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JP2021097675A - 中枢神経系を標的化したａａｖベクター - Google Patents

中枢神経系を標的化したａａｖベクター Download PDF

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JP2021097675A
JP2021097675A JP2021019477A JP2021019477A JP2021097675A JP 2021097675 A JP2021097675 A JP 2021097675A JP 2021019477 A JP2021019477 A JP 2021019477A JP 2021019477 A JP2021019477 A JP 2021019477A JP 2021097675 A JP2021097675 A JP 2021097675A
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aav capsid
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スティーブン グレイ
Gray Steven
スティーブン グレイ
トーマス マカウン
Mccown Thomas
トーマス マカウン
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University of North Carolina at Chapel Hill
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Abstract

【課題】中枢神経系を標的化したキメラＡＡＶキャプシド、それを含むウイルスベクター、及び、中枢神経系を標的化するためのベクターの使用方法を提供する。【解決手段】ＡＡＶキャプシドをコードする核酸であって、特定のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一である、ＡＡＶキャプシドコード配列を含む核酸、を提供する。【選択図】なし

Description

［優先権の記載］
本出願は、２０１４年１１月２１日に出願された米国仮出願番号６２／０８２，８９７および２０１５年９月１５日に出願された米国仮出願番号６２／２１８，８５７の利益を主張し、それらのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、中枢神経系を標的化したキメラＡＡＶキャプシド、それを含むウイルスベクター、および、中枢神経系を標的化するためのベクターの使用方法に関する。本発明は、さらに、オリゴデンドロサイトを標的化したキメラＡＡＶキャプシド、それを含むウイルスベクター、および、オリゴデンドロサイトを標的化するためのベクターの使用方法に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、１０年以上前に、筋肉に効率的に形質導入することが最初に報告された（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０９８−８１０８）。外来の発現カセットおよびＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列からなる組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、持続的な導入遺伝子発現を担うエピソーム形態で真核生物細胞内に存在する（Ｓｃｈｎｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３４９５−３５０４）。ＡＡＶベクターは、良好な安全プロファイルを有する。野生型ＡＡＶ感染と関連しているヒト疾患は存在せず、ｒＡＡＶによる形質導入後に低い毒性がヒト対象において観察される（Ｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：２９６３−２９７２）。
ＡＡＶベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関する臨床試験において用いられている。いくらかの成功が集められているが、天然起源ＡＡＶキャプシドは、ＣＮＳに関する特異性を欠き、特定の疾患適用に不適切である。ＡＡＶ技術および定向進化における最近の進歩は、変更された向性を有するベクターを含む、新規のＡＡＶ血清型を開発する能力を拡張している（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：５７０−５７８）。しかしながら、末梢臓器に関して最小限の向性で、広範なＣＮＳ遺伝子導入を可能にしているＡＡＶベクターは存在しない。
脳では、ＡＡＶベクターの大多数は、オリゴデンドロサイトのような他の細胞型に関して非常に低い有効性で、ニューロンに優勢選択性を示す。オリゴデンドロサイトを効率的に標的化するＡＡＶベクターは、開発されていない。
本発明は、末梢臓器に関して最小限の向性で、ＣＮＳへの送達後に広範なＣＮＳ遺伝子導入が可能であるキメラＡＡＶキャプシド配列の開発に一部基づく。本発明は、さらに、レット症候群を有する対象において高い形質導入能を有するキメラＡＡＶキャプシドに関する。キメラキャプシドを用いて、末梢臓器へ広範囲にベクター生体内分布せずに広範なＣＮＳ遺伝子導入が所望である、研究または治療的適用における使用のためのＡＡＶベクターを作製することができる。
本発明はさらに、末梢臓器に関して最小限の向性で、ＣＮＳへの送達後にオリゴデンドロサイト選択的または特異的な遺伝子導入が可能であるキメラＡＡＶキャプシド配列の開発に一部基づく。キメラキャプシドを用いて、ニューロンまたは末梢臓器へ広範囲にベクター生体内分布せずにオリゴデンドロサイト遺伝子導入が所望である、研究または治療的適用における使用のためのＡＡＶベクターを作製することができる。
したがって、本発明の一態様は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は：（ａ）配列番号１〜４３のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号４４〜８６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含む、ならびに、当該核酸を含むウイルス粒子および細胞に関する。
したがって、本発明の一態様は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は：（ａ）配列番号８７〜１０７のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号１０８〜１２８のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含む、ならびに、当該核酸を含むウイルス粒子および細胞に関する。
本発明の別態様は、配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシド、ならびに、本発明のＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子に関する。
本発明の別態様は、配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシド、ならびに、本発明のＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子に関する。
本発明のさらなる態様は、ＡＡＶキャプシドを含む組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法に関し、当該方法は：本発明の核酸、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列、異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、および生産的ＡＡＶ感染を生じさせるためのヘルパー機能を、インビトロで細胞に提供するステップ；および、ＡＡＶキャプシドを含んでＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する組み換えＡＡＶ粒子の集合を可能にするステップ、を含む。
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、ウイルス粒子、ＡＡＶキャプシド、またはＡＡＶ粒子を、薬学的に許容できる担体内に含む、医薬製剤に関する。
本発明の別態様は、目的の核酸を、ＣＮＳ細胞に送達する方法に関し、当該方法は、細胞を本発明のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象において、目的の核酸をＣＮＳ細胞に送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に静脈内投与するステップを含む。
本発明の別態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、ＣＮＳ機能障害と関連する障害を治療する方法に関し、前記方法は、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明の別態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、レット症候群を治療する方法に関し、当該方法は、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、目的の向性プロファイルを有するＡＡＶキャプシドを調製する方法に関し、当該方法は、目的の向性プロファイルを与えるアミノ酸配列を挿入するために本発明のＡＡＶキャプシドを改変するステップを含む。
本発明の一態様は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は：（ａ）配列番号１２９のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号１３０〜１３２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含む、ならびに、当該核酸を含むウイルス粒子および細胞に関する。
本発明の別態様は、配列番号１３０〜１３２のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシド、ならびに、本発明のＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子に関する。
本発明の別態様は、目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法に関し、当該方法は、細胞を本発明のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象において、目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明の別態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害を治療する方法に関し、当該方法は、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、Ｅ５３２Ｋ置換を含むＡＡＶ８キャプシドをコードする核酸、ならびに、当該核酸を含むウイルス粒子および細胞に関する。
本発明の別態様は、Ｅ５３２Ｋ置換を含むＡＡＶ８キャプシド、ならびに、本発明のＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子に関する。
本発明の別態様は、目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法に関し、当該方法は、細胞を本発明のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象において、目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明の別態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害を治療する方法に関し、当該方法は、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
野生型マウスの脊髄から単離されたＡＡＶキャプシドクローンのキメラ構造を示す。 野生型マウスの脳から単離されたＡＡＶキャプシドクローンのキメラ構造を示す。 レット症候群マウスから単離されたＡＡＶキャプシドクローンのキメラ構造を示す。 単離されたクローンの向性を示す。 単離されたクローンの向性を示す。 単離されたクローンの向性を示す。 単離されたクローンの形質導入効率を示す。 単離されたクローンのＭｅＣＰ２向性を示す。 単離されたクローンのＮｅｕＮ向性を示す。 Ｏｌｉｇ００１がオリゴデンドロサイト選択的な向性を有することを示す。（Ａ）ＡＡＶ８と比較した、Ｏｌｉｇ００１由来のｃａｐ遺伝子のダイアグラム。異なる色は、ライブラリーのインプット反応（ｉｎｐｕｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）内に存在する、異なるＡＡＶ親血清型（青＝ＡＡＶ２、紫＝ＡＡＶ８、赤＝ＡＡＶ９、黄＝ＡＡＶ１、および橙＝ＡＡＶ６）を表わす。黒の縦棒は、点突然変異を示す。（Ｂ）線条体パッチ／マトリックスのパッチ内のＧＦＰ陽性ミエリンの局在を含む、オリゴデンドロサイトを示唆する特性を示す、ラット線条体内の細胞のＯｌｉｇ００１形質導入。（Ｃ）ＣＮＳオリゴデンドロサイトの特有の形態を再度反映する、形質導入された細胞のより高い倍率での共焦点画像。（Ｄ）共焦点画像は、線条体内での、ＧＦＡＰ（赤）で標識された星状細胞とＧＦＰ陽性細胞の共局在の欠失を明らかにする。（Ｅ）共焦点画像は、線条体内の大多数のＯｌｉｇ００１形質導入細胞が、ニューロンのマーカー、ＮｅｕＮ（赤）と共局在しないことを示す。しかしながら、矢印（ａｒｒｏｗ ｉｎ）は、単一のＧＦＰ／ＮｅｕＮ陽性細胞を示す。 Ｏｌｉｇ００１は、ＡＡＶ８と比較して、末梢組織から脱標的化されることを示す。成体雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｏｌｉｇ００１−ＣＢｈ−ＧＦＰ（白い棒；ｎ＝４）またはＡＡＶ８−ＣＢｈ−ＧＦＰ（灰色の棒；ｎ＝５）のいずれかの５×１０１０ｖｇ（〜２．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ体重）の静脈内投与を受けた。１０日後に、二倍体マウスゲノム（ＬａｍｉｎＢ２）あたりのＧＦＰゲノムの臓器分布を、ｑＰＣＲにより決定した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 Ｅ５３２Ｋ突然変異を有するＡＡＶ８は、オリゴ向性（ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｉｃ）であることを示す。（Ａ）ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋと比較した、Ｏｌｉｇ００１由来のｃａｐ遺伝子のダイアグラム。異なる色は、異なるＡＡＶ親血清型（青＝ＡＡＶ２、紫＝ＡＡＶ８、赤＝ＡＡＶ９、黄＝ＡＡＶ１、および橙＝ＡＡＶ６）を表わす。黒の縦棒は、点突然変異を示す。ＡＡＶ８／Ｅ５３２ＫをＣＢｈ−ＧＦＰとともにパッケージして、２×１０８ｖｇを野生型雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの線条体中に頭蓋内注入した。注入後２週に、ラットを経心的に灌流して、それらの脳を固定して冠状に切開した。（Ｂ−Ｄ）線条体の共焦点画像は、ＧＦＰ陽性細胞が、ニューロン（ＮｅｕＮ）マーカーとの共局在を欠くことを示す。（Ｅ−Ｇ）線条体の共焦点画像は、ＧＦＰ陽性細胞が、共局在および星状細胞（ＧＦＡＰ）マーカーを欠くことを示す。 Ｏｌｉｇ００１オリゴデンドロサイト選択的向性が、ＶＰ３配列とは独立であることを示す。（Ａ）Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ ＶＰ３と比較した、Ｏｌｉｇ００１由来のｃａｐ遺伝子のダイアグラム。異なる色は、異なるＡＡＶ親血清型（青＝ＡＡＶ２、紫＝ＡＡＶ８、赤＝ＡＡＶ９、黄＝ＡＡＶ１、および橙＝ＡＡＶ６）を表わす。黒の縦棒は、点突然変異を示す。ＡＡＶ８のＶＰ３を有する突然変異体Ｏｌｉｇ００１（Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ８ ＶＰ３）を、２×１０８ｖｇ／μｌの力価でＣＢｈ−ＧＦＰとともにパッケージして、野生型雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの線条体中に頭蓋内注入した。２週後に、ラットを経心的に灌流して、それらの脳を固定して冠状に切開した。（Ｂ−Ｄ）線条体の共焦点画像は、ＧＦＰ陽性細胞が線条体オリゴデンドロサイト形態を示し、ニューロン（ＮｅｕＮ）マーカーとの共局在を欠くことを示す。（Ｅ−Ｇ）線条体の共焦点画像は、ＧＦＰ陽性細胞が、線条体オリゴデンドロサイト形態を示し、共局在および星状細胞（ＧＦＡＰ）マーカーを欠くことを示す。 インビトロ結合分析が、インビボ向性と一致することを示す。インビトロ混合グリア培養物を、新生児３日目マウスの脳を分離することにより作製した。培養物を、同等量のＡＡＶ８−ＣＢｈ−ＧＦＰまたはＯｌｉｇ００１−ＣＢｈ−ＧＦＰのいずれかとともに４℃で１時間インキュベートして、ベクター結合を可能にしたが、取り込みは可能にしなかった。（Ａ）細胞に結合したベクターの量をＧＦＰに関してｑＰＣＲにより定量化して、マウスゲノムＬａｍｉｎＢ２に対して正規化した。エラーバーは平均の標準誤差を示し、＊はＰ＜０．０３の有意差を示し、＊＊はＰ＜０．０１の有意差を示す。（Ｂ）倍数差を、ＡＡＶ８と比較した各ウイルスに関する平均結合を用いて決定した。 知見の概要を示す。成体ラット線条体の中に注入した場合のインビボ優性向性での本研究において用いたｃａｐ遺伝子のダイアグラム、および、ＡＡＶ８に対するインビトロ結合の倍数。異なる色は、異なるＡＡＶ親血清型を表わす（青＝ＡＡＶ２、紫＝ＡＡＶ８、赤＝ＡＡＶ９、黄＝ＡＡＶ１、および橙＝ＡＡＶ６）。黒の縦棒は点突然変異を示す。ＮＤ＝判定されず、＊はデータ示さず。 Ｏｌｉｇ００１に由来する突然変異体は、ＡＡＶ８と比較して、末梢組織から脱標的化されることを示す（図１１も参照）。成体雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｏｌｉｇ００１またはｓｃ ＣＢｈ−ＧＦＰゲノムをパッケージングする前述のその突然変異誘導体のうちの１つの、いずれかの５×１０１０ｖｇ（〜２．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ体重）の静脈内投与を受けた。１０日後に、二倍体マウスゲノム（ＬａｍｉｎＢ２）あたりのＧＦＰゲノムの臓器分布を、ｑＰＣＲにより決定した。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
本発明は、末梢臓器に関して最小限の向性で、ＣＮＳへの送達後に広範なＣＮＳ遺伝子導入が可能である、キメラＡＡＶキャプシド配列の開発に一部基づく。本発明はさらに、レット症候群を有する対象において高い形質導入能を有するキメラＡＡＶキャプシドに関する。キメラキャプシドを用いて、末梢臓器へ広範囲にベクター生体内分布せずに広範なＣＮＳ遺伝子導入が所望である、研究または治療的適用における使用のためのＡＡＶベクターを作製することができる。
本発明はさらに、末梢臓器に関して最小限の向性で、ＣＮＳへの送達後にオリゴデンドロサイト選択的または特異的な遺伝子導入が可能である、キメラＡＡＶキャプシド配列の開発に一部基づく。キメラキャプシドを用いて、ニューロンまたは末梢臓器へ広範囲にベクター生体内分布せずにオリゴデンドロサイト遺伝子導入が所望である、研究または治療的適用における使用のためのＡＡＶベクターを作製することができる。
本発明は、以下に、より詳細に説明される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる手段または本発明に加えられ得る全ての特徴の、詳細な一覧であることを意図しない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴は、他の実施態様に取り込まれ得て、特定の実施態様に関して説明される特徴は、その実施態様から取り除かれ得る。加えて、本明細書において示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変更および追加は、本発明から逸脱しない本開示に照らして、当業者に明らかである。それ故に、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを意図し、それらの並べ替え、組み合わせ、および変更の全てを徹底的に特定することを意図しない。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に説明される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いることができることが明確に意図される。さらにまた、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略することができることも検討する。説明すると、明細書が、複合体は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含む、と述べる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独でまたは任意の組み合わせで、省略および排除され得ることが明確に意図される。
別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本発明において本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。
ヌクレオチド配列は、本明細書において、特に別段の指示がない限り、左から右へ５’から３’への方向で一本鎖によってのみ提供される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って示される。
別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えおよび合成のポリペプチド、抗体またはそれらの抗原−結合フラグメントの生産、核酸配列の操作、形質転換細胞の生産、ｒＡＡＶ構築物、改変キャプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現するパッケージングベクター、および一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築に用いられ得る。そのような技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
全ての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および、本明細書において言及される他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。
Ｉ．定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶキャプシドサブユニット内の全てのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１キャプシドサブユニットのナンバリングに関する。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討する。
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、例えば、本発明の化合物または薬剤の量、投与量、時間、温度など、測定可能な値について言及する場合、規定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することを意味する。
核酸、タンパク質またはキャプシド構造の関連において本明細書で用いられる用語「から本質的になる」は、核酸、タンパク質またはキャプシド構造が、列挙されたエレメント（単数または複数）以外に、核酸、タンパク質またはキャプシド構造の目的の機能、例えば、タンパク質またはキャプシド、または、核酸によりコードされるタンパク質またはキャプシドの向性プロファイルを著しく（例えば、約１％、５％または１０％よりも多く）変更するいかなるエレメントも含まないことを意味する。
本発明の文脈における用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、限定されずに、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、および、現在公知または後に見いだされる任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くのさらなるＡＡＶ血清型およびクレードが同定されていて（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１−６３８８および表１を参照）、それらもまた、用語「ＡＡＶ」によって包含される。
様々なＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッションナンバーＮＣ ００２０７７、ＮＣ ００１４０１、ＮＣ ００１７２９、ＮＣ ００１８６３、ＮＣ ００１８２９、ＮＣ ００１８６２、ＮＣ ０００８８３、ＮＣ ００１７０１、ＮＣ ００１５１０、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ ００１３５８、ＮＣ ００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９、ＡＹ６３１９６５、ＡＹ６３１９６６を参照；それらの開示は、それらの全体で本明細書中に援用される。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；国際特許公報ＷＯ ００／２８０６１、ＷＯ ９９／６１６０１、ＷＯ ９８／１１２４４；米国特許第６，１５６，３０３号も参照；それらの開示は、それらの全体で本明細書中に援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３末端反復配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ− ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡにより提供される（その全体で本明細書中に援用される）。
「キメラ」ＡＡＶ核酸キャプシドコード配列またはＡＡＶキャプシドタンパク質は、２以上のキャプシド配列の部分を組み合わせたものである。「キメラ」ＡＡＶビリオンまたは粒子は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。
本明細書において用いられる用語「向性」は、特定の細胞または組織型（単数または複数）の中へのウイルスの選択的な侵入、および／または、特定の細胞または組織型の中への侵入を促進する細胞表面との選択的な相互作用を指し、場合により、および好ましくは、細胞内のウイルスゲノムにより保有される配列の発現（例えば転写、および場合により、翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列については、トランス作用性因子の不存在下では開始され得ないことを理解する。ｒＡＡＶゲノムの場合は，ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス由来、および／または、組み込まれないエピソーム由来、ならびに、ウイルス核酸が細胞内でとりうる任意の他の形態であってよい。
用語「向性プロファイル」は、１つまたは複数の標的細胞、組織および／または臓器の形質導入のパターンを指す。キメラＡＡＶキャプシドの代表的な例は、ＣＮＳの細胞の効率的な形質導入により特徴付けられる向性プロファイルを有し、末梢臓器の形質導入はほんのわずかである。
本明細書において用いられる用語「ＣＮＳ細胞に特異的」は、ＣＮＳに直接投与された場合に、ＣＮＳ内の全ての細胞型が選択的に形質導入され、ＣＮＳの外側の細胞が最小限の形質導入である、ウイルスベクターを指す。一部の実施態様では、形質導入された細胞の少なくとも約８０％がＣＮＳ細胞であり、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多くがＣＮＳ細胞である。
本明細書において用いられる用語「ＣＮＳ機能障害と関連する障害」は、ＣＮＳ細胞が損傷，欠失、または不適切に機能する、疾患、障害または傷害を指す。用語は、ＣＮＳ細胞が直接影響を受ける疾患、障害および傷害、ならびに、ＣＮＳ細胞が他の細胞に対する損傷（例えば、心筋梗塞または脳卒中）に次いで機能障害性になる疾患、障害および傷害を含む。
本明細書において用いられる用語「オリゴデンドロサイトに特異的」は、ＣＮＳに直接投与された場合に、ニューロン、星状細胞、および他のＣＮＳ細胞型よりも、オリゴデンドロサイトを選択的に形質導入する、ウイルスベクターを指す。一部の実施態様では，形質導入された細胞の少なくとも約８０％がオリゴデンドロサイトであり、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多くがオリゴデンドロサイトである。
本明細書において用いられる用語「オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害」は、オリゴデンドロサイトが損傷，欠失、または不適切に機能する、疾患、障害、または傷害を指す。用語は、オリゴデンドロサイトが直接影響を受ける疾患、障害および傷害、ならびに、オリゴデンドロサイトが他の細胞に対する損傷（例えば、脊髄損傷）に次いで機能障害性になる疾患、障害および傷害を含む。
本明細書において用いられる用語「損なわれている血液脳関門領域に隣接する」は、バリア機能が損なわれている血液脳関門の部分に隣接するＣＮＳ細胞を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）による細胞の「形質導入」は、細胞内へのベクターの侵入、および、ウイルスベクター内への核酸の取り込みおよびその後のウイルスベクターを介した細胞内への移行による細胞内への遺伝物質の移行を意味する。
別段の指示がない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切なポジティブまたはネガティブコントロールを参照することにより決定することができる（例えば、ポジティブコントロールの形質導入または向性のそれぞれの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多い、または、ネガティブコントロールの形質導入または向性のそれぞれの少なくとも約１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％またはそれより多い）。
同様に、標的組織に関してウイルスが「効率的に形質導入しない」または「効率的な向性を有さない」かどうか、または同様の用語は、適切なコントロールを参照して決定することができる。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳの外側の組織、例えば、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞に関して、効率的に形質導入しない（すなわち、効率的な向性を有さない）。特定の実施態様では、組織（単数または複数）（例えば、肝臓）の望ましくない形質導入は、望ましい標的組織（単数または複数）（例えば、ＣＮＳ細胞）の形質導入のレベルの２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列であってよいが（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）、好ましくは一本鎖または二本鎖のＤＮＡ配列のいずれかである。
本明細書において用いられる、「単離された」核酸またはヌクレオチド配列（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの少なくとも一部の他の構成要素、例えば、細胞またはウイルスの構造的な構成要素、または、核酸またはヌクレオチド配列と関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離または実質的にフリーである、核酸またはヌクレオチド配列を意味する。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの少なくとも一部の他の構成要素、例えば、細胞またはウイルスの構造的な構成要素、または、ポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離または実質的にフリーであるポリペプチドを意味する。
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（または文法上の同等の用語）によって、対象の症状の重症度が、減少または少なくとも部分的に改善または向上されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候のいくらかの軽減、緩和または減少が達成されること、および／または、症状の進行の遅延および／または疾患または障害の発症の予防または遅延があることを意味する。
本明細書において用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびそれらの文法上の同等物）は、疾患または障害の発症の遅延、または、疾患または障害の発症時の症候の軽減を指す。用語は、疾患の完全な廃止を暗示することを意味せず、症状の発生率を低下させる、または、症状の発症および／または進行を遅延させる、任意のタイプの予防的治療を包含する。
本明細書において用いられる「効果的な」または「治療的に効果的な」量は、いくらかの改善または利益を対象に提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「効果的な」または「治療的に効果的な」量は、対象において少なくとも１つの臨床症候のいくらかの軽減、緩和、または低減を提供する量である。当業者は、いくらかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解する。
「異種ヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、ウイルスにおいて天然起源でない配列である。一般に、異種核酸またはヌクレオチド配列は、ポリペプチドおよび／または非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む。
「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象におけるタンパク質の不存在または欠陥に起因する症候を、緩和または低減することのできるポリペプチドであり得る。加えて、「治療的ポリペプチド」は、それ以外の方法で、利益、例えば、抗癌効果または移植生存率の改善を対象に与えるポリペプチドであってよい。
本明細書において用いられる用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能する、ビリオン内にパッケージされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含むウイルス粒子を指す。本発明に係るウイルスベクターは、本発明に係るキメラＡＡＶキャプシドを含み、ＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムまたはウイルス核酸を含む任意の他の核酸をパッケージすることができる。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）を用いて、ビリオン不存在下のベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）、および／または、キャプシドに係留またはキャプシド内にパッケージされた分子を送達するためのトランスポーターとして作用するウイルスキャプシドを指し得る。
「組み換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、少なくとも１つの逆位末端反復（例えば、１、２または３つの逆位末端反復）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを産生するために、ｃｉｓで１４５塩基の末端反復（単数または複数）（ＴＲ（単数または複数））を保有するが、部分的または完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲおよび非ＡＡＶ ＴＲもまた、この目的を果たすことができる。全ての他のウイルス配列は不必要であり、ｔｒａｎｓで提供され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、（１９９２）Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは場合により、２つのＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含み、それは一般に、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の５’および３’末端にあるが、そこに連続している必要はない。ＴＲは、互いに同一または異なってよい。また、ベクターゲノムは、その３’または５’末端に単一のＩＴＲを含んでもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、逆位末端反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／または、プロウイルスレスキューなどのような所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のもののような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起点として作用するＳＶ４０ヘアピンをＴＲとして用いることができ、それはさらに、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によって改変することができる。さらに、ＴＲは、米国特許第５，４７８，７４５号（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ）に記載の「ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ配列」のように、部分的または完全に合成であってよい。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１または現在公知または後に見いだされる任意の他のＡＡＶを含む、任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が、複製、ウイルスパッケージング，組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどのような所望の機能を仲介する限り、ネイティブ末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異により変更され得る）。
用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書で相互交換可能に用いられる。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたｒＡＡＶベクターゲノムを含む。
ＡＡＶキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。
特質を「実質的に保持する」とは、特質（例えば、活性または他の測定可能な特徴）の少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％が保持されることを意味する。
ＩＩ．ＣＮＳを標的化したキメラＡＡＶキャプシド
本発明者らは、末梢臓器に関して最小限の向性で、広範なＣＮＳ遺伝子導入を提供することが可能な、キメラＡＡＶキャプシド構造を同定している。したがって、本発明の一態様は、対象、例えば野生型の対象、例えばＣＮＳ障害を有さない対象において、ＣＮＳ遺伝子導入を提供することが可能な、キメラＡＡＶキャプシド構造に関する。特定の実施態様では、本発明は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は、（ａ）配列番号１〜４３のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号４４〜８６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含む、から本質的になる、またはからなる；および、当該キメラＡＡＶキャプシドを含むウイルスに関する。一部の実施態様では，ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
