を伴う、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害であって、ＢＭＰシグナル伝達が、細胞の有効量の１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤およびＢＭＰ活性化剤への最初の接触の少なくとも２日後に活性化され、細胞を有効量の１種または複数のＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ系統に特異的な活性化剤および阻害剤とさらに接触させる阻害によって、神経堤（ＮＣ）、頭蓋プラコード（ＣＰ）および非神経外胚葉（ＮＮＥ）の非ＣＮＳ外胚葉系統をヒト幹細胞から分化させることができるという発見に、少なくとも部分的に基づく。例えば、幹細胞は、細胞を有効量の１種または複数のＷｎｔ活性化剤とさらに接触させることによってＮＣに分化させることができ、ＣＰは、幹細胞を有効量の１種または複数のＦＧＦの活性化剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができ、ＮＮＥは、幹細胞を有効量の１種または複数のＦＧＦの阻害剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができる。

ある特定の実施形態では、本開示の分化方法は、ヒト幹細胞の集団を、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害をもたらす形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤の有効量と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｎｏｄａｌ、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、またはそれらのシグナル経路を受容体および下流のエフェクターを遮断することによって遮断する。

ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤の非限定例は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１０／０９６４９６、ＷＯ／２０１１／１４９７６２、ＷＯ／２０１３／０６７３６２、ＷＯ／２０１４／１７６６０６、ＷＯ／２０１５／０７７６４８、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７巻、２７５〜２８０頁（２００９年）、およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０巻、７１５〜７２０頁（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＳＢ４３１５４２」は、番号がＣＡＳ３０１８３６−４１−９、分子式がＣ_２２Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_３、名称が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドである分子を指す。例えば、以下の構造を参照のこと：

５．２．１ 神経堤（ＮＣ）前駆体を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、非ＣＮＳ前駆体が神経堤（ＮＣ）前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤（例えば、約１ｎｇ／ｍＬの濃度で）、および有効量のウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性化剤を、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、もしくは少なくとも約５日間、または約２日まで、約３日まで、約４日まで、約５日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤を少なくとも約２日間、細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤およびＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を細胞に同時に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤およびＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤およびＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を、約６日間もしくは約６日まで、約７日まで、約８日まで、約９日まで、約１０日まで、約１１日まで、約１２日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞を、Ｗｎｔ活性化剤およびＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と、約１２日間またはそれより長い間、接触させる。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔ活性化剤の濃度は、細胞がＷｎｔシグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約２日後、または約３日後、または約４日後に増加する。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度が、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％まで増加する。特定の実施形態では、Ｗｎｔの濃度は、細胞をＷｎｔ活性化剤に接触させた２日後に、約５０％まで増加する。

ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、検出可能なレベルのＳＯＸ１０を発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％もしくは約６０％またはそれより多くが検出可能なレベルのＳＯＸ１０を発現する。

ある特定の実施形態では、細胞を約１μＭから約２０μＭの間、約２μＭから約１８μＭの間、約４μＭから約１６μＭの間、約６μＭから約１４μＭの間、または約８μＭから約１２μＭの間の濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１０μＭの濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約０．０１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌの間、約０．１ｎｇ／ｍｌから約２ｎｇ／ｍＬの間、または約１ｎｇ／ｍｌから約１．５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約１ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を約５０ｎＭから２μＭの間、約１００ｎＭから１．５μＭの間、約１５０ｎＭから１μＭの間、約２００ｎＭから９５０ｎＭの間、約２５０ｎＭから約９００ｎＭの間、約３００ｎＭから約８５０ｎＭの間、約３５０ｎＭから約８００ｎＭの間、約４００ｎＭから約７５０ｎＭの間、約４５０ｎＭから約７００ｎＭの間、約５００ｎＭから約６５０ｎＭの間、または約５５０ｎＭから約６００ｎＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約６００ｎＭまたは約１．５μＭの濃度でＷｎｔシグナル伝達の活性化剤と接触させる。

特定の実施形態では、ヒト幹細胞を、１種または複数のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（１０μＭ）と１２日までの間またはそれより長い間、１種または複数のＢＭＰシグナル伝達の活性化剤（１ｎｇ／ｍＬ）と２日間または３日間までの間、および１種または複数のウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化剤（６００ｎＭを０日目〜２日目、および１．５μＭを２日目または３日目以降から）と１２日までの間またはそれより長い間、接触させることによって、非ＣＮＳ ＮＣ前駆体をヒト幹細胞から分化させ、ここで、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤、およびＷｎｔシグナル伝達の活性化剤を細胞に同時に接触させる。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に対するグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤であってよい。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣａｄｉｇａｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００６年；１１９巻：３９５〜４０２頁；Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． ２００７年；１９巻：６５９〜６７１頁を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｂｌｅら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００３年；１１６巻：１１７５〜１１８６頁を参照されたい。

Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定例は、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓ（２０１２年）およびＣａｌｄｅｒら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」としても公知）は、ＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指し、以下の式を有する。

ＣＨＩＲ９９０２１は、選択性が高く、関連するおよび関連しないキナーゼのパネルに対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭおよびげっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値を有する。

５．２．２ 頭蓋プラコード（ＣＰ）前駆体を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、非ＣＮＳ前駆体が頭蓋プラコード（ＣＰ）前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効濃度のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効濃度のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤（例えば、約５ｎｇ／ｍＬの濃度で）、および有効濃度の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性化剤を、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、もしくは少なくとも約５日間、または約２日まで、約３日まで、約４日まで、約５日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤を少なくとも約２日間、細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を、約６日間もしくは約６日まで、約７日まで、約８日まで、約９日まで、約１０日まで、約１１日まで、約１２日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と約１２日間またはそれより長い間接触させる。

ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を、細胞がＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも約１、２、３、４または５日後に、細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を、約６日まで、約７日まで、約８日まで、約９日まで、約１０日まで、約１１日まで、約１２日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤に接触させてから約２日または３日後に、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤に接触させ、ここで、細胞を約１０日間またはそれより長い間ＦＧＦ活性化剤に接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞は、例えばＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、検出可能なレベルのＳＩＸ１および／またはＥＬＡＶＬ４を発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、検出可能なレベルのＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、および／またはクリスタリンアルファＢを発現し、ここで、細胞は水晶体プラコード前駆体である。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記活性化剤は、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。

ある特定の実施形態では、細胞を少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、または少なくとも約５日間、またはそれより長い間、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤とさらに接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤を、約２日まで、約３日まで、約４日まで、約５日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤に接触させてから少なくとも約１、２、３、４または５日後に、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから約２日後に、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤と接触させ、ここで、細胞を約２日間Ｗｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞をＦＧＦシグナル伝達の活性化剤と接触させない。ある特定の実施形態では、ＣＰ前駆細胞は、検出可能なレベルのＰＡＸ３を発現し、三叉神経プラコード前駆体である。

ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％もしくは約６０％またはそれより多くが検出可能なレベルの前述のマーカーを発現する。

ある特定の実施形態では、細胞を約１μＭから約２０μＭの間、約２μＭから約１８μＭの間、約４μＭから約１６μＭの間、約６μＭから約１４μＭの間、もしくは約８μＭから約１２μＭの間、または約１０μＭの濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１０μＭの濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの間、約０．１ｎｇ／ｍｌから約８ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍｌから約６ｎｇ／ｍＬの間、または約２ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約５ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記活性化剤は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０、その誘導体、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、細胞を約１０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍＬの間、約２０ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍＬの間、約３０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約４０ｎｇ／ｍｌから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を約５０ｎｇ／ｍＬまたは約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を約５０ｎＭから約２μＭの間、約１００ｎＭから約１．５μＭの間、約１５０ｎＭから約１μＭの間、約２００ｎＭから約９５０ｎＭの間、約２５０ｎＭから約９００ｎＭの間、約３００ｎＭから約８５０ｎＭの間、約３５０ｎＭから約８００ｎＭの間、約４００ｎＭから約７５０ｎＭの間、約４５０ｎＭから約７００ｎＭの間、約５００ｎＭから約６５０ｎＭの間、または約５５０ｎＭから約６００ｎＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の活性化剤と接触させる。

特定の実施形態では、ヒト幹細胞を、１種または複数のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（１０μＭ）と１２日間までの間またはそれより長い間、１種または複数のＢＭＰシグナル伝達の活性化剤（５ｎｇ／ｍＬ）と２日間または３日間までの間、１種または複数のＦＧＦシグナル伝達の活性化剤（５０ｎｇ／ｍＬ）と１０日間までの間またはそれより長い間、接触させることによって、非ＣＮＳ ＣＰ前駆体をヒト幹細胞から分化させ、ここで、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤およびＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を細胞に同時に接触させ、かつ細胞のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤およびＢＭＰシグナル伝達の活性化剤への最初に接触の２日または３日後に、ＦＧＦ活性化剤を細胞に接触させる。

Ｗｎｔ活性化剤を細胞にさらに接触させて三叉神経プラコード前駆体を分化させる場合、Ｗｎｔ活性化剤を２日までの間またはそれより長い間細胞に接触させ、ここで、細胞のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤およびＢＭＰシグナル伝達の活性化剤への最初の接触の２日後に、Ｗｎｔ活性化剤を細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤に接触させる細胞を、細胞のＷｎｔシグナル伝達の活性化剤との接触中または接触後に、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤に接触させない。

５．２．２．１ 下垂体細胞前駆体を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、非ＣＮＳ前駆体が下垂体プラコード前駆体または下垂体細胞であるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。

ある特定の実施形態では、幹細胞を下垂体細胞、または下垂体プラコード前駆体へと分化させ、ここで、ヒト幹細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、有効量のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種、２種またはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤を、約６日間もしくは約６日まで、約７日まで、約８日まで、約９日まで、約１０日まで、約１１日まで、約１２日まで、約１３日まで、約１４日まで、約１５日まで、約１６日まで、約１７日まで、約１８日まで、約１９日まで、約２０日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１５日間またはそれより長い間ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性化剤を、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、もしくは少なくとも約５日間、または約２日まで、約３日まで、約４日まで、約５日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤を少なくとも約３日間細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤を、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０日間もしくはそれより長い間、または約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤を少なくとも２６日間またはそれより長い間細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＳＨＨの１種または複数の活性化剤およびＦＧＦの２種またはそれより多い活性化剤を、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも約２、３、４、５、または６日後に、細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＳＨＨの１種または複数の活性化剤およびＦＧＦの２種またはそれより多い活性化剤を、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも４日後に、細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を約１μＭから約２０μＭの間、約２μＭから約１８μＭの間、約４μＭから約１６μＭの間、約６μＭから約１４μＭの間、または約８μＭから約１２μＭの間の濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１０μＭの濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの間、約０．１ｎｇ／ｍｌから約８ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍｌから約６ｎｇ／ｍＬの間、または約２ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約５ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、それぞれ、約１０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍＬの間、約２０ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍＬの間、約３０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約４０ｎｇ／ｍｌから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍＬの間、約５０ｎｇ／ｍｌから約３５０ｎｇ／ｍＬの間、約１００ｎｇ／ｍｌから約３００ｎｇ／ｍＬの間、または約１５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、Ｃ２５ＩＩおよびパルモルファミンなどのスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト、ＳＡＧ（例えば、Stantonら、Mol Biosyst. ２０１０年１月；６巻（１号）：４４〜５４頁に開示されている）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。

ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも約９、１５、３０または６０日後に、検出可能なレベルのＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＵＸ、ＬＨＸ４、ＨＥＳＸ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、および／またはＰＡＸ６を発現する。ある特定の実施形態では、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える細胞の集団が検出可能なレベルの前記マーカーを発現する。

ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから約３０から６０日後に、検出可能なレベルの１種または複数のホルモン、例えば、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および／または黄体形成ホルモン（ＬＨ）を発現する。ある特定の実施形態では、細胞はＣＲＦまたはストレシンと接触させた際にＡＣＴＨを発現し、細胞はソマトクリニンと接触させた際にＧＨを発現し、かつ／または細胞はナファレリンと接触させた際にＦＳＨを発現する。ある特定の実施形態では、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える細胞の集団が検出可能なレベルの前記ホルモンを発現している。ある特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％は２種以上のホルモンを発現する。

ある特定の実施形態では、細胞を背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せとさらに接触させる。ある特定の実施形態では、背方化剤は、ＦＧＦの活性化剤、例えば、ＦＧＦ８を含む。ある特定の実施形態では、腹方化剤は、ＢＭＰの活性化剤、例えば、ＢＭＰ２を含む。ある特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０日後またはそれより後に、背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５日もしくはそれより長い間、または約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５日までの間もしくはそれより長い間、背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せと接触させる。特定の実施形態では、細胞を少なくとも３０日間背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せと接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間、約２０ｎｇ／ｍＬから約１５０ｎｇ／ｍＬの間、約３０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約４０ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、背方化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で背方化剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間、約５ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬの間、または約１０ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、腹方化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１０ｎｇ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で腹方化剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、背方化剤と接触させた細胞は、検出可能なレベルのプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）を発現する。

ある特定の実施形態では、腹方化剤と接触させた細胞は、検出可能なレベルのＦＳＨおよび／またはＬＨを発現する。

ある特定の実施形態では、背方化剤と腹方化剤の混合物と接触させた細胞は、検出可能なレベルのＧＨおよび／またはＴＳＨＢを発現する。

特定の実施形態では、幹細胞を下垂体細胞、または下垂体プラコード前駆体へと分化させ、ここで、ヒト幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（１０μＭ）、約３日間のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤（５ｎｇ／ｍＬ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤（２００ｎｇ／ｍＬ）、およびＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤（例えば、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８および５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０）と接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨおよびＦＧＦシグナル伝達の活性化剤を、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に接触させてから少なくとも４日後に、細胞に接触させ、ここで、細胞を少なくとも約２６日間ＳＨＨおよびＦＧＦシグナル活性化剤に接触させる。

５．２．３ 非神経外胚葉（ＮＮＥ）前駆体の分化の方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非ＣＮＳ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、非ＣＮＳ前駆体が非神経外胚葉（ＮＮＥ）前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤（例えば、約１０ｎｇ／ｍＬまたは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で）、および有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。

ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤の非限定例として、ＳＵ５４０２（Sunら、Journal of medicinal chemistry ４２巻、５１２０〜５１３０頁（１９９９年）；Patersonら Br. J. Haematol. １２４巻 ５９５頁（２００４年）；Tanakaら、Nature ４３５巻：１７２頁（２００５年））、ＰＤ １７３０７４（Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）ウレア；Bansalら、J.Neurosci.Res.、２００３年；７４巻：４８６頁）、ＦＩＩＮ １ ヒドロクロリド（Ｎ−（３−（（３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−７−（４−（ジエチルアミノ）ブチルアミノ）−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メチル）フェニル）アクリルアミド；Zhou、Chem.Biol.、２０１０年；１７巻：２８５頁）、ＳＵ６６６８（５−［１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸；Yamamotoら、Cancer Res. ２００８年１２月１日；６８巻（２３号）：９７５４〜６２頁）、ＰＤ １６６２８５ ジヒドロクロリド（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン 二塩酸塩；Panekら、J Pharmacol Exp Ther. １９９７年１２月；２８３巻（３号）：１４３３〜４４頁）、ＰＤ １６１５７０（Ｎ−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）ウレア；Hambyら、J Med Chem. １９９７年７月１８日；４０巻（１５号）：２２９６〜３０３頁）、ＡＰ ２４５３４（３−（２−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イルエチニル）−４−メチル−Ｎ−［４−［（４−メチル−１−ピペラジニル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−ベンズアミド；Huangら、J.Med.Chem.、２０１０年；５３巻：４７０１頁）、またはその誘導体が挙げられる。

ある特定の実施形態では、用語「ＳＵ５４０２」は、化学式Ｃ_１７Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_３および化学名：２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸（pr-opanoic acid）を有する小分子を指す。ある特定の実施形態では、ＳＵ５４０２は、以下の化学構造：

を有する。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤、およびＦＧＦシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤、およびＦＧＦシグナル伝達の阻害剤を、約６日間もしくは約６日まで、約７日まで、約８日まで、約９日まで、約１０日まで、約１１日まで、約１２日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１２日間またはそれより長い間ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤、およびＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約１２日後に、検出可能なレベルのＴＦＡＰ２Ａを発現し、検出可能なレベルのＳＩＸ１および／またはＳＯＸ１０を発現しない。

ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくは６０％またはそれより多くが検出可能なレベルのＴＦＡＰ２Ａを発現する。

ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤は、ＳＵ５４０２（Sunら、Journal of medicinal chemistry ４２巻、５１２０〜５１３０頁（１９９９年））、その誘導体、またはそれらの混合物を含む。

ある特定の実施形態では、細胞を約１μＭから約２０μＭの間、約２μＭから約１８μＭの間、約４μＭから約１６μＭの間、約６μＭから約１４μＭの間、または約８μＭから約１２μＭの間の濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１０μＭの濃度で形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間、約１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍＬの間、約５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍＬの間、または約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を約１０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を約１μＭから約２０μＭの間、約２μＭから約１８μＭの間、約４μＭから約１６μＭの間、約６μＭから約１４μＭの間、または約８μＭから約１２μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約１０μＭの濃度でＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、ヒト幹細胞を、１種または複数のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（１０μＭ）と１２日間までの間、１種または複数のＢＭＰシグナル伝達の活性化剤（約２日間にわたって１０ｎｇ／ｍＬまたは２０ｎｇ／ｍＬ、その後、５ｎｇ／ｍＬ）と１２日間までの間、および１種または複数のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤（１０μＭ）と少なくとももしくは約２日間、または１２日間までの間、接触させることによって、非ＣＮＳ ＮＮＥ前駆体をヒト幹細胞から分化させ、ここで、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の阻害剤を細胞に同時に接触させる。

ある特定の実施形態では、上述の阻害剤、活性化剤および分子を幹細胞を含む細胞培養培地に添加する。適切な細胞培養培地として、これらに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地が挙げられる。Ｅ８／Ｅ６培地は市販されている。

Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および増殖を支持するフィーダーフリーおよび異種成分不含（ｘｅｎｏ ｆｒｅｅ）培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞再プログラミングを支持することが判明した。さらにＥ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣの培養に対するカスタム培地の配合物のベースとして使用することができる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれるＣｈｅｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１年５月；８巻（５号）：４２４〜９頁に記載されている。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ１５／０７７６４８に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン、インスリン、ＮａＨＣＯ_３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。ある特定の実施形態では、Ｅ６培地は、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含まない。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が、活性ＢＭＰまたはＷｎｔ成分を含まない点でＫＳＲ培地と異なる。

分化した細胞は、１種または複数のレポーターをさらに発現しうる。レポーターの非限定例として、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ））、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、酵素（例えば、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼ）、ならびに抗原分子が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」は、着色したタンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質またはベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素などの容易に検出可能なまたは容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子構築物を指す。ある特定の実施形態では、レポーターは、ＮＥ系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、ＮＣ系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、ＣＰ系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、またはＮＮＥ系統マーカー遺伝子の組換えプロモーターによって誘導されうる。

分化した細胞は、分化後、例えば、細胞培養培地中で精製されうる。本明細書で使用される場合、用語「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、および「単離」は、試料由来の少なくとも１種の夾雑物の量の低減を指す。例えば、所望の細胞型は、所望されない細胞型の量の対応する低減により、少なくとも約１０％まで、少なくとも約３０％まで、少なくとも約５０％まで、少なくとも約７５％まで、および少なくとも約９０％まで精製される。用語「精製する」は、試料由来のある特定の細胞（例えば、所望されない細胞）の除去を指すことができる。

本開示の主題は、本明細書に記載されている方法によって生成された１種または複数のＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団、およびこのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を含む組成物も提供する。

５．３ 分化した細胞集団を含む組成物
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、１種または複数の神経堤系統マーカー、またはその先駆細胞を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、または４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも９９．９％）の細胞の集団が、１種または複数の神経堤系統マーカー、例えば、ＳＯＸ１０を発現する。

本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、１種または複数の頭蓋水晶体プラコード系統マーカー、またはその前駆細胞を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、または４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％）の細胞の集団が、１種または複数の頭蓋水晶体プラコード系統マーカー、例えば、ＳＩＸ１、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、またはこれらの組合せを発現する。

本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、１種または複数の頭蓋三叉神経プラコード系統マーカー、またはその前駆細胞を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、または４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％）の細胞の集団が、１種または複数の頭蓋三叉神経プラコード系統マーカー、例えば、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、またはこれらの組合せを発現する。

本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカー、またはその前駆細胞を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、または４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％）の細胞の集団が、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカー、例えば、ＴＦＡＰ２Ａを発現し、細胞の集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、ＳＩＸ１、ＳＯＸ１０およびこれらの組合せからなる群より選択される１種または複数のマーカーを発現する。

本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、１種または複数の下垂体細胞マーカー、または下垂体プラコード前駆体を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、または３０％（例えば、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％）の細胞の集団が、１種または複数の下垂体細胞マーカー、例えば、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＵＸ、ＬＨＸ４、ＨＥＳＸ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、ＰＡＸ６、またはこれらの組合せを発現する。

ある特定の実施形態では、分化細胞の集団は、ヒト幹細胞の集団から誘導される。本開示の主題は、このような分化細胞の集団を含む組成物をさらに提供する。

ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０^４から約１×１０^１０、約１×１０^４から約１×１０^５、約１×１０^５から約１×１０^９、約１×１０^５から約１×１０^６、約１×１０^５から約１×１０^７、約１×１０^６から約１×１０^７、約１×１０^６から約１×１０^８、約１×１０^７から約１×１０^８、約１×１０^８から約１×１０^９、約１×１０^８から約１×１０^１０、または約１×１０^９から約１×１０^１０個の本開示の幹細胞から誘導された細胞の集団を含む。

ある特定の非限定的実施形態では、組成物は、生体適合性スキャホールドまたはマトリクス、例えば、細胞を被験体に植込むかまたは移植する際に、組織再生を促進する生体適合性三次元スキャホールドをさらに含む。ある特定の非限定的実施形態では、生体適合性スキャホールドは、細胞外マトリクス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドまたはタンパク質、多糖類（フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースまたはゼラチン、および／またはヒドロゲルを含む）を含む。（例えば、そのそれぞれの内容が、全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照のこと。）

ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤またはこれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載されているように、神経変性障害および下垂体障害を予防および／または処置するために使用することができる。

５．４ 神経変性障害および下垂体障害を処置する方法
１種または複数のＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞（「幹細胞から誘導されたＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ前駆体」とも称される）を神経変性障害または下垂体障害を処置するために使用することができる。本開示の主題は、神経変性障害または下垂体障害を処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞から誘導された前駆体を神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

神経変性障害の非限定例として、フリードライヒ運動失調症（Friedrich's Ataxia）
が挙げられる。

下垂体障害の非限定例として、下垂体機能低下障害が挙げられる。

本開示の幹細胞由来前駆体は、神経変性障害または下垂体障害を処置または予防するために、被験体に、全身的または直接的に投与または提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、目的の器官（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ））に直接注射される。

本開示の幹細胞由来前駆体は、任意の生理学的に許容されるビヒクルにおいて投与することができる。本開示の幹細胞由来前駆体および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来前駆体および前記細胞を含む医薬組成物は、局注、同所（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与によって投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、神経変性障害または下垂体障害を患っている患者に、同所（ＯＴ）注射により投与することができる。

本開示の幹細胞由来前駆体および前記細胞を含む医薬組成物は、選択されたｐＨに緩衝されうる滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁物、エマルション、分散物、または粘性組成物として、都合よく提供することができる。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製しやすい。さらに、液体組成物は、特に注射によって、投与するのに多少都合がよい。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすのに適当な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる担体を含むことができる。滅菌注射溶液は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来前駆体を含む組成物を、所望の様々な量の他の成分を含む必要量の適当な溶媒に組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤との混合物において存在してもよい。組成物は、凍結乾燥されてもよい。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化もしくは粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１７版、１９８５年などの標準教科書が、過度な実験を行うことなく適切な調製物を調製するために参考にされうる。

抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌状態を増強する種々の添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保される。注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本開示の幹細胞由来前駆体と適合性であるべきである。

必要であれば、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持することができる。容易かつ経済的に入手可能であり、容易に作用するため、メチルセルロースを使用することができる。他の適切な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて変わりうる。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適切な担体および他の添加剤の選択は、投与の正確な経路および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物が、液体、懸濁物、ゲルまたは別の液体形態、例えば時限放出形態（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍ）または液体充填形態に製剤化されることになるか否か）に依存して変わる。

