JP2021058175A - 細胞押さえ具、細胞層作製具及び細胞層製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞組織の厚みが一定で、細胞単体での評価や観察が可能な細胞組織体を作製する技術の提供。【解決手段】細胞非接着性領域を有し、培養容器２の凹部３に挿入される細胞押さえ部材１１と、前記凹部３に挿入された前記細胞押さえ部材１１を、その下端の押さえ面１１ａが前記凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に前記凹部３の前記内底面３ａに平行に配置されるように支持する支持機構１２と、を有する細胞押さえ具１Ａ。【選択図】図３

Description

本発明は、細胞押さえ具、細胞層作製具及び細胞層製造方法に関する。

細胞を培養して単層又は重層の細胞組織体を作製する場合、細胞は培養面の一部、培養器の周縁部等に凝集やスフェロイドが生じることがある。そのため、厚みが一定で且つ平らな細胞組織体を作製するのは困難である。特に辺縁部において細胞が凝集またはスフェロイドが生じた場合、辺縁部とその他の部位の屈折率に差が生じるため、細胞組織体の観察において問題が生じる。

これまでに、厚みが一定で且つ平らな細胞組織体を作製する方法として、細胞シートを重ねることにより、一定以上の厚みを持つ細胞シートを作製する方法が知られている。

例えば、特許文献１には、積層化細胞シート組成物を短時間で効率的に製造する目的で、重層する細胞シートへ細胞接着性物質を塗布して圧力印加することにより、細胞シートを積層するために必要な時間を短縮する方法が開示されている。

しかしながら、細胞シートを積層する方式では、細胞シートを積層する際に接着性物質が使用されている。特にトロンビン及びフィブリノーゲンを使用した場合、フィブリンゲルが形成され、細胞のみについて評価や観察を行うことができないという問題があった。

そこで、本発明は、細胞組織の厚みが一定で、細胞単体での評価や観察が可能な細胞組織体を作製する技術を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
細胞非接着性領域を有し、培養容器の凹部に挿入される細胞押さえ部材と、前記凹部に挿入された前記細胞押さえ部材を、その下端の押さえ面が前記凹部の内底面から上方に離間した位置に前記凹部の前記内底面に平行に配置されるように支持する支持機構と、を有する細胞押さえ具。

本発明によれば、本発明は、接着性物質を用いることなく、組織の厚みを制御しつつ、厚みが一定で且つ平らな細胞のみからなる細胞組織体を作製する技術を提供することができる。

細胞押さえ具１０の部分正断面図である。 細胞押さえ具１０の平面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ｂの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ｃの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ｄの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ｅの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ｆの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ｆの平面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。 細胞層作製具１Ａの部分正断面図である。

［細胞押さえ具］
本発明の１実施形態にかかる細胞押さえ具及び細胞層作製具を、図面を参照して説明する。なお、図１、図３〜図１０、図１２〜図１５において、上側を上、下側を下として説明する。

図３等に例示するように、細胞層作製具１Ａは細胞押さえ具１０Ａと培養容器２とで構成されている。

図３に例示した培養容器２は、その上面４から窪む凹部３が形成されたものである。なお、凹部３の内底面３ａは凹部３の深さ方向に垂直に延在する平坦面である。

培養容器２としては、例えば、ボトル、フラスコ、ディッシュ、マルチディッシュ、ウェルプレート等を挙げることができるが、これに限定されず、当業者に公知の培養容器を用いることができる。

培養容器２の凹部３の内底面３ａは、細胞接着性が付与されている。細胞接着性を付与する方法としては、プラズマ処理、細胞接着性材料の付与等、公知の方法を用いることができる。

図１、図３に示すように、細胞押さえ具１０Ａは、培養容器２の凹部３に挿入される細胞押さえ部材１１と、細胞押さえ具１０Ａの下端の押さえ面１１ａから突出されたピン状の突起（支持機構）１２とを備えている。また、細胞押さえ具１０Ａは、細胞押さえ部材１１の側面１１ｂから突出するスペーサ用突起１３も備えている。

図１〜図５に例示した細胞押さえ部材１１は円板状に形成されている。細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａは板状（図１〜図５では円板状）の細胞押さえ部材１１の片面である。
細胞押さえ部材１１は、円板状に限定されず、両面が四角形、五角形、六角形等の多角形の板状（多角形板状）であっても良い。また、細胞押さえ部材１１は、その両面の中心を通る中心軸線から側面までの最大寸法が厚みよりも大きい板状に限定されず、中心軸線から側面までの最大寸法よりも厚みの方が大きい柱状であっても良い。柱状の細胞押さえ部材１１は、四角形、五角形、六角形等の多角形断面形状で延在する多角形柱状、あるいは断面円形で延在する円柱状を挙げることができる。また、柱状の細胞押さえ部材１１は、その中心軸線方向片側の端面を押さえ面１１ａとして使用する。

細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａは平坦面である。押さえ面１１ａが平坦面であることにより、平らな細胞層６を製造することができる。

図１、図３に示すように、ピン状の突起１２は細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａから垂直に複数突出しており、各々のピン状の突起１２の先端から押さえ面１１ａまでの長さは同一である。

突起１２は、細胞押さえ具１０Ａの押さえ部材１１と一体であってもよいし、別体であってもよい。別体の突起１２は、例えば、細胞押さえ部材１１に一部を埋設固定、あるいはねじ込み等の機械的固定によって取り付けたもの等を採用できる。

細胞押さえ部材１１、突起１２、及びスペーサ用突起１３の表層は細胞非接着性材料で形成されていてもよい。細胞押さえ部材の細胞非接着性材料としては、例えば、ガラスやＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｓｉｌｏｘａｎｅ）等を挙げることができるが、これに限定されず、当業者に公知の細胞非接着性材料を用いることができる。