特定の実施態様では，本発明は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は、（ａ）配列番号１〜４３のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号４４〜８６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、から本質的になり、またはからなり；異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分に作動可能に連結される；および、当該キメラＡＡＶキャプシドを含むウイルスに関する。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では，ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では，異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分は、野生型キャプシド配列（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９）、または、本発明の任意のキャプシド配列と異なるキメラ配列である。
本発明の別態様は、ＣＮＳ障害、例えば神経発生的障害、特にレット症候群、例えばメチルシトシン結合タンパク質２をコードする遺伝子（ＭＥＣＰ２）内の突然変異に起因する障害を有する対象において、ＣＮＳ遺伝子導入を提供することが可能な、キメラＡＡＶキャプシド構造に関する。特定の実施態様では、本発明は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は、（ａ）配列番号８７〜１０７のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号１０８〜１２８のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含む、から本質的になる、またはからなる；および、当該キメラＡＡＶキャプシドを含むウイルスに関する。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
特定の実施態様では，本発明は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は、（ａ）配列番号８７〜１０７のいずれか１つのヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号１０８〜１２８のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、から本質的になり、またはからなり；異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分に作動可能に連結される；および、当該キメラＡＡＶキャプシドを含むウイルスに関する。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分は、野生型キャプシド配列（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９）または本発明の任意のキャプシド配列と異なるキメラ配列である。
配列番号４４〜８６および１０８〜１２８は、ＶＰ１キャプシドタンパク質配列を示す。本発明の説明および添付の特許請求の範囲における全てのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１ナンバリングに関する。当業者は、ＡＡＶキャプシドは一般に、より小さなＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質を同様に含むことを理解する。ＡＡＶキャプシドタンパク質に関するコード配列のオーバーラップに起因して、ＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質の核酸コード配列およびアミノ酸配列は、開示の配列に示されるＶＰ１配列から明らかである。具体的には、ＶＰ２は、配列番号１のヌクレオチド４１２（ａｃｇ）および配列番号４４のトレオニン１３８で開始する。ＶＰ３は、配列番号１のヌクレオチド６０７（ａｔｇ）および配列番号４４のメチオニン２０３で開始する。特定の実施態様では、配列番号４４由来の配列を含む単離されたＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質、および、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質または両方をコードする単離された核酸が検討される。
また、本発明は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質およびキメラキャプシドも提供し、キャプシドタンパク質は、配列番号４４〜８６および１０８〜１２８に示されるアミノ酸配列を含み、から本質的になり、またはからなり、ここで、配列番号４４〜８６および１０８〜１２８のキャプシドタンパク質コード配列内のアミノ酸の１、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１２以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、または５０以下は、別のアミノ酸（天然起源、改変および／または合成）、場合により保存的アミノ酸置換により置換され、および／または、欠失され、および／または、１、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１２以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、または５０以下のアミノ酸の挿入（Ｎ末およびＣ末伸長を含む）、または、置換、欠失および／または挿入の任意の組み合わせが存在し、ここで、置換、欠失および／または挿入は、変異キャプシドタンパク質またはキャプシドを含むビリオン（例えばＡＡＶビリオン）の構造および／または機能を過度に損なわない。例えば、本発明の代表的な実施態様では、キメラキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンは、配列番号４４〜８６および１０８〜１２８に示されるキメラキャプシドタンパク質を含むキメラビリオンの少なくとも１つの特質を実質的に保持する。例えば、キメラキャプシドタンパク質を含むビリオンは、配列番号４４〜８６および１０８〜１２８に示されるキメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンのＣＮＳ向性プロファイルを実質的に保持することができる。ウイルス形質導入のような生物学的特質を評価する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば実施例を参照）。
保存的アミノ酸置換は、当技術分野で知られている。特定の実施態様では，保存的アミノ酸置換は、以下の基の１つまたは複数において置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；および／またはフェニルアラニン、チロシン。
所望の特質を与えるために、配列番号４４〜８６および１０８〜１２８のキメラＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列をさらに改変して、当技術分野で知られている他の改変を組み込むことができることが当業者に明らかである。非限定の可能性として、キャプシドタンパク質を改変して、標的化配列（例えば、ＲＧＤ）または精製および／または検出を促進する配列を組み込むことができる。例えば、キャプシドタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース−結合タンパク質、ヘパリン／ヘパランサルフェート結合ドメイン、ポリ−Ｈｉｓ、リガンド、および／またはレポータータンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、免疫グロブリンＦｃフラグメント、単鎖抗体、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープなどの全部または一部と融合して、融合タンパク質を形成することができる。標的化ペプチドをＡＡＶキャプシド中に挿入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、国際特許公報ＷＯ ００／２８００４；Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４７４−１８１；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：５１３−３１９；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１０４０−１０４６を参照。
本発明のウイルスは、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１および米国特許第７，４６５，５８３号に記載の二重鎖ウイルスゲノムをさらに含んでよい。
また、本発明は、本発明のキメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドおよびそれを含むウイルス粒子（すなわち、ビリオン）も提供し、ウイルス粒子は、ベクターゲノム、場合によりＡＡＶベクターゲノムをパッケージ（すなわち、キャプシド形成）する。特定の実施態様では、本発明は、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶ粒子を提供し、ここで、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶベクターゲノムをパッケージする。また、本発明は、本発明のキメラ核酸キャプシドコード配列によりコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質またはＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶ粒子も提供する。
特定の実施態様では、ビリオンは、例えば細胞への送達のための、目的の異種核酸を含む、組み換えベクターである。したがって、本発明は、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの、細胞への核酸の送達に有用である。代表的な実施態様では、本発明の組み換えベクターは、動物（例えば、哺乳類）細胞へ核酸を送達または移行するのに有利に用いることができる。
任意の異種ヌクレオチド配列（単数または複数）が、本発明のウイルスベクターによって送達され得る。目的の核酸は、ポリペプチド、場合により治療的（例えば、医療または獣医用途のための）、および／または免疫原性（例えば、ワクチンのための）、ポリペプチドをコードする核酸を含む。
一部の実施態様では、ポリペプチドは、ＣＮＳ細胞、例えば、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、星状細胞、ミクログリア、および／または、上衣細胞の、増殖および／または分化を刺激するものである。例示は、制限されずに、インスリン様成長因子−１、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、アルテミン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｅｒｉｎ）、パーセフィン、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、形質転換成長因子α、血小板由来成長因子、白血病阻害因子、プロラクチン、モノカルボン酸トランスポーター１、または、核因子１Ａを含む。
治療的ポリペプチドは、限定されないが、嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ジストロフィンミニ−遺伝子またはマイクロ−遺伝子のタンパク質産物を含む、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許公報２００３０１７１３１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１３７１４−９［ミニ−ジストロフィン］；Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：２５３−６１［マイクロ−ジストロフィン］を参照）；ミニ−アグリン、ラミニン−α２、サルコグリカン（α、β、γまたはδ）、フクチン関連タンパク質、ミオスタチンプロ−ペプチド、ホリスタチン、ドミナントネガティブミオスタチン、血管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン−１または２）、抗−アポトーシス因子（例えば、ヘムオキシゲナーゼ−１、ＴＧＦ−β、アポトーシス促進シグナルの阻害剤、例えば、カスパーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、細胞死受容体［例えば、ＣＤ−０９５］、シトクロムＣ放出の調節因子、ミトコンドリアのポアの開放および膨張の阻害剤）；２型アクチビン可溶性受容体、抗−炎症性ポリペプチド、例えば、Ｉｋａｐｐａ Ｂドミナント突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニ−ユートロフィン、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント、細胞周期調節因子、改変された細菌性Ｃ３細胞外酵素であるＣｅｔｈｒｉｎのようなＲｈｏキナーゼ調節因子［ＢｉｏＡｘｏｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｉｎｔ−Ｌａｕｒｅｎ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａより入手可能］、ＢＣＬ−ｘＬ、ＢＣＬ２、ＸＩＡＰ、ＦＬＩＣＥｃ−ｓ、ドミナントネガティブカスパーゼ−８、ドミナントネガティブカスパーゼ−９、ＳＰＩ−６（例えば、米国特許出願番号２００７００２６０７６を参照）、転写因子ＰＧＣ−α１、Ｐｉｎｃｈ遺伝子、ＩＬＫ遺伝子およびチモシンβ４遺伝子）、凝固因子（例えば、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘなど）、エリスロポエチン、アンギオスタシン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、細胞内および／または細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、ネプリライシン、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α１−アンチトリプシン、メチルシトシン結合タンパク質２、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−１から−１４、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、など）、ペプチド成長因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を含むインスリン様成長因子、ＧＬＰ−１、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、形質転換成長因子−αおよび−βなど）、骨形態形成タンパク質（ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む）、リソソームタンパク質、グルタメート受容体、リンホカイン、可溶性ＣＤ４、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、タンパク質ホスファターゼ阻害剤１の阻害剤１（Ｉ−１）、ホスホランバン、ｓｅｒｃａ２ａ、リソソーム酸α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、Ｂａｒｋｃｔ、β２−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、カルサルシン、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子−α可溶性受容体）、抗−炎症性因子、例えば、ＩＲＡＰ、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣＦ−ＳＯＤ、カルクレイン、チモシン−β４、低酸素誘導性転写因子［ＨＩＦ］、血管形成因子、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、６型アデニリルシクラーゼ、２型Ｇ−タンパク質共役受容体キナーゼノックダウンを作動する分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；ホスホランバン抑制またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む）または、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α）、および、それを必要とする対象において治療的効果を有する任意の他のポリペプチドを含む。
ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードするものを含む。レポーターポリペプチドは、当技術分野で知られていて、限定されないが、蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、またはｄｓＲＥＤ２）、検出可能な産物を生じる酵素、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、またはＰｈｏｔｉｎｕｓ由来）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、または、直接検出することができるタンパク質を含む。実質的に任意のタンパク質は、例えば、タンパク質に特異的な抗体を用いることにより直接検出することができる。真核生物細胞のポジティブまたはネガティブセレクションのいずれかに適切なさらなるマーカー（および関係する抗生物質）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに開示され、周期的な更新を含む。
あるいは、異種核酸は、機能性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライセオソームが仲介するトランス−スプライシングを生じるＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを仲介する小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、マイクロＲＮＡ、または他の非翻訳の「機能性」ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；米国特許第５，８６９，２４８号（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．））などをコードしてよい。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ（例えば、腫瘍を治療するため、および／または、化学療法による損傷を防ぐために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ（ＤｕｃｈｅｎｎｅまたはＢｅｃｋｅｒ筋ジストロフィー）、制限されないが、本明細書に具体的に記載される腫瘍免疫原を含む腫瘍免疫原またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ（腫瘍を治療するため）、突然変異ジストロフィンを標的化するＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤｕｃｈｅｎｎｅまたはＢｅｃｋｅｒ筋ジストロフィー）、肝炎Ｂ表面抗原遺伝子に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ（肝炎Ｂ感染を予防および／または治療するため）、ＨＩＶ ｔａｔおよび／またはｒｅｖ遺伝子に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ（ＨＩＶを予防および／または治療するため）、および／または、病原体由来の任意の他の免疫原に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ（病原体から対象を保護するため）、または、欠損遺伝子産物（疾患を予防または治療するため）を含む。また、上述の標的または任意の他の標的に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡを、研究試薬として用いることもできる。
当技術分野で知られているように、アンチセンス核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）および抑制ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡおよびＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）配列を用いて、ジストロフィン遺伝子の欠陥により生じる筋ジストロフィーを有する患者において、「エクソンスキッピング」を誘導することができる。したがって、異種核酸は、適切なエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸または抑制ＲＮＡをコードしてよい。当業者は、エクソンスキッピングに対する特定のアプローチは、ジストロフィン遺伝子の根本的な欠陥の本質に依存することを理解していて、非常に多くのそのようなストラテジーが当技術分野で知られている。例示的なアンチセンス核酸および抑制ＲＮＡ配列は、上流分岐点および／または下流ドナースプライス部位および／またはジストロフィンエクソンの１つまたは複数（例えば、エクソン１９または２３）の内部スプライシングエンハンサー配列を標的化する。例えば、特定の実施態様では、異種核酸は、上流分岐点およびジストロフィン遺伝子のエクソン１９または２３の下流スプライスドナー部位に対して向けられる、アンチセンス核酸または抑制ＲＮＡをコードする。そのような配列を、改変Ｕ７ ｓｎＲＮＡおよびアンチセンス核酸または抑制ＲＮＡを送達するＡＡＶベクター内に組み込むことができる（例えば、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：１７９６−１７９９を参照）。別のストラテジーとしては、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを、ジストロフィンエクソン（例えば、エクソン１９または２３）の上流および下流スプライス部位に相補であるｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡともに、ＡＡＶベクター内に組み込むことができる（例えば、Ｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：３７５８−３７６３を参照）。さらに、アンチセンス核酸および抑制ＲＮＡは、エクソン１９、４３、４５または５３内のスプライシングエンハンサー配列を標的化することができる（例えば、米国特許第６，６５３，４６７号； 米国特許第６，７２７，３５５号；および米国特許第６，６５３，４６６号を参照）。
リボザイムは、部位特異的な様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的な触媒ドメインを有する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８７８８；Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：８０２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：２１１）。例えば、数多くのリボザイムは、高度の特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、たいてい、オリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断する（Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：５８５；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：１７３）。この特異性は、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に対する特異的な塩基対合相互作用を介して基質が結合するという必要性に起因している。
リボザイム触媒作用は、当初は、核酸に関する配列特異的な切断／ライゲーション反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２１７）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号は、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼのものよりも高い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用することができることを報告し、ＤＮＡ制限酵素のものに近づいている（ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ）。したがって、配列特異的なリボザイムにより仲介される、核酸発現の阻害は、治療的適用に特に適し得る（Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５９１；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２；Ｓｉｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２３：８３１）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉｒ）は、ｍＲＮＡの安定性を制御することにより、多数の遺伝子の発現を調節することができる天然の細胞のＲＮＡ分子である。特定のマイクロＲＮＡの過剰発現または減少を利用して、機能障害を治療することができ、疾患の動物モデルおよび多くの病態において効果的であることが示されている（例えば、Ｃｏｕｚｉｎ、（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１９：１７８２−４を参照）。遺伝子疾患および獲得疾患の治療のために、または、機能を亢進させて特定の組織の増殖を促進させるために、キメラＡＡＶを用いて、細胞、組織および対象内にマイクロＲＮＡを送達することができる．例えば、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６および／またはｍｉｒ−２０８を用いて、心臓および骨格筋の疾患を治療することができる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｇｅｎｅｔ．３８：２２８−３３；ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２４：１５９−６６を参照）。また、マイクロＲＮＡを用いて、遺伝子送達後の免疫系を調節することもできる（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０：４１４４−５２）。
本明細書において用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（「アンチセンスＲＮＡ」を含む）は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補であり特異的にハイブリダイズする核酸を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれをコードする核酸は、従来の技術に従って作ることができる。例えば、米国特許第５，０２３，２４３（Ｔｕｌｌｉｓ）；米国特許第５，１４９，７９７（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ）を参照。
当業者は、配列類似性の程度が、アンチセンスヌクレオチド配列がその標的（上記に定義）に特異的にハイブリダイズしてタンパク質産物の生産を（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも多く）減らすのに十分である限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に完全に相補であることは必要でないことを理解する。
ハイブリダイゼーションの特異性を決定するために、標的配列に対するそのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはさらにストリンジェントな条件の条件下で行なうことができる。低い、中程度、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を達成するための適切な条件は、本明細書に記載のとおりである。
別の言い方をすると、特定の実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列の相補と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％またはそれよりも高い配列同一性を有し、タンパク質産物（上記に定義）の生産を減らす。一部の実施態様では、アンチセンス配列は、標的配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のミスマッチを含む。
核酸配列のパーセント同一性を判定する方法は、本明細書の他のどこかでより詳細に記載される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、意図される標的に特異的にハイブリダイズしてタンパク質産物（上記に定義）の生産を減らす限り重大ではなく、日常的な手順に従って判定することができる。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約８、１０または１２または１５個のヌクレオチドの長さおよび／または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００または１５０個未満のヌクレオチドの長さである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、タンパク質産物の生産を減少させるための別の有用な方法である（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）。ＲＮＡｉは、目的の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞または生物内に導入される転写後遺伝子サイレンシングのメカニズムであり、対応するｍＲＮＡの分解をもたらす。ＲＮＡｉが遺伝子サイレンシングを達成するメカニズムは、Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：４８５−４９０；および、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９）に概説されている。ＲＮＡｉ効果は、遺伝子発現が回復する前の多数の細胞分裂に関して持続する。したがって、ＲＮＡｉは、標的化されたノックアウトまたは「ノックダウン」をＲＮＡレベルで作製するための有力な方法である。ＲＮＡｉは、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞において、成功することが証明されている（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４−８を参照）。
哺乳類細胞においてＲＮＡｉを使用する最初の試みは、ｄｓＲＮＡ分子に応答してＰＫＲを伴う抗ウイルス防御メカニズムを生じさせた（例えば、Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ５：１０７を参照）。それ以来、「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）として知られる約２１ヌクレオチドの短い合成ｄｓＲＮＡが、抗ウイルス応答を引き起こさずに哺乳類細胞においてサイレンシングを仲介することができることが示されている（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４−８；Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２を参照）。
ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ分子を含む）は、短いヘアピンＲＮＡであってよく（ｓｈＲＮＡ；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１４４３−１４４８を参照）、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様の酵素Ｄｉｃｅｒの作用によって細胞内で２０〜２５マーのｓｉＲＮＡ分子に処理されると考えられている。ｓｈＲＮＡは一般に、２つの逆位反復配列がループアウトする短いスペーサー配列により分離されているステムループ構造を有する。３〜２３個の範囲のヌクレオチドの長さのループを有するｓｈＲＮＡの報告がされている。一般に、ループ配列は重大でない。例示的なループ配列は、以下のモチーフを含む：ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡ。
ＲＮＡｉは、いずれか側に２つのループ領域を有するセンスおよびアンチセンス領域を含む環状分子をさらに含み、センスおよびアンチセンス領域の間のｄｓＲＮＡ形成の際に「ダンベル」形状の構造を形成することができる。この分子は、インビトロまたはインビボで処理されて、ｄｓＲＮＡ部分、例えばｓｉＲＮＡをリリースすることができる。
国際特許公報ＷＯ０１／７７３５０は、真核生物細胞における異種配列のセンスおよびアンチセンスの両方の転写産物を産生する双方向性の転写のためのベクターを記載する。この技術を用いて、本発明による使用のためのＲＮＡｉを生産することができる。
Ｓｈｉｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：１３４０は、ＣＭＶプロモーター（ｐｏｌ ＩＩプロモーター）から長鎖ｄｓＲＮＡを発現する方法を報告し、その方法は、組織特異的なｐｏｌ ＩＩプロモーターにも適用可能である。同様に、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６の方法は，ポリ（Ａ）テーリングを避けて、組織特異的なプロモーターとの関連で用いることができる。
ＲＮＡｉを生産する方法は、化学合成、インビトロ転写、Ｄｉｃｅｒによる長鎖ｄｓＲＮＡの消化（インビトロまたはインビボ）、送達ベクターからのインビボ発現、および、ＰＣＲ由来のＲＮＡｉ発現カセットからのインビボ発現（例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸからの、ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ１０（３）「Ｆｉｖｅ Ｗａｙｓ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｉＲＮＡｓ」を参照；ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍで入手可能）を含む。
ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのガイドラインが入手可能である（例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸからの文献を参照；ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍで入手可能）。特定の実施態様では、ｓｉＲＮＡ配列は、約３０〜５０％のＧ／Ｃ含有量を有する。さらに、ＲＮＡを転写するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを用いる場合は、４個よりも長い一続きのＴまたはＡ残基は一般に避けられる。オンラインのｓｉＲＮＡ標的ファインダーは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ）から、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｗｗｗ．ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を通して、または、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ）から、入手可能である。
ＲＮＡｉ分子のアンチセンス領域は、標的配列に対して完全に相補であってよいが、標的配列（上記に定義）に特異的にハイブリダイズして、タンパク質産物の生産を（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも多く）減少させる限り、そうである必要はない。一部の実施態様では、そのようなオリゴヌクレオチドの標的配列に対するハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはさらにストリンジェントな条件（上記に定義）の条件下で行なうことができる。
他の実施態様では、ＲＮＡｉのアンチセンス領域は、標的配列の相補と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％またはそれより高い配列同一性を有し、タンパク質産物の生産を（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも多く）減らす。一部の実施態様では、アンチセンス領域は、標的配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のミスマッチを含む。ミスマッチは一般に、中央の部分よりもｄｓＲＮＡの末端で許容される。
特定の実施態様では、ＲＮＡｉは、２つの別個のセンスおよびアンチセンス分子の間の分子間錯形成により形成される。ＲＮＡｉは、２つの別個の鎖の間の分子間塩基対形成により形成されるｄｓ領域を含む。他の実施態様では、ＲＮＡｉは、典型的に逆位反復（例えば、ｓｈＲＮＡまたは他のステムループ構造、または環状ＲＮＡｉ分子）としてセンスおよびアンチセンス領域の両方を含む、単一の核酸分子内の分子内塩基対形成により形成されるｄｓ領域を含む。ＲＮＡｉは、センスおよびアンチセンス領域の間に、スペーサー領域をさらに含んでよい。
一般に、ＲＮＡｉ分子は高度に選択性である。必要に応じて、当業者は、関連データベースを検索して、例えば、ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで利用可能）を用いて、他の公知の配列と実質的な配列ホモロジーを有さないＲＮＡｉ配列を同定することにより、標的以外の核酸の発現を干渉する可能性がある候補ＲＮＡｉを容易に除くことができる。
ＲＮＡｉの生産のためのキットは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．およびＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃから市販されている。
また、組み換えウイルスベクターは、宿主染色体と相同性を共有して宿主染色体上の遺伝子座と組み換える異種ヌクレオチド配列も含み得る。この方法を使用して、宿主細胞の遺伝的欠陥を訂正し得る。
また、本発明は、例えばワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現する組み換えウイルスベクターも提供する。異種核酸は、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原を含む、当技術分野で知られている任意の目的の免疫原をコードしてよい。あるいは、免疫原は、ウイルスキャプシド内に提示され得て（例えば、その中に組み込まれる）、または、ウイルスキャプシドに係留される（例えば、共有結合修飾による）。
ワクチンとしてのパルボウイルスの使用は、当技術分野で知られている（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８５０７；米国特許第５，９１６，５６３号（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，９０５，０４０号（Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，８８２，６５２、米国特許第５，８６３，５４１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）を参照；それらの開示は、参照によりそれらの全体で本明細書中に援用される）。抗原は、ウイルスキャプシド内に提示され得る。あるいは、抗原は、組み換えベクターゲノム中に導入された異種核酸により発現され得る。
