JP2019511918A - ヒト化ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類 - Google Patents

Abstract

マウスおよびラットなどの遺伝子改変齧歯類、ならびに当該遺伝子改変齧歯類を作製するための方法および組成物が提供される。齧歯類は、内因性齧歯類のＴｍｐｒｓｓ２遺伝子、Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、またはＴｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子などの少なくとも１つの内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヒト化を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３０１，０２３号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照による組み込み
２０１７年２月１３日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３３０９３＿１０２３４ＵＳ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の２７５ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。

ＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼは、Ｎ末端膜貫通ドメインを特徴とするプロテアーゼのファミリーである（Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３５）：２３１７７−２３１８１，２００９；Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）：８５７−８６０，２００１）。このファミリーのプロテアーゼはすべて、一本鎖チモーゲンとして発現され、高度に保存されたＲ／（ＩＶ）ＶＧＧモチーフ内の開裂によりタンパク質分解で活性化される。このファミリーの１種である、膜貫通結合型プロテアーゼセリン４型（ＴＭＰＲＳＳ４：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｓｅｒｉｎｅ ｔｙｐｅ ４）は、上皮を通過するナトリウムと水を制御する上皮ナトリウムチャンネル（ＥｎａＣ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ）を活性化することが示されている（Ｇｕｉｐｐｏｎｉ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：２８２９；Ｖｕａｇｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０：１９１）。ＴＭＰＲＳＳ４のタンパク質分解的活性化物質は判明していない。しかしながら、公開されているデータから、このタンパク質は自己活性化されることが示唆されている。活性化されるとき、ＴＭＰＲＳＳ４の触媒ドメインは、ジスルフィド結合を介してタンパク質のＮ末端への結合を維持する。ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ２、およびＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ（またはヒト気道トリプシン様プロテアーゼ；“ＨＡＴ”（Ｈｕｍａｎ Ａｉｒｗａｙ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ））は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）を開裂することが示されており、これはこのウイルスのライフサイクルにおいて最初の重要な工程である。このタンパク質は前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、活性化のためにはＨＡ１とＨＡ２に開裂されることが必要であるため、この開裂はＨＡの活性に必須である。Ｃａｃｏ−２細胞においてＴＭＰＲＳＳ４をＲＮＡｉノックダウンすると、ウイルスの拡散が減少する。さらに、ＴＭＰＲＳＳ４は、インフルエンザに感染したマウスの肺において高度に上方制御されることが示されている（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：９８９６；Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：６３２４；Ｂｏｔｔｃｈｅｒ−Ｆｒｉｅｂｅｒｓｈａｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：５６０４；Ｂｅｒｔａｍ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００１６；Ｂｅｒｔａｍ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００１６；Ｂｏｔｔｃｈｅｒ−Ｆｒｉｅｂｅｒｓｈａｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：１５５４；Ｂａｈｇａｔ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．８：２７）。

ウイルス感染および他の疾患の治療ならびに予防を目的とした、ヒトＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼを特異的に標的とする抗体をはじめとする化合物を特定し、試験するための、たとえば齧歯類の感染モデルなどのｉｎ ｖｉｖｏシステムの開発が必要とされている。

Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３５）：２３１７７−２３１８１，２００９ Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）：８５７−８６０，２００１ Ｇｕｉｐｐｏｎｉ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：２８２９ Ｖｕａｇｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０：１９１ Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：９８９６ Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：６３２４ Ｂｏｔｔｃｈｅｒ−Ｆｒｉｅｂｅｒｓｈａｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：５６０４ Ｂｅｒｔａｍ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００１６ Ｂｅｒｔａｍ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００１６ Ｂｏｔｔｃｈｅｒ−Ｆｒｉｅｂｅｒｓｈａｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：１５５４ Ｂａｈｇａｔ ｅｔ ａｌ． ２０１１ Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．８：２７

本発明は、齧歯類を操作して、新たな治療剤を特定および開発するためのｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供することが望まれているという認識を包含するものである。たとえば本発明は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類は、ウイルス感染の治療および予防を目的とした治療剤の特定および開発における使用に望ましいという認識を包含するものである。

１つの態様において、本発明は、そのゲノムが、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類を提供するものであり、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のたとえばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’制御配列の制御下にある。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類中のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）に対し、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードしている。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分に対し、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）細胞質部分と膜貫通部分を含有する。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有しており、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインに対し、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）ポリペプチドをコードしている。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有しており、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分に対し、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）ポリペプチドをコードしている。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓの座位に位置するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有しており、この遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子の連続ゲノム配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の連続ゲノム配列の置換により生じたものである。特定の実施形態では、挿入される同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードするエクソン配列を含んでいる。一部の実施形態では、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の連続ゲノム配列は、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の３’ＵＴＲも含有している。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に対しヘテロ接合性である。他の実施形態では、齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に対しホモ接合性である。

さらなる実施形態では、齧歯類は、異なる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位で２個以上のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有しており、各内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位は、それぞれの同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子でヒト化されている。たとえばヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のうちの２個以上でヒト化されている。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有しており、この遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列とヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列を含有しており、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のプロモーターの制御下にある。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインに対し、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質は、一部の実施形態では、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一（たとえば少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一）なアミノ酸配列を含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、たとえば配列番号４に明記されるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の残基Ｗ１０６〜Ｇ４９２またはＣ末端３８７アミノ酸から構成されるアミノ酸配列と実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）外部ドメインを含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、ヒト化される内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有しているヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の例は、配列番号２に明記される。

一部の実施形態では、齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列と、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有しており、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）外部ドメインをコードしている。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン４から、コードエクソン１３の終止コドンまでを含有するヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列である。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子に含有される内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と、実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）細胞質部分と膜貫通部分をコードしている。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン１〜２、およびヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３を含有しており、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分、およびヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメイン、を含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、エクソン３を含有しており、一部の実施形態では、このエクソン３は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３であり、他の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン３である。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン３の５’部分と、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の３’部分を含むエクソン３を含有する。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有しており、この遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列とヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列を含有しており、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のプロモーターの制御下にある。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている。ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質は、一部の実施形態では、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一（たとえば少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一）なアミノ酸配列を含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、たとえば配列番号１１に明記されるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の残基Ｋ５４〜Ｌ４３７またはＣ末端３８４アミノ酸から構成されるアミノ酸配列と実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）外部ドメインを含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、ヒト化される内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有しているヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている。内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の例は、配列番号９に明記される。

一部の実施形態では、齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列と、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有しており、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと、実質的に同一な外部ドメインをコードしている。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４から、コードエクソン１３の終止コドンまでを含有する連続ゲノム配列である。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に含まれる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をコードしている。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のコードエクソン１からコードエクソン３まで、およびヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有している。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有しており、この遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列とヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列を含有しており、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のプロモーターの制御下にある。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている。ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質は、一部の実施形態では、配列番号１８に明記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一（たとえば少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一）なアミノ酸配列を含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、たとえば配列番号１８に明記されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の残基Ａ４２〜Ｉ４１８またはＣ末端３７７アミノ酸から構成されるアミノ酸配列と実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）外部ドメインを含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、ヒト化される内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な（たとえば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一な）細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有しているヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている。内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の例は、配列番号１６に明記される。

一部の実施形態では、齧歯類は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列と、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有しており、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと、実質的に同一な外部ドメインをコードしている。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン３から、コードエクソン１０の終止コドンまでを含有する連続ゲノム配列である。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子に含まれる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をコードしている。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のコードエクソン１〜２、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン３からコードエクソン１３までを含有している。

別の態様では、本発明は、そのゲノムが、本明細書に記載されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する単離された齧歯類の細胞または組織を提供するものである。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子からなる群から選択される。

さらに別の態様では、本発明は、そのゲノムが、本明細書に記載されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類胚性幹細胞を提供するものである。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子からなる群から選択される。

別の態様では、本明細書に開示される齧歯類胚性幹細胞から作製された齧歯類胚も提供される。
１つの態様では、本発明は、齧歯類における内因性Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヒト化の用途に適した核酸ベクターを提供する。一部の実施形態では、核酸ベクターは、５’相同アームと３’相同アームに隣接したヒトＴｍｐｒｓｓ核酸配列（たとえば、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡ）を含む。５’および３’の相同アームは、それぞれヒトＴｍｐｒｓｓ核酸配列に対し５’と３’に配置された核酸配列であり、同族齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の外部ドメインをコードする齧歯類ゲノムＤＮＡに隣接する、齧歯類中の内因性Ｔｍｐｒｓｓ座位のゲノムＤＮＡ配列に対し相同である。ゆえに、５’および３’の相同アームは、相同組み換えを介在することができ、および同族齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の外部ドメインをコードする齧歯類ゲノムＤＮＡと、ヒトＴｍｐｒｓｓ核酸配列を置換させ、本明細書に記載されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を形成させることができる。