当業者は、組成物の構成成分は、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来前駆体の生存度または有効性に影響を与えないことを認識している。このことは、化学および製薬分野の当業者（ｔｈｏｓｅ ｓｋｉｌｌｅｄ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）にとって課題を提示せず、すなわち、この開示および本明細書で引用された文書から、標準教科書を参照することにより、または簡単な実験（過度の実験を含まない）により、課題を容易に回避することができる。

本開示の幹細胞由来前駆体の治療用途に関する１つの検討事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適の効果として、これらに限定されないが、神経変性障害を患っている被験体のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳ領域の再増殖、ならびに／または被験体のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳの機能の改良が挙げられる。

「有効量」（または「治療有効量」）は、処置の際に有益な結果または所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１または複数の用量で被験体に投与することができる。処置について、有効量は、神経変性障害または下垂体障害の進行を和らげる、好転させる、安定化させる、反転させるもしくは遅延させる、または代わりに神経変性障害または下垂体障害の病理学的帰結を低減するのに十分な量である。有効量は、一般的に、ケースバイケースを基本に医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。いくつかの因子が、典型的には、有効量を達成するために適当な投薬量を決定する際に考慮に入れられる。これらの因子として、被験体の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が挙げられる。

ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体の有効量は、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体のＣＮＳおよび／またはＰＮＳ領域の再増殖に十分な量である。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体の有効量は、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能を改良するのに十分な量であり、例えば改良された機能は、通常のヒトのＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％でありうる。

投与される細胞の量は、処置される被験体に対して変化する。ある特定の実施形態では、約１×１０^４〜約１×１０^１０、約１×１０^４〜約１×１０^５、約１×１０^５〜約１×１０^９、約１×１０^５〜約１×１０^６、約１×１０^５〜約１×１０^７、約１×１０^６〜約１×１０^７、約１×１０^６〜約１×１０^８、約１×１０^７〜約１×１０^８、約１×１０^８〜約１×１０^９、約１×１０^８〜約１×１０^１０、または約１×１０^９〜約１×１０^１０の本開示の幹細胞由来前駆体が、被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０^５〜約１×１０^７の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約２×１０^６の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０^６〜約１×１０^７の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０^６〜約４×１０^６の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。検討される有効用量の正確な決定は、特定の被験
体のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む各被験体に対する個々の因子に基づいてよい。投薬量は、この開示および当技術分野の知識から、当業者によって容易に確認されうる。

ある特定の実施形態では、神経変性障害または下垂体障害を処置するために、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される細胞は、本開示の幹細胞由来ＮＣまたはＣＰ前駆体から分化／成熟されたニューロンの集団である。

５．５ キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および（ｃ）１種または複数の神経堤系列マーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および（ｄ）幹細胞の、１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。ある特定の実施形態では、キットは、任意選択で、（ｅ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｄ）幹細胞の、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｃ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤、および（ｅ）幹細胞の、１種または複数の下垂体細胞または下垂体細胞前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。

ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、特異的な順序で、阻害剤、活性化剤および分子と接触させることを含む。阻害剤、活性化剤および分子を接触させる順序は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定することができる。

ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、本開示の方法によって記載されているように、阻害剤、活性化剤および分子と接触させることを含む（上掲の項目５．２を参照のこと）。

ある特定の実施形態では、本開示は、有効量の本開示の幹細胞由来前駆体の集団または前記前駆体を単位剤形で含む組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の細胞は、成熟分化細胞である。ある特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、積層した紙、金属箔、ま
たは医薬を保持するために適切な他の材料から作製されうる。

ある特定の実施形態では、キットは、本開示の幹細胞由来前駆体またはそれを含む組成物の集団を、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与するための指示書を含む。指示書は、神経変性障害を処置または予防するための細胞または組成物の使用についての情報を含むことができる。ある特定の実施形態では、指示書は、以下のもののうちの少なくとも１つを含む：治療剤についての記載、投薬スケジュールおよび神経変性障害もしくはその症状を処置もしくは予防するための投与、注意事項、警告、適応症、禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、過量投薬情報、有害反応、動物薬理学、臨床試験、および／または参照文献。指示書は、容器（存在する場合）に直接、または容器に貼られたラベルとして、または容器の中もしくは容器と一緒に供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとして印刷されうる。

５．６ 治療用化合物をスクリーニングする方法
本開示の幹細胞から誘導されたＮＣおよびＣＰ前駆体を使用して、神経変性障害または下垂体障害、例えば、フリードライヒ運動失調症または下垂体機能低下障害をモデル化することができ、疾患細胞表現型を克服することができる候補化合物としてスクリーニングするためのプラットホームとしての機能を果たすことができる。神経変性障害または下垂体障害を緩和する候補化合物の能力を、神経変性障害または下垂体障害を引き起こす生理学的または細胞の欠陥を救助する候補化合物の性能をアッセイすることによって決定することができる。

ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から誘導される本開示の前駆体の集団であって、前駆細胞が神経変性障害または下垂体障害を有する被験体由来のｉＰＳＣから調製され、前駆細胞が障害の細胞および／または代謝の特徴を発現する集団、ならびに（ｉｉ）試験化合物を準備するステップと；（ｂ）前駆体を試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）前駆体の機能活性、または遺伝子発現を測定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、前駆体を少なくとも約２４時間（１日）、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間試験化合物と接触させる。ある特定の実施形態では、前駆体を、試験化合物と接触させる前に、分化したニューロンへと成熟させる。

５．７ ＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥの運命を増加させる化合物をスクリーニングする方法
本開示は、ＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ前駆体の分化を促進する化合物をスクリーニング（例えば、ハイスループットスクリーニング）する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＮＥ、ＮＣ、ＣＰ、およびＮＮＥは、本明細書に記載されている方法に従って分化させることができ、ここで、細胞を試験化合物と接触させて試験化合物がＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ誘導を増強するかどうかを決定する。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞のＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥの運命への分化を決定するためのレポーター構築物、例えば、ＮＥ、ＣＰ、ＮＣまたはＮＮＥ前駆体に特異的な遺伝子のプロモーターに作動可能に連結するＧＦＰなどの検出可能なレポーターを発現する。ある特定の実施形態では、レポーター構築物は、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ、ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、およびこれらの組合せからなる群より選択される。

ある特定の実施形態では、スクリーニング方法は、本明細書に記載されている方法に従ってヒト幹細胞を培養するステップを含み、試験化合物を１日目、または２日目、または３日目、または４日目、または５日目、または６日目、または７日目に培養培地に添加する。ある特定の実施形態では、スクリーニング方法は、試験化合物と共に培養した細胞における、１種または複数のＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ前駆体マーカー、例えば、ＳＯＸ１および／もしくはＰＡＸ６（ＮＥ）；ＳＩＸ１、ＰＡＸ６、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、および／もしくはＴＦＡＰ２Ａ（ＣＰ）；ＳＯＸ１０および／もしくはＴＦＡＰ２Ａ（ＮＣ）；またはＴＦＡＰ２Ａの検出可能な発現のレベルならびに検出可能なＳＩＸ１およびＳＯＸ１０（ＮＮＥ）の発現の欠如を決定するステップと、前記レベルを、試験化合物を含まない培地中で培養された細胞中の同じマーカーの発現のレベルと比較するステップとを含み、試験化合物と共に培養した細胞におけるマーカーの発現レベルの増加が、試験化合物がＮＥ、ＮＣ、ＣＰまたはＮＮＥ前駆体誘導を増強することを示す。

６．実施例
本開示の主題は、限定としてではなく、本開示の主題の例として提供される以下の実施例および付録を参照してより理解される。

６．１ 実施例１：神経外胚葉（ＮＥ）、神経堤（ＮＣ）頭蓋プラコード（ＣＰ）および非神経外胚葉（ＮＮＥ）の外胚葉系統の幹細胞から誘導された前駆細胞を調製する方法
要約
ヒト多能性細胞（ｈＰＳＣ）は、潜在的に、身体の任意の細胞型を生じることができる。長期的な目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全なヒトの系統樹を再現するためのストラテジーの開発である。このような努力は、３つの胚葉のそれぞれへのアクセスをもたらすモジュール分化プラットホームを確立することに依拠する。この実施例は、４つの主要な外胚葉系統のすべて（ＣＮＳ、神経堤、頭蓋プラコード、非神経外胚葉）を十分に規定された条件下で並行して誘導するためのストラテジーを提示する。遺伝子レポーター株を使用して、非ＣＮＳ外胚葉誘導体を誘導する際のＢＭＰシグナル伝達に対する用量および時間に依存する役割を実証した。遺伝子編集ツールを適用して、初期細胞運命の決定の機構を精査し、頭蓋プラコードの運命を増大させる化合物を化学的にスクリーニングする本プラットホームの有用性をさらに実証した。オンデマンドでの４つの外胚葉系統への再現可能なアクセスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト外胚葉系統の多様性を再現する途中の最初のマイルストーンである。

結果
４つの外胚葉系統を誘導するためのｄＳＭＡＤｉベースの分化プロトコルは、化学的に定義したシステムを使用すると、ＮＥの運命への偏りを生じる
４つの主要な外胚葉系統は、神経外胚葉（ＮＥ）、神経堤（ＮＣ）、頭蓋プラコード（ＣＰ）および非神経外胚葉（ＮＮＥ）を含む。これらの系統のそれぞれは、図１Ａにまとめたように伝統的なＫＳＲベースのプロトコルを使用してｄＳＭＡＤｉ条件を修正することによって生成することができる。興味深いことに、ＫＳＲ条件下で、パターニング因子を含むかまたは減らす最適な時点は、誘導の４８時間後である（Dincerら、２０１３年；Micaら、２０１３年）。この時点で、ｄＳＭＡＤｉによる継続によって前部ＮＥが生じ、ＣＨＩＲ９９０２１によるＷｎｔシグナル伝達の活性化により頭蓋ＮＣが生じ、ＢＭＰ阻害剤であるＬＤＮ１９３１８９の除去により頭蓋プラコードが生じ、またはＬＤＮ１９３１８９と組み合わせたＳＵ５４０２によるＦＧＦシグナル伝達のブロッキングによりＮＮＥの運命が誘発される。定義された転写因子および他の系統特異的マーカーを使用して、初期の外胚葉系統のそれぞれを一意的に特定することができる。ＮＥの生成は、ＳＯＸ１およびＰＡＸ６の発現、ならびにＴＦＡＰ２Ａの非存在によってマークされる。ＴＦＡＰ２Ａの発現によって、非神経外胚葉から誘導される細胞型から外胚葉が分離される。ＴＦＡＰ２Ａと組み合わせて、ＳＯＸ１０対ＳＩＸ１の発現によって、それぞれ、ＮＣ対プラコードの同一性が特異的にマークされる。ＮＮＥに対する特異的転写因子が存在するかどうかは不明のままであるが、ＳＯＸ１０とＳＩＸ１の両方の非存在下でのＴＦＡＰ２Ａの発現は、これらの培養条件下でＮＮＥを確実に特定しているようである（図１Ｂ）。

規定の分化培地の下でこれらの種々の外胚葉系統マーカーの獲得をモニタリングするために、本実施例は、３種のＧＦＰレポーター株、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（図８Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ（Chambersら、２０１２年；Micaら、２０１３年）およびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（図８Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）を使用した。これらの株の特異的細胞型への分化によって、それぞれ平均９５％のＮＥ、５０％のプラコードおよび５８％のＮＥが生じた（図１Ｃおよび１Ｄ）。全体の分化効率は非常に高く、プラコードおよびＮＣ細胞の収率は分化の繰り返しにわたって可変的であり、分化培地中のある特定の因子が変化し、それによって収率に影響を与える可能性があることを示唆した。

これらのプロトコルをより厳格に規定したＥ６培地へと移行するために、本実施例は、ｈＰＳＣを複数回継代の間Ｅ８中で順応させ、４つの主要な外胚葉系統を誘発するために以前に記載された因子および濃度を維持しながら、ＫＲＳベースの培地をＥ６ベースの分化と単純に交換した（図９Ａ）。本実施例は、小分子、すなわちＣＨＩＲ９９０２１およびＳＵ５４０２の一部については、最初の濃度では、分化中に細胞を効率的に死滅させ、再度用量設定しなければならなかったことを見出した。小分子のそれぞれに対する最適な非毒性濃度を決定した後、本実施例は、Ｅ６条件下でのＮＥ形成がＫＳＲベースの条件で得られたものと同等であることを観察した。Ｅ６条件下、小分子の非存在下でのＮＥの形成について以前に実証された（Lippmannら、２０１４年）。本実施例は、小分子を使用しないか、ｄＳＭＡＤｉを使用するか、または単一のＴＧＦβ阻害剤であるＳＢ４３１５４２（ＳＢ）を使用するかのいずれかによるＰＡＸ６陽性細胞生成の効率を比較した。本実施例は、ｄＳＭＡＤｉの非存在下での堅固なＰＡＸ６の発現を見出した（誘導の１２日後に全細胞の約４０％）。しかし、ＰＡＸ６を発現する細胞のパーセンテージは、ＳＢまたはｄＳＭＡＤｉの添加でさらに改善し、それぞれ、ほぼ９０％と８０％となった（図１Ｅおよび９Ｂ）。ＰＡＸ６＋ＮＥはＴｂｒ１陽性皮質ニューロンへとさらに効率的に分化し（図９Ｅ）、これらの細胞が皮質発生の初期段階へと進行できることを示した。驚くべきことに、高いパーセンテージのＰＡＸ６＋細胞が、ＣＰまたはＮＮＥで維持された細胞を含むほとんどすべての処理群で観察された。ＣＰ細胞はＰＡＸ６を発現することができるが、これらの細胞はＳｉｘ１を同時に発現せず、これらがＣＰ起源ではないことを示唆した（図１Ｅ）。さらに、ＮＣ誘導によってＰＡＸ６陽性細胞もＳＯＸ１０陽性細胞も生成されず、Ｗｎｔ活性化によって、ＮＣを誘導するよりもむしろ、細胞を分化させる領域アイデンティティを変更する可能性があることが示された（図９Ｃ、Ｄ）。最後に、ＫＳＲ対Ｅ６条件下でＮＣへと分化したｈＰＳＣの比較遺伝子発現分析によって、Ｅ６下での非神経マーカーの発現の欠如が明らかとなった（図１Ｆ）。全体として、これらのデータによって、Ｅ６は、ＫＳＲベースの分化で開発された小分子条件下で、非神経の運命を誘導する因子を欠いていたことが示唆される。

ＴＦＡＰ２Ａを介したＢＭＰシグナル伝達は非ＣＮＳの運命を生じるために必須である
ほとんどの外胚葉系統プロトコルが、デフォルトで、ＰＡＸ６陽性ＮＥを生じた理由を理解するために、本実施例は、転写因子ＡＰ２α（ＴＦＡＰ２Ａ）の誘導について調査した。ＴＦＡＰ２ＡはＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥにおいて高度に発現され、それぞれ、ＮＣおよびＣＰに対するＳＯＸ１０およびＳＩＸ１などの他の系統に制限されたマーカーの発現に先行する分化の２日以内に上方調節される（Dincerら、２０１３年）。多くのシグナル伝達分子がレチノイドならびにＷＮＴおよびＢＭＰシグナル伝達の活性化剤などのＴＦＡＰ２Ａの発現を誘導することが報告されている（Luoら、２００３年；Xieら、１９９８年）。興味深いことに、ＫＳＲ条件下では、これらのシグナル伝達因子はいずれも、堅固なＴＦＡＰ２Ａ発現にもかかわらず、非ＣＮＳの運命の誘導の間に添加されない（Ｄｉｎｃｅｒら、２０１３年）。したがって、本実施例は、ＫＳＲベースの培地はＴＦＡＰ２Ａの誘導に十分な内因性シグナルを誘発することができるが、Ｅ６はこれらの因子を欠いていると仮定した。したがって、本実施例は、関連するシグナル伝達分子を直接添加することによってＴＦＡＰ２Ａの発現を回復させることを試みた。

プラコードおよび非神経外胚葉の生成
ＢＭＰシグナル伝達は、ニワトリ胚の発生においてＮＮＥおよびプラコードの形成に重要であることが示されている（図２Ａ）（ＧｒｏｖｅｓおよびＬａＢｏｎｎｅ、２０１４年）。本実施例は、ＢＭＰシグナル伝達を外部から刺激することによってＴＦＡＰ２Ａの発現を誘導し、ＰＡＸ６＋ＮＥを抑制することを考えた。本実施例は、用量依存的な処置の３日以内に、ＴＦＡＰ２Ａの発現が急速に上方調節されることを観察した（図２ＢおよびＣ）。高濃度（２０ｎｇ／ｍｌ）で、細胞はＴＦＡＰ２Ａ陽性となり、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の発現を欠き、ＮＮＥが強力なＢＭＰシグナル伝達の活性化により誘発されることを示した（図２Ｄ）。ＦＧＦ経路をさらに阻害することによってＣＰ誘導をさらにブロックし、それによって、ＮＮＥ誘導の効率を増大させる。ＮＮＥを規定の条件を使用してケラチノサイトへと最終分化に供する際に、本実施例は、未成熟（Ｋ１４陽性）および成熟上皮細胞（Ｋ１８陽性）の両方を達成することができた（図２Ｅ）。

次に、本実施例は、ＢＭＰシグナル伝達の３日間のパルスがＳＩＸ１陽性プラコードを生成するのに十分であるか否かを調べた。実際、ＢＭＰの添加はプラコード誘導を誘発したが、効率は低かった（図２Ｆおよび１０）。用量応答研究により、中程度の濃度のＢＭＰ４（およそ５ｎｇ／ｍｌ）がＣＰ誘導に最適であることを示した。興味深いことに、プラコード分化の間の細胞の大多数がＮＮＥに似ており、ＦＧＦアゴニストの直接添加が、ＮＮＥを犠牲にしてプラコード生成の効率を高めるのに必要である可能性があることを示した。実際に、分化の間に、ＦＧＦ２を添加し、ＦＧＦ８を添加しないことにより、ＳＩＸ１陽性細胞の形成がほぼ５０％まで増強された（図２Ｇ）。

三叉神経プラコードはｈＰＳＣから誘導されるデフォルトプラコードの運命であることが以前に示されている（Dincerら、２０１３年）。本実施例は、Ｓｉｘ１陽性ＣＰを最終的に分化させ、ＰＡＸ３などの後部マーカーよりも前プラコードマーカーであるＰＡＸ６の発現を観察した（図２Ｈ）。プラコード細胞におけるＰＡＸ６の発現は、水晶体、下垂体または嗅覚のアイデンティティに対応する。これらの細胞のさらなる分化によって、三叉神経プラコードよりも主として水晶体としての運命を確認する、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡおよびＢなどの水晶体に特異的な因子の発現が実証された（図２ＨおよびＩ）。

次に、本実施例は、これらの因子がＫＳＲにおいて適当であって、Ｅ６において適さないため、水晶体プラコードを犠牲にして三叉神経プラコードの誘導を促進する因子を特定しようとした。発生の間、三叉神経プラコードは、ＰＡＸ６＋の水晶体、下垂体および嗅覚のプラコードの後に誘導される。したがって、本実施例は、発生の間に後の細胞アイデンティティを誘発することが公知の標準的なＷＮＴシグナル伝達の活性化が、三叉神経系統へのパターニングに移行するのに十分でありうるか否かを試験した。プラコードを誘導するＢＭＰパルスの後に、分化の初期段階の間にＣＨＩＲ９９０２１のさらなるパルスへ曝露すると、三叉神経プラコードを示すＳＩＸ１プラコード細胞のＰＡＸ３の発現を誘導することができる（図２Ｊ）。これらのデータは、最小限の培地条件下で、本実施例が、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞運命の選択およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラコード誘導の間の領域特異化を厳密に再現することができることを示す。

神経堤の生成
本実施例は、ＢＭＰ４のショートパルス（１ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせたＷＮＴシグナル伝達の活性化によりほぼ均質なＳＯＸ１０陽性ＮＣ集団を生成できることを観察した（図３Ａおよび図１１）。興味深いことに、このような低濃度のＢＭＰ４で、ＴＦＡＰ２Ａは弱くしか誘導されず（図２Ｆ）、ＮＣが、最初に、ＴＦＡＰ２Ａを発現しないがまたは低レベルのＴＦＡＰ２Ａを発現する初期前駆細胞から生じる可能性があることを示唆する。しかし、ＷＮＴとＢＭＰの両方を添加することは、ＴＦＡＰ２Ａと同じく、非神経外胚葉の運命の別のマーカーであるＤＬＸ３も活性化するように相乗的に作用する（図３Ｂ）。さらに、ＮＣの分化によって、それぞれ、Ｉｓｌ１およびＭａｓｈ１染色によりマークされる自律神経および感覚神経を生じうる（図３Ｃ）。ここで表されたデータは、ＢＭＰシグナル伝達の初期の、用量依存的誘導によって、以前に報告されたよりも高い効率および低い可変性を有するＮＣを含む非ＣＮＳ外胚葉の運命の形成が可能となることを実証する。

外肺葉由来の精製された細胞型の発現分析
本実施例は、外胚葉に特異的なレポーター株を生成したため、本実施例は、４つのヒト外胚葉系統すべての転写発現特性を決定しようとした。ＮＮＥ系統を除いて、本実施例は、それぞれのレポーター株（すべての株はＷＡ−０９ｈＥＳＣから誘導された）を使用してＧＦＰ陽性細胞を選別し、これらの精製細胞のＲＮＡシークエンシングを実施した。不偏クラスタリングアルゴリズムにより、ＮＥはｈＥＳＣと接近してクラスター化する一方、ＮＮＥは他のすべての外胚葉系統から最も離れてクラスター化することが示された。興味深いことに、主成分分析に基づき、ＮＣおよびＣＰは互いに接近してクラスター化し、これらの細胞が類似する転写プロファイルを有するが、それぞれ、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の発現においては異なることが示唆された（図４ＡおよびＢ）。次いで、差次的に発現した遺伝子は、共有の、および特有の発現プロファイルを有するものへとグループ化される（図４Ｃ）。次いで、このような発現パターンを遺伝子オントロジー分析（Edgarら、２０１３年）に供した（図４Ｄ）。細胞外マトリックス再編成に関連する遺伝子は、非ＣＮＳから誘導された細胞型のすべてにおいて非常に豊富に存在する。このことは、分化の間の初期ＢＭＰシグナルがＥＣＭを介して部分的に作用する可能性があり、またはＥＣＭに関連する転写物の豊富な細胞型を少なくとも誘導することを示す。逆に、ＮＥに関連するオントロジーはシナプス伝達および神経系の発達に関与する。ＮＣに特異的な個々のオントロジーは細胞接着およびカルシウム結合を誘導し、一方、ＣＰはシナプス伝達およびイオン膜輸送に対して濃縮される。まとめると、４つの外胚葉系統に対する転写発現プロファイルは全体として異なっており、表された特異的系統のそれぞれに関連する捕捉機能である。

初期のヒト外胚葉系統のデータの不足を考慮に入れると、次に、本実施例は、外胚葉系統のそれぞれに対するより特異的なマーカーを本実施例が特定することができるか否かを調べた。外胚葉系統の中で顕著に差次的な発現を有するのと同様に、一意的に上方調節される遺伝を有する転写物をさらなる検証に供した。ＣＮＳと非ＣＮＳの運命間で共有される外肺葉分化の間に特異的に上方調節される遺伝子として、ＡＮＸＡ１、ＬＧＩ１、ＮＲ２Ｆ２およびＺＮＦ５０３が挙げられる。さらに、ＣＮＳ対非ＣＮＳを線引きする因子は、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＴＦＡＰ２ＡおよびＴＦＡＰ２Ｂである（図４Ｅ）。ＮＥにおいて、Ｓｏｘ１およびＨｅｓ５などの因子は、ＣＮＳの細胞を排他的に特定するが、低レベルのＰａｘ６転写物は、他の系統のすべてで見出すことができる（図４Ｆ）。興味深いことに、本実施例は、ＮＣ系統に特異的な、性質不明のジンクフィンガータンパク質であるＺＮＦ２２９の高い発現を観察した。他の系統については、本実施例は、それぞれ、プラコードおよびＮＮＥで優先的に発現されるＥＬＡＶＬ４およびＳＭＹＤ１を特定した。この分析により、外肺葉形成の間に、主要な系統のそれぞれの特定について公知の遺伝子と新規遺伝子の両方のサブセットがもたらされる。