免疫原性ポリペプチド、または免疫原は、制限されないが、微生物、細菌、原生動物、寄生性、真菌およびウイルス疾患を含む疾患に対して対象を保護するために適切な、任意のポリペプチドであってよい。例えば、免疫原は、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質またはインフルエンザウイルス核タンパク質遺伝子、または、ウマインフルエンザウイルス免疫原）、または、レンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶ膜ＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶマトリックス／キャプシドタンパク質、および、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物）であってよい。また、免疫原は、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニア、例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原、またはマールブルグウイルス免疫原、例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、およびＳＦＳウイルス）、または、コロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、または鳥類感染性気管支炎ウイルス免疫原、または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）免疫原、例えば、Ｓ［Ｓ１またはＳ２］、Ｍ、Ｅ、またはＮタンパク質またはそれらの免疫原性フラグメント）であってもよい。免疫原は、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）おたふく風邪免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素または他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎）免疫原、または、当技術分野で知られている任意の他のワクチン免疫原であってよい。
あるいは、免疫原は、任意の腫瘍または癌細胞抗原であってよい。場合により、腫瘍または癌抗原は、癌細胞の表面上に発現される。例示的な癌および腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１）に記載される。例示的な癌および腫瘍抗原は、限定されないが：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、以下を含む、ＭＡＲＴ−１（Ｃｏｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５），ｇｐ１００（Ｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４：２０１）およびＭＡＧＥ抗原（ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２およびＭＡＧＥ−３）（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３）、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１；ＴＲＰ−２；Ｐ−１５およびチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）；ＣＡ１２５；ＨＥ４；ＬＫ２６；ＦＢ５（エンドシアリン）；ＴＡＧ７２；ＡＦＰ；ＣＡ１９−９；ＮＳＥ；ＤＵ−ＰＡＮ−２；ＣＡ５０；Ｓｐａｎ−１；ＣＡ７２−４；ＨＣＧ；ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）；ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質；ＰＳＡ；Ｌ−ＣａｎＡｇ；エストロゲン受容体；乳脂肪グロブリン；ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公報ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；乳頭腫ウイルス抗原；および、以下の癌と関連する抗原を含む：メラノーマ、腺癌、胸腺腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵癌、脳腫瘍、腎臓癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌およびその他（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１−９１を参照）。
あるいは、異種ヌクレオチド配列は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、細胞内で望ましく生産される任意のポリペプチドをコードしてよい。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞およびそれから単離される発現されたタンパク質産物中に導入され得る。
目的の異種核酸（単数または複数）は、適切な制御配列と作動可能に結合され得ることが当業者により理解される。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサーなどと作動可能に結合され得る。
当業者はさらに、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望の組織特異的な発現およびレベルに応じて用いられ得ることを理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が、転写開始領域が導入される野生型宿主内に見られないことを意図する。
プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にとってネイティブであってよく、および／または、異種核酸配列に対してネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンスエレメントは、構造的または誘導性であってよい。
誘導性の発現制御エレメントは、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して制御を提供することが望ましい適用において一般に用いられる。遺伝子送達に関する誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織に特異的または組織に選択的なプロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉に特異的または選択的（心筋、骨格筋および／または平滑筋を含む）、神経組織に特異的または選択的（脳特異的を含む）、眼（網膜に特異的および角膜に特異的を含む）、肝臓に特異的または選択的、骨髄に特異的または選択的、膵臓に特異的または選択的、脾臓に特異的または選択的、および、肺に特異的または選択的な、プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。一実施態様では、ＣＮＳ細胞に特異的またはＣＮＳ細胞に選択的なプロモーターが用いられる。ニューロンに特異的または選択的なプロモーターの例は、制限されずに、ニューロン特異的なエノラーゼ、シナプシン、およびＭｅＣＰ２を含む。星状細胞に特異的または選択的なプロモーターの例は、制限されずに、グリア線維酸性タンパク質およびＳ１００βを含む。上衣細胞に特異的または選択的なプロモーターの例は、制限されずに、ｗｄｒ１６、Ｆｏｘｊ１、およびＬＲＰ２を含む。ミクログリアに特異的または選択的なプロモーターの例は、制限されずに、Ｆ４／８０、ＣＸ３ＣＲ１、およびＣＤ１１ｂを含む。オリゴデンドロサイトに特異的または選択的なプロモーターの例は、制限されずに、ミエリン塩基性タンパク質、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテオリピドタンパク質、Ｇｔｘ、およびＳｏｘ１０を含む。ＣＮＳ細胞に特異的または選択的なプロモーターの使用は、異種核酸の発現をさらに制限することにより、キメラＡＡＶベクターにより達成されるＣＮＳに対する特異性を増大させることができる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。
異種核酸配列（単数または複数）が転写されて、それから標的細胞内で翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルは、一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳に用いられる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起点であってよい。
また、本発明は、ＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶゲノムを含むキメラＡＡＶ粒子も提供し、ここで、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶキャプシドに「相当する」（すなわち、コードする）。また、そのようなキメラＡＡＶ粒子のコレクションまたはライブラリーも提供されて、ここで、コレクションまたはライブラリーは、２以上、１０以上、５０以上、１００以上、１０００以上、１０４以上、１０５以上、または１０６以上の別個の配列を含む。
本発明はさらに、本発明のキメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、からなる、または、から本質的になる、「空の」キャプシド粒子を包含する（すなわち、ベクターゲノムが不存在）。本発明のキメラＡＡＶキャプシドは、米国特許第５，８６３，５４１号において説明されているように、「キャプシドビヒクル」として用いることができる。ウイルスキャプシドによって共有結合、結合、またはパッケージして、細胞内に移行することのできる分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、ポリペプチド、有機小分子、またはそれらの組み合わせを含む。さらに、分子は、宿主標的細胞内への分子の移行のために、ウイルスキャプシドの外側と結合する（例えば「係留する」）ことができる。本発明の一実施態様では、分子は、キャプシドタンパク質に共有結合（すなわち、コンジュゲートまたは化学結合）されている。分子を共有結合する方法は、当業者により公知である。
また、本発明のウイルスキャプシドは、新規のキャプシド構造に対して抗体を掲げる用途を見いだす。さらなる代替としては、細胞に対する抗原提示のために、例えば対象に投与するために、外因性のアミノ酸配列をウイルスキャプシド中に挿入して、外因性のアミノ酸配列に対する免疫応答を生じさせ得る。
また、本発明は、本発明のキメラキャプシドタンパク質およびキメラウイルスキャプシドをコードする核酸（例えば、単離された核酸）も提供する。さらに、核酸を含むベクター、および、本発明の核酸および／またはベクターを含む細胞（インビボまたは培養中）が提供される。そのような核酸、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書に記載のウイルスベクターの生産のための試薬（例えば、ヘルパー構築物またはパッケージング細胞）として用いられ得る。
例示的な実施態様では、本発明は、配列番号４４〜８６または１０８〜１２８のＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列、または、配列番号１〜４４または８７〜１０７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一の核酸配列を提供する。また、本発明は、上述の、ＡＡＶキャプシド変異、キャプシドタンパク質変異および融合タンパク質をコードする核酸も提供する。特定の実施態様では、核酸は、当業者により公知の標準的な条件下で、本明細書に具体的に開示される核酸配列の相補にハイブリダイズし、変異キャプシドおよび／またはキャプシドタンパク質をコードする。場合により、変異キャプシドまたはキャプシドタンパク質は、キャプシドおよび／または配列番号１〜４４または８７〜１０７の核酸配列によりコードされるキャプシドまたはキャプシドタンパク質の特質の少なくとも１つを実質的に保持する。例えば、変異キャプシドまたは変異キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子は、配列番号１〜４４または８７〜１０７の核酸コード配列によりコードされるキャプシドまたはキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子のＣＮＳ向性プロファイルを実質的に保持することができる。
例えば、そのような配列のハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはさらにストリンジェントな条件の条件下で行なってよい。低い、中程度、およびストリンジェントなハイブリダイゼーションに関する例示的な条件は以下のとおりである：（例えば、それぞれ、５×デンハルト溶液を用いた３５〜４０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシー、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥ（３７℃）により表わされる条件；５×デンハルト溶液を用いた４０〜４５％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシー、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥ（４２℃）により表わされる条件；および、５×デンハルト溶液を用いた５０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシー、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥ（４２℃）により表わされる条件）。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ Ｅｄ．１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照。
他の実施態様では、本発明の変異キャプシドまたはキャプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１〜４４または８７〜１０７の核酸配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、場合により、配列番号１〜４４または８７〜１０７の核酸によりコードされるキャプシドタンパク質またはキャプシドの特質の少なくとも１つを実質的に保持する変異キャプシドまたはキャプシドタンパク質をコードする。
当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、核酸またはポリペプチドが公知配列に対して配列同一性を有するかどうかを同定することができる。本明細書において用いられるパーセント同一性は、ＢＬＡＳＴＮを用いて他の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた場合に（適切なヌクレオチドの挿入または欠失を有する）、核酸またはそのフラグメントが、別の核酸に対して特定のパーセント同一性を共有することを意味する。２つの異なる核酸の間のパーセント同一性を決定するために、パーセント同一性は、ＢＬＡＳＴＮプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を用いて決定される。このプログラムは、インターネット上で国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公共用途のために利用可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２）。用いられるパラメーターは、以下の最も高い計算されたパーセント同一性（以下で計算される）を生じるあらゆる組み合わせであり、デフォルトのパラメーターを丸括弧内に示す：Ｐｒｏｇｒａｍ−−ｂｌａｓｔｎ Ｍａｔｒｉｘ−−０ ＢＬＯＳＵＭ６２ Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ−−０ ｏｒ １（１）Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａ ｍｉｓｍａｔｃｈ−−０，−１，−２ ｏｒ −３（−２）Ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ−−０，１，２，３，４ ｏｒ ５（５）Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ−−０ ｏｒ １（１）Ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ−−０ ｏｒ ５０（５０）Ｅｘｐｅｃｔ−−１０．
パーセント同一性または類似性は、ポリペプチドに関していう場合、問題とされるポリペプチドが、ＢＬＡＳＴＰを用いて決定される共通の長さにわたって別のタンパク質またはその部分と比較した場合に、特定のパーセント同一性または類似性を示すことを指す。このプログラムも、インターネット上で国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公共用途のために利用可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに関するパーセント同一性または類似性は、典型的に、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照。タンパク質分析ソフトウェアは、様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられる相同性の測定を用いて、類似の配列をマッチさせる。保存的置換は典型的に、以下の基における置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
特定の実施態様では、核酸は、制限されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むベクターを含んでよい、から本質的になってよい、またはからなってよい。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを含んでよい、からなってよい、または、から本質的になってよい。
一部の実施態様では、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列をさらに含む。例えば、核酸は、ウイルスストックを産生するためのヘルパー構築物であってよい。
また、本発明は、本発明の核酸を安定的に含むパッケージング細胞も提供する。例えば、核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得て、または、エピソーム形態（例えば、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」）で安定的に維持され得る。
核酸は、送達ベクター、例えばウイルス送達ベクター中に組み込むことができる。説明のために、本発明の核酸は、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、バキュロウイルス粒子、または任意の他の適切なウイルス粒子の中にパッケージすることができる。
さらに、核酸は、プロモーターエレメントと作動可能に結合され得る。プロモーターエレメントは、本明細書により詳細に説明される。
本発明はさらに、本発明のウイルスベクターを生産する方法を提供する。代表的な実施態様では、本発明は、組み換えウイルスベクターを生産する方法を提供し、当該方法は、インビトロで、細胞に、（ａ）（ｉ）異種核酸、および（ｉｉ）ウイルス粒子へのＡＡＶテンプレートのキャプシド形成に十分なパッケージングシグナル配列（例えば、１つまたは複数の（例えば、２つの）末端反復、例えばＡＡＶ末端反復）を含む、テンプレート、および、（ｂ）ウイルス粒子へのテンプレートの複製およびキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶキャプシドをコードするＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ配列）を、提供するステップを含む。テンプレートおよびＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、キャプシド内にパッケージされたテンプレートを含む組み換えウイルス粒子が、細胞内で生産されるような条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルス粒子を集めるステップをさらに含んでよい。ウイルス粒子は、培地から、および／または、細胞を溶解することによって、集められ得る。
１つの例示的な実施態様では、本発明は、ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を生産する方法を提供し、当該方法は、インビトロで、細胞に、本発明のキメラＡＡＶキャプシドをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列、異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、および、生産的ＡＡＶ感染を生じさせるためのヘルパー機能を提供するステップ；および、ＡＡＶキャプシドを含んでＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成するＡＡＶ粒子の集合を可能にするステップを含む。
細胞は典型的に、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞である。哺乳類の細胞のような、当技術分野で知られている任意の適切な細胞を用いてよい。複製−欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス−補完のパッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス−補完の細胞もまた、適切である。
ＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法により提供され得る。現行の方法は、典型的に、単一のプラスミド上にＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、そのようにすることが便利であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、複合型アデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失したアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域中に挿入される）。また、ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現してもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであることであり、継続的な細胞分裂全体を通じて高コピー数をさらに維持する（すなわち、ＥＢＶに基づく核エピソームと命名される染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる。
さらなる代替としては、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に保有（エピソームまたは組み込み）され得る。
典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＡＡＶパッケージング配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）に隣接しない。
テンプレート（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供することができる。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、テンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失したアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域へ挿入される）。別の説明としては、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５０２５は、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載する。また、ＥＢＶベクターを用いて、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述のようにテンプレートを送達してもよい。
別の代表的な実施態様では、テンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスにより提供される。さらに別の実施態様では、ＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体中に安定的に組み込まれる。
最大限のウイルス力価を得るためには、一般に、生産的なＡＡＶ感染に必須のヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供される。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５，および米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号により記載のように、効率的なＡＡＶ生産のために必要とされるヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に組み込まれた、または、安定的な染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー遺伝子を用いてパッケージング細胞によって提供され得る。代表的な実施態様では、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージすることができず、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接していない。
当業者は、単一のヘルパー構築物上に、ＡＡＶ複製およびキャプシド配列およびヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよいが、場合により、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含む複合型アデノウイルスまたは複合型ヘルペスウイルスである。
特定の一実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。このベクターは、ｒＡＡＶテンプレートをさらに含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）へ挿入され得る。
さらなる実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。ｒＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供される。
別の例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより提供されて、ｒＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞へ組み込まれる。あるいは、ｒＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメントとして細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される（例えば、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」として、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
さらなる例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供される。ｒＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供される。例えば、ｒＡＡＶテンプレートは、ｒＡＡＶ粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
前述の方法によれば、複合型アデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および、存在する場合は、ｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖に組み込まれて、５’および３’シス配列が隣接しているので、これらの配列はアデノウイルスキャプシドの中にパッケージされ得る。上述のように、代表的な実施態様では、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ＡＡＶパッケージング配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）が隣接しないので、これらの配列はＡＡＶビリオンの中にパッケージされない。
また、ヘルペスウイルスは、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして用いてもよい。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質（単数または複数）をコードする複合型ヘルペスウイルスは、よりスケーラブルなＡＡＶベクター生産スキームのために有利に促進し得る。ＡＡＶ−２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する複合型のＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６およびＷＯ ００／１７３７７、それらの開示は、それらの全体で本明細書中に援用される）。
さらなる代替としては、本発明のウイルスベクターを、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内で生産して、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５−４３により記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶテンプレートを送達することができる。
ＡＡＶを生産する他の方法は、安定的に形質転換されたパッケージング細胞を用いる（例えば、米国特許第５，６５８，７８５号を参照）。
混入ヘルパーウイルスがフリーのＡＡＶベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法により得てよい。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、ＡＡＶは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離してもよい（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。代表的な実施態様では、任意の混入ヘルパーウイルスが複製コンピテントではないように、欠失した複製−欠損ヘルパーウイルスが用いられる。さらなる代替としては、アデノウイルスの初期遺伝子の発現のみが、ＡＡＶウイルスのパッケージングを仲介するために必要なので、後期遺伝子の発現を欠くアデノウイルスヘルパーを用いてよい。後期遺伝子の発現を欠くアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。
本発明のパッケージング方法を用いて、ウイルス粒子の高力価ストックを生産し得る。特定の実施態様では、ウイルスストックは、少なくとも約１０５形質導入ユニット（ｔｕ）／ｍｌ、少なくとも約１０６ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０７ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０８ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０９ｔｕ／ｍｌ、または少なくとも約１０１０ｔｕ／ｍｌの力価を有する。
新規のキャプシドタンパク質およびキャプシド構造は、例えば、診断または治療的用途のため、または研究試薬としての、抗体を掲げる用途を見いだす。したがって、本発明は、本発明の新規のキャプシドタンパク質およびキャプシドに対する抗体も提供する。
本明細書において用いられる用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むすべてのタイプの免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはヒトを含む任意の種の起源であってよく、または、キメラ抗体であってよい。例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６，４０３−１１（１９８９）を参照。抗体は、例えば、米国特許第４，４７４，８９３号または米国特許第４，８１６，５６７号に開示の方法に従って生産される、組み換えモノクローナル抗体であってよい。また、抗体は、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示の方法に従って、化学的に構築することもできる。
本発明の範囲内に含まれる抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｃフラグメント、および、ＩｇＧ以外の抗体から得られる対応するフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、公知技術によって生産することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生産することができ、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生産することができる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ簡単な同定を可能にすることができる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２７５−１２８１）。
ポリクローナル抗体は、標的に対するモノクローナル抗体が結合する抗原を用いて、適切な動物（例えば、ウサギ、ヤギなど）を免疫化して、その動物から免疫血清を集め、そして、公知の手順に従って免疫血清からポリクローナル抗体を分離することにより生産することができる。
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２６５，４９５−９７の技術に従って、ハイブリドーマ細胞株内で生産することができる。例えば、適切な抗原を含む溶液をマウスに注入して、十分な時間後に、マウスを屠殺して脾臓細胞を得ることができる。それから、典型的にポリエチレングリコール存在下で、脾臓細胞を、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞と融合することにより不死化して、ハイブリドーマ細胞を生産する。それから、ハイブリドーマ細胞を適切な培地中で増殖させて、所望の特異性を有するモノクローナル抗体について上清をスクリーニングする。モノクローナルＦａｂフラグメントは、当業者に公知の組み換え技術によってＥ．ｃｏｌｉ内で生産することができる。例えば、Ｗ．Ｈｕｓｅ，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−８１を参照。
標的ポリペプチドに特異的な抗体は、当技術分野で知られているファージディスプレイ技術によって得ることもできる。
様々な免疫測定法をスクリーニングに用いて、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。特異性が確立されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いた競合結合または免疫放射定量測定法に関する非常に多くのプロトコルが、当技術分野でよく知られている。そのような免疫測定法は典型的に、抗原とその特異的な抗体との間の複合体形成（例えば、抗原／抗体複合体形成）の測定を伴う。２つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用した、２部位の、モノクローナルに基づく免疫測定法を、競合結合アッセイと同様に用いることができる。
抗体は、公知技術に従って、固体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンのような材料から形成された、ビーズ、プレート、スライドまたはウェル）にコンジュゲートすることができる。抗体は同様に、公知技術に従って、放射性ラベル（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素ラベル（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）、および蛍光ラベル（例えば、フルオレセイン）のような検出可能基に直接的または間接的にコンジュゲートすることができる。本発明の方法における、抗体／抗原複合体の形成の判定は、当技術分野で知られているように、例えば、沈殿、凝集、凝結、放射活性、発色現像または変化、蛍光、発光などの検出によるものであってよい。
ＩＩＩ．ＣＮＳを標的化したキメラＡＡＶキャプシドを用いる方法
また、本発明は、末梢臓器への送達を最小限にしながら、異種ヌクレオチド配列をＣＮＳへ送達する方法にも関する。例えば、ポリペプチドまたは核酸をインビトロで生産するため、または、エクスビボの遺伝子治療のために、本発明のウイルスベクターを用いて目的のヌクレオチド配列をインビトロでＣＮＳ細胞に送達し得る。ベクターは例えば治療的または免疫原性ポリペプチドまたは核酸を発現するために、ヌクレオチド配列を、それを必要とする対象に送達する方法において、さらに有用である。このように、ポリペプチドまたは核酸は、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが欠乏しているため、または、治療またはその他の方法として、およびさらに以下に説明されるとおり、対象におけるポリペプチドまたは核酸の生産が何らかの治療的効果を与え得るため、対象はポリペプチドまたは核酸が必要であり得る。
特定の実施態様では、ベクターは、ＣＮＳに有益な効果を提供するポリペプチドまたは核酸を発現するために、例えば、ニューロンまたはグリア細胞の増殖および／または分化を促進するために、有用である。ＣＮＳに対してベクターを標的化する能力は、ＣＮＳ機能障害を伴う疾患または障害を治療するために特に有用であり得る。他の実施態様では、ベクターは、ＣＮＳ内の細胞（例えば、ニューロンおよび／またはグリア細胞）に有益な効果を提供するポリペプチドまたは核酸を発現するために有用である。
したがって、本発明の一態様は、目的の核酸をＣＮＳ細胞に送達する方法に関し、当該方法は、ＣＮＳ細胞を本発明のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳類の対象において、目的の核酸をＣＮＳ細胞に送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象において、ＣＮＳ機能障害と関連する障害を治療する方法に関し、当該方法は、対象に、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子を投与するステップを含む。
