JP2019218364A - 特にｃｃｋ２受容体陽性腫瘍の診断および／または治療に使用するためのミニガストリン類似体 - Google Patents

Abstract

【課題】ＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍への高度の取り込みを示すと同時に腎臓内での極めて低い蓄積を示すガストリン類似体の提供。【解決手段】以下の式を有するミニガストリン類似体：Ｘ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2［式中、Ｙは、ノルロイシンを表し、かつＸは、ＣＣＫ−２受容体関連疾患における診断的介入のために該ペプチドに結合した化学基を表し、その際、Ｘは、放射性核種を表し、かつ放射性金属のためのキレーターを含む］を含む、ＣＣＫ−２受容体関連疾患用診断薬であって、前記ＣＣＫ−２受容体関連疾患が、ＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍から選択される、前記ＣＣＫ−２受容体関連疾患用診断薬。【選択図】図１

Description

本発明は、ミニガストリン類似体、並びにＣＣＫ２受容体陽性腫瘍の診断および／または治療におけるその使用に関する。

９０年代初頭以降、放射性標識ペプチドの標的タンパク質として、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が使用されている。ソマトスタチン受容体は、放射性核種イメージングおよびペプチドを用いた治療のためのプロトタイプであり（Ｌｉｔ）、これが、オクトレオチドのＹ−９０およびＬｕ−１７７標識誘導体を用いた神経内分泌腫瘍に対する臨床的な第一選択治療となった（Ｌｉｔ）。いくつかの放射性標識ペプチド、例えばガストリン放出ペプチド類似体（ＧＲＰ）、グルカゴン様ペプチド−１類似体（ＧＬＰ−１）、ニューロテンシン類似体（ＮＴ）またはニューロペプチドＹ類似体（ＮＰＹ）について、腫瘍上で過剰発現されたＧＰＣＲを標的とする可能性に関して試験が行われた（Ｍａｅｃｋｅ， Ｒｅｕｂｉ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００８； ４９：１７３５−１７３８）。さらなる極めて興味深い標的は、コレシストキニン−２受容体（ＣＣＫ−２Ｒ）である。この受容体は、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および間質卵巣腫瘍上で主に発現される（Ｒｅｕｂｉ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． １９９６、およびＲｅｕｂｉ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７）。放射性標識ガストリン類似体は、標的を定めたイメージングおよび治療に関する良好な候補である。Ｉｎ−１１１標識ガストリン類似体は、ＯｃｔｒｅｏＳｃａｎ−１１１に比べてＭＴＣ検出に関して優れており、かつ特にこれがソマトスタチン受容体シンチグラフィーにおいて陰性である場合には、神経内分泌腫瘍に関する追加の情報を提供することが示された（Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ． ２００６ Ｄｅｃ；１３（４）：１２０３−１１．； Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ． ２００６ Ｎｏｖ；３３（１１）：１２７３−９）。

しかし、腎臓への高度の取り込みのため、放射性標識ペプチドを治療に使用することはできなかった。腎臓への高度の取り込みは、６つの負に帯電したグルタミン酸と相関している。１２種のガストリン関連化合物が、１１１Ｉｎ標識化合物として設計され、合成され、かつ比較された。腫瘍対腎臓の比が高いことに関して最良の化合物は、６つのＤ−グルタミン酸または６つのグルタミンを有するミニガストリンである。これらの化合物はなおもメチオニンを有しており、このメチオニンは容易に酸化されうる。このことは臨床応用には不利であり、それというのも、メチオニンの酸化後に受容体親和性が劇的に減少し、また、ＧＭＰ下での製造が劇的に妨げられうるためである。

転移した甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、さらにはＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍を有する患者の治療および画像生成を大幅に改善するための高い可能性を有しているのは、放射性標識ガストリン類似体を用いた腫瘍細胞の特異的標識である。この発見のベースとなるのが、調査が行われたＭＴＣの９２％でのそれぞれのＣＣＫ−２標的受容体の過剰発現の証明である。ここで、この証明はインビトロでの研究によってなされたものである［Ｒｅｕｂｉ １９９７］。さらに、同一のワーキンググループによって、小細胞肺癌の５７％、星状細胞腫の６５％および間質性卵巣腫瘍の１００％で、ＣＣＫ−２標的受容体の同一の過剰発現が特定された。