さらなる態様において、本発明は、そのゲノムがヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類を提供する方法を目的としている。当該方法は、齧歯類のゲノムを改変し、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のゲノム配列を、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のゲノム配列と置換させ、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を形成させることを含む。

一部の実施形態では、本発明は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類（たとえばマウスまたはラット）を作製する方法を提供するものであり、前記方法は、（ａ） 齧歯類胚性幹細胞において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位にゲノム断片を挿入することであって、前記ゲノム断片は、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含有しており、それにより、（たとえば本明細書に記載される）ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を形成させること；（ｂ） （ａ）のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類胚性幹細胞を取得すること；および（ｃ） （ｂ）の齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を生成すること、を含む。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子からなる群から選択される。様々な実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子にコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な（たとえば少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一な）外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードしている。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質からなる群から選択されるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインを含有している。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒト化される内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有している。

他の態様では、本発明は、インフルエンザウイルス感染症の治療における、化合物（たとえばヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質を特異的に標的とする候補阻害物質など）の治療有効性評価のための本明細書に開示される齧歯類の使用方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載される齧歯類を提供する工程、前記齧歯類にインフルエンザウイルスと候補化合物を投与する工程；および前記齧歯類中のインフルエンザウイルス感染の存在と重症度をモニタリングし、前記薬剤候補の治療有効性を決定する工程を含んでもよい。

一部の実施形態では、インフルエンザウイルスは、化合物の前に齧歯類に投与される。他の実施形態では、インフルエンザウイルスは、化合物の後に齧歯類に投与される。
一部の実施形態では、候補化合物は、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質に特異的な抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、候補化合物は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質からなる群から選択されるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質に特異的な抗体またはその抗原結合断片である。

本発明のその他の特徴、目的および利益は、以下の詳細な説明において明らかである。しかし、当該詳細な説明は、本発明の実施形態を示しているが、それらは例示の目的で提示されているものであり、限定を目的として提示されていないことを理解されたい。本発明の範囲内のさまざまな変更および修正は、詳細説明から当業者には明らかとなるであろう。

以下の図から構成される、本明細書に含まれる図面は、例示のみを目的としており、限定を目的とはしていない。
図１Ａ〜図１ＤはマウスＴｍｐｒｓｓ２のヒト化戦略の例。図１Ａは、マウスＴｍｐｒｓｓ２遺伝子およびヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のゲノム構造の、正確な縮尺ではない図を示す。エクソンは、ゲノム配列を横切って配置されている薄いバーで表されており、両遺伝子に対する第一のコードエクソンは、エクソンの上の開始コドン「ＡＴＧ」により示され、最終コードエクソンは、エクソンの上の「終止（Ｓｔｏｐ）」コドンにより示されている。削除される約２５，２９１ｂｐのマウスゲノム断片と、挿入される約２５，０９１ｂｐのヒトゲノム断片が示されている。実施例１に記述されるアッセイにおいて用いられたプローブの位置が示されている。ＴＭ：膜貫通ドメイン；ＳＲＣＲ：スカベンジャー受容体システインリッチ様ドメイン；ＬＤＬＲａ：低比重リポタンパク質受容体クラスＡ。 図１Ｂは、内因性マウスＴｍｐｒｓｓ２遺伝子をヒト化するための改変ＢＡＣベクターの例を、接合部配列とともに、正確な縮尺ではないが、示している（配列番号２２、２３および２４）。 図１Ｃは、ネオマイシンカセットが削除された後のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２アレルを、接合部配列とともに、正確な縮尺ではないが、示している（配列番号２２および２５）。 図１Ｄは、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質（配列番号４）、マウスＴｍｐｒｓｓ２タンパク質（配列番号２）、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質（“７０１０変異体タンパク質”）（配列番号７）の配列アライメントを明記している。 同上。 図２Ａ〜図２ＤはマウスＴｍｐｒｓｓ４のヒト化戦略の例。図２Ａは、マウスＴｍｐｒｓｓ４遺伝子およびヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のゲノム構造の、正確な縮尺ではない図を示す。エクソンは、ゲノム配列を横切って配置されている薄いバーで表されており、両遺伝子に対する第一のエクソン（または第一コードエクソン）は、エクソンの上の開始コドン「ＡＴＧ」により示され、最終コードエクソンは、エクソンの上の「終止（Ｓｔｏｐ）」コドンにより示されている。削除される約１１，０７４ｂｐのマウスゲノム断片と、挿入される約１４，９６３ｂｐのヒトゲノム断片が示されている。実施例２に記述されるアッセイで使用されたプローブの位置が示されている。ＴＭ：膜貫通ドメイン；ＳＲＣＲ：スカベンジャー受容体システインリッチ様ドメイン；ＬＤＬＲａ：低比重リポタンパク質受容体クラスＡ。 図２Ｂは、内因性マウスＴｍｐｒｓｓ４遺伝子のヒト化のための改変ＢＡＣベクターの例を、接合部配列とともに、正確な縮尺ではないが、示している（配列番号３８、３９、および４０）。 図２Ｃは、ネオマイシンカセットが削除された後のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４アレルを、接合部配列とともに、正確な縮尺ではないが、示している（配列番号４１および４０）。 図２Ｄは、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質（配列番号１１）、マウスＴｍｐｒｓｓ４タンパク質（配列番号９）、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質（“７２２４変異体タンパク質”）（配列番号１４）の配列アライメントを明記している。 同上。 図３Ａ〜図３ＤはマウスＴｍｐｒｓｓ１１Ｄのヒト化戦略の例。図３Ａは、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のゲノム構造の、正確な縮尺ではない図を示す。エクソンは、ゲノム配列を横切って配置されている薄いバーで表されており、両遺伝子に対する第一のエクソン（または第一コドンエクソン）は、エクソンの上の開始コドン「ＡＴＧ」により示され、最終コードエクソンは、エクソンの上の「終止（Ｓｔｏｐ）」コドンにより示されている。削除される約３５，６６７ｂｐのマウスゲノム断片と、挿入される約３３，９２７ｂｐのヒトゲノム断片が示されている。実施例３に記述されるアッセイで使用されたプローブの位置が示されている。ＴＭ：膜貫通ドメイン；ＳＥＡ：ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン（ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ ｓｐｅｒｍ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ａｇｒｉｎ）。 図３Ｂは、内因性マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヒト化のための改変ＢＡＣベクターの例を、接合部配列とともに、正確な縮尺ではないが、示している（配列番号５７、５８、および５９）。 図３Ｃは、ネオマイシンカセットが削除された後のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１アレルを、接合部配列とともに、正確な縮尺ではないが、示している（配列番号５７および６０）。 図３Ｄは、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質（配列番号１８）、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質（配列番号１６）、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質（“７２２６変異体タンパク質”）（配列番号２１）の配列アライメントを明記している。 同上。 図４は、ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎＴＭＰＲＳＳ４マウスが、高用量の重度インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、またはマウス馴化された重度Ｈ３Ｎ２を用いたチャレンジに対し、その感受性において違いが無いことを示す実験の結果を図示している。ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＲＰＳＳ４マウスに、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（薄い灰色の円、点線）でチャレンジしたところ、野生型マウス（薄い灰色の四角、点線）と比較して同等の生存率を示した。同様に、ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＲＰＳＳ４マウスに、Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８−Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）（濃い灰色の三角、点線）でチャレンジしたところ、野生型マウス（薄い灰色の逆三角、破線）と比較して同等の生存率を示した。１１５０ ＰＦＵのＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）または１０，０００ ＰＦＵのＡ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８−Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）のいずれかを用いて、０日目にマウスにＩＮで感染させた。対照群には、未感染の陰性対照ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＰＲＳＳ４マウスと野生型マウス（黒い菱形、実線）が含まれた。

本発明は、ＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼ（または、膜貫通結合型プロテアーゼ／セリン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｓｅｒｉｎｅ）に対して、「Ｔｍｐｒｓｓ」）をコードするヒト化遺伝子を有する遺伝子改変齧歯類（たとえばマウスおよびラット）に関する。遺伝子改変齧歯類は、たとえばインフルエンザウイルス感染などの疾患の治療および予防を目的とした、ヒトＴＭＰＲＳＳ分子を特異的に標的とする候補化合物のスクリーニングにおける使用に適している。したがって、本発明は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する遺伝子改変齧歯類、ならびにその遺伝子改変齧歯類から単離された細胞および組織を提供し、その遺伝子改変齧歯類を作製するための方法および組成物、ならびに治療用化合物のスクリーニングおよび試験を目的とした遺伝子改変齧歯類の使用方法を提供する。本発明の様々な実施形態が以下に詳細に記載される。

ＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼ（「Ｔｍｐｒｓｓ」）。
ＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼは本明細書において、非ヒト分子に対しては「Ｔｍｐｒｓｓ」、ヒト分子に対しては「ＴＭＰＲＳＳ」（膜貫通結合型プロテアーゼ／セリン（“ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｓｅｒｉｎｅ”））とも呼称され、Ｎ末端膜貫通ドメインと、Ｃ末端細胞外セリンプロテアーゼドメインが特徴であるタンパク質のファミリーである。このファミリーには少なくとも１８種が同定されており、それらは４つのサブファミリーに分類されている（Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）、上記）。全ての種が、このファミリーを規定するいくつかの共通した構造特徴を共有している。その構造特徴には、（ｉ）短いＮ末端細胞質ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）プロテアーゼドメインと、そのプロテアーゼドメインと膜貫通ドメインを繋ぐステム領域を含有する外部ドメイン、が含まれる。ステム領域は、以下の６つの異なるタイプのモジュール構造ドメインの組み合わせを含有している：ＳＥＡ（ウニ精子タンパク質／エンテロペプチダーゼ／アグリン（ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ ｓｐｅｒｍ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ／ａｇｒｉｎ））ドメイン、Ａ群スカベンジャー受容体（ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ドメイン、ＬＤＬＡ（低比重リポタンパク質受容体クラスＡ（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ））ドメイン、ＣＵＢ（Ｃｌｓ／Ｃｌｒウニ胚発生因子、骨形成タンパク質−１（Ｃｌｓ／Ｃｌｒ ｕｒｃｈｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１））ドメイン、ＭＡＭ（メプリン／Ａ５抗原／受容体タンパク質ホスファターゼｍｕ（ｍｅｐｒｉｎ／Ａ５ ａｎｔｉｇｅｎ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｍｕ））ドメイン、ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン。Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）、上記を参照のこと。たとえばＴＭＰＲＳＳ２とＴＭＰＲＳＳ４は両方ともへプシン／ＴＭＰＲＳＳサブファミリーに属しており、ステム領域において単一のＬＤＬＡドメインが先行する、Ａ群スカベンジャー受容体ドメインを有している。ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄは、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）に対する「ＨＡＴ」としても知られており、ＨＡＴ／ＤＥＳＣサブファミリーに属し、単一のＳＥＡドメインを有している。Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）、上記の図１を参照のこと。

ＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼは、最初は不活性な酵素前駆体として産生され、プロテアーゼドメインに先行するコンセンサス活性化モチーフ中の塩基性アミノ酸残基の後ろの開裂による活性化を必要とする。活性化されたプロテアーゼの一部は、プロドメイン（ｐｒｏｄｏｍａｉｎ）とプロテアーゼドメインの間のジスルフィド結合の結果として、膜への結合を維持する。細胞外ドメインは、これらプロテアーゼの細胞局在、活性化、阻害、および／または基質特異性に重要であると考えられている（Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）、上記；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４０：１２９７−１３１６（２００８））。

ＩＩ型膜貫通結合型セリンプロテアーゼの各々に関する様々な生化学的情報および病態生理学的情報が報告されている。ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ４、およびＴＭＰＲＳＳ１１Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）を開裂することが示されており、これはこのウイルスのライフサイクルにおいて最初の重要な工程である。本明細書に開示されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する遺伝子改変齧歯類動物は、ＴＭＰＲＳＳ分子の生物学的機能の全体的な解明を可能とし、ならびにヒトＴＭＰＲＳＳ分子を特異的に標的とする治療化合物のスクリーニングを可能とする有用なｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。

マウス、ヒト、およびヒト化されたＴｍｐｒｓｓの核酸配列ならびにタンパク質配列をはじめとするＴｍｐｒｓｓの配列の例が、本明細書に提供され、および以下の表に要約されている。本実施例に記載されるアッセイで使用されたプライマーおよびプローブの配列、ならびに例示的なヒト化Ｔｍｐｒｓｓアレルの挿入接合部配列も表中に含まれている。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ齧歯類動物
１つの態様では、本発明は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードするヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子をその生殖細胞系列に含有する齧歯類動物を提供する。

「ヒト化」という用語は、核酸またはタンパク質を背景として使用される場合、その構造（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列）が、齧歯類動物において自然に存在する特定の遺伝子またはタンパク質の構造と実質的に同一または同一に対応する部分と、そして関連する齧歯類の遺伝子またはタンパク質において存在するものとは異なるが、その代わりに対応するヒト遺伝子またはタンパク質において存在する構造と非常に近接した構造、または同等の構造に対応する部分も含む核酸またはタンパク質を指す。ヒト化遺伝子を含有する齧歯類またはヒト化タンパク質を発現する齧歯類は、「ヒト化」齧歯類である。

一部の実施形態では、本発明の齧歯類はマウス、ラット、ハムスターから選択される。一部の実施形態では、本発明の齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変齧歯類は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、およびメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択された科由来の動物である。一部のある実施形態では、本発明の遺伝子改変齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部のある実施形態では、本発明の遺伝子改変マウスはネズミ科のメンバーからのものである。

一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノム中に、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列とヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有しており、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と前記ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、互いに動作可能に連結され、それによって、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子はＴｍｐｒｓｓタンパク質をコードし、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のたとえばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’制御配列の制御下にある。

本発明は特に、同種交換（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）のヒト化を目的としている。言い換えると、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列が、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化遺伝子が形成される。たとえば一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子が形成される。他の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子が形成される。さらに他の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子が形成される。

一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変齧歯類は、そのゲノム中にヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有しており、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードし、このヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有している。「外部ドメイン」という用語は、細胞膜の外側に伸長する膜貫通型タンパク質の部分、すなわち、膜貫通型タンパク質の細胞外部分を指す。ＴＭＰＲＳＳ分子の外部ドメインは、プロテアーゼドメインと、そのプロテアーゼドメインと膜貫通ドメインを繋げるステム領域を含む。「ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な」外部ドメインまたはポリペプチドとは、一部の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９９％または１００％の配列が同一であるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと異なっているポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、たとえば外部ドメインのＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸の欠落またはアミノ酸追加により、外部ドメインのＮ末端またはＣ末端のみでヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと異なっているポリペプチドを意味する。および一部の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の実質的に外部ドメインであるポリペプチドを意味する。ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の「実質的に外部ドメイン」とは、外部ドメインと同一なポリペプチド、またはＮ末端もしくはＣ末端で１〜５個（すなわち、１個、２個、３個、４個または５個）のアミノ酸が欠落することにより、もしくは１〜５個のアミノ酸が追加されることにより外部ドメインとは異なっているポリペプチドを意味する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードする。「内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な」細胞質部分と膜貫通部分とは、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９９％または１００％の配列が同一であるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分とは異なっているポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、たとえば膜貫通ドメインのＣ末端でアミノ酸が欠落することにより、またはアミノ酸が追加されることにより、Ｃ末端でのみ内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分とは異なっているポリペプチドを意味する。および一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質ドメインと実質的に膜貫通ドメインから構成されるポリペプチドを意味する。内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の「実質的に膜貫通ドメイン」とは、膜貫通ドメインと同一なポリペプチド、またはＣ末端で１〜５個のアミノ酸が欠落することにより、もしくは１〜５個のアミノ酸が追加されることにより膜貫通ドメインとは異なっているポリペプチドを意味する。

一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類のゲノム中のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一なポリペプチドをコードしている。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子中の同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインをコードしている。

一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類のゲノム中のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列は、齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一なポリペプチドをコードしている。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子中に存在する内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインをコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列が、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列と置換されることから生じる。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位の齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子の連続ゲノム配列は、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の連続ゲノム配列と置換され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子が形成される。

特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子内に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードするヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のエクソンのすべてまたは一部を含む。

ある実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のゲノム配列は、ヒト化置換後も内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位に留まり、挿入された連続ヒトＴＭＰＲＳＳゲノム配列に動作可能に連結され、そして内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をコードしている。

内因性Ｔｍｐｒｓｓタンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの間の接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインを厳密にコードするヒトＴＭＰＲＳＳゲノム配列を挿入する必要はない場合がある。ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインを実質的にコードし、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質ドメインと実質的に膜貫通ドメインをコードする内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のゲノム配列に動作可能に連結された、若干長いか、または若干短いヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のゲノム配列を挿入することも可能であり、それにより得られたヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子にコードされるヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと同一な外部ドメインと、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の膜貫通ドメインと同一な膜貫通ドメインを含有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に含有されるヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）も含有する。ある実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の３’ＵＴＲに加えて、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、当該ヒトＴＭＰＲＳＳの３’ＵＴＲの後ろに、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子座位由来の追加のヒトゲノム配列も含有する。当該追加のヒトゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流のヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子座位中に存在する少なくとも１０〜２００ｂｐ、たとえば５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐまたはそれ以上からなる場合もある。他の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子中に存在するヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒト３’ＵＴＲを含有しない。そのかわりに、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子の３’ＵＴＲが含有され、これがヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子の終止コドンのすぐ後に続く。たとえばヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインをコードするエクソン配列を含有する内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでもよく、その後ろに、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインから終止コドンまでをコードするエクソン配列を含有するヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列と、その終止コドンのすぐ後ろに内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子の３’ＵＴＲを含んでもよい。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、齧歯類においてコードされたヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の発現を生じさせる。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質と同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで発現される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、細胞表面に発現され、検出される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質、またはその可溶型（たとえば脱落外部ドメイン型）が、対照齧歯類中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質またはその可溶型とたとえば同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで、齧歯類の血清中に発現され、検出される。ヒト化齧歯類中のヒト化遺伝子またはタンパク質と、対照齧歯類中の内因性齧歯類遺伝子またはタンパク質を比較する文脈において、「同等の」という用語は、比較される分子またはレベルが、互いに同一ではないが、充分に類似し、それらの比較が可能であり、観察される差異または類似性に基づいて合理的に結論が導き出せ得ることを意味する。発現レベルに関し、「実質的に同一」という用語は、比較されるレベルが、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％よりも高くまでは互いに異なっていないことを意味する。