ＴＦＡＰ２Ａの損失が非ＣＮＳ誘導体の誘導に影響を及ぼす
ここで、４つの主要な外胚葉系統を誘導するために提示された新規条件は、堅固かつ効率的である。したがって、本実施例は、外胚葉系統の特異化の間に重要な役割を果たすものを特定するための摂動研究を実施しようとした。非ＣＮＳ運命に関与する本研究の１つの最良の候補は、ｄＳＭＡＤｉの間に、初期に高度に発現されることから、ＴＦＡＰ２Ａであった。非ＣＮＳ系統がＴＦＡＰ２Ａの発現に依存するか否かを対象として、本実施例はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣ株を生成した。２種のガイドＲＮＡを使用して、フレームシフトの欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして、欠失の程度および性質を決定した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ＴＦＡＰ２Ａの発現の消失を高ＢＭＰの存在下で短い３日の誘導を使用して確認した（図５Ａおよび１２Ｃ）。ＴＦＡＰ２Ａ対野生型ｈＥＳＣのさらなる比較研究により、ＣＰまたはＮＮＥ条件下で、野生型では分化の６日目にＥ−カドヘリンの堅固な上方調節が示されたが、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞では示されなかった（図５Ｂ）。これらのデータにより、ＴＦＡＰ２Ａが、ＮＣまたはＣＰの運命へのＥＭＴ様移行から細胞を保護する場合のあるＥ−カドヘリンの発現を促進することが示唆される。

Ｅ−カドヘリンのデータを考慮に入れて、本実施例は、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞は非ＣＮＳ系統へ移行することができず、デフォルトでＣＮＳ ＮＥとなると仮定した。この仮定と一致して、ＮＥの誘導はＴＦＡＰ２Ａの損失に影響を与えなかった（図５Ｃ）。Ｓｏｘ１およびＰａｘ６などのＣＮＳに豊富な転写因子は、他の系統からのわずかの夾雑物と共に豊富に存在した。さらに、ＮＣおよびプラコードのプロトコルによって、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト対野生型細胞においてＳＯＸ１およびＰＡＸ６の発現のレベルが増加した（図５ＣおよびＤ）。しかし、予想外に、ＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞のＮＣまたはＣＰへの誘導の間に、野生型と比較して数は少ないものの、それぞれ、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１陽性細胞が見出された。このことは、ＴＦＡＰ２Ａの発現を消失させることは、非ＣＮＳ細胞型を抑制するのに十分ではないことを示す。別の驚くべき結果は、ＴＦＡＰ２Ａの破壊は、Ｓｍｙｄ１などの他のＮＮＥ関連遺伝子の発現に影響を与えなかったことであった。これらのデータによって、ＮＮＥの形成は、単にＴＦＡＰ２Ａの発現によるものではないことが示唆される。事実、以前の研究により、ＴＦＡＰ２Ｃ（ＡＰ２α）の発現はＮＮＥにおいて優勢であることが示されている（LiおよびCornell、２００７年）。

ヒト外胚葉系統を誘導するための新規の本プラットホームは、ｉｎ ｖｉｖｏでの発生プログラムを模倣する外胚葉系統の特異化の間のＢＭＰシグナル伝達に対する重要な役割を実証した。さらに、本実施例は、この系が、ＴＦＡＰ２Ａなどの運命選択の決定に関与する規定の発生因子の役割を明らかにするために遺伝子操作されうるという概念実証を提示する。

プラコード形成を増強する因子についての小分子スクリーニング
化学的に規定された系に変換することによって、最も主要な外胚葉系統に対して優れた収率を有するモジュール分化プラットホームが得られる。しかし、ＣＰの運命の誘導は比較的低いままであった（約４０％）。ＣＰ誘導の効率をさらに増強し、ＨＴＳアッセイにおける本プラットホームの適性を実証するために、本実施例は、Ｓｉｘ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰレポーター株に関して、Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＬＯＰＡＣ）を使用して小分子スクリーニングを実施した（図６Ａ）。本実施例は、対照の分化で観察されたレベルを超えてＳｉｘ１の発現を増加させた３種の有効な候補を特定した。セロトニン受容体アゴニストであるＢＲＬ−５４４３；パルテノライド、ＮＦ−ｋＢおよびＳＴＡＴが媒介するコンフォメーション転写を阻害する能力を有する植物ホルモン；ならびにフェナントロリン、メタロプロテアーゼ阻害剤。主要なヒットのさらなる検証に関して、フェナントロリンがＳｉｘ１を発現する細胞のパーセンテージを確実に増強することを確認した（図６Ｃ、１３Ａ、１３Ｂ）。

化合物とＣＰの発生の間には明らかなリンクは存在しないが、次に、本実施例は、フェナントロリンが、プラコードの運命を富化するのに具体的にどのように作用するかを決定した。ＣＰへの分化は、Ｓｏｘ１０、Ｔ、ＭｙｏＤまたはＳｏｘ１７などの他の系統マーカーの発現を誘導することなく、対照に対してＳｉｘ１の発現を５倍増加させることを示した（図６Ｄ）。次に、本実施例は、フェナントロリンの添加が、相加的または選択的にＣＰ誘導の効率を改善するか否かを評価した。興味深いことに、ＦＧＦ２の非存在下でフェナントロリンを添加すると、Ｓｉｘ１陽性細胞がほぼ４倍（１８％に対して６９％）増加する（図６Ｅ）。ＦＧＦ２またはＦＧＦ２とフェナントロリンを添加した後、Ｓｉｘ１陽性細胞の濃縮は、それぞれ、３４％および４６％まで低下した。これらの結果は、フェナントロリンが、化合物の存在下で生存することができない場合のある他の外胚葉系統を犠牲にして、Ｓｉｘ１陽性ＣＰ細胞を選択的に豊富にする可能性があることを示唆する。結論として、小分子スクリーニングによって、好まれる系統へのｈＰＳＣの分化効率をさらに改善することができる新規因子を特定するための本外胚葉系統プラットホームを使用する実行可能性が実証される。

ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥのモジュール生成に対する修正された手法は、用量依存的ＢＭＰシグナル伝達応答に依拠するが、ＮＥの精製は、修正なしで両方の系において堅固であった（図７Ａ）。ＢＭＰシグナル伝達の最初のパルスによって、非モジュールのＫＳＲベースの分化条件と比較して、ＮＣの生成、および程度は低いがＣＰの生成において、効率の増大および可変性の低減が可能となった（図７Ｂ対図１Ｄ）。

主な注目点は、ＫＳＲなどの培地に関連する因子によって引き起こされる可変性を排除する高度に堅固な、モジュールの外肺葉分化プラットホームを確立することであった。しかし、基質をコーティングすること、および細胞密度など可変性のさらなる可能性のある発生源が存在する。マトリゲルは、一般的に、基質のコーティングに使用され、数千ものタンパク質から構成されるが、この研究で使用されるビトロネクチンは、単一の組換えタンパク質である。ビトロネクチンの代わりにマトリゲルを使用することが外胚葉系統の特異化の堅固さに負の影響を与えるか否かを決定するために、本実施例は、ビトロネクチンベースの標準プロトコルと比較して、１１個のマトリゲルのバッチを試験した。驚くべきことに、２つを除くすべてのバッチが高度に堅固な誘導効率をもたらした（図１４Ａ）。外胚葉系統の選択に影響を与えることが公知の別の可能な因子は細胞密度である。すなわち、ＰＡＸ６陽性ＮＥ対Ｓｏｘ１０陽性ＮＣの生成は、出発ｈＰＳＣ播種密度に依存することが示された（Chambersら、２００９年）。本実施例は、マトリゲル（図１４Ｂ）とビトロネクチン（図１４Ｃ）の両方を使用して、１ｃｍ^２当たり５０，０００〜３００，０００個の細胞を使用する分化を実施させ、細胞密度が細胞運命の決定に明確な役割を果たさないことを見出した。これらの追加データによって、４つの外胚葉系統を獲得する上で、基質のコーティングまたは細胞密度に対し最小限の依存度しか示さない堅固な分化プラットホームがさらに確認される。

考察
オンデマンドでｈＰＳＣから多数の特異的細胞型を誘導する目的は、適切な分化プラットホームの利用可能性に依存する。現在利用可能なプロトコルは、培地の組成および培養技術に多くの矛盾が生じやすい。ここで、本実施例は、化学的に規定された系を使用して、４つの主要な外胚葉系統のすべてを誘導するストラテジーを提示する。ｉｎ ｖｉｖｏでの発生の合図となる因子（ｃｕｅ）の適用により、分化の成功がおおいに増強され、本実施例は、４つのシグナル伝達経路のモジュレーションが、初期の外胚葉系統の選択の十分な多様性を再現するのに十分であることを示す。ＣＮＳ対非ＣＮＳの運命の線引きは、ＢＭＰによる用量依存的処置に依拠する。ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥなどの任意の特異的系統を促進する具体的なＢＭＰ濃度は非常に狭い。ＢＭＰは、ＮＣを生成するＷＮＴの活性化、ＣＰを生成するＦＧＦの活性化、およびＮＮＥを生成するＦＧＦの阻害と共同で作用することができるＴＦＡＰ２Ａを上方調節することにより、少なくとも部分的に作用する。この結果により、最小限の培地系において、少量の小分子を使用するｉｎ ｖｉｖｏでの発生を模倣することによって、外胚葉細胞の運命の決定を再現することができることが実証される。この外胚葉の分化のプラットホームは、非常に堅固であり、発生経路の遺伝学的解剖および小分子スクリーニングに適している。本研究によって、ＴＦＡＰ２Ａの損失は、ＮＥまたはＮＮＥの形成に影響を与えないが、ＮＣおよびＣＰの運命の誘導にはおおいに影響を及ぼすことも実証された。

方法
ｈＰＳＣの培養および分化
Ｈ９ ＥＳＣ（ＷＡ０９）および改変レポーター株（４０〜７０継代）をマウスの胎仔線維芽細胞フィーダーのＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ベースの培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２０％のＫＳＲ、Ｌ−グルタミン酸および１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２）で培養した。ＫＳＲ ｈＰＳＣをビトロネクチンでコーティングしたＥ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に直接移し、分化が実施される４〜５継代前の間適応させた。ＫＳＲベースの分化を以前に記載したように実施し、神経外胚葉および神経堤（Micaら、２０１３年）、ならびにプラコードおよび非神経外胚葉（Dincerら、２０１３年）の通りに実施した。

Ｅ８から出発するすべての分化を、ＥＤＴＡを使用して単一の細胞に分離し、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｔｏｃｒｉｓ）を含むＥ８に高密度で再播種した。典型的には、マトリゲルをコーティングしたディッシュに１ｃｍ^２当たり２００，０００個の細胞密度で細胞を播種した。Ｅ８からＥ６への切り替えによって分化が誘発された（すなわち、０日目）。神経外胚葉（ＮＥ）の形成は、１０μＭのＳＢおよび５００ｎＭのＬＤＮを含むＥ６で１２日目まで細胞を培養することによって生じた。はじめに、神経堤（ＮＣ）は、０日目〜２日目まで、１０μＭのＳＢ、６００ｎＭのＣＨＩＲおよび１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した。３日目の細胞を、１２日目まで、１．５ｕＭのＣＨＩＲを含む１０μＭのＳＢ中で維持した。はじめに、水晶体プラコードは、０日目〜２日目まで、１０μＭのＳＢおよび５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した。３日目の細胞を、１２日目まで、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む１０μＭのＳＢ中で維持した。はじめに、三叉神経プラコードは、０日目〜２日目まで、１０μＭのＳＢおよび５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した。２日目に、６００ｎｍのＣＨＩＲを添加した。３日目に、細胞を、１０μＭのＳＢおよび６００ｎＭのＣＨＩＲで処理した。４日目〜１２日目まで、細胞を、１０μＭのＳＢで処理した。最後に、非神経外胚葉（ＮＮＥ）を、０日目〜１日目まで、１０μＭのＳＢ、１０μＭのＳＵ５４０２および１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理し、次いで、２日目〜１２日目まで、１０μＭのＳＢおよび５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した。

Ｐａｘ６およびＳｉｘ１ Ｈ２Ｂ−ＧＦＰノックインレポーター株の生成
ドナープラスミドを構築し、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｐＵＣ１９にクローニングした。ＴＡＬＥＮ配列をＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェア（Cermakら、２０１１年；Doyleら、２０１２年）を使用して予測した。

Ｐａｘ６ ＴＡＬＥＮＳおよびＳｉｘ１ ＴＡＬＥＮＳ：。ＴＡＬＥＮをＴＡＬＥＮ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ）（Sanjanaら、２０１２年）を使用して生成し、記載されたように実施した。ドナープラスミド（２０ｕｇ）およびＴＡＬＥＮ対（それぞれ５ｕｇ）をＨ９ ｈＥＳＣ（３２〜３６継代）へヌクレオフェクトした（Ｌｏｎｚａ Ｋｉｔ Ｖ）。ヌクレオフェクトした細胞をＫＳＲ培地とＲＯＣＫ阻害剤中のＭＥＦフィーダー層に播種した。４８時間後、ピューロマイシン（１ｕｇ／ｍｌ）を添加し、陽性クローンを選択した。次いで、ピューロマイシン抵抗性コロニーを単離し、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的化をＰＣＲを使用して確認した。さらに、検証には、誘導された分化とＰａｘ６抗体またはＳｉｘ１抗体のいずれかで同時に標識するＧＦＰが含まれた。

ＲＮＡシークエンシングおよび分析
総ＲＮＡ（Ｔｒｉｚｏｌ）を少なくとも二連で分化の１２日目にＧＦＰ選別細胞から（ＮＥ、ＮＣおよびプラコード）またはバルクで（ＮＮＥ）単離した。６千万の読み取りデータが生じ、Ｔｏｐｈａｔ ｖ１．２（Trapnellら、２０１２年）を使用してアライニングした。次いで、ＨＴｓｅｑ（Andersら、２０１５年）を使用して読み取りデータをカウントし、差次的に発現した遺伝子をＤＥＳｅｑ（AndersおよびHuber、２０１０年）を使用して計算した。差次的に発現した群を、遺伝子オントロジーによる分類およびＬｉｆｅＭａｐ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（Edgarら、２０１３年）を使用するシグナル伝達経路濃縮について分析した。得られたＲＮＡシークエンシングデータセットをＧＥＯにアップロードする。

ＴＦＡＰ２Ａノックアウト株の生成
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してノックアウトｈＥＳＣ株を生成した。手短に述べると、２種のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ設計ツール（Congら、２０１３年）を使用して予測し、ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクター（Maliら、２０１３年）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。Ｃａｓ９−ＧＦＰ（５ｕｇ）と両方のガイドＲＮＡ（それぞれ１ｕｇ）をＨ９ ｈＥＳＣへヌクレオフェクトし、ＲＯＣＫ阻害剤を含むＫＳＲ培地中マトリゲルをコーティングしたディッシュに再播種した。２４時間後、細胞をＧＦＲについて選別し、ＲＯＣＫ阻害剤を含むＫＳＲ培地中のＭＥＦフィーダー層に播種した。次いで、コロニーを単離し、ＴＦＡＰ２Ａの標的化領域をＰＣＲによって増幅させ、ＴＯＰＯ ＴＡベクターにクローニングし、フレームシフトの変異を特定するためにシークエンシングした。

参考文献
1. Anders, S., and Huber, W. (2010). Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology 11, R106.
2. Anders, S., Pyl, P.T., and Huber, W. (2015). HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 31, 166-169.
3. Blauwkamp, T.A., Nigam, S., Ardehali, R., Weissman, I.L., and Nusse, R. (2012). Endogenous Wnt signalling in human embryonic stem cells generates an equilibrium of distinct lineage-specified progenitors. Nature communications 3, 1070.
4. Cermak, T., Doyle, E.L., Christian, M., Wang, L., Zhang, Y., Schmidt, C., Baller, J.A., Somia, N.V., Bogdanove, A.J., and Voytas, D.F. (2011). Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic acids research 39, e82.
5. Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 27, 275-280.
6. Chambers, S.M., Qi, Y., Mica, Y., Lee, G., Zhang, X.J., Niu, L., Bilsland, J., Cao, L., Stevens, E., Whiting, P., et al. (2012). Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature biotechnology 30, 715-720.
7. Chen, G., Gulbranson, D.R., Hou, Z., Bolin, J.M., Ruotti, V., Probasco, M.D., Smuga-Otto, K., Howden, S.E., Diol, N.R., Propson, N.E., et al. (2011). Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods 8, 424-429.
8. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823.
9. Dincer, Z., Piao, J., Niu, L., Ganat, Y., Kriks, S., Zimmer, B., Shi, S.H., Tabar, V., and Studer, L. (2013). Specification of functional cranial placode derivatives from human pluripotent stem cells. Cell reports 5, 1387-1402.
10. Doyle, E.L., Booher, N.J., Standage, D.S., Voytas, D.F., Brendel, V.P., Vandyk, J.K., and Bogdanove, A.J. (2012). TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic acids research 40, W117-122.
11. Edgar, R., Mazor, Y., Rinon, A., Blumenthal, J., Golan, Y., Buzhor, E., Livnat, I., Ben-Ari, S., Lieder, I., Shitrit, A., et al. (2013). LifeMap Discovery: the embryonic development, stem cells, and regenerative medicine research portal. PloS one 8, e66629.
12. Groves, A.K., and LaBonne, C. (2014). Setting appropriate boundaries: fate, patterning and competence at the neural plate border. Developmental biology 389, 2-12.
13. Li, W., and Cornell, R.A. (2007). Redundant activities of Tfap2a and Tfap2c are required for neural crest induction and development of other non-neural ectoderm derivatives in zebrafish embryos. Developmental biology 304, 338-354.
14. Lippmann, E.S., Estevez-Silva, M.C., and Ashton, R.S. (2014). Defined human pluripotent stem cell culture enables highly efficient neuroepithelium derivation without small molecule inhibitors. Stem cells 32, 1032-1042.
15. Luo, T., Lee, Y.H., Saint-Jeannet, J.P., and Sargent, T.D. (2003). Induction of neural crest in Xenopus by transcription factor AP2alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 532-537.
16. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E., and Church, G.M. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826.
17. Maroof, A.M., Keros, S., Tyson, J.A., Ying, S.W., Ganat, Y.M., Merkle, F.T., Liu, B., Goulburn, A., Stanley, E.G., Elefanty, A.G., et al. (2013). Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell stem cell 12, 559-572.
18. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S.M., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2013). Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell reports 3, 1140-1152.
19. Sanjana, N.E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M.M., Feng, G., and Zhang, F. (2012). A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols 7, 171-192.
20. Schorle, H., Meier, P., Buchert, M., Jaenisch, R., and Mitchell, P.J. (1996). Transcription factor AP-2 essential for cranial closure and craniofacial development. Nature 381, 235-238.
21. Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D.R., Pimentel, H., Salzberg, S.L., Rinn, J.L., and Pachter, L. (2012). Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols 7, 562-578.
22. Xie, W.F., Kondo, S., and Sandell, L.J. (1998). Regulation of the mouse cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein gene by the transcription factor AP-2. The Journal of biological chemistry 273, 5026-5032.

６．２ 実施例２：ヒト多能性幹細胞からの様々なホルモン放出下垂体細胞の誘導
要約
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、再生医療において適用するための潜在的に制限されない細胞供給源を表す。ホルモン生成細胞は、細胞療法の適用に特に適している場合があり、下垂体機能障害の処置は有効な治療標的である場合がある。以前の研究により、ｉｎ
ｖｉｖｏでの下垂体の発生に関与する発生の相互作用を模倣する３Ｄオルガノイド培養を使用するマウスのＥＳＣからの下垂体系統の誘導が実証された。

本実施例では、細胞の製造に適する化学的に規定された単層培養条件を使用してｈＰＳＣから下垂体前葉系統を誘導するシンプルで効率の良いストラテジーが記載されている。本実施例は、精製されたプラコード系統が、複雑な共培養条件の非存在下で、規定の合図となる因子を使用して下垂体の運命に誘導されうることを実証する。単一細胞の遺伝子発現分析を使用して、本実施例は、８０％を超える下垂体ホルモン発現細胞を有するｈＰＳＣから誘導された系統の多様性を規定する。最後に、本実施例は、下垂体機能障害のマウスモデルへの移植後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのベースとなるホルモン放出と刺激に誘導されるホルモン放出およびｉｎ ｖｉｖｏでの生着およびホルモン放出について実証する。

ここで、本実施例は、十分に規定したｃＧＭＰにより利用可能な単層培養条件下で、ｈＰＳＣ由来の下垂体前葉のホルモン産生細胞の効率的な誘導について報告する。さらに、本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏで達成することができる下垂体前葉のサブタイプの多様性を対象とする単一細胞のｍＲＮＡ発現データを提示する。さらに、本実施例は、生成された細胞が、適当な刺激に応答することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的であり、ｉｎ ｖｉｖｏで下垂体機能低下症の動物モデルにおいてホルモンを分泌することを示す。このデータによって、ｍＥＳＣを使用する以前の報告とは対照的に、下垂体細胞の運命が、腺の発生の複雑な３Ｄ編成を模倣することとは無関係に、かつ、下垂体前葉のアイデンティティを誘導すると考えられる視床下部細胞との直接の接触なしに、誘導されうることが示される。本実施例は、精製したプラコード前駆体細胞に適当なシグナルを与えることによって、下垂体のアイデンティティを効率よく特定することができ、モルフォゲン勾配をさらに操作することによって、ホルモンの細胞型の相対的組成に制御された変更を与えることが可能となることを実証する。本実施例は、下垂体機能低下症の細胞ベースの処置に対するさらなる開発に適切な様々なホルモン生成細胞型にアクセスする堅固な分化プラットホームを提供する。

結果
十分に規定した条件下でのｈＰＳＣからの頭蓋プラコードの誘導
本実施例は、ｈＰＳＣからの腺下垂体を含む頭蓋プラコードの生成について最近報告した（Dincerら、２０１３年）。しかし、以前のプロトコルは、下垂体系統の細胞を生成するために最適化されておらず、いくつかの不明確な試薬、例えば、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、マトリゲルおよびマウスの胎仔線維芽細胞（ｉＭＥＦ）フィーダーを含有した。これらの構成成分は、所与の分化プロトコルの堅固さに対する可変性のかなりの発生源であり、ヒトへの移行に適する細胞療法の開発を複雑化している。さらに、ＰＳＣからの下垂体前葉系統の細胞の生成効率は、マウスとヒトの細胞の両方について公開されたすべての研究において低いものであった。最後に、マウスのＥＳＣにおける３Ｄ培養の研究によって示唆された誘導プロセスの間に、視床下部細胞との直接的相互作用が必要であるか否か（Sugaら、２０１１年）、または制限された数の規定のシグナルが下垂体の運命を誘発するのに十分であるか否かを、最終的に評価することが重要であった。

このプロトコルの最初のステップは、下垂体前葉系統を生成する能力のある初期頭蓋プラコード細胞の効率的な誘導である。新規な頭蓋プラコード誘導プロトコルは、無血清単層ベースの誘導条件に依拠し、十分に規定したｃＧＭＰにより利用可能な構成成分を使用する。プラコード誘導を誘発するために使用される特異的シグナルは、ｉｎ ｖｉｖｏでプラコード誘導を特定すると考えられる発生シグナルに基づく（図１５Ａ）。本実施例は、中程度の濃度のＢＭＰ４への曝露が頭蓋プラコードの運命の効率的な誘導に必要とされることを観察している。さらに、ＦＧＦシグナルの非存在下で水晶体のデフォルトも報告するｉｎ ｖｉｖｏでのニワトリ胚の発生における研究（Baileyら、２００６年）と一致する条件下で、水晶体は「デフォルト」プラコードの運命であると思われる（図２２）。詳細的な一時的発現分析により、ｍＲＮＡレベル（図１５Ｂ）とタンパク質レベル（図１５Ｃ）の両方で６日間の分化までに、多能性マーカーの急速な損失、ならびにＳＩＸ１、ＥＹＡ１およびＤＬＸ３／５などの重要なプラコード遺伝子の堅固な誘導が明らかとなった。ＳＯＸ１０（神経堤）、ＳＯＸ１７（外胚葉）、Ｔ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）またはＭＹＯＤ（筋原性の系統）などの夾雑する細胞型の存在をマークする転写物は、これらの条件下では誘導されなかった（図１５Ｂ）。以前の研究により、ｈＰＳＣから誘導されるプラコード細胞の「デフォルト」アイデンティティとしてＰＡＸ３＋三叉神経プラコードが報告された（Dincerら、２０１３年）。規定のプラコード誘導条件を使用するこのプロトコルは、ＰＡＸ３発現よりＰＡＸ６を示す（図１５Ｃ）。プラコード誘導およびＰＡＸ６発現の収率および選択性をさらに定量化するために、本実施例は、ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（図２５）、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＳＯＸ１０−ＧＦＰ（Chambersら、２０１２年；Micaら、２０１３年）に対するｈＥＳＣ遺伝的レポーター株を使用した。分化の６日目および１１日目のフローサイトメトリーにより、夾雑するＳＯＸ１０陽性神経堤細胞の非存在下で、ＰＡＸ６陽性およびＳＩＸ１陽性の前頭蓋プラコードの堅固な誘導が確認された（図２３）。

