JP2021028329A - タンパク質及びペプチドの免疫原性を減少させる方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の一つの目的は、生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を減少させる方法を提供することにある。【解決手段】本発明は、キャリアを位置特異的にタンパク質またはペプチドに結合することにより、タンパク質またはペプチドの血中半減期を増やし、免疫原性を減少させる方法及びその用途に関する。本発明の生理活性タンパク質またはペプチド結合体は、人体内の免疫原性が顕著に低下してタンパク質やペプチドに対する抗体生成率が低下するため、生理活性タンパク質またはペプチドの臨床効力減少現象が低い利点を有し、また、これを免疫反応に対する安全性が高い持続型製剤の開発に有用に利用することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質またはペプチドにキャリアを位置特異的に結合させることにより、タンパク質またはペプチドの血中半減期を増加させ、その免疫原性を減少させる方法及びその用途に関する。

生物学的治療剤に対する免疫反応は、非ヒト及びヒト由来のタンパク質のすべてに対して広く誘発することができる。このような反応は、臨床効果を弱め、有効性を制限し、時には病理学的疾患を引き起こしたり、患者の死を引き起こすことさえある。特に、組換え自己タンパク質を標的とする中和抗体の生成は、患者の体内に内在しているタンパク質と交差反応を誘発することができるため、深刻な結果をもたらすことができる（非特許文献１）。モノクローナル抗体のようなバイオ医薬品の問題点は、分子生物学の発展とともに大きく減少した。しかし、多くの組換えタンパク質医薬品は、体内で発現されるタンパク質配列と同一であるため、依然として中和免疫反応を引き起こす可能性が残っている（非特許文献２）。免疫原性を誘導することが可能であるメカニズムは完全には明らかではないが、自己タンパク質に対する耐性は、患者に投与された産物及び患者の様々な因子によって壊れることが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。免疫原性の要因は、用量、投与の頻度と経路、タンパク質医薬品の免疫調節能力、それらの製剤などを含む。免疫反応を誘発する最も重要な要因は、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を効果的に刺激することができる抗原認識部位（epitope）があるかどうかである。（非特許文献５）

一方、エキセンディン−４（exendin-4）は、ギラモンスターのトカゲ（Gila monster lizard）の唾液腺から発見された天然ペプチドであり、ヒトＧＬＰ−１（グルカン様ペプチド1）と５２％の配列類似性を有する。エキセンディン−４及びＧＬＰ−１は類似したインスリン分泌能を有している。しかし、ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（dipeptidyl peptidase-IV、 DPP-IV）により迅速に非活性化され、非常に短い半減期を有する一方、エキセンディン−４は、２番目のアミノ酸配列であるアラニンの代わりに存在するグリシンによりＤＰＰ−ＩＶに対する耐性を有し、２型糖尿病の治療剤としてより効果的であり得る。また、インスリンまたはそのアナログ、及びＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストも糖尿病及び肥満治療剤として使用される。しかし、このような非ヒトアミノ酸配列の存在は、Ｔ細胞の抗原認識部位として作用することができる。合成エキセンディン−４などの２型糖尿病治療薬として承認されたエクセナチド（Byetta）は、臨床試験で１年間エクセナチド投与を受けた患者の中、約３０％以上がエクセナチドに対する抗体が生成された。最近承認されたリキシセナチドは、 患者の約６０〜７１％が抗体を生成した（非特許文献６乃至非特許文献９）。即ち、エクセナチドは、処理される生体内異物として認識され、抗体が生成された。この理由から、治療効果を確実に期待することが困難な問題が広く発生している。

従って、長期間の治療又は予防を目的として体内に投与された生理活性タンパク質又はペプチドの場合、免疫原性を調節することが重要である。特に、インスリン又はインスリン分泌ペプチド及び抗肥満タンパク質などの成人病関連の生理活性タンパク質またはペプチドは、投与後に体内で長く持続する持続型製剤として開発する場合が多い。また、持続型製剤でなくても長期間に複数回投与しなければならない場合が多く、免疫反応を誘導しないことが重要な問題となっている。

このような背景の下、本発明者らは、免疫反応を誘発しないタンパク質またはペプチドの医薬製剤を開発するために鋭意努力した結果、キャリアをタンパク質またはペプチドに位置特異的に結合させる場合、キャリアが結合されていないタンパク質又はペプチドに比べて、免疫原性を減少させることを確認し、本発明を完成した。

韓国登録特許第１０−１０５８２９０号（あるいは国際公開特許ＷＯ２００８−０８２２７４） 韓国公開特許第２０１４−０１０６４５２号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１４−１３３３２４） 韓国公開特許第１０−２０１２−０１３５１２３号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１２−１６５９１５） 国際公開特許ＷＯ２０１４／１０７０３５ 韓国公開特許第１０−２０１２−０１３７２７１号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１２−１６９７９８） 第１０−２０１２−０１３９５７９号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１２−１７３４２２） 国際公開特許第ＷＯ９７／３４６３１号 国際公開特許第ＷＯ９６／３２４７８号

Lim LC, Hematology 2005 10(3):255-9 Namaka M et al., Curr Med Res Opin 2006 22(2):223-39 Chester K et al., Expert Rev Clin Immunol 2005 1(4): 549-559 Baker MP and Jones TD, Curr. Opin. Drug Disc Dev 2007 10(2):219-227 reviewed Baker MP and Jones TD, Curr. Opin. Drug Disc Dev 2007 10(2):219-227 Zinman B et al., Annals of Internal Medicines. 2007 146(7): 477-486 Schnabel CA et al., Peptides 2006 27:1902-1910 DeFronzo R.A. et al., Diabetes Care 2005 28:1092-1100 Buse J.B. et al., Diabetes Care 2004 27:2628-2635 H.Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979

本発明の一つの目的は、生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を減少させる方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基に 非ペプチジルリンカーを介してキャリアが結合した生理活性タンパク質またはペプチド結合体を含む組成物を提供することにある。本発明の他の目的は、キャリアが生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基に結合した生理活性タンパク質またはペプチド結合体の製造方法を提供することにある。

本発明の一つの態様は、生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基にキャリアを結合させる工程を含む、キャリアが結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドに比べて生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を減少させる方法を提供する。

本発明の具体的な実施形態において、前記キャリアは、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合物質、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位を有するポリマー、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内の結合組織またはその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン、エラスチン類似ポリペプチド（elastin-like polypeptide、ELP）、ＸＴＥＮポリペプチド、カルボキシ末端ペプチド（carboxyl terminal peptide、CTP）、ＳＩＰ（structure inducing probe）、糖類及び高分子ポリマーからなる群から選択されることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むことを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記生理活性タンパク質またはペプチド、及びキャリアは、それらの間に介在するリンカーを介して結合されることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記リンカーは、非ペプチド性リンカーであることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記生理活性タンパク質またはペプチドが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性リンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に結合したことを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記生理活性タンパク質またはペプチドが、抗肥満ペプチド、インスリン分泌ペプチドまたはそのアナログ、レプチン、インスリン、インスリンアナログ、グルカゴン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、ＧＬＰ−１のようなグルカゴン−様ペプチド、ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニスト、胃抑制ポリペプチド （Gastric inhibitory polypeptide、ＧＩＰ ）、Ｇタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptor、GPCR ）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リムポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモデュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩa、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、レラキシン、シクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片からなる群から選択されることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記生理活性タンパク質またはペプチドは、エキセンディン−４、エキセンディン−４誘導体、ＧＬＰ−１アゴニスト、インスリン、及びＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストからなる群から選択されることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記エキセンディン−４誘導体は、エキセンディン−４のＮ−末端のアミン基が除去された、エキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端アミン基がヒドロキシル基で置換されたエキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端アミン基がカルボキシル基で置換されたエキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端アミン基がジメチル基で修飾されたエキセンディン−４誘導体；及びエキセンディン−４のＮ−末端ヒスチジン残基のα-炭素が除去されたエキセンディン−４誘導体からなる群から選択されるエキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾（変形）された誘導体であることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前術した内部残基は、エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４の１２番目または２７番目がリジン残基であることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前述した内部残基は、エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４の２７番目がリジン残基であることを特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４誘導体は、エキセンディン−４のＮ−末端ヒスチジン残基のα-炭素が除去された、エキセンディン−４誘導体であることを特徴とする。

