JP2019510022A - 半減期が延長されリガンド結合性が低下した第ｖｉｉｉ因子 - Google Patents

Abstract

本発明は、水溶性重合体を治療タンパク質の酸化糖質部分に結合させる材料及び方法に関し、結合を可能にする条件下、酸化糖質部分と活性化水溶性重合体とを接触させることを含む。より詳細には、本発明は、半減期が延長されリガンド結合性が低下した修飾組換え第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月３日出願の米国特許仮出願番号第６２／２６２，６７４号の優先権を主張し、これは、参照することにより本明細書に援用される。

発明の分野
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の半減期を延長する材料及び方法に関する。

発明の背景
血友病Ａ及びＢの人々における出血の治療及び／または予防に広く認められた方法には、因子補充療法が含められることが多い。因子補充療法は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及び第ＩＸ因子（ＦＩＸ）などの血液凝固タンパク質の輸液（血流中への注射）が関与する。これらのタンパク質は、典型的には、ヒト血漿からの単離、及び遺伝子操作された細胞株での発現でという、２種類の提供源に由来する。欠損している凝固因子の補充は、永久的ではないため、そのような療法を受ける患者は、因子を繰り返し輸液されなければならない。

ＦＶＩＩＩなどの治療タンパク質の薬理学的性質及び免疫学的性質は、化学修飾及び重合体化合物との結合により改善することができる。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、コロミン酸（ＣＡ）とも称するが、これは天然起源の多糖である。ＰＳＡは、α（２→８）ケトシド結合を持つＮ−アセチルノイラミン酸ホモ重合体であり、その非還元末端に隣接ジオール基を有する。この重合体は負電荷を有し、ヒト身体の天然成分である。ＰＳＡは、大量に、及び予め定めた物理特性を持つように、細菌から容易に産生させることができる（米国特許第５，８４６，９５１号（特許文献１））。細菌により産生されるＰＳＡは、ヒト体内で産生されるＰＳＡと同じシアル酸単量体からなる。重合体の中にはそうでないものもあるが、ＰＳＡは生分解性である。

コロミン酸とカタラーゼ及びアスパラギナーゼとの共有結合カップリングは、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を高めることが示されている。ポリシアル酸化アスパラギナーゼ及び非修飾アスパラギナーゼを用いたｉｎ ｖｉｖｏ比較試験は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を延長することを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２００１，２１７，２１５−２４（非特許文献１））。

種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、かつ患者レシピエントに対する健康リスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬物動力学的及び／または薬物動態学的性質を改善するための、水溶性重合体をタンパク質に結合させる材料及び方法の開発は、依然として必要とされている。

米国特許第５，８４６，９５１号

Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２００１，２１７，２１５−２４

本発明は、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期、薬物動力学的及び／または薬物動態学的性質を改善するために、重合体をタンパク質に結合させるための材料及び方法を提供する。

１つの実施形態において、修飾第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）が提供される。修飾ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ半減期を延長するとともに、ＦＶＩＩＩに結合するリガンドとの修飾ＦＶＩＩＩの結合を減少させる修飾を含む。リガンドの例は、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）から選択される。修飾の例は、本明細書中記載されるが、例えば、水溶性重合体の付加などの化学修飾が挙げられる。

例示実施形態において、修飾ＦＶＩＩＩは、血漿由来である。例示実施形態において、ＦＶＩＩＩは、遺伝子組換えにより改変宿主細胞から産生される。様々な実施形態において、修飾ＦＶＩＩＩは、インタクトＢドメインを含む。様々な実施形態において、ＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩであり、インタクトＢドメインを含む。

例示実施形態において、修飾ＦＶＩＩＩは、非修飾ＦＶＩＩＩよりも低い親和性（ＫＤ）でＶＷＦ及びＬＲＰ１に結合する。

例示実施形態において、修飾ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩと結合したポリシアル酸（ＰＳＡ）を含む。この実施形態で使用されるＰＳＡ部分の例は、約２０ｋＤａの平均分子量を有する。例示実施形態において、ＰＳＡは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、または約５０ｋＤａから選択される平均分子量を有する。例示実施形態において、ＰＳＡは、低多分散度を有する。例示ＰＳＡ結合体は、ＰＳＡとＦＶＩＩＩ分子の間にアミノオキシリンカーを含む。例示アミノオキシリンカーは、修飾ＦＶＩＩＩの酸化糖質に付加されている。

本発明は、医薬組成物も提供する。例示医薬配合物は、上記の修飾ＦＶＩＩＩ、ならびに薬学上許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤、及び／または賦形剤を含む。

様々な実施形態において、上記の修飾ＦＶＩＩＩは、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する。様々な実施形態において、上記の修飾ＦＶＩＩＩは、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有し、このＰＥＧ化ＦＶＩＩＩはＰＥＧ部分と結合しており、このＰＥＧ部分は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期がより長い方のＦＶＩＩＩに結合しているＰＳＡとほぼ同じ平均分子量である。例示実施形態において、ＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩは、約２０ｋＤａの平均分子量を有するＰＳＡ部分と結合しており、約２０ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ部分と結合しているＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する。様々な実施形態において、半減期は、倍率で約１倍、約２倍、または約３倍長くなっている。さらに他の様々な実施形態において、半減期は、倍率で約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍長くなっている。

例示実施形態において、上記のＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩは、上記のＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ両者の結合を同等な条件下で測定した場合、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合よりも低い結合親和性で、ＶＷＦまたはＬＲＰ１に結合する。例示実施形態において、上記のＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩは、上記のＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ両者の結合を同等な条件下で測定しており、ＰＥＧ及びＰＳＡが、ほぼ同じ平均分子量のものである場合、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合よりも低い結合親和性で、ＶＷＦまたはＬＲＰ１に結合する。様々な実施形態において、ＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合よりも、倍率で約０．５倍低い。さらに他の実施形態において、ＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１との結合よりも、倍率で約０．１倍、約０．２倍、約０．３倍、約０．４倍、約０．５倍、約０．６倍、約０．７倍、約０．８倍、約０．９倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍低い。

１つの実施形態において、ＦＶＩＩＩ半減期を延長するとともに修飾ＦＶＩＩＩのＶＷＦ及びＬＲＰ１からなる群より選択されるリガンドへの結合を減少させる修飾を含む修飾組換えＦＶＩＩＩが提供され、この修飾は、アミノオキシリンカーを通じてＰＳＡをＦＶＩＩＩに付加することを含む。例示実施形態において、アミノオキシリンカーは、修飾ＦＶＩＩＩの酸化糖質に付加されており、この修飾組換えＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、非修飾組換えＦＶＩＩＩ及び／またはＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩよりも長く、この修飾組換えＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１に対する結合親和性は、非修飾組換えＦＶＩＩＩ及び／またはＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩによるＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合よりも低い。例示実施形態において、比較対象種は、ほぼ同じ平均分子量のＰＳＡ及びＰＥＧ部分を含む。

本発明はさらに、そのような治療を必要とする対象を、本発明の修飾ＦＶＩＩＩで治療する方法を提供する。例示実施形態において、開示される修飾ＦＶＩＩＩを含む本発明の医薬組成物が、ＦＶＩＩＩ欠乏、または別の因子（例えば、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ）の欠乏と関連した疾患または障害と診断された哺乳類に投与される。

例示実施形態において、本発明は、哺乳類対象において出血性障害を治療する方法を提供する。例示方法は、上記の修飾ＦＶＩＩＩまたはその医薬組成物を、そのような治療を必要としている対象に、出血性障害の１つまたは複数の症候を減少または除去するのに有効な量で投与することを含む。例示実施形態において、医薬配合物の投与は、４日ごとに１回以下、５日ごとに１回以下、６日ごとに１回以下、７日ごとに１回以下、８日ごとに１回以下、９日ごとに１回以下、または１０日ごとに１回以下で、対象に投与した場合に、出血性障害の１つまたは複数の症候を減少または除去するのに有効な量を達成する。

密度の異なる３種のセンサーチップ固定ＶＷＦで、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ群及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩについてＲ_ｍａｘで表した結合シグナルを示し、Ｒ_ｍａｘは飽和下での最大結合として計算されたものである。 ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩについて、ＬＲＰ１に対するＦＶＩＩＩタンパク質濃度依存的結合の結果を示す。 ｒＦＶＩＩＩはＬＲＰ１に強固に結合し、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩはＬＲＰ１との残留会合を示し、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩは、ＬＲＰ１と事実上会合できなかったことを示す。 トロンビンによるＦＶＩＩＩ活性化後の経時的ＦＸａ生成を示す。 再緩衝化ｒＦＶＩＩＩ及びＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩについて、ピークトロンビン生成曲線の評価結果を示す。 再緩衝化ｒＦＶＩＩＩ及びＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩについて、合計トロンビン生成曲線を示す。 マウスにおいて、ＰＥＧ化及びポリシアル酸化ｒＦＶＩＩＩが、ｒＦＶＩＩＩに比べて改善されたＰＫパラメーターを示したことを示す。 ラットにおいて、ＰＥＧ化及びポリシアル酸化ｒＦＶＩＩＩが、ｒＦＶＩＩＩに比べて改善されたＰＫパラメーターを示したことを示す。 マカクにおいて、ＰＥＧ化及びポリシアル酸化ｒＦＶＩＩＩが、ｒＦＶＩＩＩに比べて改善されたＰＫパラメーターを示したことを示す。

治療タンパク質の薬理学的及び免疫学的性質は、化学修飾及びポリシアル酸（ＰＳＡ）などの重合体化合物との結合により、改善することができる。得られる結合体の性質は、一般に、重合体の構造及び大きさに強く依存する。そのため、明確で狭い寸法分布を持つ重合体が、当該分野で一般に好適である。ＰＥＧのような合成重合体は、狭い寸法分布で容易に製造可能であるが、一方ＰＳＡは、狭い寸法分布を持つ最終ＰＳＡ調製物をもたらすような様式で精製することが可能である。

本明細書中記載されるとおり、ポリシアル酸化を通じてなどの可溶性重合体の付加は、ＦＶＩＩＩなどの治療タンパク質の性質を改善する１つのアプローチである。

治療タンパク質
血液凝固タンパク質
１つの態様において、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、このタンパク質は、ヒト血漿に由来するものでも、米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，７３３，８７３号、米国特許第５，１９８，３４９号、米国特許第５，２５０，４２１号、米国特許第５，９１９，７６６号、及びＥＰ３０６９６８に記載されるとおり、組換え操作技法により生成させることも可能である。最近の例として、米国特許第７，６４５，８６０号、米国特許第８，６３７，６４０号、米国特許第８，６４２，７３７号、及び米国特許第８，８０９，５０１号が追加して挙げられる。

治療ポリペプチド、例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、及びＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼをはじめとする血液凝固タンパク質は、タンパク質分解酵素により迅速に分解され、抗体により中和される。このことが、これらの半減期及び循環時間を減少させ、それによりこれらの治療有効性を限定している。これらの凝固タンパク質の所望の治療効果または予防効果に到達して維持するためには、比較的高用量及び頻繁な投与が必要である。結果として、適切な用量調節を得ることが困難になり、頻繁な静脈内投与の必要性は、患者の生活様式に制限を課す。

本明細書中記載されるとおり、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、及びＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含むがこれらに限定されない血液凝固タンパク質が本発明により企図される。本明細書中使用される場合、「血液凝固タンパク質」という用語は、その特定の天然血液凝固タンパク質に付随する生物活性を表出する、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、及びＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼのいずれかを示す。

血液凝固カスケードは、内因性経路、外因性経路、及び共通経路の、３つの異なるセグメントに分けられる（Ｓｃｈｅｎｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４，１１，２７２−７）。カスケードには、一連のセリンプロテアーゼ酵素（酵素原）及びタンパク質補因子が関与する。カスケードでは、必要になると、不活性酵素原前駆体が活性型に変換され、活性型が、引き続き次の酵素に変換される。

内因性経路は、凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、及びＸＩＩを必要とする。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、及び第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が、負電荷を有する表面と接触することで起こる。同じく必要であるのは、血小板から分泌されるカルシウムイオン及びリン脂質である。