ｈＰＳＣから誘導された頭蓋プラコードに由来する下垂体前葉のパターニング
下垂体の複雑な形態発生は、初期の胚段階の間に起こる（マウスで約Ｅ１０）。腺の前葉および中葉は下垂体プラコードに対応する口側外胚葉から誘導されるが、後下垂体は神経外胚葉から発生する（図１６Ａ）。誘導のための組織の相互作用およびＦＧＦ、ＢＭＰおよびＳＨＨを含む種々の規定のシグナル伝達経路は、ｉｎ ｖｉｖｏでの嚢の陥入、適切な腺の発生およびホルモンサブタイプの特異化に重要であることが示された（図１６Ａ、上のパネル）（検討のため、（Zhuら、２００７年）を参照のこと）。ここで、本実施例は、プラコードの運命へとｈＰＳＣの分化を方向付けるこれらの重要なシグナル伝達経路をモジュレートすることが、下垂体アイデンティティを誘発するのに十分であるか否かを評価した（図１６Ａ、下のパネル）。このデータにより、ＳＨＨ、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０に時間を決めて曝露することにより、ＰＩＴＸ１／２、ＬＨＸ３／４ならびにＨＥＳＸ１およびＳＩＸ６を含む下垂体前葉の発生に関連する遺伝子を堅固に誘導することが示される（図１６Ｂ）。下垂体分化条件下での発現は、ＰＩＴＸ１、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４およびＳＩＸ６に対する抗体を使用するタンパク質レベルについても確認された（図１６Ｃ）。

本実施例は、自らのｃＧＭＰにより利用可能なＥ８／Ｅ６ベースの誘導プロトコルを、公開されたＫＳＲベースのプラコード誘導プロトコル（ＰＩＰ）と比較した（Dincerら、２０１３年）。分化の効率に劇的な影響を及ぼすＫＳＲのロット間の変動を補うために、本実施例は、２つの異なる濃度のＢＭＰ阻害剤、ＬＤＮ−１９３１８９を使用してＰＩＰを実施した。１５日間の分化後、ＳＩＸ１などの頭蓋のプラコードのマーカーならびに頭蓋の下垂体マーカーであるＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＬＨＸ３、およびＬＨＸ４をプロービングするｑＲＴ−ＰＣＲを使用して細胞を分析した。さらに、神経外胚葉マーカーであるＰＡＸ６および非神経外胚葉転写因子であるＴＦＡＰ２Ａがこの分析に含まれた（図３０Ａ）。ＳＩＸ１およびＬＨＸ３を染色する免疫蛍光法を使用して、細胞のアイデンティティをタンパク質レベルでさらに確認した（図３０Ｂ）。これらの実験に使用されたＫＳＲのロットは、ＳＩＸ１およびＴＦＡＰ２Ａの低い発現ならびにＰＡＸ６の高い発現によって示されるように、下垂体またはプラコードのアイデンティティを有効に誘導することができなかった。ＬＤＮ−１９３１８９の濃度を低下させることにより、完全にではないが部分的に、この新たなＥ８／Ｅ６ベースのプロトコルと比較した効果を救うことができた。ここで提示したｃＧＭＰにより利用可能なプロトコルは、種々のｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ株にわたって確実かつ同等の効率で作用する（図３１Ａ〜３１Ｃ）。さらに、本実施例は、組換えタンパク質であるＳＨＨをパルモルファミンおよびＳＡＧなどの小分子スムーズンドアゴニストで置きかえることができることを確認した（図３１Ｄおよび３１Ｅ）。しかし、堅固な下垂体前葉系統のマーカーの誘導にもかかわらず、本実施例は、小分子ベース誘導条件を使用する場合に細胞死の増加を観察し、次の研究で組換えＳＨＨを使用することとなった。

興味深いことに、ｈＰＳＣから誘導された視床下部の原基（Maroofら、２０１３年；Merkleら、２０１５年）によって馴化した培地（図２４）は、下垂体マーカーの発現を堅固に誘導するのに不十分であった（図１６Ｂ）。具体的には、ＣＭのみを使用する場合、ＬＨＸ４ならびにＨＥＳＸ１およびＳＩＸ６の誘導の欠如が存在した。ＬＨＸ４およびＳＩＸ６は、下垂体前駆体の増殖に関係し、このことは視床下部系統であるＣＭの存在下で生じた細胞の総数が低減したことを説明しうる。視床下部の原基と直接相互作用する組織が下垂体発生の間に必要とされる場合があるという証拠がマウスのＥＳＣにおいて存在する（Sugaら、２０１１年）。しかし、このデータでは、規定の外部からの合図となる因子が下垂体プラコードのアイデンティティを誘導するのに十分である場合があることが示唆される。下垂体プラコードの誘導および分化の間の下垂体組織の役割をより直接的に評価するために、実施例は、ＳＩＸ１：：Ｈ２ＢＧＦＰレポーター細胞株を使用した（図２５）。デフォルト条件下で分化した初期のプラコード細胞を分化の６日目にＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ発現について選別し、続いて、水晶体条件（デフォルト）、ＳＨＨ、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０の存在下（下垂体条件）またはｈＰＳＣから誘導された視床下部神経外胚葉によって馴化した培地の存在下（図１７Ａ）のいずれかでさらに分化させた。遺伝子発現分析によって、いずれの視床下部系統の細胞も欠く、精製したＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ＋細胞においてでさえ、規定された誘導条件は、重要な下垂体マーカーのすべての発現を誘導するのに十分であることが明らかとなった。対照的に、視床下部のＣＭは、デフォルト水晶体条件下で観察されたレベルを上回るＬＨＸ４の発現を誘導することができなかった（図１７Ｂ）。下垂体誘導は、前プラコード組織のパターニングを除外する標準プロトコルと比較して遅れて開始するため（６日目対４日目）、誘導、特にＬＨＸ４のレベルは、無選別細胞に関する標準の下垂体プラコード誘導プロトコルと比較して、ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ精製細胞においてやや低いものであった。あるいは、選別プロセスは、誘導効率を低下させる場合もある。

異なる実験のセットにおいて、本実施例は、ｈＰＳＣから誘導された視床下部の原基と直接接触させて、６日目に選別したＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ＋細胞を共培養し、さらなる分化の９日目（１５日目）に、計画プラコードマーカーであるＳＩＸ１および下垂体マーカーであるＬＨＸ３について細胞を染色した。さらなる対照として、本実施例は、「デフォルト」の水晶体条件ならびに標準的下垂体条件および視床下部用に馴化した培地を含んだ（図１７Ａ）。水晶体条件によってレチノイド様クラスターが形成され、ＳＩＸ１の発現が下方調節され始め、下垂体条件によってＳＩＸ１／ＬＨＸ３のダブル陽性細胞が得られた。馴化した培地によってＳＩＸ１を維持することができ、一方、ごく弱いレベルのＬＨＸ３の発現を誘導した。共培養条件はＳＩＸ１発現を維持することができるが、ＬＨＸ３の発現は観察されなかった（図１７Ｃ）。これらの知見は、正しい外部からの発生のキュア（ｃｕｒｅ）は、視床下部系統の細胞からの、細胞接触により媒介されるシグナルの非存在下で、ｈＰＳＣを下垂体系統細胞へと方向付けるのに十分であるという概念を支持するものである。本実施例は、共培養条件をさらに最適化することにより、最終的に、下垂体系統の細胞が得られる場合があることについて除外できないが、規定の系統のｈＰＳＣから誘導された細胞に作用する規定のシグナルの使用は、より複雑な共培養ベースの系に本質的な可変性を低減する場合があり、続くトランスレーショナルな応用にとってより適切なプラットホームを提示する場合がある。

ｈＰＳＣから誘導された腺下垂体細胞は機能的である
腺下垂体の主な機能は、ストレス応答（副腎皮質刺激ホルモン［ＡＣＴＨ］）骨格成長（成長ホルモン［ＧＨ］）、代謝（甲状腺刺激ホルモン［ＴＳＨ］）および生殖機能（プロラクチン［ＰＲＬ］、および卵胞刺激ホルモン［ＦＳＨ］、黄体形成ホルモン［ＬＨ］）を含むヒトの身体における重要な事象を制御する６つの異なるホルモンを分泌することである。したがって、本実施例は、３０日間の分化後に、培養におけるホルモンのサブタイプの存在を評価した。本実施例は、その培養において、ＡＣＴＨ、ＧＨ、ＰＲＬならびにＦＳＨおよびＬＨ発現細胞を検出することができた（図１８Ａ）。細胞培養上清のＥＬＩＳＡ測定によって、細胞が、ＡＣＴＨ、ＧＨおよびＦＳＨの分泌の基本的速度を示すことが確認された（図１８Ｂ）。下垂体前葉におけるホルモンの放出は、種々の標的器官によって分泌される種々の因子から、および門脈を介して視床下部細胞によって放出される上流の因子からのいくつかのフィードバック機構によってしっかりと調節される。したがって、下垂体細胞の機能的応答は、これらの種々の調節刺激と密接にリンクする必要がある。分化３０日目のｈＰＳＣから誘導された下垂体細胞は、ＣＲＦ、ストレシンまたはウロコルチンによる刺激に応答して、ＡＣＴＨの放出の誘導を示した。対照的に、グレリンやソマトクリニンなどの不適当な刺激への曝露はＡＣＴＨの放出を誘発しなかった（図１８Ｃ）。一方、ＣＲＦを除くソマトクリニンへの曝露は、ＧＨ放出において堅固な増加を誘発した（図１８Ｄ）。最後に、本実施例は、ナファレリンに曝露した際のＦＳＨの誘導を示すことができた（図１８Ｅ）。

単一細胞の遺伝子発現分析は多様なホルモン系統を明らかにする
下垂体腺内での種々のホルモン前駆体系統の分化（Tabar、２０１１年）は、種々のパターニング事象に関与するしっかりと調節された空間的および時間的プロセスである（図１６Ａ）。ｈＰＳＣベースの培養系における前駆体の運命の多様性に対処するために、本実施例は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットホームを使用する単一細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。本実施例は、多能性幹細胞から成熟ホルモン発現細胞への全下垂体発生にわたる３４種の遺伝子についてプロービングした。本実施例は、Ｔ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＭＹＯＤおよびＳＯＸ１７などの有効な中胚葉または外胚葉の夾雑物についてアッセイするためのプライマーも含めた。分化３０日目および６０日目の主成分分析（ＰＣＡ）により、ほとんどの細胞が明確な時間に依存する変化を示し、いくつかの細胞だけが、計画より前に移動するか（すなわち、３０日目の細胞が６０日目のプロファイルを示す）、または遅延する（すなわち、６０日目の細胞が３０日目の特性を保持する）ことが示された（図１９Ａ、Ｂ）。スクリープロット（図１９Ｂ）により、データの変動のほとんどを説明するＰＣＡ成分が規定された。階層的クラスタリングによって、いくつかのより小さなサブクラスターと共に散在する２つの主要なクラスターにおいて生じる時間軸に非常に沿う細胞の分離が確認された（図１９Ｃ）。

さらに、生のｃｔ値に基づくヒートマップが図３２に提供されている。本実施例は、前駆体マーカーであるＨＥＳＸ１、およびＮＥＵＲＯＤ１、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞で一過的に発現したより成熟したマーカーについての３０日目の培養における免疫蛍光染色によって、単一細胞のデータをさらに検証した。分化の１５日目の免疫蛍光分析は、ＮＥＵＲＯＤ１の陰性対照として機能した（図３３Ａ）。本実施例は、分化３０日目の同一細胞中で、ＨＥＳＸ１およびＮＥＵＲＯＤ１の同時標識化を確認した。しかし、ＨＥＳＸ１発現のレベルは、１５日目と比較して３０日目において非常に低かった。

この分析によって、３０日目の培養物が、高いパーセンテージの下垂体様細胞を含有し、細胞の約７０％が、下垂体マーカーであるＰＩＴＸ１およびＬＨＸ３を同時発現することが明らかとなった。このパーセンテージは６０日目までにさらに上昇した。一方、３０日目までに、本実施例は、Ｔ、ＳＯＸ１７またはＭＹＯＤを発現する４個の細胞（分析されたすべての細胞の約５％）を検出できるに過ぎず、低いパーセンテージの有効な夾雑物の存在を示唆する。ほとんどの細胞が、下垂体のＰＯＭＣ系統の発生に対して重要であることが示されている転写因子であるＴＢＸ１９（ＴＰＩＴ）を発現した（Lamoletら、２００１年）。さらに、ほとんどの細胞（約８４％）が頭蓋のプラコードのマーカーであるＳＩＸ１を発現した。ほとんどのＳＩＸ１＋細胞は、下垂体プラコードの運命に整合する、ＰＡＸ６も発現した。しかし、本実施例は、組み合わせて合計２０％の細胞を表す小さなサブセットの細胞において、ＰＡＸ２（上鰓の）、ＰＡＸ３（三叉神経の）またはＰＡＸ８（耳の）を含む他のプラコードの運命の発現も観察した。

下垂体前葉の最終的な機能単位は、特異的なホルモンを発現し、分泌する細胞である。この単一細胞の分析により、分化の３０日目に、およそ５０％の細胞が少なくとも１種のホルモンｍＲＮＡ種を発現することが示された。このパーセンテージは、６０日目までに約８０％まで上昇し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を示した（図１９Ｄ）。発生中および成体のげっ歯類の下垂体の両方は、２種以上のホルモンを発現する細胞を含有することができることが報告されている（Nunezら、２００３年；Villalobosら、２００４年）。実際に、ｈＰＳＣから誘導された培養では、本実施例は、分化の３０日目までに細胞の１０％において２種以上のホルモン転写物（「多量ホルモン」）の発現を検出することができた。分化の６０日目までに、このパーセンテージは、全細胞集団の約３０％まで増大した（図１９Ｄ）。本実施例は、６０日目までに多量ホルモン細胞の大多数がＰＯＭＣおよびＧＨの両方（約１０％）を発現することを見出した。３種以上の転写物を発現する細胞は、６０日目までに検出されるのみで、通常はＰＯＭＣを含有した（図２６）。

分化の３０日目にｈＰＳＣから誘導された下垂体細胞において発現される最も頻度の高いホルモン転写物はＰＯＭＣ（全細胞の３０％）であり、背下垂体の原基から出現すると考えられる。ＧＨまたはＴＳＨなどのより腹側の細胞型は、分化の３０日目までに全細胞集団の低いパーセンテージ（約２０％）しか構成しなかった。ＰＲＬは、さらに小さな細胞のサブセットにおいて発現された。最後に、２つの最も腹側の細胞型であるＦＳＨおよびＬＨは、発生のごく後期にのみ出現し、３０日目まで検出されなかった（図１９Ｅ）。分化の６０日目に、ＰＯＭＣおよびＧＨ発現細胞の数は、それぞれ、５５％および３０％まで増加した。ほんの僅かの細胞だけが、分化の６０日目にＦＳＨおよびＬＨを発現した（図１９Ｅ）。単一細胞のＰＣＲに加えて、本実施例は、市販のＢＤ Ｌｙｏｐｌａｔｅのスクリーニングキットを使用して培養の３０日目の細胞表面マーカーの発現を特徴付けた（図３４）。

モルフォゲンを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの下垂体前葉細胞の背側−腹側パターニング
下垂体機能低下症は、非常に多様で複雑な疾患である。下垂体機能障害の原因に応じて、影響するホルモンの種類は様々となりうる。例えば、ＧＨ不足は、通常、先天性遺伝疾患を有する患者で観察される（van Gelderenおよびvan der Hoog、１９８１年）が、
後に放射線処置を受けた患者でも生じる場合がある（ＳｋｌａｒおよびＣｏｎｓｔｉｎｅ、１９９５年）。対照的に、下垂体の自己免疫疾患である、リンパ球性下垂体炎は、主にＡＣＴＨに影響を及ぼす（Rivera、２００６年）。したがって、将来のｈＰＳＣから誘導された下垂体細胞の広範な適用のために、細胞代替療法が、所与の患者集団の特異的な需要に対してカスタマイズされる必要を有する場合がある。の標準的条件により、背側のＡＣＴＨ＋細胞が最も得られるため、本実施例は、さらなるシグナルを使用して、より腹側の細胞型の生成を増強することができるか否かを調べた。

ＦＧＦ８およびＢＭＰ２シグナル伝達の勾配が、マウスの下垂体の背側−腹側のパターニングに重要な役割を果たすことが示されている（Rosenfeldら、２０００年）（図１６Ａ）。したがって、本実施例は、高濃度のＦＧＦ８（背側化する）またはＢＭＰ２（腹側化する）のいずれか、またはｉｎ ｖｉｖｏで生じるモルフォゲン勾配を模倣する中程度の濃度レベルで２種のパターニング因子の混合物で、下垂体系統の細胞を処理した。下垂体前駆体系統およびホルモンのサブタイプの重要な転写因子についての遺伝子発現研究により、ほとんどの腹側細胞型を生成するためのＢＭＰ２の必要性が確認された。ＦＳＨＢおよびＬＨＢは、ＢＭＰ２の存在下で有意に上方調節されたが、ＦＧＦ８はＦＳＨＢの収率に負の作用を発揮した（図２０Ａ）。

次に、本実施例は、分析の解像度を上昇させるために単一細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。ＦＧＦ８、ＢＭＰ２または両方の因子の組合せで処置した、６０日目の単一細胞の教師なし階層的クラスタリングにより、３つの大きな細胞のクラスターが明らかとなった（図２０Ｂ）。さらに、生のｃｔ値に基づくヒートマップが図３２において提供される。３つの処置のそれぞれに対応する細胞が、クラスター毎に観察された。しかし、クラスター３の全細胞の４９％がＢＭＰ２処理群に由来する一方、クラスター２の全細胞の５６％はＦＧＦ８群から誘導された。クラスター１は、およそ等しい比率で、３つの処理のすべてに由来する細胞を表した。下垂体前葉ホルモンのそれぞれについて単一細胞の発現を分析することによって、本実施例は、ｈＰＳＣベースの培養系におけるマウスのｉｎ ｖｉｖｏ研究（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、２０００年）から予測される知見を確認することができた。高濃度のＦＧＦ８によって、高濃度のＢＭＰ２と比較して（それぞれ、７５％対４０％）、ＰＯＭＣを発現する細胞の数の増加が導かれた（図２０Ｃ）。さらに、両方のシグナル伝達分子の中間の濃度によって、ＦＧＦ８またはＢＭＰ２のいずれか単独と比較して、ＧＨおよびＴＳＨＢを発現する細胞の増加を生じた（図２０Ｃ）。最後に、高濃度のＢＭＰ２は、ＡＣＴＨ＋背側細胞型の数を減少させるだけでなく、ＦＳＨＢおよびＬＨＢを発現する腹側細胞型の数を増加させる。

次に、本実施例は、３つの培養条件下で（ＦＧＦ８、ＦＧＦ８／ＢＭＰ２、ＢＭＰ２：図２０Ｄ）、４種の異なるホルモンについて染色する伝統的な免疫蛍光法を使用して、単一細胞のｑＲＴ−ＰＣＲデータを検証した。免疫細胞化学のデータの定量化により、ＦＧＦ８処理した培養において、背側のＡＣＴＨ発現細胞への偏りが確認された。ＰＲＬおよびＧＨは、以下のＦＧＦ８／ＢＭＰ２を用いる組合せ処理で観察された最も豊富なホルモンであり、一方、ＦＳＨは、ＢＭＰ２で処理された培養において最も豊富な細胞型であった（図２０Ｅ）。ＰＯＭＣは、ＡＣＴＨの前駆体ポリペプチドであり、翻訳の間に４４種のアミノ酸が除去され、最終的にホルモンＡＣＴＨを生じる。

移植したヒトＥＳＣから誘導された下垂体前葉細胞は、下垂体機能低下症のｉｎ ｖｉ
ｖｏモデルにおいて機能的である
ｉｎ ｖｉｖｏで生存し、機能するｈＰＳＣから誘導された下垂体細胞の能力を評価するために、本実施例は、３０日目の細胞を下垂体切除したラットに移植した。傍咽頭方法を使用する下垂体（図２１Ａ）の外科手術による除去の後、ラットにおける下垂体機能低下症を、血中のＡＣＴＨレベルを測定することによって確認した。下垂体切除に成功したラットを２つの実験群、マトリゲルのみの注射を受ける偽群（ｎ＝４）とｈＥＳＣから誘導された下垂体細胞を含有するマトリゲルを受ける移植群（ｎ＝７）に分けた（３０日目、ＢＭＰ２処理を行わない標準条件）。２×１０^６個の細胞を皮下に移植した後、処置群および対照群の両方について、移植後７週間、血流中の下垂体ホルモンレベルをモニタリングした（図２１Ｂ〜Ｄ）。移植の３週間後からスタートして、移植群のホルモンレベルは、１週間の時点で比較して増加し始め、一方偽群のレベルはほとんど変化しないままであった。ＡＣＴＨレベルは、実験の７週間の期間、移植対対照群で一定の高いレベルのままであった（図２１Ｂ）。損傷していない動物で観察されたＡＣＴＨレベルと比較して、移植群は、ＡＣＴＨレベルの約６０％を回復した（データは示さず）。２種の他のホルモン、すなわち、ＧＨおよびＬＨのレベルの増加は、より可変的で、試験した時点で全く有意ではなかった。しかし、本実施例は、移植の３週間および７週間後のＧＨレベルでは有意な増加を検出することができた（図２１Ｃ）。ＬＨレベルの有意な増加は観察されなかった（図２１Ｄ）。移植した動物のホルモンレベルを週齢の一致するインタクトなラットのレベルと比較し、ＡＣＴＨについて約４０％、ＧＨについて約２８％、およびＰＲＬについて約２０％であることが分かった（図３５）。移植細胞の機能を評価する最終段階で、本実施例は、ホルモン分泌によって影響を受けた下流因子の測定を実施した。ＡＣＴＨの放出に際し、通常のＨＰＡ軸応答の一部として副腎により分泌されるグルココルチコイドの増加が存在する（WebsterおよびSternberg、２００４年）。ヒトでは、ＡＣＴＨは、コルチゾールの放出を誘発するが、げっ歯類の主なグルココルチコイドはコルチコステロンである（Wand、２００８年）。したがって、本実施例は、両方の実験群でコルチコステロンのレベルを測定した（図２１Ｅ）。移植群では、移植の７週間後までに、統計的に有意な差を生じるコルチコステロンの一貫して高いレベルが示された。これらのデータにより、ｈＰＳＣから誘導された細胞によって放出されたヒトのＡＣＴＨは、宿主の副腎からのステロイドホルモンの放出を誘発することができることが示される。移植の７週間後に、動物を屠殺し、移植片を組織学的に分析した（図２１Ｆ〜Ｇ）。本実施例は、移植片に関して６つの下垂体前葉ホルモンのそれぞれを発現する細胞を検出することができた（図２１Ｆ）。これらのデータにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の生存が確認され、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる分化と細胞の成熟が示唆される。移植片の立体解析学的定量化によって、移植片当たり平均３．０８×１０^６±０．４２×１０^６（平均±ＳＤ；ｎ＝３）個のヒトの細胞が示され、免疫組織化学によりＳＩＸ１とヒトの核抗原（ｈＮＡ）の同時発現により決定されるように、大多数（９５％超）はプラコードのアイデンティティを有した。移植片におけるＫｉ６７陽性増殖細胞の比率は、ｈＮＡ＋集団の９．６％±０．６％（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。移植片全体は、多能性関連表面マーカーであるＳＳＥＡ−４およびＴｒａ１−６０について陰性に染色された。腫瘍の徴候は、移植の７週間後まで検出されなかった。移植片の立体解析学的定量化により、動物当たり平均１８２１２±２９６９個のＡＣＴＨ^＋細胞が示され（光学的細胞分画法）、８１±１０ｍｍ^３の移植片体積を有した（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ；平均±ＳＤ；ｎ＝３）。