本発明を実施するための他の態様は、生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基に非ペプチジルリンカーを介してキャリアが結合した生理活性タンパク質またはペプチド結合体を含む組成物を提供し、前記結合体はキャリアが結合していない生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性より減少された免疫原性を示す。

本発明の他の具体的な実施形態において、前術した結合体は、持続性製剤の副作用である減少された免疫原性を特徴とする。

本発明の他の具体的な実施形態において、前記非ペプチジルリンカーは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。

本発明を実施するためのもう一つの態様は、生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基にキャリアが結合された、生理活性タンパク質またはペプチド結合体の製造方法を提供する。

本発明の生理活性タンパク質またはペプチド結合体は、人体内の免疫原性が著しく低下して、タンパク質またはペプチドに対する抗体生成率が減少する。そのため、前記結合体は、生理活性タンパク質またはペプチドの臨床効果の減少が低く、免疫反応に対する高い安全性を有する持続型製剤の開発に有用に使用することができる。

エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞活性試験に使用されたドナー、世界人口、及びヨーロッパと北アメリカ人口のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型頻度の比較を示した図である。

本発明は、生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基にキャリアを結合させる工程を含む、キャリアが結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドに比べて生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を減少させる方法に関する。

本発明において本発明者らは、生理活性タンパク質またはペプチドの末端より内部残基に非ペプチジルリンカーとＦｃ断片を結合して 、目的タンパク質またはペプチドが抗原として作用しメカニズムを阻害することにより、生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を低下させる方法を開発した。本発明者らは、このような方法を使用する場合、ペプチドのＮ末端などの他の位置に修飾して結合体を製造することに比べて、 Ｔ細胞の活性化及び動物における抗体の生成反応を顕著に抑制することを確認した。その結果、本発明者らは、既存のタンパク質医薬製剤として使用された生理活性タンパク質またはペプチド結合体を生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性減少用組成物、または方法として新たな用途で使用することができることを発見した。

体内の免疫原性の減少如何は、公知の方法により制限なく測定することができる。例えば、免疫原性の差異は、Ｎ末端またはＣ末端を含むＮ末端以外の部位にそれぞれキャリアの結合してＴ細胞のエクス・ビボ（ex vivo）活性測定法によって確認することができる。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ−末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件ではリジン残基とも共有結合を形成することができる。反応ｐＨを変化させながらペグ化（pegylation）反応を進めた後、イオン交換カラムを使用して反応混合物から位置異性体を分離することができる。

生体内のタンパク質またはペプチドの活性に重要な部位であるＮ−末端以外の位置でカップリングが行われた場合、アミン基は修飾されるアミノ酸残基位置に導入され、前記タンパク質またはぺプチドと非ペプチジルポリマーのアルデヒド基との間に共有結合を形成する。

Ｎ−末端の保護方法は、ジメチル化以外にメチル化、脱アミノ化またはアセチル化の方法を含み、これらに限定されない。

本発明における、「生理活性タンパク質またはペプチド」とは、遺伝的発現または生理機能を調節することができるタンパク質またはペプチドを意味する。前記生理活性タンパク質またはペプチドは、キャリアが本発明における生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基に結合し、そのため、キャリアが結合されていないタンパク質またはペプチドに比べて減少された免疫原性を有する限り、制限なく本発明の範囲に含まれることができる。後述するように、前記キャリアは、リンカー、具体的には、非ペプチジルリンカーを介して生理活性タンパク質またはペプチドに結合することができる。

また、前記生理活性タンパク質またはペプチドは、天然型生理活性タンパク質またはペプチド以外に誘導体、変異体、またはその断片を含む。

前記生理活性タンパク質またはペプチドの例として、抗肥満ペプチド、インスリン分泌ペプチドまたはそのアナログ、レプチン、インスリン、インスリンアナログ、グルカゴン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン−様ペプチド（ＧＬＰ−１など）、ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニスト、胃抑制ポリペプチド（Gastric inhibitory polypeptide、 GIP)、Ｇタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptor、GPRC）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リムポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモデュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩ a 、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、シクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体と抗体断片を含むが、これに限定されない。

より具体的には、前記生理活性タンパク質またはペプチドは、インスリン、インスリン分泌ペプチド、またはＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストを含んでもよいが、これに限定されない。

本発明における用語、「インスリン」とは、インスリン受容体に対して刺激効果を有するすべてのペプチドまたは変形ペプチドを含む。前記インスリンは、例えば、天然型インスリン、速効インスリン、基底インスリン、天然型インスリンにおいて一部のアミノ酸が置換、付加、欠失及び修飾のいずれか一つの方法またはこれらの方法の組み合わせを通じて変形が起こった物質であるインスリンアナログ、またはこれらの断片であり得る。また、本発明において使用される前記インスリンは、短い半減期を克服するために持続型の技術を適用した持続型インスリンであってもよい。具体的には、前記インスリンは、週１回投与することができる持続型インスリンまたは持続型インスリンアナログであってもよいが、これに限定されない。

本発明における前記インスリンの具体的な例を一部挙げれば、韓国登録特許第１０−１０５８２９０号（あるいは国際公開特許ＷＯ２００８−０８２２７４）、または韓国公開特許第２０１４−０１０６４５２号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１４−１３３３２４）に記載されたインスリンまたはインスリンアナログとその持続型を含むが、その範囲は制限されない。また、前記明細書全体は、本発明の参考資料として含まれる。

本発明に使用される用語、「インスリンアナログ」とは、天然型インスリンとして生体内の血糖値を調節する同一な機能を有する物質を意味する。具体的には、前記インスリンアナログは、天然型インスリン配列において１つ以上のアミノ酸が変形されたものを含む。前記インスリンアナログは、天然型インスリンのＡ鎖またはＢ鎖のアミノ酸が変異されたインスリンアナログであってもよい。前記天然型インスリンのアミノ酸配列は、下記の通りである。

Ａ鎖：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号：１）

Ｂ鎖：Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：２）

具体的には、天然型インスリンにおいて少なくとも１つ以上のアミノ酸が置換 、付加、欠失、修飾、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変形が起こったものであってもよいが、これに限定されない。

前記アミノ酸の置換または付加において、ヒトのタンパク質から通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然のアミノ酸を使用することができる。前記非定型アミノ酸の市販供給源は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ及びＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれることができる。このようなアミノ酸が含まれたペプチド及び典型的なペプチド配列は商業的ペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙ及びＢａｃｈｅｍ、または韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購入することができる。