細胞押さえ部材１１、突起１２、及びスペーサ用突起１３はその表面が細胞非接着性処理されたものであってもよい。細胞非接着性処理としては、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣポリマー）を塗布することであってもよいが、これに限定されない。なお、細胞押さえ部材１１の細胞非接着性処理の範囲について、押さえ面１１ａと、押さえ面１１ａに接する側面１１ｂのうち、少なくとも、細胞と接触する、または接触する可能性のある領域について、細胞非接着性材料とする、もしくは細胞非接着性処理されるようにしてもよい。このようにすることにより、細胞押さえ部材１１を細胞から離すときに細胞への影響を抑えることが可能となる。

図２に例示するように、スペーサ用突起１３は、細胞押さえ部材１１の側面１１ｂから突出され、細胞押さえ部材１１の側面の周方向の複数箇所に分散配置されている。図２において、複数のスペーサ用突起１３は、細胞押さえ部材１１の側面の周方向に互いに間隔開けて均等配置されている。

図４に例示するように、スペーサ用突起１３は、細胞押さえ部材１１の側面から突出した横棒１３ｂと、横棒１３ｂの先端に接続し押さえ面１１ａと垂直な方向に延びた縦棒１３ａとを有している。
図２において、スペーサ用突起１３の横棒１３ｂは、細胞押さえ部材１１の側面から押さえ面１１ａに沿う方向に突出されている。
スペーサ用突起１３の縦棒１３ａは、横棒１３ｂから下方へ延出する部分（以下、下側延出部、とも言う）と、横棒１３ｂから上方へ延出する部分（以下、上側延出部、とも言う）とを有している。縦棒１３ａの下側延出部の細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａから下方への突出寸法は、複数のピン状の突起１２の細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａから下方への突出寸法と同じに揃えられている。

図４等に例示するように、押さえ面１１ａから突出された突起１２は、先端が凹部３の内底面３ａに突き当てられる。また、図４に例示するように、縦棒１３ａの横棒１３ｂの下側延出部の先端（下端）は、凹部３の内底面３ａにその上方から当接する。
図４等に例示したスペーサ用突起１３は、その縦棒１３ａの下側延出部の先端が凹部３の内底面３ａに当接することで、細胞押さえ部材１１を押さえ面１１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置にて凹部３の内底面３ａと平行となるように支持する突起の役割を果たす。

図４に例示するように、横棒１３ｂは凹部３の内周面３ｂに当接され、縦棒１３ａは凹部３に挿入された細胞押さえ部材１１と凹部３の内周面３ｂ全周との間にクリアランス１８を確保する。

スペーサ用突起１３は、細胞押さえ部材１１から突出され、凹部３の内底面３ａにその上方から当接される突起１２を兼ねる。上述の通り、スペーサ用突起１３の細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａから下方への突出寸法と、複数のピン状の突起１２の長さは同一である。そのため、スペーサ用突起１３は凹部３の内底面３ａに当接すると、細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａを、凹部３の内底面３ａと平行、且つ、凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に支持する役割を果たす。

次に、細胞層作製具１Ａを用いて細胞層を製造する細胞層製造方法の一例を説明する。
まず、図３に例示するように、凹部３に細胞を入れて細胞接着性処理された凹部３の内底面３ａに付着させる。さらに凹部３に細胞を入れ、突起１２の細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａからの突出寸法より厚く細胞を堆積させて細胞堆積層５を形成させ、凹部３に培養液を入れる。細胞堆積層５の細胞同士は密に接着しておらず、細胞堆積層５は押圧力等の外力に対して容易に流動する流動性を有する。

続いて、図４に例示するように、細胞押さえ具１０Ａの細胞押さえ部材１１を凹部３内にその上方から挿入する。細胞押さえ部材１１は、凹部３に突起１２の先端が凹部３の内底面３ａに突き当たるまで挿入する。その結果、細胞押さえ部材１１は、凹部３の内底面３ａから突起１２の寸法相当だけ上方に離間した位置に支持される。

凹部３に挿入した細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａは、細胞押さえ部材１１を凹部３に対してその内底面３ａに向かって下降させていく過程で、突起１２先端が凹部３の内底面３ａに突き当たる前に、細胞堆積層５の押圧を開始する。培養する前の堆積した細胞堆積層５は流動性が高く、細胞押さえ部材１１によって押圧すると容易に変形して、細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａに面接触する。

細胞堆積層５を細胞押さえ部材１１によって押圧すると、細胞堆積層５を形成する細胞の一部が、スペーサ用突起１３により細胞押さえ部材１１と凹部３の内周面３ｂ全周との間のクリアランス１８に流出する。流出した細胞は、ピペット等で吸引することにより除去し、細胞堆積層５における細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａの面方向外側に位置する辺縁部を平坦化する。ピペットによるクリアランス１８内の細胞の吸引除去はピペット先端をクリアランス１８に挿入して行なう。細胞堆積層５の辺縁部は押さえ面１１ａと面一に平坦化する。
なお、例えば、細胞堆積層５の流動性が非常に高く、凹部３への細胞投入量を調整することで、細胞堆積層５の流動性によって細胞堆積層５に細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａと面一の平坦な上面が得られる場合などは、ピペットによるクリアランス１８内の細胞の吸引を省略できる。