方法
ＥＳＣおよび培養条件
ヒト多能性幹細胞Ｈ９（ＷＡ−０９、ＸＸ、３５〜５０継代）、ＭＥＬ−１（ＸＹ、２０〜４０継代）、ＨＵＥＳ−６（ＸＸ、２４〜４０継代）、ｈｉＰＳＣ（胎仔の線維芽細胞株ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）から誘導した社内で生成したｈｉＰＳＣ（Chamberら、２００９年）、ＸＹ、１５〜３０継代）および改変レポーター細胞株（すべてＨ９バックグラウンド、４０〜７５継代）をＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｅ８）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Chenら、２０１１年）を使用するＶＴＮ−Ｎ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で維持し、ＥＤＴＡを使用して１週間に２回継代した（Chen、２００８年）。細胞を１ヵ月に１回、マイコプラズマの夾雑について試験した。

ＥＳＣの分化
神経外胚葉への分化を以前に記載したもの（Chambers ２００９年）に若干の修正を加えて実施した。手短に述べると、細胞をＥ８＋Ｙ−２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ）中でＶＴＮ−Ｎでコーティングしたディッシュに１ｃｍ^２当たり２５００００個の細胞で播種した。２４時間後（０日目）、培地を１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１μＭのＸＡＶ９３９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（５日目まで）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６（Ｅ６）（Ｃｈｅｎ）に交換した。５日目から、ＸＡＶ９３９を培地から除去した。培地を１１日目まで毎日交換した。

視床下部外胚葉の分化を以前に記載したもの（Maroofら、２０１３年；Merkleら、２０１５年）に若干の修正を加えて実施した。手短に述べると、細胞をＥ８＋Ｙ−２７６３２中でＶＴＮ−Ｎでコーティングしたディッシュに１ｃｍ^２当たり２５００００個の細胞で播種した。２４時間後（０日目）、培地を１０μＭのＳＢ４３１５４２を２日間補充したＥ６に交換した。２日目から、Ｅ６培地に高濃度のＳＨＨ（１μｇ／ｍｌ）を１１日目まで補充した。馴化培地の調製のために、細胞をＥ６のみで２４時間培養した後に２回洗浄して誘導培地から潜在的なＳＨＨを除去した。１３日目にＥ６のみを細胞に添加し、２４時間馴化した。これを使用する前に、馴化培地を滅菌濾過して、デブリおよび死細胞を除去した。

水晶体の分化について、細胞をＥ８＋１０μＭのＹ−２７６３２中でＶＴＮ−Ｎでコーティングしたディッシュに１ｃｍ^２当たり２５００００個の細胞で播種した。２４時間後（０日目）、培地を１０μＭのＳＢ４３１５４２および５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＥ６に交換した。培地は毎日交換した。３日目に、ＢＭＰ４を培地から除去し、細胞を１５日目までＥ６＋１０μＭのＳＢ４３１５４２中で培養した。１５日目から、細胞をＥ６のみで１２０日までの間維持した。３０日目から、フィーディングの間、週に１回ＶＴＮ−Ｎ（１：１００）を培地に補充し、細胞がプレートから剥がれるのを防いだ。

下垂体の分化について、細胞をＥ８＋１０μＭのＹ−２７６３２中でＶＴＮ−Ｎでコーティングしたディッシュ（分化は、２４ウェルプレートで最も進む）に１ｃｍ^２当たり２５００００個の細胞で播種した。２４時間後（０日目）、培地を１０μＭのＳＢ４３１５４２および５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＥ６に交換した。培地は毎日交換した。３日目に、ＢＭＰ４を培地から除去し、細胞をＥ６＋１０μＭのＳＢ４３１５４２中で１日培養した。標準的な分化条件として、４日目に、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃ２５ＩＩ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）をＥ６に補充した。一部の実験では、ＳＨＨを１μＭのパルモルファミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）または１μＭのＳＡＧ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置きかえた。ここから、培地の体積を倍にして、１５日目まで細胞を１日おきにフィーディングした。分化の１５日目に、ＢＤＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ細胞選別機を使用してＳＩＸ１ Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ^＋細胞を選別した。次いで、精製した細胞を、ポリオルニチン／ラミニン／フィブロネクチンをコーティングしたプレートに１０μＭのＹ−２７６３２、２００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂおよび５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０を補充したＥ６に液滴として播種した（１滴１０μｌ当たり５００００個の細胞）。２４時間後、３０日目まで、培地をＳＨＨ、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０を含有するＥ６に交換した。培地は一日おきに交換した。一部の実験では、下垂体誘導を若干遅く開始するか（６日目）、または４日目か６日目のいずれかから視床下部外胚葉で馴化した培地中で細胞を分化させた。共培養実験では、ＳＩＸ１ Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ陽性細胞を６日目に選別し、１ｃｍ^２当たり５００００個の細胞を、１０μＭのＳＢ４３１５４２のみを補充したＥ６中の視床下部神経外胚葉細胞に直接播種した。

下垂体細胞の成熟およびサブタイプの特異化
標準的な（本文で別段言及していなければ）下垂体の成熟として、３０日目の培地は、さらなる３０日のために「Ｅ６のみ」に交換した。パターニング実験（本文で示した）として、高濃度のＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ、背方化）、高濃度のＢＭＰ２（２０ｎｇ／ｍｌ、腹方化）または中間の濃度で両方（ＦＧＦ８ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ２ １０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかをＥ６培地に補充した。

ＲＮＡ抽出および伝統的な定量的リアルタイムＰＣＲ
製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈａｓｅ−ｌｏｃｋチューブ（５Ｐｒｉｍｅ）と組み合わせてＴＲＩｚｏｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）試薬を使用して、少なくとも３つの独立した実験から全ＲＮＡを抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。定量的ＲＴ ＰＣＲとして、本実施例は、ＢｉｏＲａｄのＣＦＸ９６ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒでＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプライマーアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ）と組み合わせたＳＳｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。すべての反応を製造業者のプロトコルに従って実行した。遺伝子発現をグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および対照の細胞型（図で示されている）に対して正規化した。結果は、ΔΔＣｔ方法（LivakおよびSchmittgen、２００１年）を使用して計算した。

単一細胞の定量的ＲＴ−ＰＣＲ
単一細胞のＰＣＲ分析として、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を剥離させた。４０μｍの細胞ストレーナーを通して濾過した後、ＢＤＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ機器でＤＡＰＩ陰性細胞を選別し、実質的に細胞調製物からデブリと死細胞を一掃した。選別された細胞懸濁液を１ｍｌ当たり４０００００個の細胞の濃度まで調整した。製造業者のマニュアルに従ってＦｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１システムを使用して単一細胞を捕捉した。各Ｃ１チップ毎の捕捉率を標準組織培養明視野顕微鏡を使用して微視的に確認した。捕捉率は以下の通りであった：３０日目：９１％（８７／９６）６０日目：９４％（９０／９６）６０日目 ＦＧＦ８：９３％（８９／９６）６０日目 ＦＧＦ８／ＢＭＰ２：８９％（８５／９６）６０日目 ＢＭＰ２：９３％（８９／９６）。細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコルに従って、ウェットラボで試験したＦｌｕｉｄｉｇｍのＤＥＬＴＡｇｅｎｅアッセイと組み合わせてＣ１を使用してｃＤＮＡに転写した（図２７）。ウェットラボで試験したＤＥＬＴＡｇｅｎｅアッセイは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍから直接購入した。得られたｃＤＮＡを１：５に希釈して、製造業者のマニュアル（「Fast Gene Expression Analysis Using EvaGreen on the BioMark or BioMark HD System」）に従って、ＥｖａＧｒｅｅｎ化学と組み合わせたＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋシステムを使用して単一細胞のＰＣＲ増幅に供した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍの９６．９６ Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙを使用してＰＣＲを実行した。各プライマー対をチップ上に技術的に二連でランした。偽陰性の数を増加させることを対価として偽陽性の細胞（calls）を最小限にするために、技術的プライマー反復間で一貫した増幅結果を生じる単一細胞のみを考慮した。全体の不一致率は低かった（プライマー対当たり３％超）。ＦｌｕｉｄｉｇｍのＳＩＮＧｕＬＡＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓｅｔ ｆｏｒ Ｒ（バージョン３．０．２（２０１３−０９−２５）「Ｆｒｉｓｂｅｅ Ｓａｉｌｉｎｇ」）と組み合わせてＦｌｕｉｄｉｇｍのリアルタイムＰＣＲ分析ソフトウェアを使用して発現データを分析した。

顕微鏡、抗体およびフローサイトメトリー
細胞を１回ＰＢＳで洗浄した後、細胞を４％（ｖ／ｖ）のパラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して透過処理し、細胞をＰＢＳ中１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを用いて室温で１〜５時間ブロッキングした。細胞をＰＢＳ中２％のＦＣＳ（ｖ／ｖ）で希釈した一次抗体と一緒に、４℃で終夜インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストを図２８に提供する。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＰＢＳで希釈した適当なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとコンジュゲートした二次抗体と一緒に、室温で１時間インキュベートした（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＰＢＳで２回洗浄した後、核をＤＡＰＩを使用して染色した。さらに２回の洗浄ステップの後、ＨａｍａｍａｔｓｕのＯＲＣＡ ＣＣＤカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓのＩＸ７１倒立顕微鏡を使用して、細胞の蛍光画像を撮った。

免疫組織化学分析では、動物をＰＢＳと、次いで、４％のパラホルムアルデヒドで灌流した。マトリゲルプラグを４％のパラホルムアルデヒド中で後固定し、次に、３０％のスクロースに浸漬した。免疫組織化学分析用に、マトリゲルプラグを３０μｍの凍結切片とした。切片をＡｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ溶液（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で前処理した。切片をＰＢＳで洗浄し、次いで、ブロッキング溶液（１％のＢＳＡ−０．３％のＴｒｉｔｏｎ−ＰＢＳ）を用い、室温で１時間ブロッキングした。切片をｈＮＡ、Ｋｉ６７、ＡＣＴＨ、ＧＨ、ＴＳＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨおよびＬＨで染色し、次に、Ａｌｅｘａ−５６８とコンジュゲートした二次抗体で染色した。Ｈａｍａｍａｔｓｕのカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓのＢＸ５１顕微鏡を使用して、画像を得た。光学的細胞分画プローブを使用して、マトリゲルプラグ全体におけるＡＣＴＨ細胞の数を立体解析学的に定量化し、Ｃａｖａｌｉｅｒｉ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ方法（Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、移植片の体積を分析した。

フローサイトメトリー分析では、細胞（異なるレポーター細胞株）をＴｒｙｐＬＥ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞培養プラスチックから剥離した。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞をＰＢＳおよびＤＡＰＩ中２％のＦＣＳ、１ｍＭのＥＤＴＡに懸濁させた。４０μｍの細胞ストレーナーを使用して細胞を濾過し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａのＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。単一の（ダブレットの除外）生存（ＤＡＰＩ−）細胞のみを分析した。データをＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．７．６（ＦＬＯＷＪＯ ＬＬＣ）を使用してさらに処理した。

細胞表面マーカーのスクリーニング
ＢＤ Ｌｙｏｐｌａｔｅ（商標）細胞表面マーカーのスクリーニングでは、３０日目の細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して、１ｃｍ^２当たり１０００００個の細胞密度で９６ウェルイメージングプレートに再播種した。４時間後、付着期の細胞をバイオイメージングのために使用者のマニュアルに従って染色した。細胞をＯｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で分析した。画像を処理し、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアパッケージ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して分析した。

ホルモン放出の刺激
ｉｎ ｖｉｔｒｏでホルモン放出を刺激するために、上述のように、細胞を２４ウェルプレートで分化させた。分化の３０日目に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、溶媒または刺激物のいずれかを含有する２５０μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加した。１２時間後に、
上清を除去し、２０００ｇで５分間遠心分離して、デブリをペレット化した。上清を新しい反応チューブに移し、急速冷凍して、ＥＬＩＳＡ測定まで−８０℃で保存した。使用した刺激物は以下の通りであった：ＣＲＦ（Ｔｏｃｒｉｓ、１μＭ）、ストレシンＩ（Ｔｏｃｒｉｓ、２μＭ）、グレリン（Ｔｏｃｒｉｓ、１μＭ）、ソマトクリニン（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１μｇ／ｍｌ）、ナファレリン（Ｔｏｃｒｉｓ、１μＭ）およびウロコルチン（Ｔｏｃｒｉｓ、５００ｎＭ）。

ＥＬＩＳＡ測定
細胞上清中または動物の血清中のホルモン濃度をＥＬＩＳＡ測定を使用して分析した。細胞培養物の上清中のホルモン濃度を、製造業者のマニュアルに従って伝統的な単一ホルモンＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。ＡＣＴＨ（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ、ラットとヒトのＡＣＴＨを検出する）、ｈＧＨ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ヒトに特異的）、ＦＳＨ（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ、ＦＳＨ（ｌｕｍＥＬＩＳＡ、ヒトに特異的）およびコルチコステロン（Ａｂｃａｍ）。プレートをＥｎＳｐｉｒｅ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して読み取った。ｉｎ ｖｉｖｏでの試料のホルモン濃度を、伝統的なＥＬＩＳＡ（ＡＣＴＨに対してのみ、１：２に希釈した血清）またはＬｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する種特異的（ヒトまたはラット）Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＥＬＩＳＡのいずれかを使用して分析した。磁気ビーズをベースとするサンドイッチイムノアッセイを製造業者のマニュアルに従って実施した。二連のウェルで２５μｌの希釈していない血清試料をＬｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭａｐ ３Ｄ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって分析した。サイトカインの濃度を５−ｐ ｌｏｇ分析を使用するＬｕｍｉｎｅｘのＸｐｏｎｅｎｔ ４．１およびＥＭＤ−ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｉｌｌｉｐｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｔ ｖ５．１によって決定した。

細胞の下垂体切除したラットへの移植、試料の調製
オスの無胸腺ヌードラット（ＲＮＵラット Ｃｒｌ：ＮＩＨ−Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を８週齢で傍咽頭アプローチを使用して下垂体切除した。血漿のＡＣＴＨを下垂体切除の１週間後に測定し、下垂体機能低下症を確認した。下垂体を切除したラットを２つの群に無作為化した：偽対照（ｎ＝４）、ヒトＥＳから誘導した下垂体細胞を皮下移植した群（ｎ＝７）。シリンジ（１ｍｌ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とマトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を注射前に氷上で冷やし、注射前にマトリゲルがゲルを形成するのを防いだ。ラットの首の毛を剃り、ベタジンおよび７０％のエタノールを用いて調製した。０．９ｍｌのマトリゲルを２百万個のヒト下垂体細胞の懸濁液（１００μｌのｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｅ６培地中）と混合した。マトリゲルと細胞の混合物をラットの首の皮下組織に注射した。

午前８時に、イソフルラン麻酔下で、移植前、移植の１週間後、３週間後、５週間後および７週間後に、後眼窩採血により血液を採取した。血液をＫ２ ＥＤＴＡで処理したＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ＭＡＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて回収し、血漿を単離して、−８０℃で保存した。

移植の７週間後、動物を麻酔し（Ｆａｔａｌ Ｐｌｕｓ、６０ｍｇ／ｋｇ）、０．１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、次いで、４％のパラホルムアルデヒド（０．１ＭのＰＢＳ中、ｐＨ７．４）を心臓内に灌流した。マトリゲルプラグを切除して、４％のパラホルムアルデヒド中で６時間後固定し、次に、３０％のスクロース中に４℃で２４時間浸漬し、次いで、包埋する化合物中で凍結させた（ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）。マトリゲルプラグを免疫組織化学分析用に３０μｍの凍結切片とした。切片をＡＣＴＨ、ＧＨ、ＴＳＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨおよびＬＨ（ウサギのＩｇＧ、１：１００、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｇｒａｍ）で、次に、Ａｌｅｘａ ５６８とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。ＨａｍａｍａｔｓｕのカメラおよびＯｌｙｍｐｕｓのＢＸ５１顕微鏡によって、画像を得た。光学的細胞分画プローブを使用して、マトリゲルプラグ全体におけるＡＣＴＨ細胞の数の立体解析学的定量化を行い、ｃａｖａｌｉｅｒｉ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ方法（Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、移植片の体積を分析した。

統計分析
データを、各図の凡例で示すように、試料の平均±ＳＥＭとして表す。平均は、個々の実験のデータ（対応する図の凡例で示した数）を表す。群間の差を、片側ｔ検定またはボンフェローニの多重比較ポストホックテストを用いる一元ＡＮＯＶＡによって分析した。ｐ＜０．０５＝^＊、ｐ＜０．０１＝^＊＊、ｐ＜０．００１＝^＊＊＊、ｐ＜０．０００１＝^＊＊＊＊

参考文献
1. Bailey, A.P., Bhattacharyya, S., Bronner-Fraser, M., and Streit, A. (2006). Lens specification is the ground state of all sensory placodes, from which FGF promotes olfactory identity. Developmental cell 11, 505-517.
2. Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 27, 275-280.
3. Chambers, S.M., Qi, Y., Mica, Y., Lee, G., Zhang, X.J., Niu, L., Bilsland, J., Cao, L., Stevens, E., Whiting, P., et al. (2012). Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature biotechnology 30, 715-720.
4. Chemaitilly, W., and Sklar, C.A. (2010). Endocrine complications in long-term survivors of childhood cancers. Endocrine-related cancer 17, R141-159.
5. Chen, G. (2008). Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. In StemBook (Cambridge (MA)).
6. Chen, G., Gulbranson, D.R., Hou, Z., Bolin, J.M., Ruotti, V., Probasco, M.D., Smuga-Otto, K., Howden, S.E., Diol, N.R., Propson, N.E., et al. (2011). Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods 8, 424-429.
7. Dincer, Z., Piao, J., Niu, L., Ganat, Y., Kriks, S., Zimmer, B., Shi, S.H., Tabar, V., and Studer, L. (2013). Specification of functional cranial placode derivatives from human pluripotent stem cells. Cell reports 5, 1387-1402.
8. Dreser, N., Zimmer, B., Dietz, C., Sugis, E., Pallocca, G., Nyffeler, J., Meisig, J., Bluthgen, N., Berthold, M.R., Waldmann, T., et al. (2015). Grouping of histone deacetylase inhibitors and other toxicants disturbing neural crest migration by transcriptional profiling. Neurotoxicology 50, 56-70.
9. Ezzat, S., Asa, S.L., Couldwell, W.T., Barr, C.E., Dodge, W.E., Vance, M.L., and McCutcheon, I.E. (2004). The prevalence of pituitary adenomas: a systematic review. Cancer 101, 613-619.
10. Lamolet, B., Pulichino, A.M., Lamonerie, T., Gauthier, Y., Brue, T., Enjalbert, A., and Drouin, J. (2001). A pituitary cell-restricted T box factor, Tpit, activates POMC transcription in cooperation with Pitx homeoproteins. Cell 104, 849-859.
11. Lee, G., Ramirez, C.N., Kim, H., Zeltner, N., Liu, B., Radu, C., Bhinder, B., Kim, Y.J., Choi, I.Y., Mukherjee-Clavin, B., et al. (2012). Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nature biotechnology 30, 1244-1248.
12. Leung, A.W., Kent Morest, D., and Li, J.Y. (2013). Differential BMP signaling controls formation and differentiation of multipotent preplacodal ectoderm progenitors from human embryonic stem cells. Developmental biology 379, 208-220.
13. Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408.
14. Maroof, A.M., Keros, S., Tyson, J.A., Ying, S.W., Ganat, Y.M., Merkle, F.T., Liu, B., Goulburn, A., Stanley, E.G., Elefanty, A.G., et al. (2013). Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell stem cell 12, 559-572.
15. Merkle, F.T., Maroof, A., Wataya, T., Sasai, Y., Studer, L., Eggan, K., and Schier, A.F. (2015). Generation of neuropeptidergic hypothalamic neurons from human pluripotent stem cells. Development 142, 633-643.
16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S.M., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2013). Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell reports 3, 1140-1152.
17. Murry, C.E., and Keller, G. (2008). Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell 132, 661-680.
18. Nunez, L., Villalobos, C., Senovilla, L., and Garcia-Sancho, J. (2003). Multifunctional cells of mouse anterior pituitary reveal a striking sexual dimorphism. The Journal of physiology 549, 835-843.
19. Regal, M., Paramo, C., Sierra, S.M., and Garcia-Mayor, R.V. (2001). Prevalence and incidence of hypopituitarism in an adult Caucasian population in northwestern Spain. Clinical endocrinology 55, 735-740.
20. Rivera, J.A. (2006). Lymphocytic hypophysitis: disease spectrum and approach to diagnosis and therapy. Pituitary 9, 35-45.
21. Rosenfeld, M.G., Briata, P., Dasen, J., Gleiberman, A.S., Kioussi, C., Lin, C., O'Connell, S.M., Ryan, A., Szeto, D.P., and Treier, M. (2000). Multistep signaling and transcriptional requirements for pituitary organogenesis in vivo. Recent progress in hormone research 55, 1-13; discussion 13-14.
22. Sklar, C.A., and Constine, L.S. (1995). Chronic neuroendocrinological sequelae of radiation therapy. International journal of radiation oncology, biology, physics 31, 1113-1121.
23. Smith, J.C. (2004). Hormone replacement therapy in hypopituitarism. Expert opinion on pharmacotherapy 5, 1023-1031.
24. Smith, S.M., and Vale, W.W. (2006). The role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in neuroendocrine responses to stress. Dialogues Clin Neurosci 8, 383-395.
25. Steinbeck, J.A., Jaiswal, M.K., Calder, E.L., Kishinevsky, S., Weishaupt, A., Toyka, K.V., Goldstein, P.A., and Studer, L. (2015). Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell stem cell.
26. Suga, H., Kadoshima, T., Minaguchi, M., Ohgushi, M., Soen, M., Nakano, T., Takata, N., Wataya, T., Muguruma, K., Miyoshi, H., et al. (2011). Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature 480, 57-62.
27. Szarek, E., Farrand, K., McMillen, I.C., Young, I.R., Houghton, D., and Schwartz, J. (2008). Hypothalamic input is required for development of normal numbers of thyrotrophs and gonadotrophs, but not other anterior pituitary cells in late gestation sheep. The Journal of physiology 586, 1185-1194.
28. Tabar, V. (2011). Making a pituitary gland in a dish. Cell stem cell 9, 490-491.
29. van Gelderen, H.H., and van der Hoog, C.E. (1981). Familial isolated growth hormone deficiency. Clinical genetics 20, 173-175.
30. Villalobos, C., Nunez, L., and Garcia-Sancho, J. (2004). Phenotypic characterization of multi-functional somatotropes, mammotropes and gonadotropes of the mouse anterior pituitary. Pflugers Archiv : European journal of physiology 449, 257-264.
31. Wand, G. (2008). The influence of stress on the transition from drug use to addiction. Alcohol Res Health 31, 119-136.
32. Webster, J.I., and Sternberg, E.M. (2004). Role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, glucocorticoids and glucocorticoid receptors in toxic sequelae of exposure to bacterial and viral products. J Endocrinol 181, 207-221.
33. Zhu, X., Gleiberman, A.S., and Rosenfeld, M.G. (2007). Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev 87, 933-963.
34. Zimmer, B., Lee, G., Balmer, N.V., Meganathan, K., Sachinidis, A., Studer, L., and Leist, M. (2012). Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect 120, 1116-1122.