一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述された齧歯類動物から単離された細胞または組織をさらに提供する。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞、リンパ球（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）、マクロファージ、および単球から選択される。一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組み合わせから選択される。

一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが本明細書に記述されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類胚性幹細胞を提供する。一部の実施形態では、齧歯類胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞である。他の実施形態では、齧歯類胚性幹細胞は、ラット胚性幹細胞である。そのゲノム中にヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類胚性幹細胞を使用して、本明細書において以下に詳述されるようにヒト化齧歯類動物を作製することができる。

一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に対しヘテロ接合性である。他の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に対しホモ接合性である。

ある実施形態では、齧歯類は、複数、すなわち２個以上のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子をそのゲノム中に含有する。言い換えると、齧歯類において、２個以上の異なる内因性Ｔｍｐｒｓｓ座位が、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を使用してヒト化されている。たとえば、齧歯類は、以下から選択される遺伝子座位のうちの２個以上で、ヒト化されている：Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｐｒｓｓ４、およびＴｍｐｒｓｓ１１ｄ。

例示的なヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２齧歯類（たとえばマウス）、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４齧歯類（たとえばマウス）、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ齧歯類（たとえばマウス）を以下にさらに記載する。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２齧歯類
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列と、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列を含有し、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のたとえばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’制御配列の制御下にあるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有する齧歯類を提供する。齧歯類の例としてはマウスとラットが挙げられる。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。

特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質は、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、たとえばヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質のアミノ酸１０６〜４９２など、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質のＣ末端の３８７アミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、配列番号４のＷ１０６〜Ｇ４９２から構成されるアミノ酸と実質的に同一な外部ドメインを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、配列番号４のＷ１０６〜Ｇ４９２から構成されるアミノ酸と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する外部ドメイン；配列番号４のＷ１０６〜Ｇ４９２から構成されるアミノ酸配列とは、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が異なる外部ドメイン；または配列番号４のＷ１０６〜Ｇ４９２から構成されるアミノ酸配列とは、たとえばＮ末端またはＣ末端で１〜５個のアミノ酸が欠落している、または１〜５個のアミノ酸が追加されているなど、外部ドメインのＮ末端またはＣ末端のみで異なっている外部ドメイン、を含有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメインをさらに含有する。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメイン、ならびにヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、配列番号７に明記されるアミノ酸配列を有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列が、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列と置換されることから生じる。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列と置換され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を形成させる。

特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードするヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のエクソン配列、すなわちすべてまたは一部のエクソン配列を含有する。内因性Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの間の接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインを厳密にコードするヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム配列を挿入する必要はない場合があり、およびヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の実質的に外部ドメインをコードし、若干長いか、または若干短いヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム配列を使用して、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと同一な外部ドメインを有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質を作製することが可能である。

特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の少なくともコードエクソン４から、コードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。

ある実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のイントロン３と、コードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の３’部分、イントロン３と、コードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。特定の実施形態では、ヒト化で含まれるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の３’部分は、約５〜１０塩基対の長さ、すなわち、コードエクソン３の３’末端の約５、６、７、８、９、または１０塩基対である。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の３’ＵＴＲも含有する。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン１３の全体が、ヒト化用の連続ヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム配列中に含まれ、これは、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の３’ＵＴＲも含有する。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の３’ＵＴＲの下流の追加ヒトゲノム配列を含む。追加のヒトゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２座位のヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流に存在する、少なくとも１０〜２００ｂｐ、または少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐの配列であってもよい。

一部の実施形態では、ヒト化されたＴｍｐｒｓｓ２座位に残っている内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一なポリペプチドをコードしている。内因性Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の膜貫通ドメインを厳密にコードする内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２ゲノム配列を維持する必要はない場合があり、およびヒト化置換において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の実質的に膜貫通ドメインをコードし、若干長いか、または若干短い齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２ゲノム配列を維持して、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の膜貫通ドメインと同一な膜貫通ドメインを有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードすることが可能である。一部の実施形態では、ヒト化されたＴｍｐｒｓｓ２座位に残っている内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のエクソン１〜２と、コードエクソン３の５’部分を含有し、当該コードエクソン３の５’部分は、コドンエクソン３の実質的な部分、たとえばコードエクソン３の３’末端の５〜１０塩基対を除くコードエクソン３全体である。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン１〜２と、コードエクソン３の５’部分、ならびにヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の３’部分と、コードエクソン４からコードエクソン１３までを含有し、当該ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分、およびヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードする。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメイン、およびヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、配列番号７に明記されるアミノ酸配列を有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のエクソンとイントロンは、配列番号１、３および５〜６に見出される配列である。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、齧歯類において、コードされるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の発現を生じさせる。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質と同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで発現される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、細胞表面に発現され、検出される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質、またはその可溶型（たとえば脱落外部ドメイン型）が、対照齧歯類中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質またはその可溶型とたとえば同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで、齧歯類の血清中に発現され、検出される。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４齧歯類
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列と、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列を含有し、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のたとえばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’制御配列の制御下にあるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有する齧歯類を提供する。齧歯類の例としてはマウスとラットが挙げられる。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質は、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、たとえばヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質のアミノ酸５４〜４３７など、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質のＣ末端の３８４アミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、配列番号１１のＫ５４〜Ｌ４３７から構成されるアミノ酸と実質的に同一な外部ドメインを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、配列番号１１のＫ５４〜Ｌ４３７から構成されるアミノ酸と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する外部ドメイン；配列番号１１のＫ５４〜Ｌ４３７から構成されるアミノ酸配列とは、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が異なる外部ドメイン；または配列番号１１のＫ５４〜Ｌ４３７から構成されるアミノ酸配列とは、たとえばＮ末端またはＣ末端で１〜５個のアミノ酸が欠落している、または１〜５個のアミノ酸が追加されているなど、外部ドメインのＮ末端またはＣ末端のみで異なっている外部ドメイン、を含有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメインをさらに含有する。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメイン、ならびにヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、配列番号１４に明記されるアミノ酸配列を有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列が、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列と置換されることから生じる。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の連続ゲノム配列と置換され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を形成させる。

特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードするヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のエクソン配列、すなわちすべてまたは一部のエクソンを含有する。内因性Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインを厳密にコードするヒトＴＭＰＲＳＳ４ゲノム配列を挿入する必要はない場合があり、およびヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の実質的に外部ドメインをコードし、若干長いか、または若干短いヒトＴＭＰＲＳＳ４ゲノム配列を使用して、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと同一な外部ドメインを有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質を作製することが可能である。

特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の少なくともコードエクソン４から、コードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。

ある実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のイントロン３の３’部分と、コードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。特定の実施形態では、ヒト化に含まれるヒトＴＭＰＲＳＳ４のイントロン３の３’部分は、約１４０〜１６０塩基対の長さ、すなわち、イントロン３の３’部分の約１４０、１４５、１５０、１５５、１６０塩基対である。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の３’ＵＴＲも含有する。特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の３’ＵＴＲを含有せず、および内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子の３’ＵＴＲが、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子の終止コドンのすぐ後に続く。

一部の実施形態では、ヒト化されたＴｍｐｒｓｓ４座位に残っている内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一なポリペプチドをコードしている。内因性Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の膜貫通ドメインを厳密にコードする内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４ゲノム配列を維持する必要はない場合があり、およびヒト化置換において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の実質的に膜貫通ドメインをコードし、若干長いか、または若干短い齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４ゲノム配列を維持して、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の膜貫通ドメインと同一な膜貫通ドメインを有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードすることが可能である。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のコードエクソン１〜３と、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のコードエクソン１〜３と、イントロン３の５’部分、ならびにヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のイントロン３の３’部分と、コードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメイン、およびヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、配列番号１４に明記されるアミノ酸配列を有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子と齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のエクソンとイントロンは、配列番号８、１０および１２〜１３に見出される配列である。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、齧歯類において、コードされるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の発現を生じさせる。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードするヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードするヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質と同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで発現される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、細胞表面に発現され、検出される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質、またはその可溶型（たとえば脱落外部ドメイン型）が、対照齧歯類中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質またはその可溶型とたとえば同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで、齧歯類の血清中に発現され、検出される。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ齧歯類
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列と、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列を含有し、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のたとえばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’制御配列の制御下にあるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有する齧歯類を提供する。齧歯類の例としてはマウスとラットが挙げられる。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている。