引き続いて、突起１２先端の凹部３の内底面３ａに対する突き当て状態を維持したまま細胞堆積層５を形成する細胞を培養して細胞同士を接着させる。つまり、細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａの凹部３の内底面３ａからの離間距離を維持したまま細胞堆積層５の細胞を培養して互いに接着させ、細胞層６（図５参照）を形成する。細胞層６には細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａに対応する上面が形成される。細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａは凹部３の内底面３ａと平行な平坦面であるため、凹部３内には細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａに対応する平坦な上面を有する細胞層６を形成できる。
細胞堆積層５の細胞の培養は予め設定した時間長さの培養時間だけ行なう。培養時間は例えば２〜３時間であるが、これに限定されるものではない。

予め設定した時間長さの培養時間での細胞堆積層５の細胞の培養が完了したら、次に、図５に例示するように、細胞押さえ具１０Ａを上方へ移動させ凹部３から取り出す。凹部３の上方に移動させることにより、凹部３内には厚みが一定で且つ上面が平らな細胞層６が残る。細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａは凹部３の内底面３ａと平行であるため、細胞層６の上面と底面は平行な面を有する。この細胞層６の上面は平らであるため、顕微鏡等の観察に適している。

図５において、スペーサ用突起１３の縦棒１３ａは、凹部３から上方に突出する長さを有する。
図５において、スペーサ用突起１３の縦棒１３ａの凹部３から上方に突出した部分は、細胞押さえ具１０Ａを凹部３から取り出すために手指等で把持する取っ手の役割を果たす。

図６は、変形例の細胞押さえ具１０Ｂを示す。
また、図６は、変形例の細胞押さえ具１０Ｂと培養容器２とで構成される細胞層作製具１Ｂも示している。細胞層作製具１Ｂは、図３〜図５の細胞層作製具１Ａについて、細胞押さえ具１０Ａを図６の細胞押さえ具１０Ｂに変更したものである。

図６に例示した細胞押さえ具１０Ｂは、図１〜図５を参照して説明した細胞押さえ具１０Ａについて細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａから突出する突起１２を省略し、細胞押さえ部材１１にその側面１１ｂから突出する突起１４（以下、側部突起、とも言う）を設けたものである。
側部突起１４は、細胞押さえ部材１１の側面１１ｂの周方向の互いに離間した複数箇所に均等配置されている。

図６に例示した細胞層作製具１Ｂの側部突起１４は、細胞押さえ部材１１を培養容器２の凹部３にその上方から挿入していくときに、培養容器２の上面４にその上方から当接する。図６に例示した細胞層作製具１Ｂの細胞押さえ部材１１は、側部突起１４が培養容器２の上面４に当接することで、凹部３に対してその深さ方向において凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に位置決めされる。また、図６に例示した細胞層作製具１Ｂの細胞押さえ部材１１は、その周囲の各側部突起１４が培養容器２の上面４に当接することで、側部突起１４によって培養容器２に対して、押さえ面１１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に内底面３ａに平行に配置されるように支持される。
側部突起１４は、細胞押さえ部材１１を、押さえ面１１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に内底面３ａに平行に配置されるように支持する支持機構の役割を果たす。

図６に例示した細胞層作製具１Ｂは、図３に示すように凹部３内に細胞堆積層５及び培養液を入れた後、細胞押さえ部材１１を凹部３に挿入し、側部突起１４を培養容器２の上面４に当接させることで、細胞堆積層５を細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａに面接触させることができる。図６に例示した細胞層作製具１Ｂは、培養容器２の上面４に対する側部突起１４の当接を維持したまま、細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａに面接触させた細胞堆積層５を培養して細胞層６を形成した後、培養容器２に対して上方へ移動させるだけで凹部３から撤去できる。図６に例示した細胞層作製具１Ｂは、上面が平坦な細胞層６の形成（作製）に利用できる。

なお、図６に例示した細胞層作製具１Ｂは、培養容器２の上面４に当接させた側部突起１４間にピペットを、細胞押さえ部材１１の側面１１ｂと凹部３の内周面３ｂとの間に確保されたクリアランス１８まで挿入するための隙間が確保された構成を好適に採用できる。
但し、図６に例示した細胞層作製具１Ｂは、培養容器２の上面４に当接させた側部突起１４間にピペットを挿入可能な隙間が確保されていない構成も採用可能である。

図７に例示する細胞層作製具１Ｃは、複数の凹部３を有する培養容器２と、培養容器２の凹部３の開口部を開閉する蓋１５とを備えている。蓋１５は、蓋板１５ａと、蓋板１５ａの片面に設けられた複数の細胞押さえ具１０Ａとを備えている。細胞押さえ具１０Ａは細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａから突出された複数の突起１２（支持機構）を含む。

図７に例示した細胞層作製具１Ｃの培養容器２の上面４上には、ゴム、エラストマ等の柔軟性に富む高分子材料によって形成されたシール材４ａが設けられている。蓋１５の蓋板１５ａは、細胞押さえ部材１１を培養容器２の凹部３にその上方から挿入していくときに、培養容器２のシール材４ａにその上方から当接する。蓋１５の複数の細胞押さえ具１０Ａの細胞押さえ部材１１は、蓋板１５ａを培養容器２の上面４に当接することにより、培養容器２の複数の凹部３へ同時に挿入される。

培養容器２の凹部３に挿入された細胞押さえ部材１１は、押さえ面１１ａから突出されている突起１２の先端が凹部３の内底面３ａに突き当てられることで、複数の突起１２によって、押さえ面１１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に内底面３ａに平行に配置されるように支持される。蓋１５の蓋板１５aは、各細胞押さえ具１０Ａの突起１２の先端が凹部３の内底面３ａに突き当てられることで、培養容器２のシール材４ａに当接されシール材４ａ上に載置される。
図７に例示した細胞層作製具１Ｃでは、培養容器２や蓋板１５ａの形成精度に依らず、各細胞押さえ部材１１の内底面に対する高さ方向（上下方向）の位置決めを突起１２によって実現できる。