最初の治療研究（フェーズ０の研究）は、高度に転移した甲状腺髄様癌を有する８名の患者で行われた。⁹⁰Ｙ標識ミニガストリン類似体を用いた治療後に、２名の患者については部分寛解が達成され、４名の患者は、癌疾患であるＭＴＣの以前の強い進行性の経過の安定化を示した。上述のアッセイにおいて使用された物質が腎臓内に強度に蓄積されるという観点で、治療の腎毒性に基づき、この研究を停止せざるを得なかった。

その間に、欧州ＣＯＳＴイニシアティブ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の支援を受けて、大幅に改善された複数の放射性標識ガストリン類似体が様々なワーキンググループによって合成され、かつそれらの特性について研究が行われてきた。従来のガストリン類似体と比較して、これらの比較的新しい物質は、ヒトの組織への吸収に関して有意に高い腫瘍対腎臓の比を有する［Ｌａｖｅｒｍａｎ ２０１１， Ｐｏｌｅｎｃ−Ｐｅｉｔｌ ２０１１， Ｏｃａｋ ２０１１， Ｆａｎｉ ２０１２］。現在、これらの比較的新しいガストリン類似体のうち、¹⁷⁷Ｌｕ−ＰＰ−Ｆ１１（６つのＤ−Ｇｌｕ残基を有する直鎖ミニガストリン類似体、以下、ＰＰ−Ｆ１１と呼ぶ）は、腫瘍内でのその有利な高度の蓄積とそれに伴う腎臓内での低度の蓄積とに基づき、将来的な放射性核種療法に関して最良の特性を示した。

従って本発明の目的は、ＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍内でのさらに良好な蓄積を示すと同時に腎臓内での極めて低い蓄積を示すガストリン類似体を提供することである。

本目的は、本発明にしたがって、ＣＣＫ−２受容体関連疾患における診断的介入および／または治療的介入のためのミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１であって、式：ＰＰ−Ｆ１１−Ｘ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂［式中、Ｙは、メチオニンと置換されるアミノ酸を表し、かつＸは、該ペプチドに結合した化学基を表す］を有する前記ミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１により達成される。

特に、腫瘍対腎臓の比が高いことに関して極めて適した化合物は、６つのＤ−グルタミン酸または６つのグルタミンを有するミニガストリン類似体である。これらの化合物はなおもメチオニンを有しており、このメチオニンは容易に酸化されうる。このことは、生じうる形態に基づき、ＧＭＰ下での臨床応用にとって不利である。従って、このメチオニンを、酸化不可能な等配電子アミノ酸によって置き換えるものの、生物学的活性はそのまま保つことによって、酸化電位を有しない化合物がもたらされる。これによって貯蔵および製造の間の酸化が回避され、これによって、より親和性の低い化合物をもたらすことができ、その結果、腫瘍対腎臓の比が低くなる。

本発明の好ましい一実施形態において、メチオニンはノルロイシンにより置換されている。このいわゆるＰＰ−Ｆ１１Ｎミニガストリンは、目下、最良の腫瘍対腎臓の比を示しており、従って臨床応用のための最も有望な候補である。癌の放射線治療に関して、Ｘは放射性核種を表すことができ、これには、結合基、例えば放射性金属、例えば¹⁷⁷Ｌｕ若しくは⁹⁰Ｙ若しくは¹¹¹Ｉｎのためのキレーター、または非金属、例えばＦ−１８若しくは放射性ヨウ素のための補欠分子族が含まれる。医用イメージングを改善するため、Ｘは、光学活性な化学化合物、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤまたはＤＹ−７００に関して、および光学的治療応用に関して、光増感剤、例えばフォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）、フォルスカム（Ｆｏｒｓｃａｍ）またはフォトクロル（Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ）であることができる。双方の応用に関して、活性な化学化合物は光学活性ナノ粒子であることができる。化学療法的介入を支援するために、Ｘは、化学療法的活性化合物、例えばゲムシタビン、ドキソルビシンまたはシクロホスファミドを表すことができる。記載された薬剤の送達は、Ｘとしてのナノ粒子またはリポソームによって行われることができ、一方でこれらには化学療法的薬剤が負荷される。

