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JP2019521085A - アルテミシニンアナログ、並びに、脂質異化作用を促進するため及び糖代謝を改善するための使用、方法、及び組成物 - Google Patents

アルテミシニンアナログ、並びに、脂質異化作用を促進するため及び糖代謝を改善するための使用、方法、及び組成物 Download PDF

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JP2019521085A JP2018557930A JP2018557930A JP2019521085A JP 2019521085 A JP2019521085 A JP 2019521085A JP 2018557930 A JP2018557930 A JP 2018557930A JP 2018557930 A JP2018557930 A JP 2018557930A JP 2019521085 A JP2019521085 A JP 2019521085A
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Abstract

式（Ａ）によって表されるアルテミシニンアナログ、並びに、脂質異化作用を促進するため及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための医薬品の調製におけるその適用。アルテミシニンアナログは、白色脂肪の褐色化を促進して体重の低減及び代謝の改善を達成し、それによって、高血糖、インスリン抵抗性、脂質異常症、及び／又は脂肪肝に対する治療効果を提供する。

Description

本発明は、生物医学の分野に属し、特に、脂肪分解を促進するため及びグルコース代謝を改善するための調製物の調製における、アルテムエーテルの使用に関する。
データは、肥満及びその関連する代謝性疾患が、世界中で問題を引き起こしている流行性疾患となっていることを示す。２０１５年に世界保健機関（ＷＨＯ、World Health Organization）によって発表されたデータによると、世界人口の肥満率は１３％であり、中国での成人の肥満率は６．９％である。青年の肥満率がより高く、急激に増大する傾向を示していることが懸念されており、このことは、肥満率が今後数十年にわたり高くなり続けることを意味する。研究によって、肥満が、２型糖尿病、高血圧、脂肪肝などの一連の代謝性疾患を生じさせ得、さらには、健康上の大きな負担及び経済的負担を国及び人々にもたらすであろう、ある特定の腫瘍の罹患率を増大させ得ることが示されている。
研究によって、脂肪組織が肥満の発症及び進行の核となる位置にあり、代謝の健康において主軸となる役割を有することが示されている。現在では、人体において、白色脂肪、褐色脂肪、及びベージュ脂肪という３種類の脂肪組織が存在することが知られている。白色脂肪組織は、トリグリセリドの形態でエネルギーを蓄え、一方、褐色脂肪及びベージュ脂肪は、熱産生を介してエネルギーを消費する。ベージュ脂肪は白色脂肪において見られ、褐色脂肪の特徴を有する。ベージュ脂肪は、表現型の観点から、白色脂肪及び褐色脂肪の移行形態であると見なすことができる。白色脂肪組織においてベージュ脂肪が出現する現象は、白色脂肪の褐色化と呼ばれる。ベージュ脂肪と褐色脂肪は異なる部分にあり、発生由来源が異なるが、これらは同一の熱産生機能を発揮し、エネルギー消費の観点から同一の能力を有し、熱産生脂肪組織と呼ばれる。生理学的条件下では、熱産生脂肪組織を活性化する２つの条件があり、それは、低温曝露及び食糧摂取（特に、高カロリー食品）である。低温曝露の間、熱産生脂肪組織は活性化されて、一定体温を維持する。食糧摂取の間、熱産生脂肪の活性化は一時的なエネルギーピークを緩和し、代謝の安定性を維持する。
熱産生脂肪組織、その分化及び発生、機能調節、並びに臨床適用は、近年、代謝の分野において、研究のホットスポットである。集団調査によると、活性な熱産生脂肪組織を有する個体は体重増加しにくく、２型糖尿病などの代謝関連疾患にかかりにくい。ベルベリン及びサリチルサリチル酸などの、代謝を改善する一部の薬物は、熱産生脂肪組織の活性化による効果の一部を達成し得る。同様に、動物モデルにおいて、関連する遺伝子が変更されても（ノックアウトされるか又は過剰発現する）、又は薬物刺激（β−アドレナリン受容体アゴニストなど）が行われても、熱産生褐色脂肪の活性化の後、熱産生褐色脂肪は、体重を制御し、代謝を改善するように機能する。したがって、要するに、ベージュ脂肪組織は、過剰なエネルギーを消費する能力を有し、ある特定の条件下で活性化され得る、人体における熱産生脂肪組織である。熱産生脂肪組織の活性化は、褐色脂肪の機能を増強させるためであっても、又は、白色脂肪の褐色化を促進するためであっても、体重制御及び代謝において役割を有し得る。これまで、代謝の改善の達成のために熱産生脂肪組織を特異的に標的化する化合物も薬物も発見されておらず、また、この標的化のためのハイスループットスクリーニングも発見されていない。
熱産生脂肪組織は、脂肪酸に蓄えられた化学的エネルギーを熱エネルギーに変換するが、それは、熱産生脂肪組織が、特別な分子である、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１、uncoupling protein 1）を有するためである。ＵＣＰ１は、ミトコンドリアの内膜上に局在しているが、電子輸送鎖の結合及びＡＴＰ合成を切断し得、活性化の場合には化学的エネルギーを熱エネルギーに直接変化する。ＵＣＰ１は熱産生脂肪組織で見られる。この独特な組織局在化のために、ＵＣＰ１は、熱産生脂肪組織の機能的分子のみならず、表現型マーカーでもある。ＵＣＰ１に加えて、ＰＧＣ１α、ＰＲＤＭ１６、及びシトクロムＣが、褐色化プロセスに関与する重要な分子である。
研究によって、肥満及び代謝性疾患の発生が、生活環境と遺伝因子との組合せの結果であることが報告されている。高脂肪飼料によって誘発された肥満マウスは、肥満及び代謝性疾患の発症及び進行のメカニズムを研究するための、実験室で一般に使用される動物モデルである。ｏｂ／ｏｂマウスは、レプチン遺伝子を欠いているために重度のインスリン抵抗性を有し、誕生時から脂肪肝を有しおり、これらの代謝障害は、マウスが成長するにつれて徐々に悪化し、最終的にマウスを早期死亡させる。これらの先天的な代謝障害の存在によって、ｏｂ／ｏｂマウスは、糖尿病及びインスリン抵抗性の実験室研究のための一般的な動物モデルである。脂肪細胞の分化及び発生のインビトロ研究のために一般的に使用される細胞モデルは、３Ｔ３−Ｌ１及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２であり、前者は、前駆脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化のプロセスをシミュレートし、後者は、方向付け後の、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化のプロセスを反映する。細胞系に加えて、脂肪の発生を研究するための細胞モデルにはまた、間質血管細胞群（ＳＶＦ、Stromal Vascular Fraction）も含まれる。ＳＶＦは一次前駆脂肪細胞であり、単離、培養、及びある特定の誘発の後に白色脂肪細胞に分化し得、それによって、前駆脂肪細胞の白色脂肪へのインビボでの分化プロセスを、インビトロ環境で模倣し得る。
従来技術によって、アルテムエーテル（ＡＲＴ、artemether）（式II）が、赤血球期マラリア原虫を効率的且つ迅速に死滅させ得る、アルテミシニン（artemisinin）（式Ｉ）のアナログであることが開示されている。これは、クロロキン耐性の熱帯熱マラリア及び悪性マラリアの治療において使用されており、効果が迅速であり、短期有効性が良好であり、且つ、毒性及び副作用が少ない。これは、マラリアの治療の第一選択薬であり、広く使用されている。最近の研究によって、アルテムエーテルもまた、腫瘍細胞を死滅させる効果及び免疫調節の効果を有することが示されており、腫瘍、並びに全身性エリテマトーデス及び関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療において新たな可能性を示している。
体重の制御及び代謝の改善におけるアルテムエーテルの適用可能性は、いまだ見出されていない。アルテムエーテルに加えて、アルテミシニンに基づく薬物にはまた、アルテスネート、ジヒドロアルテミシニン、アルテエーテル、ＳＭ９０５、アルテミシド、アルテミソン、及びＳＭ９３４も含まれ、そのうち、ジヒドロアルテミシニンは、インビボでのアルテムエーテル及び他のアルテミシニンアナログの二次代謝産物である。
従来技術の調査に基づいて、本願発明者は、医薬品におけるアルテムエーテル及びアルテミシニンアナログの新規な使用、特に、脂肪分解を促進するため及びグルコース代謝を改善するための調製物の調製におけるアルテムエーテルの使用を提供する。
したがって、本発明の目的は、医薬品におけるアルテムエーテル及びアルテミシニンアナログの新規な使用、特に、脂肪分解を促進するため及びグルコース代謝を改善するための調製物の調製におけるアルテムエーテルの使用、特に、白色脂肪の褐色化を促進するための、体重を低減させるための、及びグルコース代謝を改善するための調製物の調製におけるアルテムエーテル及びアルテミシニンアナログの使用を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の第１の態様は、脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための薬品の調製における、以下の一般式（Ａ）：