ＣＮＳ障害は、限定されないが、思考および認識の障害、例えば、神経分裂症およびせん妄；健忘障害；気分障害、例えば、情動障害および不安障害（外傷後ストレス障害、分離不安障害、選択性無言症、反応性アタッチメント障害、常同性運動障害、パニック障害、広場恐怖症、特定の恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害、急性ストレス障害、全般的不安障害、物質により誘導される不安障害および／または特記されない不安障害を含む）；社会的行動の障害；学習および記憶の障害、例えば、学習障害（例えば、失読症）；運動能力障害；コミュニケーション障害（例えば、吃音）；広汎性発達障害（例えば、自閉性障害、レット障害（レット症候群）、小児期崩壊性障害、アスペルガー障害、および／または特記されない広汎性発達障害）および認知症を含む。したがって、用語「中枢神経障害」は、上記に挙げた障害、ならびに、抗鬱障害（大鬱病性障害、気分変調性障害、特記されない抗鬱障害、産後鬱を含む）；季節性情動障害；躁病；双極性障害（双極性障害Ｉ、双極性障害ＩＩ、気分循環性障害、特記されない双極性障害を含む）；注意欠陥および破壊的行動障害（多動性障害を有する注意欠陥障害、行為障害、反抗的行為障害および／または特記されない破壊的行動障害を含む）；薬剤依存症／物質乱用（アヘン、アンフェタミン、アルコール、幻覚剤、大麻、吸入剤、フェンシクリジン、鎮静剤、睡眠薬、精神安定剤および／またはコカインの乱用を含む）；アルコールにより誘導される障害；アンフェタミンにより誘導される障害；カフェインにより誘導される障害；大麻により誘導される障害；コカインにより誘導される障害；幻覚剤により誘導される障害；吸入剤により誘導される障害；ニコチンにより誘導される障害；オピオイドにより誘導される障害；フェンシクリジンにより誘導される障害；鎮静剤、睡眠薬または精神安定剤により誘導される障害；動揺；無気力；精神病；興奮性；脱抑制；統合失調症様障害；統合失調性感情障害；妄想性障害；簡易精神病性障害、共有精神病性障害；物質により誘導される精神病性障害；特記されない精神病性障害；単極性障害、気分障害（例えば、精神病性の特徴を有する気分障害）；身体表現性障害；虚偽性精神障害；解離性障害；精神遅滞；幼少または幼児期の感情および接触障害；摂食障害、例えば、神経性食欲不振、神経性過食症および／または特記されない摂食障害；睡眠障害（例えば、原発性不眠症、原発性過眠症、睡眠発作、呼吸関連睡眠障害および概日リズム睡眠障害および／または睡眠時随伴症のような睡眠異常）；衝動制御障害（例えば、盗癖、放火狂、抜毛癖、病的賭博および／または間欠性爆発性障害）；適応障害；人格障害（例えば、妄想性人格障害、分裂病質人格障害、統合失調症性人格障害、反社会的人格障害、境界性人格障害、演技性人格障害、自己愛性人格障害、回避性人格障害、依存性人格障害および／または強迫性人格障害）；チック障害（例えば、トゥレット障害、慢性運動または発声チック障害、一過的なチック障害および／または特記されないチック障害）；除去障害；および、前述の任意の組み合わせ、ならびに、任意の他の障害またはＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ − Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＤＳＭ−ＩＶ；ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９４）に記載される障害群を包含する。また、「中枢神経障害」は、制限されないが、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、不随意運動障害、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などを含む、ＣＮＳを関与させる他の病状も含む。他のＣＮＳ障害は、制限されずに、てんかん、多発性硬化症、神経原性疼痛、心因性疼痛、および片頭痛を含む。
一実施態様では、ＣＮＳ機能障害と関連する障害は、脱髄性疾患である。一実施態様では、ＣＮＳ機能障害と関連する障害は、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッハー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、ツェルウェガー病、１８ｑ−症候群、脳性麻痺、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、フェニールケトン尿症、またはウイルス感染、または、ＣＮＳ機能障害と関連することが公知または後に見いだされる任意の他の障害である。別の実施態様では、本発明の方法を用いて、ＣＮＳ機能障害と直接関連しないがＣＮＳ細胞における異種ポリペプチドまたは核酸の発現により恩恵を受ける障害を治療する。例示は、制限されずに、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、ＣＮＳ腫瘍、および他のＣＮＳ障害を含む。
他の実施態様では、ＣＮＳ障害は、前述の疾患の任意のサブセットを包含し、または、前述の症状の任意の１つまたは複数を除外する。特定の実施態様では、用語「中枢神経障害」は、ＣＮＳの良性および／または悪性腫瘍を含まない。
特定の実施態様では、ＣＮＳ障害は、レット症候群である。さらなる実施態様では、本発明は、それを必要とする哺乳類の対象におけるレット症候群を治療する方法に関する。特定の実施態様では、当該方法は、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子、例えば、メチルシトシン結合タンパク質２をコードする核酸を含むＡＡＶ粒子を投与するステップを含む。
本発明の別の態様では、本発明のキメラＡＡＶキャプシドおよびベクターは、以下に述べるように、１つまたは複数の末梢臓器または組織の標的化に望ましい向性プロファイルにさらに改変することができる、完全またはほぼ完全に脱標的化されたベクターである。この態様では、本発明は、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞の中に異種ヌクレオチド配列を送達する方法にも関する。例えば、インビトロでポリペプチドを生産するため、またはエクスビボでの遺伝子治療のために、本発明のウイルスベクターを用いて目的のヌクレオチド配列をインビトロで細胞に送達し得る。ベクターは、例えば、治療的または免疫原性ポリペプチドまたは核酸を発現するために、ヌクレオチド配列を、それを必要とする対象に送達する方法において、さらに有用である。このような方法で、ポリペプチドまたは核酸は、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが欠乏しているため、または、治療またはその他の方法として、およびさらに以下に説明されるとおり、対象におけるポリペプチドまたは核酸の生産が何らかの治療的効果を与え得るため、対象はポリペプチドまたは核酸が必要であり得る。
一般に、本発明のウイルスベクターを用いて、生物学的効果を有する任意の外来核酸を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害と関連する症候が治療または改善され得る。さらに、本発明を用いて、治療的ポリペプチドを送達することが有益である任意の病状を治療することができる。例示的な病状は、限定されないが：嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（ＩＸ因子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来の神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（制限されずに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ、繰り返しを取り除くマイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含む、抑制ＲＮＡ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経障害、癌（エンドスタチン、アンギオスタシン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；制限されずに、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、ＶＥＧＦに対する抑制ＲＮＡを含むアンチセンスＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含む、抑制ＲＮＡ、多剤耐性遺伝子産物または癌免疫原）、糖尿病（インスリン、ＰＧＣ−α１、ＧＬＰ−１、ミオスタチンプロ−ペプチド、グルコース輸送体４）、ＤｕｃｈｅｎｎｅおよびＢｅｃｋｅｒを含む筋ジストロフィー（例えば、ジストロフィン、ミニ−ジストロフィン、マイクロ−ジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する、抑制ＲＮＡ［例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ］、ラミニン−α２、フクチン関連タンパク質、ドミナントネガティブミオスタチン、ホリスタチン、２型アクチビン可溶性受容体、抗−炎症性ポリペプチド、例えば、Ｉｋａｐｐａ Ｂドミナント突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニ−ユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子内のスプライス部位に対する、抑制ＲＮＡ［例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ］［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照］、エクソンスキッピングを誘導するための、Ｕ７ ｓｎＲＮＡに対する抑制ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ］［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照］、および、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、フルラ―病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリ病［α−ガラクトシダーゼ］およびポンぺ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］）、および、他のリソソーム蓄積症およびグリコーゲン蓄積症を含む他の代謝欠陥、先天性気腫（α１−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、メープルシロップ尿症（分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（および、眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性に関して、ＰＤＧＦ、エンドスタチンおよび／またはアンギオスタシン）、脳のような固形臓器の疾患（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタシンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、グリア芽腫［エンドスタチン、アンギオスタシンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓（肝炎Ｂおよび／または肝炎Ｃ遺伝子に関する、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）、腎臓、心臓、以下を含む、鬱血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ［Ｉ−１］、ホスホランバン、ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ［ｓｅｒｃａ２ａ］、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣＦ−ＳＯＤ、カルクレイン、チモシン−β４、低酸素誘導性転写因子［ＨＩＦ］、βａｒｋｃｔ、β２−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体キナーゼ［βＡＲＫ］、ホスホイノシチド−３キナーゼ［ＰＩ３キナーゼ］、カルサルシン、血管形成因子、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、６型アデニリルシクラーゼ、２型Ｇ−タンパク質共役受容体キナーゼのノックダウンを作動する分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、ホスホランバンに対する抑制ＲＮＡ［例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ］；ホスホランバン抑制またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅなどの送達による）、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓの送達による）、心臓移植の生存改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ、ミオスタチンプロ−ペプチド、抗−アポトーシス因子、ホリスタチン）、肢虚血（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＧＣ−１α、ＥＣ−ＳＯＤ、ＨＩＦ）、腎臓欠乏（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗−炎症性因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体）、肝炎（α−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠乏（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む、脊椎大脳性運動失調、フェニールケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などを含む。さらに、本発明は、臓器移植後に用いて、移植の成功を高めることができ、および／または、臓器移植のネガティブな副作用または補助療法を減らすことができる（例えば、免疫抑制剤または阻害性の核酸を投与して、サイトカイン産生を阻止することによる）。別の例としては、骨形態形成タンパク質（ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）は、例えば、癌患者における骨折（ｂｒｅａｋ）または外科的除去後に、骨の同種移植片とともに投与することができる。
本発明に従って治療することのできる例示的なリソソーム病は、制限されずに：フルラー症候群（ＭＰＳ ＩＨ）、シャイエ症候群（ＭＰＳ ＩＳ）、およびフルラー−シャイエ症候群（ＭＰＳ ＩＨ／Ｓ）（α−Ｌ−イズロニダーゼ）；ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）（イズロネートサルフェートスルファターゼ）；サンフィリポＡ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）（ヘパラン−Ｓ−サルフェートサルファミニダーゼ）、サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ）、サンフィリポＣ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＣ）（アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ）、サンフィリポＤ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＤ）（Ｎ−アセチル−グルコサミン−６−サルフェートスルファターゼ）；モルキオＡ疾患（ＭＰＳ ＩＶＡ）（ガラクトサミン−６−サルフェートスルファターゼ）、モルキオＢ疾患（ＭＰＳ ＩＶＢ）（β−ガラクトシダーゼ）；Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−ｌｍａｙ疾患（ＭＰＳ ＶＩ）（アリールスルファターゼＢ）；Ｓｌｙ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）（β−グルクロニダーゼ）；ヒアルロニダーゼ欠乏（ＭＰＳ ＩＸ）（ヒアルロニダーゼ）；シアリドーシス（ムコリピドーシスＩ）、ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ−細胞疾患）（Ｎ−アクチルグルコス（ａｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓ）−アミニル（ａｍｉｎｙｌ）−１−ホスホトランスフェラーゼ触媒サブユニット）、ムコリピドーシスＩＩＩ（偽性ハーラー・ポリジストロフィー）（Ｎ−アセチルグルコース−アミニル−１−ホスホトランスフェラーゼ；ＩＩＩＡ型［触媒サブユニット］およびＩＩＩＣ型［基質認識サブユニット］）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（ガングリオシドβ−ガラクトシダーゼ）、Ｉ型ＧＭ２ガングリオシドーシス（テイ・サックス病）（β−ヘキサミニダーゼＡ）、ＩＩ型ＧＭ２ガングリオシドーシス（サンドホフ病）（β−ヘキソサミニダーゼＢ）；ニーマン・ピック病（Ａ型およびＢ型）（スフィンゴミエリナーゼ）；ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）；ファーバー病（セラミニダーゼ）；ファブリ―病（α−ガラクトシダーゼＡ）；クラッベ病（ガラクトシルセラミドβ−ガラクトシダーゼ）；異染性白質ジストロフィー（アリールスルファターゼＡ）；ウォルマン病を含むリソソーム酸リパーゼ欠乏（リソソーム酸リパーゼ）；バッテン病（若年性ニューロンセロイドリポフスチン沈着症）（リソソーム膜貫通ＣＬＮ３タンパク質）シアリドーシス（ノイラミニダーゼ１）；ガラクトシアリドーシス（ゴールドバーグ症候群）（防御タンパク質／カテプシンＡ）；α−マンノシドーシス（α−Ｄ−マンノシダーゼ）；β−マンノシドーシス（β−Ｄ−マンノシドーシス）；フコシドーシス（α−Ｄ−フコシダーゼ）；アスパルチルグルコサミン尿症（Ｎ−アスパルチルグルコサミニダーゼ）；およびシアル酸尿症（リン酸ナトリウム共輸送体）を含む。
本発明に従って治療することのできる例示的な糖原病は、限定されないが、Ｉａ型ＧＳＤ（フォン・ギールケ病）（グルコース−６−ホスファターゼ）、Ｉｂ型ＧＳＤ（グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ）、Ｉｃ型ＧＳＤ（ミクロソームリン酸またはピロリン酸トランスポーター）、Ｉｄ型ＧＳＤ（ミクロソームグルコース輸送体）、ポンぺ病または幼児期のＩＩａ型ＧＳＤ（リソソーム酸α−グルコシダーゼ）およびＩＩｂ型（Ｄａｎｏｎ）（リソソーム膜タンパク質−２）を含むＩＩ型ＧＳＤ、ＩＩＩａ型およびＩＩＩｂ型ＧＳＤ（脱分枝酵素；アミログルコシダーゼおよびオリゴグルカノトランスフェラーゼ）、ＩＶ型ＧＳＤ（アンダーソン病）（分岐酵素）、Ｖ型ＧＳＤ（マッカードル病）（筋ホスホリラーゼ）、ＶＩ型ＧＳＤ（ハース病）（肝臓ホスホリラーゼ）、ＶＩＩ型ＧＳＤ（垂井病）（ホスホフルクトキナーゼ）、ＶＩＩＩ／ＩＸａ型ＧＳＤ（Ｘ−結合ホスホリラーゼキナーゼ）、ＩＸｂ型ＧＳＤ（肝臓および筋ホスホリラーゼキナーゼ）、ＩＸｃ型ＧＳＤ（肝臓ホスホリラーゼキナーゼ）、ＩＸｄ型ＧＳＤ（筋ホスホリラーゼキナーゼ）、ＧＳＤ Ｏ（グリコーゲンシンターゼ）、ファンコニ−ビッケル症候群（グルコース輸送体−２）、ホスホグルコイソメラーゼ欠乏、筋ホスホグリセレートキナーゼ欠乏、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠乏、フルクトース１，６−ジホスファターゼ欠乏、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ欠乏、および乳酸デヒドロゲナーゼ欠乏を含む。
心筋に送達することのできる核酸およびポリペプチドは、損傷、悪化または機能退化した心筋および／または先天性心臓欠陥の治療に有益であるものを含む。例えば、心疾患の治療において血管新生を促進するのに有用な血管新生因子は、限定されないが、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦＩＩ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１３８、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ １α）、内皮ＮＯシンターゼ（ｅＮＯＳ）、ｉＮＯＳ、ＶＥＦＧＲ−１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、アンギオジェニン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アンジオポエチン、血小板由来成長因子、血管新生因子、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血管透過性因子（ＶＰＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮成長因子（ＰＤ−ＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、散乱因子（ＳＦ）、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｔｒｏｐｈｉｎ）、プロリフェリン、ホリスタチン、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ミドカイン、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）、フラクタルカイン、ＩＣＡＭ−１、アンジオポエチン−１および−２（Ａｎｇ１およびＡｎｇ２）、Ｔｉｅ−２、ニューロピリン−１、ＩＣＡＭ−１、ケモカイン、および、平滑筋細胞、単球、または白血球遊走を刺激するサイトカイン、抗−アポトーシスのペプチドおよびタンパク質、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−１ｂ、ＦＧＦ−１ｃ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２ｂ、ＦＧＦ−２ｃ、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−３ｂ、ＦＧＦ−３ｃ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、単球走化性タンパク質−１、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−２、初期増殖応答因子−１（ＥＧＲ−１）、ＥＴＳ−１、ヒト組織カルクレイン（ＨＫ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ、キマーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子およびヘパリナーゼを含む（例えば、米国特許出願番号２００６０２８７２５９および米国特許出願番号２００７００５９２８８を参照）。
成人に見られる最も一般的な先天性心疾患は、二尖大動脈弁であり、一方で、心房中隔欠損は、成人に見られる先天性心疾患の３０〜４０％を占める。小児科の集団において見られる最も一般的な先天性心臓欠陥は、心室中隔欠損である。他の先天性心疾患は、アイゼンメンゲル症候群、動脈管開存症、肺狭窄、大動脈縮窄、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、単心室症、エブスタイン奇形、および両大血管右室起始症を含む。多くの研究が、これらの先天性心疾患の１つまたは複数と関連する推定遺伝子座を特定している。例えば、ダウン症候群と関連する先天性心疾患に関する推定の遺伝子（単数または複数）は、ＥＴＳ２およびＭＸ１の間の２１ｑ２２．２−ｑ２２．３である。同様に、ディジョージ症候群のほとんどのケースは、染色体２２ｑ１１．２（ディジョージ症候群染色体領域、またはＤＧＣＲ）の欠失に起因する。いくつかの遺伝子が、推定の転写因子ＴＵＰＬＥ１を含むこの欠失において失われる。この欠失は、様々な表現型、例えば、シュプリンツェン症候群；円錐動脈幹異常顔貌（またはＴａｋａｏ症候群）；および、ファロー四徴症、総動脈幹症、および大動脈弓離断症を含む、心臓の単離された流出路欠陥と関連する。前述の障害の全ては、本発明に従って治療することができる。
心臓および血管系の他の重大な疾患は、遺伝子の、典型的に多遺伝子の、病因学の構成要素を有するとも考えられる。これらの疾患は、例えば、左心低形成症候群、心臓弁異形成症、パイフェル心腎臓症候群、ｏｃｕｌｏｆａｃｉｏｃａｒｄｉｏｄｅｎｔａｌ症候群、ケーパー−トリエロ症候群、Ｓｏｎｏｄａ症候群、Ｏｈｄｏ眼裂縮小症候群、心手症候群、ピエール・ロバン症候群、ヒルシュスプルング病、Ｋｏｕｓｓｅｆｆ症候群、Ｇｒａｎｇｅ閉塞性動脈症候群、カーンズ・セイヤー症候群、カルタゲナー症候群、アラジール症候群、リッチャー‐スキンゼル症候群、イーヴェマルク症候群、ヤング・シンプソン症候群、ヘマクロマトーシス、Ｈｏｌｚｇｒｅｖｅ症候群、バース症候群、スミス−レムリ−オピッツ症候群、糖原病、ゴーシェ様の疾患、ファブリ病、Ｌｏｗｒｙ−Ｍａｃｌｅａｎ症候群、レット症候群、オピッツ症候群、マルファン症候群、ミラー・ディカー脳回欠損症候群、ムコ多糖症、ブルガダ症候群、ｈｕｍｅｒｏｓｐｉｎａｌ骨形成不全、ファバー症候群、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ症候群、マルファン様過可動症候群、無トランスフェリン血症、コルネリア・デ・ランゲ症候群、レパード症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ症候群、早老症、およびウィリアムズ・ボイレン候群を含む。これらの障害の全ては、本発明に従って治療することができる。
抗アポトーシス因子は、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋へ送達して、筋消耗疾患、肢虚血、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患および／またはＩ型またはＩＩ型糖尿病を治療することができる。
骨格筋へ送達することのできる核酸は、損傷、悪化または機能退化した骨格筋の治療に有益であるものを含む。筋ジストロフィーを引き起こす遺伝子欠陥は多くの形態の疾患に関して知られている。これらの欠損遺伝子は、タンパク質産物を生産することができないか、適切に機能することのできないタンパク質産物を生産するか、または、細胞の適切な機能を妨げる機能障害性のタンパク質産物を生産するかのいずれかである。異種核酸は、機能障害性のタンパク質の生産または活性を阻害する、治療的に機能性のタンパク質またはポリヌクレオチドをコードし得る。生じた核酸から発現され得る、または、生じた核酸によって（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの送達によって）阻害され得るポリペプチドは、制限されずに、ジストロフィン、ミニ−ジストロフィンまたはマイクロ−ジストロフィン（Ｄｕｃｈｅｎｅ’ｓ ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ ＭＤ）；ジストロフィン関連糖タンパク質β−サルコグリカン（肢帯ＭＤ ２Ｅ）、δ−サルコグリカン（肢帯ＭＤ ２ ２Ｆ）、α−サルコグリカン（肢帯ＭＤ ２Ｄ）およびγ−サルコグリカン（肢帯ＭＤ ２Ｃ）、ユートロフィン、カルパイン（２Ａ型常染色体劣性肢帯ＭＤ）、カベオリン−３（常染色体優性の肢帯ＭＤ）、ラミニン−α２（メロシン−欠損先天性ＭＤ）、ミニアグリン（ラミニン−α２欠損先天性ＭＤ）、フクチン（福山型先天性ＭＤ）、エメリン（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ＭＤ）、ミオチリン、ラミンＡ／Ｃ、カルパイン−３、ジスフェリン、および／またはテレソニンを含む。さらに、異種核酸は、欠損ジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導するために、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ、または、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−２０８をコードし得る。
特定の実施態様では、核酸は、（例えば、ジストロフィー性の舌を治療するために）舌筋に送達される。舌へ送達する方法は、舌への直接的な注射、経口投与、局所投与や、静脈内投与、関節内投与などを含む、当技術分野で知られている任意の方法によるものでよい。
また、前述のタンパク質を横隔膜筋へ投与して、筋ジストロフィーを治療することもできる。
あるいは、任意の他の治療的ポリペプチドをコードする遺伝子導入ベクターが投与され得る。
特定の実施態様では、本明細書に記載の目的の核酸を、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋へ送達するために、例えば、これらの組織の１つまたは複数と関連する障害、例えば、筋ジストロフィー、心疾患（ＰＡＤおよび鬱血性心不全を含む）などを治療するために、本発明に係るウイルスベクターを用いる。
遺伝子導入は、病状に関する治療の提供および理解において、実質的な潜在的用途を有する。欠損遺伝子が公知かつクローン化されている多くの遺伝性疾患が存在する。一般に、上記の病状は、２つのクラスに分類される：一般に劣性様式での遺伝性である、通常は酵素の欠乏状態、および、典型的に優勢の様式で遺伝性である、調節性または構造的タンパク質が関わり得る不平衡状態。欠乏状態の疾患については、補充療法のために、遺伝子導入を用いて、影響を受けた組織中に正常な遺伝子を運ぶことができ、ならびに、抑制ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを用いて、疾患に関する動物モデルを作ることができる。不平衡病状については、遺伝子導入を用いて、モデル系において病状を作ることができ、それから、病状を解消する目的で用いることができる。したがって、本明細書に係るウイルスベクターは、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書において用いられる病状は、疾患を引き起こしまたはそれをより重症にさせる欠乏または不平衡を、部分的または全体的に治療することにより治療される。突然変異を引き起こすための、または、欠陥を直す、ための、核酸配列の部位特異的組み換えの使用も可能である。
また、本発明に係るウイルスベクターを用いて、アンチセンス核酸または抑制ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を、インビトロまたはインビボで細胞に提供してもよい。標的細胞での抑制ＲＮＡの発現は、細胞による特定のタンパク質（単数または複数）の発現を低減させる。したがって、抑制ＲＮＡを投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させ得る。また、抑制ＲＮＡをインビトロで細胞に投与して、細胞の生理機能を調節し得て、例えば、細胞または組織培養系を最適化し得る。
さらなる態様として、本発明のウイルスベクターを用いて、対象において免疫応答を生じさせ得る。この実施態様によれば、免疫原をコードする核酸を含むウイルスベクターが対象に投与され得て、対象による免疫原に対する能動免疫応答（場合により、防御免疫応答）が高まり得る。免疫原は、以上に記載のとおりである。
あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与してよく、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸が細胞中に導入されて、細胞が対象に投与されて、そこで、免疫原をコードする異種核酸が場合により発現されて、対象において、免疫原に対して免疫応答を誘導する。特定の実施態様では、細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、免疫原と遭遇した後の宿主組織および細胞の「関与により特徴付けられる。それは、リンパ細網組織内の免疫担当細胞の分化および増殖に関与し、抗体の合成または細胞が仲介する反応性の進行、またはその両方をもたらす。」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。別の言い方をすると、能動免疫応答は、感染により、またはワクチン接種により、免疫原に曝露された後に、宿主によって高められる。能動免疫は、「予め作られた物質（抗体、伝達因子、胸腺移植片、インターロイキン−２）の、能動免疫された宿主から免疫されていない宿主への伝達」を通して獲得される、受動免疫と対照され得る。同上。
本明細書において用いられる「防御」免疫応答または「防御」免疫は、免疫応答が、疾患の発生率を防ぐまたは低下させるという点で対象に何らかの利益を与えることを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、（例えば、癌または腫瘍の回帰を生じさせることにより、および／または、転移を防止することにより、および／または、転移性小瘤の成長を防止することにより）、疾患、特に癌または腫瘍の治療において有用であり得る。防御効果は、治療の利益が、その任意の不利な点に勝る限り、完全または部分的であってよい。
また、本発明のウイルスベクターは、癌細胞抗原（または免疫学的に同様の分子）または癌細胞に対して免疫応答を生じる任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与による癌免疫療法のために、投与してもよい。説明すると、免疫応答は、例えば、癌を有する患者を治療するために、癌細胞抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを投与することにより、対象において癌細胞抗原に対して生じ得る。ウイルスベクターは、本明細書に記載されるように、インビボで、またはエクスビボでの方法を用いることにより、対象に投与され得る。
本明細書において用いられる用語「癌」は、腫瘍を形成する癌を含む。同様に、用語「癌性組織」は、腫瘍を含む。「癌細胞抗原」は、腫瘍抗原を含む。
用語「癌」は、体の離れた部位に広がる潜在性を有する（すなわち、転移する）無制御な組織増殖のような、当技術分野で理解されているその意味を有する。例示的な癌は、限定されないが、白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンのリンパ腫）、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、脳腫瘍（例えば、グリオーマおよび膠芽腫）、骨癌、肉腫、メラノーマ、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌などを含む。本発明の実施態様では、本発明は、腫瘍を形成する癌を治療および／または予防するために実施される。
また、用語「腫瘍」は、当技術分野において、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊としても理解される。腫瘍は、悪性または良性であってよい。代表的な実施態様では、本明細書に開示される方法を用いて、悪性腫瘍が予防および治療される。
癌細胞抗原は、以上に説明されている。用語「癌を治療する」または「癌の治療」により、癌の重症度が低下すること、または、癌が予防され、または少なくとも部分的に除去されることが意図される。例えば、特定の文脈では、これらの用語は、癌の転移が、予防または低下または少なくとも部分的に除去されることを示す。さらに代表的な実施態様では、これらの用語は、転移性小瘤の成長（例えば、原発性腫瘍の外科的除去後）が、予防または低下または少なくとも部分的に除去されることを示す。用語「癌の予防」または「癌を予防する」により、当該方法が、癌の発生率または発症を少なくとも部分的に除去または低下させることが意図される。別の言い方をすると、対象における癌の発症または進行が、遅くなり、制御され、可能性または蓋然性が低減され、または遅延され得る。
特定の実施態様では、細胞は、癌を有する対象から取り出されて、本発明に係るウイルスベクターと接触され得る。それから、改変された細胞が対象に投与されて、それにより、癌細胞抗原に対する免疫応答が誘発される。この方法は、インビボで十分な免疫応答を高めることができない（すなわち、高い抗体を十分な量で生産することができない）免疫不全の対象で特に有利に用いられる。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性タンパク質−１、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）によって高められ得ることが、当技術分野で知られている。したがって、免疫調節性サイトカイン（例えば、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターとともに対象に投与され得る。
サイトカインは、当技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得て、またはあるいは、サイトカインをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターを用いて対象に送達され得て、そして、サイトカインがインビボで生産される。
ウイルスベクターは、研究目的のために、例えば、インビトロまたは動物でのＣＮＳ機能の研究のために、または、疾患の動物モデルの作製および／または研究における使用のために、ＣＮＳ細胞を標的化するのにさらに有用である。例えば、外傷性脳損傷または脊髄損傷のような神経損傷の動物モデル、または、神経変性疾患の動物モデルにおいて、ベクターを用いて、異種核酸をニューロンに送達することができる。例えば、脱髄性疾患の動物モデルにおいて、ベクターを用いて、異種核酸をオリゴデンドロサイトに送達することができる。脱髄は、制限されずに、ウイルス（例えば、セムリキウイルス、ミューリン肝炎ウイルス、またはタイラーミューリン脳脊髄炎ウイルス）の投与、および、化学物質（例えば、クプリゾン、エチジウムブロマイド、またはリゾレシチン）の投与を含む様々な手段によって、動物において誘導することができる。一部の実施態様では、ベクターは、実験的な自己免疫性脳脊髄炎の動物モデルにおいて用いることもできる。この状態は、例えば、カイナイト、ＳＩＮ−１、抗ガラクトセレブロシドの投与、または照射によって誘導することができる。他の実施態様では、細胞の一部または全てを殺すために、毒性薬剤または毒性薬剤を生産する酵素（例えば、チミジンキナーゼ）を、ウイルスベクターを用いてオリゴデンドロサイトに特異的に送達することができる。
さらに、本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法でのさらなる用途を見いだし、それにより、目的の遺伝子が、一時的または安定的に、細胞培養系、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて発現される。また、本発明を実施して、例えば、実験、産業または市販目的のためのタンパク質生産の目的のために、核酸を送達することができる。
本発明に係る組み換えウイルスベクターは、獣医および医療用途の両方での用途を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスターなど）などを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、年少者、および成人を含む。場合により、例えば、対象は、本明細書に記載されるものを含む障害を有する、またはそのリスクがあると考えられるため、または、本明細書に記載されるものを含む核酸の送達から恩恵を受けるため、対象は、本発明の方法「を必要とする」。例えば、特定の実施態様では、対象は、脱髄性障害または脊髄または脳損傷を有していて（または有していたことがあり）、または、それらのリスクがある。さらなる選択肢としては、対象は、実験動物および／または疾患の動物モデルであってよい。
特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明のウイルスベクター、および、場合により、他の薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射については、担体は典型的に液体である。投与の他の方法については、担体は、固形または液体のいずれかであってよい。吸入投与については、担体は呼吸に適していて、好ましくは固形または液体の微粒子形態である。
「薬学的に許容できる」によって、毒性またはその他の望ましくないものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
本発明の一態様は、ヌクレオチド配列をインビトロで細胞に移行させる方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法に従って、感染の適切な多様性で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターまたはキャプシドの力価は、標的の細胞型および数、および、特定のウイルスベクターまたはキャプシドに応じて変更することができ、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。特定の実施態様では、少なくとも約１０３の感染ユニット、より好ましくは少なくとも約１０５感染ユニットが、細胞に導入される。