特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質は、配列番号１８に明記されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、たとえばヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質のアミノ酸４２〜４１８など、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質のＣ末端の３７７アミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、配列番号１８のＡ４２〜Ｉ４１８から構成されるアミノ酸と実質的に同一な外部ドメインを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、配列番号１８のＡ４２〜Ｉ４１８から構成されるアミノ酸と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する外部ドメイン；配列番号１８のＡ４２〜Ｉ４１８から構成されるアミノ酸配列とは、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が異なる外部ドメイン；または配列番号１８のＡ４２〜Ｉ４１８から構成されるアミノ酸配列とは、たとえばＮ末端またはＣ末端で１〜５個のアミノ酸が欠落している、または１〜５個のアミノ酸が追加されているなど、Ｎ末端またはＣ末端のみで異なっている外部ドメイン、を含有する。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分と膜貫通部分をさらに含有している。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含有する。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメイン、ならびにヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインを含有する。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、配列番号２１に明記されるアミノ酸配列を有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列が、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列と置換されることから生じる。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ座位の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列と置換され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を形成させる。特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードするヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のエクソン配列、すなわちすべてまたは一部のエクソンを含有する。内因性Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインを厳密にコードするヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム配列を挿入する必要はない場合があり、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の実質的に外部ドメインをコードし、若干長いか、または若干短いヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム配列を使用して、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと同一な外部ドメインを有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質を作製することが可能である。

特定の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の少なくともコードエクソン３から、コードエクソン１０の終止コドンまでを含有する。

ある実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の少なくともイントロン２の３’部分と、コードエクソン３からコードエクソン１０の終止コドンまでを含有する。特定の実施形態では、ヒト化に含まれるヒトＴＭＰＲＳＳ２のイントロン２の３’部分は、約４４４塩基対の長さである。

一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子に挿入されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の３’ＵＴＲを含有する。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン１０の全体が、ヒト化用の連続ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム配列中に含まれ、これは、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の３’ＵＴＲを含有する。特定の実施形態では、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の３’ＵＴＲの下流の追加ヒトゲノム配列を含む。追加のヒトゲノム配列は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ座位のヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流に存在する、１０〜２００ｂｐ、５０〜２００ｂｐ、または約１５０、１６０、１７０、１８０ｂｐの配列であってもよい。

一部の実施形態では、ヒト化されたＴｍｐｒｓｓ１１ｄ座位に残っている内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質部分と膜貫通部分と実質的に同一なポリペプチドをコードしている。内因性Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質とヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の膜貫通ドメインを厳密にコードする内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄゲノム配列を維持する必要はない場合があり、およびヒト化置換において、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の実質的に膜貫通ドメインをコードし、若干長いか、または若干短い齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄゲノム配列を維持して、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の膜貫通ドメインと同一な膜貫通ドメインを有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードすることが可能である。

特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のコードエクソン１〜２と、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン３からコードエクソン１０までを含有する。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメイン、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている。特定の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、配列番号２１に明記されるアミノ酸配列を有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている。

一部の実施形態では、ヒト化に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子と齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のエクソンとイントロンは、配列番号１５、１７および１９〜２０に見出される配列である。

一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、齧歯類において、コードされるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の発現を生じさせる。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードするヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードするヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を有していない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質と同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで発現される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、細胞表面に発現され、検出される。ある実施形態では、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質、またはその可溶型（たとえば脱落外部ドメイン型）が、対照齧歯類中の対応する齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質またはその可溶型とたとえば同等のレベルで、または実質的に同一のレベルで、齧歯類の血清中に発現され、検出される。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ齧歯類動物を作製する方法
本開示のさらなる態様は、上述のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ齧歯類を作製する方法、ならびにヒト化Ｔｍｐｒｓｓ齧歯類の作製における使用に適した核酸ベクターおよび非ヒト胚性幹細胞を作製する方法を目的としている。

本明細書で提供される齧歯類は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例示的な実施形態において、齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を担持する細菌人工染色体（ＢＡＣ）のクローンは、細菌相同組み換えならびにＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を使用して改変されることができる（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）。結果として、齧歯類Ｔｍｐｒｓｓヌクレオチド配列を、元のＢＡＣクローンから削除し、ヒトＴｍｐｒｓｓヌクレオチド配列を挿入することで、５’および３’齧歯類相同アームに隣接したヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を担持する改変ＢＡＣクローンが得られる。改変ＢＡＣクローンは、直線化されることで、たとえばエレクトロポレーション法などにより、齧歯類胚性幹細胞（ＥＳ）内に導入することができる。マウスＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞は共に当技術分野で説明されている。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８−００７８０００Ａ１（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）は、遺伝子改変マウスを作製するためのマウスＥＳ細胞およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載している；ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１、ＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１、Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｎａｔｕｒｅ ４６７：２１１−２１５，ａｎｄ Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）は、遺伝子改変ラットを作製するためのラットＥＳ細胞および方法について記載している。

ゲノム内に統合されたヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有するＥＳ細胞を選択することができる。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位内に統合されたヒト化Ｔｍｐｒｓｓを有するＥＳ細胞は、齧歯類アレルの消失および／またはヒトアレルの獲得のアッセイに基づいて選択されることができる。次いで選択されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照）、またはＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１及びＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１に記載の方法を使用することにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。ドナーＥＳ細胞を含む胚は胚盤胞期までインキュベートし、次に代理母に移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０齧歯類を産生する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を保有する齧歯類の仔は、齧歯類アレルの消失および／またはヒトアレルの獲得のアッセイを使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型決定により特定することができる。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に対してヘテロ接合性の齧歯類を交配させ、ホモ接合性齧歯類を作製することができる。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を１つ含有する齧歯類を、別のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類と交配させ、複数のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類を作製することができる。たとえば、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有する齧歯類を、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有する齧歯類と交配させ、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子とヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有する齧歯類を作製することができる。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類を使用する方法
本明細書において開示される齧歯類は、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質を特異的に標的とする化合物を特定および試験する事を目的とした、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質を発現する有用なｉｎ ｖｉｖｏシステムおよび生物物質（たとえば細胞）の供給源を提供する。

１つの態様において、本明細書に開示される齧歯類を使用して、インフルエンザウイルス感染を治療および／または予防するための、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の阻害物質などの候補化合物の能力が決定される。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有し、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質を発現する齧歯類に、候補化合物を投与し、その後、インフルエンザウイルス感染実験を行う。化合物の予防効果は、対照齧歯類と比較して、齧歯類が、インフルエンザウイルス感染の重度な兆候が少ないおよび／もしくは低いか、ならびに／または生存能力の改善を示すかどうかを決定することで評価することができる。

他の実施形態では、インフルエンザウイルス感染実験の後に、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有し、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインを備えたヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質を発現する齧歯類に、そのヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の候補阻害物質が投与される。候補阻害物質の治療効果は、対照齧歯類と比較して、齧歯類が、インフルエンザウイルス感染の重度な兆候が少ないおよび／もしくは低いか、ならびに／または生存能力の改善を示すかどうかを決定することで評価することができる。

適切な対照齧歯類としては、たとえば、実験感染が行われないヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類、および化合物を全く用いずに実験感染が行われるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類、および実験感染が行われ、治療効果があることが知られている化合物が投与されるヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類、が挙げられる。

本発明方法において評価され得る化合物としては、たとえば低分子プロテアーゼ阻害物質、核酸系阻害物質（たとえばｓｉＮＲＡ、リボザイム、アンチセンス構築物など）、抗原結合タンパク質（たとえば、抗体またはその抗原結合断片）、またはブロッキングペプチド／ペプチド阻害物質などの候補ＴＭＰＲＳＳ阻害物質が挙げられる。ＴＭＰＲＳＳ阻害物質は、ＴＭＰＲＳＳタンパク質が、ヘマグルチニン前駆体タンパク質（ＨＡ０）をＨＡ１とＨＡ２サブユニットにタンパク質分解的に開裂する能力を阻害または低下させることにより機能し得る。