具体的には、前術したインスリンアナログは、逆向きインスリン、インスリン変異体、インスリン断片、インスリンアゴニスト、インスリン誘導体などを含み、その製造法としては、遺伝子組換えだけでなく、固相方法でも製造することができるが、これらに限定されるものではない。

前記用語、「インスリン誘導体」とは、体内で血糖値を調節する機能を有しながら、天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖とアミノ酸配列相同性を示し、また、アミノ酸残基の一部のグループが化学的に置換（例えば、α-メチル化、α-ヒドロキシル化）、除去（例えば、脱アミノ化）または修飾（例えば、Ｎ-メチル化）され得るペプチド形態を含む。また、前記インスリン誘導体には、天然型インスリンとアミノ酸配列に相同性がなくても、インスリン受容体と結合して体内で血糖値を調節するペプチド模倣体及び低分子あるいは高分子化合物も含む。

本発明で使用される前記用語、「インスリン断片」とは、インスリン中に１つ以上のアミノ酸が付加または除去された断片を意味する。前記付加されたアミノ酸は、天然の状態で存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。このようなインスリン断片は、体内で血糖値を調節する機能を保持する

本発明で使用される前記用語、「インスリン変異体」とは、インスリンと一つ以上の異なるアミノ酸配列を有するペプチドであり、体内で血糖値を調節する機能を保持する。

本発明のインスリンアゴニスト、誘導体、断片及び変異体をそれぞれ調製する方法は、単独、及びその組み合わせで使用することができる。本発明のインスリンアゴニスト、誘導体、断片、及び変異体をそれぞれ製造する方法は、単独で、及び組み合わせで使用することができる。例えば、本発明には天然型インスリンとは異なるアミノ酸配列を有し、末端アミノ酸残基が脱アミノ化され、体内で血糖値を調節する機能を保持したペプチドが含まれることができる。

前記アゴニスト、誘導体、断片、変異体の説明は、他の種類のタンパク質またはペプチドに対しても適用することができる。

具体的には、前記インスリンアナログは、インスリンＢ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、３番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸、３０番目のアミノ酸；Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、１８番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてもよく、より具体的には、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸；Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてもよい。具体的には、前述のアミノ酸において１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、または２７以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであり得るが、これに限定されない。

前述した位置のアミノ酸残基は、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン、イソロイシン、バリン、グルタミン、グリシン、リジン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、または／及びアスパラギン酸で置換することができる。

本発明における「インスリン分泌ペプチド」とは、インスリンを分泌する機能を保持するペプチドを意味する。前記インスリン分泌ペプチドは、膵臓のベータ細胞のインスリンの合成または発現を刺激し得る。上記インスリン分泌性ペプチドは、具体的には、ＧＬＰ−１（glucagon like peptide-1）、エキセンディン−３（exendin-3）またはエキセンディン−４（exendin-4）であるが、これに限定されない。前記インスリン分泌ペプチドは、天然型インスリン分泌ペプチドだけでなく、その前駆体、アゴニスト、誘導体、断片及び変異体などを含む。また、先に述べたようにこれらの組み合わせも含むことができる。

ＧＬＰ−１は、小腸から分泌されるホルモンであり、一般的にインスリン生合成及び分泌を促進し、グルカゴン分泌を抑制して、細胞によるグルコースの吸収を促進する。小腸において、グルカゴン前駆体は、３つのペプチド、即ち、グルカゴン、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２に分解される。ここで、ＧＬＰ−１は、インスリン分泌機能を有していない形態のＧＬＰ−１（１〜３７）を意味するが、その後にプロセシングされて活性化されたＧＬＰ−１（７〜３７）形態に転換される。

エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と５３％のアミノ酸配列相同性を示す３９個のアミノ酸を有するポリペプチドである。前記エキセンディン−４は、下記配列を有することができるが、これに限定されない。

エキセンディン−４：Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（配列番号：３）

一方、エキセンディン−３は、エキセンディン−４と２番目及び３番目のアミノ酸が異なるポリペプチドである。エキセンディン−３は、エキセンディン−４の２番目及び３番目の位置のアミノ酸がそれぞれセリン及びアスパラギン酸で置換されたものであり、Ｓｅｒ²Ａｓｐ³−エキセンディン−４（１−３９）で表示することができる。具体的には、前記エキセンディン−３は、下記配列を有することができるが、これに限定されない。

エキセンディン−３：Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（配列番号：４）

前術したインスリン分泌ペプチド誘導体は、インスリン分泌ペプチドのＮ−末端が変形されたものであることができる。より具体的には、前記インスリン分泌性ペプチド誘導体のＮ−末端の電荷を修飾（変化）させることにより受容体との迅速な解離を引き起こすことができ、前記Ｎ−末端の正電荷が、中性または有効負電荷に修飾されることができる。

本発明の前記インスリン分泌ペプチド誘導体は、インスリン分泌ペプチドのＮ−末端アミノ（またはアミン）基が除去されたデスアミノ-ヒスチジル誘導体（Desamino-histidyl誘導体）；前記アミノ基がヒドロキシル基で置換したβ-ヒドロキシイミダゾプロピオニル誘導体（beta-hydroxy imidazopropionyl−誘導体）；前記アミノ基が２つのメチル基で修飾されたジメチル-ヒスチジル誘導体（Dimethyl-histidyl−誘導体）；Ｎ−末端のアミノ基がカルボキシル基で置換したβ-カルボキシイミダゾプロピオニル誘導体（beta-carboxyimidazopropionyｌ−誘導体）または Ｎ−末端のヒスチジン残基のアルファカーボンが除去され、イミダゾールアセチル基のみを保持してアミノ基の正電荷が除去されたイミダゾアセチル誘導体（Imidazoacetyl−誘導体）などが含まれることができ、また、他のＮ末端アミノ基が修飾された誘導体は本発明の範囲に属する。

その例として、前記インスリン分泌ペプチド誘導体は、エキセンディン−４のＮ−末端アミノ（またはアミン）基、またはアミノ酸残基が化学的に修飾された誘導体であることができる。具体的には、エキセンディン−４のＮ−末端ヒスチジン残基（最初のアミノ酸）のα炭素に存在するαアミノ基を置換または除去することによりエキセンディン−４誘導体が製造される。より具体的には、Ｎ−末端アミノ基を除去したデスアミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４（Desamino‐histidyl‐exendin-4、ＤＡ−エキセンディン−４）；Ｎ−末端アミノ基をヒドロキシル基で置換したβ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4、ＨＹ−エキセンディン−４）；Ｎ−末端アミノ基をカルボキシル基で置換したβ−カルボキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4、ＣＸ−エキセンディン−４）；Ｎ−末端アミノ基を２つのメチル残基で修飾したジメチル−ヒスチジル−エキセンディン−４（Dimethyl-histidyl-exendin-4、ＤＭ−エキセンディン−４）；またはＮ−末端ヒスチジン残基のα−炭素を除去したイミダゾアセチル−エキセンディン−４（Imidazoacetyl-exendin-4、ＣＡ−エキセンディン−４）などを含むことができる。インスリン分泌ペプチドに関する韓国公開特許第１０−２０１２−０１３５１２３号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１２−１６５９１５）または国際公開特許ＷＯ２０１４／１０７０３５に開示された内容も、本発明の範囲に含まれることは自明である。前記特許明細書の全内容は、本発明に対して参考文献として含まれる。