外因性経路は、血管の内腔が損傷を受けると開始される。膜糖タンパク質組織因子が、露出し、次いで循環第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）と、少量の予め存在するその活性型ＦＶＩＩａに結合する。この結合が、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの完全変換を促進し、続いて、カルシウム及びリン脂質の存在下、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）から第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）への変換及び第Ｘ因子（ＦＸ）から第Ｘａ因子（ＦＸａ）への変換を促進する。ＦＶＩＩａと組織因子との会合は、ＦＶＩＩの基質（ＦＩＸ及びＦＸ）結合部位をより近位へと近づけることにより、及びＦＶＩＩａの酵素活性を向上させる立体構造変化を誘導することにより、タンパク質分解活性を向上させる。

ＦＸの活性化は、２つの経路で共通する点である。第Ｖａ因子（ＦＶａ）及び第Ｘａ因子は、リン脂質及びカルシウムと共に、プロトロンビンをトロンビンに変換し（プロトロンビナーゼ複合体）、次いでこれがフィブリノーゲンを切断して、フィブリン単量体を形成させる。単量体は、重合してフィブリン鎖を形成する。第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）は、これらの鎖を互いに共有結合させて、強固な網を形成させる。

ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの変換は、複数のプロテアーゼによっても触媒され、そのようなプロテアーゼとして、トロンビン、ＦＩＸａ、ＦＸａ、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、及び第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）が挙げられる。カスケードの初期段階を阻害する場合、組織因子経路阻害剤は、ＦＶＩＩａ／組織因子／ＦＸａ生成物複合体を標的とする。

第ＶＩＩＩ因子
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、非常に低濃度で血漿中を循環し、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）と非共有結合している。止血の間、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離して、カルシウム及びリン脂質または細胞膜の存在下で、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）介在ＦＸ活性化速度を向上させることにより、この活性化の補因子として作用する。

トロンビンにより活性化したＦＶＩＩＩは、低密度リポタンパク質受容体タンパク質（本明細書中以下、「ＬＲＰ」と称する）への結合に関わるとされている（Ｙａｋｈｙａｅｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９０（Ｓｕｐｐｌ．１），１９９７，１２６−Ｉ、本明細書中参照として援用される）。非活性化ＦＶＩＩＩが、多機能エンドサイトーシス受容体である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）と相互作用することも実証されている（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｊｓｔｅｒｓ，Ｐ．Ｐ．Ｆ．Ｍ．，Ｍｅｉｊｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｅ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，ｖａｎ Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．，−Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４，２３７３４−２３７３９、ＷＯ ００／２８０２１、Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｙａｋｈｙａｅｖ，Ａ．Ｖ．，Ｍｉｋｈａｉｌｅｎｋｏ，Ｉ．，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．，ａｎｄ Ｓａｒａｆａｎｏｖ，Ａ．Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４，３７６８５−３７６９２、本明細書中参照により援用される）。この受容体は、ＦＶＩＩＩの循環からのクリアランスで役割を果たすことが示唆されている（Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，既出、Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｈ．Ｐ．，Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｎｄｅｒ，Ｂ．，Ｍｉｈａｌｙ，Ｊ．，Ｄｅｎｉｓ，Ｃ．，Ｄｏｍｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．Ｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５，１７０３−１７０８、本明細書中参照により援用される）。

ＬＲＰは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ファミリーの一員であり、このファミリーは、ＬＤＬ受容体、超低密度リポタンパク質受容体、アポリポタンパク質Ｅ受容体２、及びメガリンも含む（総説については、Ｎｅｅｌｓ Ｊ．Ｇ．，Ｈｏｒｎ，Ｉ．Ｒ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．−Ｊ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ １９９８，１２，２１９−２４０、Ｈｅｒｚ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１，１０８，７７９−７８４を参照、本明細書中参照により援用される）。ＬＲＰは、様々な組織で発現し、そのような組織として、肝臓、肺、胎盤、及び脳が挙げられる（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｐａｌｌｅｓｅｎ，Ｇ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９９２，２６９，３７５−３８２、本明細書中参照により援用される）。この受容体は、細胞外の５１５ｋＤａアルファ鎖からなり、この鎖は膜貫通８５ｋＤａベータ鎖と非共有結合している（Ｈｅｒｚ，Ｊ．，Ｋｏｗａｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０，９，１７６９−１７７６、本明細書中参照により援用される）。アルファ鎖は、４つのクラスターを含有し、クラスターはそれぞれ異なる数の補体型リピートからなり、リピートは、多くの構造的及び機能的に無関係のリガンドの結合に介在する（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｈｏｔｌｅｔ，Ｔ．Ｌ．，Ｅｔｚｅｒｏｄｔ，Ｍ．，Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｎｙｋｊａｅｒ，Ａ．，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｇｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８，１３６９１−１３６９６、Ｗｉｌｌｎｏｗ，Ｔ．Ｅ．，Ｏｒｔｈ，Ｋ．，ａｎｄ Ｈｅｒｚ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９，１５８２７−１５８３２、 Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．，Ｌｏｏｋｅｎｅ，Ａ．，Ｏｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｇ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．−Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４，３１３０５−３１３１１、本明細書中参照により援用される）。

ベータ鎖は、膜貫通ドメイン及びエンドサイトーシスに不可欠な短い細胞質テイルを含む。アルファ鎖は、巨大外部ドメインとして機能し、上皮成長因子様ドメイン、Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ配列、及びＬＤＬ受容体クラスＡドメインの３種類のリピートを含む。これらのクラスＡドメインは、リガンド結合に関わるとされており、クラスターＩ（２つのドメイン）、クラスターＩＩ（８つのドメイン）、クラスターＩＩＩ（１０のドメイン）、及びクラスターＩＶ（１１のドメイン）と呼ばれる４つの別個のクラスターで存在する。

ＬＲＰは、活性化非酵素補因子第ＶＩＩＩａ因子とも結合する（Ｙａｋｈｙａｅｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９０，（Ｓｕｐｐｌ．１），１９９７，１２６−Ｉ）。ＦＶＩＩＩ軽鎖は、組換えＬＲＰクラスターＩＩ及びＩＶと相互作用することが実証されており、一方ＬＲＰクラスターＩ及びＩＩＩへの結合は観察されなかった（Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ １９９９既出）。

ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を持つ約２７０〜３３０ｋＤの一本鎖前駆体として合成される。血漿から精製された場合（例えば、「血漿由来」または「血漿性」）、ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）及び軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）で構成される。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるが、一方、重鎖は、Ｂドメイン内でのタンパク質分解により、９０〜２２０ｋＤの範囲にある。

ＦＶＩＩＩは、出血性障害の治療用途で組換えタンパク質としても合成される。治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を明らかにするために、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが考案されている。そうしたアッセイは、内因性ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ効果を模倣する。ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏでのトロンビン処理は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより測定した場合、その凝血原活性の急激な上昇及びその後の低下をもたらす。この活性化及び不活性化は、重鎖及び軽鎖両方における特定の限定的タンパク質分解と一致し、この分解は、ＦＶＩＩＩの異なる結合エピトープの利用可能性を変更して、例えばＦＶＩＩＩがＶＷＦから解離して、リン脂質表面に結合することを可能にし、またはある特定のモノクローナル抗体との結合能力を変更させる。

ＦＶＩＩＩの欠乏または機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友病Ａと関連する。血友病Ａに対処するための選択治療は、血漿由来またはｒＦＶＩＩＩ濃縮製剤を用いた補充療法である。ＦＶＩＩＩレベルが１％未満の重篤な血友病Ａの患者は、一般に、投薬間のＦＶＩＩＩを１％超に維持する目的で予防的治療を受けている。様々なＦＶＩＩＩ製品の循環中平均半減期を考慮すると、この目的は、通常、ＦＶＩＩＩを週に２〜３回投与することにより達成可能である。

参照ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ００４５１（ＦＡ８＿ヒト）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２（５９９２），３２６−３０、Ｖｅｈａｒ ＧＨ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２（５９９２），３３７−４２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ，２００２，２００３：２９，１１−２９が挙げられる。

ポリペプチド
１つの態様において、本発明の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書中記載されるとおり、治療タンパク質という用語は、治療タンパク質に付随する生物活性を表出する任意の治療タンパク質分子を示す。本発明の１つの実施形態において、治療タンパク質分子は、全長タンパク質である。１つの実施形態において、治療タンパク質は、半減期を延長するように修飾されたＦＶＩＩＩである。

企図される治療タンパク質分子として、全長タンパク質、全長タンパク質の前駆体、全長タンパク質の生物活性サブユニットまたは断片、ならびにこれらの形状の治療タンパク質のいずれかの生物活性誘導体及び変異体が挙げられる。したがって、治療タンパク質として、（１）少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、またはそれより多いアミノ酸領域にわたり、本明細書中記載される、参照核酸によりコードされるポリペプチドまたはアミノ酸配列と、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％、またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、及び／または（２）本明細書中記載されるとおりの参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原性断片、及び／またはその保存的修飾変異体に対して産生された抗体、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と特異的に結合するもの、が挙げられる。

本発明に従って、「組換え治療タンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術を介して得られた任意の治療タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、この用語は、本明細書中記載されるとおりのタンパク質を包含する。

本明細書中使用される場合、「内因性治療タンパク質」は、治療を受けることが意図される哺乳類から生じる治療タンパク質を含む。この用語は、この哺乳類に存在する導入遺伝子または任意の他の外来ＤＮＡから転写される治療タンパク質も含む。本明細書中使用される場合、「外因性治療タンパク質」は、治療を受けることが意図される哺乳類から生じたのではない血液凝固タンパク質を含む。

本明細書中使用される場合、「血漿由来」、「血漿由来血液凝固タンパク質」、または「血漿性」は、凝固経路に関与する性質を有する、哺乳類から得られた血液中に見つかる全ての形状のタンパク質を含む。

本明細書中使用される場合、「生物活性な誘導体」または「生物活性な変異体」は、分子の例えば結合性などの機能的及び／または生物学的性質、及び／またはペプチド骨格もしくは基本重合体単位などの基礎構造と実質的に同じ機能的及び／または生物学的性質及び／または基礎構造を有する、その分子の任意の誘導体または変異体を含む。

「変異体」または「誘導体」などの「類似体」とは、構造が実質的に類似しており、度合いが異なる場合があったとしても、天然起源の分子と同じ生物活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと実質的に類似の構造を有し、同じ生物活性を有するポリペプチドを示す。変異体または類似体は、その類似体の由来元である天然起源のポリペプチドと比べて、それらのアミノ酸配列の組成に、１つまたは複数の変異に基づく違いがあり、そのような変異として、（ｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端及び／または天然起源のポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（例えば、断片）での１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端での１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または付加（典型的には「付加」または「融合」）及び／または天然起源のポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域での１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または付加（典型的には「挿入」）、あるいは（ｉｉｉ）天然起源のポリペプチド配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基の他のアミノ酸への置換、が挙げられる。例として、「誘導体」は、類似体の１種であり、参照ポリペプチドと同一または実質的に同様な構造を有する、例えば、化学的に修飾されたポリペプチドを示す。

変異体ポリペプチドは、類似体ポリペプチドの１種であり、１つまたは複数のアミノ酸残基が、本発明の治療タンパク質アミノ酸配列に付加されている挿入変異体を含む。挿入は、タンパク質の一端または両端に位置する場合も、及び／または治療タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置する場合もある。一端または両端に追加残基を有する挿入変異体として、例えば、融合タンパク質、及びアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質が挙げられる。１つの態様において、血液凝固タンパク質分子は、特に分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞で組換えにより発現する場合に、任意選択で、Ｎ末端Ｍｅｔを含有する。

欠失変異体では、本明細書中記載されるとおりの治療タンパク質ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている。欠失は、治療タンパク質ポリペプチドの一端または両端で実行され得る、及び／または治療タンパク質アミノ酸配列内の１つまたは複数の残基の除去で実行され得る。したがって、欠失変異体には、治療タンパク質ポリペプチド配列の断片が含まれる。