図７に例示した細胞層作製具１Ｃ及び蓋１５は、図３に示すように凹部３内に細胞堆積層５及び培養液を入れた後、細胞押さえ部材１１を凹部３に挿入し、蓋板１５ａを培養容器２のシール材４ａ上に載置して、細胞層の作製に用いることができる。蓋板１５ａを培養容器２のシール材４ａ上に載置した蓋１５は、予め設定した時間長さの培養時間の細胞培養を行なった後、培養容器２に対して上方へ移動させて撤去する。蓋１５を培養容器２から撤去すれば、凹部３に挿入状態の複数の細胞押さえ部材１１を一挙に凹部３から取り出すことができる。

図８は、変形例の細胞層作製具１Ｄ及び細胞押さえ具１０Ｄを例示する。
図８の細胞層作製具１Ｄは、図３〜図５の細胞層作製具１Ａについて、細胞押さえ具１０Ａを図８の細胞押さえ具１０Ｄに変更したものである。
図８の細胞押さえ具１０Ｄは、細胞押さえ部材２１と、細胞押さえ部材２１にその押さえ面２１ａからの突出寸法を変更可能に取り付けられた雄ねじ軸付きピン２２とを有するものである。

図８の細胞押さえ具１０Ｄの細胞押さえ部材２１は、図１〜図５を参照して説明した細胞押さえ具１０Ａの細胞押さえ部材１１に、雌ねじ孔２１ｃとピン収容孔２１ｅとを形成したものである。
なお、図８の細胞押さえ具１０Ｄの細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａは、図１、図３〜図５を参照して説明した細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａと同様の構成である。

図８の細胞押さえ具１０Ｄの細胞押さえ部材２１の雌ねじ孔２１ｃは、細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａとは逆の上面２１ｂから押さえ面２１ａに向かって窪んで形成されている。
細胞押さえ部材２１のピン収容孔２１ｅは、雌ねじ孔２１ｃの押さえ面２１ａ側の端である孔底から押さえ面２１ａに向かって延在形成され、雌ねじ孔２１ｃ側の基端とは逆の先端側が押さえ面２１ａに開口されている。ピン収容孔２１ｅは雌ねじ孔２１ｃと同軸に延在形成されている。また、ピン収容孔２１ｅは雌ねじ孔２１ｃに比べて径小に形成されている。
雌ねじ孔２１ｃ及びピン収容孔２１ｅは、細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａに垂直に延在形成されている。

雄ねじ軸付きピン２２は、細胞押さえ部材２１のピン収容孔２１ｅに収容されたピン２２ａと、ピン２２ａの延在方向片端に形成された雄ねじ軸２２ｂとを有する。
雄ねじ軸２２ｂはピン２２ａに比べて太く形成されている。
雄ねじ軸２２ｂは細胞押さえ部材２１の雌ねじ孔２１ｃに収容されている。また、雄ねじ軸２２ｂは、その側面に形成された雄ねじ部２２ｃを細胞押さえ部材２１の雌ねじ孔２１ｃ内周面の雌ねじ部２１ｄに螺合させて細胞押さえ部材２１に螺着されている。
雄ねじ軸付きピン２２のピン２２ａは雄ねじ軸２２ｂに同軸に形成されている。

雄ねじ軸２２ｂのピン２２ａ側の先端とは逆の後端には、マイナスドライバー等の工具を係合させて雄ねじ軸付きピン２２を軸回り回転させるための工具係合部２２ｄが形成されている。図８に例示した工具係合部２２ｄはマイナスドライバーの先端を係合可能な工具係合溝である。
図８に例示した雄ねじ軸２２ｂは、その全体を雌ねじ孔２１ｃ内に収容可能なサイズに形成されている。工具係合部２２ｄは、雄ねじ軸２２ｂ全体が雌ねじ孔２１ｃ内に収容された状態であっても工具を係合可能なように、雄ねじ軸２２ｂの後端に形成される。工具係合部２２ｄは、マイナスドライバーあるいはプラスドライバーの先端を係合可能な工具係合溝、例えば、六角レンチを挿入して係合可能なレンチ嵌合凹部等の、雄ねじ軸２２ｂ後端面から窪む工具係合凹部を採用できる。なお、凹部でなくとも、工具（スパナなど）と係合可能であれば凸部であっても構わない。

雄ねじ軸付きピン２２のピン２２ａの長さは、細胞押さえ部材２１のピン収容孔２１ｅの全長よりも長い。
ピン２２ａにおける、細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａから突出させた部分は細胞押さえ具１０Ｄの突起１２を形成する。
図８の細胞押さえ具１０Ｄは、雄ねじ軸付きピン２２の雄ねじ軸２２ｂ後端の工具係合部２２ｄに係合させた工具によって軸回り回転させ、雌ねじ孔２１ｃ軸線方向における雄ねじ軸２２ｂの位置を変更することで、雄ねじ軸付きピン２２の細胞押さえ部材２１に対する押さえ面２１ａに垂直の方向の位置を調整できる。その結果、図８の細胞押さえ具１０Ｄは、細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａからのピン２２ａの突出寸法、すなわち突起１２の押さえ面２１ａからの突出寸法、を調整できる。

雄ねじ軸付きピン２２の雄ねじ軸２２ｂと細胞押さえ部材２１の雌ねじ孔２１ｃとは、ピン２２ａを細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａからの突出寸法を可変に支持するピン支持機構を構成する。
図８の細胞押さえ具１０Ｄは、図３〜図５の細胞層作成具において細胞押さえ具１０Ａにかえて細胞層６の作製に使用できる。図８の細胞押さえ具１０Ｄは、ピン２２ａの押さえ面２１ａからの突出寸法を予め調整して、細胞押さえ部材２１を凹部３に挿入する。凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１は、ピン２２ａ先端を凹部３の内底面３ａに突き当てるだけで、細胞押さえ部材２１を、凹部３の内底面３ａからピン２２ａの押さえ面２１ａからの突出寸法相当分だけ上方に離間した位置に位置決めできる。