ウイルスベクターを導入することができる細胞（単数または複数）は、制限されないが、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、具体的には、脳細胞、例えば、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、星状細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管および筋線維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば、軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む）、生殖細胞などを含む、任意のタイプであってよい。あるいは、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる代替としては、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であってよい。さらに、さらなる代替としては、細胞は、癌または腫瘍細胞（癌および腫瘍は上述される）であってよい。さらに、細胞は、上記に示された起源の任意の種由来であってよい。
ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は、対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞が対象の中に戻される。エクスビボでの治療のために対象から細胞を取り出して、その後に対象の中に戻し入れる方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、別の対象由来の細胞の中に、培養細胞の中に、または、任意の他の適切な起源からの細胞の中に導入されて、細胞は、それを必要とする対象に投与される。
エクスビボでの遺伝子治療に適切な細胞は、上述のとおりである。対象に投与する細胞の用量は、対象の年齢、状態および種、細胞のタイプ、細胞により発現される核酸、投与方法などに基づき変化する。典型的に、薬学的に許容できる担体中、少なくとも約１０２〜約１０８または約１０３〜約１０６の細胞が、投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、製剤担体と組み合わせて有効量で対象に投与される。
一部の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入されている細胞が投与されて、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子としてまたはキャプシド内に発現される）に対する免疫原性応答を誘発し得る。典型的には、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、有効量のポリペプチドを発現する細胞の量が投与される。場合により、用量は、防御免疫応答（上記に定義される）を生じるのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益が、その任意の不利な点に勝る限り、完全または永久である必要はない。
本発明のさらなる態様は、本発明のキャプシドまたはウイルスベクターを対象に投与する方法である。特定の実施態様では、当該方法は、目的の核酸を動物対象に送達する方法を含み、当該方法は、有効量の本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与するステップを含む。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。場合により、ウイルスベクターは、効果的な投与量で、薬学的に許容できる担体中で送達される。
さらに、本発明のウイルスベクターを対象に投与して、免疫原性応答（例えば、ワクチンとして）を誘発することができる。典型的に、本発明のワクチンは、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、有効量のウイルスを含む。場合により、用量は、防御免疫応答（上記に定義される）を生じるのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益が、その任意の不利な点に勝る限り、完全または永久である必要はない、対象および免疫原は、上述のとおりである。
対象に投与されるウイルスベクターの用量は、投与方法、治療される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達される核酸に依存し、日常的な方法で決定することができる。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入ユニットまたはそれより多く、好ましくは、約１０７または１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４形質導入ユニット、さらにより好ましくは、約１０１２形質導入ユニットのウイルス力価である。
特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）を用いて、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成し得る。
例示的な投与方法は、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾル経由）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面の両方へ、気道表面を含む、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳へ）を含む。また、投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節の中またはその付近）に対するものであってもよい。任意の所定のケースにおける最も適切な経路は、治療される症状の性質および重症度、および、用いられる特定のベクターの性質に依存する。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、例えば、脳または脊髄に直接投与される。直接投与は、特異性の高いＣＮＳ細胞の形質導入をもたらすことができ、例えば、ここで、形質導入された細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くが、ＣＮＳ細胞である。ベクターを直接ＣＮＳに投与するための、当技術分野で知られている任意の方法を用いることができる。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む大脳、皮質、基底核、海馬および扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘へ導入され得る。また、ベクターは、網膜、角膜または視神経のような眼の異なる領域にも投与され得る。ベクターは、ベクターの投与をより分散させるために、（例えば、腰椎穿刺によって）脳脊髄液中に送達され得る。
送達ベクターは、制限されないが、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達またはそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で知られている任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）に投与され得る。
典型的に、ウイルスベクターは、液体製剤中で、直接的な注入（例えば、定位的な注入）によって、ＣＮＳ内の所望の領域または区画に投与される。一部の実施態様では、ベクターは、リザーバーおよび／またはポンプを介して送達することができる。他の実施態様では、ベクターは、所望の領域に対する局所適用によって、または、エアロゾル製剤の経鼻内投与によって、提供され得る。眼または耳の中への投与は、液体の液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替としては、ベクターは、固形の徐放製剤として投与され得る。パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの制御放出は、国際特許公報ＷＯ ０１／９１８０３に記載される。
対象が損なわれている血液脳関門（ＢＢＢ）を有する一部の実施態様では、ウイルスベクターは、対象に、全身性（例えば、静脈内）に送達することができ、ここで、ベクターは、ＢＢＢ損傷（ＢＢＢ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）の領域（例えば境界）において、ＣＮＳ細胞を形質導入する。特定の実施態様では、ベクターは、損なわれている領域内の細胞を形質導入するが、損なわれていない領域内の細胞を形質導入しない。したがって、本発明の一態様は、哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子を静脈内投与するステップを含む。
一部の実施態様では、ＢＢＢにおける損傷は、疾患または障害に起因する。例示は、制限されずに、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、疾患、筋萎縮性側索硬化症、および多発性硬化症、てんかん、ＣＮＳ腫瘍、または脳梗塞を含む。他の実施態様では、ＢＢＢ損傷は、例えばＣＮＳへの薬剤の送達を促進するための、誘導された破壊であり得る。一時的なＢＢＢ損傷は、例えば、毒性化学物質（例えば、メトラゾール、ＶＰ−１６、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、フルオロウラシル、およびエトポシド）、浸透性薬剤（例えば、マンニトールおよびアラビノース）、生物学的薬剤（例えば、レチノイン酸、ホルボールミリステートアセテート、ロイコトリエンＣ４、ブラジキニン、ヒスタミン、ＲＭＰ−７、およびアルキルグリセロール）、または照射（例えば、超音波または電磁気放射線）によって誘導され得る。
本発明に係る骨格筋への投与は、制限されないが、手足（例えば、上腕、前腕、上肢、および／または下肢）、背中、首、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指における、骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋組織は、限定されないが、小指外転筋（手）、小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足外転骨（ａｂｄｕｃｔｏｒ ｏｓｓｉｓ ｍｅｔａｔａｒｓｉ ｑｕｉｎｔｉ）、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手）、短小指屈筋（足）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、 大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｉ）、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、眼窩下筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第３腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、後頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および小頬骨筋、および当技術分野で知られている任意の他の適切な骨格筋を含む。
ウイルスベクターは、制限されずに、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、単離された手足灌流（足および／または腕；例えばＡｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８−３４６４を参照）、および／または直接的な筋肉内注入を含む、任意の適切な方法によって、骨格筋に送達することができる。
心筋への投与は、制限されずに、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与を含む。ウイルスベクターは、例えば、静脈内投与、大動脈内投与、例えば、動脈内投与、（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）直接的な心臓注入、および／または冠動脈灌流を含む、当技術分野で知られている任意の方法によって、心筋に送達することができる。
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む、任意の適切な方法によるものであってよい。
また、任意のこれらの組織への送達は、骨格、心臓および／または横隔膜筋の組織の中に埋め込むことのできるウイルスベクターを含むデポーを送達することによって達成することもでき、または、組織は、ウイルスベクターを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触することができる。そのような実施可能なマトリックスまたは基質の例は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている）。
特定の実施態様では、本発明に係るウイルスベクターは、（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患［例えば、ＰＡＤまたは鬱血性心不全］を治療するために）、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される。
本発明を用いて、骨格、心臓および／または横隔膜筋の障害を治療することができる。あるいは、本発明を実施して、骨格、心臓および／または横隔膜筋に核酸を送達することができ、血液内を正常に循環する非翻訳ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）またはタンパク質産物（例えば、酵素）の生産のための、または、他の組織への全身性送達のための、プラットフォームとして用いて、障害（例えば、糖尿病のような代謝障害（例えば、インスリン）、血友病（例えば、因子ＩＸまたは因子ＶＩＩＩ）、またはリソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンぺ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］またはファブリ病［α−ガラクトシダーゼＡ］）またはグリコーゲン蓄積症（例えば、ポンぺ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］）を治療する。代謝障害の治療に他の適切なタンパク質は、上述のとおりである。
代表的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象において、筋ジストロフィーを治療する方法を提供し、当該方法は、有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類の対象に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、筋ジストロフィーを治療するのに効果的な異種核酸を含む。例示的な実施態様では、方法は、有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類の対象に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニ−ジストロフィン、マイクロ−ジストロフィン、ユートロフィン、ミニ−ユートロフィン、ラミニン−α２、ミニ−アグリン、フクチン関連タンパク質、ホリスタチン、ドミナントネガティブミオスタチン、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチンプロ−ペプチド、２型アクチビン可溶性受容体、抗−炎症性ポリペプチド、例えば、Ｉｋａｐｐａ Ｂドミナント突然変異体、サルコスパン、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント、またはミオスタチンに対する抑制ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ）、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−２０８、または、欠損ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導するための抑制ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ）をコードする異種核酸を含む。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、本明細書中の他のどこかに記載のように、骨格、横隔膜および／または心筋に投与することができる。
本発明はさらに、それを必要とする対象において、代謝障害を治療する方法を包含する。代表的な実施態様では、当該方法は、有効量の本発明のウイルスベクターを、対象の骨格筋に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、代謝障害は、ポリペプチドの欠乏および／または欠陥の結果である。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書に記載される。さらなる選択肢としては、異種核酸は、分泌タンパク質をコードしてよい。
また、本発明を実施して、全身性送達に関する抑制ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ）を生産することもできる。
また、本発明は、それを必要とする対象において、先天性心不全を治療する方法も提供し、当該方法は、有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類の対象に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、先天性心不全を治療するのに効果的な異種核酸を含む。代表的な実施態様では、当該方法は、有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類の対象に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管形成因子、ホスホランバン、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン、β−アドレナリン受容体キナーゼ（βＡＲＫ）、βＡＲＫｃｔ、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、カルクレイン、ＨＩＦ、チモシン−β４、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、６型アデニリルシクラーゼ、２型Ｇ−タンパク質共役受容体キナーゼのノックダウンを作動する分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；ホスホランバン抑制またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅ、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−２０８をコードする、異種核酸を含む。
注射剤は、従来の形態、液体の溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固形形態として、またはエマルションとして、従来の形態で調製することができる。あるいは、全身性の様式よりむしろ局所に、例えば、デポーまたは徐放性製剤で、ウイルスベクターを投与し得る。さらに、ウイルスベクターは、外科的に埋め込み可能なマトリックス、例えば、骨補填材、縫合、ステントなど（例えば、米国特許第７，２０１，８９８に記載）に乾燥させて送達することができる。
経口投与に適切な医薬組成物は、所定の量の本発明の組成物をそれぞれが含む、カプセル、カシェ剤、トローチ、または錠剤のような個別の単位で；粉末または顆粒として；水性または非水性の溶液中の溶液または懸濁液として；または、水中油または油中水エマルションとして提供され得る。経口送達は、本発明のウイルスベクターを、動物の消化管内の消化酵素による分解に耐えることが可能な担体と複合することにより行なわれ得る。そのような担体の例は、当技術分野で知られているプラスチックカプセルまたは錠剤を含む。そのような製剤は、薬学の任意の適切な方法により調製されて、組成物および適切な担体（上記の１つまたは複数の捕捉的な成分を含んでよい）を結合させるステップを含む。一般に、本発明の実施態様に係る医薬組成物は、液体または微粉化された固形担体または両方と、組成物を均一かつ密接に混合して、それから、必要な場合は、生じた混合物を成形することにより調製される。例えば、錠剤は、場合により、１つまたは複数の補足的な成分とともに、組成物を含む粉末または顆粒を圧縮または成形することにより、調製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械において圧縮することにより調製されて、さらさらした形態の組成物、例えば、粉末または顆粒は、場合により、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性／分散剤（単数または複数）と混合される。成形錠剤は、適切な機械内で成形することにより作られて、粉末化された化合物は、不活性の液体結合剤を用いて湿らせられる。
口腔（舌下の）投与に適切な医薬組成物は、風味付けられたベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント内に本発明の組成物を含むトローチ；および、不活性ベース、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア内に組成物を含む菱形錠剤を含む。
非経口投与に適切な医薬組成物は、本発明の組成物の滅菌された水性および非水性注射溶液を含んでよく、その製剤は、場合により、意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの製剤は、意図されるレシピエントの血液と等張の組成物を与える、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および溶質を含んでよい。水性および非水性の滅菌された懸濁液、溶液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含んでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油類、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝された培地を含む。非経口ビヒクルは、食塩水、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補液、電解質補液（例えば、リンガーブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤、および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような他の添加剤も存在してよい。
組成物は、単位／投与または複数回投与の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中に存在してよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水を添加することのみ必要な、凍結−乾燥（凍結乾燥）された状態で保管することができる。
即席の注射溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、密封された容器中の単位投与形態での本発明の注射可能な安定の滅菌組成物が提供され得る。組成物は、凍結乾燥物の形態で提供することができ、適切な薬学的に許容できる担体を用いて再構成して、対象への注射に適切な液体組成物を形成することができる。単位投与形態は、約１μｇ〜約１０ｇの本発明の組成物であってよい。組成物が実質的に水に不溶性である場合は、生理的に許容できる十分な量の乳化剤を、水性担体中で組成物を乳化するのに十分な量で含んでよい。そのような有用な乳化剤の１つは、ホスファチジルコリンである。
直腸投与に適切な医薬組成物は、単位用量坐薬として提供され得る。これらは、組成物を、１つまたは複数の従来の固形担体、例えばココアバターなどと混合して、それから、生じた混合物を成形することにより調製することができる。
皮膚への局所適用に適切な本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル、または油の形態をとりうる。使用することのできる担体は、限定されないが、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類、経皮エンハンサー、およびそれらの２以上の組み合わせを含む。一部の実施態様では、例えば、局所送達は、本発明の医薬組成物を、皮膚の中へ浸透することが可能な、脂溶性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することにより行なうことができる。
経皮投与に適切な医薬組成物は、長期間にわたり対象の表皮との密接な接触を維持するように適合された個別のパッチの形態であってよい。また、経皮投与に適切な組成物は、イオン導入によって送達することもでき（例えば、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）、典型的に、場合により緩衝された本発明の組成物の水溶液の形態をとる。適切な製剤は、シトレートまたはｂｉｓ＼ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含んでよく、０．１〜０．２Ｍの活性成分を含んでよい。
本明細書に開示されるウイルスベクターは、任意の適切な手段によって、例えば、対象が吸入するウイルスベクターからなる呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより、対象の肺に投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であってよい。ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、任意の適切な手段によって、例えば、当業者に公知の圧力駆動式のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いて、生産され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照。ウイルスベクターを含む固形粒子のエアロゾルは、同様に、調剤分野で公知の技術によって、任意の固形微粒子薬物エアロゾル発生器を用いて生産され得る。
ＩＶ．末梢組織を標的化するＡＡＶキャプシドの使用。
本発明のＡＡＶキャプシドおよびベクターは、末梢臓器および組織に関して完全またはほぼ完全に脱標的化することが示されている。この脱標的化は、所望の向性プロファイルを生じる、例えば、特定の臓器および組織を標的化する、および／または、他の臓器および組織を脱標的化するように変更することのできる、「ブランク」ベクターとしてのベクターの理想を作る。したがって、本発明の一態様は、目的の向性プロファイルを有するＡＡＶキャプシドを調製する方法に関し、当該方法は、目的の向性プロファイルを提供するアミノ酸配列を挿入するために本発明のＡＡＶキャプシドを改変するステップを含む。一部の実施態様では、目的の向性プロファイルは、骨格筋、心筋、横隔膜、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、消化管、肺、関節組織、舌、卵巣、精巣、生殖細胞、癌細胞、またはそれらの組み合わせから選択される組織については選択性が高く、および／または、肝臓、卵巣、精巣、生殖細胞、またはそれらの組み合わせから選択される組織については選択性が低い。
特異的な標的化および脱標的化配列の例は、当技術分野で知られている。１つの例は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の場合、ヘパリンと血清型のいずれかの相互作用と関連すると思われる連続的な基本のフットプリントに対してマップ化されている、選択的な肝臓向性に関する分子基盤である。具体的には、ＡＡＶ６上の単一のリジン残基（Ｋ５３１）がヘパリン結合能力およびその結果として肝臓向性を規定することが以前に示されている。推論では、リジン残基と、他の血清型上の対応するグルタミン酸／アスパラギン酸残基の置換型の突然変異誘発は、場合により、キャプシド表面上に最小限の連続的な基本のフットプリントを形成することにより、ヘパリン結合を与える。別の例は、国際公報ＷＯ２０１２／０９３７８４に開示される三倍軸ループ（ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ ａｘｉｓ ｌｏｏｐ）４における変更を含む、キャプシド突然変異体であり、その全体で参照により本明細書中に援用される。これらの突然変異体は、（ｉ）肝臓の形質導入の低下、（ｉｉ）内皮細胞を横切る動きの増大、（ｉｉｉ）全身性形質導入；（ｉｖ）筋組織（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）の形質導入の増大、および／または（ｖ）脳組織（例えば、ニューロン）の形質導入の低下を含む、１つまたは複数の特質を示す。他の向性順序（ｔｒｏｐｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：７７５２−７７５９；Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：１０７０−１０７８；Ｂｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：４４３−４５５；Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９−７０８；およびＡｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：７９−８２に記載され；それぞれ、その全体で参照により援用される。
一部の実施態様では、本発明のＡＡＶキャプシドは、ＤＮＡスクランブルおよび／または定向進化を通して改変して、所望の向性プロファイルを有する改変キャプシドを特定することができる。ＡＡＶキャプシドのＤＮＡスクランブルおよび定向進化に関する技術は、国際公報ＷＯ２００９／１３７００６に記載され、その全体で参照により本明細書中に援用される。
Ｖ．オリゴデンドロサイトを標的化したキメラＡＡＶキャプシド
本発明者らは、ニューロンおよびＣＮＳの他の細胞よりも優先的にオリゴデンドロサイトを形質導入することが可能なキメラＡＡＶキャプシド構造を特定している。したがって、本発明の一態様は、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸に関し、当該核酸は、（ａ）配列番号１２９（ＢＮＰ６１）のヌクレオチド配列；または（ｂ）配列番号１３０（ＢＮＰ６１）をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、から本質的になり、またはからなり；異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３部分に作動可能に連結される；および、当該キメラＡＡＶキャプシドを含むウイルスに関する。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分と、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分は、野生型キャプシド配列（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９）、または、本発明の任意のキャプシド配列と異なるキメラ配列である。
特定の実施態様では、本発明の核酸は、さらに、キャプシドタンパク質内にＥ５３２Ｋ置換をコードする（ＡＡＶ８キャプシド配列に対するナンバリング）。
一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドをコードする核酸は、異なるＡＡＶキャプシド配列のＶＰ３をコードする部分に作動可能に連結された、配列番号１３１（ＢＮＰ６２）または１３２（ＢＮＰ６３）をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、から本質的になり、またはからなり；ウイルスは、当該キメラＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、配列番号１３１または１３２をコードするヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分と、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３部分に作動可能に連結された、配列番号１３１または１３２をコードするヌクレオチド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分は、野生型キャプシド配列（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９）または本発明の任意のキャプシド配列とは異なるキメラ配列である。
特定の実施態様では、本発明の核酸は、さらに、キャプシドタンパク質内にＥ５３２Ｋ置換をコードする（ＡＡＶ８キャプシド配列に対するナンバリング）。
配列番号１３０〜１３２は、本発明のＶＰ１キャプシドタンパク質配列の例を示す。本発明の説明および添付の特許請求の範囲における全てのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１ナンバリングに関する。当業者は、ＡＡＶキャプシドは、一般に、より小さなＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質を同様に含むことを理解する。ＡＡＶキャプシドタンパク質に関するコード配列のオーバーラップに起因して、ＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質の核酸コード配列およびアミノ酸配列は、配列番号１２９〜１３２に示されるＶＰ１配列から明らかである。具体的には、ＶＰ２は、配列番号１２９のヌクレオチド４１２（ａｃｇ）および配列番号１３０のトレオニン１４８で開始する。ＶＰ３は、配列番号１２９のヌクレオチド６０７（ａｔｇ）および配列番号１３０のメチオニン２０３で開始する。特定の実施態様では、配列番号１３０〜１３２由来の配列を含む単離されたＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質、および、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質、または両方をコードする単離された核酸が検討される。
特定の実施態様では、本発明のキャプシドは、さらに、Ｅ５３２Ｋ置換を含む（ＡＡＶ８キャプシド配列に対するナンバリング）。
また、本発明は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質およびキメラキャプシドも提供し、キャプシドタンパク質は、配列番号１３０〜１３２の１つに示されるアミノ酸配列を含み、から本質的になり、またはからなり、ここで、配列番号１３０〜１３２の１つのキャプシドタンパク質コード配列内のアミノ酸の１、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１２以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、または５０以下は、別のアミノ酸（天然起源、改変および／または合成）、場合により保存的アミノ酸置換により置換され、および／または、欠失され、および／または、１、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１２以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、または５０以下のアミノ酸の挿入（Ｎ末およびＣ末伸長を含む）、または、置換、欠失および／または挿入の任意の組み合わせが存在し、ここで、置換、欠失および／または挿入は、変異キャプシドタンパク質またはキャプシドを含むビリオン（例えば、ＡＡＶビリオン）の構造および／または機能を過度に損なわない。例えば、本発明の代表的な実施態様では、キメラキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンは、配列番号１３０〜１３２の１つに示されるキメラキャプシドタンパク質を含むキメラビリオンの少なくとも１つの特質を実質的に保持する。例えば、キメラキャプシドタンパク質を含むビリオンは、配列番号１３０〜１３２の１つに示されるキメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンのオリゴデンドロサイト向性プロファイルを実質的に保持することができる。ウイルス形質導入のような生物学的特質を評価する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば実施例を参照）
本発明のさらなる実施態様は、ＡＡＶ８キャプシドをコードする核酸に関し、キャプシドは、Ｅ５３２Ｋ置換を含む。一部の実施態様では、核酸は、（ａ）配列番号１３３のヌクレオチド配列（ＡＡＶ８ Ｅ５３２Ｋキャプシドヌクレオチド配列）；または（ｂ）配列番号１３４をコードするヌクレオチド配列（ＡＡＶ８ Ｅ５３２Ｋキャプシドアミノ酸配列）と、少なくとも９０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含み、から本質的になり、またはからなり；ウイルスは、当該キメラＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施態様では、ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、ＡＡＶ８ Ｅ５３２Ｋキャプシドコード配列は、本発明のキャプシド配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分をさらに含む。
保存的アミノ酸置換は、当技術分野で知られている。特定の実施態様では、保存的アミノ酸置換は、以下の基の１つまたは複数において置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；および／またはフェニルアラニン、チロシン。
配列番号１３０〜１３２のキメラＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列および／またはＡＡＶ８ Ｅ５３２Ｋ置換をさらに改変して、所望の特質を与えることが当技術分野で知られている他の改変を組み込むことができることが当業者に明らかである。非限定の可能性として、キャプシドタンパク質を改変して、標的化配列（例えば、ＲＧＤ）または精製および／または検出を促進する配列を組み込むことができる。例えば、キャプシドタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース−結合タンパク質、ヘパリン／ヘパランサルフェート結合ドメイン、ポリ−Ｈｉｓ、リガンド、および／または、レポータータンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、免疫グロブリンＦｃフラグメント、単鎖抗体、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープなどの全部または一部と融合して、融合タンパク質を形成することができる。標的化ペプチドをＡＡＶキャプシド中に挿入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、国際特許公報ＷＯ ００／２８００４；Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４７４−１８１；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：５１３−３１９；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１０４０−１０４６を参照。
本発明のウイルスは、国際特許公報ＷＯ ０１／９２５５１および米国特許第７，４６５，５８３号に記載の二重鎖ウイルスゲノムをさらに含んでよい。
また、本発明は、本発明のキメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドおよびそれを含むウイルス粒子（すなわち、ビリオン）も提供し、ウイルス粒子は、ベクターゲノム、場合によりＡＡＶベクターゲノムをパッケージ（すなわち、キャプシド形成）する。特定の実施態様では、本発明は、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶ粒子を提供し、ここで、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶベクターゲノムをパッケージする。また、本発明は、本発明のキメラ核酸キャプシドコード配列によりコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質またはＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶ粒子も提供する。