置換変異体では、治療タンパク質ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が、除去されて、代替残基に置き換えられている。１つの態様において、置換は、性質が保存されるものであり、この種の保存的置換は、当該分野で周知である。あるいは、本発明は、非保存的置換も包含する。保存的置換の例は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されているが、以下にも提示する。

あるいは保存的置換の例は、以下に提示するものである。

ポリヌクレオチド
本発明の治療タンパク質をコードする核酸として、例えば特に限定せずに、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、多形型変異体、アレル、合成変異体、及び天然起源の変異体が挙げられる。

本発明の治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしてまた、特に限定せずに、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書中記載されるとおりの参照アミノ酸配列をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするもの、及びそれらの保存的修飾変異体、（２）本明細書中記載されるとおりの参照核酸配列に対して、少なくとも約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約５００、約１０００、またはそれより多いヌクレオチド（最大成熟タンパク質の１２１８ヌクレオチドの全長配列まで）の領域にわたり、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するもの、が挙げられる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件の例として、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８中、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ中、５５℃で３０分間の洗浄が挙げられる。当然ながら、ハイブリダイズさせようとする配列の長さ及びＧＣヌクレオチド含有量に基づいて、これらの例示条件の改変形態を作ることが可能である。当該分野で標準である公式は、適切なハイブリダイゼーション条件を決定するのに適切である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）§§９．４７−９．５１を参照。

「天然起源の」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列とは、典型的には、哺乳類に由来するものであり、哺乳類として、ヒトなどの霊長類、ラット、マウス、ハムスターなどの齧歯類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸及びタンパク質は、組換え分子（例えば、異種性であり、野生型配列をコードするもの、またはその変異体、または天然起源ではないもの）が可能である。

治療タンパク質の製造
治療タンパク質の製造は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの製造方法、（ｉｉ）例えば特に限定されないが、形質移入、電気穿孔法、もしくは微量注入による、原核もしくは真核生物細胞への組換えＤＮＡ導入方法、（ｉｉｉ）この形質転換細胞の培養方法、（ｉｖ）治療タンパク質の、例えば恒常的にまたは誘導に際しての発現方法、及び（ｖ）精製治療タンパク質を得る目的で、例えば培養培地からまたは形質転換細胞を収穫することによる、この血液凝固タンパク質の単離方法、の当該分野で既知の任意の方法を含む。

他の態様において、治療タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を産生することを特徴とする原核もしくは真核生物宿主系中での発現により産生される。真核生物細胞の例として、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、及びＨｅｐＧ２などがある。

多種多様なベクターが、治療タンパク質の調製に使用され、それらは真核生物及び原核生物発現ベクターから選択される。原核生物発現用ベクターの例として、特に限定せずに、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、及びｐＢＡＤなどのプラスミドが挙げられ、原核生物発現ベクターで使用されるプロモーターとして、特に限定せずに、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤの１種または複数種が挙げられる。真核生物発現用ベクターの例として、以下が挙げられる：（ｉ）酵母菌での発現用として、特に限定せずに、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクターに、特に限定せずに、プロモーターとしてＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などを使用する、（ｉｉ）昆虫細胞での発現用として、特に限定せずに、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクターに、特に限定せずに、プロモーターとしてＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどを使用する、及び（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現用として、特に限定せずに、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、及び、１つの態様において、特に限定せずに、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクターに、特に限定せずに、プロモーターとしてＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ−アクチンなどを使用する。

最近の追加例として，米国特許第７，６４５，８６０号、米国特許第８，６３７，６４０号、米国特許第８，６４２，７３７号、及び米国特許第８，８０９，５０１号が挙げられる。

投与
１つの実施形態において、本発明の結合型治療タンパク質は、注射、例えば、静脈内、筋肉内、または腹腔内注射により投与することができる。

本発明の結合型治療タンパク質を含む組成物を、ヒトまたは実験動物に投与するため、１つの態様において、組成物は、１種または複数種の薬学上許容される担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、安定であり、凝集及び切断産物などのタンパク質分解を阻止し、それに加えて、以下で記載されるとおり、当該分野で周知である経路を用いて投与した場合にアレルギー性または他の有害反応を起こさない、分子実体及び組成物を示す。「薬学上許容される担体」として、あらゆる臨床上有用な溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、及び吸収遅延剤などが挙げられ、上に開示される作用剤が含まれる。

本明細書中使用される場合、「有効量」は、疾患または障害を治療するのに適切な、あるいは疾患または障害の症候を改善させるのに適切な用量を含む。１つの実施形態において、「有効量」は、本明細書中記載されるとおりの出血性障害を有する哺乳類を治療するのに適切な用量を含む。

組成物は、経口、外用、経皮、非経口、吸入スプレー、経膣、直腸、または頭蓋内注射により投与することができる。非経口という用語は、本明細書中使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または輸液技法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球後、肺内注射、及び／または特定部位での外科移植による投与も同様に企図される。一般に、組成物は、パイロジェン、ならびにレシピエントに対して有害となる可能性がある他の不純物を本質的に含まない。

組成物の単回または複数回投与は、治療する医師により選択される用量レベル及びパターンで行うことができる。疾患の予防または治療の場合、適切な投薬量は、上記のとおり、治療対象の疾患の種類、疾患の重篤度及び過程、薬の投与が予防目的なのか治療目的なのか、以前の治療、患者の病歴及び薬に対する反応、ならびに担当医師の判断に依存することになる。

本発明は、本明細書中定義されるとおりの結合型治療タンパク質を有効量で含む医薬組成物にも関する。医薬組成物は、さらに、薬学上許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤、または賦形剤を含むことができる。医薬組成物は、上記に定義される出血性障害の治療に使用することができる。本発明の医薬組成物は、液剤の場合も、凍結乾燥製剤の場合もある。医薬組成物の液剤は、任意の適切な凍結乾燥プロセスに供することができる。

さらなる態様として、本発明は、対象への投与に使用しやすい様式で包装された本発明の組成物を含むキットを含む。１つの実施形態において、そのようなキットは、本明細書中記載される化合物または組成物（例えば、結合型治療タンパク質を含む組成物）を含み、化合物または組成物は、密閉ビンまたは容器などの収容器に包装されていて、本方法の実施における化合物または組成物の使用を説明するラベルが収容器に貼付されている、または包装に同封されている。１つの実施形態において、キットは、結合型治療タンパク質を含む組成物を有する第一容器、及び第一容器に入った組成物用の生理学的に許容される再構築溶液を有する第二容器を含む。１つの態様において、化合物または組成物は、単位剤形で包装される。キットは、さらに、特定の投与経路に従って組成物を投与するのに適した装置を含むことができる。好ましくは、キットは、治療タンパク質またはペプチド組成物の使用を説明するラベルを含む。

水溶性重合体
１つの態様において、提供される治療タンパク質誘導体（すなわち、結合型治療タンパク質）分子は、水溶性重合体と結合しており、そのような重合体として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、糖質、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、水溶性重合体は、分子量が３５０〜１２０，０００Ｄａ、５００〜１００，０００Ｄａ、１０００〜８０，０００Ｄａ、１５００〜６０，０００Ｄａ、２，０００〜４５，０００Ｄａ、３，０００〜３５，０００Ｄａ、及び５，０００〜２５，０００Ｄａの範囲にあるシアル酸分子からなる。水溶性重合体のカップリングは、直接またはリンカー分子を介してタンパク質とカップリングさせることにより行うことができる。化学リンカーの１つの例は、糖質選択性ヒドラジド及びスルフヒドリル反応性マレイミド基を有するＭＢＰＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド）である（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２，２６７，１５９１６−２２）。他の代表的及び好適なリンカーを以下に記載する。

ホモ二官能性リンカー
例示実施形態において、水溶性重合体のカップリングは、ホモ二官能性リンカーを介して行われる。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、架橋リンカーのスペーサー腕のそれぞれ対向端に同一の反応基を有し、式Ｙ−Ｌ−Ｙを有する。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_ｎ’ＯＮＨ_２であり、式中ｎ’＝１〜１０である。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_２ＯＮＨ_２である。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_４ＯＮＨ_２である。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_６ＯＮＨ_２である。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_８ＯＮＨ_２である。例示実施形態において、ホモ二官能性リンカーは、ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_１０ＯＮＨ_２である。

１つの実施形態において、誘導体は、未変性治療タンパク質製剤の全機能活性を保持し、未変性治療タンパク質製剤と比較した場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで延長された半減期を提供する。例示実施形態において、誘導体は、未変性血液凝固タンパク質に対して少なくとも約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、１１０、約１２０、約１３０、約１４０、または約１５０パーセント（％）の生物活性を保持する。例示実施形態において、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩよりも約７０％高い比活性度を得る。例示実施形態において、誘導体及び未変性血液凝固タンパク質の生物活性は、発色活性対血液凝固因子抗原値の比（血液凝固因子：Ｃｈｒ：血液凝固因子：Ａｇ）により求められる。本発明の例示実施形態において、構築物の半減期は、未変性治療タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０倍減少または上昇する。

例示実施形態において、誘導体、例えば、本明細書中記載されるとおりのＰＳＡを含む修飾ＦＶＩＩＩは、修飾ＦＶＩＩＩの持つ、１種または複数種のリガンド、例えばＶＷＦまたはＬＲＰ１などと相互作用（例えば、結合）する能力を低下させる、あるいはいずれにしろ制限するような方法で修飾される。例えば、本開示による修飾ＦＶＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多いＰＳＡ部分が、ＦＶＩＩＩのアミノ酸を分離するように直接付加されている、またはＦＶＩＩＩの例えば、糖質部分に付加されている、ＦＶＩＩＩを含む。本明細書中開示されるとおり、アミノオキシリンカーは、ＦＶＩＩＩ糖質部分を介して付加されることが企図される。

様々な実施形態において、修飾ＦＶＩＩＩの、例えば、ＶＷＦ及び／またはＬＲＰ１との結合親和性は、修飾ＦＶＩＩＩの半減期と直接相関する。例えば、ＶＷＦへの結合が強いほど、半減期は、ＶＷＦによる制御が大きくなり、例えば、水溶性重合体により制御されなくなる。このように、ＶＷＦ結合をより大幅に減少させる修飾は、ＶＷＦにではなく、水溶性重合体により付与されるクリアランス阻止特性に基づき半減期の延長を制御するようになる。

シアル酸及びＰＳＡ
ＰＳＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸の重合体（一般に同種重合体）からなる。第二級アミノ基は、通常、アセチル基を有するが、その代わりにグリコリル基を有する場合もある。ヒドロキシル基で可能な置換基として、アセチル、ラクチル、エチル、スルファート、及びホスファート基が挙げられる。

ＰＳＡ及びｍＰＳＡは、一般に、本質的に、２，８−または２，９−グリコシド結合またはこれらの組み合わせ（例えば２，８−と２，９−の交互結合）により結合されたＮ−アセチルノイラミン酸部分からなる直鎖重合体を含む。特に好適なＰＳＡ及びｍＰＳＡでは、グリコシド結合は、α−２，８である。そのようなＰＳＡ及びｍＰＳＡは、コロミン酸から都合よく派生し、本明細書中、「ＣＡ」及び「ｍＣＡ」と称する。典型的なＰＳＡ及びｍＰＳＡは、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも２０のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、それらは、２〜３００のＮ−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは５〜２００のＮ−アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは１０〜１００のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含むことができる。ＰＳＡ及びＣＡは、好ましくは、Ｎ−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。したがって、ＰＳＡ及びＣＡは、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。

部分の酸化
ＰＳＡ及びＣＡがＮ−アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合（例えば、ｍＰＳＡ及びｍＣＡなどの場合）、それらは、好ましくは、重合体鎖の一端または両端に位置する。そのような「他の」部分は、例えば、末端Ｎ−アセチルノイラミン酸部分の酸化または還元に由来する部分が可能である。

例えば、ＷＯ−Ａ−０１８７９２２は、非還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によりアルデヒド基に変換されているようなｍＰＳＡ及びｍＣＡを記載する。さらに、ＷＯ２００５／０１６９７４は、還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が、還元を受けて、還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位で還元開環し、それにより隣接ジオール基が形成され、続いて酸化により隣接ジオール基がアルデヒド基に変換されているようなｍＰＳＡ及びｍＣＡを記載する。