(A)
（式中、Ｒは、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、ブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）、２−アミノエトキシ、２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ、チオモルホリニル、及び１，１−ジオキシドチオモルホリニルから選択される）によって表されるアルテミシニンアナログの使用を提供する。
本発明の第２の態様は、それを必要とする対象に、治療有効量の、以下の一般式（Ａ）：

(A)
（式中、Ｒは、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、ブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）、２−アミノエトキシ、２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ、チオモルホリニル、及び１，１−ジオキシドチオモルホリニルから選択される）によって表されるアルテミシニンアナログを投与することを含む、脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための方法を提供する。
好ましくは、治療有効量の前記アルテミシニンアナログの前記投与は、経口又は注射による。より好ましくは、前記アルテミシニンアナログの投与量は、それぞれ、経口投与では２０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、注射では１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇである。
本発明の第３の態様は、以下の一般式（Ａ）：、

(A)
（式中、Ｒは、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、ブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）、２−アミノエトキシ、２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ、チオモルホリニル、及び１，１−ジオキシドチオモルホリニルから選択される）によって表される、脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するためのアルテミシニンアナログを提供する。
好ましくは、先行する態様のいずれかの使用、アルテミシニンアナログ、又は方法に従って、前記アルテミシニンアナログは、式（II）によって表されるアルテムエーテルである。