特定の実施態様では、ビリオンは、例えば細胞への送達のための、目的の異種核酸を含む組み換えベクターである。したがって、本発明は、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの、細胞への核酸の送達に有用である。代表的な実施態様では、本発明の組み換えベクターは、動物（例えば、哺乳類）細胞へ核酸を送達または移行するのに有利に用いることができる。
任意の異種ヌクレオチド配列（単数または複数）が、本発明のウイルスベクターによって送達され得る。目的の核酸は、ポリペプチド、場合により治療的（例えば、医療または獣医用途のための）、および／または免疫原性（例えば、ワクチンのための）、ポリペプチドをコードする核酸を含む。
一部の実施態様では、ポリペプチドは、オリゴデンドロサイトの増殖および／または分化を刺激するものである。例示は、制限されずに、インスリン様成長因子−１、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、アルテミン、形質転換成長因子α、血小板由来成長因子、白血病阻害因子、プロラクチン、モノカルボン酸トランスポーター１、または核因子１Ａを含む。
治療的ポリペプチドは、限定されないが、上述のものを含む。
ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列は、上述のレポーターポリペプチドをコードするものを含む。
あるいは、異種核酸は、上述のように、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、スプライセオソームが仲介するトランス−スプライシングを生じるＲＮＡ、遺伝子サイレンシングを仲介する小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、または他の非翻訳の「機能性」ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡなどをコードしてよい。
また、本発明は、上述のように、例えば、ワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現する組み換えウイルスベクターも提供する。
あるいは、異種ヌクレオチド配列は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、細胞内で望ましく生産される、任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養された細胞およびそこから単離された発現されたタンパク質産物に導入され得る。
目的の異種核酸（単数または複数）は、上述の適切な制御配列と作動可能に結合され得ることが、当業者により理解される。有利に、本発明のオリゴデンドロサイトに特異的なキメラキャプシドは、オリゴデンドロサイトに特異的なプロモーターの使用を必要とする従来技術のＡＡＶベクターと比較して、構成的プロモーターの使用がオリゴデンドロサイトに特異的な様式で目的の異種核酸（単数または複数）を発現するのを可能にする。
また、本発明は、ＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶゲノムを含むキメラＡＡＶ粒子も提供し、ここで、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶキャプシドに「相当する」（すなわち、コードする）。また、そのようなキメラＡＡＶ粒子のコレクションまたはライブラリーも提供され、ここで、コレクションまたはライブラリーは、２以上、１０以上、５０以上、１００以上、１０００以上、１０４以上、１０５以上、または１０６以上の別個の配列を含む。
本発明はさらに、本発明のキメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、からなる、または、から本質的になる、「空の」キャプシド粒子を包含する（すなわち、ベクターゲノムが不存在）。本発明のキメラＡＡＶキャプシドは、米国特許第５，８６３，５４１号において説明されているように、「キャプシドビヒクル」として用いることができる。ウイルスキャプシドによって共有結合、結合、またはパッケージして、細胞内に移行することのできる分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、ポリペプチド、有機小分子、またはそれらの組み合わせを含む。さらに、分子は、宿主標的細胞内への分子の移行のために、ウイルスキャプシドの外側と結合する（例えば「係留する」）ことができる。本発明の一実施態様では、分子は、キャプシドタンパク質に共有結合（すなわち、コンジュゲートまたは化学結合）されている。分子を共有結合する方法は、当業者により公知である。
また、本発明のウイルスキャプシドは、新規のキャプシド構造に対して抗体を掲げる用途も見いだす。さらなる代替としては、細胞に対する抗原提示のために、例えば対象に投与するために、外因性のアミノ酸配列をウイルスキャプシド中に挿入して、外因性のアミノ酸配列に対する免疫応答を生じさせ得る。
また、本発明は、本発明のキメラキャプシドタンパク質およびキメラウイルスキャプシドをコードする核酸（例えば、単離された核酸）も提供する。さらに、核酸を含むベクター、および、本発明の核酸および／またはベクターを含む細胞（インビボまたは培養中）が提供される。そのような核酸、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書に記載のウイルスベクターの生産のための試薬（例えば、ヘルパー構築物またはパッケージング細胞）として用いられ得る。
例示的な実施態様では、本発明は、配列番号１３０〜１３２のＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列、または、配列番号１２９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を提供する。また、本発明は、上述の、ＡＡＶキャプシド変異、キャプシドタンパク質変異および融合タンパク質をコードする核酸も提供する。特定の実施態様では、核酸は、当業者により公知の標準的な条件下で本明細書に具体的に開示される核酸配列の相補にハイブリダイズし、変異キャプシドおよび／またはキャプシドタンパク質をコードする。場合により、変異キャプシドまたはキャプシドタンパク質は、キャプシドおよび／または配列番号１２９の核酸配列によりコードされるキャプシドまたはキャプシドタンパク質の特質の少なくとも１つを実質的に保持する。例えば、変異キャプシドまたは変異キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子は、配列番号１２９の核酸コード配列によりコードされるキャプシドタンパク質またはキャプシドを含むウイルス粒子のオリゴデンドロサイト向性プロファイルを実質的に保持することができる。
例えば、そのような配列のハイブリダイゼーションは、上述のように、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはさらにストリンジェントな条件の条件下で行なってよい。
他の実施態様では、本発明の変異キャプシドまたはキャプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１２９の核酸配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、場合により、配列番号１２９の核酸によりコードされるキャプシドタンパク質またはキャプシドの特質の少なくとも１つを実質的に保持する、変異キャプシドまたはキャプシドタンパク質をコードする。
当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、核酸またはポリペプチドが、上述のように公知配列と配列同一性を有するかどうか特定することができる。
特定の実施態様では、核酸は、制限されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むベクターを含んでよい、から本質的になってよい、またはからなってよい。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを含んでよい、からなってよい、または、から本質的になってよい。
一部の実施態様では、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列をさらに含む。例えば、核酸は、ウイルスストックを生産するためのヘルパー構築物であってよい。
また、本発明は、上述のように本発明の核酸を安定的に含む、パッケージング細胞も提供する。
核酸は、送達ベクター、例えばウイルス送達ベクター中に組み込むことができる。説明のために、本発明の核酸は、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、バキュロウイルス粒子、または任意の他の適切なウイルス粒子の中にパッケージすることができる。
さらに、核酸は、プロモーターエレメントと作動可能に結合され得る。プロモーターエレメントは、本明細書により詳細に説明される。
本発明はさらに、上述の本発明のウイルスベクターを生産する方法を提供する。
本発明のパッケージング方法を用いて、ウイルス粒子の高力価ストックを生産し得る。特定の実施態様では、ウイルスストックは、少なくとも約１０５形質導入ユニット（ｔｕ）／ｍｌ、少なくとも約１０６ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０７ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０８ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０９ｔｕ／ｍｌ、または少なくとも約１０１０ｔｕ／ｍｌの力価を有する。
新規のキャプシドタンパク質およびキャプシド構造は、例えば、診断または治療的用途のため、または研究試薬としての、抗体を掲げる用途を見いだす。したがって、本発明は、上述の本発明の新規のキャプシドタンパク質およびキャプシドに対する抗体も提供する。
ＶＩ．オリゴデンドロサイトを標的化したキメラＡＡＶキャプシドを用いる方法。
また、本発明は、異種ヌクレオチド配列をオリゴデンドロサイトに送達する方法にも関する。例えば、インビトロでポリペプチドまたは核酸を生産するために、または、エクスビボでの遺伝子治療のために、本発明のウイルスベクターを用いて、例えば、目的のヌクレオチド配列を、インビトロでオリゴデンドロサイトに送達し得る。ベクターは、例えば、治療的または免疫原性ポリペプチドまたは核酸を発現するために、それを必要とする対象にヌクレオチド配列を送達する方法において、さらに有用である。このような方法で、ポリペプチドまたは核酸は、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが欠乏しているため、または、治療またはその他の方法として、およびさらに以下に説明されるとおり、対象におけるポリペプチドまたは核酸の生産が何らかの治療的効果を与え得るため、対象はポリペプチドまたは核酸が必要であり得る。
特定の実施態様では、ベクターは、例えば、オリゴデンドロサイトの増殖および／または分化を促進する有益な効果をオリゴデンドロサイトに提供する、ポリペプチドまたは核酸を発現するのに有用である。ベクターをオリゴデンドロサイトに標的化する能力は、オリゴデンドロサイト機能障害および／またはニューロンの脱髄が関与する疾患または障害を治療するのに特に有用であり得る。他の実施態様では、ベクターは、オリゴデンドロサイト（例えば、ニューロン）の近くの細胞に有益な効果を提供するポリペプチドまたは核酸を発現するのに有用である。
したがって、本発明の一態様は、目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法に関し、当該方法は、オリゴデンドロサイトを、本発明のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳類の対象において、目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子または医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む。
本発明ののさらなる態様は、それを必要とする対象において、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害を治療する方法に関し、当該方法は、治療的に有効量の本発明のＡＡＶ粒子を、対象に投与するステップを含む。一実施態様では、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害は、脱髄性疾患である。一実施態様では、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害は、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッハー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、ツェルウェガー病、１８ｑ−症候群、脳性麻痺、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、フェニールケトン尿症、またはウイルス感染、または、オリゴデンドロサイト機能障害と関連することが公知または後に見いだされる任意の他の障害である。別の実施態様では、本発明の方法を用いて、オリゴデンドロサイト機能障害と直接関連はしないが、ニューロン、星状細胞、または他のＣＮＳ細胞型における発現に加えて、またはそれらの代わりに、オリゴデンドロサイトにおける異種ポリペプチドまたは核酸の発現によって恩恵を受ける障害を治療する。例示は、制限されずに、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、ＣＮＳ腫瘍、および上述の他のＣＮＳ障害を含む。
本発明の別の態様では、本発明のキメラＡＡＶキャプシドおよびベクターは、完全またはほぼ完全に脱標的化されたベクターであり、上述のように、１つまたは複数の末梢臓器または組織の標的化に望ましい向性プロファイルにさらに改変することができる。この態様では、本発明は、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞の中に異種ヌクレオチド配列を送達する方法にも関する。例えば、インビトロでポリペプチドを生産するため、またはエクスビボでの遺伝子治療のために、本発明のウイルスベクターを用いて目的のヌクレオチド配列をインビトロで細胞に送達し得る。ベクターは、例えば、治療的または免疫原性ポリペプチドまたは核酸を発現するために、それを必要とする対象にヌクレオチド配列を送達する方法において、さらに有用である。このような方法で、ポリペプチドまたは核酸は、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが欠乏しているため、または、治療またはその他の方法として、およびさらに以下に説明されるとおり、対象におけるポリペプチドまたは核酸の生産が何らかの治療的効果を与え得るため、対象はポリペプチドまたは核酸が必要であり得る。
一般に、本発明のウイルスベクターを用いて、生物学的効果を有する任意の外来核酸を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害と関連する症候が治療または改善され得る。さらに、本発明を用いて、治療的ポリペプチドを送達することが有益である任意の病状を治療することができる。例示的な病状は、上述したものを含む。
また、本発明に係るウイルスベクターを用いて、インビトロまたはインビボで細胞に、アンチセンス核酸または抑制ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を提供し得る。標的細胞での抑制ＲＮＡの発現は、細胞による特定のタンパク質（単数または複数）の発現を減らす。したがって、抑制ＲＮＡを投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を低減し得る。また、抑制ＲＮＡをインビトロで細胞に投与して、細胞の生理機能を調節、例えば、細胞または組織培養系の最適化をしてもよい。
さらなる態様としては、本発明のウイルスベクターを用いて、対象における免疫応答を生じさせ得る。本実施態様によれば、免疫原をコードする核酸を含むウイルスベクターは、対象に投与され得て、能動免疫応答（場合により、防御免疫応答）が、対象によって免疫原に対して高められる。免疫原は、上記に記載したとおりである。
あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与され得て、改変された細胞が対象に投与される。異種核酸が細胞中に導入されて、細胞が対象に投与されて、そこで、免疫原をコードする異種核酸が場合により発現されて、そして、対象において免疫原に対して免疫応答を誘導する。特定の実施態様では、細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
また、本発明のウイルスベクターは、癌細胞抗原（または免疫学的に同様の分子）または上述のように癌細胞に対する免疫応答を生じさせる任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターを投与することによって、癌免疫療法のために投与してもよい。ウイルスベクターは、本明細書に記載のように、インビボで、またはエクスビボでの方法を用いて、対象に投与され得る。
特定の実施態様では、細胞は、癌を有する対象から取り出されて、本発明に係るウイルスベクターと接触され得る。それから、改変された細胞が対象に投与されて、それにより、癌細胞抗原に対する免疫応答が誘発される。この方法は、インビボで十分な免疫応答を高めることができない（すなわち、高い抗体を十分な量で生産することができない）免疫不全の対象で特に有利に用いられる。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性タンパク質−１、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）によって高められ得ることが、当技術分野で知られている。したがって、免疫調節性サイトカイン（例えば、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターとともに対象に投与され得る。
サイトカインは、当技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得て、またはあるいは、サイトカインをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターを用いて対象に送達され得て、そして、サイトカインがインビボで生産される。
ウイルスベクターは、研究目的のために、例えば、インビトロまたは動物でのＣＮＳ機能の研究のために、または、疾患の動物モデルの作製および／または研究における使用のために、オリゴデンドロサイトを標的化するのにさらに有用である。例えば、脱髄性疾患の動物モデルにおいて、ベクターを用いて、異種核酸をオリゴデンドロサイトに送達することができる。脱髄は、制限されずに、ウイルス（例えば、セムリキウイルス、ミューリン肝炎ウイルス、またはタイラーミューリン脳脊髄炎ウイルス）の投与、および、化学物質（例えば、クプリゾン、エチジウムブロマイド、またはリゾレシチン）の投与を含む様々な手段によって、動物において誘導することができる。一部の実施態様では、ベクターは、実験的な自己免疫性脳脊髄炎の動物モデルにおいて用いることもできる。この症状は、例えば、カイナイト、ＳＩＮ−１、抗ガラクトセレブロシドの投与、または照射によって誘導することができる。他の実施態様では、ウイルスベクターを用いて、細胞の一部または全てを殺すために、毒性薬剤または毒性薬剤を生産する酵素（例えば、チミジンキナーゼ）を、オリゴデンドロサイトに特異的に送達することができる。
さらに、本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法でのさらなる用途を見いだし、それにより、目的の遺伝子が、一時的または安定的に、細胞培養系、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて発現される。また、本発明を実施して、例えば、実験、産業または市販目的のためのタンパク質生産の目的のために、核酸を送達することができる。
本発明に係る組み換えウイルスベクターは、獣医および医療用途の両方での用途を見いだす。適切な対象は、上述の鳥類および哺乳類の両方を含む。場合により、例えば、対象は、本明細書に記載されるものを含む障害を有する、またはそのリスクがあると考えられるため、または、本明細書に記載されるものを含む核酸の送達から恩恵を受けるため、対象は、本発明の方法「を必要とする」。例えば、特定の実施態様では、対象は、脱髄性障害または脊髄または脳損傷を有していて（または有していたことがあり）、または、それらのリスクがある。さらなる選択肢としては、対象は、実験動物および／または疾患の動物モデルであってよい。
特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明のウイルスベクター、および、場合により、他の薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射については、担体は典型的に液体である。投与の他の方法については、担体は、固形または液体のいずれかであってよい。吸入投与については、担体は呼吸に適していて、好ましくは固形または液体の微粒子形態である。
「薬学的に許容できる」によって、毒性またはその他の望ましくないものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
本発明の一態様は、ヌクレオチド配列をインビトロで細胞に移行させる方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法に従って、感染の適切な多様性で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターまたはキャプシドの力価は、標的の細胞型および数、および、特定のウイルスベクターまたはキャプシドに応じて変更することができ、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。特定の実施態様では、少なくとも約１０３の感染ユニット、より好ましくは少なくとも約１０５感染ユニットが、細胞に導入される。
ウイルスベクターを導入することのできる細胞（単数または複数）は、上述の任意のタイプであり得る。
ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は、対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞が対象の中に戻される。エクスビボでの治療のために対象から細胞を取り出して、その後に対象の中に戻し入れる方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、別の対象由来の細胞の中に、培養細胞の中に、または、任意の他の適切な起源からの細胞の中に導入されて、細胞は、それを必要とする対象に投与される。
エクスビボでの遺伝子治療に適切な細胞は、上述のとおりである。対象に投与する細胞の用量は、対象の年齢、状態および種、細胞のタイプ、細胞により発現される核酸、投与方法などに基づき変化する。典型的に、薬学的に許容できる担体中、少なくとも約１０２〜約１０８または約１０３〜約１０６の細胞が、投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、製剤担体と組み合わせて有効量で対象に投与される。
一部の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入されている細胞が投与されて、上述のように、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子としてまたはキャプシド内に発現される）に対する免疫原性応答を誘発し得る。
本発明のさらなる態様は、本発明のキャプシドまたはウイルスベクターを対象に投与する方法である。特定の実施態様では、当該方法は、目的の核酸を動物対象に送達する方法を含み、当該方法は、有効量の本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与するステップを含む。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。場合により、ウイルスベクターは、効果的な投与量で、薬学的に許容できる担体中で送達される。
さらに、本発明のウイルスベクターを対象に投与して、上述のように、免疫原性応答を（例えば、ワクチンとして）誘発することができる。
対象に投与されるウイルスベクターの用量は、投与方法、治療される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達される核酸に依存し、日常的な方法で決定することができる。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入ユニットまたはそれより多く、好ましくは、約１０７または１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４形質導入ユニット、さらにより好ましくは、約１０１２形質導入ユニットのウイルス力価である。
特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）を用いて、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成し得る。
例示的な投与方法は、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾル経由）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面の両方へ、気道表面を含む、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳へ）を含む。また、投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節の中またはその付近）に対するものであってもよい。任意の所定のケースにおける最も適切な経路は、治療される症状の性質および重症度、および、用いられる特定のベクターの性質に依存する。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、例えば、脳または脊髄に直接投与される。直接投与は、特異性の高いオリゴデンドロサイトの形質導入をもたらすことができ、例えば、ここで、形質導入された細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くが、オリゴデンドロサイトである。ベクターを直接ＣＮＳに投与するための、当技術分野で知られている任意の方法を用いることができる。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む大脳、皮質、基底核、海馬および扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘へ導入され得る。また、ベクターは、網膜、角膜または視神経のような眼の異なる領域にも投与され得る。ベクターは、ベクターの投与をより分散させるために、（例えば、腰椎穿刺によって）脳脊髄液中に送達され得る。
送達ベクターは、制限されないが、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達またはそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で知られている任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）に投与され得る。
典型的に、ウイルスベクターは、液体製剤中で、直接的な注入（例えば、定位的な注入）によって、ＣＮＳ内の所望の領域または区画に投与される。一部の実施態様では、ベクターは、リザーバーおよび／またはポンプを介して送達することができる。他の実施態様では、ベクターは、所望の領域に対する局所適用によって、または、エアロゾル製剤の経鼻内投与によって、提供され得る。眼または耳の中への投与は、液体の液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替としては、ベクターは、固形の徐放製剤として投与され得る。パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの制御放出は、国際特許公報ＷＯ ０１／９１８０３に記載される。
対象が、損なわれている血液脳関門（ＢＢＢ）を有する一部の実施態様では、ウイルスベクターは、対象に、全身性（例えば、静脈内）に送達することができ、ここで、ベクターは、ＢＢＢ損傷の領域（例えば境界）において、オリゴデンドロサイトを形質導入する。特定の実施態様では、ベクターは、損なわれている領域内の細胞を形質導入するが、損なわれていない領域内の細胞を形質導入しない。したがって、本発明の一態様は、哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法に関し、当該方法は、有効量の本発明のＡＡＶ粒子を静脈内投与するステップを含む。
一部の実施態様では、ＢＢＢにおける損傷は、上述の疾患または障害に起因する。他の実施態様では、ＢＢＢ損傷は、例えば、上述のように、ＣＮＳへの薬剤の送達を促進するための、誘導された破壊であり得る。
注射剤は、従来の形態、液体の溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固形形態として、またはエマルションとして、従来の形態で調製することができる。あるいは、全身性の様式よりむしろ局所に、例えば、デポーまたは徐放性製剤で、ウイルスベクターを投与し得る。さらに、ウイルスベクターは、外科的に埋め込み可能なマトリックス、例えば、骨補填材、縫合、ステントなど（例えば、米国特許第７，２０１，８９８に記載）に乾燥させて送達することができる。
異なる投与経路に適切な医薬組成物は、上述のものであってよい。
本発明を説明したが、同じことが、以下の実施例においてより詳細に説明され、それは、例示目的のみのために本明細書に含められ、本発明に対する限定を意図しない。
［実施例１］
高いＣＮＳ向性および最小限の末梢臓器向性を有する、ＡＡＶキャプシドの開発
キャプシドＤＮＡシャッフリングおよび定向進化と呼ばれるプロセスを通してＡＡＶキャプシドを開発し、それを用いて新規のＡＡＶキャプシド配列のライブラリーを作製した。それから、これらのキャプシドを、マウスにおいて多数ラウンドの選択圧に供し、潜在的なさらなるキャプシド突然変異誘発がセレクションのラウンド間で生じた。回収したキャプシドクローンを、レポーター導入遺伝子（ＧＦＰ）または治療的導入遺伝子（レット症候群について、ＭｅＣＰ２）に対するベクターとして用いて、生体内分布および治療的可能性に関してマウスで評価した。
用いたオリジナルのライブラリーは、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、およびｒｈ１０由来のシャッフルされたキャプシドで構成された。さらなる改変されたキャプシドも組み込んだ：ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４７、Ｓｅｉｚ３２、Ｓｅｉｚ８３、およびＤｒ．Ｇｒａｙの実験室由来の記載されないキャプシド（悪化クローン１および１１４）。ライブラリーは、前述したとおりに作製した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２５２−１２６０（２００８））。野生型マウスまたはレット症候群のマウスモデル（Ｂ６．１２９Ｐ２（Ｃ）−Ｍｅｃｐ２ｔｍ１．１Ｂｉｒｄ／Ｊ）のいずれかを、インビボのセレクションに用いた。セレクションの各ラウンドについて、マウス（ＷＴマウス、ノックアウト雄Ｒｅｔｔマウス、ヘテロ接合雌Ｒｅｔｔマウス）は、ライブラリーの単一の腰部髄腔内注入を受けて、それから、２〜５日後に、頸部脊髄および脳の多数の領域から組織を回収した。これらのサンプルから、組織を機械的に解離して、説明されるように、ニューロンを選択的に回収した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２５２−１２６０（２００８））。ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号６９５０６）を用いてニューロン濃縮サンプルからＤＮＡを回収した。エラープローンＰＣＲを用いて、前述したプライマーを用いて、低いスタートテンプレート（ａ ｌｏｗ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）および５０回の増幅サイクルでｔａｑポリメラーゼを用いて、ラウンド間のライブラリーをさらに多様化した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２５２−１２６０（２００８））。プールされたＰＣＲ産物を、ＷＴ ＡＡＶ主鎖へ戻してクローン化して（ｐＳＳＶ９）、プールされたクローンを用いて、次のラウンドのスタートライブラリーを作製した。プールされたクローンを、ＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＣａｐを含む１０倍過剰のｐＸＲ２およびアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＸＸ６８０）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。この方法により、キメラキャプシドは、主にＡＡＶ２キャプシドの中にパッケージされた。それから、それ自身のキャプシド内にそれぞれのキメラＡＡＶゲノムが大部分パッケージ化されるように、細胞あたり５感染単位のＭＯＩでＷＴアデノウイルスとともに、ＡＡＶ２によりキャプシド形成されたキメラを細胞あたり０．５ゲノムのＭＯＩでＨＥＫ２９３細胞に加えた。７２時間後、細胞を採取して、記載されるとおりにウイルスを精製して（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１４１２−２８（２００６））、ｑＰＣＲにより滴定した。合計３ラウンドのセレクションを行なった。各ラウンド後に回収したキャプシドのサンプリングを、組み換えＡＡＶ２主鎖（ＩＴＲエレメントを欠く）およびＳＳＶ９複製−コンピテント主鎖にサブクローニングして、シーケンスした。
回収したキャプシドの生体内分布および（一部のケースでは、治療的可能性）を評価するために、一部のクローンを、５マイクロリットルの容量での単一の腰部髄腔内投与によってマウス中に投与した。生体内分布を評価するときは、注入後２〜４週にマウスを屠殺して、記載のとおり（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２５２−１２６０（２００８））、ベクターＤＮＡ生体内分布に関して組織サンプルを分析した。回収したキャプシドクローンの治療可能性を評価するときは、ヒトＭｅＣＰ２遺伝子（マウスＭｅＣＰ２プロモーターにより作動される）を各キャプシド中にパッケージして、それから、４〜５週の月齢時に、腰部髄腔内注入によって、雄ノックアウトＲｅｔｔマウス中に投与した。マウスを、それらのピーク体重の２０％を失う時点についてモニターして、以前に記載のとおり（Ｇａｄａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（１）：１８−３０（２０１３））、生存を示す事前決定されたエンドポイントとして用いた。
代表的なクローンを、図１〜３に示す。クローンＩＴｂｒａｉｎ−２．０２およびＩＴｂｒａｉｎ−２．０４のＣＮＳ向性を、図４Ａ〜４Ｅに示す。図４Ａに示される場合を除き、成体ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０１０ｖｇのｓｃＡＡＶ／ＧＦＰベクターをＩＴ注入して、それから、末梢臓器に対するｑＰＣＲ生体内分布およびＧＦＰ発現のＩＨＣのために、注入後３週に屠殺した。図４Ｂ＝前脳、皮質。図４Ｃ＝中脳、海馬。図４Ｄ＝後脳、小脳。図４Ｅは、腰部脊髄の中心管および前角を示す。ｎ．ｄ．＝データ無し。（Ａ）のスケールバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。（Ｂ−Ｅ）に関するスケールバーは右下に示され、１００ミクロンである。ＡＡＶ９は、ＣＳＦ内投与後の広範なＣＮＳ遺伝子導入に関する現在の「ゴールドスタンダード」を示し、Ｏｌｉｇ００１は、別個に得られたシャッフルされたキャプシドである。図５は、クローンＩＴｃｏｒｄ−１．０６およびＩＴｃｏｒｄ３．０３のＣＮＳおよび末梢分配を示す。成体ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０１０ｖｇのｓｃＡＡＶ／ＧＦＰベクターをＩＴ注入して、それから、ＣＮＳ組織および末梢臓器に対するｑＰＣＲ生体内分布のために、注入後３週に屠殺した。エラーバーはＳＥＭを示す。図６は、クローンＲＴＴＦ−１．１１のＣＮＳ向性を示す。図は、４〜５週の月齢でクローンＦ１．１１（ＧＦＰ遺伝子をパッケージング、マウスあたり１×１０１０ｖｇ）の髄腔内注入を受けて、それから、４週後に屠殺された、マウス由来の脳切片上の抗−ＧＦＰ免疫組織化学を示す。Ｒｅｔｔマウス由来の画像（左）は、ＷＴマウス（右）と比較して、頭−尾の軸全体に沿って、より強い形質導入を示す。代表的な結果を示す。
９個のキメラＡＡＶ／ＧＦＰウイルスの形質導入効率および向性を試験した。各ウイルスを、５〜７月齢である３匹のＭｅＣＰ２＋／−雌マウス中に、大槽内注入した（マウスあたり５Ｅ１０ｖｇ）（別段の指示がある場合を除く）。注入後３週に、マウスを灌流して、脳を採取した。４％パラホルムアルデヒドを含む１×ＰＢＳ中での４８時間の固定後、Ｌｅｉｃａ ＶＴ １０００Ｓ振動刃ミクロトームを用いて５０μｍで脳を切開した。切片を、０．３Ｍ ＰＢＳＴ中５％の正常ヤギ血清中で、室温で１時間インキュベートして、それから、一次抗体溶液（０．３Ｍ ＰＢＳＴ中５％ヤギ血清、ニワトリ抗−ＧＦＰ（Ａｖｅｓ；１：５００）＋ウサギ抗−マウスＭｅＣＰ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：５００）、またはニワトリ抗−ＧＦＰ（Ａｖｅｓ；１：５００）＋ウサギ抗−マウスＮｅｕＮ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：５００））中で、４℃で４０〜４８時間インキュベートした。０．３Ｍ ＰＢＳＴで３回洗浄後、切片を、二次抗体溶液（０．３Ｍ ＰＢＳＴ、ヤギ抗−ニワトリＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：１０００）、ヤギ抗−ウサギＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：１０００））中で、室温で４時間インキュベートして、それから、０．３Ｍ ＰＢＳＴ中でさらに３回洗浄した。それから、切片を、０．３Ｍ ＰＢＳＴ中で０．５μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩとともに室温で３０分間インキュベートして、０．３Ｍ ＰＢＳで１回洗浄した。免疫標識された切片を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡を用いて撮像した。画像は、４×デジタルズームで２０倍対物レンズを用いて撮影した。
特定の脳領域に関する形質導入効率を推定するために、ＤＡＰＩ染色された核に対する、ＧＦＰを発現しているニューロンの割合を、海馬、皮質、脳幹、海馬台、大脳核、および小脳の切片由来のランダム場に関して計算した（ｎ＝１２〜２５）。キャプシドあたりの平均形質導入効率を、全ての分析にわたる平均効率を平均することにより計算した（図７）。ＭｅＣＰ２向性を決定するために、ＧＦＰ＋ニューロンに対するＧＦＰ＋／ＭｅＣＰ２＋ニューロンの割合を、以下の領域のそれぞれについて計算した：海馬、皮質、脳幹、海馬台、大脳核、および小脳（図８）。遺伝学的にＷＴグリア細胞は、免疫蛍光による検出には低すぎるレベルでＭｅＣＰ２を発現し得るので、グリア形態を有する細胞はＭｅＣＰ２向性の計算に用いなかった。ＭｅＣＰ２について行なったのと同様の方法を用いて、ＮｅｕＮ向性を計算した（図９）。
［実施例２］
オリゴデンドロサイトを選択的に標的化するＡＡＶキャプシドの開発
材料および方法
ＡＡＶキャプシドＤＮＡシャッフリングおよびインビボクローンレスキュー