本発明における、「ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニスト」とは、天然型ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストであるオキシントモジュリンのようにＧＬＰ−１／グルカゴン二重作用活性を有するペプチドまたはその断片、前駆体、変異体、または誘導体を含む。本発明において前記ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストは、短い半減期を克服するための持続型の技術を適用したＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストであることができ、好ましくは、週１回投与し得る持続型ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストであるが、これに制限されない。

前記ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストは、オキシントモジュリンを含む。

前記「オキシントモジュリン」とは、グルカゴンの前駆体であるプレ−グルカゴン（pre-glucagon）から生産されたペプチドを意味する。本発明において、オキシントモジュリンは天然型オキシントモジュリン、その前駆体、誘導体、断片及び変異体などを含む。

前記オキシントモジュリンは、具体的にはＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡのアミノ酸配列（配列番号：５）を有することができるが、これに制限されない。

前記オキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリン配列の任意のアミノ酸を付加、欠失または置換により製造されたペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド模倣体を含み、ＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方を活性化させることができ、特に、天然型オキシントモジュリンにより活性化されたレベルより高レベルで各の受容体を活性化させることができる。

本発明におけるＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストの具体的な実施例を一部挙げれば、韓国公開特許第１０−２０１２−０１３７２７１号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１２−１６９７９８）、第１０−２０１２−０１３９５７９号（あるいは国際公開特許ＷＯ２０１２−１７３４２２）に記載されたＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニスト及びその誘導体とその持続型を含む。前記特許明細書全体は、本発明の参考資料として含まれる。

本発明において、前記生理活性タンパク質またはペプチドに結合されるキャリアは、生理活性タンパク質またはペプチドの生体内半減期を延長させることができる物質であり得る。

前記生理活性タンパク質またはペプチドの例として、生理活性タンパク質またはペプチドの腎クリアランス（renal clearance）を減少させることができる様々な物質、例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合物質、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位を有するポリマー、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内の結合組織またはその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、エラスチン類似ポリペプチド（elastin-like polypeptide、ELP）、ＸＴＥＮポリペプチド、カルボキシ末端ペプチド（carboxyl terminal peptide、CTP）、 構造誘導プローブ（structure inducing probe、SIP）、糖類、高分子ポリマー、特定のアミノ酸配列、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位を有するポリマーなどを含む。また、前記生理活性タンパク質またはペプチドとキャリアとの連結は、遺伝子組換え、及びイン・ビトロ連結を含むが、これらに限定されない。

前記キャリアは、生理活性タンパク質またはペプチドに共有結合的または非共有結合的に連結することができる。前術したＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ Ｆｃであり得る。

ポリエチレングリコールをキャリアとして使用する場合、位置特異的にポリエチレングリコールに結合させることができるＡｍｂｒｘ社のＲｅｃｏｄｅ技術を使用することができる。また、グリコシル化された部分に位置特異的に結合させることができるＮｅｏｓｅ社の糖ペグ化（glycopegylation）技術を使用することができる。また、生体内においてポリエチレングリコールがゆっくりと除去される放出可能なＰＥＧ技術を使用することができるが、これらに限定されない。また、本発明で使用することができる技術には、ＰＥＧを用いて生体内利用率を増加させる技術が含まれる。また、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸のような非ペプチド性ポリマーも、前記技術を用いて生理活性タンパク質またはペプチドに結合することができる。

アルブミンをキャリアとして使用する場合、本発明で用いることができる技術には、アルブミンあるいはアルブミンの断片を生理活性タンパク質またはペプチドに直接共有結合して生体内の安定性を向上させる技術が含まれることができる。アルブミンが直接結合していなくても、アルブミン結合物質、例えば、アルブミン特異的結合抗体あるいは抗体断片を生理活性タンパク質またはペプチドに結合させてアルブミンと結合させる技術を用いることができ、アルブミンに結合親和性を有する特定のペプチド／タンパク質を生理活性タンパク質またはペプチドに結合する技術を用いることができる。また、アルブミンに結合親和性を有する脂肪酸を生理活性タンパク質またはペプチドに結合させる技術を用いることができるが、これに限定されない。アルブミンを用いて生体内安定性を向上させる任意の技術または結合方法などがこれに含まれることができる。

生体内半減期を増加させるために、抗体または抗体断片をキャリアとして使用して生理活性タンパク質またはペプチドに結合させる技術も本発明に含まれることができる。ＦｃＲｎ結合部位を有する抗体または抗体断片を用いることができ、ＦａｂのようなＦｃＲｎ結合部位を含まない任意の抗体断片を使用し得る。触媒抗体を利用するＣｏｖＸ社のＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ技術がこれに含まれることができ、免疫グロブリンＦｃ領域を利用して生体内半減期を増加させる技術も本発明に含まれることができる。

免疫グロブリンＦｃ領域を利用する場合、Ｆｃ領域及び生理活性タンパク質またはペプチドと結合するリンカー及びその結合方法は、ペプチド結合あるいはポリエチレングリコールなどが含まれるが、これらに限定されず、如何なる化学的結合方法が用いられることができる。また、Ｆｃ領域とインスリンアナログの結合比は１：１または１：２であってもよいが、これに限定されない。

Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン不変領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして安全に使用することができる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が少ないため、複合体の生産、精製、及び生産収率の面において有利である。また、別の抗体由来のアミノ酸配列の相違による高い不均一性を示すＦａｂを欠いているので、前記免疫グロブリンＦｃ領域単独で著しく向上した均一性を有する複合体を提供し、血液抗原性を誘導する可能性も減少する。

また、前述したＰＥＧは、目的ペプチドの特定の部位または様々な部位に非特異的に結合してペプチドの分子量を増加させる。そのため、前記ＰＥＧは腎クリアランスを抑制し、加水分解を防止するのに効率的であり、特別な副作用も引き起こさない。また、外来ペプチドにＰＥＧが結合すると、免疫細胞により外来ペプチドに存在する抗原部位の認識を阻害することができる。具体的には、前記ＰＥＧは、ペプチドが抗原提示細胞により貪食され、タンパク質分解されるのを阻害することができ、ペプチドが抗原として作用する可能性を低下させることができる。特に、外来タンパク質が抗原としてＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を刺激するためには、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩに結合する形態の約１４〜２４個の短いペプチドを抗原提示細胞の表面に提示されなければならない。これはＰＥＧの結合部位に応じて適切な大きさに分解される過程で抑制することができる。

本発明の一実施形態では、前記キャリアと前記生理活性タンパク質またはペプチドが、リンカー、具体的には、非ペプチド性リンカーを介して連結される。

本発明において、前記非ペプチド性リンカーは、２つ以上の繰り返し単位を含んでいる生体適合性ポリマーを意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合によって互いに結合している。前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性ポリマーと混合して使用することができる。

本発明で使用可能な非ペプチジルリンカーは、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸、及びそれらの組み合わせから構成される群から選択されてもよい。本発明で使用される前記生分解性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）またはＰＬＧＡ（ポリラクチク−グリコール酸、polylactic-glycolic acid）であり得る。本発明の一つの具体的な実施形態において、前記非ペプチジルポリマーは、ポリエチレングリコールである。また、当該技術分野において公知の誘導体や、当該分野で公知の方法により容易に調製される誘導体も本発明の範囲に含まれる。