本発明のミニガストリンの使用に関しては、ＣＣＫ−２受容体関連疾患での診断的介入および／またはＣＣＫ−２受容体関連疾患での治療的介入が予定される。

本発明の好ましい実施形態を、以下に添付図面に関してより詳細に説明する。

図１は、ＣＯＳＴイニシアティブから得られるミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１から出発するＰＰ−Ｆ１１Ｎの構造設計を示す。 図２は、ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデルにおける４時間後のＰＰ−Ｆ１１、ＰＰ−Ｆ１１ＮおよびＰＰ−Ｆ１１ ｏｘ（酸化されたＰＰ−Ｆ１１）の生体内分布を示す。 図３は、ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデルにおける４時間後のＰＰ−Ｆ１０、ＰＰ−Ｆ１０ＮおよびＰＰ−Ｆ１０ ｏｘ（酸化されたＰＰ−Ｆ１０）の生体内分布を示す。 図４は、時間の経過に伴う多様なミニガストリン類似体の安定性を示す。

図１は、上述のＣＯＳＴイニシアティブから誘導されたミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１を示す。修飾されたミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１Ｎは、酸化可能なアミノ酸であるメチオニンとノルロイシンとを置換することにより達成された。ＤＯＴＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸を表し、これは、式（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ）₄を有する有機化合物である。この分子は、中央の１２員のテトラアザ（すなわち、４個の窒素原子を含む）環からなる。ＤＯＴＡは、特にランタニドイオンのための錯化剤として使用される。その錯体は、造影剤および癌の治療としての医療用途を有する。

ＰＰ−Ｆ１１Ｎを、ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデルにより調べた。ＰＰ−Ｆ１１と比較して、ミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１Ｎは腫瘍への有意により高度の取り込みを示し、これによって、腎臓内での蓄積がほとんどない極めて好ましい腫瘍−ノイズ比ももたらされる。図２は、胸腺欠損ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデルにおける４時間後のＰＰ−Ｆ１１、ＰＰ−Ｆ１１Ｎおよび酸化されたＰＰ−Ｆ１１ ｏｘ（酸化されたＰＰ−Ｆ１１）の生体内分布を示す。腫瘍陽性：マウスの一方の側部に、ヒトＣＣＫ−２受容体をトランスフェクトしたＡ４３１細胞を用いた；腫瘍陰性：マウスのもう一方の側部に、ＣＣＫ−２受容体陰性Ａ４３１細胞を用いた。メチオニンをノルロイシンと置換することによる腫瘍へのより高度の取り込みの効果は、ＤＧｌｕ６配列を有する化合物を用いた場合に特に明らかであり、これは、ＰＰ−Ｆ１０と呼ばれるＤＧＬｎ６を有する配列を有する化合物とは異なる。

図３は、図２に示す結果と比較した、ＰＰ−Ｆ１０およびＰＰ−Ｆ１０ＮおよびＰＰ−Ｆ１０ ｏｘ（酸化されたＰＰ−Ｆ１０）についての結果を示す。ＰＰ−Ｆ１０の構造式は、下記の通りである：
ＰＰ−Ｆ１０：ＤＯＴＡ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂
ＰＰ−Ｆ１０Ｎ：ＤＯＴＡ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂；
ＰＰ−Ｆ１０ ｏｘ：ＤＯＴＡ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ（ｏｘ）−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂。

従って、図３においては有望な腫瘍への取り込みは認められない。なぜならば、他の臓器、例えば膵臓、腎臓および骨に、標的腫瘍よりも部分的にさらに高い用量が取り込まれるためである。