シアル酸リッチ糖タンパク質は、ヒト及び他の生体中で、セレクチンと結合する。それらは、ヒトインフルエンザ感染で重要な役割を果たす。例えば、シアル酸は、宿主細胞または細菌の表面上のマンノース抗原をマンノース結合レクチンから隠すことができる。これにより、補体の活性化を防止する。シアル酸は、最後から２番目のガラクトース残基も隠し、そうすることで、肝実質細胞上のガラクトース受容体による糖タンパク質の迅速なクリアランスを防止する。

コロミン酸（ＰＳＡのサブクラス）は、α（２→８）ケトシド結合を持つＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）同種重合体であり、とりわけ、Ｋ１抗原を持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の特定株により産生される。コロミン酸は、多くの生理学的機能を有する。コロミン酸は、薬物及び化粧品の原材料として重要である。

ポリシアル酸化アスパラギナーゼ及び未変性アスパラギナーゼを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの比較実験は、ポリシアル酸化が、この酵素の半減期を延長したことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １９９７，１３４１，２６−３４）。

本明細書中使用される場合、「シアル酸部分」は、水性の溶液または懸濁液に可溶性であり、ＰＳＡ−血液凝固タンパク質結合体を薬学的有効量で投与した際、哺乳類に、副作用などのマイナスの影響をほとんどまたは全く及ぼさない、シアル酸単量体または重合体（「多糖類」）を含む。重合体は、１つの態様において、約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００のシアル酸単位を有することを特徴とする。例示実施形態において、ポリシアル酸は、重合体が約２０ｋＤの分子量を持つように複数のシアル酸単位を含む。ある特定の態様において、異なるシアル酸単位が、鎖中で組み合わされている。

本発明の１つの実施形態において、多糖化合物のシアル酸部分は、高親水性であり、例示実施形態において、化合物全体が、高親水性である。親水性は、シアル酸単位のペンダント型カルボキシル基、ならびにヒドロキシル基により主に付与される。糖単位は、他の官能基、例えば、アミン、ヒドロキシル、またはスルファート基、あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。これらの基は、天然起源の糖化合物に存在する場合も、誘導体多糖化合物に導入されている場合もある。

天然起源の重合体ＰＳＡは、幅広いサイズ分布（例えばＳｉｇｍａＣ−５７６２）及び高い多分散度（ＰＤ）を示す多分散調製物として入手可能である。多糖類は、エンドトキシンを共精製する内在リスクを持つ細菌で通常産生されるため、長鎖シアル酸重合体の精製は、エンドトキシン含有量上昇の可能性を高める恐れがある。１〜４のシアル酸単位を持つ短いＰＳＡ分子は、合成で調製することもでき（Ｋａｎｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２２７−８、Ｒｅｓｓ ＤＫ ａｎｄ Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２００４；１：３１−４６）、したがって、高エンドトキシンレベルのリスクを最小限に抑えることができる。しかしながら、狭いサイズ分布及び低い多分散度を持ち、しかもエンドトキシンを含まないＰＳＡ調製物が、現在製造可能である。本発明の特定用途の多糖化合物は、１つの態様において、細菌により産生されたものである。こうした天然起源の多糖類のあるものは、糖脂質として知られる。１つの実施形態において、多糖化合物は、実質的に、末端ガラクトース単位を含まない。

付加方法
治療タンパク質は、当業者に既知の様々な技法のいずれかにより、多糖化合物と共有結合させることができる。本発明の様々な態様において、シアル酸部分は、例えば、米国特許第４，３５６，１７０号（本明細書中参照により援用される）に記載される方法により、治療タンパク質、例えば、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＶＷＦに結合される。最近のさらなる例として、米国特許第７，６４５，８６０号、米国特許第８，６３７，６４０号、米国特許第８，６４２，７３７号、及び米国特許第８，８０９，５０１号が挙げられ、これらは本明細書中に参照として援用される。

ＰＳＡにポリペプチドをカップリングする他の技法も、既知であり、本発明により企図される。例えば、米国公開第２００７／０２８２０９６号は、例えば、ＰＳＡのアミンまたはヒドラジド誘導体のタンパク質への結合を記載する。また、米国公開第２００７／０１９１５９７号は、還元端で基質（例えば、タンパク質）と反応するためのアルデヒド基を有するＰＳＡ誘導体を記載する。これらの参照文献は、その全体が、参照により援用される。

様々な方法が、米国特許第５，８４６，９５１号（その全体が、参照により援用される）の第７欄、第１５行から第８欄、第５行にわたり開示される。技法の例として、血液凝固タンパク質または多糖いずれか一方のカルボキシル基と血液凝固タンパク質または多糖のアミン基との間のペプチド結合を通じた結合、あるいは血液凝固タンパク質または多糖のカルボキシル基と血液凝固タンパク質または多糖のヒドロキシル基の間のエステル結合を介した結合が挙げられる。治療タンパク質を多糖化合物と共有結合させる別の結合は、シッフ塩基を介するもので、血液凝固タンパク質の自由アミノ基と、多糖の非還元末端で過ヨウ素酸酸化により形成されたアルデヒド基とを反応させる（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＨＪ ａｎｄ Ｌｕｇｏｗｓｋｉ Ｃ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１−８、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＡＩ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７；１３４１；２６−３４）。生成したシッフ塩基は、１つの態様において、ＮａＣＮＢＨ_３を用いた特異的還元により安定化されて、第二級アミンを形成する。代替アプローチは、先に酸化した後、ＮＨ_４Ｃｌで還元的アミノ化することにより、ＰＳＡの末端自由アミノ基を生成させることである。２つのアミノまたは２つのヒドロキシル基を結合させるために二官能性試薬を使用することができる。例えば、アミノ基を有するＰＳＡを、ＢＳ３（スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）／Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のような試薬で、タンパク質のアミノ基とカップリングさせる。さらに、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）のようなヘテロ二官能性架橋試薬が、例えば、アミン基とチオール基を結合させるために使用される。

例示実施形態において、先に酸化し、アルデヒド官能基を生成させた後に、ＰＳＡヒドラジドを調製して、タンパク質の糖質部分とカップリングさせる。

上記のとおり、治療タンパク質の自由アミン基が、シアル酸残基の１−カルボキシル基と反応して、ペプチジル結合を形成する、あるいは１−カルボン酸基と、血液凝固タンパク質のヒドロキシルまたは他の適切な活性基との間でエステル結合が形成される。あるいは、カルボキシル基が、脱アセチル化５−アミノ基とペプチド結合を形成する、または治療タンパク質分子のアルデヒド基が、シアル酸残基のＮ−脱アセチル化５−アミノ基とシッフ塩基を形成する。

あるいは、多糖化合物は、治療タンパク質と、非共有結合様式で会合する。例えば、多糖化合物と薬学的活性化合物は、１つの態様において、疎水性相互作用を介して結合する。他の非共有結合的会合として、静電相互作用が挙げられ、これは反対の電荷のイオンが互いに引き寄せ合うものである。

様々な実施形態において、治療タンパク質は、化学量論的量で、多糖化合物と結合または会合している（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：７、１：８、１：９、または１：１０など）。様々な実施形態において、１〜６、７〜１２、または１３〜２０の多糖類が、血液凝固タンパク質と結合している。さらに他の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多くの多糖類が血液凝固タンパク質と結合している。

様々な実施形態において、治療タンパク質は、修飾によりグリコシル化部位が導入されている（すなわち、生来のグリコシル化部位以外の部位）。そのような修飾は、当該分野で既知の標準分子生物学技法を用いて達成することができる。さらに、治療タンパク質は、１つまたは複数の糖質部分を介して水溶性重合体と結合させる前に、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化することができる。これらのグリコシル化部位は、タンパク質が水溶性重合体と結合するための標的として機能することができる（米国特許出願第２００９００２８８２２号、米国特許出願第２００９／００９３３９９号、米国特許出願第２００９／００８１１８８号、米国特許出願第２００７／０２５４８３６号、米国特許出願第２００６／０１１１２７９号、及びＤｅＦｒｅｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１６，９，８３３−４３）。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでは自然にグリコシル化されないタンパク質（例えば、糖タンパク質ではないタンパク質）を、上記のとおり修飾することができる。

アミノオキシ結合
本発明の１つの実施形態において、ヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体とアルデヒドとの反応（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の糖質部分でのもの）によるオキシム基の形成が、血液凝固タンパク質の結合体の調製に利用される。例えば、糖タンパク質（例えば、本発明による治療タンパク質）は、最初に、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）などの酸化剤で酸化される（Ｒｏｔｈｆｕｓ ＪＡ ｅｔ Ｓｍｉｔｈ ＥＬ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９６３，２３８，１４０２−１０、及びＶａｎ Ｌｅｎｔｅｎ Ｌ ａｎｄ Ａｓｈｗｅｌｌ Ｇ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７１，２４６，１８８９−９４）。糖タンパク質の過ヨウ素酸酸化は、１９２８に記載された古典的Ｍａｌａｐｒａｄｅ反応に基づいており、これは過ヨウ素酸塩で隣接ジオールを酸化することにより活性アルデヒド基を形成する反応である（Ｍａｌａｐｒａｄｅ Ｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｆｒａｎｃｅ，１９２８，４３，６８３−９６）。そのような酸化剤のさらなる例として、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）_４）、酢酸マンガン（ＭｎＯ（Ａｃ）_３）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＯＡｃ）_２）、酢酸タリウム（ＴｌＯＡｃ）、硫酸セリウム（Ｃｅ（ＳＯ_４）_２）（ＵＳ ４，３６７，３０９）、または過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４）がある（Ｍａｒｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９９７，１１９，１２６６１−２）。「酸化剤」は、生理反応条件下で糖質の隣接ジオールを酸化し、それにより活性アルデヒド基を生成することができる、穏やかな酸化化合物を意味する。

第二ステップは、アミノオキシ基を有する重合体を、酸化された糖質部分に結合させて、オキシム結合を形成させることである。本発明の１つの実施形態において、このステップは、触媒量の求核触媒アニリンまたはアニリン誘導体の存在下で行うことができる（Ｄｉｒｋｓｅｎ Ａ ｅｔ Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８、Ｚｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，６，２０７−９）。アニリン触媒は、オキシム結合反応を劇的に加速するので、試薬を非常に低濃度で使用することが可能になる。本発明の例示実施形態において、オキシム結合は、ＮａＣＮＢＨ_３で還元してアルコキシアミン結合を形成させることにより安定化される。さらなる触媒を、以下に記載する。

アミノオキシ技術のさらなる情報は、以下の参考文献に見出すことができ、それぞれ、その全体が援用される：ＥＰ １６８１３０３Ａ１（ＨＡＳ化エリスロポエチン）、ＷＯ ２００５／０１４０２４（オキシム結合基により連結された重合体とタンパク質の結合体）、ＷＯ９６／４０６６２（アミノオキシ含有リンカー化合物及び結合体におけるそれらの使用）、ＷＯ ２００８／０２５８５６（修飾タンパク質）、Ｐｅｒｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９８，５４，１２２６９−７８、Ｋｕｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂ Ｊ ｅｔ．Ｐｏｚｓｇａｙ Ｖ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２００５，７０，６８８７−９０、Ｌｅｅｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２００６，２４（６），７１６−２９、及びＨｅｒｅｄｉａ ＫＬ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｅｃｕｌｅｓ ２００７，４０（１４），４７７２−９。