６．３ 実施例３：多能性幹細胞からの神経堤の誘導
多能性幹細胞をＥ８／Ｅ６培地で培養し、神経堤前駆細胞に分化させた。これらの神経堤前駆細胞の自発的分化により、ＭＡＳＨ１発現でマークされる自律神経と、ＩＳＬ１および／またはＢＲＮ３ａ発現でマークされる感覚神経の両方が生じた。

多能性幹細胞を、実施例１で記載し、図２９Ａで示したように、Ｅ８／Ｅ６培地で分化させた。特に、多能性幹細胞をＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ４およびＣＨＩＲ９９０２１を補充したＥ６培地で２日間分化させた（すなわち、０日目から２日目まで、Ｅ６培地で培養）。２日目に、培養培地からＢＭＰ４を除去し、細胞を、２日目から１１日目まで培養するために、ＳＢ４３１５４２およびＣＨＩＲ９９０２１を補充したＥ６培地で培養した。１１日目に、細胞を、ＣＤ４９ｄおよびＳｏｘ１０を発現する細胞についてＦＡＣＳ選別し、神経堤分化培地でさらに培養した。１５日目に培養からスフェロイドを選択し、再播種し、これを１８日目に再度再播種した。２５日目に、選別した神経堤細胞は、ＭＡＳＨ１およびＩＳＬ１を発現した（図２９Ｂ）。

６．４ 実施例４：主要な外胚葉系統のすべてへのヒトＰＳＣの分化のモジュールプラットホーム
要約
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の運命を異なる系統に方向付けるには、規定されない活性とともに可変的な出発条件および成分が必要であり、その結果、特定の摂動の再現性および評価を混乱させる不一致を招く。ここで、本実施例は、ｈＰＳＣから４つの主要な外胚葉系統を誘導するために単純なモジュールプロトコールを導入する。最小限の化学的に規定した培地においてＦＧＦ、ＢＭＰ、ＷＮＴおよびＴＧＦｂ経路の活性を正確に変化させることにより、本実施例は、細胞密度とは無関係に異なる基質で複数のｈＰＳＣ株における神経外胚葉、神経堤（ＮＣ）、頭蓋プラコード（ＣＰ）および非神経外胚葉の、並行した堅固な再現性のある誘導を示す。本実施例は、外胚葉分化におけるＴＦＡＰ２転写因子の役割を調べること、ＮＣおよびＣＰ特異化におけるＴＦＡＰ２Ａの重要性を明らかにすること、および小分子スクリーニングを行うことにより、このシステムの有用性を強調するものであり、前記小分子スクリーニングによって、ＣＰ分化をさらに増強する化合物を識別した。このプラットホームは、外胚葉細胞型の全範囲を系統的に誘導するための土台となる。

序論
ヒトにおいて、初期発生細胞型は単離および研究するのが困難である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）の方向付けられた分化によって、基礎生物学およびトランスレーショナルバイオロジーに適用するための体系的手法において、初期運命決定にアクセスするモデル系が提供される。ｉｎ ｖｉｖｏでの発生の間に作用することが公知である発生経路のｉｎ ｖｉｔｒｏでのモジュレーション（Suzuki and Vanderhaeghen, 2015; Tabar and Studer, 2014）に基づき、自然分化パラダイムおよび方向付けられた分化ストラテジーなどの初期系統へＰＳＣを分化させるためのいくつかのストラテジーが存在する。様々な分化プラットホームにわたって帰結に大きく影響を及ぼす因子として、フィーダー細胞の使用、単層に基づくストラテジー対胚葉体（ＥＢ）に基づくストラテジー、または複合培地組成が挙げられる。例えば、多くの公開されたプロトコールには、血清または所望の運命を誘導するためのＫＳＲ（ノックアウト血清代替物）などの血清代替因子を含有する培地が関与する。これらの試薬の製造におけるバッチ間変動は、分化の再現性に影響を及ぼし、目的の特異的細胞型を生成するために骨の折れるロット試験の遂行を必須とすることが多い（Blauwkamp et al., 2012; Gadue et al., 2006; Zimmer et al., 2016）。ＫＳＲなどの複雑な試薬に対するこのような広範な品質管理ストラテジーは、任意の単一のプロトコールについては実行可能であるが、これらは、モジュール形式で何十もの、またはおそらく何百もの規定された細胞型を生成することを目的とする、より意欲的なストラテジーの開発を妨げる。

本研究所は、それぞれＢＭＰおよびＴＧＦｂシグナル伝達経路を阻害する小分子であるＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）の添加に基づいて、神経系の複数の細胞型を誘導するプロトコールを確立した。ＳＭＡＤ二重阻害（ｄＳＭＡＤｉ）と称されるこの阻害カクテルの組合せは、転写因子ＰＡＸ６の発現によって特徴付けられる前部神経外胚葉（ＮＥ）へと初期化する中枢神経系（ＣＮＳ）における細胞の効率的な生成を可能とする（Chambers et al., 2009）。ｄＳＭＡＤｉへの改変により、前脳、中脳および脊髄前駆細胞を含む胚の脳脊髄軸に沿った多くの異なる神経亜型を得ることができる（Suzuki and Vanderhaeghen, 2015; Tabar and Studer, 2014）。さらに、ｄＳＭＡＤｉは、神経堤（ＮＣ）（Menendez et al., 2011; Mica et al., 2013）、頭蓋プラコード（ＣＰ）および非神経外胚葉（ＮＮＥ）（Dincer et al., 2013; Leung et al., 2013）などの非ＣＮＳ細胞型を生成するように適応させることもできる。総体的に、ｄＳＭＡＤｉは、ＰＡＸ６＋ＮＥのほぼ均一な層を生成する堅固かつ広く使用されるプラットホームである。しかし、ｄＳＭＡＤｉ下でＰＡＸ６＋ＮＥを誘導する場合でさえ、ＰＡＸ６＋細胞における最も前部の終脳マーカーＦＯＸＧ１＋の獲得は、ＫＳＲバッチ変動による影響を受けることがあり、この問題により、終脳運命へと向かう能力を完全に回復させるために、ＷＮＴシグナル伝達経路の間接的阻害剤（ＸＡＶ０９３９３）の添加が必要となりうる（Maroof et al., 2013）。したがって、スケーラブルかつ十分なモジュール分化プラットホームは、ＫＳＲまたは他の複雑な培地因子を避けるべきである。ここで、本実施例は、主要な外胚葉系統（ＣＮＳ−ＮＥ、ＮＣ、ＣＰ、およびＮＮＥ）すべてに並行してアクセスするための上記の規定したプラットホームを確証することを目指す。

最近、化学的に規定されており、より少数の成分で生成される、いくつかの代替基本培地が、開発された。特に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地の開発は、わずか８つの規定された化合物で、一切の動物性タンパク質なしで、ｈＰＳＣの維持を可能にする（Chen et al., 2011）。さらに、２成分、すなわちＴＧＦβｉおよびＦＧＦ２の除去は、ｈＰＳＣの自然分化を誘発する。Ｅ８からＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（Ｅ６）に移行することで、いかなる小分子阻害剤も添加せずにＰＡＸ６＋ＮＥを生じさせることができる（Lippmann et al., 2014）が、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の添加は、神経運命獲得の速度および効率を大幅に向上させる。この報告で、本実施例は、十分に規定された培地条件下でヒトＰＳＣから主要な外胚葉系統のすべてを並行してかつ高純度で得るための方向付けられた分化システムを計画した。本実施例は、これらの分化ストラテジーを応用して、外胚葉系統のセット全体に対する（特定の系統に対する、ではなく）遺伝的摂動実験の効果に取り組む概念実証研究、または特定の外胚葉運命への分化をさらに増強する分子を特定するための化学的スクリーニングの実行可能性を実証する概念実証研究を探求する。分化プラットホームの効率および多用途性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでオンデマンドでＰＳＣから任意のヒト細胞型にアクセスするための、モジュール型の、方向付けられた分化条件を確立するという長期的な目的に向けての重要なステップを示す。

結果
４つの外胚葉系統を誘導するためのｄＳＭＡＤｉベースの分化プロトコールは、化学的に規定したシステムを使用すると、ＮＥの運命への偏りを生じる
４つの主要な外胚葉系統は、ＮＥ、ＮＣ、ＣＰ、およびＮＮＥを含む。これらの系統のそれぞれは、図４０Ａにまとめたように伝統的なＫＳＲベースのプロトコールを使用してｄＳＭＡＤｉ条件を修正することによって生成することができる。ＫＳＲ条件下で、パターニング因子を含むかまたは減らす最適な時点は、誘導の４８時間後である（Dincer et al., 2013; Mica et al., 2013）。この時点で、ｄＳＭＡＤｉによる継続によって前部ＮＥが生じ、ＣＨＩＲ９９０２１によるＷＮＴシグナル伝達の活性化により頭蓋ＮＣが生じ、ＢＭＰ阻害剤であるＬＤＮ１９３１８９の除去によりＣＰが生じ、またはＬＤＮ１９３１８９の除去と組み合わせたＳＵ５４０２によるＦＧＦシグナル伝達のブロッキングによりＮＮＥの運命が誘発される。規定された転写因子および他の系統特異的マーカーを使用して、初期の外胚葉系統のそれぞれを一意的に特定することができる。ＮＥの生成は、ＳＯＸ１およびＰＡＸ６の発現、ならびに転写因子ＡＰ２ａ（ＴＦＡＰ２Ａ）の非存在によってマークされる。ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の存在または非存在との組合せでのＴＦＡＰ２Ａの発現により、ＮＮＥから誘導される細胞型から外胚葉が分離される。ＴＦＡＰ２Ａとの組合せでのＳＯＸ１０対ＳＩＸ１の発現によって、それぞれ、ＮＣ対ＣＰアイデンティティが特異的にマークされる。ＮＮＥに対する特異的転写因子が存在するかどうかは不明のままであるが、ＳＯＸ１０とＳＩＸ１の両方の非存在下でのＴＦＡＰ２Ａの発現は、これらの培養条件下でＮＮＥを確実に特定するようである（図４０Ｂ）。

規定された分化培地におけるこれらの種々の外胚葉系統マーカーの獲得をモニタリングするために、本実施例は、３種のＧＦＰレポーター株、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（図４０Ｃ〜４０Ｆ）、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ（Chambers et al., 2012; Mica et al., 2013）、およびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ（図４０Ｃ、４０Ｇ、および４０Ｈ）を使用した。ＫＳＲベースの条件下でのこれらの株の特異的細胞型への分化によって、平均９５％のＮＥ、５０％のＣＰ、および５８％のＮＣがそれぞれ生じた（図４０Ｉおよび４０Ｊ）。全体の分化効率は非常に高く、ＣＰおよびＮＣ細胞の収率は分化の繰り返しにわたって可変的であった。これは、ある特定の因子がＫＳＲベースの条件で変化し、それによって収率に影響を与える可能性があることを示唆する。さらに、ＮＥの領域パターニングを評価したとき、ＰＡＸ６およびＳＯＸ１の発現は、非常に堅固であった（図４０Ｉ）が、前部マーカーＦＯＸＧ１は、試験したＫＳＲバッチの１つではＷＮＴ阻害があっても可変的であった（図４０Ｊ）。これは、ＫＳＲが、分化中に領域アイデンティティを変更しうる成分を含有することを含意する。

これらのプロトコールをより厳格に規定したＥ６培地へと移行するために、本実施例は、ｈＰＳＣを複数回継代の間Ｅ８中で順応させ、最初は、４つの主要な外胚葉系統を誘発するために前に記載した因子および濃度を維持しながら、ＫＳＲベースの培地を単にＥ６ベースの分化と交換した（図３７Ａ）。本実施例は、小分子、すなわちＣＨＩＲ９９０２１およびＳＵ５４０２の一部については、最初の濃度では、分化中に細胞を効率的に死滅させ、再度用量設定しなければならなかったことを見出した（データを示さない）。小分子のそれぞれに対する最適な非毒性濃度を決定した後、本実施例は、Ｅ６条件下でのＮＥ形成がＫＳＲベースの条件で得られたものと同等であることを観察した。Ｅ６条件下、小分子の非存在下でのＮＥの形成は、以前に実証された（Lippmann et al., 2014）。本実施例は、小分子を使用しないか、ｄＳＭＡＤｉを使用するか、または単一のＴＧＦβ阻害剤ＳＢを使用するかのいずれかによるＰＡＸ６＋細胞生成の効率を比較した。本実施例は、ｄＳＭＡＤｉの非存在下でＰＡＸ６発現の上方調節を見出した（誘導の１２日後に全細胞の約４０％）。しかし、ＰＡＸ６を発現する細胞のパーセンテージは、ＳＢまたは完全ｄＳＭＡＤｉの添加でさらに改善し、それぞれ、ほぼ９０％と８０％となった（図４１Ａ）。ＰＡＸ６＋ＮＥは、ＴＢＲ１＋皮質ニューロンへとさらに分化することができる（図４１Ｃ）神経ロゼットを効率的に形成することができ（図４１Ｂ）、これは、これらの細胞が、皮質発生の初期段階を経て進行することができることを示す。さらに培養すると（分化の５０日目）、結果として生じたニューロンは、カルシウムイメージングによって示されるように、グルタミン酸処理に対して応答性を示した（図４１Ｄ）。驚くべきことに、高いパーセンテージのＰＡＸ６＋細胞が、ＣＰまたはＮＮＥ条件で維持された細胞を含むほとんどすべての処理群で観察された（図３７Ｂ）。ＣＰ細胞はＰＡＸ６を発現することができるが、これらの細胞はＳＩＸ１を同時に発現せず、これらがＣＰ起源ではないことを示唆した。さらに、ＮＣ誘導によってＰＡＸ６＋細胞もＳＯＸ１０＋細胞も効率的に生成されず（図４１Ｅおよび４１Ｆ）、ＷＮＴ活性化は、ＮＣを誘導するよりもむしろ、推定的ＮＥ細胞を分化させる領域アイデンティティを変更する可能性があることが示唆された。最後に、ＫＳＲ対Ｅ６条件下でＮＣへと分化したｈＰＳＣの比較遺伝子発現分析によって、Ｅ６下での非神経マーカーの発現の欠如が明らかとなった（図４１Ｇ）。全体として、これらのデータによって、Ｅ６は、ＫＳＲベースの分化で開発された小分子条件下で、非神経の運命を誘導する因子を欠いていたことが示唆される。

ＴＦＡＰ２Ａを介したＭＰシグナル伝達は非ＣＮＳの運命を生じるために必須である
ほとんどの外胚葉系統プロトコールが非神経の運命を誘導することができなかった理由を理解するために、本実施例は、ＴＦＡＰ２Ａの誘導について調査した。ＴＦＡＰ２ＡはＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥにおいて高度に発現され、ＮＣおよびＣＰについてのそれぞれＳＯＸ１０およびＳＩＸ１などの他の系統に制限されたマーカーの発現に先行して、分化から数日以内に上方調節される（Dincer et al., 2013）。多くのシグナル伝達分子、例えば、レチノイドならびにＷＮＴおよびＢＭＰシグナル伝達の活性化剤は、ＴＦＡＰ２Ａの発現を誘導することが報告されている（Luo et al., 2003; Xie et al., 1998）。

興味深いことに、ＫＳＲ条件下では、これらのシグナル伝達因子はいずれも、堅固なＴＦＡＰ２Ａ発現にもかかわらず、非ＣＮＳの運命の誘導の間に直接添加されなかった（Dincer et al., 2013）。したがって、本実施例は、ＫＳＲベースの培地はＴＦＡＰ２Ａの誘導に十分な内因性シグナルを誘発することができるが、Ｅ６はこれらの因子を欠いていると仮定した。したがって、本実施例は、関連するシグナル伝達分子を直接添加することによってＴＦＡＰ２Ａの発現を回復させることを試みた。

ＢＭＰシグナル伝達は、ＮＮＥおよびプラコードの形成に重要であることが示されている（図３７Ｃ）（Groves and LaBonne, 2014）。本実施例は、ＢＭＰシグナル伝達を外部から刺激することによって、ＴＦＡＰ２Ａの発現を誘導し、その後、ＣＮＳ分化を抑制することを考えた。本実施例は、ＢＭＰ４での処理から３日以内に用量依存的にＴＦＡＰ２Ａの発現が急速に上方調節されることを観察した（図１Ｄおよび１Ｅ）。高濃度（２０ｎｇ／ｍｌ）で、細胞は、ＴＦＡＰ２Ａ＋となり、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１の発現を欠き、これは、ＮＮＥが、強力なＢＭＰシグナル伝達の活性化により誘発されることを含意する（図３７Ｆ）。ＦＧＦ経路をさらに阻害することによってＣＰ誘導をさらにブロックし、それによって、ＮＮＥ誘導の効率を増大させる（データを示さない）。ＮＮＥを規定の条件を使用してケラチノサイトへの最終分化に供したとき、本実施例は、未成熟（Ｋ１４＋）および成熟（Ｋ１８＋）上皮細胞の両方に達することができた（図３７Ｇ）。これらのデータは、ＢＭＰ４シグナル伝達がＮＮＥ形成を迅速に誘導することができることを示唆する。

実際、ＢＭＰの添加はプラコード誘導を誘発したが、効率は低かった（図３８Ａおよび１０）。用量応答研究は、中程度の濃度のＢＭＰ４（およそ５ｎｇ／ｍｌ）がＣＰ誘導に最適であることを示した。興味深いことに、プラコード分化の間の細胞の大多数がＮＮＥに似ており、ＦＧＦアゴニストの直接添加が、ＮＮＥを犠牲にしてプラコード生成の効率を高めるのに必要である可能性があることを示した。実際に、分化の間に、ＦＧＦ２を添加し、ＦＧＦ８を添加しないことにより、ＳＩＸ１＋細胞の形成がほぼ５０％まで増強された（図３８Ｂ）。

ＫＳＲベースの培地中の三叉神経プラコードがｈＰＳＣから誘導されるデフォルトプラコードの運命であることは以前に示されている（Dincer et al., 2013）。本実施例は、ＳＩＸ１＋ＣＰを最終分化させ、前部プラコードマーカーＰＡＸ６およびＳＩＸ３の発現を観察した（図３８Ｃ）。プラコード細胞におけるＰＡＸ６の発現は、水晶体、下垂体または嗅覚のアイデンティティに対応する。これらの細胞のさらなる分化は、免疫細胞化学的検査によってＳＩＸ３、ＣＲＹＡＡ、およびＣＲＹＡＢの発現を明示したので、初期プラコードアイデンティティが後部三叉神経プラコードよりも前部水晶体に対応する可能性が高いことを示唆する（図３８Ｄおよび３８Ｅ）。興味深いことに、これらのデータは、水晶体がｉｎ ｖｉｖｏで発生中のデフォルトプラコードであることを示唆するニワトリ胚における研究（Bailey et al., 2006）と一致している。

次に、本実施例は、水晶体プラコードを犠牲にして三叉神経プラコードの誘導を促進する因子を特定しようとした。これらの因子は、ＫＳＲ中にあり、Ｅ６中にない可能性が高いからである。発生の間、三叉神経プラコードは、ＰＡＸ６＋水晶体、下垂体および嗅覚のプラコードの後に誘導される。したがって、本実施例は、発生の間に後の細胞アイデンティティを誘発することが公知の標準的なＷＮＴシグナル伝達の活性化が、三叉神経系統へのパターニングに移行するのに十分でありうるか否かを試験した。プラコードを誘導するＢＭＰ処理の後に、分化の初期段階の間にＣＨＩＲ９９０２１のさらなるパルスへ曝露すると、三叉神経プラコードの運命に対応するプラコード細胞におけるＰＡＸ３＋およびＰＡＸ６発現を誘導することができた（図３８Ｅ）。これらのデータは、最小限の培地条件下で、本実施例が、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞運命の選択を、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラコード誘導の間の領域特異化を、厳密に再現することができたことを示す。

興味深いことに、本実施例はまた、低用量ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）のショートパルスと組み合わせたＷＮＴシグナル伝達の活性化によってほぼ均質なＳＯＸ１０＋ＮＣ集団を生成できることを観察した（図３８Ｆおよび１１）。このＢＭＰ４濃度では、ＴＦＡＰ２Ａは弱くしか誘導されず、これは、ＮＣが、最初に、ＴＦＡＰ２Ａを発現しないかまたは低レベルのＴＦＡＰ２Ａを発現する初期前駆細胞から生じる可能性があることを示唆する。しかし、ＷＮＴとＢＭＰの両方の添加は、ＴＦＡＰ２ＡとＮＮＥの運命の別のマーカーであるＤＬＸ３とを活性化するように、相乗的に作用する（図３８Ｇ）。さらに、ＮＣの自然分化は、自律および感覚ニューロンの運命にそれぞれ対応する、ＡＳＣＬ１またはＩＳＬ１を発現するニューロンを生じさせることができ（図３８Ｈ）、結果として生じたニューロンは、長期培養時に機能的に活性である（図３８Ｉ）。ここで提示するデータは、ＢＭＰシグナル伝達の初期の用量依存的誘導によって、ＮＣを含む非ＣＮＳ外胚葉の運命の形成が可能となり、これらの運命のうちのいくつかが、以前に報告されたよりも高い効率および低い可変性で形成されることを実証する。

細胞株にわたってのプロトコールの堅固さに取り組むために、本実施例は、７種のさらなるＥＳＣ／ｉＰＳＣ株を評価し、有効な抗体を使用して外胚葉系統の収率を定量化した。それぞれのＰＳＣ株は、特定の分化した系統についての適切なマーカーを、効率の程度は様々だが、誘導することができた（図３９Ａおよび３９Ｂ）。ＣＮＳおよび非ＣＮＳ系統の区分は、ＴＦＡＰ２Ａの発現によって特徴付けられる。ＴＦＡＰ２Ａ＋細胞のパーセンテージは、試験した細胞型において、ＢＭＰ４で処理しないと０％〜５％、ＢＭＰ４を添加すると５６％〜９５％の範囲であった。様々な株からの前部ＮＥの生成は、６７％〜９５％（ＦＯＸＧ１）および５６％〜９１％（ＰＡＸ６）の範囲の効率を示した。ＮＣは、３０％〜５８％（ＳＯＸ１０）を示し、ＣＰは、１０％〜４５％（ＳＩＸ１）を示した。まとめると、これらのデータは、規定の培養条件によって、ｈＰＳＣ株にわたって様々なＮＮＥ外胚葉の運命のすべてへのアクセスが可能になることを実証する。

外胚葉由来の精製された細胞型の発現分析
４つの外胚葉系統は、初期発生中の典型的な過渡的段階を示し、高度に規定された段階にある多数のヒト細胞を得ることは、困難である。典型的に、レポーター株は、特定の細胞型を区別するために利用されるが、ＰＡＸ６は、ＮＥとＣＰの両方において見出すことができ、ＳＯＸ１０は、ＮＣプラコードと聴覚プラコードの両方において見出すことができる（Taylor and Labonne, 2005）。本実施例は、次に、４つの外胚葉系統のそれぞれについての精製細胞からの転写発現特性を決定しようとした。ＮＮＥ系統を除いて、本実施例は、それぞれのレポーター株（すべての株はＷＡ−０９ｈＥＳＣから誘導された）を使用してＧＦＰ＋細胞を選別し、これらの精製細胞のＲＮＡシークエンシングを実施した。不偏クラスタリングアルゴリズムにより、ＮＥはｈＥＳＣと接近してクラスター化する一方、ＮＮＥは他のすべての外胚葉系統から最も離れてクラスター化することが示された。興味深いことに、純粋なＮＣおよびＣＰを、それぞれ、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１などの単一のマーカーの発現に基づいて単離することへの努力にもかかわらず、主成分分析に基づき、ＮＣおよびＣＰは、互いに接近してクラスター化し、これらの細胞が類似する転写プロファイルを有することが示唆された（図４Ａおよび４Ｂ）。次いで、差次的に発現した遺伝子を、共有のかつ特有の発現プロファイルを有するものにグループ化した（図４Ｃ）。次いで、このような発現パターンを遺伝子オントロジー分析（Edgar et al., 2013）に供した（図４Ｄ）。ＥＣＭ再編成に関連する遺伝子は、非ＣＮＳから誘導された細胞型のすべてにおいて非常に豊富に存在する。このことは、分化の間の初期ＢＭＰシグナルが、一部はＥＣＭを介して作用する可能性があること、またはＥＣＭに関連する転写物が豊富な細胞型を少なくとも誘導することを含意する。逆に、ＮＥに関連するオントロジーは、シナプス伝達および神経系の発達に関与する。ＮＣに特異的な個々のオントロジーは、細胞接着およびカルシウム結合を含むが、ＣＰではシナプス伝達およびイオン膜輸送が濃縮されていた。まとめると、４つの外胚葉系統についての転写発現プロファイルは、全体として異なっており、表された特異的系統のそれぞれに関連する機能を捕らえている。