図４は、ＰＰ−Ｆ１１、ＰＰ−Ｆ１０ＮおよびＰＰ−Ｆ１０（いずれも¹⁷⁷Ｌｕで放射性標識されている）と比較したＰＰ−Ｆ１１Ｎの薬理学的安定性を示す。ヒト血清中で安定性を確認した；ＨＰＬＣを用いて代謝物の測定を行った。本発明によるミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１Ｎは、すべての被検体の中で最も高い薬理学的安定性を示す。

材料：ペプチド（ＰＰ−Ｆ１０、ＰＰ−Ｆ１０Ｎ、ＰＰ−Ｆ１１およびＰＰ−１１Ｎ）を、メリフィールド方法によりＰＬＳ（ドイツ国ハイデルベルク）によって合成した。すべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（スイス国ブフス）より購入した。Ａ４３１細胞（細胞株扁平上皮癌）に、ＣＣＫ２ＲをコードするｃＤＮＡまたは空ベクター（”ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ”）¹を安定的にトランスフェクトした。このＡ４３１細胞は、Ｌ．Ａｌｏｊ（ナポリ）からの寄贈品であった。Ｌｕ−１７７を、ＩＴＧ（ドイツ国ミュンヘン）から購入した。ペプチド結合体と天然の^natＬｕとの複合体を形成した。

ミニガストリンの標識を、次のような状況の下で行った：
ＨＰＬＣ分析のためのシステム：
システム：ポンプＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２０３０．０１、ダイオードアレイ３３０．７１、オートサンプラー４１０、 Ｐａｃｋａｒｄ Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ Ｆｌｏｗ−Ｏｎｅ＼
カラム：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ １２０ ＢＳ−Ｃ２３ ３μｍ １５０×４．６ｍｍ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ
グラジエント：

精製のためのシステム：
ポンプ１：Ｗａｔｅｒｓ ５１５、ポンプ２：Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ−７０００、ＫｎａｕｅｒＵＶ検出器Ｋ２５１０、放射線モニターＥｂｅｒｌｉｎｅ、インターフェースＳＳ４２０Ｘ、ＥＺｓｔａｒｔ
Ｒｈｅｏｄｙｎｅマニュアルインジェクター
カラム１：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ １２０ ＢＳ−Ｃ２３ ３μｍ １０×４．６ｍｍ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ
カラム２：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ １２０ ＢＳ−Ｃ２３ ３μｍ １５０×４．６ｍｍ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ

製品：
Ｌｕ−１７７：ロット Ｌｕ−１２−０５２−０１／１２１０４２、活性 ２ＧＢｑ／２００μｌ ０．０４Ｍ ＨＣＬ、ｉｔｇ（ＩＴＭ ＡＧ）
ＰＰ−Ｆ１１Ｎ：０．２５ｍＭ Ｈ₂Ｏ溶液
アンモニウム溶液：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、金属不含
アスコルビン酸Ｎａ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
ＨＣｌ ３０％：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、金属不含
Ｈ₂Ｏ：Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｔｅｌより

Ｌｕ−１７７を用いたペプチドＰＰＦ１１Ｎの標識：
ＰＰＦ−１１Ｎを用いたＬｕ−１７７の標識を、同位体：ペプチド比１：４７で行った。

Ｌｕ−１７７とペプチドとの混合物を、エッペンドルフ１．５ｍｌ ｌｗ ｂｉｎｄｉｎｇへ：
− ２０μｌ Ｌｕ−１７７（１９０ＭＢｑ）
− ５μｌ アスコルビン酸アンモニウム０．７Ｍ
− ５０μｌ ＰＰＦ−１１Ｎ ０．２５ｍＭ
− ５μｌ ＨＣ１ ０．０４Ｍ
この混合物を、９５℃で２０分間加熱した。

その後、複合体を精製し、かつＨＰＬＣ法で確認した。

２つの合成を並行して達成した。

ＨＰＬＣによる標識ペプチドの精製
２つの標識反応を、２Ｄ ＨＰＬＣに注入した。

２Ｄ ＨＰＬＣの説明：
第１のステップ：生成物をレオダインマニュアルインジェクターを用いてループに注入し、この生成物を第１のポンプを用いてカラム１を通じて押す。この生成物をループからカラム１へと移し、Ｈ₂Ｏ＋０．１ＴＦＡで洗浄する。