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ血清型１〜６、８、９、ｒｈ１０からシャッフルされたキャプシド、いくつかのキメラキャプシドおよび突然変異体キャプシド、および、Ｅ５３３Ｋ突然変異を有するＡＡＶ８からなるライブラリーを、以前に記載された方法（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２５２（２００８））を用いて生産した。シャッフルされたライブラリーを、以前に線条体６−ヒドロキシ−ドーパミン処置を受けたラット中に静脈内注入した。３日後、ラットを屠殺して、線条体から細胞を機械的に解離した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを用いてニューロン濃縮サンプルからＤＮＡを回収して、続いて、エタノール沈殿により濃縮した。Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１１６８１８３４００１、低いスタートテンプレート（ｌｏｗ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）、５０サイクル；Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、以前に記載されたプライマー（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２５２（２００８））を用いて無傷のキャプシドライブラリー配列を回収した。その後にエラープローンＰＣＲステップを用いて、ラウンド間のライブラリーをさらに多様化した。プールされた突然変異誘発されたＰＣＲ産物をＷＴ ＡＡＶ主鎖中に戻してクローン化して（ｐＳＳＶ９）、プールされたクローンを用いて次のラウンドのスタートライブラリーを作製した。プールされたクローンを、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびｃａｐを含む１０倍過剰のｐＸＲ２およびアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＸＸ６８０）を用いてＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。この方法により、キメラキャプシドゲノムは、主にＡＡＶ２キャプシド中にパッケージされた。ＡＡＶ２によりキャプシド形成されたキメラライブラリーの力価を、ｑＰＣＲを用いて決定した。それから、それ自身のキャプシド内にそれぞれのキメラＡＡＶゲノムが大部分パッケージ化されるように、細胞あたり５感染単位の感染の多様性でＷＴアデノウイルスとともに、ＡＡＶ２によりキャプシド形成されたキメラを０．５ｖｇ／細胞の感染の多様性でＨＥＫ２９３細胞に加えた。４８時間後、細胞を採取して、記載されるとおりにウイルスを精製して（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：４５０（２０１３））、ｑＰＣＲにより滴定した。合計２ラウンドのセレクションを行なった。回収されたクローンを各ラウンド後に回収して、ｒＡＡＶ ｐＸＲ２主鎖およびＳＳＶ９複製コンピテント主鎖にサブクローニングして、シーケンスした。
クローニング
部位特異的突然変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ ｑｕｉｋ ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ｋｉｔ）を用いて、ｐＧＳＫ２／８（ｒｅｐＡＡＶ２−ｃａｐＡＡＶ８）内に単一の突然変異（Ｅ５３２Ｋ、Ｏｌｉｇ００１ ＶＰ１ナンバリングを使用）を導入するために、ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋを作製した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍを用いてプライマーを設計した；フォワード：５’ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧ３’（配列番号１３５）およびリバース：５’ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（配列番号１３６）。単一のコロニーを増殖させて、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングにより確認した。Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ８ ＶＰ３を作製するために、フォワード（Ｆ１）：５’ＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧ（配列番号１３７）、および、ＶＰ３転写開始で突然変異誘発性のリバースプライマー：５’ＣＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＡＡＧＡＧＡ３’（配列番号１３８）を使用して、ＶＰ１およびＶＰ２を含むＯｌｉｇ００１のＮ末を増幅し、６５９ｂｐフラグメントをもたらした。ＡＡＶ８ ＶＰ３配列のＣ末部分を、用いられたフォワードプライマー：５’ＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡ３’（配列番号１３９）および用いられたリバースプライマー（Ｒ２）：５’ＡＧＡＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣ３’（配列番号１４０）を用いてｐＧＳＫ２／８から増幅して、４３７ｂｐ産物を生じた。２つのＰＣＲ産物は、互いに２０ｂｐの重複する配列を有した。キメラｃａｐ遺伝子の全体を、フラグメントおよびＦ１およびＲ２プライマーの両方を用いて増幅した。最終ＰＣＲ産物（Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ８ ＶＰ３）およびｐＧＳＫ２／８を、ＳｗａＩおよびＢｓｉＷＩで消化した。６２６６ｂｐのＧＳＫ２／８バンドおよび１０７０ｂｐのキメラｃａｐ遺伝子ＰＣＲ産物をゲル抽出した。フラグメントを、１００ｎｇのｐＧＳＫ２／８ベクターを用いて、ベクターに対して３：１の挿入のモル比でライゲーションした。ライゲーション混合物をＢｌｕｅ−ＸＬ（Ａｇｉｌｅｎｔ；２００２４９）細胞中に形質転換して、ＬＢ−Ａｍｐプレート上にプレーティングした。単一コロニーを増殖させて、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを介して確認した。
ＡＡＶベクターの生産
組み換えＡＡＶを、以前に記載されたとおり（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：４５０（２０１３））、ＨＥＫ２９３細胞において三重のプラスミドトランスフェクションの方法の後に、イオジキサノールグラジエント遠心分離およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて生産した。ＣＭＶエンハンサー、ミニチュアニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢｈ）、およびＭＶＭイントロンのコントロールの下で（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１１４３（２０１１））、高いＧＦＰを有する自己相補ゲノムを用いて、全ＡＡＶベクターをパッケージした。ピーク画分を、５％ソルビトールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析して、ＮａＣｌを３５０ｍＭ ＮａＣｌの終濃度まで添加した。ｑＰＣＲを介してウイルス力価を得た（以下参照）。
生体内分布試験およびウイルス力価のためのｑＰＣＲ
ウイルス力価を決定するため、および、生体内分布試験のために、ｑＰＣＲを用いた（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ／ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ｂｏａｒｄ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ Ｎ．Ｃｒａｗｌｅｙ．．．［ｅｔ ａｌ．］Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｕｎｉｔ ４ １７（２０１１））。全ての反応を、Ｒｏｃｈｅ ４８０ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ器具上で、ＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎ−ｂａｓｅｄ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ｆａｓｔ ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造元の説明書に従って行なった。力価のためにウイルスサンプルを調製するために、それらをＤＮａｓｅ Ｉで１時間処理して、それから、ＥＤＴＡを添加して７０℃で１０分間温めることにより、ＤＮａｓｅ Ｉを失活させた。ｑＰＣＲ分析のためにキャプシド形成されたウイルスゲノムを遊離させるために、プロテイナーゼＫで少なくとも２時間、５０℃で反応混合物を消化して、それから、１０分間ボイルしてプロテイナーゼＫを失活させた。サンプルをＰＣＲグレード水中に希釈して、ｑＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用いた。ＧＦＰウイルスの定量化のために、プラスミドＤＮＡを標準として用いた。マウスゲノムのＤＮＡの定量化のために、精製および定量化されたマウスゲノムＤＮＡを標準として用いた。全ての成功的な反応は、Ｒ２値１を用いた検量線を用いて、融解曲線分析により単一の産物を与え、並行して行なっていたテンプレートを含まない反応は、産物を生じなかった。ＧＦＰプライマーは、以下のとおりであった：
フォワード：５’ＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣ３’（配列番号１４１）
リバース：５’ＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＣ３’（配列番号１４２）。
マウスゲノムＤＮＡの定量化のためのＬａｍｉｎＢ２プライマーは、以下のとおりであった：
フォワード：５’ＧＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＣ３’（配列番号１４３）
リバース：５’ＣＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣ３’（配列番号１４４）。
ＡＡＶベクターを滴定するために、以下のプライマーを用いた：
フォワード：５’ＡＡＣＡＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ３’（配列番号１４５）
リバース：５’ＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ３’（配列番号１４６）。
動物の手順
これらの試験で用いられる全ての動物は、１２時間の明暗サイクルに維持されて、水および食料へのアクセスが自由な、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ，２５０〜２５０グラム）または成体雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）のいずれかであった。全てのケアおよび手順は、Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに関するＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅに従い、全ての手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって事前に承認を受けた。
６−ヒドロキシ−ドーパミン処置
はじめに、ラット（Ｎ＝２）を、５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール、ｉ．ｐ．で麻酔して、定位フレーム内に置いた。次に、ラットは、Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ Ｇ，Ｗａｔｓｏｎ Ｃ．，Ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，６ｔｈ ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｂｏｓｔｏｎ（２００７））のアトラスに従って、右側線条体（０．５ｍｍプレグマ前部、３．５ｍｍ側面、５．５ｍｍ頭頂へ、６−ヒドロキシ−ドーパミン（２μｌ、２０μｇ）の片側のみの注入を受けた。この処置は、処置後１４日に、線条体ドーパミン含有量に有意な減少をもたらす。
ＡＡＶキャプシドライブラリー投与
ＡＡＶキャプシドライブラリーを、６−ヒドロキシ−ドーパミン処置後１４日に投与した。それぞれのセレクションのラウンドについて、２匹のラットをはじめにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を用いて麻酔して、続いて、ＡＡＶキャプシドライブラリーウイルスの静脈内尾静脈注入を受けた。３日後、ラットを安楽死させて、右側線条体を切り取った。続いて、その後のＰＣＲクローンレスキューのために、以前に記載のとおり（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：５７０（２０１０））、細胞を機械的に解離した。
定位的なＡＡＶベクター投与
上記のように、ペントバルビタールを用いてラットを麻酔して、定位フレーム内に置いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５％ソルビトールおよび３５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の異なるＡＡＶクローンのそれぞれを、Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ Ｇ，Ｗａｔｓｏｎ Ｃ．，Ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ， ６ｔｈ ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｂｏｓｔｏｎ（２００７））のアトラスに従って、線条体（０．５ｍｍプレグマ前部、３．５ｍｍ側面、５．５ｍｍ頭頂へ、１μｌ／５分）の速度で注入した。ベクター注入後１４日に、免疫組織化学評価のためにラットを屠殺した。
免疫組織化学
ベクター注入後１４日に、ラットは過量投与のペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を受けて、続いて、１００ｍｌの氷冷０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４（２５ｍｌ／分）で経心的に灌流して、１８０ｍｌの氷冷４％パラホルムアルデヒド−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）（３０ｍｌ／分）を続けた。それぞれの脳を、４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒド−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．４）中に後固定した。固定した脳を、Ｌｅｉｃａビブラトーム（４０μｍの厚さ）上で冠状に切開して、さらなる処理まで氷冷０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４中に保管した。免疫染色のために、スライドを０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４中で５分間、３回洗浄して、それから、０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４中、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘおよび１０％ヤギ血清中で、３０分間ブロッキングした。一次抗体ＮｅｕＮ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＭＡＢ３７７）およびＧＦＡＰ（１：２０００；Ｄａｋｏ；Ｚ０３３４）を、４℃で、０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４中、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘおよび５％ヤギ血清中で、一晩、穏やかに撹拌してインキュベートした。切片を０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４中で洗浄して、上述のように再度ブロッキングした。ＮｅｕＮに関する二次ヤギ抗−マウスＡｌｅｘａ ５９４（Ａ１１０３２）またはＧＦＡＰに関するヤギ抗−ウサギＡｌｅｘａ ５９４（Ａ１１０８０）（どちらも、４℃で４５分間、穏やかに撹拌して、０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４中、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘおよび５％ヤギ血清中に、１：５００）。切片を、０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４で３回、それぞれ５分間洗浄した。切片を浮かせて、スライドガラス上に置き、室温で一晩乾燥させた。スライドに蛍光マウント媒体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ）を乗せて、カバーグラスを乗せた。共焦点イメージングを、Ｌｅｉｃａ Ｓｐ２共焦点を用いてＵＮＣ−Ｃｈａｐｅｌ ＨｉｌｌでのＭｉｃｈａｅｌ Ｈｏｏｋｅｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅで行なった。連続的なレーザースキャンを用いて４０倍対物レンズを用いてスライドを可視化して、ｚ−スタックを得た。Ｚ−スタックは、１０〜１２枚のスライドで約４μｍであり、スタックあたり０．３６μｍの厚みであった。Ｌｅｉｃａソフトウェアにおいてスタックを平らにして、Ｉｍａｇｅ Ｊにおいて処理した。少なくとも５つの非依存的なフィールドを用いて、ＧＦＰ陽性細胞およびＮｅｕＮまたはＧＦＡＰとそれらの共標識を計測して、向性を決定した。
生体内分布
成体雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、５％Ｄ−ソルビトールを含む２００μｌのＰＢＳ中、５×１０１０ｖｇ（〜２．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ体重）で、尾静脈に静脈内注入した。注入後１０日に、臓器を採取した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを用いて各臓器から全ＤＮＡを抽出して、ＧＦＰおよびマウスゲノムＬａｍｉｎＢ２の全コピーをｑＰＣＲにより決定した。ＡＡＶ８に関して５匹のマウスから、Ｏｌｉｇ００１に関して４匹のマウスからデータを集めた。
インビトロ結合
混合グリア培養物を、産まれて３日の子犬のＣ５７ＢＬ／６Ｊから調製した。前脳を細かく切り刻み、分離して、Ｔ７５フラスコ中にプレーティングする前に洗浄した。フラスコから細胞を取り出し、それから、およそ５×１０５細胞で５枚の３５ｍｍ組織培養皿へ再プレーティングした。９５％密集度で、ＣＢｈ−ＧＦＰレポーターゲノムを含む４つのＡＡＶウイルス（Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ８ ＶＰ３；Ｏｌｉｇ００１；ＡＡＶ８；ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋ）を希釈して、１００ｖｇ／細胞のＭＯＩで、４通りで別個に加えて、４℃で１０分ごとに混合しながら１時間インキュベートした。プレートを氷冷ＰＢＳで３回リンスして、細胞をプレートからスクラップ化して、ペレット化して、−８０℃で凍結させた。ＰＢＳのみの皿もモックサンプルとして含めた。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを用いてサンプルからＤＮＡを単離した。ウイルスＧＦＰおよびマウスゲノムＬａｍｉｎＢ２の量を、ｑＰＣＲにより決定した。統計分析およびグラフ化をＰｒｉｓｍで行なった。Ｇｒｕｂｂｓ検定を用いて異常値を決定して、その後に除去した。片側マンホイットニー検定を用いて統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を決定した。ＡＡＶ８由来の各ウイルスの平均から、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅを決定した。
結果
オリゴデンドロサイト選択的なＡＡＶキャプシドの同定
シャッフルされたＡＡＶキャプシドライブラリーを、６−ヒドロキシ−ドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の片側のみの投与後２週に静脈内に投与して、３日後に、分離した線条体細胞からＰＣＲによってＡＡＶクローンを回収した。驚くべきことに、１０個中１０個の選択クローンが、同一でなくても非常に類似の配列を有した。キャプシドシャッフリング、ライブラリー投与およびクローン選択の２回目のラウンドでさえ、１２個中１２個のクローンが、最初のラウンドと同様に、ほとんど同一の配列を有した（図１０Ａ）。片側のみ６−ＯＨＤＡで処置されたラットに、キメラウイルス（Ｏｌｉｇ００１と呼ばれる）を静脈内投与した場合、２週後に、免疫組織化学的検査は、同側性の線条体内の少数のＧＦＰ陽性ニューロンおよび希薄な数のオリゴデンドロサイト様細胞のみ示した。著しく対照的に、ナイーブのラットへのＯｌｉｇ００１クローンの線条体注入の２週後、オリゴデンドロサイトは、遺伝子発現は構成的ＣＢｈプロモーターにより作動されるにもかかわらず、大多数の形質導入された細胞を含んだ（図１０Ｂ〜１０Ｅ）。ＧＦＰ陽性細胞は、線条体パッチ／マトリックスにおいて、ミエリンの明らかな標識で典型的なオリゴデンドロサイト形態を示した（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。さらに、ＧＦＰ陽性細胞は、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、星状細胞マーカーと共局在せず（図１０Ｄ）、たった約５％のＧＦＰ陽性細胞が、ＮｅｕＮ、ニューロンのマーカーと共局在した（図１０Ｅ）。したがって、ほとんど全てのＧＦＰ陽性細胞（＞９５％）は、ほんの少数のニューロンを有するオリゴデンドロサイトであり、ＧＦＰ陽性星状細胞またはミクログリアではなかった。向性におけるこの変化は、Ｏｌｉｇ００１キャプシド配列のＶＰ３に特異的な部分と９９．３％の相同性（７アミノ酸の違い）を共有するＡＡＶ８のニューロン向性の特徴と直接対照をなす（図１０Ａ）。
Ｏｌｉｇ００１は、末梢組織から脱標的化される。
選択プロセスがキャプシドライブラリーの静脈内投与と関与することを考慮して、我々は、ＡＡＶ８と比較して、野生型齧歯類におけるＯｌｉｇ００１の生体内分布を特徴付けようとした。成体雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、等量のどちらかのウイルスの静脈内投与を受けた。１０日後、臓器を採取して、生体内分布を、Ｏｌｉｇ００１−ＣＢｈ−ＧＦＰ（白い棒）およびＡＡＶ８−ＣＢｈ−ＧＦＰ（灰色の棒）に関して、ｑＰＣＲにより定量した（図１１）。Ｏｌｉｇ００１の生体内分布は、ＡＡＶ８と比較して、試験された全ての末梢臓器、特に肝臓において、有意に減少した（図１１）。我々の以前の結果と合わせると、これらのデータは、Ｏｌｉｇ００１が、ＣＮＳの中および外の両方で、関連するＡＡＶ８とは大きく異なる向性を有することを示す。
ＡＡＶ８におけるＥ５３２Ｋ突然変異は、向性をニューロンからオリゴデンドロサイトに転換させる。
ＡＡＶ８のＶＰ３領域からＯｌｉｇ００１を区別する７アミノ酸のうち、これまで、１残基のみが（Ｏｌｉｇ００１ ＶＰ１ナンバリングを使用してＥ５３２Ｋ、または、ＡＡＶ８ ＶＰ１ナンバリングを使用してＥ５３３Ｋ）、受容体／リガンド相互作用の変化と関連している（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１３９３（２００６））。Ｗｕおよび同僚は、密接に関連するＡＡＶ１とＡＡＶ６との間に見られるリガンド結合および組織向性の違いは、単に、対応する５３２残基のリジンまたはグルタミン酸により説明されること、および、ＡＡＶ８内のＥ５３３Ｋ突然変異が、ヘパリンサルフェートに結合する新たな能力を与えることを見いだした（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１３９３（２００６））。続いて我々は、脳における、ＡＡＶ８の向性に対するＥ５３２Ｋ突然変異の影響を試験した（図１２Ａ）。ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋを、ＣＢｈ−ＧＦＰとともにパッケージして、２×１０８ｖｇ／μｌの力価で野生型雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの線条体へ注入した。注入後２週に、脳を採取して、ニューロン（ＮｅｕＮ）および星状細胞（ＧＦＡＰ）マーカーを用いてネイティブＧＦＰの共局在について評価した（図１２Ｂ〜１２Ｇ）。ネイティブＧＦＰは、ニューロン（図１２Ｂ〜１２Ｄ）または星状細胞（図１２Ｅ〜１２Ｇ）マーカーのいずれとも共局在しなかった。対照的に、ＧＦＰ陽性細胞は、オリゴデンドロサイトの特徴的な形態を示した。合わせると、Ｅ５３２Ｋ突然変異を有するＡＡＶ８は、ＡＡＶ８の向性をニューロン選択的からオリゴデンドロサイト選択的へ変化させ、Ｏｌｉｇ００１内の同一残基がオリゴデンドロサイト向性に向かう役割を示す。しかしながら、Ｏｌｉｇ００１の関連において、我々は、突然変異（Ｋ５３２Ｅ）の逆転はオリゴデンドロサイト向性に影響しないことを見いだした（図１５に要約される）。
Ｏｌｉｇ００１オリゴデンドロサイト向性は、ＶＰ３の外側のアミノ酸により与えられる
伝統的に、ＶＰ３残基のみが、ＡＡＶ血清型の向性および細胞外受容体結合に寄与すると考えられていて、一方、Ｎ末部分の特定のＶＰ１およびＶＰ２部分は、エンドソームのエスケープおよび核内移行を仲介すると考えられている（Ｂｌｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：２５２８（２００５）；Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５１９９（２００６）；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５２９６（２００５）；Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１０４０（２００６））。オリゴデンドロサイト向性に寄与するＯｌｉｇ００１キャプシドの特定のアミノ酸を同定するために、我々は、ＶＰ３内の７残基の違いをＡＡＶ８残基に返還するＯｌｉｇ００１突然変異体を作製した。しかしながら、ラット線条体におけるＯｌｉｇ００１のオリゴデンドロサイト向性を細胞の９８％未満に低下させる単一またはクラスターのＯｌｉｇ００１ ＶＰ３内の突然変異（単数または複数）はなかった（図１５に要約される）。同様に、末梢臓器生体内分布は、試験された全ての突然変異体において非常に減少して、最も大きな減少は、ＶＰ１／ＶＰ２特異的領域Ｏｌｉｇ００１を保持する突然変異体に見られた（図１６）。次のステップとして、我々は、全てのＯｌｉｇ００１ ＶＰ３配列をＡＡＶ８ ＶＰ３配列で置き換えて、ＶＰ３の全体的な寄与を評価した（図１３Ａ）。ＡＡＶ８ ＶＰ３を有する突然変異体Ｏｌｉｇ００１（Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ８ ＶＰ３）を、ＣＢｈ−ＧＦＰとともにパッケージして、野生型雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの線条体へ注入した。２週後、脳を採取して、ニューロン（ＮｅｕＮ）および星状細胞（ＧＦＡＰ）マーカーを用いてネイティブＧＦＰの共局在について評価した（図１３Ｂ〜１３Ｇ）。ネイティブＧＦＰは、ＮｅｕＮとほとんど（細胞の２％）共局在せず（図１３Ｂ〜１３Ｄ）、ＧＦＡＰとは共局在しなかった（図１３Ｅ〜１３Ｇ）。加えて、ＧＦＰ陽性細胞は、線条体オリゴデンドロサイトの特徴的な形態を示した。これらの結果は、キャプシドのＶＰ１／ＶＰ２に特異的な部分が、ＡＡＶ向性に対して、これまで評価されていなかった影響を有することを示唆する。
インビトロの結合データ
Ｏｌｉｇ００１キャプシドのＶＰ１／ＶＰ２に特異的な部分は、オリゴデンドロサイト上の受容体（単数または複数）への細胞外結合の増加を通して、または、オリゴデンドロサイトに特異的であり得る未知のメカニズムによる細胞内トラフィッキングの増大を介して、オリゴデンドロサイトの好ましい形質導入へ向けられ得る。これらの２つのシナリオ間を区別するために、我々は、Ｏｌｉｇ００１、Ｏｌｉｇ００１／ＶＰ３ ＡＡＶ８突然変異体、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋ突然変異体を含む混合グリア培養物（全てＣＢｈ−ＧＦＰとともにパッケージ）を用いて、インビトロ結合実験を行なった。混合グリア培養物を、同等量の各ウイルスとともに４℃で１時間インキュベートした。この手順は、ベクターが細胞表面に結合するのを可能にするが、内部移行を防止する（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：３１７（２０１２））。細胞に結合したベクターの量を、ＧＦＰに関してｑＰＣＲにより定量化して、マウスゲノムＬａｍｉｎＢ２に対して正規化した（図１４Ａ）。我々のインビボでの結果と一致して、Ｏｌｉｇ００１は、混合されたグリア細胞集団に、ＡＡＶ８よりも９倍多く結合した（図１４Ｂ）。Ｏｌｉｇ００１／ＡＡＶ ＶＰ３の結合は、Ｏｌｉｇ００１よりもわずかに低く（ＡＡＶ８よりも４倍多い）、一方で、ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋは、ＡＡＶ８よりも４６倍多く結合した（図１１Ｂ）。これらの結果は、Ｅ５３２Ｋ突然変異およびＶＰ１／ＶＰ２に特異的なＮ末ドメインの両方ともが、Ｏｌｉｇ００１のオリゴデンドロサイト向性に、余剰（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）の様式でそれぞれ寄与することを示唆する。したがって、インビトロデータは、観察されたインビボ向性データと一致する。
これらの試験は、オリゴデンドロサイトに関する選択的なインビボ向性を有する新規のキメラＡＡＶキャプシド変異、キメラの親ＡＡＶ血清型の正常のニューロンの向性からの大きな離脱を示す知見を生じた。過去の試験は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８がオリゴデンドロサイトを低効率で形質導入する能力を示しているが、これらの試験は、ニューロン、これらのベクターに関する好ましい細胞型での発現を防止するために、オリゴデンドロサイトプロモーターの使用を必要とした（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５：５０４（１９９９）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０（１９９８）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：５１７（２００６）；Ｌａｗｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１６９２（２００９））。対照的に、Ｏｌｉｇ００１は、頭蓋内投与後に、ユビキタスプロモーターを用いてオリゴデンドロサイトを効率的および選択的に形質導入する能力を有する。したがって、Ｏｌｉｇ００１は、オリゴデンドロサイトに関して好ましい向性、および、ニューロンに関して低い向性を有し、これまでに報告されたどのＡＡＶキャプシドとも異なる。
我々は、このオリゴデンドロサイト向性を作動するのに十分であるＯｌｉｇ００１キャプシドの２つの別個および余剰（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）の領域を同定した。興味深いことに、ＡＡＶ８における単一アミノ酸の突然変異、Ｅ５３２Ｋ（ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋ）は、オリゴデンドロサイトに関して獲得された向性を選択して、そのニューロン向性を大いに低下させるのに十分である。しかしながら、ＡＡＶ８／Ｅ５３２Ｋ突然変異体は、インビトロで、オリゴデンドロサイトに対して、有意に増加した結合（ＡＡＶ８よりも４６倍高い）を示すので、このオリゴデンドロサイト選択性は、ニューロン向性の単一の損失により生じるのではない（図１５）。キャプシドＯＲＦのＶＰ１／ＶＰ２に特異的なＮ末内でのその位置を考慮すると、そのオリゴデンドロサイト向性を与えるＯｌｉｇ００１の第二のドメインは、おそらく、より興味深いものである。キャプシドのＶＰ３に特異的な領域（ビリオンあたり、６０個の全キャプシドサブユニットのうち５４個を占める（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：８６０（１９７１）；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６（１９７１））は、一般に、受容体結合に関与する主要エレメントを含むと考えられている（（Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０７：４７（２０１１）に概説される）。著しく対照的に、ＡＡＶ向性におけるＶＰ１／ＶＰ２依存的な転換は、ＶＰ３配列の操作のみがＡＡＶベクター向性に対する寄与因子ではないことを示す。明らかに、我々の知見は、ＶＰ１およびＶＰ２（ビリオンあたり、６０個の全キャプシドサブユニットのうち５４個を占める（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：８６０（１９７１）；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６（１９７１））が、細胞内トラフィッキングよりむしろ細胞外結合により生じるＡＡＶベクター向性に対して大きな影響を及ぼし得ることを示す。
本明細書に記載のＯｌｉｇ００１ベクターは、効率的な化学的トランスフェクションまたはベクターにより仲介される形質導入に対して典型的に難治性である、オリゴデンドロサイトへの遺伝子導入が必要な、インビボおよびインビトロでの研究用途に有用であり得る。さらに、オリゴデンドロサイトにインビボで効率的に標的化する能力は、脱髄性疾患、例えばカナバン病またはクラッベ病に関する治療ストラテジーを発展させ得る。これらの試験は、ＡＡＶの向性が、ＶＰ１／ＶＰ１に特異的なＮ末ドメインよりむしろ、もっぱらキャプシドのＶＰ３に特異的な部分によって規定されるという一般に受け入れられた見解に、さらに挑戦する。
前述したものは本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲と同等のものはその中に含められる。

Claims (171)

  1. ＡＡＶキャプシドをコードする核酸であって、前記核酸は、
    （ａ）配列番号１〜４３のいずれか１つのヌクレオチド配列；または
    （ｂ）配列番号４４〜８６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列
    と少なくとも７０％同一である、ＡＡＶキャプシドコード配列
    を含む、
    核酸。
  2. 請求項１の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、
    核酸。
  3. 請求項１の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、
    核酸。
  4. 請求項１の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、
    核酸。
  5. 請求項１の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、
    核酸。
  6. ＡＡＶキャプシドをコードする核酸であって、
    前記核酸は、
    （ａ）配列番号１〜４３のいずれか１つのヌクレオチド配列；または
    （ｂ）配列番号４４〜８６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列；
    と少なくとも７０％同一である、ＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、
    異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分に作動可能に連結される、
    核酸。
  7. 請求項６の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列の前記のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、
    核酸。
  8. 請求項６の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列の前記のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、
    核酸。
  9. 請求項６の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列の前記のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、
    核酸。
  10. 請求項６の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列の前記のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、
    核酸。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター、細菌人工染色体、または酵母人工染色体である、
    核酸。
  12. 請求項１から１１のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、前記コード配列を含むＡＡＶベクターである、
    核酸。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列をさらに含む、
    核酸。
  14. インビトロでの細胞であって、
    ゲノムに安定的に組み込まれた請求項１から１３のいずれか一項の核酸を含む、
    インビトロでの細胞。
  15. 請求項１から１３のいずれか一項の核酸を含む、
    ウイルス粒子。
  16. 請求項１５のウイルス粒子であって、
    前記ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、または、バキュロウイルス粒子である、
    ウイルス粒子。
  17. ＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  18. 請求項１７のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  19. 請求項１７のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  20. 請求項１７のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  21. ＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含み；
    異なるＡＡＶキャプシドのＶＰ３部分に作動可能に連結される、
    ＡＡＶキャプシド。
  22. 請求項２１のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  23. 請求項２１のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  24. 請求項２１のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号４４〜８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  25. 請求項２１から２４のいずれか一項のＡＡＶキャプシドであって、
    ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、および、有機小分子からなる群から選択される化合物に、共有結合され、結合され、またはキャプシド形成する、
    ＡＡＶキャプシド。
  26. ＡＡＶ粒子であって、
    ＡＡＶベクターゲノム；および
    請求項２１から２４のいずれか一項のＡＡＶキャプシド
    を含み、
    前記ＡＡＶキャプシドは、前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する、
    ＡＡＶ粒子。
  27. 請求項２６のＡＡＶ粒子であって、
    前記ＡＡＶベクターゲノムは、異種核酸を含む、
    ＡＡＶ粒子。