既存のインフレームフュージョン（inframe fusion）方法により得られた融合タンパク質で使用されたペプチドリンカーは、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血清半減期が延長される効果を期待だけ得ることができないという欠点がある。しかし、本発明の非ペプチド性ポリマーは、ペプチド結合を有していない物質であるため、基本的に、タンパク質分解酵素に対する耐性を有し、ペプチドの血清半減期を長くすることができる。本発明で使用することができる非ペプチド性ポリマーの分子量の範囲は具体的には、１〜１００ｋＤａ、より具体的には、１〜２０ｋＤａである。本発明の前記免疫グロブリンＦｃ領域に結合される非ペプチド性ポリマーは、一種類のポリマーまたは、異なる種類のポリマーの組み合わせであり得るが使用されることもできる。

本発明において、前記キャリアは生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基に結合されることを特徴とする。この場合、上述したように、前記キャリアは、リンカーを介して生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基に結合することができる。

生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基は、生理活性タンパク質またはペプチドにキャリアが結合した場合、キャリアが結合していないタンパク質またはペプチド、またはタンパク質またはペプチドの末端にキャリアが結合したタンパク質またはペプチドに比べて、その免疫原性が減少する残基であれば、制限なく含む。

前記生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部アミノ酸は、リジン、システインなどがあり得る。

より具体的には、前記生理活性タンパク質またはペプチドが、インスリン分泌ペプチド、特にエキセンディン−４またはエキセンディン−４の誘導体である場合、その内部残基は、１２番目または２７番目のリジン残基であってもよいが、これに限定されない。

また、非ペプチジルポリマーとしてアルデヒドリンカーを使用する場合、Ｎ−末端はリジン残基のアミン基と反応し、インスリン分泌ペプチドの修飾型を使用して反応収率を改善することができる。例えば、Ｎ−末端をブロッキングする方法、リジン残基を置換する方法、アミン基を導入する方法を用いて目的の位置に反応性アミン基を維持することができ、さらにペグ化及びカップリング収率を向上させることができる。

本発明の好ましい実施態様では、本発明のインスリン分泌ペプチドの非末端内部残基にキャリアが結合されたインスリン分泌ペプチド結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域がインスリン分泌ペプチドのＮ−末端以外のアミン基に特異的に結合したインスリン分泌ペプチド結合体を意味する。

具体的な一実施形態として、本発明者は、インスリン分泌ペプチドのリジン残基にＰＥＧを選択的に結合される方法において、天然型エキセンディン−４にＰＥＧを結合させる場合、ｐＨ９．０で反応させてリジン残基へのペグ化反応を誘導する反面、他の方法においては、Ｎ−末端の除去または保護された形態のエキセンディン−４誘導体にＰＥＧを結合させる場合、ｐＨ７．５で反応させてリジン残基へのペグ化反応を誘導する。結果として、Ｎ−末端結合とは反対に、リジン残基に結合すると、エクス・ビボＴ細胞活性が顕著に抑制されることを確認することができた（表２〜４）。

また、本発明で使用される用語、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）、重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び軽鎖不変領域（ＣＬ１）を意味し、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分をさらに含んでもよい。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型タンパク質と実質的に同等または向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域を除いて、重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含むＦｃ領域の一部または全体を含むことができる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２及び／またはＣＨ３のアミノ酸配列の比較的に長い部分が除去されている断片であり得る。即ち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、及び６）重鎖不変領域及び軽鎖不変領域の各ドメインの二量体から構成されることができる。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（変異体）を含む。アミノ酸配列誘導体は、天然アミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより異なる配列を有する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番位置のアミノ酸残基は修飾に適切な標的として用いてもよい。また、ジスルフィド結合を形成することができる領域が除去されるか、または天然型Ｆｃ形態のＮ−末端であるアミノ酸残基が除去されるが、またはそこに メチオニン残基が付加されるものが含まれたなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されることもでき、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されることもできる。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際公開特許第ＷＯ ９７／３４６３１号、国際公開特許第ＷＯ ９６／３２４７８号などに開示されている。

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている（H.Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈr／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。

場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、及びアミド化（amidation）などで修飾されることができる。

前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一な生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。

また、このようなＦｃ領域は、ヒト及び牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットピックなどの動物の生体内から分離した天然型から得られることができ、または形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であることができる。ここで、天然型から得る方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを利用してＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。

具体的には、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え型の免疫グロブリンＦｃ領域である。

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であることができる。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法と微生物を利用した遺伝子工学的方法のような一般的な方法を用いることができる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発してない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により符合する形態は、糖鎖が除去されたり非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言える。

本発明において糖鎖の除去（Deglycosylation）は、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、具体的には、大腸菌で生産して糖鎖化されていないＦｃ領域を意味する。

一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットピックなどの動物起源であることができ、具体的には、ヒト起源である。

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であることができる。具体的には、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、より具体的には、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となっているＩｇＧ由来であるが、これに制限されない。

一方、本発明に使用される用語、「組み合わせ（combination）」とは、同じ起源の一本鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の一本鎖ポリペプチドに結合して二量体または多量体を形成することを意味する。すなわち、二量体または多量体は、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃ断片からなる群から選択される２つ以上の断片から形成され得る。

本発明において前記用語、「ハイブリッド（hybrid）」とは、一本鎖免疫グロブリンＦｃ領域に少なくとも２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に相応する配列が存在することを意味する。本発明において、様々な形態のハイブリッドが可能である。即ち、前記ハイブリッドはＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなる群から選択された１〜４つのドメインに構成され、ヒンジを含むことができる。一方、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせまたは混成化も可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も具体的には補体依存毒性（Complementdependent cytotoxicity、 CDC）のようなエフェクター機能（effector function）をほとんど有していないＩｇＧ４のＦｃ領域である。

したがって、本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、例えば、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化Ｆｃ領域であることができるが、これに限定されない。ヒト由来のＦｃ領域は、例えば、体内の抗原として作用して新しい抗体を産生することができ、望ましくない免疫反応を引き起こすことができる非ヒト由来のＦｃ領域に比較して好ましい。

本発明の具体的な実施形態に使用される非ペプチジルポリマーは、免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性タンパク質またはペプチドに結合することができる反応基を有する。さらに具体的な実施形態において、この反応基は、両末端に位置する。前記非ペプチジルポリマーの両末端反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）及びスクシンイミド（succinimide）誘導体からなる群から選択されることが望ましい。前記において、スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオネート（succinimidyl propionate）、ヒドロキシスクシンイミジル（hydroxy succinimidyl）、スクシンイミジルカルボキシ（succinimidyl carboxymethyl）またはスクシンイミジルカーボネート（succinimidyl carbonate）であり得る。。特に、前記非ペプチジルポリマーが両末端に反応性アルデヒド基の反応基を有する場合、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとの両末端を最小限の非特異的反応で連結することは有効である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりもはるかに安定である。アルデヒド反応基は、低いｐＨでＮ−末端で選択的に反応し、高いｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件では、リジン残基と共有結合を形成する。