図８の細胞押さえ具１０Ｄは、雌ねじ孔２１ｃとピン収容孔２１ｅとが構成するピン突出量調整孔が複数形成された細胞押さえ部材２１と、細胞押さえ部材２１の複数のピン突出量調整孔のそれぞれに挿入された雄ねじ軸付きピン２２とを有する構成を採用できる。この構成の場合、図８の細胞押さえ具１０Ｄの複数の雄ねじ軸付きピン２２のそれぞれのピン２２ａとピン支持機構とは、細胞押さえ部材２１の押さえ面２１ａが凹部３の内底面３ａからピン２２ａの押さえ面２１ａからの突出寸法相当分だけ上方に離間した位置に内底面３ａに平行に延在するように細胞押さえ部材２１を支持する支持機構を構成できる。

雄ねじ軸２２ｂは、図８に例示した雌ねじ孔２１ｃから細胞押さえ部材２１の上面２１ｂ側に常時突出可能な軸線方向寸法を確保した構成も採用可能である。
この場合、雄ねじ軸２２ｂの工具係合部は、雄ねじ軸２２ｂにおける細胞押さえ部材２１の上面２１ｂ側に常時突出される後端部に設けることが好ましい。また、雄ねじ軸２２ｂにおける細胞押さえ部材２１の上面２１ｂ側に常時突出される後端部に設けられる工具係合部は、工具係合凹部に限定されず、例えば、袋レンチやスパナ等を外側に係合可能に形成された後端係合部であっても良い。

図９、図１０は、変形例の細胞層作製具１Ｅ、１Ｆ及び細胞押さえ具１０Ｅ、１０Ｆを例示する。図９、図１０に例示した細胞押さえ具１０Ｅ、１０Ｆは、軸付き押さえ部材３１と、軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３が螺着される上部支持部材とを有するものである。
なお、図９の細胞押さえ具１０Ｅ、１０Ｆの上部支持部材に符号３２Ａ、図１０の細胞押さえ具１０Ｆの上部支持部材に符号３２Ｂをそれぞれ付した。

図９に例示した細胞層作製具１Ｅは、培養容器２と、培養容器２の上面４上に載置して凹部３上に配置される上部支持部材３２Ａを含む細胞押さえ具１０Ｅとを有するものである。

図９に例示した細胞押さえ具１０Ｅは、軸付き押さえ部材３１と、軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３が螺着される上部支持部材３２Ａとを有するものである。軸付き押さえ部材３１は、細胞押さえ部材１１と、細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａとは逆側の上面１１ｃから突出された雄ねじ軸３３とを有する。

雄ねじ軸３３は、細胞押さえ部材１１の上面１１ｃから押さえ面１１ａに垂直の向きで押さえ面１１ａとは逆側へ延出されている。また、雄ねじ軸３３は、細胞押さえ部材１１のその押さえ面１１ａに垂直な中心軸線と同軸に延在形成されている。
延出されている。図９において雄ねじ軸３３は上部支持部材３２Ａの雌ねじ孔３２ｃに挿入されている。図９において雄ねじ軸３３はその側面に形成された雄ねじ部３３ａを、上部支持部材３２Ａの雌ねじ孔３２ｃ内周面の雌ねじ部３２ｄに螺合させて上部支持部材３２に螺着されている。

上部支持部材３２Ａは、凹部３上に延在配置される支持部材本体３２ａと、培養容器２の上面４における凹部３の開口部の周囲の領域上に載置される載置片部３２ｂとを有する。
図１１（ａ）〜（ｃ）に例示するように、支持部材本体３２ａは、雌ねじ孔３２ｃが貫通形成された中央部３２ｆから複数方向に腕部３２ｇが延出された構成を採用できる。載置片部３２ｂは支持部材本体３２ａの複数の腕部３２ｇの先端にそれぞれ形成されている。支持部材本体３２ａは、培養容器２の上面４における凹部３の開口部の周囲の領域上に載置片部３２ｂを載置することで、凹部３上に延在配置される。
上部支持部材３２Ａの各載置片部３２ｂを培養容器２の上面４上に載置したとき、上部支持部材３２Ａの雌ねじ孔３２ｃはその中心軸線が上下方向に延在する向きとなる。
なお、腕部３２ｇ間の空間は、細胞押さえ部材１１の側面１１ｂと凹部３内周面との間のクリアランス１８へのピペットの挿入に利用できる。

細胞押さえ具１０Ｅは、軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３を上部支持部材３２Ａに対して回転させて雄ねじ軸３３の上部支持部材３２Ａに対する螺着位置を調整することで、支持部材本体３２ａの中央部３２ｆと細胞押さえ部材１１との間の距離を調整できる。
細胞押さえ具１０Ｅは、支持部材本体３２ａの中央部３２ｆと細胞押さえ部材１１との間の距離を予め調整して細胞押さえ部材１１を凹部３に挿入できる。上部支持部材３２Ａは、培養容器２の上面４における凹部３の開口部の周囲の領域上に載置片部３２ｂを載置して凹部３開口部を跨ぐように配置される。
培養容器２の上面４上に載置された上部支持部材３２Ａは、支持部材本体３２ａの中央部３２ｆとの間の距離を予め調整して凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１をその押さえ面２１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に内底面３ａに平行に配置されるように支持できる。
細胞押さえ具１０Ｅは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１を、培養容器２上に載置した上部支持部材３２Ａによって雄ねじ軸３３を介して支持することで、細胞層の作製に用いることができる。