(II)
好ましくは、先行する態様のいずれかの使用、アルテミシニンアナログ、又は方法に従って、前記脂肪分解の促進は、白色脂肪の褐色化の促進を含む。
好ましくは、先行する態様のいずれかの使用、アルテミシニンアナログ、又は方法に従って、前記脂肪分解の促進及び／又は代謝関連疾患の予防若しくは治療は、体重の制御及び代謝の改善を含む。
好ましくは、先行する態様のいずれかの使用、アルテミシニンアナログ、又は方法に従って、前記代謝関連疾患は、肥満が原因の高血糖、インスリン抵抗性、脂質異常症、及び／又は脂肪肝である。
本発明の第４の態様は、脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための医薬組成物であって、（１）本発明の第３の態様に従うアルテミシニンアナログ、及び（２）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
好ましくは、経口投与のための前記医薬組成物の剤形は、経口懸濁剤、散剤、及び顆粒剤から選択され、注射用の前記医薬組成物の剤形は、水溶液、油、及び懸濁液から選択される。
本発明の具体的な技術的解決策を、本発明の概念と合わせて以下にさらに記載する。
本発明のアルテムエーテルの構造は、式（II）で示される通りである。
(II)
本発明はまた、白色脂肪の褐色化を促進する能力を有する、アルテムエーテル以外のアルテミシニンアナログに関する。アルテミシニンの構造は式（Ｉ）によって表され、アルテミシニンアナログは式（Ａ）によって表される。
式（Ａ）によって表されるアルテミシニンアナログは、Ｒがヒドロキシルであるジヒドロアルテミシニン、Ｒがエトキシであるアルテエーテル（arteether）、Ｒがブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）であるアルテスネート（artesunate）、Ｒが２−アミノエトキシであるＳＭ９３４、Ｒが２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシであるＳＭ９０５、Ｒがチオモルホリニルであるアルテミシド（artemiside）、Ｒが１，１−ジオキシドチオモルホリニルであるアルテミソン（artemisone）である。
本発明のアルテミシニンアナログは、以下の表に示すＲ基を有する。
本発明は、インビボ及びインビトロでの実験によって、アルテミシニンに基づく化合物が、白色脂肪の褐色化を誘発する効果を有し、白色脂肪の褐色化を促進することによって、体重の低減、代謝の改善、グルコース代謝のホメオスタシスの維持、脂肪肝の軽減、及び糖尿病を伴う症状の改善において役割を有することを実証する。アルテミシニンに基づく薬物の臨床適用の実施は、忍容できない副作用は見られなかったことを示す。齧歯動物モデルの研究において、高濃度のアルテムエーテルが神経性無食欲症の原因となった可能性があるが、投与の用量及びタイミングについての明らかなエビデンスはないことが報告されている。したがって、全体として、アルテムエーテルは、臨床薬として理想的な安全性を有する。
以下、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して詳細に記載する。
図１及び図２は、アルテムエーテルによって、３Ｔ３−Ｌ１が褐色脂肪細胞様の特徴を示すことが可能になったことを示す図である。そのうち、図１は、様々な濃度のＡＲＴで処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞の形態学的変化を示す。図２は、様々な濃度のＡＲＴで３Ｔ３−Ｌ１を処理した後の、ＵＣＰ１のｍＲＮＡレベルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 図３〜図５は、アルテムエーテルによって、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２が褐色脂肪様の形態学的特徴を示すことが可能になったことを示す図である。そのうち、図３は、ＢＭＰ７分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、及びアルテムエーテルで処理されたＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の、細胞の形態学的特徴を示す。図４は、ウェスタンブロットアッセイによる、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、及び様々な濃度のアルテムエーテルで処理されたＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の、褐色脂肪関連遺伝子ＵＣＰ１、ＰＧＣ１ａ、ＰＲＤＭ１６、及びＣｙｔｏＣのタンパク質レベルを示す。図５は、アルテムエーテル（１５μＭｏｌ／Ｌ）で処理した後の、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２のミトコンドリアMitoTracker Green染色を示す。 図６〜７は、アルテムエーテルによって、ＳＶＦ一次前駆脂肪細胞が分化の間に褐色脂肪様の形態学的特徴を獲得し得たことを示す図である。そのうち、図６は、様々な濃度のアルテムエーテルでＳＶＦを処理した後の細胞の形態学的変化を示す。図７は、様々な濃度のアルテムエーテルでＳＶＦを処理した後の、褐色脂肪関連遺伝子ＰＲＤＭ１６、ＰＧＣ１α、及びＵＣＰ１の発現レベルを示す。 図８〜９は、褐色化の促進に対するアルテミシニンアナログの効果を説明する図である。そのうち、図８は、アルテミシニン及びそのアナログ、例えば、アルテムエーテル、アルテスネート、及びジヒドロアルテミシニンで処理された、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の細胞の形態学を示す。図９は、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ０Ｔ１／２を様々な濃度のジヒドロアルテミシニンで処理した後の、褐色脂肪関連遺伝子の発現レベルを示す。 図１０は、アルテムエーテルが、高脂肪飼料によって誘発される体重増加を阻害したことを示す図である。そのうち、図１０Ａは、高脂肪飼料条件下でアルテムエーテルを皮下注射されたマウスの体重の変化を示す。＊ｐ＜０．０５。図１０Ｂは、高脂肪飼料条件下でアルテムエーテルを皮下注射されたマウスの体重の増加を示す。＊ｐ＜０．０５。 図１１は、アルテムエーテルの皮下注射が、高脂肪給餌マウスにおける脂肪組織を低減させたことを示す図である。そのうち、図１１Ａは、アルテムエーテルを皮下注射したマウス及び対照群のマウスの鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪の容積を示す。図１１Ｂは、アルテムエーテルを皮下注射したマウス及び対照群のマウスの鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪の重量と、マウスの体重との比率を示す。＊ｐ＜０．０５。図１１Ｃは、アルテムエーテルを皮下注射したマウス及び対照群のマウスの鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪の形態学を示す。 図１２は、アルテムエーテルの皮下注射が、高脂肪によって誘発された肥満マウスにおけるグルコース代謝を改善したことを示す図である。そのうち、図１２Ａは、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを皮下注射したマウス及び対照群のマウスのグルコース負荷（glucose tolerance）曲線を示す。＊ｐ＜０．０５。図１２Ｂは、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを皮下注射したマウス及び対照群のマウスのグルコース負荷曲線を示す。＊ｐ＜０．０５。 図１３は、アルテムエーテルが、高脂肪飼料によって誘発される脂肪肝を阻害したことを示す図である。この図は、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを皮下注射したマウス及び対照群のマウスの肝細胞の形態学を示す。 図１４は、アルテムエーテルの皮下注射が、高脂肪給餌マウスにおいて皮下脂肪の褐色化を誘発したことを示す図である。そのうち、図１４Ａは、８週間の投与の後の、４℃の環境における、高脂肪給餌マウスの体温の変化を示す。＊ｐ＜０．０５。図１４Ｂは、８週間の投与の後、４℃に６時間曝露した後の、高脂肪給餌マウスの鼠径脂肪組織におけるＵＣＰ１の発現を示す。 図１５は、アルテムエーテルの腹腔内注射が、高脂肪飼料によって誘発される体重増加を阻害したことを示す図である。そのうち、図１５Ａは、高脂肪飼料条件下でアルテムエーテルを腹腔内注射されたマウスの体重の変化を示す。＊ｐ＜０．０５。図１５Ｂは、高脂肪飼料条件下でアルテムエーテルを腹腔内注射されたマウスの体重の増加を示す。＊ｐ＜０．０５。 図１６は、アルテムエーテルの腹腔内注射が、高脂肪給餌マウスにおける脂肪組織を有意に低減させたことを示す図である。そのうち、図１６Ａは、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスの鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪の容積を示す。図１６Ｂは、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスの鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪の重量と、マウスの体重との比率を示す。＊ｐ＜０．０５。図１６Ｃは、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスの鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪細胞の形態学を示す。 図１７は、アルテムエーテルの腹腔内注射が、高脂肪によって誘発された肥満マウスにおけるグルコース代謝を改善したことを示す図である。そのうち、図１７Ａは、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスの随時血中グルコースを示す。＊ｐ＜０．０５。図１７Ｂは、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスのグルコース負荷試験の結果を示す。＊ｐ＜０．０５。図１７Ｃは、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスのインスリン負荷（insulin tolerance）を示す。＊ｐ＜０．０５。 図１８は、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウス及び対照群のマウスの肝細胞の組織学的形態学を示す図である。 図１９は、８週間の高脂肪飼料給餌の後の、対照群のマウスと比較した、アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウスの血清における、脂質代謝に関連する指標の変化を示す図である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 図２０は、アルテムエーテルの腹腔内注射が、高脂肪給餌マウスにおける皮下脂肪の褐色化を誘発したことを示す図である。そのうち、図２０Ａは、８週間のアルテムエーテルの腹腔内注射の後の、４℃の環境での高脂肪給餌マウスの体温の変化を示す。＊ｐ＜０．０５。図２０Ｂは、８週間のアルテムエーテルの腹腔内注射の後、４℃に６時間曝露した後の、高脂肪給餌マウスの鼠径脂肪組織におけるＵＣＰ１の発現を示す。 図２１は、アルテムエーテルが、糖尿病性ｏｂ／ｏｂマウスの体重増加を阻害したことを示す図である。そのうち、図２１Ａは、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射されたｏｂ／ｏｂマウスの体重の変化を示す。図２１Ｂは、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射されたｏｂ／ｏｂマウスの体重増加の変化を示す。＊ｐ＜０．０５。 図２２は、アルテムエーテルが、糖尿病性ｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝を改善することを示す図であり、この図は、８週間のアルテムエーテルの腹腔内注射の後の、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓切片のＨＥ染色の結果を示す。 図２３は、アルテムエーテルの腹腔内注射が、健康なマウスの成長に影響しなかったことを示す図である。そのうち、図２３Ａは、投与群及び対照群における、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された、通常飼料を給餌された健康なマウスの体重を示す。図２３Ｂは、投与群及び対照群における、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された、通常飼料を給餌された健康なマウスの体重増加を示す。 図２４は、アルテムエーテルの腹腔内注射が、健康なマウスのグルコース代謝に影響しなかったことを示す図である。そのうち、図２４Ａは、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された健康な痩せたマウスのグルコース負荷を示す。図２４Ｂは、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された健康な痩せたマウスのグルコースインスリン負荷を示す。 図２５は、マウスにおける、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇのアルテムエーテルの腹腔内注射が、肝臓損傷を生じさせなかったことを示す図であり、この図は、８週間のアルテムエーテルの腹腔内注射の後の、健康な痩せたマウスの肝臓組織切片のＨＥ染色の結果を示す。 図２６は、アルテムエーテルが、マウスの飼料摂取量を変化させなかったことを示す図である。そのうち、図２６Ａは、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された、通常飼料を給餌された痩せたマウスの、マウス当たりの１日飼料摂取量を示す。図２６Ｂは、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された、高脂肪飼料を給餌された肥満マウスの、マウス当たりの１日試料消費量を示す。
アルテムエーテルは、分化の間の３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞の褐色化を誘発した
１．１ 材料
１．１．１ ３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞
１．１．２ ＤＭＥＭ培地（Gibco）
１．１．３ ウシ胎児血清（Gibco）
１．１．４ 仔ウシ血清（TBD）
１．１．５ ビオチン（Sigma社）
１．１．６ ペニシリン及びストレプトマイシン
１．１．７ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１．１．８ トリゾール（Life Technology社）
１．１．９ 逆転写キット（ThermoScientific社）
１．１．１０ Power SYBR Green Master Mix（ThermoScientific社）
１．２ 設備
１．２．１ 一定温度の無菌インキュベーター（Thermo Scientific Forma Series II water Jacket）
１．２．２ リアルタイム定量ＰＣＲ機器（Applied Biotech 7500 real time PCR System）