水溶性重合体をアミノオキシリンカーにカップリングさせる多数の方法が、本開示で企図される。例えば、リンカーの、ＰＳＡなどの水溶性重合体の還元末端または非還元末端いずれかへのカップリングが、本明細書中記載される。カップリング部位（例えば、還元末端か非還元末端）は、結合プロセスの１つまたは複数の条件（例えば、時間及び温度）ならびに水溶性重合体の状態（例えば、未変性か酸化状態）により決定される。１つの実施形態において、ＰＳＡなどの酸化水溶性重合体は、低温（例えば、２〜８℃）でカップリング反応を行うことにより、その非還元末端で、アミノオキシリンカーにカップリングされる。例示実施形態において、ＰＳＡなどの未変性（例えば、非酸化）水溶性重合体は、より高い温度（例えば、２２〜３７℃）でカップリング反応を行うことにより、その還元末端で、アミノオキシリンカーにカップリングされる。上記の実施形態は、以下で及び実施例で、より詳細に説明される。

本明細書中記載されるとおり、酸化ＰＳＡとジアミノオキシリンカーとの反応は、非還元端でのアルデヒド基の「迅速反応」、及び還元端での「緩慢反応」の、２通りの反応を示す。未変性ＰＳＡ（酸化されておらず、活性アルデヒド基を有さない）を、室温で、還元端で反応させた場合、誘導体化ＰＳＡが観察される可能性がある。したがって、様々な実施形態において、ＰＳＡなどの水溶性重合体の還元端での望ましくない副反応を最小限に抑える目的で、ＰＳＡ−アミノオキシリンカー試薬の調製は、２〜８℃の温度で行われる。

本開示の例示実施形態において、未変性ＰＳＡの還元端での誘導体化が提供される。本明細書中記載されるとおり、未変性ＰＳＡ（ＮａＩＯ_４により酸化されておらず、したがって、その非還元端で自由アルデヒド基を有さない）を、室温で、ジアミノオキシリンカーと反応させると、ＰＳＡの還元端での誘導体化が観察される可能性がある。このカップリングは、還元端での開環及びその後のオキシム形成を通じて起こる（上記の実際の副反応及びアミノオキシ−ＰＳＡ試薬に副生成物が存在する原因）。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、上限約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセント（％）の修飾度がもたらされる。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、上限約７０％の修飾度がもたらされる。

例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、約２０％〜約９９％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約２０％〜約１５０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、約３０％〜約９０％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約３０％〜約１４０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、約３０％〜約８０％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約４０％〜約１３０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、約３０％〜約７０％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約５０％〜約１２０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、約３０％〜約６０％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約４０％〜約１１０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、最大約３５％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約５０％〜約１２０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、最大約５４％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約５０％〜約１２０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、最大約５８％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約５０％〜約１２０％高い比活性を得る。例示実施形態において、反応は、未変性ＰＳＡを用いて行われ、最大約７０％の修飾度がもたらされ、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩより約７０％高い比活性を得る。

主生成物として、以下の構造が^１３ＣＮＭＲ分光測定により明らかとなった。

例示実施形態において、ＰＳＡ及びｍＰＳＡは、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、特に好ましくは少なくとも２０のＮ−アセチルノイラミン酸部分（ｎ）を含む。例示実施形態において、ｎは、２〜３００のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含むことができる。例示実施形態において、ｎは、５〜２００のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含むことができる。例示実施形態において、ｎは、１０〜１００のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含むことができる。例示実施形態において、ポリシアル酸は、重合体が約２０ｋＤの分子量を有するように、複数のシアル酸単位を含む。反応は、デキストラン及びデンプンまたは還元端基を有する他の多糖類など、他の糖質に置き換えることが可能である。ｍ−トルイジンまたはアニリンのような求核触媒の使用も企図される。したがって、本明細書中提供されるのは、未変性ＰＳＡ（すなわち先に酸化させない）を用いたアミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製であり、次いで、この試薬を治療タンパク質の化学修飾に用いることができる。

したがって、本開示の様々な実施形態において、非還元端へのカップリングが優先されるジアミノオキシリンカーの酸化ＰＳＡなどの水溶性重合体へのカップリング条件（例えば、２〜８℃のインキュベーション温度）での方法、または１つの代替形態において、還元端へのカップリングが優先されるジアミノオキシリンカーの未変性非酸化ＰＳＡなどの水溶性重合体へのカップリング条件（例えば、室温インキュベーション）での方法が提供される。

本発明の様々な実施形態において、本明細書中記載されるアミノオキシ技術により、治療タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸ）の酸化糖質部分に結合する水溶性重合体として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、糖質、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。

求核触媒
本明細書中記載されるとおり、水溶性重合体の治療タンパク質への結合は、アニリンにより触媒される。アニリンは、アルデヒド及びケトンとアミンが水性条件下で反応して安定なイミン、例えばヒドラゾン及びオキシムなどを形成するのを強く触媒する。以下の図は、無触媒の場合とアニリンに触媒される場合のオキシム結合反応とを比較する（Ｋｏｈｌｅｒ ＪＪ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２００９，１０，２１４７−５０）。

しかしながら、アニリンに関連する多数の健康リスクを考慮すると、代替触媒が望ましい。本発明は、代替オキシム結合触媒としてアニリン誘導体を提供する。そのようなアニリン誘導体として、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、及びｐ−アニシジンが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の１つの実施形態において、ｍ−トルイジン（別名ｍｅｔａ−トルイジン、ｍ−メチルアニリン、３−メチルアニリン、または３−アミノ−１−メチルベンゼン）を用いて、本明細書中記載される結合反応を触媒する。ｍ−トルイジンとアニリンは、同様な物性を有し、本質的に同じｐＫａ値を有する（ｍ−トルイジン：ｐＫａ４．７３、アニリン：ｐＫａ４．６３）。

本発明の求核触媒は、オキシム結合（例えば、アミノオキシ結合を用いて）またはヒドラゾン形成（例えば、ヒドラジド化学反応を用いて）に有用である。本発明の様々な実施形態において、求核触媒は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ｍＭの濃度で結合反応に提供される。１つの実施形態において、求核触媒は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの量で提供される。本発明の様々な実施形態において、結合反応混合物のｐＨは、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、及び約７．５である。１つの実施形態において、ｐＨは、約５．５〜約６．５である。

結合型タンパク質の精製
様々な実施形態において、本開示に従って、酸化剤とともにインキュベートされたタンパク質及び／または水溶性重合体に結合した治療タンパク質の精製が望まれる。多数の精製技法が、当該分野で既知であり、そのような方法として、特に限定せずに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、またはそれらの組み合わせ、濾過方法（例えば、ＵＦ／ＤＦ）、及び沈殿方法、ならびに透析手法、ならびに上記技法の任意の組み合わせが挙げられる（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４６３（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｕｒｇｅｓｓ ＲＲ ａｎｄ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ＭＰ），２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ２００９）。

有効性
様々な実施形態において、マウスモデルを用いて、半減期有効性を評価することができる。例示実施形態において、マウスモデルを用いて、ＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することを明らかにする。例示実施形態において、マウスモデルを用いて、約２０ｋＤａの平均分子量を有するＰＳＡ部分と結合させた修飾ＦＶＩＩＩが、約２０ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ部分と結合させたＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することを明らかにする。例示実施形態において、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの尾切り落とし出血モデルを用いて、ＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することを明らかにする。例示実施形態において、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの頸動脈閉塞モデルを用いて、ＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することを明らかにする。例示実施形態において、血友病性関節出血のマウスモデル（関節内穿刺）を用いて、ＰＳＡ修飾ＦＶＩＩＩがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することを明らかにする。

以下の実施例は、本発明を制限することを意図するのではなく、本発明の具体的な実施形態を例示するにすぎない。

実施例１
ホモ二官能性リンカーＮＨ _２ ［ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ］ _２ ＯＮＨ _２ の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_２ＯＮＨ_２

２つの活性アミノオキシ基を有する（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン）を、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７，５３，５４８５−９２）に従って、第一級アミンのガブリエル合成変法を用いる２ステップ有機反応で合成した。第一ステップでは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、２，２−クロロジエチルエーテルの１分子を、ｅｎｄｏ−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドの２分子と反応させた。得られた中間体を、エタノール中でヒドラジン分解して、所望のホモ二官能性を調製した。

実施例２
ホモ二官能性リンカーＮＨ _２ ［ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ］ _４ ＯＮＨ _２ の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_４ＯＮＨ_２

２つの活性アミノオキシ基を有する（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）を、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７，５３，５４８５−９２）に従って、第一級アミンのガブリエル合成変法を用いる２ステップ有機反応で合成した。第一ステップでは、ＤＭＦ中、ビス−（２−（２−クロロエトキシ）−エチル）−エーテルの１分子を、ｅｎｄｏ−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド２分子と反応させた。得られた中間体を、エタノール中でヒドラジン分解して、所望のホモ二官能性を調製した。

実施例３
ホモ二官能性リンカーＮＨ _２ ［ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ］ _６ ＯＮＨ _２ の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_６ＯＮＨ_２

２つの活性アミノオキシ基を有する（３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン）を、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７，５３，５４８５−９２）に従って、第一級アミンのガブリエル合成変法を用いる２ステップ有機反応で合成した。第一ステップでは、ＤＭＦ中、二塩化ヘキサエチレングリコールの１分子を、ｅｎｄｏ−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドの２分子と反応させた。得られた中間体を、エタノール中でヒドラジン分解して、所望のホモ二官能性を調製した。

実施例４
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の合成の詳細
３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７，５３，５４８５−９２）に従って、実施例１に概説したとおりの２ステップ有機反応で合成した。

ステップ１：
ｅｎｄｏ−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（５９．０ｇ、１．００当量）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド７００ｍＬに溶解させた溶液に、無水Ｋ_２ＣＯ_３（４５．５１ｇ、１．００当量）及び２，２−ジクロロジエチルエーテル（１５．８４ｍＬ、０．４１当量）を加えた。反応混合物を、５０℃で２２時間攪拌した。混合物を減圧下で濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン２Ｌに懸濁させ、飽和ＮａＣｌ水溶液（毎回１Ｌ）で２回抽出した。ジクロロメタン層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、次いで、減圧下で濃縮乾固し、高真空で乾燥させて、３−オキサペンタン−１，５−ジオキシ−ｅｎｄｏ−２’，３’−ジカルボキシジイミドノルボルネン６４．５ｇを、白黄色固体として得た（中間体１）。

ステップ２：
中間体１（６４．２５ｇ、１．００当量）を無水エタノール８００ｍＬに溶解させた溶液に、ヒドラジン水和物３１．０ｍＬ（４．２６当量）を加えた。次いで、反応混合物を２時間還流させた。溶媒の減圧蒸留により、混合物を濃縮して出発体積の半分にした。生じた沈殿を濾別した。残ったエタノール層を、減圧下で濃縮乾固した。粗生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを含有する残渣を真空乾燥させて、４６．３ｇとした。粗生成物を、さらに、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０、ジクロロメタン／メタノール混合液、９／１を用いた均一溶媒溶出）で精製して、純粋な最終生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン１１．７ｇを得た。

実施例５
アミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）１０００ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１６ｍＬに溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン１７０ｍｇを、反応混合物に加えた。室温で２時間振盪した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム７８．５ｍｇを加え、一晩、１８時間反応を進行させた。次いで、反応混合物を、５ｋＤカットオフの再生セルロース製膜（５０ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、限外濾過／透析濾過手順（ＵＦ／ＤＦ）に供した。

実施例６
クロマトグラフィー精製ステップを用いるアミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）１２９０ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２５ｍＬ（緩衝液Ａ）に溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン２０９ｍｇを、反応混合物に加えた。室温で１時間振盪した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１０１ｍｇを加え、３時間、反応を進行させた。次いで、反応混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィーゲル（カラム寸法：ＸＫ２６／１３５）を用いる弱アニオン交換クロマトグラフィーステップに供した。反応混合物を、１１０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＤＥＡＥカラムに、流速１ｃｍ／分で添加した。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で流速２ｃｍ／分で洗浄し、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン及びシアニドを除去した。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％緩衝液Ｂ及び４３％緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなる段階的勾配で溶出させた。溶離液を、ポリエーテルスルホン製５ｋＤ膜（５０ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＵＦ／ＤＦで濃縮した。最終透析濾過ステップは、緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行った。調製物を、総ＰＳＡ（レソルシノールアッセイ）及び総アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾度を求めることで、特性分析した。さらに、多分散度ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン及びシアニドを求めた。