初期のヒト外胚葉系統のデータが不足していたので、次に、本実施例は、外胚葉系統のそれぞれに対してより特異的なマーカーを特定することができるか否かを調べた。外胚葉系統の中での顕著な差次的発現を有する転写物、および一意的に上方調節される遺伝子を、さらなる検証に供した。ＣＮＳ運命と非ＣＮＳの運命の間で共有される、外胚葉分化の間に特異的に上方調節される遺伝子として、ＡＮＸＡ１、ＬＧＩ１、ＮＲ２Ｆ２およびＺＮＦ５０３が挙げられる。さらに、非ＣＮＳ対ＣＮＳを線引きする因子は、ＮＥＵＲＯＧ１、ＨＡＮＤ１、ＴＦＡＰ２ＡおよびＴＦＡＰ２Ｂである（図４Ｅ）。予想どおり、ＮＥにおいて、ＳＯＸ１およびＨＥＳ５などの因子は、ＣＮＳの細胞を排他的に特定するが、低レベルのＰＡＸ６転写物は、他の系統のすべてで見出すことができた（図４Ｆ）。興味深いことに、本実施例は、性質不明のジンクフィンガータンパク質であるＺＮＦ２２９の高度な発現をＮＣ系統において特異的に観察した。他の系統については、本実施例は、プラコードおよびＮＮＥでそれぞれ優先的に発現されるＥＬＡＶＬ４およびＳＭＹＤ１を特定した（図４Ｆ）。さらに、本実施例は、ＮＣデータセットを、ニワトリにおけるＮＣの特定に重点が置かれた以前に発表された研究（Simoes-Costa and Bronner, 2016）と比較した。ＮＣに有意に豊富に存在する遺伝子について、本実施例は、２つのデータセット間に有意な重なり（ｐ＝３．５６ ３ １０−７）を見出した（保存される重要なＮＣマーカーを表す；図４２Ｃおよび４２Ｄ）。興味深いことに、ＺＮＦ２２９などの本研究における一部の候補マーカーはマウスでは保存されておらず、したがって、検証研究は複雑である。とは言え、さらなる適切な初代細胞データが入手できるようになれば、データセットの特にＣＰおよびＮＮＥについての比較研究が役立つであろう。

本実施例は、上記のさらなるＰＳＣ株におけるゲノム分析から選択した系統マーカーの発現を検証した。遺伝子のサブセットについて、本実施例はまた、免疫細胞化学的検査およびハイコンテントイメージングによって発現を評価した。本実施例は、ＲＮＡによれば、いくつかの遺伝子の発現が複数の系統に存在するようであるが、タンパク質分析によってそれらのマーカーが選択的に発現されることを見出した。ＳＯＸ１およびＺＢＴＢ１６（ＰＬＺＦ）は、実際、主としてＮＥに豊富に存在したが、ＴＦＡＰ２ＢおよびＨＡＮＤ１などの因子は、ＮＣまたはＮＮＥのいずれかに豊富に存在した（図４２Ａおよび４２Ｂ）。プラコードのアイデンティティを、ＳＩＸ１の発現とＴＦＡＰ２Ｂ発現の非存在とによって規定した。この分析よって、ヒト外胚葉形成の間の主要な系統それぞれについての特異的特定のための、公知のマーカーと新規マーカー（ＺＮＦ２２９などの、いくつかのまだ性質不明の遺伝子を含む）の両方の包括的セットが得られる。

ＴＦＡＰ２Ａの損失が非ＣＮＳ誘導体の誘導に影響を及ぼす
ここで、４つの主要な外胚葉系統を誘導するために提示する新規条件は、堅固かつ効率的である。したがって、本実施例は、そのプラットホームを使用して、外胚葉系統の特異化の間に重要な役割を果たすものを特定するための摂動研究を実施した。非ＣＮＳ運命に関与する本研究の１つの最良の候補は、誘導の間に、初期に高度に発現されることから、ＴＦＡＰ２Ａであった。非ＣＮＳ系統がＴＦＡＰ２Ａの発現に依存するか否かに取り組むために、本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系（Mali et al., 2013）を使用してＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣ株を生成した。２種のガイドＲＮＡを使用して、フレームシフトの欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして、欠失の程度および性質を決定した（図４３Ａおよび４３Ｂ）。タンパク質レベルでのＴＦＡＰ２Ａの発現の消失を、高ＢＭＰの存在下で短い３日の誘導を使用して確認した（図５Ａ、４３Ｃ、および４３Ｄ）。ＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ対野生型ｈＥＳＣのさらなる比較研究により、ＣＰまたはＮＮＥ条件下で、野生型細胞では分化の６日目にＣＤＨ１の堅固な発現が示されたが、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞では示されなかった（図５Ｂ）。これらのデータにより、ＴＦＡＰ２Ａが、ＮＣ運命へのＥＭＴ様移行から細胞を保護しうるＣＤＨ１の発現を促進することが示唆される。

ＣＤＨ１のデータを考慮に入れて、本実施例は、ＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞は非ＣＮＳ系統へ移行することができず、デフォルトでＣＮＳ ＮＥとなると仮定した。この仮定と一致して、ＮＥの誘導は、ＴＦＡＰ２Ａの損失に影響を与えなかった（図５Ｃ）。ＳＯＸ１およびＰＡＸ６などのＣＮＳに豊富な転写因子は、他の系統からのわずかの夾雑物と共に豊富に存在した。さらに、ＮＣおよびプラコードのプロトコールによって、ＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ対野生型細胞においてＳＯＸ１およびＰＡＸ６の発現のレベルが増加した（図５Ｃおよび５Ｄ）。しかし、予想外に、ＴＦＡＰ２Ａ ＫＯ細胞のＮＣまたはＣＰへの誘導の間に、野生型と比較して数は劇的に少ない数であるものの、それぞれ、ＳＯＸ１０およびＳＩＸ１＋細胞を見出すことができた（図４３Ｅおよび４３Ｆ）。このことは、ＴＦＡＰ２Ａの発現を消失させることが、非ＣＮＳ細胞型を抑制するのに十分ではないこと、または他の因子が、ＴＦＡＰ２ＡのＳＯＸ１０もしくはＳＩＸ１を独立してわずかに代償および調節することができることのいずれかを含意する。ＮＣおよびＣＰの誘導におけるＴＦＡＰ２Ａの損失に対する影響は劇的であったが、ＮＮＥに対する影響は、顕著でなかった。本実施例によってＮＮＥ条件ではＰＡＸ６の発現もＳＯＸ１の発現も観察されず、ＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１などのＮＮＥ関連遺伝子の発現は、ほとんど影響を受けなかった（図５Ｃおよび４３Ｇ）。これらのデータによって、ＮＮＥの形成は、単にＴＦＡＰ２Ａの発現によるものではないことが示唆される。事実、以前の研究により、ＴＦＡＰ２Ｃ（ＡＰ２γ）の発現がＮＮＥにおいて優勢であることが示されている（Li and Cornell, 2007）。ＮＮＥは、ＮＣおよびＣＰ分化において見出される共通の細胞型であるので、本実施例は、それらの集団におけるＴＦＡＰ２Ｃの発現を分析し、ほとんど又はは全く発現を見出さなかった（図４３Ｈ）。このことによって、ＴＦＡＰ２Ｃの発現はＮＮＥ系統に特異的であることが示唆される。

ヒト外胚葉系統を誘導するための新規プラットホームは、ｉｎ ｖｉｖｏでの発生プログラムを模倣する外胚葉系統の特異化の間のＢＭＰシグナル伝達に対する重要な役割を実証した。さらに、本実施例は、この系を遺伝子操作して、運命選択の決定に関与する規定の発生因子、例えばＴＦＡＰ２Ａの役割を明らかにすることができるという概念実証を提示する。

プラコード形成を増強する因子についての小分子スクリーニング
神経分化の分子的精査に加えて、モジュールプラットホームは、４つ主要な初期外胚葉系統すべてについて卓越した収率で無制限の数の細胞を生成する能力を有し、それ故、これらの単離困難な細胞型の薬物スクリーニングをより行いやすくする。しかし、ＣＰの運命の誘導効率は、比較的低いままであった（約４０％）。ＣＰ誘導の効率をさらに増強し、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイにおけるこのプラットホームの適性を実証するために、本実施例は、ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰレポーター株に関してＬｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＬＯＰＡＣ）を使用して小分子スクリーニングを実施した（図６Ａ）。最初のスクリーニングによって、対照よりもＳＩＸ１の発現を促進した１１の化合物が明らかになった。観察された変化倍率の再現性および堅固さに基づいて、リストを次の３種の有効な候補に絞り込んだ：セロトニン受容体アゴニストであるＢＲＬ−５４４３；ＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴが媒介するコンファメーション転写を阻害する能力を有する植物ホルモンであるパルテノライド；およびメタロプロテアーゼ阻害剤として作用することができる金属キレート剤であるフェナントロリン（図６Ｂ）。これらの候補化合物は、対照分化で観察されるレベルより上にＳＩＸ１の発現を増加させた。主要なヒットのさらなる検証によって、フェナントロリンは、ＳＩＸ１を発現する細胞のパーセンテージの堅固な増加を誘発することが確認された（図６Ｃ、４９Ａ、４９Ｂ）。

化合物とＣＰの発生の間には明らかなリンクは存在しなかったが、次に、本実施例は、フェナントロリンが、プラコードの運命を特異的に富化するためにどのように作用するかを決定した。ＣＰへの分化は、ＳＯＸ１０、Ｔ、ＭＹＯＤまたはＳＯＸ１７などの他の系統マーカーの発現を誘導することなく、対照に対してＳＩＸ１の発現を５倍増加させることを示した（図６Ｄ）。次に、本実施例は、フェナントロリンの添加が、相加的または選択的にＣＰ誘導の効率を改善するか否かを評価した。興味深いことに、ＦＧＦ２の非存在下でフェナントロリンを添加すると、ＳＩＸ１＋細胞がほぼ４倍（１８％に対して６９％）増加する（図６Ｅ）。ＦＧＦ２またはＦＧＦ２とフェナントロリンを添加した後、ＳＩＸ１＋細胞の濃縮は、それぞれ、３４％および４６％まで低下した。これらの結果は、フェナントロリンが、ＦＧＦ２の存在下を除く化合物の存在下で生存することができない場合のある他の外胚葉系統を犠牲にして、ＳＩＸ１＋ＣＰ細胞を選択的に豊富にする可能性があることを示唆する。結論として、小分子スクリーニングによって、好まれる系統へのｈＰＳＣの分化効率をさらに改善することができる新規因子を特定するための外胚葉系統プラットホームを使用する実行可能性が実証される。

規定の培地条件、すなわち、ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥのＥ６のもとでのモジュール生成に対する修正された手法は、用量依存的ＢＭＰシグナル伝達応答に依拠したが、ＮＥの生成は、修正なしでいずれの系においても堅固であった（図７Ａ）。ＢＭＰシグナル伝達の最初のパルスによって、ＫＳＲベースの分化条件と比較して、ＮＣの生成、および程度は低いがＣＰの生成において、効率の増大および可変性の低減が可能となった（図７Ｂ対図４４Ａ）。

本研究の主な注目点は、ＫＳＲなどの培地に関連する因子によって引き起こされる可変性を排除する高度に堅固な、モジュール型の外胚葉分化プラットホームを確立することであった。しかし、基質をコーティングすることおよび細胞密度など、可変性のさらなる可能性のある発生源が存在する。マトリゲルは、一般的に、基質のコーティングに使用され、数千ものタンパク質から構成されるが、ビトロネクチンは、単一の組換えタンパク質である。ビトロネクチンの代わりにマトリゲルを使用することが外胚葉系統の特異化の堅固さに負の影響を与えうるか否かを決定するために、本実施例は、ビトロネクチンベースの標準プロトコールと比較して、１１の独立したロットのマトリゲルを試験した。驚くべきことに、２つを除くすべてのバッチが高度に堅固な誘導効率をもたらした（図４４Ａ）。外胚葉系統の選択に影響を与えることが公知の別の可能な因子は、細胞密度である。すなわち、ＰＡＸ６＋ＮＥ対ＳＯＸ１０＋ＮＣの生成は、出発ｈＰＳＣ播種密度に依存することが示された（Chambers et al., 2009）。本実施例は、マトリゲルとビトロネクチンの両方を使用して、１ｃｍ２当たり５０，０００〜３００，０００個の細胞を使用する分化を実施し（図４４Ｂ）、細胞密度が細胞運命の決定に明確な役割を果たさないことを見出した。最後に、組換えＢＭＰ４などの成長因子は、効力の技術的可変性を示しうる。ＴＦＡＰ２Ａを活性化するために必要な限界濃度を決定すれば、ＢＭＰ４の有効用量を設定することができ、これにより、この懸念事項は対処されるはずである。低いＴＦＡＰ２Ａレベルが（ＷＮＴ活性化との組合せで）ＮＣを生成する一方で中等度のレベルがＣＰおよびＮＮＥの運命を促進する、様々な非ＣＮＳ系統の生成にＢＭＰ４の用量設定が有用であることが明らかになるはずである。結論として、これらのデータによって、４つの重要な外胚葉系統を獲得する上で、基質のコーティングまたは細胞密度に対し最小限の依存度しか示さないこの分化プラットホームの堅固さが、例証される。

考察
オンデマンドでｈＰＳＣから多数の特異的細胞型を誘導する目的は、適切な分化プラットホームの利用可能性に依存する。現在利用可能なプロトコールは、不明確な培地成分を使用することが多く、これらの成分は、可変性をもたらしやすく、最終的な臨床解釈に適していない。さらに、このようなプロトコールは、専ら個々の外胚葉系統へのアクセスを、細胞密度、ＥＢ対単層培養の使用、および広範囲の培地組成の利用に関してそれぞれ異なる条件下で提供する。したがって、過去の研究では、系統特異的プロトコールによって異なる多数の交絡因子があったので、４つの系統すべてにわたって特異的な遺伝的または化学的摂動の影響を規定することは、ほぼ不可能であった。

ここで、堅固で、モジュール型の、化学的に規定された系を使用して、４つの主要な外胚葉系統のすべてを誘導するためのストラテジーを提示した。ｉｎ ｖｉｖｏでの発生の合図となる因子（cue）の適用により、この系での分化の成功がおおいに増強され、本実施例は、４つのシグナル伝達経路のモジュレーションが、初期の外胚葉系統の選択の十分な多様性を再現するのに十分であることを示す。ＣＮＳ対非ＣＮＳの運命の線引きは、ＢＭＰによる用量依存的処理に依拠する。ＮＣ、ＣＰおよびＮＮＥなどの任意の特異的系統を促進する具体的なＢＭＰ濃度は、非常に厳密である。ＢＭＰは、ＮＣを生成するＷＮＴの活性化、ＣＰを生成するＦＧＦの活性化、およびＮＮＥを生成するＦＧＦの阻害と共同で作用することができるＴＦＡＰ２Ａを上方調節することにより、少なくとも部分的に作用する。本結果により、最小限の培地系において、少量の小分子を使用するｉｎ ｖｉｖｏでの発生を模倣することによって、外胚葉細胞の運命の決定を再現することができることが実証される。結果として生じる系は、技術的に単純であり、さらなる選別も選択も必要としない特異的外胚葉系統のほぼ均一な集団を生じさせる。再現性および技術的容易さの改善以外に、Ｅ６などの高度に規定された培地の使用は、さらなるトランスレーショナルな応用のための臨床グレードの細胞の産生を大いに促進することになる。

本実施例によって、外胚葉分化プラットホームは、発生経路の遺伝学的解剖および小分子スクリーニングに適していることが実証される。本概念実証研究において、本実施例によって、ＴＦＡＰ２Ａの損失は、ＮＥの形成にもＮＮＥの形成にも影響を与えないが、ＮＣおよびＣＰの運命の誘導にはおおいに影響を及ぼすことも実証される。本データは、神経管欠損および感覚器官発生の欠損に伴って周産期致死性を示すが非神経の運命は影響を受けなかったＴｆａｐ２αノックアウトマウスにおける報告（Schorle et al., 1996）と一致している。ＴＦＡＰ２Ａの損失は、ＴＦＡＰ２Ｃなどの他のＴＦＡＰ２タンパク質によって代償される可能性が高い（Li and Cornell, 2007）。予備的なデータによって、ＴＦＡＰ２Ｃは、いずれの外胚葉分化の間にも上方調節されないことが示唆される。しかし、ＴＦＡＰ２Ｂは、強く上方調節され、ＮＮＥの形成における潜在的代償機能が示唆された。

小分子スクリーニングにおける本分化プラットホームの使用は、特定の領域特異的前駆体集団または特定のクラスのニューロンに方向付けられた分化のための化合物の特定を含みうるものであった。ここで、本実施例によって、プラコード系統の富化のためにこのようなスクリーニングを実施することの実行可能性が実証された。本規定の分化プラットホームは、ＮＣまたはＮＮＥ系統の生成に関し、最適化されたＫＳＲロットを使用する条件と比較しても非常に効率的であった（図４４Ｈおよび７Ａ）が、ＳＩＸ１＋ＣＰ前駆体の誘導効率は、改善されなかった。しかし、本小分子スクリーニングにおける主ヒット化合物であるフェナントロリンの存在下（図６Ｅ）で、本実施例は、大多数の細胞においてＣＰマーカー発現を誘発することができた。フェナントロリンが作用する機序は、まだ不確定である。しかし、これらのデータは、この薬物がＳＩＸ１＋細胞の正の選択によって主として作用することを示唆している。プラコードの発生およびサブタイプの特異化の間のフェナントロリンの作用機序に取り組むためのさらなる研究が必要であろう。

本実施例によって、４つの主要な外胚葉系統の誘導以外に、次のステップは、ＰＡＸ６＋水晶体からＰＡＸ３＋三叉神経プラコードへの切り替えで例証されるような領域的に偏りのある系統の系統的誘導であることが想定される。領域特異的ＣＮＳ系統を生成できることは当技術分野で周知であり、デフォルト頭蓋ＮＣから迷走および腸ＮＣへの切り替えなどの特定のＮＣ系統を生成するための類似のストラテジーが、現在開発中である（Fattahi et al., 2016）。ヒト外胚葉系統プロジェクトにおける最終ステップは、それぞれの領域特異的外胚葉系統から生成される様々な神経および非ニューロンサブタイプの誘導、単離および分子的特徴付けとなる。それぞれの胚葉についての系統的分化条件を開発する目的は、ヒトＰＳＣからの中胚葉系統の多様性を再現する最近の努力（Loh et al., 2016）によってさらに例証される。このような胚葉特異的な努力を組み合わせることにより、オンデマンドで任意のヒト細胞型にアクセスするための統一的なプラットホームを最終的に得ることができる。

結論として、本研究は、外胚葉系統の多様性を生じさせるための青写真および４つの主要な外胚葉系統の並行した発生に関与する分子経路の精査に相当する資源を当技術分野に提供する。本研究は、領域のパターニングおよび最終運命の特異化に最適なクロマチン段階を決定することなどの細胞運命決定に関連する分子的機序を理解するための機序研究を含む、多くの潜在的応用の基礎を構築する。本研究は、ヒト障害のための新規細胞療法を開発することを目的とした応用を含む、将来の臨床解釈に適した条件下で広範囲の外胚葉系統を誘導するための土台も作る。

方法
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｈ９（ＸＸ、ｐ３１〜４０）、Ｈ１（ＸＹ、ｐ３５〜４０）、ＭＥＬ１（ＸＹ、ｐ４０〜４６）、ＨＵＥＳ６（ＸＸ、ｐ２５〜３５）、ＨＵＥＳ８（ＸＹ、ｐ６４〜６８）ならびに誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株ＢＪ１、Ｓｅｖ６およびＭＲＣ５を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２と、非必須アミノ酸と、Ｌ−グルタミンと、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）と、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２とを含有するｈＥＳＣ培地中、マウス胚性フィーダー層上で培養した。ＰＡＸ６ Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ、ＳＯＸ１０ ＧＦＰおよびＳＩＸ１ Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ親株は、Ｈ９である。多能性幹細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡで解離させ、ビトロネクチンをコーティングしたディッシュにそれらを播種することにより、細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に順応させた。最初に十分に順応しなかった株を廃棄し、マトリゲルをコーティングしたディッシュを用いて再び試み、次の継代でビトロネクチンに移行した。３〜４週間の培養（約６〜８継代）後、細胞を順応したと見なした。すべての細胞を３７℃で、５％ＣＯ２で培養した。培地を毎日交換した。すべての細胞株を、ＳＴＲ分析を使用して定期的に確認し、核型異常について定期的に試験し、マイコプラズマについて日常的にチェックした。

両方のタイプの（ＫＳＲおよびＥ６ベースの）分化について、使用した略語およびタイミングのセットを下の表１〜２に収載する：

ＫＳＲベースの分化（１０〜１２日）

分化開始前の調製
マトリゲルをＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースの培地で希釈（１：５０）し、組織培養処理ディッシュにコーティングする。ディッシュをパラフィルムで覆い、４℃で終夜保存する。

培地組成
ＫＳＲ分化培地（１Ｌ）。ＫＳＲ分化培地は、次のとおりである：８２０ｍｌのノックアウトＤＭＥＭ（１×）培地、１５０ｍｌのノックアウト血清代替物、１０ｍｌのＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ、１０ｍｌのＬ−グルタミン ２００ｍＭ、１０ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸 １００×、および１ｍＬの２−メルカプトエタノール １０００×。

Ｎ２培地（１Ｌ）。Ｎ２培地は、次のとおりである：１ＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）１Ｘ培地、１ｍｌの２−メルカプトエタノール １０００×、２．０ｇの炭酸水素ナトリウム、１．５６ｇのＤ−（＋）−グルコースおよび２０ｕｌのプロゲステロン（ストック：０．０３２ｇのプロゲステロンを１００ｍｌの１００％エタノールに溶解する）と、１０ｍｌのＮ２サプリメントＢ １００ｘ。

分化の−１日目
ｈＰＳＣ培養物は、分化を開始する前に７０％〜８０％コンフルエントであるべきである。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ解離緩衝剤で剥離させ（３７℃で３０分）、細胞をプレートから穏やかに解離させる。細胞を４５ミクロンの細胞ストレーナーに通し、細胞をペレット化する（５分間、２００×ｇ）。細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、再度ペレット化する。１０μＭのＲＯＣＫｉを含有するｈＥＳＣ培地に１ｃｍ^２当たり２５０〜３００，０００個の細胞を播種する。細胞を３７℃のインキュベーターの中で終夜インキュベートする。

分化の０日目
ｈＰＳＣ培地は、高密度単層に見えるはずである。プラスチックは、ほとんど見えないはずである。下記の特定の分化を開始する前に細胞をＰＢＳまたはＫＳＲ分化培地で洗浄する。

神経外胚葉分化。０日目（０〜２４時間）：５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地を細胞に添加する。前部神経外胚葉への分化のより大きな偏りを生じさせるために、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋５μＭのＸＡＶを含有するＫＳＲ分化培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地に交換する。前部神経外胚葉に分化している場合、細胞への５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋５μＭのＸＡＶを含有するＫＳＲ分化培地を維持する。

２日目（４８〜７２時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地に交換する。前部神経外胚葉に分化している場合、細胞への５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋５μＭのＸＡＶを含有するＫＳＲ分化培地を維持する。

３日目（７２〜９６時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地に培地を交換する。前部神経外胚葉に分化している場合、細胞への５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋５μＭのＸＡＶを含有するＫＳＲ分化培地を維持する。

４日目（９６〜１２０時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有する、７５％ＫＳＲ分化培地および２５％Ｎ２培地に交換する。前部神経外胚葉に分化している場合、細胞への５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋５μＭのＸＡＶを含有する、７５％ＫＳＲ分化培地および２５％Ｎ２培地。

５日目（１２０〜１４４時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有する、７５％ＫＳＲ分化培地および２５％Ｎ２培地に交換する。前部神経外胚葉に分化している場合、ＸＡＶを除去し、７５％ＫＳＲ分化培地および２５％Ｎ２培地、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ、での細胞の処理を継続する。

６〜１１日目：５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有する培地勾配に従って毎日培地を交換する。

神経堤分化。０日目（０〜２４時間）：５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋３μＭのＣＨＩＲを含有するＫＳＲ分化培地に交換する。

２〜１１日目：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋３μＭのＣＨＩＲを含有する培地勾配と１日おきに交換する。