一部の実施形態では、候補阻害物質は、抗体またはその抗体結合断片である。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方とも、本発明の目的に適している。特定の実施形態では、抗体は、ＴＭＰＲＳＳタンパク質に特異的に結合し、そのＴＭＰＲＳＳタンパク質のプロテアーゼ活性を阻害するが、別のＴＭＰＲＳＳタンパク質のプロテアーゼ活性は実質的に阻害しない。たとえば抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体阻害物質は、ＴＭＰＲＳＳ２タンパク質に特異的に結合し、ＴＭＰＲＳＳ２タンパク質のプロテアーゼ活性を阻害するが、ＴＭＰＲＳＳ４およびＴＭＰＲＳＳ１１Ｄのタンパク分解活性に対しては効果はなく、またはＴＭＰＲＳＳ４およびＴＭＰＲＳＳ１１Ｄのタンパク分解活性を、同一または実質的に同一な実験条件下で試験された非阻害性対照分子と比較して、２５％以下まで（たとえば２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ以下まで）低下させる。

一部の実施形態では、阻害物質は、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体またはその抗体結合断片である。一部の実施形態では、阻害物質は、抗ＴＭＰＲＳＳ４抗体またはその抗体結合断片である。他の実施形態では、阻害物質は、抗ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ抗体またはその抗体結合断片である。

インフルエンザウイルスの実験感染は、公知のプロトコールに従って誘導およびモニタリングすることができる。たとえば、ＵＳ２０１３／０２７３０７０Ａ１を参照のこと。たとえば、齧歯類動物は、インフルエンザウイルスを鼻内投与されることができる。感染動物を評価して、感染の兆候および重症度を決定することができる。たとえば動物を、（１）体重変化および生存率、（２）フローサイトメトリーを介した細胞変化、（３）全肺の免疫化学法染色、ＰＡＳ染色およびＨ＆Ｅ染色、ならびに（４）血清中のサイトカイン値に関して分析してもよい。ウイルスに感受性であることが知られている対照動物は、非感染動物と比較して、樹状細胞の頻度、肺中のインフルエンザ陽性の肺胞マクロファージ、好中球または上皮細胞のレベル、およびＩＦＮγ値の著しい上昇を示す。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作成し使用するかを当業者に説明するために提供されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定することを意図していない。別途示されていない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くである。

実施例１ 内因性Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヒト化。
本実施例は、齧歯類（例えば、マウス）においてＴｍｐｒｓｓ２をコードする内因性遺伝子をヒト化する方法の例を示す。本実施例に記述された方法を使用して、任意のヒト配列、または所望の場合にはヒト配列（または配列断片）の組み合わせを使用して、齧歯類の内因性Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子をヒト化することができる。

内因性Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子をヒト化するための標的化ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンとＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して構築された（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照のこと。それらは参照により本明細書に援用される）。

簡潔に述べると、マウスＴｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンのｂＭＱ−２６４Ａ１５を使用して、以下のように改変した。ＤＮＡ断片は、５’マウス相同ヌクレオチド配列、約２５，０９１ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノムＤＮＡ（ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の最後の７ｂｐ、イントロン３、およびコードエクソン４〜コードエクソン１３（コードエクソン１３の一部である３’ＵＴＲを含む）を含有している）、約２，６９１ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、および３’マウス相同配列を含むよう作製された。このＤＮＡ断片を使用し、細菌細胞中での相同組み換えを介してＢＡＣクローンｂＭＱ−２６４Ａ１５を改変した。結果として、ＢＡＣクローン中の外部ドメインをコードするマウスＴｍｐｒｓｓ２ゲノム断片（約２５，２９１ｂｐ）が、約２５，０９１ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム断片、その後に続く約２６９１ｂｐの自己削除ネオマイシンカセットで置換された。具体的には、置換されたマウスＴｍｐｒｓｓ２ゲノム断片は、マウスＴｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン３の最後の７ｂｐ、イントロン３、およびコードエクソン４〜コードエクソン１３の終止コドンを含有していた（図１Ａ〜１Ｂ）。挿入されたヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の最後の７ｂｐ、イントロン３、およびコードエクソン４〜コードエクソン１３（ヒトＴＭＰＲＳＳ２の３’ＵＴＲを含む）、およびヒトＴＭＰＲＳＳ２の３’ＵＴＲの下流の１３１ｂｐのヒト３’ゲノム配列を含有した（図１Ａ〜１Ｂ）。得られた改変ＢＡＣクローンは、５’から３’に向かって、（ｉ）マウスＴｍｐｒｓｓ２ ５’ＵＴＲ、マウスＴｍｐｒｓｓ２エクソン１（非コード）、コードエクソン１〜３（コードエクソン３の最後の７ｂｐは除く）を含む約１２ｋｂのマウスゲノムＤＮＡを含有する５’マウス相同アーム；（ｉｉ）ヒトコードエクソン３の最後の７ｂｐ、イントロン３、ヒトコードエクソン４〜１３（ヒトＴＭＰＲＳＳ２の３’ＵＴＲを含む）、およびヒト３’ゲノム配列を含む約２５，０９１ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム断片；（ｉｉｉ）約２６９１ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、その後に続く（ｉｖ）マウスＴｍｐｒｓｓ２ ３’ＵＴＲを含有する４５ｋｂの３’マウス相同アームと、元のＢＡＣクローン中に残っていたマウスゲノム断片、を含有した。図１Ａ〜１Ｂを参照のこと。接合部の配列も図１Ｂの下部に明記されている。ヒトＴＭＰＲＳＳ２ゲノム断片とネオマイシンカセット、ならびに挿入接合部の上流および下流を含有する改変ＢＡＣクローンの一部を配列番号５に明記する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に明記する。このヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質（“７０１０変異体タンパク質”）、マウスＴｍｐｒｓｓ２タンパク質（配列番号２）、およびヒトＴｍｐｒｓｓ２タンパク質（配列番号４）のアライメントは図１Ｄに示す。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有する上述の改変ＢＡＣクローンを使用して、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞をエレクトロポレーションし、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有する改変ＥＳ細胞を生成した。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子を含有する陽性標的化ＥＳ細胞は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２配列（たとえばヒトＴＭＰＲＳＳ２のコードエクソン４〜１３）の存在を検出し、マウスＴｍｐｒｓｓ２配列の消失および／または保持を確認する（たとえばマウスＴｍｐｒｓｓ２のコードエクソン４〜１３の消失）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）により特定された。表１は、上述の内因性Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブを明記する（図１Ａ〜１Ｂ）。正しく標的化されたＥＳ細胞クローンが選択されると、ネオマイシン選択カセットは、例えばエレクトロポレーションを介してＣｒｅリコンビナーゼを導入することにより、削除されることができる。代替方法として、当該ネオマイシン選択カセットは、ＥＳクローンから生成した後代を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する除去（ｄｅｌｅｔｏｒ）齧歯類系統と交配することにより、削除することができる。カセット削除後のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２座位を図１Ｃに示し、接合部配列を図１Ｃの下部に示す。

（カセットを有する、または有していない）選択ＥＳ細胞クローンを使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用してメスのマウスに移植し（たとえば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２アレルをゲノム中に含有する一腹の仔を生成した。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２アレルを保有するマウスを、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）の改良法を使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認し、同定した。仔は遺伝子型同定され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２座位に対してヘテロ接合性の動物のコホートを、特徴解析のために選択する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２座位に対してホモ接合性の動物は、ヘテロ接合性動物の交配により作製される。

実施例２ 内因性Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヒト化。

本実施例は、齧歯類（例えば、マウス）においてＴｍｐｒｓｓ４をコードする内因性遺伝子をヒト化する方法の例を示す。本実施例に記述された方法を使用して、任意のヒト配列、または所望の場合にはヒト配列（または配列断片）の組み合わせを使用して、齧歯類の内因性Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子をヒト化することができる。

内因性Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子をヒト化するための標的化ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンとＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して構築された（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）、上記を参照のこと）。