前記非ペプチジルポリマーの両末端反応基は、互いに同一または異ってもよい。

例えば、前記非ペプチジルポリマーは一方の末端にはマレイミド基、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を有することができる。両方の末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチジルポリマーとして利用する場合には、前記ヒドロキシ基は公知の化学反応により多様な反応基で活性化したり、または市販の変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の生理活性タンパク質またはペプチド結合体、具体的にはインスリン分泌ペプチド結合体を製造することができる。

本発明のインスリン分泌ペプチド結合体は、インスリンの合成及び分泌促進、食欲抑制、体重減少、ベータ細胞血中グルコース敏感度の増加、ベータ細胞増殖（beta cell proliferation）の促進、胃排出遅延（gastric emptying delay）、グルカゴン抑制のような従来のインスリン分泌ペプチドの生体内の活性が維持されるだけでなく、インスリン分泌ペプチドの血中半減期及びこれによる前記ペプチドの生体内効力持続効果が画期的に増加することになる。そのため、このようなインスリン分泌ペプチドは糖尿病、肥満、急性冠症候群（Acute coronary syndrome）または多嚢胞性卵巣症候群（Polycystic ovary syndrome）の治療に有用である。

もう一つの態様として、本発明は生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基にキャリアが非ペプチジルリンカーを介して結合された、生理活性タンパク質またはペプチド結合体を含む組成物を提供し、前記結合体はキャリアが結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドに比べて減少された免疫原性を示す。

具体的には、前術した結合体は、持続性製剤の副作用である、免疫原性を減少させることを特徴とする。

また、前記非ペプチジルリンカーは、ポリエチレングリコールであることができる。

前記生理活性タンパク質またはペプチド、リンカー、結合体は前記で説明した通りである。

本発明のまた他の態様として、本発明は、生理活性タンパク質またはペプチド結合体の製造方法を提供する。

具体的には、本発明は、
（１）両末端にアルデヒド、マレイミド、またはスクシンイミド反応基を有する非ペプチジルポリマーを生理活性タンパク質またはペプチドのアミンまたはチオール基に共有結合させる工程；
（２）生理活性タンパク質またはペプチドのＮ−末端以外の位置を介して非ペプチジルポリマーに共有結合した生理活性タンパク質またはペプチドペプチドを前記（１）の反応混合物から分離する工程；及び
（３）生理活性タンパク質またはペプチドに共有結合した非ペプチジルポリマーの他の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合させて、非ペプチジルポリマーの両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性タンパク質またはペプチドと結合した工程を含む、生理活性タンパク質またはペプチド結合体を製造する方法を提供する。

好ましい一態様として、本発明は、
（１）両末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチジルポリマーを生理活性タンパク質またはペプチドのリジン残基に共有結合させる工程；
（２）生理活性タンパク質またはペプチドのりジン残基を介して非ペプチジルポリマーに共有結合した生理活性タンパク質またはペプチドペプチドを前記（１）の反応混合物から分離する工程；及び（３） 生理活性タンパク質またはペプチドに共有結合した非ペプチジルポリマーの他の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合させて、非ペプチジルポリマーの両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性タンパク質またはペプチドと結合した工程を含む、生理活性タンパク質またはペプチド結合体を製造する方法を提供する。より具体的には、（１）工程の非ペプチジルポリマー及び生理活性タンパク質またはペプチドであるインスリン分泌ペプチドのリジン残基は、ｐＨ ７．５以上で結合することができる。

以下、下記実施例により本発明をより詳しく説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

＜実施例１＞：エキセンディン−４のペグ化（Pegylation）及びペグ化されたエキセンディン−４の位置異性体分離
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２個有している分子量３．４ｋＤａのＰＥＧ、ＩＤＢ Ｉｎｃ．、韓国）を天然型エキセンディン−４（米国のAmerican Peptides）のＮ−末端にペグ化させるため、３ｍｇ／ｍｌ濃度のペプチドとＰＥＧとのモル比を１：１５にして４℃で９０分間反応させた。この時の反応は、１００ｍＭ濃度のＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）内で行われ、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ₃）を添加して反応された。

また、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧをエキセンディン−４のリジン（Ｌｙｓ）残基にペグ化させるため、３ｍｇ／ｍｌ濃度のペプチドとＰＥＧとのモル比を１：３０にして４℃で３時間反応させた。この時の反応は、１００ｍＭ濃度のＮａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）内で行われ、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢを添加して反応させた。前記反応液は、ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）を通じて一次的にモノ−ペグ化された（Mono-pegylated）ペプチドを精製し、ＳＯＵＲＣＥＳ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）を通じて異性体を分離した。Ｎ−末端がペグ化されたピーク（N-term pegylatedピーク）が最も前方に出てきて、その後に順に２個のリジンがペグ化されたピーク（Lys Pegylatedピーク）が出ることが分かった。溶出されたピークは、ペプチドマッピング（mapping）方法でペグ化された位置を確認することができた。

Ｌｙｓ１２ペグ化された結合体が先に溶出され、Ｌｙｓ２７ペグ化された結合体は最も後ろで溶出された。Ｎ−末端の位置異性体とＬｙｓ１２位置異性体との間に完全なピーク分離が可能であった。

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）５８−２７流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→４０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ８．５、Ｂ：Ａ ＋ ０．５Ｍ ＮａＣｌ）

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭクエン酸ｐＨ３．０、Ｂ：Ａ ＋ ０．５Ｍ ＫＣｌ）

＜実施例２＞：ＣＡエキセンディン−４リジン残基のペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）と位置異性体分離
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧをＣＡエキセンディン−４（米国のAmerican Peptides）のリジン（Ｌｙｓ）残基にペグ化させるため、３ｍｇ／ｍｌ濃度のＣＡエキセンディン−４とＰＥＧとのモル比を１：３０にして、４℃で３時間反応させた。ＣＡエキセンディン−４は、天然型エキセンディンのＮ−末端ヒスチジン残基でアルファ炭素が削除され、側鎖のβ−炭素が直接カルボキシル炭素に結合したＮ−末端変形エキセンディン−４である。この時の反応は、１００ｍＭ濃度のＮａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）内で行われ、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢを添加して反応させた。前記反応液は、ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）を通じて一次的にモノ−ペグ化された（Mono-pegylated）ペプチドを精製し、ＳＯＵＲＣＥＳ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）を通じて異性体を分離した。

２個のリジンがペグ化されたピーク（Lys Pegylatedピーク）が出ることが分かった。
溶出されたピークは、ペプチドマッピング（mapping）方法でペグ化された位置を確認することができた。

Ｌｙｓ１２ペグ化された結合体が先に溶出され、Ｌｙｓ２７ペグ化された結合体は、最も後ろで溶出され、Ｎ−末端の位置異性体とＬｙｓ１２位置異性体との間に完全なピーク分離が可能であった。

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→４０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ８．５、Ｂ：Ａ ＋ ０．５Ｍ ＮａＣｌ）

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＸＫ １６ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭクエン酸ｐＨ３．０、Ｂ：Ａ ＋ ０．５Ｍ ＫＣｌ）