１．２．３ 顕微鏡（Olympus IX711）
１．２．５ 冷却遠心分離機（Eppendorf Centrifuge 5427R）
１．２．６ 核酸定量的機器（Colibri）
１．３ 溶液
１．３．１ 培地
３Ｔ３−Ｌ１ 維持培地
３Ｔ３−Ｌ１誘発型分化培地
１．３．２ アルテムエーテル原液を、１０ｍＭｏｌ／Ｌの保存濃度でＤＭＳＯ中で溶解した。
１．３．３ ビオチン：１６０ｍｇのビオチン及び８０ｍｇのパントテン酸カルシウムを２００ｍｌの脱イオン水に溶解し、加熱して溶解した。溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
１．３．４ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（５０ｍＭｏｌ／Ｌ）：１．１５ｇの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを、１００ｍｌの０．２Ｍ水酸化カリウムに溶解し、溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
１．３．５ デキサメタゾン（１ｍＭｏｌ／Ｌ）：０．０３９ｇのデキサメタゾンを１００ｍｌの水に溶解し、溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
１．３．６ インスリン（１ｍｇ／ｍｌ）：０．１ｇのインスリンを１００ｍｌの水に溶解し、数滴の塩酸を添加してインスリンを溶解し、溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
１．４ 方法
１．４．１ 白色前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を培養し、分化を誘導した
２．５×１０５個の３Ｔ３−Ｌ１白色前駆脂肪細胞を３．５ｃｍの細胞培養皿に播種し、３日間、維持培地内で培養した。細胞を接触阻害まで増殖させた。接触阻害に達した４８時間後、培地を誘導分化培地に交換し、０．５ｍＭｏｌ／Ｌの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｍｉｘ）、１μＭｏｌ／Ｌのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）、及び１μｇ／ｍｌのインスリン（インスリン）を含む誘導分化混合物を添加した。誘導分化混合物は、短縮してＭＤＩと呼ぶ。ＭＤＩを添加する日を、分化の０日目と定義した。上記培地における２日間の培養後、新鮮な誘導分化培地に換え、１μｇ／ｍｌのインスリンを培地に添加した。さらに２日間の後、新鮮な誘導分化培地に換え、培養物が８日目まで分化するまで、培地を１日おきに交換した。
１．４．２ 化合物処理
アルテムエーテルを、１０ｍＭｏｌ／Ｌの保存濃度でＤＭＳＯ中で保管した。ＭＤＩを分化の０日目に添加し、一方、アルテムエーテル（５、１０、又は１５μＭｏｌ／Ｌ）を処理のために添加した。その後、培地を交換した各時点で、同一濃度のアルテムエーテルを、３Ｔ３−Ｌ１が分化して成熟するまで添加した。
１．４．３ ３Ｔ３−Ｌ１からの細胞の全ＲＮＡの抽出、及びｃＤＮＡへの逆転写
分化して成熟した３Ｔ３−Ｌ１を、３．５ｃｍの培養皿内で誘導し、分化の方法は方法１．４．１を参照した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１ｍｌのトリゾールで完全に溶解し、完全に混合し、２００μｌのクロロホルムを添加した。激しく振とうした後、混合物を１５分にわたり室温とし、４℃で遠心分離し、遠心分離機の条件は、１２０００ｇで１０分間であった。この時点で、溶解物は、クロマトグラフィーの作用により、３つの層に分離した。上部の水性相溶液を新たな遠心分離管内に慎重にピペッティングし、５００μｌのイソプロパノールを添加した。穏やかに混合した後、混合物を１０分にわたり室温とし、１２０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、乳白色の半透明の沈殿物が試験管の底に見られた。沈殿物を、ＤＥＰＣ水で希釈した７５％エタノールで３回洗浄し、７５００ｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、室温で空気乾燥した。沈殿物を６０μｌのＤＥＰＣ水に溶解し、Colibri Tepertecによって定量し、−８０℃で保管した。
対応するｃＤＮＡを、１μｇのＲＮＡからの逆転写によって合成し、逆転写キットは、Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kitであった。合成系は以下の通りであった。
合成条件は以下の通りであった。
合成されたｃＤＮＡを、冷蔵庫内で、−２０℃で保管した。
１．４．４ リアルタイムｑＰＣＲ
反応系：
上記の系は３０μｌの全容積を有し、３つのウェルに分けられ、その各々は１０μｌの容積を有していた。
反応条件：
１８Ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列はGTAACCCGTTGAACCCCATTであり、リバースプライマー配列はCCATCCAATCGGTAGTAGCGであった。
ＵＣＰ１の増幅のためのフォワードプライマー配列はAGGCTTCCAGTACCATTAGGTであり、リバースプライマーはCTGAGTGAGGCAAAGCTGATTTであった。
ｍＲＮＡの相対量を、１８Ｓを内部参照として使用して、ΔΔＣＴ法に従って計算した。対照ｍＲＮＡのレベルを１に設定し、各処理群を対照群と比較して相対量を得た。
１．４．５ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１．５ 結果
１．５．１ アルテムエーテルによって、３Ｔ３−Ｌ１が褐色脂肪細胞様の特徴を示すことが可能になった
細胞形態学をOlympus IX711顕微鏡下で観察し、記録した。図１に示すように、対照群の３Ｔ３−Ｌ１は典型的な白色脂肪細胞の特徴を示し、細胞容積は大きく、脂質液滴は大きく丸く、脂質液滴の数は少なかった。アルテムエーテル（ＡＲＴ）で処理した３Ｔ３−Ｌ１は、典型的な褐色脂肪細胞様の特徴を示し、細胞容積は小さめで、脂質液滴は小さく密であった。また、この変化は、濃度依存性の傾向を有していた。アルテムエーテルの濃度が増大するにつれ、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の変化はより明らかとなった。
１．５．２ アルテムエーテルは３Ｔ３−Ｌ１におけるＵＣＰ１の発現を上方調節した
３Ｔ３−Ｌ１の全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。ＵＣＰ１のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムｑＰＣＲによって検出した。対照群と比較して、ＡＲＴで処理した３Ｔ３−Ｌ１におけるＵＣＰ１の発現は有意に上方調節され、濃度依存性の傾向を示した。
３Ｔ３−Ｌ１は、標準的な白色前駆脂肪細胞である。アルテムエーテルによって、３Ｔ３−Ｌ１が分化の間に褐色脂肪様の特徴を獲得することが可能になった。３Ｔ３−Ｌ１は、褐色脂肪の形態学的特徴を有していたのみならず、褐色脂肪のマーカーであるＵＣＰ１の発現も示した。
アルテムエーテルは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉系幹細胞が、脂肪細胞への分化の間に褐色脂肪様の特徴を示すように誘導した
２．１ 材料
２．１．１ Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉系幹細胞系
２．１．２ ＤＭＥＭ培地（Gibco）
２．１．３ ウシ胎児血清（Gibco）
２．１．４ 仔ウシ血清（TBD）
２．１．５ ビオチン（Sigma社）
２．１．６ ペニシリン及びストレプトマイシン
２．１．７ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
２．１．８ ＢＭＰ４（R&D社）
２．１．９ ＢＭＰ７（Prospec社）
２．１．８ ＰＶＤＦ膜（Millipore Immunobilon）
２．１．９ Chemiluminescent液体numECL ultra（NCM Biotech Co., Ltd.社）
２．１．１０ MitoTracker Green（Life Technology社）
２．１．１１ 他の記載していない試薬は、Sigma社から購入した。
２．２ 設備
２．２．１ 一定温度の無菌インキュベーター（Thermo Scientific Forma Series II water Jacket）
２．２．２ 顕微鏡（Olympus IX711）
２．２．３ 電気泳動器具（BioRad PowerPac HC）
２．２．４ 自動化学発光器具（ImageQuant LAS4000 Mini）
２．３ 溶液
２．３．１ 培地
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２維持培地
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２誘導分化培地
２．３．２ アルテムエーテル原液を１０ｍＭｏｌ／Ｌの保存濃度でＤＭＳＯに溶解した。
２．３．３ ビオチン
１６０ｍｇのビオチン及び８０ｍｇのパントテン酸カルシウムを２００ｍｌの脱イオン水に溶解し、加熱して溶解した。溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
２．３．４ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（５０ｍＭｏｌ／Ｌ）
１．１５ｇの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを、１００ｍｌの０．２Ｍ水酸化カリウムに溶解し、溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
２．３．５ デキサメタゾン（１ｍＭｏｌ／Ｌ）
０．０３９ｇのデキサメタゾンを１００ｍｌの水に溶解し、溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
２．３．６ インスリン（１ｍｇ／ｍｌ）
０．１ｇのインスリンを１００ｍｌの水に溶解し、数滴の塩酸を添加してインスリンを溶解し、溶液を０．２２μｍのフィルター膜を介して濾過し、滅菌した。
２．３．７ 細胞タンパク質抽出用の溶解緩衝液
２．４ 方法
２．４．１ Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の培養及び分化
７．５×１０５個のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を３．５ｃｍの細胞培養皿に播種し、３〜５日、維持培地内で培養した。播種の翌日、ＢＭＰ４（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加して、細胞を接触阻害まで増殖させた。接触阻害に達した２日後、培地を誘導分化培地に交換し、誘導混合物（０．５ｍＭｏｌ／ＬのＭｉｘ、１μＭｏｌ／ＬのＤｅｘ、１ｎｇ／ｍｌのインスリン、１００ｎＭｏｌ／Ｌのインドメタシン、１ｎＭのＴ３）を同時に添加した。この日を分化の０日目と定義した。２日間の誘発後、新鮮な誘導分化培地に換え、１ｎｇ／ｍｌのインスリン及び１ｎＭｏｌ／ＬのＴ３を添加した。さらに２日間の培養後、細胞が成熟した時点である８日目まで培養物が分化するまで、１日おきに新鮮な培地に換えた。この時点で、分化し成熟した細胞は、白色脂肪細胞であった。
７．５×１０５個のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を３．５ｃｍの細胞培養皿に播種し、３〜５日、維持培地内で培養した。播種の翌日、ＢＭＰ７（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加して、細胞を接触阻害まで増殖させた。接触阻害に達した２日後、培地を誘導分化培地に交換し、誘導混合物（０．５ｍＭのＭｉｘ、１μｍのＤｅｘ、１ｎｇ／ｍｌのインスリン、１００ｎＭのインドメタシン、１ｎＭのＴ３）を同時に添加した。この日を分化の０日目と定義した。２日間の誘導後、新鮮な誘導分化培地に換え、１ｎｇ／ｍｌのインスリン及び１ｎＭのＴ３を添加した。さらに２日間の誘導後、細胞が成熟した時点である８日目まで培養物が分化するまで、１日おきに新鮮な培地に換えた。この時点で、分化して成熟した細胞は、褐色脂肪細胞であった。
２．４．２ アルテムエーテル処理
分化の０日目に、すなわち、誘導分化混合物を添加した際に、化合物を１０ｍＭｏｌ／Ｌの保存濃度で培地に添加し、最終濃度をそれぞれ５μＭｏｌ／Ｌ、１０μＭｏｌ／Ｌ、及び１５μＭｏｌ／Ｌとした。新鮮な培地に換えた際、対応する化合物を補い、化合物は、細胞が分化して成熟するまで常に細胞と共にあった。
２．４．３ 細胞の総タンパク質の抽出
分化して成熟したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を３．５ｃｍの培養皿で誘導し、分化の方法は方法２．４．１を参照した。３００μｌのトリゾールを添加して細胞を完全に溶解させ、溶解物を１．５ｍｌの遠心分離管に移し、１００℃で１０分間加熱した。溶解物を１３０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上層の脂質を除去し、中間層の澄明化した溶解物を新たな遠心分離管に移した。２．５μｌの溶解物を取り出し、ＢＣＡ法によって定量し、２００μｌの溶解物を５０μｌのローディングバッファーと混合し、１００℃で１０分間加熱し、使用するまで−２０℃で保管した。
２．４．４ ウェスタンブロット
３０μｇのＣ３Ｈ０Ｔ１／２タンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を行い、電気泳動はベースゲル上では８０Ｖで、また分離ゲル上では１００Ｖで、標的バンドが分離されるまで行った。タンパク質を氷浴内のＰＶＤＦ膜に、１００Ｖで１００分間移した。移し終えたら、これを１時間、ＴＢＳＴ（ＴＢＳ緩衝液＋０．５％Ｔｗｅｅｎ）で調製した５％脱脂乳でブロックし、特異的抗体と共に一晩、４℃でインキュベートした。翌日、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで３回、室温で１０分間洗浄し、対応する二次抗体と共に、室温で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳＴで３回、一次抗体の条件と同一の条件で洗浄し、化学発光試薬と共に室温で１分間インキュベートし、ImageQuant LAS4000 Mini自動化学発光装置で検出し、曝露し、結果を記録した。抗体のカタログ番号及び抗体の希釈率を以下の表に示す。
２．４．４ MitoTracker Greenでの活性なミトコンドリアの標識
分化して成熟したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を３．５ｃｍの培養皿で誘導した。培地を取り出し、１ｍｌのＰＢＳを添加した。MitoTracker GreenをＰＢＳに最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した。混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、緑色蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した。代表的な視野をキャプチャーし、記録した。
２．５ 結果