上部支持部材３２Ａと軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３とは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１を、培養容器２上に載置した上部支持部材３２Ａの支持部材本体３２ａに対して昇降可能に支持する押さえ部材昇降機構を構成する。
また、上部支持部材３２Ａと軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３とは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１を、その押さえ面２１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に内底面３ａに平行に配置されるように支持する支持機構を構成する。

図１０に例示した細胞押さえ具１０Ｆは、図９に例示した細胞押さえ具１０Ｅについて、雌ねじ孔３２ｃが貫通形成された上部支持部材３２Ａにかえて、内面に雌ねじ部が存在しない貫通孔３２ｅが貫通形成された上部支持部材３２Ｂを採用したものである。貫通孔３２ｅは、上部支持部材３２Ｂの支持部材本体３２ａの中央部３２ｆに形成されている。上部支持部材３２Ｂは、雌ねじ孔３２ｃを貫通孔３２ｅに変更した点のみが図９に例示した上部支持部材３２Ａと異なる。

また、図１０に例示した細胞押さえ具１０Ｆは、支持部材本体３２ａの貫通孔３２ｅに挿通した細胞押さえ部材１１の雄ねじ軸３３の支持部材本体３２ａの中央部３２ｆから上側に突出された部分に螺着された上部ナット３４、及び雄ねじ軸３３の支持部材本体３２ａの中央部３２ｆから下側に突出された部分に螺着された下部ナット３５も有している。
支持部材本体３２ａの貫通孔３２ｅに挿通された軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３は、下部ナット３５を回転させて雄ねじ軸３３に対する螺着を変更し、上部ナット３４を支持部材本体３２ａの中央部３２ｆに締め付けることで、支持部材本体３２ａの中央部３２ｆと細胞押さえ部材１１との間の離間距離を調整できる。また、軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３は、上部ナット３４を支持部材本体３２ａの中央部３２ｆに締め付けることで上部支持部材３２Ｂに固定される。

図１０に例示した細胞押さえ具１０Ｆは、支持部材本体３２ａの中央部３２ｆと細胞押さえ部材１１との間の離間距離を予め調整して雄ねじ軸３３を上部支持部材３２Ｂに固定した状態で細胞押さえ部材１１を凹部３に挿入できる。そして、細胞押さえ具１０Ｆは、上部支持部材３２Ｂを培養容器２の上面４上に載置することで、上部支持部材３２Ｂによって、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１をその押さえ面２１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に配置されるように支持できる。

上部支持部材３２Ｂの各載置片部３２ｂを培養容器２の上面４上に載置したとき、上部支持部材３２Ｂの貫通孔３２ｅはその中心軸線が上下方向に延在する向きとなる。培養容器２の上面４上に載置した上部支持部材３２Ｂは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１をその押さえ面２１ａが凹部３の内底面３ａに平行となる向きで支持できる。
細胞押さえ具１０Ｆは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１を、培養容器２上に載置した上部支持部材３２Ｂによって雄ねじ軸３３を介して支持することで、細胞層の作製に用いることができる。

上部支持部材３２Ｂと軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３とは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１を、培養容器２上に載置した上部支持部材３２Ｂの支持部材本体３２ａに対して昇降可能に支持する押さえ部材昇降機構を構成する。
また、上部支持部材３２Ｂと軸付き押さえ部材３１の雄ねじ軸３３とは、凹部３に挿入した細胞押さえ部材２１を、その押さえ面２１ａが凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に内底面３ａに平行に配置されるように支持する支持機構を構成する。

図７に例示した蓋１５は、細胞押さえ具１０Ａにかえて図８に例示した細胞押さえ具１０Ｄを採用した構成も採用可能である。
また、蓋は、雌ねじ孔３２ｃが複数箇所に貫通形成された蓋板を採用し、この蓋板の複数箇所に図９に例示した細胞押さえ具１０Ｅが組み立てられた構成も採用可能である。 蓋は、貫通孔３２ｅが複数箇所に貫通形成された蓋板を採用し、この蓋板の複数箇所に図１０に例示した細胞押さえ具１０Ｆが組み立てられた構成も採用可能である。

細胞層は次に示すような方法によっても製造することができる。図１２に例示するように、凹部３の内底面３ａ上に凹部３に細胞を入れて細胞堆積層５を形成させ、凹部３に培養液を入れる。

図１３に例示するように、細胞押さえ具１０Ａの細胞押さえ部材１１を凹部３内に挿入し、突起１２によって凹部３の内底面３ａから上方に離間した位置に支持し、細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａとの間に隙間を確保する。

図１４に例示するように、細胞押さえ部材１１を突起１２により凹部３の内底面３ａからの離間距離を維持したまま細胞堆積層５を培養し、細胞堆積層５を形成する細胞同士を接着させ、かつ細胞堆積層５の厚さを増大させて細胞堆積層５を細胞押さえ部材１１の押さえ面１１ａに面接触させる。これにより、凹部３内に厚みが一定で且つ平らな細胞層６が製造される。押さえ面１１ａは凹部３の内底面３ａと平行であるため、細胞層６の上面と底面は平行な面を有する。

培養された細胞は、細胞押さえ部材１１と凹部３の内周面３ｂ全周との間の間隙（クリアランス１８）に流出することがある。流出した細胞は、ピペット等で吸引することにより除去してもよい。

図１５に例示するように、細胞押さえ具１０Ａを凹部３から取り出して凹部３の上方に移動させる。作製された細胞層６は凹部３の内底面３ａ上に残る。この細胞層６の上面は平ら（観察に適した平面）であるため、顕微鏡等の観察に適している。