実施例７
還元ステップのないアミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）５７３ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１１．３ｍＬ（緩衝液Ａ）に溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン９４ｍｇを、反応混合物に加えた。室温で５時間振盪した後、次いで、反応混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィーゲル（カラム寸法：ＸＫ１６／１０５）を用いる弱アニオン交換クロマトグラフィーステップに供した。反応混合物を、５０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＤＥＡＥカラムに、流速１ｃｍ／分で添加した。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で流速２ｃｍ／分で洗浄し、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン及びシアニドを除去した。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％緩衝液Ｂ及び４３％緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなる段階的勾配で溶出させた。溶離液を、ポリエーテルスルホン製５ｋＤ膜（５０ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＵＦ／ＤＦで濃縮した。最終透析濾過ステップは、緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行った。調製物を、総ＰＳＡ（レソルシノールアッセイ）及び総アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾度を求めることで、特性分析した。さらに、多分散度ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１、５−ジオキシアミン及びシアニドを求めた。

実施例８
還元ステップがなく求核触媒ｍ−トルイジンの存在下で行われるアミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）５７３ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９ｍＬ（緩衝液Ａ）に溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン９４ｍｇを、この溶液に加えた。続いて５０ｍＭのｍ−トルイジン原液２．３ｍＬをこの反応混合物に加えた。室温で２時間振盪した後、次いで、混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィーゲル（カラム寸法：ＸＫ１６／１０５）を用いる弱アニオン交換クロマトグラフィーステップに供した。反応混合物を、５０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＤＥＡＥカラムに、流速１ｃｍ／分で添加した。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で流速２ｃｍ／分で洗浄し、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン及びシアニドを除去した。アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％緩衝液Ｂ及び４３％緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなる段階的勾配で溶出させた。溶離液を、ポリエーテルスルホン製５ｋＤ膜（５０ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＵＦ／ＤＦで濃縮した。最終透析濾過ステップは、緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行った。調製物を、総ＰＳＡ（レソルシノールアッセイ）及び総アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾度を求めることで、特性分析した。さらに、多分散度ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン及びシアニドを求めた。

実施例９
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製
実施例４〜８に従って、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を調製した。透析濾過後、生成物を−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試薬を適切な体積の水に溶解させて、糖質修飾を介したＰＳＡ−タンパク質結合体の調製に使用した。

実施例１０
アミノオキシ−ＰＳＡ及び求核触媒としてｍ−トルイジンを用いるｒＦＶＩＩＩのポリシアル酸化
方法１：
５０ｍｇのｒＦＶＩＩＩを反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し入れ、希釈してタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬとした。この溶液に、ＮａＩＯ_４を加えて、最終濃度２００μＭとした。酸化は、暗所で、穏やかに振盪しながら、室温で３０分間行った。次いで、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を用いて、室温で６０分間反応をクエンチした。溶液を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．０）で平衡化させた体積２０ｍＬのＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供した。カラムは、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化させた。次いで、酸化ｒＦＶＩＩＩを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出させた。ｒＦＶＩＩＩ含有画分を収集した。タンパク質含有量を求め（クーマシー、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌを滴下してｐＨ６．０に調整した。次いで、分子量が２０ｋＤのアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上記のもの）を５０倍モル過剰で加え、続いて求核触媒としてｍ−トルイジンを加えた（最終濃度：１０ｍＭ）。カップリング反応は、暗所で、穏やかに振盪しながら、室温で２時間行った。過剰のアミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、ＨＩＣにより除去した。酢酸アンモニウム含有緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を加えることにより、反応混合物の電気伝導率を１３０ｍＳ／ｃｍに上昇させ、８０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ）を充填したカラムに添加した。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。続いて、結合体を、５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出させた。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ含有画分を収集し、再生セルロース製の３０ｋＤ膜（８８ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＵＦ／ＤＦに供した。調製物を、総タンパク質（クーマシー、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）及びＦＶＩＩＩ発色活性を測定することで、特性分析した。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩと比べて７０％超の比活性を示すことが明らかとなった。

方法２：
Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４）中の組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）５８ｍｇを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に溶解させて、最終タンパク質濃度を１．０±０．２５ｍｇ／ｍＬとする。次いで、０．５ＮのＨＣｌ水溶液を滴下することにより、溶液のｐＨを、６．０に補正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１０分以内で加え、濃度２００μＭとする。酸化反応を、Ｔ＝＋２２±２℃の温度（Ｔ）で、３０±５分間行う。次いでＬ−システイン水溶液（１Ｍ）をＴ＝＋２２±２℃で、１５分以内で加えて、反応混合物中の最終濃度を１０ｍＭとすること及び６０±５分間のインキュベーションにより反応を停止させる。

酸化ｒＦＶＩＩＩを、ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）でのアニオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製する。混合物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．５）で希釈して、電気伝導率を５ｍｓ／ｃｍとする。この溶液を、カラム体積１０ｍＬのＩＥＸカラム（床高さ：５．４ｃｍ）に、流速１．５ｃｍ／分で添加する。続いて、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の９２：８混合物（ｗ／ｗ）を５ＣＶ用いて、このカラムを洗浄する（流速：１．５ｃｍ／分）。次いで、酸化ｒＦＶＩＩＩを、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（ｗ／ｗ）混合物で溶出させ、続いて緩衝液Ｂを５ＣＶ用いて後溶出ステップを行う。溶出ステップは、流速１．０ｃｍ／分で行う。

続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ_２）試薬を、５０倍モル過剰で、精製酸化ｒＦＶＩＩＩを含有する溶離液に、穏やかな攪拌下、最大１５分の長さの時間（ｔ）以内で加える。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で加え、最終濃度１０ｍＭとする。反応混合物を、１２０±１０分間、暗所で、温度（Ｔ）Ｔ＝＋２２±２℃で穏やかな攪拌下、インキュベートする。

得られるＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製する。このクロマトグラフィーで使用するのは、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｌｏｗ ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のカラムに床高さ（ｈ）１５ｃｍで充填したもので、その結果カラム体積（ＣＶ）は８１ｍＬである。

反応混合物に、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウムを含有、ｐＨ６．９）を加えることにより、酢酸アンモニウムを加える。２体積分の反応混合物を、１体積分の酢酸アンモニウム含有緩衝液系と混合し、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液を滴下することにより、ｐＨ値をｐＨ６．９に補正する。この混合物を、流速１ｃｍ／分でＨＩＣカラムに添加し、続いて３ＣＶ超の平衡緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を用いて洗浄ステップを行う。

反応副生成物及びアンチカオトロピック塩を除去するため、第二洗浄ステップを、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を上向流様式で流速２ｃｍ／分で用いて行う。次いで、精製ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の溶出を、下向流様式で、４０％洗浄液緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）及び６０％溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）の段階的勾配を用いて流速１ｃｍ／分で行う。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、結合体含有溶離液を、４ＣＶ未満以内で収集する。後溶出ステップを、同一条件下、３ＣＶ超の溶出緩衝液で行い、低及び／または非修飾ｒＦＶＩＩＩを主生成物から分離する。

最後に、精製結合体を、分子量カットオフが３０ｋＤである再生セルロース製膜（８８ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により濃縮する。

この手順を用いて調製した結合体を、総タンパク質、ＦＶＩＩＩ発色活性について測定し、かつＰＳＡ含有量（レソルシノールアッセイ）を測定することによりポリシアル酸化度を求めることで、特性分析する。得られる結合体について、比活性５０％超及びＰＳＡ度５．０超と計算される。

方法３：
５０ｍｇのｒＦＶＩＩＩを反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し入れ、希釈してタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬとした。分子量が２０ｋＤのアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上記のもの）を５０倍モル過剰で加え、続いて求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）及びＮａＩＯ_４（最終濃度：４００μＭ）を加えた。カップリング反応は、暗所で、穏やかに攪拌しながら、室温で２時間行った。続いて、システインを用いて、室温で６０分間反応をクエンチした（最終濃度：１０ｍＭ）。次いで、酢酸アンモニウム含有緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を加えることにより、反応混合物の電気伝導率を１３０ｍＳ／ｃｍに上昇させ、８０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＣＴ）を充填したカラムに添加した。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。続いて、結合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出させた。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ含有画分を収集し、再生セルロース製の３０ｋＤ膜（８８ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＵＦ／ＤＦに供した。調製物を、合計タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）及びＦＶＩＩＩ発色活性を測定することで、特性分析した。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体は、未変性ｒＦＶＩＩＩと比べて７０％以上の比活性であることが明らかとなった。

方法４：
５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４）中の組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）５０ｍｇを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に溶解させて、最終タンパク質濃度を１．０±０．２５ｍｇ／ｍＬとした。次いで、０．５ＮのＨＣｌ水溶液を滴下することにより、溶液のｐＨを、６．０に補正した。

続いて、このｒＦＶＩＩＩ溶液に、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ_２）試薬を５０倍モル過剰で、穏やかな攪拌下、最大１５分の長さの時間（ｔ）以内で加えた。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で加え、最終濃度１０ｍＭとした。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を加え、濃度を４００μＭとした。

反応混合物を、暗所で、温度（Ｔ）Ｔ＝＋２２±２℃で穏やかな攪拌下、１２０±１０分間インキュベートした。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）を加えて反応混合物中の最終濃度を１０ｍＭとすること及び６０±５分間のインキュベーションにより反応を停止させた。

得られたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製した。このクロマトグラフィーで使用したのは、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｌｏｗ ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のカラムに床高さ（ｈ）１５ｃｍで充填したもので、その結果カラム体積（ＣＶ）は８１ｍＬであった。

反応混合物に、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウムを含有、ｐＨ６．９）を加えることにより、酢酸アンモニウムを加えた。２体積分の反応混合物を、１体積分の酢酸アンモニウム含有緩衝液系と混合し、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液を滴下することにより、ｐＨ値をｐＨ６．９に補正した。この混合物を、流速１ｃｍ／分でＨＩＣカラムに添加し、続いて３ＣＶ超の平衡緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を用いて洗浄ステップを行った。

反応副生成物及びアンチカオトロピック塩を除去するため、第二洗浄ステップを、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を上向流様式で流速２ｃｍ／分で用いて行った。次いで、精製ｒＦＶＩＩＩ結合体の溶出を、下向流様式で、４０％洗浄液緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）及び６０％溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）の段階的勾配を用いて流速１ｃｍ／分で行った。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、結合体含有溶離液を、４ＣＶ未満以内で収集した。後溶出ステップを、同一条件下、３ＣＶ超の溶出緩衝液で行い、少量及び／または非修飾ｒＦＶＩＩＩを主生成物から分離した。

最後に、精製結合体を、分子量カットオフが３０ｋＤである再生セルロース製膜（８８ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により濃縮した。

この手順を用いて調製した結合体を、総タンパク質、ＦＶＩＩＩ発色活性の測定、及びＰＳＡ含有量（レソルシノールアッセイ）の測定によるポリシアル酸化度の測定により、特性分析した。
分析データ（６つの連続バッチの平均）：
プロセス収率（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）：５８．９％
プロセス収率（ＦＶＩＩＩクロマトグラフィー）：４６．４％
比活性：（ＦＶＩＩＩクロマトグラフィー／ｍｇタンパク質）：４１４８ＩＵ／ｍｇ
比活性（出発物質に対する割合（％））：７９．９％
ＰＳＡ度（ｍｏｌ／ｍｏｌ）：８．１

実施例１１
ジアミノオキシリンカーの未変性ＰＳＡへのカップリング
この実施例は、未変性ＰＳＡ（すなわち先に酸化されていない）を用いたアミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製手順を記載し、この試薬は、治療タンパク質の化学修飾に用いることができる。

ａ）周辺温度でのカップリング
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した未変性ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）５２．２ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．０５ｍＬに溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン（リンカー分子）１０．３ｍｇを、反応混合物に滴下した。反応物を、暗所で、穏やかに振盪しながら、室温で２時間インキュベートした。