２．５．１ アルテムエーテルによって、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２が褐色脂肪様の形態学的特徴を示すことが可能になった
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、多分化能を有する間葉系幹細胞であり、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は白色脂肪細胞に分化し、ＢＭＰ７分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は褐色脂肪細胞に分化する。ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の分化の間、アルテムエーテル（１５μＭｏｌ／Ｌ）を処理のために同時に添加した。細胞の形態学を観察し、ＢＭＰ７分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は典型的な褐色脂肪細胞の特徴を有し、細胞は小さく、脂質液滴は小さく大量であった。ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は典型的な白色脂肪細胞の特徴を有し、細胞は大きく、脂質液滴は大きく少量であった。ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の分化の間、アルテムエーテル（１５μＭｏｌ／Ｌ）を処理のために同時に添加し、細胞は褐色脂肪様の特徴を示し、これはＢＭＰ７分化誘導細胞の形態学に類似していた（図３に示す）。
２．５．２ アルテムエーテルは、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞が分化して成熟した後の、褐色脂肪に関連する遺伝子の発現を上方調節した
ＢＭＰ７分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を陽性対照として使用した。ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を様々な濃度のアルテムエーテル（５、１０、１５μＭｏｌ／Ｌ）で処理し、褐色脂肪に関連する遺伝子のタンパク質レベルを、β−アクチンを内部参照として用いてウェスタンブロットによって検出した。結果は、アルテムエーテルが、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において褐色脂肪に関連する遺伝子ＵＣＰ１、ＰＧＣ１ａ、ＰＲＤＭ１６、及びＣｙｔｏＣのタンパク質レベルを増大させたことを示し、この増大は濃度依存性の傾向を有していた（図４に示す）。
２．５．３ アルテムエーテルは、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２のミトコンドリア生合成を増強させた
ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２のミトコンドリアをMitoTracker Greenで標識し、アルテムエーテル（１５μＭｏｌ／Ｌ）で処理した後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２のミトコンドリア生合成が有意に増強されたことが観察された（図５に示す）。
ＢＭＰ４によって、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉系幹細胞が、白色脂肪の特徴を有する細胞に分化することが可能になった。アルテムエーテルでの処理の後、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は分化して成熟し、細胞形態学、関連遺伝子の発現、及びミトコンドリア生合成の増強という３つの態様を含む、褐色脂肪細胞様の特徴を示した。
アルテムエーテルによって、間質血管細胞群（ＳＶＦ）が分化の間に褐色脂肪細胞様の特徴を獲得することが可能になった。
３．１ 材料
３．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
３．１．２ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（Gibco）
３．１．３ ウシ胎児血清（Gibco）
３．１．４ ビオチン（Sigma社）
３．１．５ ペニシリン及びストレプトマイシン
３．１．６ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
３．１．７ ＰＶＤＦ膜（Millipore Immunobilon）
３．１．８ 化学発光試薬numECL ultra（NCM Biotech Co., Ltd.社）
３．１．１０ 他の記載していない試薬は、Sigma社から購入した。
３．２ 設備
３．２．１ 一定温度の無菌インキュベーター（Thermo Scientific Forma Series II water Jacket）
３．２．２ 顕微鏡（Olympus IX711）
３．２．３ 電気泳動器具（BioRad PowerPac HC）
３．２．４ 自動化学発光装置（ImageQuant LAS4000 Mini）
３．３ 溶液
３．３．１ ＳＶＦ培地（分化及び培養）
３．３．２ 細胞タンパク質抽出用の溶解緩衝液
３．４ 方法
３．４．１ ＳＶＦの分離、培養、及び分化
オスマウスの鼠径脂肪を切片に切断し、コラーゲナーゼで、３７℃で１５分間処理し、２５０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットをＦ１２／ＤＭＥＭ培地に再懸濁した。２．５×１０５個の細胞を採取し、１ｍｌのポリリジンで３０分間前処理した３．５ｃｍの培養皿に播種した。細胞の接触阻害の２日後（分化の０日目と定義される）、以下の脂肪細胞分化プロトコルに従って誘導を行った：１０％ウシ胎児血清、０．５ｍＭｏｌ／ＬのＭｉｘ、１μＭｏｌ／ＬのＤｅｘ、５μｇ／ｍｌのインスリン、及び１μＭｏｌ／Ｌのロシグリタゾンを含むＦ１２／ＤＭＥＭでの２日間の誘導後、培養を、１０％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍｌのインスリン、及び１μＭｏｌ／Ｌのロシグリタゾンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて２日間継続し、その後、細胞が８日目まで分化するまで、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１日おきに換えた。
３．４．２ アルテムエーテルでのＳＶＦの処理
分化の０日目に、ＳＶＦを様々な濃度のアルテムエーテル（５、１０、１５μＭｏｌ／Ｌ）で処理し、次いで、新鮮な培地に換え、対応する濃度のアルテムエーテルを、細胞が分化して成熟するまで添加した。
３．４．３ ＳＶＦ細胞の総タンパク質の抽出及びウェスタンブロット
総ＳＶＦタンパク質を抽出するための方法は２．４．３と同一であり、ウェスタンブロット方法及び抗体のカタログ番号は、２．４．４と同一であった。
３．５ 結果
３．５．１ アルテムエーテルによって、ＳＶＦ一次前駆脂肪細胞が、分化の間に褐色脂肪様の形態学的特徴を獲得することが可能になった
ＳＶＦ一次前駆脂肪細胞の分化の間、ＳＶＦが分化して成熟するまで、細胞を様々な濃度のアルテムエーテルで処理した。標準的な分化対照細胞と比較して、アルテムエーテルで処理した細胞はサイズがより小さめであり、多空洞の小さな脂質液滴の特徴を有していた。また、この変化は、濃度依存性の傾向を有していた（図６に示す）。
３．５．２ アルテムエーテルは、ＳＶＦ分化の間の褐色脂肪に関連する遺伝子の発現を上方調節した
アルテムエーテルで処理したＳＶＦ細胞における褐色脂肪に関連する遺伝子の発現レベルを、ウェスタンブロットによって検出した。図７に示すように、ＰＲＤＭ１６、ＰＧＣ１α、及びＵＣＰ１の発現レベルは、アルテムエーテル濃度が増大するにつれ徐々に増大することが分かった。ＳＶＦは、アルテムエーテルの作用下で一次前駆脂肪細胞であり、ＳＶＦは、インビトロで褐色脂肪の特徴を有する脂肪細胞に分化した。
他のアルテミシニンアナログもまた、アルテムエーテルに加えて褐色化を促進した
４．１ 材料
４．１．１ Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉系幹細胞系
４．１．２ ＤＭＥＭ培地（Gibco）
４．１．３ ウシ胎児血清（Gibco）
４．１．４ 仔ウシ血清（TBD）
４．１．５ ペニシリン及びストレプトマイシン
２．１．６ アルテムエーテル、アルテミシニン、アルテスネート、ジヒドロアルテミシニン（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
２．１．７ ＰＶＤＦ膜（Millipore Immunobilon）
２．１．８ Chemiluminescent No.5 numECL ultra（NCM Biotech Co., Ltd.社）
２．１．９ MitoTracker Green（Life Technology社）
２．１．１０ 他の記載していない試薬は、Sigma社から購入した。
４．２ 設備
４．２．１ 一定温度の無菌インキュベーター（Thermo Scientific Forma Series II water Jacket）
４．２．２ 顕微鏡（Olympus IX711）
４．２．３ 電気泳動器具（BioRad PowerPac HC）
４．２．４ 自動化学発光器具（ImageQuant LAS4000 Mini）
４．３ 方法
４．３．１ Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の培養及び分化
方法２．４．１に従う。
４．３．２ 化合物の処理
アルテミシニン、アルテスネート、及びジヒドロアルテミシニンを、１０ｍＭｏｌ／Ｌの保存濃度でＤＭＳＯ中で保管した。図８に示す濃度を、分化の０日目に添加した。２日ごとに新鮮な培地に換え、対応する濃度の化合物を、細胞が分化して成熟するまで添加した。
４．３．３ Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の総タンパク質の抽出及びウェスタンブロット
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の総タンパク質を抽出するための方法は、２．４．３と同一であった。
ウェスタンブロット方法及び抗体のカタログ番号は、２．４．４と同一であった。
４．４ 結果
対照と比較して、アルテムエーテルで処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２は、以下の褐色脂肪細胞様の特徴を示した：細胞はサイズが小さく、多空洞の小さな脂質液滴を有していた。アルテミシニン、アルテスネート、及びジヒドロアルテミシニンで処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２は全て、類似の形態学的特徴を示した（図８に示す）。ジヒドロアルテミシニンは、褐色脂肪に関連する遺伝子の発現を上方調節した。
ジヒドロアルテミシニン（ＤＨＡ、dihydroartemisinin）は、アルテミシニン及びそのアナログの二次代謝産物である。ジヒドロアルテミシニンが褐色化を促進する効果を有していれば、これは、アルテミシニン及びそのアナログが全て、褐色化を促進する効果を有することを意味する。様々な濃度（１、２．５、５、７．５μＭｏｌ／Ｌ）のジヒドロアルテミシニンで、ＢＭＰ４分化誘導Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を処理した後、褐色脂肪に関連する遺伝子であるＰＧＣ１α及びＵＣＰ１の発現レベルをウェスタンブロットによって検出し、褐色脂肪に関連する遺伝子の発現レベルが、ジヒドロアルテミシニンの濃度が増大するにつれて徐々に増大することが分かった（図９に示す）。この結果によって、アルテミシニンアナログが白色脂肪の褐色化を促進する能力を有していることが確認された。
アルテムエーテルは、高脂肪飼料によって誘発される体重増加を阻害した
５．１ 材料
５．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
５．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
５．１．３ 天秤（Sartorius社）
５．１．４ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
５．２ 方法
５．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを皮下注射した。アルテムエーテルをＰＢＳ中に１５μＭｏｌ／Ｌの濃度で希釈し、各側に２００μｌずつ、左右両方の鼠径領域に注射した。対照群のマウスには、等容積のＰＢＳを注射した。投与を８週間にわたって継続し、マウスの体重を週に１回記録した。
５．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
５．３ 結果
アルテムエーテルを皮下注射したマウスの体重は、対照群のマウスの体重よりも有意に軽かった。図１０Ａに示すように、６週間の投与の後、２つの群の間の体重の差は統計的に異なっていた。図１０Ｂに示すように、投与群のマウスの体重増加は、対照群のマウスの体重増加よりも有意に緩やかであった。アルテムエーテルの皮下注射は、マウスの体重増加を高脂肪飼料条件下で有意に阻害した。
アルテムエーテルの皮下注射は、高脂肪給餌マウスの脂肪組織を低減させた
６．１ 材料
６．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
６．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
６．１．３ パラホルムアルデヒド（４％、Sigma社）
６．１．４ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
６．２ 方法
６．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを皮下注射した。アルテムエーテルをＰＢＳ中に１５μＭｏｌ／Ｌの濃度で希釈し、各側に２００μｌずつ、左右両方の鼠径領域に注射した。対照群のマウスには、等容積のＰＢＳを注射した。投与は８週間継続した。マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、解剖し、鼠径脂肪（鼠径の皮下脂肪）、精巣上体脂肪（生殖腺の内臓脂肪）、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪（ＢＡＴ、標準的な褐色脂肪）を取り出し、秤量し、固定した。脂肪組織の組織学的分析は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託した。組織学的分析のプロセスは、固定、パラフィン包埋、切片化、及びＨＥ染色のステップを含んでいた。
６．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
６．３ 結果
３つの代表的な脂肪組織片（鼠径脂肪、精巣上体脂肪、及び褐色脂肪）を取り出し、分析した。アルテムエーテルを皮下注射したマウスにおける脂肪組織の容積（図１１Ａ）及び重量（図１１Ｂ）が、対照群のマウスのそれよりも有意に小さいことが分かった。脂肪組織の切片化及び染色は、投与群のマウスの脂肪細胞が、対照群のマウスのそれよりも有意に小さいことを示した（図１１Ｃ）。アルテムエーテルは、高脂肪給餌マウスにおける脂肪の容積及び重量を低減させ、アルテムエーテルによって生じる重量の減少は、脂肪組織の減少に主に起因していた。
アルテムエーテルの皮下注射は、高脂肪飼料によって誘発された肥満マウスにおけるグルコース代謝を改善した
７．１ 材料