細胞押さえ部材の細胞非接着性材料としては、例えば、ガラスやＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｓｉｌｏｘａｎｅ）等を挙げることができるが、これに限定されず、当業者に公知の細胞非接着性材料を用いることができる。細胞押さえ部材は、細胞に接触する押さえ面に、上述の細胞被接着性材料がコーティングされたものであってもよい。

培養容器２の凹部３には、細胞堆積層５と培養液等が収容される。凹部３に収容される細胞としては、細胞同士が接着して細胞層６を形成することができる細胞であればどのような細胞であってもよく、例えば、動物由来の細胞、植物由来の細胞等が挙げられる。

細胞が由来する動物種としては、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、マーモセット、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、フェレット等が挙げられる。

細胞は、多能性幹細胞、癌細胞等の株化した細胞等であってもよい。株化した細胞としては、例えば、ヒト正常心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等が挙げられるが、これに限定されない。多能性幹細胞としては、組織幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。

細胞は、組織から単離された細胞であってもよい。組織としては、脂肪組織、皮膚組織、肝組織、腎組織、血管組織等であってもよい。

細胞層６は単層又は複数の層からなり、細胞層６の厚さは１個の細胞の厚さ以上である。細胞層６の厚さは、３μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、９５μｍ以上、１００μｍ以上、又はそれ以上の厚さであってもよい。

細胞層６を製造する際に細胞堆積層５を押圧する力は、細胞の種類等によって、予め適切な値に設定することができる。細胞堆積層５を押圧する力は、細胞の生存、細胞の生理機能に悪影響を与えない範囲に設定することが好ましい。

細胞の培養は、細胞と培養液を含む容器を、例えば、３７℃、湿度１００％、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養してもよい。温度、湿度、ＣＯ_２濃度等の条件は、適宜変更することができる。

細胞の培養に用いる基礎培地としては、例えば、イーグル培地、ダルベッコ最小培地、Ｆ１０培地、Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｌ−１５培地等が挙げられるが、これに限定されない。

細胞の培養に用いる培地は、上述の基礎培地に血清を添加したものであってもよい。培養液に添加する血清としては、例えば、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清等が挙げられる。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］細胞非接着性領域を有し、培養容器の凹部に挿入される細胞押さえ部材と、前記凹部に挿入された前記細胞押さえ部材を、その下端の押さえ面が前記凹部の内底面から上方に離間した位置に前記凹部の前記内底面に平行に配置されるように支持する支持機構と、を有する細胞押さえ具。
［２］前記支持機構は、前記細胞押さえ部材から突出され、前記培養容器にその上方から当接される突起である、［１］に記載の細胞押さえ具。
［３］前記突起は前記細胞押さえ具の前記押さえ面からピン状に突出され先端が前記凹部の内底面に突き当てられる、［２］に記載の細胞押さえ具。
［４］前記突起は、前記細胞押さえ部材に支持されたピンの前記押さえ面から突出された部分であり、前記支持機構は、前記ピンと、前記細胞押さえ部材に設けられ前記ピンを前記細胞押さえ部材の前記押さえ面からの突出寸法を可変に支持するピン支持機構とを有する、［３］に記載の細胞押さえ具。
［５］前記支持機構は、前記細胞押さえ部材の側面から突出され前記培養容器の内周面に当接されるスペーサ用突起であり、前記スペーサ用突起は前記細胞押さえ部材の前記側面の周方向の複数箇所に分散配置され前記凹部に挿入された前記細胞押さえ部材と前記凹部の内周面全周との間にクリアランスを確保する、［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞押さえ具。
［６］前記支持機構は、前記凹部上に延在配置される支持部材本体及び前記培養容器における前記凹部の開口部の周囲の領域上に載置されることで前記支持部材本体を前記凹部上に支持する載置片部を有する上部支持部材と、前記凹部上に配置された前記上部支持部材の前記支持部材本体に対して前記細胞押さえ部材を昇降可能に支持する押さえ部材支持機構とを有する、［１］または［５］に記載の細胞押さえ具。
［７］培養容器と、前記培養容器の凹部の開口部を開閉する蓋とを備え、前記蓋は［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞押さえ具を備える、細胞層作製具。
［８］前記培養容器には前記凹部が複数形成され、前記蓋が複数の前記細胞押さえ具を備える、［７］に記載の細胞層作製具。
［９］前記凹部の内部に細胞が収容されている［７］又は［８］に記載の細胞層作製具。
［１０］培養容器の凹部の内底面上に前記凹部に入れた細胞を堆積させ細胞堆積層を形成することと、［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞押さえ具の前記細胞押さえ部材を前記凹部内に挿入し前記前記支持機構によって前記凹部の前記内底面から上方に離間した位置に支持して前記細胞堆積層を前記細胞押さえ部材によって押圧し、前記細胞堆積層を前記細胞押さえ部材の前記押さえ面に面接触させることと、前記細胞押さえ部材を前記支持機構により前記凹部の前記内底面からの離間距離を維持したまま前記細胞を培養して前記細胞堆積層を形成する前記細胞同士を接着させることと、を含む、細胞層製造方法。
［１１］培養容器の凹部の内底面上に前記凹部に入れた細胞を堆積させ細胞堆積層を形成することと、［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞押さえ具の前記細胞押さえ部材を前記凹部内に挿入し前記前記支持機構によって前記凹部の前記内底面から上方に離間した位置に支持して前記細胞押さえ部材の前記押さえ面と前記細胞堆積層との間に隙間を確保することと、前記細胞押さえ部材を前記支持機構により前記凹部の前記内底面からの離間距離を維持したまま前記細胞を培養して前記細胞堆積層を形成する前記細胞同士を接着させ、かつ前記細胞堆積層の厚さを増大させて前記細胞堆積層を前記細胞押さえ部材の前記押さえ面に面接触させることと、を含む、細胞層製造方法。