＜実施例３＞：イミダゾ−アセチル（Imidazo-acetyl）エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
イミダゾ−アセチルエキセンディン−４（ＣＡエキセンディン−４、ＡＰ、米国）を用いて実施例２と同様の方法で３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧをＣＡエキセンディン−４のＬｙｓと反応させた。その後、二つのＬｙｓ異性体ピークのうち、主な反応性が示され、かつ、Ｎ−末端異性体と明確に区分されている最も後方の異性体ピーク（Ｌｙｓ２７位置異性体）を用いてカップリング反応を行った。前記ペプチドと前記免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８、全体タンパク質濃度を６０ｍｇ／ｍｌとし、４℃で２０時間反応させた。反応は１００ｍＭ Ｋ−Ｐ（ｐＨ６．０）及び還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢを添加した溶液で行った。前記カップリング反応の後、ＳＯＵＲＣＥ Ｑ １６ｍｌ及びＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ １６ｍｌを用いた２工程の精製は実施例２と同様で行った。ＨＰＬＣ逆相分析の結果、純度９５．８％を示した。

＜実施例４＞：エクス・ビボ（ex vivo）試験のためのヒト末梢血単核細胞（PBMC）の分離及びドナーの選別
ヒト末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells、PBMC）は、健康なドナーから採取した血液から２４時間以内に分離した。供与血液はＵＫ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Addenbrooke Hospital、Cambridge、UK）から提供された。末梢血単核細胞は、 Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ^TM（Axis-shield、Dundee、Scotland）を用いた密度勾配遠心分離法により得られた白血球層（buffy coat）から分離した。このうち、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ^TM（StemCell Technologies Inc、London、UK）を用いて除去された。各ドナーの末梢血単核細胞は、使用前まで液体窒素中に保管した。ドナーの細胞は、ＨＬＡ ＳＳＰ−ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（Biotest、Solihull、UK）を用いてＨＬＡ−ＤＲ半数体遺伝子型（haplotype）を鑑別した。Ｔ細胞の反応性は、インフルエンザＡ及びエプスタイン・バール・ウイルス（Epstein Barr virus）由来の抗原ペプチドであるＫＬＨ（Keyhole Limpet Haemocyanin、Pierce（Perbio）、Northumberland、UK）を用いて試験した。世界人口のＨＬＡ−ＤＲタイプの頻度を代表する５０人のドナーを選別して１つのコホート（cohort）で構成した。コホートを構成する各ドナーのＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ半数体遺伝子型とＴ細胞の反応性を表１に示し、ドナーの遺伝子型の頻度を世界の人口の頻度との比較結果を図１に示した。下記表１は、ドナー別のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型及び抗原ペプチドＫＬＨに対するＴ細胞の反応性を示したものである。

上記表１のボールドで表示された欄（ドナー１７、１８、２７、３０、及び５０）は、供与細胞の解凍前後のＫＬＨに対する反応性が有意に差を示したものである。

＜実施例５＞：ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ^TM エクス・ビボ（ex vivo) T細胞増殖試験
代表的な生理活性タンパク質またはペプチドであるインスリン分泌ペプチドのペグ化位置に応じた免疫原性抑制メカニズムを確認するために、非結合天然型エキセンディン−４、非結合ＣＡエキセンディン−４、ＣＡエキセンディン−４のリジン残基にペグ化された連結体ペプチド（ＣＡエキセンディン−４−ＰＥＧ（ｉｎｔｅｒ））及び天然型エキセンディン−４のＮ−末端にペグ化された連結体ペプチド（エキセンディン−４−ＰＥＧ（Ｎ−ｔｅｒｍ））のＴ細胞増殖能を比較した。この時、ＣＡエキセンディン−４はペグ化することができるＮ−末端残基を有していないため、ＣＡエキセンディン−４に対してはＮ−末端ペグ化連結体を製造していなかった。

Ｔ細胞の増殖試験のために、前記ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍して細胞数と生存率を測定した。細胞は、ＡＩＭ−Ｖ培地で４−６ｘ１０⁶細胞／ｍｌになるように希釈した。各ドナー細胞を２４ウェル培養プレートに分注した後、試験試料を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添加した（ｎ＝３）。各ドナー細胞に対する再現性の確認のために抗原ペプチドＫＬＨ処理群を準備して置いた。すべての試験群と対照群は、３７℃、５％ＣＯ₂の条件の培養器で８日間培養した。５、６、７、８日目にそれぞれ細胞の一部を取って、９６ウェルの培養プレートに移して細胞増殖率を測定した。細胞増殖率の測定のためにウェル当り０．７５μｉ［³Ｈ］−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Perkin Elmer Buckinghamshire、UK）を添加して１８時間培養した後、ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩ細胞回収器を利用して９６ウェルのフィルタープレートに細胞を回収した。各ウェルの放射線活性度（cpm、count per minute）は１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Perkin Elmer Buckinghamshire、UK）を用いて測定した。その結果、刺激指標（SI、stimulation index）の実験的閾値に基づいて２以上（ＳＩ≧２、ｐ ＜０．０５）の場合を陽性（Ｐ）と判定した。ＳＩ≧１．９に該当する境界値を含む場合には、別途表示（Ｐ＊）した。その結果、ＣＡエキセンディン−４及びエキセンディン−４に対してそれぞれ１２％及び１０％のドナーから陽性反応を確認した。しかし、前記ペプチドの内部残基にペグ化されたＣＡエキセンディン−４は、すべてのドナーから陰性と確認された。一方、Ｎ−末端にペグ化されたエキセンディン−４は、６％のドナーで陽性を示した。従って、Ｎ−末端よりペプチドの内部リジン残基にペグ化された場合、前記ペプチドの免疫原性は顕著に阻害される（表２）。表２は、Ｔ細胞の増殖及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を示す。

表３は、Ｔ細胞の増殖反応強度及び頻度（ＳＩ≧１．９境界値を含む）を示す。

上記のような結果は、生理活性タンパク質またはペプチドの末端ではなく、内部残基に非ペプチド性ポリマー、特にPEGを連結した連結体の免疫原性が阻害されることを示唆するものである。

＜実施例６＞： ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ^TM エクス・ビボ（ex vivo) インターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌試験
代表的な生理活性タンパク質またはペプチドであるインスリン分泌ペプチドのペグ化位置に応じた免疫原性抑制メカニズムを確認するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ^TM Ｔ細胞の増殖アッセイでの同じ試料及びドナー細胞を用いて、実施例５のペグ化されたエキセンディン−４及び非結合エキセンディン−４に対してインターロイキン−２分泌能を比較測定した。抗インターロイキン−２抗体（R＆D Systems、Abingdon、UK）はＥＬＩＳｐｏｔプレート（Millipore、Herts、UK）に結合させた。前記プレートをＰＢＳ（phosphate-buffered saline）で３回洗浄した後、１％の牛血清アルブミンが補充されたＰＢＳを添加して反応させた。ＡＩＭ−Ｖ培養培地で洗浄した後、ＡＩＭ−Ｖ培養培地で希釈（４−６ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）したドナー細胞を１００μｌ／ウェルずつ分注した。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように試験試料を５０μｌずつ添加した（ｎ＝６）。８日間培養した後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートにビオチン標識されたインターロイキン−２検出抗体とストレプトアビジン−ＡＰ（R＆D Systems、Abingdon、UK）を順次的に結合させた後、スポットを表現するためにＢＣＩＰ／ＮＢＴ（（R＆D Systems、Abingdon、UK）をプレートに添加した。蒸留水で洗浄して前記反応を終了させた後、プレートを乾燥させた。Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用し、ウェル当り生成されたスポット（spw、spots per well）をスキャンして分析した。前記エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞活性度の測定試験の結果は、刺激指標（SI、stimulation index）の実験的閾値に基づいて、２以上（ＳＩ≧２、ｐ＜０．０５）の場合を陽性（Ｅ）と判定した。ＳＩ≧１．９に該当する境界値を含む場合には、別途表示（Ｅ＊）した。その結果、ＣＡエキセンディン−４及びエキセンディン−４に対してそれぞれ１２％及び１６％のドナーからの陽性反応が確認された。しかし、ペプチド内部残基にペグ化されたＣＡエキセンディン−４は、ドナーから２％のみであった。一方、Ｎ−末端にペグ化されたエキセンディン−４は、６％のドナーで陽性を示した。即ち、Ｎ−末端よりペプチドの内部リジン残基にペグ化された場合、前記ペプチドの免疫原性は顕著に阻害された（表２〜４）。表４は、Ｔ細胞のインターロイキン−２の分泌反応の強度及び頻度（ＳＩ≧１．９境界値を含む）を示す。