７．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
７．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
７．１．３ グルコース注射
７．１．４ 注射用のインスリン（Humulin）
７．１．５ 血糖値測定器（Roche OneTouch ExtraEasy）
７．１．６ 血中グルコース試験紙（Roche OneTouch ExtraEasy）
７．１．８ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
７．２ 方法
７．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを皮下注射した。アルテムエーテルをＰＢＳ中に１５μＭｏｌ／Ｌの濃度で希釈し、各側に２００μｌずつ、左右両方の鼠径領域に注射した。対照群のマウスには、等容積のＰＢＳを注射した。投与は８週間継続した。
７．２．２ グルコース負荷試験
マウスを１２〜１６時間絶食させ、２ｍｇ／ｋｇの用量のグルコースを腹腔内注射した。注射後の０分目、３０分目、６０分目、９０分目、及び１２０分目に、血液を尾静脈から回収し、血中グルコースを、OneTouch ExtraEasy血糖値測定器及びOneTouch ExtraEasy血中グルコース試験紙で測定し、結果を記録した。
７．２．３ インスリン負荷試験
インスリンを、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕの用量で腹腔内注射した。注射後の０分目、１５分目、３０分目、４５分目、及び６０分目に、血液を尾静脈から回収し、血中グルコースを測定した。
７．２．４ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
７．３ 結果
８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを皮下注射したマウスのグルコース負荷は、対照群のマウスのそれよりも有意に良好であり（図１２Ａ）、インスリン負荷は、対照群のマウスのそれよりも有意に良好であった（図１２Ｂ）。高脂肪飼料給餌条件下で、８週間の投与の後、アルテムエーテルを皮下注射したマウスのグルコース代謝及びインスリン感受性は、対照群のマウスのそれよりも有意に良好であり、このことは、アルテムエーテルがグルコース代謝のホメオスタシスの維持において役割を有することを示す。
アルテムエーテルは、高脂肪飼料によって誘発される脂肪肝を阻害した
８．１ 材料
８．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
８．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
８．１．３ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
８．２ 方法
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを皮下注射した。アルテムエーテルをＰＢＳ中に１５μＭｏｌ／Ｌの濃度で希釈し、各側に２００μｌずつ、左右両方の鼠径領域に注射した。対照群のマウスには、等容積のＰＢＳを注射した。投与は８週間継続した。マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、マウスの肝臓組織を取り出した。組織の固定、パラフィン包埋、切片化、及びＨＥ染色を含む組織学的分析は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託した。
８．４ 結果
８週間の高脂肪飼料給餌の後、明らかな脂質蓄積が対照群のマウスの肝臓で見られ、一方、少量の脂質のみが、アルテムエーテルを皮下注射したマウスの肝臓で見られた。脂肪肝の状態は、対照群のマウスのそれよりも有意に改善された。アルテムエーテルの皮下注射は、高脂肪飼料によって誘発される脂肪肝を効果的に阻害した。
アルテムエーテルの皮下注射は、高脂肪給餌マウスにおける皮下脂肪の褐色化を誘発した
９．１ 材料
９．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
９．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
９．１．３ マウス用温度計（Physitemp BAT-12）
９．１．４ ＵＣＰ１抗体（Abcam社、ab10983、１：５０）
９．１．５ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
９．２ 方法
９．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを皮下注射した。アルテムエーテルをＰＢＳ中に１５μＭｏｌ／Ｌの濃度で希釈し、各側に２００μｌずつ、左右両方の鼠径領域に注射した。対照群のマウスには、等容積のＰＢＳを注射した。投与は８週間継続した。マウスを絶食させ、４℃の飼育箱で維持した。直腸温度を２時間ごとに測定した。６時間後、マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、鼠径脂肪を組織学的分析のために取り出した。組織の固定、パラフィン包埋、及び切片化を含む組織学的分析、並びにＵＣＰ１の免疫組織化学的実験は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託した。
９．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
９．３ 結果
８週間の投与の後、アルテムエーテルを皮下注射したマウスの体温は、４℃の環境に曝露した場合、対照群のマウスの体温よりも有意に高かった（図１４Ａ）。低温曝露環境での体温の維持は、熱産生脂肪組織によって行われる生理学的機能である。精巣上体脂肪を取り出し、ＵＣＰ１の免疫組織化学的試験にかけ、結果は、投与群のマウスの皮下脂肪が有意なＵＣＰ１発現を示すことを示した（図１４Ｂ）。８週間の皮下投与の後、アルテムエーテルを皮下注射されたマウスは、体温を維持する能力が有意に増大しており、明らかな褐色化が皮下脂肪において見られた。アルテムエーテルが体重増加を阻害し、且つ皮下脂肪の褐色化を促進することによって代謝を改善することが示された。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって誘発される体重増加を阻害した
１０．１ 材料
１０．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）
１０．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
１０．１．３ 天秤（Sartorius社）
１０．１．４ アルテムエーテル（Wuhan Feierde Biotech Co., Ltd.社）
１０．１．５ ココナッツ油（Aladdin社）
１０．２ 方法
１０．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行い、マウスの体重を週に１回記録した。
１０．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１０．３ 結果
アルテムエーテルを腹腔内注射されたマウスの体重は、対照群のマウスの体重よりも有意に軽かった。図１５Ａに示すように、３週間の投与の後、２つの群の間の体重の差は統計的に異なっていた。図１５Ｂに示すように、投与群のマウスの体重増加は、対照群のマウスの体重増加よりも有意に緩やかであった。アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって誘発される体重増加を有意に阻害した。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪給餌マウスにおける脂肪組織を有意に低減させた
１１．１ 材料
１１．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１１．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
１１．１．３ パラホルムアルデヒド（４％、Sigma社）
１１．１．４ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１１．１．５ ココナッツ油（Aladdin）
１１．２ 方法
１１．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、解剖し、鼠径脂肪（鼠径の皮下脂肪）、精巣上体脂肪（生殖腺の内臓脂肪）、及び肩甲骨間領域の褐色脂肪（ＢＡＴ、標準的な褐色脂肪）を取り出し、秤量し、固定した。脂肪組織の組織学的分析は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託し、これは、固定、パラフィン包埋、切片化、及びＨＥ染色のステップを含んでいた。
１１．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１１．３ 結果
３つの代表的な脂肪組織片を取り出し、分析した。アルテムエーテルを皮下注射したマウスにおける脂肪組織の容積（図１６Ａ）及び重量（図１６Ｂ）が、対照群のマウスのそれよりも有意に小さいことが分かった。脂肪組織の切片化及び染色は、投与群のマウスにおける脂肪細胞が、対照群のマウスのそれよりも有意に小さいことを示した（図１６Ｃ）。アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって生じる脂肪蓄積を効果的に阻害した。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって誘発された肥満マウスにおけるグルコース代謝を改善した
１２．１ 材料
１２．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１２．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
１２．１．３ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１２．１．４ ココナッツ油（Aladdin社）
１２．１．５ グルコース注射
１２．１．６ 注射用のインスリン（Humulin）
１２．１．７ 血糖値測定器（Roche OneTouch ExtraEasy）
１２．１．８ 血中グルコース試験紙（Roche OneTouch ExtraEasy）
１２．１．９ クロラール水和物（１０％、Sigma社）
１２．１．１０ 自動生化学的分析器及び血中グルコース用キャリブレーターCfas及びキット（Roche社）
１２．２ 方法
１２．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。
１２．２．２ グルコース負荷試験
マウスを１２〜１６時間絶食させ、体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量のグルコースを腹腔内注射した。注射後の０分目、３０分目、６０分目、９０分目、及び１２０分目に、血液を尾静脈から回収し、血中グルコースを、OneTouch ExtraEasy血糖値測定器及びOneTouch ExtraEasy血中グルコース試験紙で測定し、結果を記録した。
１２．２．３ インスリン負荷試験
インスリンを、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕの用量で腹腔内注射した。注射後の０分目、１５分目、３０分目、４５分目、及び６０分目に、血液を尾静脈から回収し、血中グルコースを測定した。
１２．２．４ 随時血中グルコースのモニタリング
マウスを１０％クロラール水和物で麻酔し、血液を眼窩から採取した。全血を３００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。血清を採取し、血中グルコースレベルを、自動生化学的分析器及び血中グルコース用キャリブレーターCfas及びキット（Roche社）によって測定した。
１２．２．５ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１２．３ 結果
８週間の高脂肪飼料給餌の後の、アルテムエーテルを腹腔内注射したマウスの随時血中グルコースは、対照群のマウスの随時血中グルコースよりも有意に低く、グルコース負荷は、対照群のマウスのグルコース負荷よりも有意に良好であり（図１２Ａ）、インスリン感受性もまた、対照群のマウスのインスリン感受性よりも有意に良好であった（図１２Ｂ）。アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料を給餌された肥満マウスの血中グルコースを効果的に低減させ、グルコース代謝及びインスリン感受性を有意に改善した。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって誘発された肥満マウスにおける脂肪肝を効果的に阻害した
１３．１ 材料
１３．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１３．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
１３．１．３ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１３．１．４ ココナッツ油（Aladdin社）
１３．２ 方法
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、マウスの肝臓組織を取り出し、固定した。肝臓の組織学的分析は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託し、組織学的分析のプロセスは、組織の固定、パラフィン包埋、切片化、及びＨＥ染色を含んでいた。
１３．４ 結果
８週間の高脂肪飼料給餌の後、明らかな脂質蓄積が対照群のマウスの肝臓で見られ、一方、少量の脂質のみが、アルテムエーテルを腹腔内注射したマウスの肝臓で見られ、図１８に示すように、肝細胞の形態学もまた正常であった。アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって誘発される脂肪肝を効果的に阻害した。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪飼料によって生じる血中脂質の上昇を阻害した
１４．１ 材料
１４．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（４〜６週齢）マウス（Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１４．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
１４．１．３ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１４．１．４ ココナッツ油（Aladdin社）
１４．１．５ クロラール水和物（１０％、Sigma社）
１４．１．６ 脂質キャリブレーターCfas Lipid及び自動生化学的分析器において使用される他のキャリブレーターCfas、並びに関連する指標のための検出キット（Roche社）
１４．２ 方法
１４．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。
１４．２．２ マウスにおける血清指標の検出