１Ａ…細胞層作製具、１Ｂ…細胞層作製具、１Ｃ…細胞層作製具、１Ｄ…細胞層作製具、１Ｅ…細胞層作製具、１Ｆ…細胞層作製具、２…培養容器、３…凹部、３ａ…内底面、３ｂ…内周面、４…上面、４ａ…シール材、５…細胞堆積層、６…細胞層、１０Ａ…細胞押さえ具、１０Ｂ…細胞押さえ具、１０Ｄ…細胞押さえ具、１０Ｅ…細胞押さえ具、１０Ｆ…細胞押さえ具、１１…細胞押さえ部材、１１ａ…押さえ面、１１ｂ…側面、１１ｃ…上面、１２…突起、１３…スペーサ用突起、１３ａ…縦棒、１３ｂ…横棒、１４…側部突起、１５…蓋、１５ａ…蓋板、１８…クリアランス、２１…細胞押さえ部材、２１ａ…押さえ面、２１ｂ…上面、２１ｃ…雌ねじ孔、２１ｄ…雌ねじ部、２１ｅ…ピン収容孔、２２…雄ねじ軸付きピン、２２ａ…ピン、２２ｂ…雄ねじ軸、２２ｃ…雄ねじ部、２２ｄ…工具係合部、３１…軸付き押さえ部材、３２Ａ…上部支持部材、３２Ｂ…上部支持部材、３２ａ…支持部材本体、３２ｂ…載置片部、３２ｃ…雌ねじ孔、３２ｄ…雌ねじ部、３２ｅ…貫通孔、３２ｆ…中央部、３２ｇ…腕部、３３…雄ねじ軸、３３ａ…雄ねじ部、３４…上部ナット、３５…下部ナット。

国際公開第２０１７／０７７９８５号

Claims (11)

1. 細胞非接着性領域を有し、培養容器の凹部に挿入される細胞押さえ部材と、
   前記凹部に挿入された前記細胞押さえ部材を、その下端の押さえ面が前記凹部の内底面から上方に離間した位置に前記凹部の前記内底面に平行に配置されるように支持する支持機構と、
   を有する細胞押さえ具。
2. 前記支持機構は、前記細胞押さえ部材から突出され、前記培養容器にその上方から当接される突起である、請求項１に記載の細胞押さえ具。
3. 前記突起は前記細胞押さえ具の前記押さえ面からピン状に突出され先端が前記凹部の内底面に突き当てられる、請求項２に記載の細胞押さえ具。
4. 前記突起は、前記細胞押さえ部材に支持されたピンの前記押さえ面から突出された部分であり、
   前記支持機構は、前記ピンと、前記細胞押さえ部材に設けられ前記ピンを前記細胞押さえ部材の前記押さえ面からの突出寸法を可変に支持するピン支持機構とを有する、請求項３に記載の細胞押さえ具。
5. 前記支持機構は、前記細胞押さえ部材の側面から突出され前記培養容器の内周面に当接されるスペーサ用突起であり、前記スペーサ用突起は前記細胞押さえ部材の前記側面の周方向の複数箇所に分散配置され前記凹部に挿入された前記細胞押さえ部材と前記凹部の内周面全周との間にクリアランスを確保する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞押さえ具。
6. 前記支持機構は、前記凹部上に延在配置される支持部材本体及び前記培養容器における前記凹部の開口部の周囲の領域上に載置されることで前記支持部材本体を前記凹部上に支持する載置片部を有する上部支持部材と、前記凹部上に配置された前記上部支持部材の前記支持部材本体に対して前記細胞押さえ部材を昇降可能に支持する押さえ部材支持機構とを有する、請求項１または５に記載の細胞押さえ具。
7. 培養容器と、前記培養容器の凹部の開口部を開閉する蓋とを備え、前記蓋は請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞押さえ具を備える、細胞層作製具。
8. 前記培養容器には前記凹部が複数形成され、前記蓋が複数の前記細胞押さえ具を備える、請求項７に記載の細胞層作製具。
9. 前記凹部の内部に細胞が収容されている請求項７又は８に記載の細胞層作製具。
10. 培養容器の凹部の内底面上に前記凹部に入れた細胞を堆積させ細胞堆積層を形成することと、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞押さえ具の前記細胞押さえ部材を前記凹部内に挿入し前記前記支持機構によって前記凹部の前記内底面から上方に離間した位置に支持して前記細胞堆積層を前記細胞押さえ部材によって押圧し、前記細胞堆積層を前記細胞押さえ部材の前記押さえ面に面接触させることと、
    前記細胞押さえ部材を前記支持機構により前記凹部の前記内底面からの離間距離を維持したまま前記細胞を培養して前記細胞堆積層を形成する前記細胞同士を接着させることと、
    を含む、細胞層製造方法。
11. 培養容器の凹部の内底面上に前記凹部に入れた細胞を堆積させ細胞堆積層を形成することと、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞押さえ具の前記細胞押さえ部材を前記凹部内に挿入し前記前記支持機構によって前記凹部の前記内底面から上方に離間した位置に支持して前記細胞押さえ部材の前記押さえ面と前記細胞堆積層との間に隙間を確保することと、
    前記細胞押さえ部材を前記支持機構により前記凹部の前記内底面からの離間距離を維持したまま前記細胞を培養して前記細胞堆積層を形成する前記細胞同士を接着させ、かつ前記細胞堆積層の厚さを増大させて前記細胞堆積層を前記細胞押さえ部材の前記押さえ面に面接触させることと、
    を含む、細胞層製造方法。

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