三叉神経プラコード分化。０日目（０〜２４時間）：５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地と交換する。

２日目（４８〜７２時間）：細胞への培地を、１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地と交換する。

３〜１１日目：細胞への培地を１０μＭのＳＢを含有する培地勾配と１日おきに交換する。

非神経外胚葉分化。０日目（０〜２４時間）：５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地と交換する。

２日目（４８〜７２時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＫＳＲ分化培地と交換する。

３〜１１日目：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋１０μＭ ＳＵを含有する培地勾配と１日おきに交換する。

Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６ベースの分化（１０〜１２日）
分化開始前の調製
マトリゲルをＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースの培地で希釈（１：５０）するかまたはビトロネクチンをＰＢＳで希釈し（１：１００）、組織培養処理ディッシュにコーティングする。ディッシュをパラフィルムで覆い、４℃で終夜保存する。

分化の−１日目
ｈＰＳＣ培養物は、分化を開始する前に７０％〜８０％コンフルエントであるべきである。細胞をＥＤＴＡ解離緩衝剤で剥離させ（３７℃で５分）、細胞をプレートから穏やかに解離させる。細胞を４５ミクロンの細胞ストレーナーに通し、細胞をペレット化する（５分間、２００×ｇ）。細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、再度ペレット化する。１０μＭのＲＯＣＫｉを含有するＥ８培地に１ｃｍ２当たり２５０〜３００，０００個の細胞を播種する。細胞を３７℃のインキュベーターの中で終夜インキュベートする。

分化の０日目
ｈＰＳＣ培地は、高密度単層に見えるはずである。プラスチックは、ほとんど見えないはずである。下記の特定の分化を開始する前に細胞をＰＢＳまたはＥ６培地で洗浄する。

神経外胚葉分化。０日目（０〜２４時間）：５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地を細胞に添加する。前部神経外胚葉への分化のより大きな偏りを生じさせるために、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢ＋５μＭのＸＡＶを含有するＥ６培地を細胞に添加する。

３日目（７２〜９６時間）：細胞への培地を、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地に交換する。前部神経外胚葉に分化している場合、ＸＡＶを除去し、５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢでの細胞の処理を継続する。

４〜１２日目：培地を５００ｎＭのＬＤＮ＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地と１日おきに交換する。

神経堤分化。０日目（０〜２４時間）：１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢ＋６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢ＋６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地と交換する。

２日目（４８〜７２時間）：細胞への培地を１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢ＋６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地と交換する。

３日目（７２〜９６時間）：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋１．５μＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地と交換する。
４〜１２日目：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋１．５μＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地と１日おきに交換する。

頭蓋プラコード分化。０日目（０〜２４時間）：５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地と交換する。

２日目（４８〜７２時間）：細胞への培地を５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地と交換する。

３日目（７２〜９６時間）：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有するＥ６培地と交換する。
４〜１２日目：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有するＥ６培地と毎日交換する。

三叉神経プラコード分化。０日目（０〜２４時間）：５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地と交換する。

２日目（４８〜７２時間）：細胞への培地を５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢ＋６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地と交換する。

３日目（７２〜９６時間）：細胞への培地を１０μＭのＳＢ＋６００ｎＭのＣＨＩＲを含有するＥ６培地と交換する。

４日目（９６〜１２０時間）：培地を１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地と５〜１２日目に交換する：細胞への培地を１０μＭのＳＢを含有するＥ６培地と毎日交換する。

非神経外胚葉分化。０日目（０〜２４時間）：１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢ＋１０μＭのＳＵを含有するＥ６培地を細胞に添加する。

１日目（２４〜４８時間）：細胞への培地を１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０μＭのＳＢ＋１０μＭのＳＵを含有するＥ６培地と交換する。

２〜１２日目：細胞への培地を５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１０１μのＳＢを含有するＥ６培地と１日おきに交換する。

外胚葉系統からの前駆細胞の分化
ニューロンへのＮＥ分化。１０日目に開始して、培養物を、Ｂ２７サプリメントを含有するＮ２培地中でさらに１０日維持し、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離させ、４５ミクロンの細胞ストレーナーに通し、細胞を培地またはＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ニューロン分化培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｂ２７、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、１００μＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦと、１０μＭのＤＡＰＴ）に、１ｃｍ２当たり約５０Ｋ個の低い細胞密度で播種した。培養物がニューロンに見えたら（約５〜６日）、ＤＡＰＴを除去する。

感覚および自律ニューロンへのＮＣ分化。分化した神経堤細胞を１０日目にＡｃｃｕｔａｓｅで解離させ、Ｎ２と、Ｂ２７と、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２と、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１とを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に１ｍｌ当たり２００万個で再懸濁させた。細胞懸濁液を懸濁培養用の超低接着プレートに移して、ＮＣスフェアを形成する。Ｎ２と、Ｂ２７と、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２と、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１とを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で１５日目までスフェアを維持し、次いで、ＰＯ／ＬＡＭ／ＦＮをコーティングしたプレート上の、Ｎ２と、Ｂ２７と、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦとを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に１：１比で播種して、感覚および自律ニューロンに自然分化させる。

水晶体プラコードおよび三叉神経ニューロンへのＣＰ分化。水晶体プラコード。１０日目に開始して、１０μＭのＳＢ４３１５４２を含有するＥ６でさらに１０日間、頭蓋プラコード培養物を維持した。２０日目に開始して、ＳＢ４３１５４２を培地から除去し、分化休止のためにＥ６のみで培養物を維持した。培地を週３回（月曜日、水曜日、金曜日）交換した。

三叉神経ニューロン。１０日目に、２００μｌピペットを使用して三叉神経プラコードクラスターを手作業で採取した。採取したクラスターを、Ｂ２７サプリメントと、１０μＭのＤＡＰＴと、５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦと、５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦと、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと、１００μＭのＡＡとを含有するＮ２培地に移した。１ｃｍ２当たりおおよそ１０〜２０個のクラスターをマトリゲル上に播種した。培地を週３回（月曜日、水曜日、金曜日）交換した。

ケラチノサイトへのＮＮＥ分化。分化の１０日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を解離させ、４５ミクロンの細胞ストレーナーに通し、細胞を培地またはＰＢＳで１回洗浄した。Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎを製造業者の仕様書に従って使用して事前にコーティングしておいた細胞培養プラスチック上の、１０μＭのＳＢ４３１５４２と、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、１０１１ＭのＳＵ５４０２とを含有するＥ６中で細胞を１：２継代させた。２日後、培地を、Ｓ７サプリメントを含有する７５％Ｅ６／２５％ＥｐｉＬｉｆｅに交換した。さらに２日後、培地を、Ｓ７サプリメントを含有する５０％Ｅ６／５０％ＥｐｉＬｉｆｅに交換した。２日後、培地を、Ｓ７サプリメントを含有する２５％Ｅ６／７５％ＥｐｉＬｉｆｅに交換した。さらに２日後、培地を、Ｓ７サプリメントを含有する１００％ＥｐｉＬｉｆｅに交換した。これ以降は培地（Ｓ７サプリメントを含有するＥｐｉＬｉｆｅ）を週３回（月曜日、水曜日、金曜日）交換した。

ＰＡＸ６およびＳＩＸ１ Ｈ２Ｂ ＧＦＰレポーター株の生成
ドナープラスミドを構築し、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｐＵＣ１９にクローニングした。ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェア（Cermak et al., 2011; Doyle et al., 2012）を使用してＴＡＬＥＮ配列を予測した。ＰＡＸ６ ＴＡＬＥＮ：ＴＧＴＣＣＴＧＴＡＴＴＧ ＴＡＣＣＡＣＴおよびＴＧＴＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴ ＳＩＸ１ ＴＡＬＥＮ：ＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡおよびＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＴＧＧＧＧＡ。ＴＡＬＥＮ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ）（Sanjana et al., 2012）を使用してＴＡＬＥＮを生成し、記載するとおりに実施した。ドナープラスミド（２０ｕｇ）およびＴＡＬＥＮペア（それぞれ５ｕｇ）をＨ９ ｈＥＳＣ（３２〜３６継代）にヌクレオフェクトした（Ｂ−０１６プログラムを使用するＬｏｎｚａ Ｋｉｔ Ｖ）。ヌクレオフェクトした細胞を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を加えたＫＳＲ培地中のＭＥＦフィーダー層上に播種した。４８時間後、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を添加して陽性クローンについて選択した。次いで、ピューロマイシン耐性クローンを単離し、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを使用して標的化を確認した。さらなる検証は、方向付けられた分化、およびＰＡＸ６またはＳＩＸ１抗体どちらかでのＧＦＰの共標識を含んだ。

ＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣ株の生成
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してノックアウトｈＥＳＣ株を生成した。手短に述べると、２種のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ設計ツール（Cong et al., 2013）を使用して予測し、ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。Ｃａｓ９−ＧＦＰ（５ｕｇ）と両方のガイドＲＮＡ（それぞれ１ｕｇ）をＨ９ ｈＥＳＣにヌクレオフェクトし（Ｂ−０１６プログラムを使用するＬｏｎｚａ Ｋｉｔ Ｖ）、マトリゲルをコーティングしたディッシュ上の１０μＭのＲＯＣＫｉを含有するＫＳＲ培地に播種した。２４時間後、細胞をＧＦＰについて選別し、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するＫＳＲ培地中のＭＥＦフィーダー層上に播種した。次いで、コロニーを単離し、ＴＦＡＰ２Ａの標的化領域をＰＣＲによって増幅させ、ＴＯＰＯ ＴＡベクターにクローニングし、シークエンシングしてフレームシフト変異体を特定した。

ハイコンテント画像分析
ヒト胚性幹細胞（Ｈ９、Ｈ１、ＨＵＥＳ８、ＨＵＥＳ６およびＭＥＬ１）および誘導多能性幹細胞（ＢＪ１、ＭＲＣ５およびＳｅＶ６）を、最低限４継代（約２週間）にわたってＥ８培地中で順応させ、４種の外胚葉系統に分化するように誘導した。分化の１０日目に３０分間、３７℃でＡｃｃｕｔａｓｅを使用してバルクの分化体を解離させ、９６ウェルイメージングプレートに播種した。２日後に４％パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを使用して透過処理し、０．２％Ｔｗｅｅｎ中で維持した（前記試薬はすべて、ＰＢＳで希釈したものである）。次いで、外胚葉系統を示す様々なマーカーに対する抗体を使用して、細胞を染色した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥ）を使用して、プレートをスキャンして測定値を記録し、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。これらの細胞株を含む実験を、生物学的に反復し（ｎ＝４）、技術的に反復した（１生物学的反復当たりｎ＝２）。

ＲＮＡシークエンシングおよび分析
総ＲＮＡ（Ｔｒｉｚｏｌ）を少なくとも二連で分化の１２日目にＧＦＰ選別細胞から（ＮＥ、ＮＣおよびＣＰ）またはバルクで（ＮＮＥ）単離した。ＲＮＡシークエンシングライブラリーのリボソーム除去を行い、おおよそ６千万の読み取りデータが生じ、Ｔｏｐｈａｔ ｖ１．２（Trapnell et al., 2012）を使用してｈｇ１９とアライニングした。次いで、ＨＴｓｅｑ（Anders et al., 2015）を使用して読み取りデータをカウントし、差次的に発現した遺伝子をＤＥＳｅｑ（Anders and Huber, 2010）を使用して計算した。差次的に発現した群を、遺伝子オントロジーによる分類およびＬｉｆｅＭａｐ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（Edgar et al., 2013）を使用するシグナル伝達経路濃縮について分析した。得られたＲＮＡシークエンシングデータセットをＧＥＯ（ＧＳＥ１０１６６１）にアップロードする。

プラコードの運命のエンハンサーについての小分子スクリーニング
Ｈ９ ＳＩＸ１ Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ細胞を、前に説明したように水晶体プラコードに分化させ、マトリゲルをコーティングした９６ウェルプレート上に播種した。３日目（ＳＩＸ１ Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰを個々の細胞において検出することができる前日）に、培地にＬＯＰＡＣライブラリーからの化合物をさらに補充した。化合物ごとに２つの異なる濃度（１μＭおよび１０μＭ）を使用した。分化の６日目まで培地を交換しなかった。分化の６日目にプレートをＰＢＳで１回洗浄し、細胞を４％ＰＦＡで固定した。バックグラウンドに対するシグナル強度を増大させるために、ＧＦＰに対する抗体を使用して細胞を染色した。適切なＡｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした二次抗体と核対比染色剤ＤＡＰＩとで標識した後、Ｍｅｔａ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｅｔａ−ｍｏｒｐｈ）を使用して、ＤＡＰＩ陽性細胞に対する核ＧＦＰシグナルのパーセントを計算することにより、細胞を分析した。

皮質および感覚ニューロンのカルシウムイメージング
ＮＥから誘導した皮質ニューロンおよびＮＣから誘導した感覚ニューロン（上記）を、ポリオルニチン、ラミニンおよびフィブロネクチンをコーティングしたＩｂｉｄｉプレート上に播種した。１４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、１．８ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース、およびｐＨ７．４で１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳからなるＴｙｒｏｄｅ溶液中の、２０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）−Ｆ１２７と１ｍｍｏｌ／Ｌのストック濃度を有するＤＭＳＯの１：１（ｖ／ｖ）量に溶解した２μｍｏｌ／ＬのＦｌｕｏ−４ ＡＭを、４５分間、ＲＴで、細胞に負荷した。細胞内の一過性カルシウム上昇を、倒立広視野イメージングシステム（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｗｉｄｅ ｆｉｅｌｄ／Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して加熱ステージで２５０ｍｓの間隔（１秒当たり４フレーム）で記録した。次いで、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、バックグラウンド減算ベースライン蛍光に正規化したバックグラウンド減算蛍光強度変化として関心領域（ＲＯＩ）を定量化した。

定量化および統計分析
様々な外胚葉系統を誘導するストラテジーの開発中に、８０を超える分化（生物学的および技術的）を実施して、系統特異的ＧＦＰについてのＦＡＣＳ解析によりプロトコールの再現性および堅固さを評価した。すべてのデータを、その特定の実験について表示されるボックスプロットにプロットする。具体的には、図３７Ｅ（ｎ＝３）、図３８Ａ、３８Ｇ（ｎ＝３）、図３８Ｂ（ｎ＝２）、図３９（生物学的反復ｎ＝２、技術的反復ｎ＝４）、図６Ｃ（ｎ＝３）、図６Ｄ（ｎ＝２）、図６Ｅ（ｎ＝６）および図７Ａ（ｎ＝８）。図４０Ｈ（生物学的ｎ＝５、技術的ｎ＝２）、図４２（生物学的反復ｎ＝２、技術的反復ｎ＝４）、図４４（ｎ＝３）。

本文書中の、生成したＲＮＡシークエンシングデータを、受託番号ＧＥＯ：ＧＳＥ１０１６６１でＧＥＯにアップロードする。このデータセットは、ＨＴＳｅｑからのカウントテーブルと、出発ｈＥＳＣと比較したそれぞれの細胞型の変化倍率の定量化とを含む。

参考文献
Anders, S., and Huber, W. (2010). Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11, R106.
Anders, S., Pyl, P.T., and Huber, W. (2015). HTSeq−a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 31, 166−169.
Bailey, A.P., Bhattacharyya, S., Bronner-Fraser, M., and Streit, A. (2006). Lens specification is the ground state of all sensory placodes, from which FGF promotes olfactory identity. Dev. Cell 11, 505−517.
Blauwkamp, T.A., Nigam, S., Ardehali, R., Weissman, I.L., and Nusse, R. (2012). Endogenous Wnt signalling in human embryonic stem cells generates an equilibrium of distinct lineage-specified progenitors. Nat. Commun. 3, 1070.
Cermak, T., Doyle, E.L., Christian, M., Wang, L., Zhang, Y., Schmidt, C., Baller, J.A., Somia, N.V., Bogdanove, A.J., and Voytas, D.F. (2011). Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, e82.
Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275−280.
Chambers, S.M., Qi, Y., Mica, Y., Lee, G., Zhang, X.J., Niu, L., Bilsland, J., Cao, L., Stevens, E., Whiting, P., et al. (2012). Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715−720.
Chen, G., Gulbranson, D.R., Hou, Z., Bolin, J.M., Ruotti, V., Probasco, M.D., Smuga-Otto, K., Howden, S.E., Diol, N.R., Propson, N.E., et al. (2011). Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat. Methods 8, 424−429.
Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., and Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819−823.
Dincer, Z., Piao, J., Niu, L., Ganat, Y., Kriks, S., Zimmer, B., Shi, S.H., Tabar, V., and Studer, L. (2013). Specification of functional cranial placode derivatives from human pluripotent stem cells. Cell Rep. 5, 1387−1402.
Doyle, E.L., Booher, N.J., Standage, D.S., Voytas, D.F., Brendel, V.P., Vandyk, J.K., and Bogdanove, A.J. (2012). TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, W117-22.
Edgar, R., Mazor, Y., Rinon, A., Blumenthal, J., Golan, Y., Buzhor, E., Livnat, I., Ben-Ari, S., Lieder, I., Shitrit, A., et al. (2013). LifeMap Discovery□: the embryonic development, stem cells, and regenerative medicine research portal. PLoS ONE 8, e66629.
Fattahi, F., Steinbeck, J.A., Kriks, S., Tchieu, J., Zimmer, B., Kishinevsky, S., Zeltner, N., Mica, Y., El-Nachef, W., Zhao, H., et al. (2016). Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature 531, 105−109.
Felgentreff, K., Du, L., Weinacht, K.G., Dobbs, K., Bartish, M., Giliani, S., Schlaeger, T., DeVine, A., Schambach, A., Woodbine, L.J., et al. (2014). Differential role of nonhomologous end joining factors in the generation, DNA damage response, and myeloid differentiation of human induced plurip-otent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 8889−8894.
Gadue, P., Huber, T.L., Paddison, P.J., and Keller, G.M. (2006). Wnt and TGF-beta signaling are required for the induction of an in vitro model of primitive streak formation using embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 16806−16811.
Groves, A.K., and LaBonne, C. (2014). Setting appropriate boundaries: fate, patterning and competence at the neural plate border. Dev. Biol. 389, 2−12.
Kriks, S., Shim, J.W., Piao, J., Ganat, Y.M., Wakeman, D.R., Xie, Z., Carrillo-Reid, L., Auyeung, G., Antonacci, C., Buch, A., et al. (2011). Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature 480, 547−551.
Leung, A.W., Kent Morest, D., and Li, J.Y. (2013). Differential BMP signaling controls formation and differentiation of multipotent preplacodal ectoderm progenitors from human embryonic stem cells. Dev. Biol. 379, 208−220.
Li, W., and Cornell, R.A. (2007). Redundant activities of Tfap2a and Tfap2c are required for neural crest induction and development of other non-neural ectoderm derivatives in zebrafish embryos. Dev. Biol. 304, 338−354.
Lippmann, E.S., Estevez-Silva, M.C., and Ashton, R.S. (2014). Defined human pluripotent stem cell culture enables highly efficient neuroepithelium derivation without small molecule inhibitors. Stem Cells 32, 1032−1042.
Loh, K.M., Chen, A., Koh, P.W., Deng, T.Z., Sinha, R., Tsai, J.M., Barkal, A.A., Shen, K.Y., Jain, R., Morganti, R.M., et al. (2016). Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell 166, 451−467.
Luo, T., Lee, Y.H., Saint-Jeannet, J.P., and Sargent, T.D. (2003). Induction of neural crest in Xenopus by transcription factor AP2alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 532−537.
Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E., and Church, G.M. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823−826.
Maroof, A.M., Keros, S., Tyson, J.A., Ying, S.W., Ganat, Y.M., Merkle, F.T., Liu, B., Goulburn, A., Stanley, E.G., Elefanty, A.G., et al. (2013). Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 12, 559−572.
Menendez, L., Yatskievych, T.A., Antin, P.B., and Dalton, S. (2011). Wnt signaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 19240−19245.
Mica, Y., Lee, G., Chambers, S.M., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2013). Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140−1152.
Miller, J.D., Ganat, Y.M., Kishinevsky, S., Bowman, R.L., Liu, B., Tu, E.Y., Mandal, P.K., Vera, E., Shim, J.W., Kriks, S., et al. (2013). Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell 13, 691−705.
Sanjana, N.E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M.M., Feng, G., and Zhang, F. (2012). A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171−192.
Schorle, H., Meier, P., Buchert, M., Jaenisch, R., and Mitchell, P.J. (1996). Transcription factor AP-2 essential for cranial closure and craniofacial development. Nature 381, 235−238.
Simoes-Costa, M., and Bronner, M.E. (2016). Reprogramming of avian neural crest axial identity and cell fate. Science 352, 1570−1573.
Suzuki, I.K., and Vanderhaeghen, P. (2015). Is this a brain which I see before me? Modeling human neural development with pluripotent stem cells. Development 142, 3138−3150.
Tabar, V., and Studer, L. (2014). Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nat. Rev. Genet. 15, 82−92.
Taylor, K.M., and Labonne, C. (2005). SoxE factors function equivalently during neural crest and inner ear development and their activity is regulated by SUMOylation. Dev. Cell 9, 593−603.
Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D.R., Pimentel, H., Salzberg, S.L., Rinn, J.L., and Pachter, L. (2012). Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562−578.
Xie, W.F., Kondo, S., and Sandell, L.J. (1998). Regulation of the mouse cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein gene by the transcription factor AP-2. J. Biol. Chem. 273, 5026−5032.
Zimmer, B., Piao, J., Ramnarine, K., Tomishima, M.J., Tabar, V., and Studer, L. (2016). Derivation of Diverse Hormone-Releasing Pituitary Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports 6, 858−872.

本開示の主題およびその利点について詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲によって定義された発明の精神および範囲を逸脱せずに、種々の変化、置換および変更を本明細書において行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されている過程、機械、製造物、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者が本開示の主題の開示から容易に理解するように、本明細書に記載されている対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施し、または実質的に同じ結果を達成する既存のまたは後に開発される過程、機械、製造物、組成物、手段、方法またはステップを、本開示の主題に従って利用できる。したがって、添付の特許請求の範囲は、このような過程、機械、製造物、組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むことを意図する。

その開示が、参照によりすべての目的のために全体として本明細書に組み込まれる特許、特許出願、刊行物、製品の記載およびプロトコルがこの出願を通して引用されている。

Claims (43)

1. ＳＯＸ１０を含む少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
2. ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
3. ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される１種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
4. ＴＦＡＰ２Ａを含む少なくとも１種のｏｒｅ非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
5. 前記細胞が、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１または３に記載の集団。
6. 前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項２に記載の集団。
7. 前記細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤に曝露される、請求項４に記載の集団。
8. 前記幹細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１から７のいずれか一項に記載の集団。
9. 前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項４、７および８のいずれか一項に記載の集団。
10. ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の集団。
11. ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の集団。
12. Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ誘導体、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項１、３、５および８から１１のいずれか一項に記載の集団。
13. ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、請求項２、６、および８から１２のいずれか一項に記載の集団。
14. ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項４、７、および８から１３のいずれか一項に記載の集団。
15. 幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
16. 幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
17. 幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
18. 幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
19. 前記細胞が、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１５または１７に記載の方法。
20. 前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１６に記載の方法。
21. 前記細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤に曝露される、請求項１８に記載の方法。
22. 前記幹細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記幹細胞が、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１８、２１および２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. ＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項１５、１７、１９、および２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、請求項１６、２０、および２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項１８、２１、および２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記少なくとも１種の神経堤系統マーカーが、ＳＯＸ１０を含む、請求項１５、１９、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記少なくとも１つの頭蓋プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６、２０、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７、１９、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーが、ＴＦＡＰ２Ａを含む、請求項１８、２１、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記分化細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、請求項１５から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物。
35. 医薬組成物であり、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
36. 対象における神経変性障害および／または下垂体障害を処置する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞、または請求項３４もしくは３５に記載の組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
37. 前記下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、請求項３６に記載の方法。
38. 神経変性障害および／または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞、または請求項３４もしくは３５に記載の組成物の使用。
39. 下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、請求項３８に記載の使用。
40. 神経変性障害および／または下垂体障害の処置における使用のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞。
41. 下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、請求項４０に記載の使用のための細胞。
42. 神経変性障害および／または下垂体障害の処置における使用のための、請求項３４または３５に記載の組成物。
43. 下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、請求項４２に記載の使用のための組成物。