簡潔に述べると、マウスＴｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンのＲＰ２３−７１Ｍ１５を使用して、以下のように改変した。ＤＮＡ断片は、５’マウス相同ヌクレオチド配列、約４，９９６ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、約１４，９６３ｂｐのヒトゲノムＤＮＡ（ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有している）、および３’マウス相同配列を含むよう作製された。このＤＮＡ断片を使用し、細菌細胞中での相同組み換えを介してＢＡＣクローンＲＰ２３−７１Ｍ１５を改変した。結果として、ＢＡＣクローン中の外部ドメインをコードするマウスゲノム断片（約１１，０７４ｂｐ）が、約４，９９６ｂｐの自己削除ネオマイシンカセット、その後に続く約１４，９６３ｂｐのヒトゲノムＤＮＡで置換された。具体的には、削除され、置換されたマウスゲノム断片は、マウスＴｍｐｒｓｓ４遺伝子のマウスイントロン３の３’の１３０ｂｐ、コードエクソン４〜コードエクソン１３の終止コドンまでを含有していた（図２Ａ〜２Ｂ）。挿入されたヒトゲノム断片は、約１５０ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ４イントロン３の３’部分、およびヒトＴＭＰＲＳＳ４コードエクソン４〜コードエクソン１３の終止コドンまでを含有していた（図２Ａ〜２Ｂ）。得られた改変ＢＡＣクローンは、５’から３’に向かって、約４４．８ｋｂのマウスゲノムＤＮＡ（マウスＴｍｐｒｓｓ４ ５’ＵＴＲ、マウスＴｍｐｒｓｓ４コードエクソン１〜３、マウスＴｍｐｒｓｓ４イントロン３の一部（３’の１３０ｂｐが無い）を含む）を含有する５’マウス相同アーム、約４９９６ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、約１５０ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ４イントロン３の３’部分、ヒトＴＭＰＲＳＳ４コードエクソン４〜コードエクソン１３の終止コドンまで、その後に直接続くマウスＴｍｐｒｓｓ４ ３’ＵＴＲと、元のＢＡＣクローンに残ったマウスゲノムＤＮＡ（総計で約１１８ｋｂの３’マウス相同アーム）を含有した。図２Ａ〜２Ｂを参照のこと。接合部の配列も図２Ｂの下部に明記されている。ネオマイシンカセットとヒトＴＭＰＲＳＳ４ゲノム断片と、ならびに挿入接合部の上流および下流を含有する改変ＢＡＣクローンの一部を配列番号１２に明記する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に明記する。このヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質（“７２２４変異体タンパク質”）、マウスＴｍｐｒｓｓ４タンパク質（配列番号９）、およびヒトＴｍｐｒｓｓ４タンパク質（配列番号１１）のアライメントは図２Ｄに示す。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有する上述の改変ＢＡＣクローンを使用して、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞をエレクトロポレーションし、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を備えた改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子を含有する陽性標的化ＥＳ細胞は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４配列（たとえばヒトＴＭＰＲＳＳ４のコードエクソン４〜１３）の存在を検出し、マウスＴｍｐｒｓｓ４配列の消失および／または保持を確認する（たとえばマウスＴｍｐｒｓｓ４のコードエクソン４〜１３の消失）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）により特定された。表２は、上述の内因性Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブを明記する（図２Ａ〜２Ｂ）。正しく標的化されたＥＳ細胞クローンが選択されると、ネオマイシン選択カセットは、例えばエレクトロポレーションを介してＣｒｅリコンビナーゼを導入することにより、削除されることができる。代替方法として、当該ネオマイシン選択カセットは、ＥＳクローンから生成した後代を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する除去（ｄｅｌｅｔｏｒ）齧歯類系統と交配することにより、除去することができる。カセット削除後のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４座位を図２Ｃに示し、接合部配列を図２Ｃの下部に示す。
（カセットを有する、または有していない）選択ＥＳ細胞クローンを使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用してメスのマウスに移植し（たとえば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）、上記を参照のこと）、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４アレルをゲノム中に含有する一腹の仔を作製した。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４アレルを保有するマウスを、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）の改良法を使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認し、同定した。仔は遺伝子型同定され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４座位に対してヘテロ接合性の動物のコホートを、特徴解析のために選択した。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４座位に対してホモ接合性の動物は、ヘテロ接合性動物の交配により作製された。

実施例３ 内因性Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヒト化。

本実施例は、齧歯類（例えば、マウス）においてＴｍｐｒｓｓ１１ｄをコードする内因性遺伝子をヒト化する方法の例を示す。本実施例に記述された方法を使用して、任意のヒト配列、または所望の場合にはヒト配列（または配列断片）の組み合わせを使用して、齧歯類の内因性Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子をヒト化することができる。

内因性Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子をヒト化するための標的化ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンとＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して構築された（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）、上記を参照のこと）。

簡潔に述べると、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンのＲＰ２３−９５Ｎ２２を使用して、以下のように改変した。ＤＮＡ断片は、５’マウス相同ヌクレオチド配列、約３３，９２７ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ１１ＤゲノムＤＮＡ（ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のイントロン２の３’末端の４４４ｂｐ、およびコードエクソン３〜コードエクソン１０（コードエクソン１０の一部である３’ＵＴＲを含む）を含有している）、約４，９９６ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、および３’マウス相同配列を含むよう作製された。このＤＮＡ断片を使用し、細菌細胞中での相同組み換えを介してＢＡＣクローンＲＰ２３−９５Ｎ２２を改変した。結果として、ＢＡＣクローン中の外部ドメインをコードするマウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄゲノム断片（約３５，６６７ｂｐ）が、約３３，９２７ｂｐのヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム断片、その後に続く約４，９９６ｂｐの自己削除ネオマイシンカセットで置換された。具体的には、置換されたマウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄゲノム断片は、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のイントロン２の３’部分、およびコードエクソン３〜コードエクソン１０中の終止コドンまでを含有していた（図３Ａ〜３Ｂ）。挿入されたヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のイントロン２の３’末端の４４４ｂｐ、およびコードエクソン３〜コードエクソン１０（ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄの３’ＵＴＲを含む）、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄの３’ＵＴＲの下流の１７２ｂｐのヒト３’ゲノム配列を含有した（図３Ａ〜３Ｂ）。得られた改変ＢＡＣクローンは、５’から３’に向かって、（ｉ）マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ ５’ＵＴＲ、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄコードエクソン１〜２、およびイントロン２の５’部分を含有する約１４３ｂｐのマウスゲノムＤＮＡを含有する５’マウス相同アーム、（ｉｉ）ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄのイントロン２の３’部分、コードエクソン３〜１０（３’ＵＴＲを含む）、およびヒト３’ゲノム配列を含むヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム断片、（ｉｉｉ）約４，９９６ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、その後に続く（ｉｖ）マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ ３’ＵＴＲと、元のＢＡＣクローン中に残ったマウスゲノム断片を含有する１０ｋｂの３’マウス相同アーム、を含有した。図３Ａ〜３Ｂを参照のこと。接合部の配列も図３Ｂの下部に明記されている。ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄゲノム断片とネオマイシンカセット、ならびに挿入接合部の上流および下流を含有する改変ＢＡＣクローンの一部を配列番号１９に明記する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に明記する。このヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質（“７２２６変異体タンパク質”）、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質（配列番号１６）、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質（配列番号１８）のアライメントは図３Ｄに示す。

ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有する上述の改変ＢＡＣクローンを使用して、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞をエレクトロポレーションし、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有する改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子を含有する陽性標的化ＥＳ細胞は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ配列（たとえばヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄのコードエクソン３〜１０）の存在を検出し、マウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄ配列の消失および／または保持が確認される（たとえばマウスＴｍｐｒｓｓ１１ｄのコードエクソン３〜１０の消失）を確認するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）により特定される。表３は、上述の内因性Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブを明記する（図３Ａ〜３Ｂ）。正しく標的化されたＥＳ細胞クローンが選択されると、ネオマイシン選択カセットは、例えばエレクトロポレーションを介してＣｒｅリコンビナーゼを導入することにより、削除されることができる。代替方法として、当該ネオマイシン選択カセットは、ＥＳクローンから生成した後代を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する除去（ｄｅｌｅｔｏｒ）齧歯類系統と交配することにより、除去することができる。カセット削除後のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ座位を図３Ｃに示し、接合部配列を図３Ｃの下部に示す。
（カセットを有する、または有していない）選択ＥＳ細胞クローンを使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用してメスのマウスに移植し（たとえば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）、上記を参照のこと）、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄアレルをゲノム中に含有する一腹の仔を生成する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄアレルを保有するマウスを、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記）の改良法を使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認し、同定する。仔は遺伝子型同定され、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ座位に対してヘテロ接合性の動物のコホートを、特徴解析のために選択する。ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ座位に対してホモ接合性の動物は、ヘテロ接合性動物の交配により作製される。

実施例４ ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎと野生型のＴｍｐｒｓｓ４マウスにおける、１群および２群インフルエンザＡウイルスの評価
動物感染モデルとしてのヒト化Ｔｍｐｒｓｓ齧歯類の用途を実証するために、重度インフルエンザ感染のインフルエンザＡの１群および２群のモデルにおける、ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＰＲＳＳ４マウスと、野生型（ＷＴ）同腹仔の生存を評価する実験を行った。

ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＰＲＳＳ４マウスは、そのゲノム中のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子に対しホモ接合性であり、実施例２に記載されるように作製された。これらの実験に使用されたウイルス株には、過去のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザＡウイルスの１群単離株、および実験室内でマウス馴化されたＡ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８（ＨＡ，ＮＡ）Ｘ−３１（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザＡウイルスの２群単離株が含まれた。すべての実験は、６〜８週齢のオスおよびメスのＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＰＲＳＳ４マウス、またはＷＴ同腹仔で行われた。１１５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）または１０，０００ＰＦＵのＡ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８−Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）を用いて、マウスにチャレンジを行った。これらの生存モデルにおいて、マウスは感染後（ｐ．ｉ．）０日目に鼻内（ＩＮ）チャレンジされた。感染後１４日目まで毎日マウスの体重を測定し、観察を行った。開始体重から２０％減少した時点で安楽死させた。結果は、生存率として報告される（表４）。