マウスを１０％クロラール水和物で麻酔し、血液を眼窩から採取した。全血を３００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。血清を採取し、血清指標を、脂質キャリブレーターCfas Lipid、高密度リポタンパク質Cfas、及び低密度リポタンパク質Cfas、並びに関連する指標のための検出キットによって測定した。
１４．２．３ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１４．３ 結果
８週間の高脂肪飼料給餌の後、アルテムエーテルを腹腔内注射したマウスの血清におけるトリグリセリド及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ、high-density lipoprotein）は、対照群と異ならなかった。図１９に示すように、血清コレステロール及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、low density lipoprotein）は、対照群と比較して有意に減少した。アルテムエーテルは、高脂肪飼料によって生じる脂質異常症を有意に改善した。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、高脂肪給餌マウスにおける皮下脂肪の褐色化を誘発した
１５．１ 材料
１５．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）
１５．１．２ 高脂肪飼料（Research Diets社）
１５．１．３ マウス用温度計（Physitemp BAT-12）
１５．１．４ ＵＣＰ１特異的抗体（Abcam社、ab10983、１：５０）
１５．１．５ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１５．１．６ ココナッツ油（Aladdin社）
１５．２ 方法
１５．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。高脂肪飼料を使用して、肥満マウスが脂肪含量６０％となるように誘導した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。マウスに高脂肪飼料を給餌している間、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。マウスを絶食させ、４℃の飼育箱で維持した。直腸温度を２時間ごとに測定した。６時間後、マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、鼠径脂肪を組織学的分析のために取り出した。組織の固定、パラフィン包埋、及び切片化を含む組織学的分析、並びにＵＣＰ１の免疫組織化学的実験は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託した。
１５．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１５．３ 結果
８週間の投与の後、アルテムエーテルを腹腔内注射したマウスの体温は、４℃の環境に曝露した場合、対照群のマウスの体温よりも有意に高かった（図１９Ａ）。低温曝露環境での体温の維持は、熱産生脂肪組織によって行われる生理学的機能であった。マウスの精巣上体脂肪を取り出し、ＵＣＰ１の免疫組織化学的試験にかけ、結果は、投与群のマウスの皮下脂肪が有意なＵＣＰ１発現を示すことを示した（図１９Ｂ）。８週間のアルテムエーテルの腹腔内注射の後、投与群のマウスは、体温を維持する能力が有意に増大しており、明らかな褐色化が皮下脂肪で見られた。アルテムエーテルが、皮下脂肪の褐色化を促進することによって体重増加を阻害することが示された。
アルテムエーテルは、糖尿病性マウスであるｏｂ／ｏｂマウスにおける体重増加を阻害した
１６．１ 材料
１６．１．１ オスｏｂ／ｏｂマウス（４週齢、南京大学のModel Animal Research Center）
１６．１．２ 天秤（Sartorius社）
１６．１．３ アルテムエーテル（Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd.社）
１６．１．４ ココナッツ油（Aladdin社）
１６．２ 方法
１６．２．１ マウスの飼育及び投与
ｏｂ／ｏｂマウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスが４週齢まで成長したら、マウスを各群につき４頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。投与群に、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のｏｂ／ｏｂマウスには、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇのアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行い、マウスの体重を週に１回記録した。
１６．２．３ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１６．３ 結果
投与群のｏｂ／ｏｂマウスの体重は、対照群のマウスの体重よりも低い傾向にあったが、統計的に異ならなかった（図２１Ａ）。しかし、投与群のマウスの体重増加は、対照群のマウスの体重増加よりも有意に緩やかであり（図２１Ｂ）、このことは、アルテムエーテルがｏｂ／ｏｂマウスの体重増加を有意に阻害したことを示す。しかし、投与群と対照群との間の差は、８週間にわたる投与の時点では、統計的に有意ではかった。アルテムエーテルは、糖尿病性動物モデルであるｏｂ／ｏｂマウスの体重増加を効果的に阻害した。
アルテムエーテルは、糖尿病性ｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝を改善した
１７．１ 材料
１７．１．１ オスｏｂ／ｏｂマウス（４週齢、南京大学のModel Animal Research Center）
１７．１．２ アルテムエーテル（Wuhan Feierde Biotech Co., Ltd.社）
１７．１．３ ココナッツ油（Aladdin社）
１７．２ 方法
ｏｂ／ｏｂマウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスが４週齢まで成長したら、マウスを各群につき４頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。投与群のマウスに、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のｏｂ／ｏｂマウスには、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇのアルテムエーテルを注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、マウスの肝臓組織を取り出し、固定し、パラフィン包埋した。組織学的分析は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託した。
１７．３ 結果
アルテムエーテル投与群のｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝は、対照群のマウスの脂肪肝と比較して有意に緩和された（図２２）。アルテムエーテルは、糖尿病性動物モデルｏｂ／ｏｂの脂肪肝を効果的に緩和した。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、健康なマウスの成長に影響しなかった
１８．１ 材料
１８．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）
１８．１．２ 通常飼料（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１８．１．３ 天秤（Sartorius社）
１８．１．４ アルテムエーテル（Wuhan Feierde Biotech Co., Ltd.社）
１８．１．５ ココナッツ油（Aladdin社）
１８．２ 方法
１８．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。投与群のマウスに、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。対照群のマウスには、１００μｌのココナッツ油を注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行い、マウスの体重を週に１回記録した。
１８．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１８．３ 結果
８週間の投与の間、投与群及び対照群におけるマウスの体重に差はなかった（図２３Ａ）。投与群のマウスの体重増加もまた、対照群のマウスの体重増加と有意には異ならなかった（図２３Ｂ）。アルテムエーテルの腹腔内注射は、健康な痩せたマウスの正常な成長に影響しなかった。
アルテムエーテルの腹腔内注射は、健康な痩せたマウスにおけるグルコース代謝に影響しなかった
１９．１ 材料
１９．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１９．１．２ 通常飼料（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
１９．１．３ グルコース注射
１９．１．４ 注射用のインスリン（Humulin）
１９．１．５ 血糖値測定器（Roche OneTouch ExtraEasy）
１９．１．６ 血中グルコース試験紙（Roche OneTouch ExtraEasy）
１９．２ 方法
１９．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスには、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射し、対照群のマウスには１００μｌのココナッツ油を注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。
１９．２．２ グルコース負荷試験
マウスを１２〜１６時間にわたり絶食させ、２ｍｇ／ｋｇの用量のグルコースを腹腔内注射した。注射後の０分目、３０分目、６０分目、９０分目、及び１２０分目に、血液を尾静脈から回収し、及び血中グルコースを、OneTouch ExtraEasy血糖値測定器及びOneTouch ExtraEasy血中グルコース試験紙で測定し、結果を記録した。
１９．２．３ インスリン負荷試験
インスリンを、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕの用量で腹腔内注射した。注射後の０分目、１５分目、３０分目、４５分目、及び６０分目に、血液を尾静脈から回収し、血中グルコースを測定した。
１９．２．４ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
１９．３ 結果
健康な痩せたマウスに、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射した。図２３Ａに示すように、投与群のマウスにおけるグルコース負荷曲線は、対照群のマウスのそれと異ならず、このことは、グルコース代謝がアルテムエーテルに影響されなかったことを示す。図２４Ｂに示すように、投与群のマウスにおけるインスリン負荷曲線もまた、対照群のマウスのそれと異ならなかった。アルテムエーテルの腹腔内注射は、健康な痩せたマウスのグルコース代謝を変化させなかった。
体重１ｋｇ当たり２０ｍｇのアルテムエーテルの腹腔内注射は、マウスにおいて肝臓損傷を生じさせなかった
２０．１ 材料
２０．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢）
２０．１．２ 通常飼料（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
２０．１．３ アルテムエーテル（Wuhan Feierde Biotech Co., Ltd.社）
２０．１．４ ココナッツ油（Aladdin社）
２０．２ 方法
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを各群につき８頭のマウスで、対照群及び投与群にランダムに分けた。投与群のマウスには、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスに、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射した。対照群のマウスには１００μｌのココナッツ油を注射した。投与は週に２回、８週間にわたって行った。マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、マウスの肝臓組織を取り出し、固定した。肝臓組織の固定、パラフィン包埋、切片化、及びＨＥ染色は、Shanghai Saige Biotech Co., Ltd.社に委託した。
２０．３ 結果
図２５に示すように、アルテムエーテルを８週間にわたって腹腔内注射された健康な痩せたマウスの肝細胞の形態学は正常であり、対照群のマウスのそれと異ならなかった。体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを、週に２回、８週間にわたって腹腔内注射したケースでは、アルテムエーテルは肝毒性を有していなかった。
アルテムエーテルは、マウスの飼料摂取量を変化させなかった
２１．１ 材料
２１．１．１ オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
２１．１．２ 通常飼料（Shanghai Slike experimental animal Co., Ltd.社）
２１．１．３ 高脂肪飼料（Research Diets社）
２１．１．４ アルテムエーテル（Wuhan Feierde Biotech Co., Ltd.社）
２１．１．５ ココナッツ油（Aladdin社）
２１．２ 方法
２１．２．１ マウスの飼育及び投与
マウスを、復旦大学のLaboratory Animal CenterのＳＰＦ動物実験室で、２１℃〜２３℃の室温で、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスが８週齢まで成長したら、マウスを、各群につき８頭のマウスで、高脂肪対照群、高脂肪投与群、正常投与群、及び正常対照群の４つの群にランダムに分けた。投与群（高脂肪試料及び通常飼料）には、アルテムエーテルを腹腔内注射した。腹腔内注射用のアルテムエーテルは、４℃で、ココナッツ油中で、６ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭｏｌ／Ｌ）の保存濃度で保管し、光から保護した。投与群のマウスには、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量のアルテムエーテルを注射し、対照群のマウスには１００μｌのココナッツ油を注射した。飼料を週に１回秤量し、各群のマウスの飼料消費量を記録した。
２１．２．２ データ分析
データの差をステューデントＴ検定法によって分析し、ｐ＜０．０５は統計学的差異を示す。
２１．３ 結果
図２６Ａに示すように、高脂肪群では、投与群のマウスの飼料消費量は、対照群のマウスの飼料消費量と実質的に等しく、差がなかった。図２６Ｂに示すように、正常群では、投与群のマウスの飼料消費量は、対照群のマウスの飼料消費量と異ならなかった。通常飼料及び高脂肪飼料の両方の条件下で、アルテムエーテルの腹腔内注射は、マウスの通常飼料摂取量に影響しなかった。この実施例の条件下で、アルテムエーテルは、神経性無食欲症を生じさせなかった。