ｂ）上昇した温度でのカップリング
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した未変性ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）５２．２ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．０５ｍＬに溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン（リンカー分子）１０．３ｍｇを、反応混合物に滴下した。反応物を、暗所で、穏やかに振盪しながら、室温で２時間インキュベートした。次いで、温度を３２〜３７℃に上昇させ、反応混合物をさらに１４時間インキュベートした。

ｃ）上昇した温度及び上昇したリンカー過剰率でのカップリング
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した未変性ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）５２．２ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．０５ｍＬに溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン（リンカー分子）１０．３ｍｇを、反応混合物に滴下した。反応物を、暗所で、穏やかに振盪しながら、室温で２時間インキュベートした。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン２６．３ｍｇを反応物に滴下し、温度を３２〜３７℃に上昇させ、反応混合物をさらに１４時間インキュベートした。

ｄ）ＰＳＡ誘導体の精製
インキュベーション完了後、ａ〜ｃ各時点で生成した反応混合物を、徹底した透析により精製した。そのため、反応混合物の試料を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（０−５−３ｍＬ、ＭＷＣＯ３．５ｋＤ、再生セルロース、Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、以下のパターンに従って１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した：
緩衝液５００ｍＬに対して室温で２時間；
緩衝液５００ｍＬに対して室温で２時間；
緩衝液５００ｍＬに対して４℃で１２時間；
最初の試料体積まで濃縮するため、「透析用Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ濃縮溶液」５０ｍＬに対して室温で１時間。

精製したアミノオキシ−ＰＳＡは、こうして、例えば、上記実施例１１、１２、１４、及び１７〜３１に従って、タンパク質結合反応にすぐに使えるようになる。同様に、本明細書中記載される水溶性重合体のどれでも、この実施例に記載されるとおりにアミノオキシリンカーにカップリングさせ、次いで上記実施例に記載されるとおりタンパク質に結合させることができる。

調製物を、総ＰＳＡ（レソルシノールアッセイ）及び総アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定して修飾度を求めることにより、特性分析した。調製物（ａ）の場合、修飾度（ＭＤ）は０．３５、（ｂ）の場合、ＭＤ＝０．５４、（ｃ）の場合、ＭＤ＝０．５８と判明した。その上さらに、多分散度ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを測定した。多分散度は、すべての調製について１．１５未満であり、遊離リンカーの含有量は、ＰＳＡ濃度の０．１５ｍｏｌ％未満であった。

還元端で修飾されたＰＳＡについては、^１３Ｃ ＮＭＲ分光分析により、以下の構造が判明した。

実施例１２
クロマトグラフィー精製ステップを用いる４℃でのアミノオキシ−ＰＳＡの調製
室温で調製したアミノオキシ−ＰＳＡ試薬の詳細分析による特性決定の間に、ＮＭＲ試験（例えば、米国仮出願第６１／６４７，８１４号を参照、その全体が参照により援用される）により、ジアミノオキシリンカーによる酸化ＰＳＡの誘導体化は、ＰＳＡの非還元端でのアルデヒド基の迅速反応及びＰＳＡの還元端でのアルデヒド基（ヘミケタール形での）の緩慢反応の、２つの別々の反応からなることが明らかとなった。後者の反応は、試薬製造では回避すべき望ましくない副反応と見なされる可能性がある。

したがって、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製プロセスを、本実施例で記載されるとおりに最適化した。プロセスを室温で行う場合、還元端のみが相当に生じる。そのため、プロセスを調整し、２〜８℃で行った。全プロセス（ＩＥＸによるＰＳＡ試薬の化学反応及び精製）を２〜８℃で行うことにより、ＰＳＡの還元端での副反応は、相当減少した。したがって、このプロセス変更は、より高品質の試薬をもたらす。

手順
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）１２９０ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２５ｍＬ（緩衝液Ａ）に溶解させた。次いで、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン２０９ｍｇを反応混合物に加え、暗所で、穏やかに振盪しながら、２〜８℃で、１時間インキュベートした。

インキュベーション後、混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィーゲル（カラム寸法：ＸＫ２６／１３５）を用いて弱アニオン交換クロマトグラフィーステップに供した。このステップは、温度２〜８℃の冷蔵室で行われた。反応混合物を、予め冷やした緩衝液Ａ（１１０ｍＬ）で希釈し、緩衝液Ａで予め平衡化したＤＥＡＥカラムに、流速１ｃｍ／分で添加した。次いで、カラムを、２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で、流速２ｃｍ／分で洗浄し、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを除去した。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％緩衝液Ｂ及び４３％緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなる段階的勾配で溶出させた。溶離液を、ポリエーテルスルホン製５ｋＤ膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＵＦ／ＤＦにより濃縮した。調製物を、総ＰＳＡ（レソルシノールアッセイ）及び総アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定して修飾度を求めることにより、特性分析した。最終調製物のＰＳＡ濃度は、４６．０ｍｇ／ｍＬであり、修飾度は８３．５％であった。その上さらに、多分散度は、１．１３１であると判明した、また、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンについて、濃度は０．２２μｇ／ｍＬ（ＰＳＡの０．０７ｍｏｌ％）と測定された。

精製したアミノオキシ−ＰＳＡは、こうして、上記実施例１１、１２、１４、及び１７〜３１に従って、結合反応にすぐに使えるようになる。

実施例１３
ポリシアル酸化ｒＦＶＩＩＩの合成（大規模）
実施例９で概説した方法に多少の変更を加えて、ｒＦＶＩＩＩのポリシアル酸化を大規模で行った。この目的のため、１．５ｇのｒＦＶＩＩＩを、記載されるとおりＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中でポリシアル酸化した（タンパク質濃度：１．１ｍｇ／ｍＬ、蛍光アッセイにより測定）。次いで、生成物を、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｌｏｗ ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製した。次いで、溶離液を、分子量カットオフが３０ｋＤの再生セルロース製膜を用いて、限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により濃縮した。次いで、濃縮物を、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ 分取グレード／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。この手順を、生成物から潜在不純物を分離する最終精製ステップとして用いる。最後に、精製した結合体（「ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ」）を、ＵＦ／ＤＦ（再生セルロース／分子量カットオフ３０ｋＤ）により再度濃縮した。この方法を用いて、ＢＤＳを、ＧＭＰ条件下で調製して、第Ｉ相臨床試験に使用するための材料を製造した：ロットＤ、ロットＥ、及びロットＦ。

実施例１４
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ結合親和性の測定
以下のとおりＢｉａｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ結合親和性を分析した。

血漿由来ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、３種類の密度で、ＣＭ５バイオセンサーチップのフローセルに固定した。治験用ＦＶＩＩＩ試料を、泳動緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）で希釈して、５種の希釈液の系列（所定のタンパク質値により０．１８〜５ｎＭのＦＶＩＩＩ）にし、次いで、「シングルサイクル」モードを用いて５０μＬ／分の一定流速でチップに添加した。会合用の時間は４分であり、解離用の時間は１０分であった。各サイクル後、ＦＶＩＩＩをチップから除去し（「再生」）、新たなＦＶＩＩＩ試料で実験を繰り返した。「Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」プログラムのラングミュアモデルを用いて、会合定数及び解離定数を求めた。以下の動態パラメーターが求められた：会合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤ。結合は、Ｒ_ｍａｘ、すなわち飽和で計算された最大結合を評価することによっても求めた。３種の異なるＶＷＦ固定レベルの平均から動態学的結果を計算した。

Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いて、ＶＷＦとＦＶＩＩＩの間の複合体形成の動態を求めた。この目的のため、血漿由来ＶＷＦを、センサーチップ表面に３種の異なるレベルで固定し、治験用ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及びｒＦＶＩＩＩを、上記の実施例１３に記載される緩衝液に加えて再緩衝化した（「再緩衝化ＦＶＩＩＩ」）。試料を、５種の異なる濃度で、シングルサイクルモードで注入した。固定されたＶＷＦとＦＶＩＩＩの間には均質な１：１相互作用があると仮定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置の「Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」プログラムのラングミュアモデルを用いて、会合定数及び解離定数を求めた。

表１に、ＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ相互作用を説明する動態パラメーターをまとめるが、ｋａは、会合速度定数であり、ｋｄは解離速度定数であり、ＫＤは平衡解離定数（＝ｋｄ／ｋａ）である。さらなる評価及びデータ比較のため、ＫＤについて、様々な試料群の平均及び３ＳＤを計算した。

（表１）VWF-FVIII 結合の動態パラメーター

相互作用動態は、前臨床ＢＤＳバッチ（平均ＫＤ０．２８ｎＭ）と第Ｉ相臨床試験ＢＤＳバッチ（平均ＫＤ０．２８ｎＭ）の間で、及び前臨床ＦＤＰバッチ（平均ＫＤ０．３１ｎＭ）と第Ｉ相臨床試験ＦＤＰロット（ＫＤ０．３７ｎＭ）の間で同様であった。再緩衝化ｒＦＶＩＩＩについては、ＫＤ値は、０．２６〜０．３７ｎＭの範囲にあり、したがって、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩに匹敵するものであった。

図１は、３種の異なる密度のセンサーチップ固定ＶＷＦで、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ群及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩについて、Ｒ_ｍａｘで表した結合シグナルを示し、Ｒ_ｍａｘは、計算された飽和における最大結合である。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩは両方ともＶＷＦ濃度依存相互作用を示し、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ前臨床と臨床試験のＢＤＳ及びＦＤＰバッチとの間に関連する差はなかった。再緩衝化ｒＦＶＩＩＩと比較すると、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの結合は、約５０％と大幅に減少した。これは、ｒＦＶＩＩＩをＰＳＡ修飾した結果であり、この修飾は、ＶＷＦの特異的結合エピトープがＰＳＡにより遮蔽されるｒＦＶＩＩＩ結合体をもたらすと判断された。

興味深いことに、また、再緩衝化ｒＦＶＩＩＩと比較してＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩで観測された上記の結合性とは異なり、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩタンパク質）もＶＷＦに対する結合の減少を示したが、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩほど明白ではなかった。

実施例１５
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１受容体相互作用の測定
ＬＲＰ１（α２−マクログロブリン受容体／ＣＤ９１）受容体（ＢｉｏＭａｃ、Ｌｅｉｐｚｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、説明書に従って、一定レベルで、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のＣＭ４センサーチップのフローセルに固定した。次いで、治験用ＦＶＩＩＩ試料の系列希釈物（２１〜３５７ｎＭ、所定のタンパク質値に従って）を、「ｋｉｎｊｅｃｔ」モードを用いてチップに添加し、ＦＶＩＩＩの会合用に１０分間及び解離用に５分間の時間をとった。各サイクル後、ＦＶＩＩＩをチップから除去し（「再生」）、新たなＦＶＩＩＩ試料で実験を繰り返した。均質な１：１相互作用と仮定して、「Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」プログラムのラングミュアモデルを用いて、会合定数及び解離定数を求めた。以下の動態パラメーターが求められた：会合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤ。結合は、結合段階後のシグナル（反応単位）を測定することによっても評価した。３種の異なるフローセルの平均から動態学的結果を計算した。

クリアランス受容体ＬＲＰ１に対するＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの結合親和性を、上記のとおりＢｉａｃｏｒｅ技術を用いて求めた。結合は、１０から１００μｇ／ｍＬ（２１〜３５７ｎＭに相当）まで希釈した試料の系列希釈物で試験した。したがって、分析は、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ ＢＤＳバッチ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩについては可能であったが、ＦＤＰロットについては、それらの試料のタンパク質濃度が低かったため不可能であった。以下のパラメーターを求めた：ｋａは、会合速度定数であり、ｋｄは解離速度定数であり、ＫＤは平衡解離定数（＝ｋｄ／ｋａ）である。さらなる評価及びデータ比較のため、ＫＤについて、様々な試料群の平均及び３ＳＤを計算した。