第２のステップ：第２のポンプを用いてグラジエントを開始し、バルブの位置を変えて順にカラム１およびカラム２を接続する。

生成物を、カラム１からカラム２へと押す。ペプチドの余剰分をカラム２内の標識されたＬｕ−１７７−ＰＰＦ１１Ｎと分離し、かつ５００ｕｌの画分サイズで収集する。収集されたチューブは、なおも５ｍｇのアスコルビン酸Ｎａを含む。

ＨＰＬＣによる精製の結果

２つの画分を合一し、かつ溶媒を３５分間で蒸発させた。

その後、６００ｕｌのＰＢＳ １ｘおよび１０ｕｌの５ｍＭ ＤＴＰＡ溶液を添加した。

最終溶液：２９５ＭＢｑ／６１０ｕｌ。

安定性
放射性標識化合物１２ＭＢｑを、新鮮なヒト血漿２ｍＬ中でインキュベートした。試料４０μＬを、０、１、２、１８、２４、４８および７２時間後に採取し、かつＭｉｎｉ−ＵｎｉＰｒｅｐ Ｆｉｌｔｅｒ中に２００μＬ（５０％メタノールおよび５０％アセトニトリル）を添加した。この溶液を、ボルテックス後に濾過する。濾過した溶液４０μＬをＨＰＬＣにより分析する。

生体内分布の試験
ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、５×１０⁶のＡ４３１細胞を注射した。ＣＣＫ−２受容体陽性Ａ４３１細胞¹を一方の側腹部に注射し、かつ他方に非特異的対照としてｍｏｃｋ細胞を注射した。腫瘍は、約１０日後には約８０〜１２０ｍｇの重量に達する。放射性標識ペプチド１５０〜２００ｋＢｑ（５ピコモル）を、尾静脈に注射した。注射後所定の時点の後に、マウスをＣＯ₂窒息により殺した。器官を解剖し、秤量し、かつ放射能を測定した。１ｇ当たりの％注入放射能（％ｉ．Ａ．／ｇ）を算出した。この動物実験は、現地の動物愛護委員会によって承認され、かつ国の規則に従って行ったものである。

Claims (9)

1. ＣＣＫ−２受容体関連疾患における診断的介入および／または治療的介入のためのミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１であって、式：ＰＰ−Ｆ１１−Ｘ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−ＤＧｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂［式中、Ｙは、メチオニンと置換されるアミノ酸を表し、かつＸは、該ペプチドに結合した化学基を表す］を有する前記ミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１。
2. メチオニンがノルロイシンにより置換されている、請求項１に記載のミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１。
3. Ｘが、放射性核種、例えば¹⁷⁷Ｌｕまたは⁹⁰Ｙまたは¹¹¹Ｉｎを表す、請求項１または２に記載のミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１。
4. Ｘが、光学活性な化学化合物を表す、請求項１から３までのいずれか１項に記載のミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１。
5. Ｘが、化学療法的活性化合物を表す、請求項１から４までのいずれか１項に記載のミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１。
6. Ｘがナノ粒子またはリポソームを表し、ここで、該ナノ粒子またはリポソームは、診断的機能を有する（例えば、光学活性剤またはＭＲＩ造影剤）か、またはそれ自体が治療的機能を有するか、または活性化合物が負荷されている、請求項１から５までのいずれか１項に記載のミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１。
7. ＣＣＫ−２受容体関連疾患における診断的介入における、請求項１から６までのいずれか１項に記載のミニガストリンの使用。
8. ＣＣＫ−２受容体関連疾患における治療的介入における、請求項１から７までのいずれか１項に記載のミニガストリンの使用。
9. メチオニンが、酸化電位を有しておらずかつ高い腫瘍親和性を示すメチオニン等配電子アミノ酸により置換されている、請求項８に記載のガストリン類似体の使用。

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