Claims (10)

  1. 脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための医薬の調製における、以下の一般式（Ａ）：

    (A)
    （式中、Ｒは、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、ブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）、２−アミノエトキシ、２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ、チオモルホリニル、及び１，１−ジオキシドチオモルホリニルから選択される）によって表されるアルテミシニンアナログの使用。
  2. 治療有効量の、以下の一般式（Ａ）：、

    (A)
    （式中、Ｒは、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、ブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）、２−アミノエトキシ、２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ、チオモルホリニル、及び１，１−ジオキシドチオモルホリニルから選択される）によって表されるアルテミシニンアナログを、それを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする、脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための方法。
  3. 治療有効量のアルテミシニンアナログを投与するステップが、経口又は注射によるものであり、好ましくは、前記アルテミシニンアナログの投与量が、それぞれ、経口投与では２０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、注射では１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 以下の一般式（Ａ）：

    (A)
    （式中、Ｒは、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、ブタン二酸モノエステル基（スクシネート基）、２−アミノエトキシ、２Ｒ−３−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ、チオモルホリニル、及び１，１−ジオキシドチオモルホリニルから選択される）によって表されることを特徴とする、脂肪分解を促進するための及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するためのアルテミシニンアナログ。
  5. アルテミシニンアナログが、式（II）：

    (II)
    によって表されるアルテムエーテルであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用、アルテミシニンアナログ、又は方法。
  6. 脂肪分解の促進が、白色脂肪の褐色化の促進を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用、アルテミシニンアナログ、又は方法。
  7. 脂肪分解の促進及び／又は代謝関連疾患の予防若しくは治療が、体重の制御及び代謝の改善を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用、アルテミシニンアナログ、又は方法。
  8. 代謝関連疾患が、肥満が原因の高血糖、インスリン抵抗性、脂質異常症、及び／又は脂肪肝であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用、アルテミシニンアナログ、又は方法。
  9. 脂肪分解を促進するため及び／又は代謝関連疾患を予防若しくは治療するための医薬組成物であって、（１）請求項４又は５に記載のアルテミシニンアナログ、及び（２）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
  10. 好ましくは、経口投与のための医薬組成物の剤形が、経口懸濁剤、散剤、及び顆粒剤から選択され、注射用の医薬組成物の剤形が、水溶液、油、及び懸濁液から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
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