表２に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ前臨床と第Ｉ相臨床試験ＢＤＳとの相互作用及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩとＬＲＰ１受容体との相互作用の動態パラメーターをまとめる。相互作用の動態は、前臨床（平均ＫＤ）と第Ｉ相臨床試験ＢＤＳバッチ（平均ＫＤ）との間で同様であった。さらに、結合動態は、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩと再緩衝化ｒＦＶＩＩＩとの間で同様であった。表面プラズモン共鳴アッセイは一般にばらつきが大きく、また動態結合パラメーターの評価であるため、複数の試料間でのＫＤのばらつきは、生物学的に関連性があるものとはみなされず、まとめると、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ前臨床と第Ｉ相臨床試験バッチとは同様な性質を持つことが確認された。

（表２）ＬＲＰ１−ＦＶＩＩＩ結合の動態パラメーター

図２は、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩについて及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩについてＬＲＰ１に対するＦＶＩＩＩタンパク質濃度依存結合の結果を示す。ＦＶＩＩＩタンパク質濃度を、反応単位で表した結合シグナルに対してプロットした。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩは、両方とも、ＦＶＩＩＩ濃度依存相互作用を示し、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの前臨床と第Ｉ相臨床試験ＢＤＳバッチとの間に関連する差はなかった。再緩衝化ｒＦＶＩＩＩと比べて、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの結合は、目立って減少した。これは、ｒＦＶＩＩＩがＰＳＡ修飾された結果であり、この修飾は、ＬＲＰ１の特異的結合エピトープがＰＳＡにより遮蔽されるｒＦＶＩＩＩ結合体をもたらすと判断された。

興味深いことに、ｒＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ、及びＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの結合活性を比較すると、ｒＦＶＩＩＩは、ＬＲＰ１と強く結合し、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩは、ＬＲＰ１との残留会合を示し、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩは、事実上、ＬＲＰ１と会合できなかったということを示す（図３）。

実施例１６
ＦＩＸａ補因子活性の測定
ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのテンナーゼ複合体内のＦＶＩＩＩのＦＩＸａ補因子活性を、ＦＩＸａ補因子活性アッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。このアッセイは、ＦＸａ生成の動態性質に詳細な洞察を提供する。試料を、それらの所定の力価に従って１．０ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性に希釈し、トロンビン活性後のＦＸａ生成の経時的過程を測定した。

図４は、トロンビンによるＦＶＩＩＩ活性化後のＦＸａ生成を経時的に示す。全てのＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩバッチは、時間依存性ＦＸａ生成を示し、バッチ間にはわずかな差しかなかった（図４、パネルＡ〜Ｄ）。群の平均の比較（図４、パネルＥ）から、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ前臨床ならびに第Ｉ相臨床試験ＢＤＳ及びＦＤＰバッチは、同様な性質を有することが確認された。再緩衝化ｒＦＶＩＩＩとＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの間でＦＸａ生成曲線にいくつかの差が観測され（図４、パネルＥ）、例えば再緩衝化ｒＦＶＩＩＩの方が、わずかに低いＦＸａ生成の最大値を示した。

定量的基準に基づいて種々の試料群間の同等性を評価するため、ＦＸ活性化の最大速度を、生成曲線の直線部分の傾きを求めることにより計算した。結果を表３に示す。直接比較用の、個々のバッチ間の相対差及び前臨床ＢＤＳまたはＦＤＰバッチの算術平均（表４）。個々の第Ｉ相臨床試験ＢＤＳバッチ間の相対差及び前臨床ＢＤＳバッチの平均は１１％以下であったので、これにより、２つの試料群の同等性が確認される。第Ｉ相臨床試験ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ ＦＤＰと前臨床ＦＤＰの平均の間の差は１１％以下であったので、これもまたそれらの同様な特性を実証する。種々のＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ群と再緩衝化ｒＦＶＩＩＩの平均との間の相対比較を、表５に示す。差は６％以下であったので、すなわち、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩは、ＦＸａ生成に同様な動態性質を有することが実証された。

（表３）トロンビンによるＦＶＩＩＩ前活性化後のＦＸａ生成パラメーター

（表４）ＦＸａ生成パラメーター：前臨床ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ ＢＤＳ及びＦＤＰバッチの平均に対する相対差

（表５）ＦＸａ生成パラメーター：ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ群と再緩衝化ｒＦＶＩＩＩの間の相対差

実施例１７
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）
ＴＧＡは、血友病Ａ患者の状況に似た環境でトロンビン生成を調べる具体的な手法である。ＦＶＩＩＩを１％未満含有するヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩを漸増量で（０．０１から１ＩＵ／ｍＬ、それらの所定の力価に基づく）補充した。リン脂質ミセルと複合体化した組換えヒト組織因子を少量、血漿に加えて、小血管壁損傷を刺激することにより、反応を開始した。

トロンビン生成は、曲線のピークトロンビンの濃度依存性増加を比較することにより、評価した（図５）。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩは、両方とも、ピークトロンビンのＦＶＩＩＩ濃度依存性増加を示し、個々のバッチ間のばらつきはわずかしかなかった（図５、パネルＡ〜Ｄ）。群平均の比較（図５、パネルＥ）から、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ前臨床ならびに第Ｉ相臨床試験ＢＤＳ及びＦＤＰバッチは、同様な性質を持つことが確認された。ピークトロンビン生成の差は、再緩衝化ｒＦＶＩＩＩとＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの間で観察された（図５、パネルＥ）。

より徹底した評価のため、定量比較を行った。表６に、試験した異なるＦＶＩＩＩ濃度で測定されたピークトロンビン値をまとめる。試料は、それぞれについてピークトロンビンの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより、比較分析した。さらに、個々のＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ第Ｉ相臨床試験ＢＤＳ／ＦＤＰバッチのピークトロンビン値のＡＵＣ及び前臨床ＢＤＳ／ＦＤＰバッチの算術平均について、相対差を計算した。

個々の第Ｉ相臨床試験ＢＤＳバッチの値と前臨床ＢＤＳバッチ平均の相対差は９％以下であったので、これにより、２つの試料群間の同等性が確認される。第Ｉ相臨床試験ＦＤＰについては、前臨床ＦＤＰの平均との差が４％以下であったので、同じく高い類似特性を示した。

ピークトロンビン生成曲線（図５）の評価は、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩよりも再緩衝化ｒＦＶＩＩＩの方がわずかに高いトロンビン生成であることを示した。複数のＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ群で計算されたＡＵＣ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩの平均の相対差が１４％以下であったので、この結果は、関連性の低いものであり、実際の生理学的に関連した差によるよりもアッセイ固有のばらつきに関連すると見なされた。

トロンビン生成を、総トロンビン生成を求めることにより、さらに評価した。調査したＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ及び再緩衝化ｒＦＶＩＩＩＢＤＳの試料全てが、合計トロンビン生成に同様なＦＶＩＩＩ濃度依存性増加を示し、群間の差はわずかであった（図６）。ピークトロンビン生成と比べて、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩと再緩衝化ｒＦＶＩＩＩの間の差は、さらにもっと小さかった。

（表６）ＦＶＩＩＩバッチの濃度依存性ピークトロンビン増加能力

（表７）ピークトロンビン生成能力−平均前臨床ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩＢＤＳ及びＦＤＰバッチに対する相対差

（表８）ピークトロンビン生成能力−ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ群と再緩衝化ｒＦＶＩＩＩとの間の相対差

実施例１８
血友病マウスにおけるＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ、及びｒＦＶＩＩＩの薬物動態の比較
ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ、及びｒＦＶＩＩＩの薬物動態を、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスで測定した。ＦＶＩＩＩを２００ＩＵ／体重ｋｇで、尾静脈から注射した。１群６匹のマウスからなる各群のマウスを、所定の時点で屠殺し、クエン酸血漿を調製する。血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、発色活性アッセイで測定する。図７及び表９に示すとおり、ＰＥＧ化及びポリシアル酸化ｒＦＶＩＩＩは、ｒＦＶＩＩＩよりも改善されたＰＫパラメーターを示した（ＨＬ増加は約２）。同様な結果が、ラット（図８）及びマカク（図９）でも観察された。（異なる実験間での比較を可能にするため、データは１Ｕ／ｋｇの共通用量に正規化した）。

（表９）

実施例１９
ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの有効性を、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの尾切落とし出血モデルで測定した。ＦＶＩＩＩを２００ＩＵ活性／ｋｇで投与し、続いて、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの注射から１８〜５４時間後に尾先端を切り落とした。失血を測定したところ、ＰＫ実験から予想されるとおり、データから、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩでより長い有効性が確認された。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩは、出血を、ｒＦＶＩＩＩより約２倍長く制御する。

有効性を、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの頸動脈閉塞モデルでも測定した。ＦＶＩＩＩを２００ＩＵ活性／ｋｇで投与し、続いて、塩化第二鉄で頸動脈を損傷させた。血管閉塞までの時間を測定したところ、上記の結果と一致し、ＰＫ実験から予想されるとおり、データから、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩでより長い有効性が確認された。ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおいてＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩはｒＦＶＩＩＩよりも約２倍長く存在することが観察された。

最後に、血友病性関節出血のマウスモデル（関節内穿刺）におけるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩＩ及びＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの効果を評価した。修飾ｒＦＶＩＩＩ（すなわちＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ及びＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ）での処置は、マウスモデルにおいてｒＦＶＩＩＩよりも少なくとも２倍長く続くことが示された。

Claims (18)

1. 修飾第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）であって、ＦＶＩＩＩ半減期を延長しかつ前記修飾ＦＶＩＩＩの、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）からなる群より選択されるリガンドへの結合を減少させる修飾を含む、前記修飾ＦＶＩＩＩ。
2. 血漿由来である、請求項１に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
3. 組換え体である、請求項１に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
4. 全長ＦＶＩＩＩであり、かつインタクトＢドメインを含む、請求項３に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
5. 非修飾ＦＶＩＩＩと比べてより低い親和性（ＫＤ）で、ＶＷＦ及びＬＲＰ１に結合する、請求項１に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
6. 前記修飾が、ポリシアル酸（ＰＳＡ）を含む、請求項１に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
7. 前記ＰＳＡが、約２０ｋＤａからなる群より選択される平均分子量を有する、請求項６に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
8. 前記ＰＳＡが、低い多分散度を有する、請求項６または７に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
9. 前記ＰＳＡが、アミノオキシリンカーを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
10. 前記アミノオキシリンカーが、前記修飾ＦＶＩＩＩの酸化糖質に付加されている、請求項９に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾ＦＶＩＩＩと、薬学上許容される担体、希釈剤、塩、緩衝液、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
12. 前記半減期が、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩよりも長い、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
13. 倍率で約１、２、または３倍、前記半減期がより長い、請求項１２に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
14. ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合と比べた場合に、ＶＷＦまたはＬＲＰ１への前記結合がより低下している、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
15. ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合と比べた場合に、倍率で０．５、ＶＷＦまたはＬＲＰ１への前記結合がより低下している、請求項１１に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
16. 修飾組換えＦＶＩＩＩであって、ＦＶＩＩＩ半減期を延長しかつ前記修飾ＦＶＩＩＩの、ＶＷＦ及びＬＲＰ１からなる群より選択されるリガンドへの結合を減少させる修飾を含み、前記修飾が、アミノオキシリンカーとともにＰＳＡを含み、前記アミノオキシリンカーが前記修飾ＦＶＩＩＩの酸化糖質と結合しており、
    前記修飾組換えＦＶＩＩＩの半減期が、非修飾組換えＦＶＩＩＩ及び／またはＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩよりも長く、かつ
    非修飾組換えＦＶＩＩＩ及び／またはＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩによるＶＷＦまたはＬＲＰ１への結合と比べた場合に、前記修飾組換えＦＶＩＩＩによるＶＷＦまたはＬＲＰ１への前記結合がより低下している、
    前記修飾組換えＦＶＩＩＩ。
17. 前記修飾ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩ欠乏と関連する疾患または障害と診断された哺乳類に投与される、請求項１〜１０及び１２〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＦＶＩＩＩ。
18. 哺乳類における出血性障害の治療方法であって、請求項１〜１０及び１２〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＦＶＩＩＩ、または請求項１１に記載の医薬組成物を、前記出血性障害の１種または複数種の症候を減少または除去するのに有効な量で、前記哺乳類に投与するステップを含む、前記治療方法。

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