  28. 請求項２７のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  29. 請求項２７のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  30. 請求項２９のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、治療的ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  31. 請求項２９のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、成長因子または分化因子をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  32. 請求項２９のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、インスリン様成長因子−１、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、アルテミン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｅｒｉｎ）、パーセフィン、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、形質転換成長因子α、血小板由来成長因子、白血病阻害因子、プロラクチン、モノカルボン酸トランスポーター１、または、核因子１Ａをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  33. 請求項２９のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、レポータータンパク質をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  34. 請求項２６から３３のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  35. 請求項２６から３３のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞に特異的またはＣＮＳ細胞に選択的なプロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  36. 請求項３５のＡＡＶ粒子であって、
    前記のＣＮＳ細胞に特異的またはＣＮＳ細胞に選択的なプロモーターは、ニューロン特異的なエノラーゼ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、グリア線維酸性タンパク質、Ｓ１００β、ｗｄｒ１６、Ｆｏｘｊ１、ＬＲＰ２、ミエリン塩基性タンパク質、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテオリピドタンパク質、Ｇｔｘ、またはＳｏｘ１０由来のプロモーターである、
    ＡＡＶ粒子。
  37. ＡＡＶキャプシドを含む組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法であって、
    前記方法は、
    請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列、異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、および、生産的ＡＡＶ感染を生じさせるためのヘルパー機能を、インビトロで細胞に提供するステップ；および
    前記ＡＡＶキャプシドを含んで前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する前記組み換えＡＡＶ粒子の集合を可能にするステップ、
    を含む、
    方法。
  38. 請求項３７の方法により生産される、
    ＡＡＶ粒子。
  39. 医薬製剤であって、
    請求項１から１３のいずれか一項の核酸、請求項１５または１６のいずれか一項のウイルス粒子、請求項１７から２５のいずれか一項のＡＡＶキャプシド、または、請求項２６から３６または３８のいずれか一項のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容できる担体内に含む、
    医薬製剤。
  40. 目的の核酸をＣＮＳ細胞に送達する方法であって、
    前記方法は、前記細胞を、請求項２６から３６または３８のいずれか一項のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む、
    方法。
  41. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、ＣＮＳ細胞に送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項２６から３６または３８のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項３０の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  42. 請求項４１の方法であって、
    前記の哺乳類の対象は、ヒト対象である、
    方法。
  43. 請求項４１または４２の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、ＣＮＳに送達される、
    方法。
  44. 請求項４３の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって、ＣＮＳに直接送達される、
    方法。
  45. 請求項４３の方法であって、
    前記対象は、損なわれている（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）血液脳関門を有し、
    前記ＡＡＶ粒子は、静脈内投与によってＣＮＳに送達される、
    方法。
  46. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項２６から３６または３８のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項３０の医薬製剤を、哺乳類の対象に静脈内投与するステップを含む、
    方法。
  47. それを必要とする哺乳類の対象において、ＣＮＳ機能障害と関連する障害を治療する方法であって、
    前記方法は、治療的に有効量の請求項２６から３６または３８のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項３９の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  48. ＡＡＶキャプシドをコードする核酸であって、
    前記核酸は、
    （ａ）配列番号８７〜１０７のいずれか１つのヌクレオチド配列；または
    （ｂ）配列番号１０８〜１２８のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列
    と少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列を含む、
    核酸。
  49. 請求項４８の核酸であって、
    前記ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、
    核酸。
  50. 請求項４８の核酸であって、
    前記ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、
    核酸。
  51. 請求項４８の核酸であって、
    前記ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、
    核酸。
  52. 請求項４８の核酸であって、
    前記ＡＡＶキャプシドコード配列は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、
    核酸。
  53. ＡＡＶキャプシドをコードする核酸であって、
    前記核酸は、
    （ａ）配列番号８７〜１０７のいずれか１つのヌクレオチド配列；または
    （ｂ）配列番号１０８〜１２８のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列；
    と少なくとも７０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、
    異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分に作動可能に連結される、
    核酸。
  54. 請求項５３の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、
    核酸。
  55. 請求項５３の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、
    核酸。
  56. 請求項５３の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、
    核酸。
  57. 請求項５３の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、
    核酸。
  58. 請求項４８から５７のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター、細菌人工染色体、または酵母人工染色体である、
    核酸。
  59. 請求項４８から５８のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、前記コード配列を含むＡＡＶベクターである、
    核酸。
  60. 請求項４８から５９のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列をさらに含む、
    核酸。
  61. インビトロでの細胞であって、
    ゲノムに安定的に組み込まれた、請求項４８から６０のいずれか一項の核酸を含む、
    インビトロでの細胞。
  62. ウイルス粒子であって、
    請求項４８から６０のいずれか一項の核酸を含む、
    ウイルス粒子。
  63. 請求項６２のウイルス粒子であって、
    前記ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、または、バキュロウイルス粒子である、
    ウイルス粒子。
  64. ＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  65. 請求項６４のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  66. 請求項６４のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  67. 請求項６４のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  68. ＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含み；
    異なるＡＡＶキャプシドのＶＰ３部分に作動可能に連結される、
    ＡＡＶキャプシド。
  69. 請求項２１のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  70. 請求項２１のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  71. 請求項２１のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１０８〜１２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２部分を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  72. 請求項６４から７１のいずれか一項のＡＡＶキャプシドであって、
    ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、および、有機小分子からなる群から選択される化合物に、共有結合され、結合され、またはキャプシド形成する、
    ＡＡＶキャプシド。
  73. ＡＡＶ粒子であって、
    ＡＡＶベクターゲノム；および
    請求項６４から７１のいずれか一項のＡＡＶキャプシド
    を含み、
    前記ＡＡＶキャプシドは、前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する、
    ＡＡＶ粒子。
  74. 請求項７３のＡＡＶ粒子であって、
    前記ＡＡＶベクターゲノムは、異種核酸を含む、
    ＡＡＶ粒子。
  75. 請求項７４のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  76. 請求項７４のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  77. 請求項７６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、治療的ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  78. 請求項７７のＡＡＶ粒子であって、
    前記治療的ポリペプチドは、メチルシトシン結合タンパク質２である、
    ＡＡＶ粒子。
  79. 請求項７６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、成長因子または分化因子をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  80. 請求項７６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、インスリン様成長因子−１、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、アルテミン、ニュールツリン、パーセフィン、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、形質転換成長因子α、血小板由来成長因子、白血病阻害因子、プロラクチン、モノカルボン酸トランスポーター１、または核因子１Ａを、コードする、
    ＡＡＶ粒子。
  81. 請求項７６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、レポータータンパク質をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  82. 請求項７３から８１のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  83. 請求項７３から８１のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、ＣＮＳ細胞に特異的またはＣＮＳ細胞に選択的なプロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  84. 請求項８３のＡＡＶ粒子であって、
    前記のＣＮＳ細胞に特異的またはＣＮＳ細胞に選択的なプロモーターは、ニューロン特異的なエノラーゼ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、グリア線維酸性タンパク質、Ｓ１００β、ｗｄｒ１６、Ｆｏｘｊ１、ＬＲＰ２、ミエリン塩基性タンパク質、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテオリピドタンパク質、Ｇｔｘ、またはＳｏｘ１０由来のプロモーターである、
    ＡＡＶ粒子。
  85. ＡＡＶキャプシドを含む組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法であって、
    前記方法は、
    請求項４８から６０のいずれか一項に係る核酸、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列、異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、および、生産的ＡＡＶ感染を生じさせるためのヘルパー機能を、インビトロで細胞に提供するステップ；および
    前記ＡＡＶキャプシドを含んで前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する前記組み換えＡＡＶ粒子の集合を可能にするステップ、
    を含む、
    方法。
  86. 請求項８５の方法により生産される、
    ＡＡＶ粒子。
  87. 医薬製剤であって、
    請求項４８から６０のいずれか一項の核酸、請求項６２または６３のいずれか一項のウイルス粒子、請求項６４から７２のいずれか一項のＡＡＶキャプシド、または、請求項７３から８４または８６のいずれか一項のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容できる担体内に含む、
    医薬製剤。
  88. 目的の核酸をＣＮＳ細胞に送達する方法であって、
    前記方法は、前記細胞を、請求項７３から８４または８６のいずれか一項のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む、
    方法。
  89. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、ＣＮＳ細胞に送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項７３から８４または８６のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項８７の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  90. 請求項８９の方法であって、
    前記の哺乳類の対象は、ヒト対象である、
    方法。
  91. 請求項８９または９０の方法であって、
    前記対象は、レット症候群を有する、
    方法。
  92. 請求項８９から９１のいずれか一項の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、ＣＮＳに送達される、
    方法。
  93. 請求項９２の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって、ＣＮＳに直接送達される、
    方法。
  94. 請求項９２の方法であって、
    前記対象は、損なわれている血液脳関門を有し、
    前記ＡＡＶ粒子は、静脈内投与によってＣＮＳに送達される、
    方法。
  95. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項７３から８４または８６のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項８７の医薬製剤を、哺乳類の対象に静脈内投与するステップを含む、
    方法。
  96. 請求項９５の方法であって、
    前記対象は、レット症候群を有する、
    方法。
  97. それを必要とする哺乳類の対象において、レット症候群を治療する方法であって、
    前記方法は、治療的に有効量の請求項７３から８４または８６のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項８７の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  98. ＡＡＶキャプシドをコードする核酸であって、
    前記核酸は、
    （ａ）配列番号１２９のヌクレオチド配列；または
    （ｂ）配列番号１３０〜１３２の１つをコードするヌクレオチド配列；
    と少なくとも９０％同一であるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分を含み、
    異なるＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ３をコードする部分に作動可能に連結される、
    核酸。
  99. 請求項９８の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、
    核酸。
  100. 請求項９８の核酸であって、
    前記のＡＡＶキャプシドコード配列のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ１／ＶＰ２をコードする部分は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列を含む、
    核酸。
  101. 請求項９８から１００のいずれか一項の核酸であって、
    Ｅ５３２Ｋ置換をさらにコードする、
    核酸。
  102. 請求項９８から１０１のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター、細菌人工染色体、または酵母人工染色体である、
    核酸。
  103. 請求項９８から１０２のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、前記コード配列を含むＡＡＶベクターである、
    核酸。
  104. 請求項９８から１０３のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列をさらに含む、
    核酸。
  105. インビトロでの細胞であって、
    ゲノムに安定的に組み込まれた、請求項９８から１０４のいずれか一項の核酸を含む、
    インビトロでの細胞。
  106. ウイルス粒子であって、
    請求項９８から１０４のいずれか一項の核酸を含む、
    ウイルス粒子。
  107. 請求項１０６のウイルス粒子であって、
    前記ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、または、バキュロウイルス粒子である、
    ウイルス粒子。
  108. ＡＡＶキャプシドであって。
    配列番号１３０〜１３２の１つと少なくとも９６％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  109. 請求項１０８のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１３０〜１３２の１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  110. 請求項１０９のＡＡＶキャプシドであって、
    配列番号１３０〜１３２の１つのアミノ酸配列を含む、
    ＡＡＶキャプシド。
  111. 請求項１０８から１１０のいずれか一項のＡＡＶキャプシドであって、
    Ｅ５３２Ｋ置換をさらにコードする、
    ＡＡＶキャプシド。
  112. 請求項１０８から１１１のいずれか一項のＡＡＶキャプシドであって、
    ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、および、有機小分子からなる群から選択される化合物に、共有結合され、結合され、またはキャプシド形成する、
    ＡＡＶキャプシド。
  113. ＡＡＶ粒子であって、
    ＡＡＶベクターゲノム；および
    請求項１０８から１１２のいずれか一項のＡＡＶキャプシド
    を含み、
    前記ＡＡＶキャプシドは、前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する、
    ＡＡＶ粒子。
  114. 請求項１１３のＡＡＶ粒子であって、
    前記ＡＡＶベクターゲノムは、異種核酸を含む、
    ＡＡＶ粒子。
  115. 請求項１１３のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  116. 請求項１１３のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  117. 請求項１１６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、治療的ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  118. 請求項１１６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、成長因子または分化因子をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  119. 請求項１１６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、インスリン成長因子−１、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、アルテミン、形質転換成長因子α、血小板由来成長因子、白血病阻害因子、プロラクチン、モノカルボン酸トランスポーター１、または、核因子１Ａをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  120. 請求項１１６のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、レポータータンパク質をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  121. 請求項１１３から１２０のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  122. 請求項１１３から１２０のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、オリゴデンドロサイト特異的またはオリゴデンドロサイト選択的なプロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  123. 請求項１２２のＡＡＶ粒子であって、
    前記のオリゴデンドロサイト特異的またはオリゴデンドロサイト選択的なプロモーターは、ミエリン塩基性タンパク質、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテオリピドタンパク質、Ｇｔｘ、またはＳｏｘ１０から選択されるプロモーターである、
    ＡＡＶ粒子。
  124. ＡＡＶキャプシドを含む組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法であって、
    前記方法は、
    請求項９８から１０４のいずれか一項に係る核酸、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列、異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、および、生産的ＡＡＶ感染を生じさせるためのヘルパー機能を、インビトロで細胞に提供するステップ；および
    前記ＡＡＶキャプシドを含んで前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する前記組み換えＡＡＶ粒子の集合を可能にするステップ、
    を含む、
    方法。
  125. 請求項１２４の方法により生産される、
    ＡＡＶ粒子。
  126. 医薬製剤であって、
    請求項９８から１０４のいずれか一項の核酸、請求項１０６または１０７のいずれか一項のウイルス粒子、請求項１０８から１１２のいずれか一項のＡＡＶキャプシド、または、請求項１１３から１２３または１２５のいずれか一項のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容できる担体内に含む、
    医薬製剤。
  127. 目的の核酸をオリゴデンドロサイトに送達する方法であって、
    前記方法は、前記オリゴデンドロサイトを、請求項１１３から１２３または１２５のいずれか一項のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む、
    方法。
  128. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、オリゴデンドロサイトに送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項１１３から１２３または１２５のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項１２６の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  129. 請求項１２８の方法であって、
    前記の哺乳類の対象は、ヒト対象である、
    方法。
  130. 請求項１２８または１２９の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される、
    方法。
  131. 請求項１３０の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって、ＣＮＳに直接送達される、
    方法。
  132. 請求項１３１の方法であって、
    前記対象は、損なわれている血液脳関門を有し、
    前記ＡＡＶ粒子は、静脈内投与によってＣＮＳに送達される、
    方法。
  133. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項１１３から１２３または１２５のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項１２６の医薬製剤を、哺乳類の対象に静脈内投与するステップを含む、
    方法。
  134. それを必要とする哺乳類の対象において、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害を治療する方法であって、
    前記方法は、治療的に有効量の請求項１１３から１２３または１２５のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項１２６の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  135. 請求項１３４の方法であって、
    前記のオリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害は、脱髄性疾患である、
    方法。
  136. 請求項１３４の方法であって、
    前記のオリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害は、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッハー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、ツェルウェガー病、１８ｑ−症候群、脳性麻痺、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、フェニールケトン尿症、またはウイルス感染である、
    方法。
  137. 目的の向性プロファイルを有するＡＡＶキャプシドを調製する方法であって、
    前記方法は、前記の目的の向性プロファイルを与えるアミノ酸配列を挿入するために、請求項１０８から１１２のいずれか一項のＡＡＶキャプシドを改変するステップを含む、
    方法。
  138. 請求項１３７の方法であって、
    前記の目的の向性プロファイルは、骨格筋、肝臓、心筋、横隔膜、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、消化管、肺、関節組織、舌、卵巣、精巣、生殖細胞、癌細胞、またはそれらの組み合わせから選択される、組織である、
    方法。
  139. ＡＡＶ８キャプシドをコードする核酸であって、
    前記キャプシドは、Ｅ５３２Ｋ置換を含む、
    核酸。
  140. 請求項１３９の核酸であって、
    前記核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター、細菌人工染色体、または酵母人工染色体である、
    核酸。
  141. 請求項１３９から１４０のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、前記コード配列を含むＡＡＶベクターである、
    核酸。
  142. 請求項１３９から１４１のいずれか一項の核酸であって、
    前記核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列をさらに含む、
    核酸。
  143. インビトロでの細胞であって、
    ゲノムに安定的に組み込まれた、請求項１３９から１４２のいずれか一項の核酸を含む、
    インビトロでの細胞。
  144. ウイルス粒子であって、
    請求項１３９から１４２のいずれか一項の核酸を含む、
    ウイルス粒子。
  145. 請求項１４４のウイルス粒子であって、
    前記ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、または、バキュロウイルス粒子である、
    ウイルス粒子。
  146. Ｅ５３２Ｋ置換を含む、
    ＡＡＶ８キャプシド。
  147. 請求項１４６のＡＡＶキャプシドであって、
    ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、および、有機小分子からなる群から選択される化合物に、共有結合され、結合され、またはキャプシド形成する、
    ＡＡＶキャプシド。
  148. ＡＡＶ粒子であって、
    ＡＡＶベクターゲノム；および
    請求項１４６から１４７のいずれか一項のＡＡＶキャプシド
    を含み、
    前記ＡＡＶキャプシドは、前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する、
    ＡＡＶ粒子。
  149. 請求項１４８のＡＡＶ粒子であって、
    前記ＡＡＶベクターゲノムは、異種核酸を含む、
    ＡＡＶ粒子。
  150. 請求項１４８のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  151. 請求項１４８のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  152. 請求項１５１のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、治療的ポリペプチドをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  153. 請求項１５１のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、成長因子または分化因子をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  154. 請求項１５１のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、インスリン成長因子−１、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、アルテミン、形質転換成長因子α、血小板由来成長因子、白血病阻害因子、プロラクチン、モノカルボン酸トランスポーター１、または、核因子１Ａをコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  155. 請求項１５１のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、レポータータンパク質をコードする、
    ＡＡＶ粒子。
  156. 請求項１４８から１５５のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  157. 請求項１４８から１５５のいずれか一項のＡＡＶ粒子であって、
    前記異種核酸は、オリゴデンドロサイト特異的またはオリゴデンドロサイト選択的なプロモーターに作動可能に連結される、
    ＡＡＶ粒子。
  158. 請求項１５７のＡＡＶ粒子であって、
    前記のオリゴデンドロサイト特異的またはオリゴデンドロサイト選択的なプロモーターは、ミエリン塩基性タンパク質、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテオリピドタンパク質、Ｇｔｘ、またはＳｏｘ１０から選択されるプロモーターである、
    ＡＡＶ粒子。
  159. ＡＡＶキャプシドを含む組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法であって、
    前記方法は、
    請求項１３９から１４２のいずれか一項に係る核酸、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列、異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、および、生産的ＡＡＶ感染を生じさせるためのヘルパー機能を、インビトロで細胞に提供するステップ；および
    前記ＡＡＶキャプシドを含んで前記ＡＡＶベクターゲノムをキャプシド形成する前記組み換えＡＡＶ粒子の集合を可能にするステップ、
    を含む、
    方法。
  160. 請求項１５９の方法によって生産される、
    ＡＡＶ粒子。
  161. 医薬製剤であって、
    請求項１３９から１４２のいずれか一項の核酸、請求項１４４または１４５のいずれか一項のウイルス粒子、請求項１４６から１４７のいずれか一項のＡＡＶキャプシド、または、請求項１４８から１５８または１６０のいずれか一項のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容できる担体内に含む、
    医薬製剤。
  162. 目的の核酸を、オリゴデンドロサイトに送達する方法であって、
    前記方法は、前記オリゴデンドロサイトを、請求項１４８から１５８または１６０のいずれか一項のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む、
    方法。
  163. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、オリゴデンドロサイトに送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項１４８から１５８または１６０のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項１６１の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  164. 請求項１６３の方法であって、
    前記の哺乳類の対象は、ヒト対象である、
    方法。
  165. 請求項１６３または１６４の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される、
    方法。
  166. 請求項１６５の方法であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって、ＣＮＳに直接送達される、
    方法。
  167. 請求項１６５の方法であって、
    前記対象は、損なわれている血液脳関門を有し、
    前記ＡＡＶ粒子は、静脈内投与によってＣＮＳに送達される、
    方法。
  168. 哺乳類の対象において、目的の核酸を、損なわれている血液脳関門領域に隣接するＣＮＳの領域に送達する方法であって、
    前記方法は、
    有効量の請求項１４８から１５８または１６０のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項１６１の医薬製剤を、哺乳類の対象に静脈内投与するステップを含む、
    方法。
  169. それを必要とする哺乳類の対象において、オリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害を治療する方法であって、
    前記方法は、治療的に有効量の請求項１４８から１５８または１６０のいずれか一項のＡＡＶ粒子または請求項１６１の医薬製剤を、哺乳類の対象に投与するステップを含む、
    方法。
  170. 請求項１６９の方法であって、
    前記のオリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害は、脱髄性疾患である、
    方法。
  171. 請求項１６９の方法であって、
    前記のオリゴデンドロサイト機能障害と関連する障害は、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッハー病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、ツェルウェガー病、１８ｑ−症候群、脳性麻痺、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、フェニールケトン尿症、またはウイルス感染である、
    方法。
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