上記のような結果は、生理活性タンパク質またはペプチドの末端ではなく、内部残基に非ペプチド性ポリマー、特にＰＥＧを連結した連結体の免疫原性が阻害されることを示唆するものである。

＜実施例７＞：正常ラットにおける持続性インスリン分泌ペプチドに対する抗体生成試験 実施例３で製造したＣＡエキセンディン−４をＰＥＧを介して免疫グロブリンＦｃ断片に連結させた結合体を、正常のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに週１回、２６週間皮下投与し、その後、４週間を回復期間にした（ｎ＝４０〜６０／群）。投与前と、投与中の１３、１９、２６週目、回復期間終了時点でそれぞれ採血して血清を分離し、そこからインスリン分泌ペプチドに対する抗体の生成有無を測定した。

その結果、薬物が投与された１６０の個体中、ただ二匹のみから１３週目、回復期間後に、それぞれ抗体が検出された。しかし、この抗体は、薬物に対する中和抗体ではないことが確認された（表５）。表５は、ラット（ＳＤ Ｒａｔ）における２６週間投与による抗体の生成を示す。

＜実施例８＞：カニクイザル（Cynomolgus monkey）における持続性インスリン分泌ペプチドに対する抗体生成試験
実施例３で製造したＰＥＧを介してＣＡエキセンディン−４を免疫グロブリンＦｃ断片に結合させた結合体を、カニクイザル（Cynomolgus monkey）に週１回、２６週間皮下投与し、その後４週間回復期間にした（ｎ＝８〜１２／群）。投与前と、投与中の１２、１９、２６週目及び回復期間終了時点でそれぞれ採血して血清を分離し、そこからインスリン分泌ペプチドに対する抗体の生成有無を測定した。その結果、すべての個体で抗体の生成は観察されなかった（表６）。表６は、カニクイザル（Cynomolgus monkey）における２６週間投与による抗体の生成を示す。

＜実施例９＞：血中抗薬物抗体の検出及び中和能の評価試験
実施例３の結合体がラットまたはカニクイザルの体内で抗薬物抗体（anti-drug antibody、ADA）を生成したかを検出するために、ｂｒｉｄｇｉｎｇ ＥＬＩＳＡ法で調査した。ストレプトアビジン（streptavidin）が底部に結合された９６ウェルマイクロプレートにビオチン化した実施例３の結合体を結合させた後、水で洗浄した。ジゴキシゲニン（digoxigenin、dig）-標識された実施例３の結合体（以下、HM11260C）をラットまたはサルの血清試料と共に添加して反応させた後、水で洗浄した。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合された抗ｄｉｇ抗体（anti-DIG-POD antibody）を添加してＴＭＢ基質（3,3'、5,5'-Tetramethylbenzidine substrate）により発色した。ラット血清における測定感度は、３．１ｎｇ／ｍｌ、サル血清における測定感度は１２．５ｎｇ／ｍｌであった。検出された抗ＨＭ１１２６０Ｃ抗体のＨＭ１１２６０Ｃに対する中和能を評価するために、ヒトＧＬＰ−１受容体を過発現させた細胞株（GLP-1R/CHO）に血清試料とＨＭ１１２６０Ｃを共に添加し、ｃＡＭＰ誘導能に対する抑制率を測定した。抗体は１６０匹のうちただ二匹で生成され、中和能がないことが確認した。

前記のような結果は、生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性は生理活性タンパク質またはペプチドの末端以外の内部残基に非ペプチジルリンカー及びＦｃ断片を結合させることにより低下し、そのため、目的のペプチドが抗原として作用するメカニズムを阻害する。前記結果は、前術した製造方法を使用する場合、動物におけるＴ細胞の活性化及び抗体産生反応が顕著に抑制されることを裏付けている。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (16)

1. 生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基にキャリアを結合させる工程を含む、キャリアが結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドに比べて生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を減少させる方法。
2. 前記キャリアは、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合物質、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位を有するポリマー、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内の結合組織またはその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＸＴＥＮポリペプチド、カルボキシ末端ペプチド（carboxyl terminal peptide、CTP）、ＳＩＰ（structure inducing probe）、糖類（saccharide）、及び高分子ポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記生理活性タンパク質またはペプチド及びキャリアは、その間に介在するリンカーを通じて結合される、請求項１に記載の方法。
5. 前記リンカーは、非ペプチド性リンカーである、請求項３に記載の方法。
6. 前記非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
7. 前記生理活性タンパク質またはペプチドが、免疫グロブリンＦｃ領域と、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性ポリマーを通じて連結される、請求項４に記載の方法。
8. 前記生理活性タンパク質またはペプチドが抗肥満ペプチド、インスリン分泌ペプチドまたはそのアナログ、レプチン、インスリン、インスリンアナログ、グルカゴン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、ＧＬＰ−１のようなグルカゴン−様ペプチド、ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニスト、ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）、Ｇタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptor）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リムポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモデュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、レラキシン、シクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記生理活性タンパク質またはペプチドは、エキセンディン−４、エキセンディン−４の誘導体、ＧＬＰ−１アゴニスト、インスリン及びＧＬＰ−１／グルカゴンの二重アゴニストからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記エキセンディン−４の誘導体は、エキセンディン−４のＮ−末端アミン基が除去された、エキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端アミン基がヒドロキシル基で置換されたエキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端アミン基がカルボキシル基で置換された、エキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端アミン基がジメチル基で修飾された、エキセンディン−４誘導体；エキセンディン−４のＮ−末端ヒスチジン残基のアルファ炭素が除去された、エキセンディン−４誘導体からなる群から選択される、エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４誘導体である、請求項９に記載の方法。
11. 前記内部残基は、エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４誘導体の１２番目または２７番目のリジン残基である、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記内部残基は、エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４誘導体の２７番目のリジン残基である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記エキセンディン−４のＮ−末端電荷が修飾されたエキセンディン−４誘導体は、エキセンディン−４のＮ−末端ヒスチジン残基のアルファ炭素が除去された、エキセンディン−４誘導体である、請求項１１に記載の方法。
14. 生理活性タンパク質またはペプチドの非末端の内部残基に、キャリアが非ペプチド性リンカーを通じて結合された、生理活性タンパク質またはペプチドの結合体を含む組成物であって、前記結合体は、キャリアが結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドに比べて減少された免疫原性を示す組成物。
15. 前記結合体は、持続性製剤の副作用である免疫原性を減少させることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコールである、請求項１４に記載の組成物。