重度インフルエンザＡの１群ウイルス［Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）］と、マウス馴化重度インフルエンザＡの２群ウイルス［Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８−Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）］の両方でチャレンジを行った後、ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＰＲＳＳ４マウスの生存を、ＷＴ同腹仔と比較した（図４）。ＭＡＩＤ７２２５ ＨｕｍＩｎ ＴＭＰＲＳＳ４マウスの生存は、Ｈ１Ｎ１チャレンジ（それぞれ、２５％；ｎ＝８と、２０％；ｎ＝１０）またはＨ３Ｎ２チャレンジ（それぞれ、２５％；ｎ＝８と、１１．１％；ｎ＝９）のいずれかも、野生型マウスと差異は無かった。

本発明の背景を説明し、その実践に関して追加的詳細を提供するための本明細書の出版物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (67)

1. 内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列とを含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類であって、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のプロモーターの制御下にある、齧歯類。
2. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードしている、請求項１に記載の齧歯類。
3. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をさらに含有している、請求項２に記載の齧歯類。
4. 前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一なポリペプチドをコードしている、請求項１に記載の齧歯類。
5. 前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一なポリペプチドをコードしている、請求項１に記載の齧歯類。
6. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位に位置付けられ、かつ、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のゲノム配列から前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子の前記ヌクレオチド配列への置換から生じる、請求項１に記載の齧歯類。
7. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子はヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子であり、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子であり、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子はヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子である、請求項１に記載の齧歯類。
8. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている、請求項７に記載の齧歯類。
9. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質は、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の齧歯類。
10. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の外部ドメインは、配列番号４の残基Ｗ１０６〜Ｇ４９２から構成されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含有する、請求項８に記載の齧歯類。
11. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をさらに含有している、請求項８に記載の齧歯類。
12. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一なポリペプチドをコードしている、請求項７に記載の齧歯類。
13. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のヌクレオチド配列は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する、請求項１２に記載の齧歯類。
14. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含有する、請求項１３に記載の齧歯類。
15. 前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のヌクレオチド配列は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をコードする、請求項７に記載の齧歯類。
16. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン１〜２、および前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３を含有し、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分と、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインとを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質をコードしている、請求項７に記載の齧歯類。
17. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン３の５’部分と、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の３’部分とを含むエクソン３を含有する、請求項１６に記載の齧歯類。
18. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子はヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子であり、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子であり、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子はヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子である、請求項１に記載の齧歯類。
19. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質をコードしている、請求項１８に記載の齧歯類。
20. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質は、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の齧歯類。
21. 前記外部ドメインは、配列番号１１の残基Ｋ５４〜Ｌ４３７から構成されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含有する、請求項１９に記載の齧歯類。
22. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をさらに含有している、請求項１９に記載の齧歯類。
23. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードしている、請求項１８に記載の齧歯類。
24. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでを含有する、請求項２３に記載の齧歯類。
25. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子の終止コドンのあとに、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子の３’ＵＴＲがつづく、請求項２４に記載の齧歯類。
26. 前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のヌクレオチド配列は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をコードする、請求項１８に記載の齧歯類。
27. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のコードエクソン１からコードエクソン３までと、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでとを含有する、請求項１８に記載の齧歯類。
28. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子はヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子であり、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子であり、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子はヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子である、請求項１に記載の齧歯類。
29. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質をコードしている、請求項２８に記載の齧歯類。
30. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質は、配列番号１８に明記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の齧歯類。
31. 前記外部ドメインは、配列番号１８の残基Ａ４２〜Ｉ４１８から構成されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含有する、請求項２９に記載の齧歯類。
32. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をさらに含有している、請求項２９に記載の齧歯類。
33. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードしている、請求項２８に記載の齧歯類。
34. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン３からコードエクソン１０の終止コドンまでを含有する、請求項３３に記載の齧歯類。
35. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含有する、請求項３４に記載の齧歯類。
36. 前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子によりコードされる内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をコードする、請求項２８に記載の齧歯類。
37. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のコードエクソン１〜２と、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン３からコードエクソン１０までとを含有する、請求項２８に記載の齧歯類。
38. 前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１に記載の齧歯類。
39. 前記齧歯類は、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に関してヘテロ接合性である、請求項１に記載の齧歯類。
40. 前記齧歯類は、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子に関してホモ接合性である、請求項１に記載の齧歯類。
41. 前記齧歯類は、同族内因性Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子座位に少なくとも２個のヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する、請求項１に記載の齧歯類。
42. 単離された齧歯類の細胞または組織であって、そのゲノムが内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列とを含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有し、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のプロモーターの制御下にある、単離された齧歯類の細胞または組織。
43. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子からなる群から選択される、請求項４２に記載の単離された齧歯類の細胞または組織。
44. 齧歯類胚性幹細胞であって、そのゲノムが内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列とを含むヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有し、前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のプロモーターの制御下にある、齧歯類胚性幹細胞。
45. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子からなる群から選択される、請求項４４に記載の齧歯類胚性幹細胞。
46. 請求項４４に記載の齧歯類胚性幹細胞から生成される齧歯類胚。
47. 同族齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の外部ドメインをコードする齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位の齧歯類ゲノムＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡ配列に対し相同な５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列に隣接される、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡを含有するベクター。
48. そのゲノムがヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類を提供する方法であって、
    齧歯類のゲノムを改変して、内因性Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のゲノム配列を、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のゲノム配列で置換し、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を形成することを含む、方法。
49. ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類を作製する方法であって、
    （ａ） 齧歯類胚性幹細胞中の内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位内にゲノム断片を挿入する工程であって、前記ゲノム断片は、同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含有しており、それによって、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子が形成され、ここで前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位の齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子のプロモーターの制御下にある、工程、
    （ｂ） （ａ）の前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を含有する齧歯類胚性幹細胞を取得する工程、および、
    （ｃ） （ｂ）の前記齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作製する工程、を含む、方法。
50. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、前記同族ヒトＴＭＰＲＳＳ遺伝子によりコードされるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードしている、請求項４９に記載の方法。
51. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ座位の前記齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子によりコードされる齧歯類Ｔｍｐｒｓｓタンパク質の細胞質部分および膜貫通部分と実質的に同一な細胞質部分および膜貫通部分をさらに含有している、請求項５０に記載の方法。
52. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子、ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子、およびヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
53. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン１〜２と、ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３までとを含有する、請求項５２に記載の方法。
54. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子は、前記内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ２遺伝子のコードエクソン３の５’部分と、前記ヒトＴＭＰＲＳＳ２遺伝子のコードエクソン３の３’部分とを含むエクソン３を含有する、請求項５３に記載の方法。
55. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ４遺伝子のコードエクソン１からコードエクソン３までと、ヒトＴＭＰＲＳＳ４遺伝子のコードエクソン４からコードエクソン１３の終止コドンまでとを含有する、請求項５２に記載の方法。
56. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子は、内因性齧歯類Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄ遺伝子のコードエクソン１〜２と、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ遺伝子のコードエクソン３からコードエクソン１０までとを含有する、請求項５２に記載の方法。
57. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓ遺伝子は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質からなる群から選択されるヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質の外部ドメインを含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質をコードする、請求項５２に記載の方法。
58. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質のＷ１０６〜Ｇ４９２またはＣ末端の３８７アミノ酸を含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ２タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
59. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質のＫ５４〜Ｌ４３７またはＣ末端の３８４アミノ酸を含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ４タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
60. 前記ヒト化Ｔｍｐｒｓｓタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質のＡ４２〜Ｉ４１８またはＣ末端の３７７アミノ酸を含有するヒト化Ｔｍｐｒｓｓ１１ｄタンパク質である、請求項５７に記載の方法。
61. 前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項４９に記載の方法。
62. インフルエンザウイルス感染症の治療における化合物の治療有効性を評価する方法であって、
    請求項１〜４１のいずれか１項に記載の齧歯類を提供する工程、
    前記齧歯類にインフルエンザウイルスと候補化合物を投与する工程、および、
    前記齧歯類におけるインフルエンザウイルス感染の存在と重症度をモニタリングし、前記候補化合物の治療有効性を決定する工程、を含む、方法。
63. 前記インフルエンザウイルスは、前記候補化合物の前に前記齧歯類に投与される、請求項６２に記載の方法。
64. 前記インフルエンザウイルスは、前記候補化合物の後に前記齧歯類に投与される、請求項６２に記載の方法。
65. 前記候補化合物は、ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質に特異的な抗体またはその抗原結合断片である、請求項６２に記載の方法。
66. 前記ヒトＴＭＰＲＳＳタンパク質は、ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質、ヒトＴＭＰＲＳＳ４タンパク質、およびヒトＴＭＰＲＳＳ１１Ｄタンパク質からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
67. 前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項６２に記載の方法。