JP2019182845A

JP2019182845A - キヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ｋａｔ２）阻害剤

Info

Publication number: JP2019182845A
Application number: JP2019061581A
Authority: JP
Inventors: 英嗣藤垣; Hidetsugu Fujigaki; 邦明齋藤; Kuniaki Saito
Original assignee: Fujita Health University
Current assignee: Fujita Health University
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2019-10-24

Abstract

【課題】ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患、例えば統合失調症の治療に有用な医薬組成物を提供する。
【解決手段】

［Ｒ^１は、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、グルクロン酸基、ジグルクロン酸基、Ｒ’は、ハロゲン、アミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキル、ｎは１〜３；Ｒ^２は、水素、ハロゲン、アミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキル］で示される化合物またはその塩。
【選択図】なし

Description

本発明は、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ＫＡＴ２）阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、グリチルリチン酸またはその誘導体を含む、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）産生増加に起因する疾患を治療するための医薬組成物に関する。

キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴ）には、４種類のアイソザイム（ＫＡＴ１〜ＫＡＴ４）が存在する。そのアイソザイムの一つである、ＫＡＴ２は、トリプトファン−キヌレニン代謝経路においてＬ−キヌレニン（Ｌ−ＫＹＮ）をキヌレン酸（ＫＹＮＡ）に変換する酵素である。

キヌレン酸（ＫＹＮＡ）は、ＮＭＤＡ型受容体および神経型ニコチン性アセチルコリンに対する拮抗作用を有し、その濃度が上昇すると、記憶、学習、認知機能が低下すること、そして、統合失調症患者では、脳内のＫＹＮＡ濃度が増加することが報告されている（非特許文献１〜３）。さらに、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症ダウン症候群、双極性障害およびアルツハイマー病の患者もまた、ＫＹＮＡ濃度が増加することが報告されている（非特許文献４〜１０）。

グリチルリチン酸およびその誘導体は、胃潰瘍などの消化性潰瘍の治療に広く用いられているが、ＫＡＴ２阻害作用を有するとの報告はなく、また統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害およびアルツハイマー病などのＫＹＮＡ産生増加によって引き起こされる疾患の治療に有効であるとの報告もない。
さらに、ＰＦ−０４８５９９８９、ＢＦＦ−１２２、Ｓ−ＥＳＢＡ（（Ｓ）−（４−エチルスルホニル）ベンゾイルアラニン）などの薬剤がＫＡＴ２阻害剤として市販されているが、それらの薬剤はグリチルリチン酸およびその誘導体とは構造が大きく異なる。

Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neurosci Lett 313:96-98 The kynurenic acid hypothesis of schizophrenia. Physiol Behav 92:203-209 Elevated levels of kynurenic acid in the cerebrospinal fluid of male patients with schizophrenia. Schizophr Res 80:315-322 Kynurenate and 7-chlorokynurenate formation in chronically epileptic rats. Epilepsia 46:1010-1016 Endogenous protectant kynurenic acid in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neurol Scand 107:412-418 Metabolites of the kynurenine pathway of tryptophan metabolism in the cerebrospinal fluid of Malawian children with malaria. J Infect Dis 188:844-849 Quinolinic acid and kynurenine pathway metabolism in inflammatory and non-inflammatory neurological disease. Brain 115(Pt 5):1249-1273 Increased kynurenic acid levels and decreased brain kynurenine aminotransferase I in patients with Down syndrome. Life Sci 58:1891-1899 Elevated levels of kynurenic acid in the cerebrospinal fluid of patients with bipolar disorder. J Psychiatry Neurosci. 2010, 35, 195-199. Kynurenine metabolism in Alzheimer’s disease. J Neural Transm. 1999, 106, 165-181.

本発明は、ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患、例えば統合失調症の治療に有用な医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、約13,000種類の化合物のスクリーニングを行い、既存化合物のＫＡＴ２阻害作用を鋭意検討した結果、あらゆる構造を有する被験化合物の中で、驚くべきことにグリチルリチン酸やその誘導体が共通して優れたＫＡＴ２阻害作用を有し得るという知見を見出し、さらにＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患、例えば統合失調症に対しても、グリチルリチン酸およびその誘導体が優れた治療効果を発揮し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の態様の発明を提供するものである。
［１］式（Ｉ）：
［式中、Ｒ^１は、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、グルクロン酸基またはジグルクロン酸基であり、ここで、Ｒ’は、ハロゲンまたはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルであり、ｎは１〜３であり；および
Ｒ^２は、水素またはハロゲンもしくはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルである］
で示される化合物またはその塩を含む、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）産生増加に起因する疾患を治療するための医薬組成物。
［２］Ｒ^１が、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３またはジグルクロン酸基であり；および
Ｒ^２が、水素またはＣＨ_３である、［１］記載の医薬組成物。
［３］化合物が、以下：
から選択される、［１］または［２］記載の医薬組成物。
［４］該ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患が、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害またはアルツハイマー病である、［１］〜［３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［５］該ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患が、統合失調症である、［４］記載の医薬組成物。
［６］式（Ｉ）：
［式中、Ｒ^１は、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、グルクロン酸基またはジグルクロン酸基であり、ここで、Ｒ’は、ハロゲンまたはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルであり、ｎは１〜３であり；および
Ｒ^２は、水素またはハロゲンもしくはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルである］
で示される化合物またはその塩を含む、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ＫＡＴ２）阻害剤。
［７］治療を必要とする患者に、治療上の有効量の［１］〜［３］のいずれかの式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を投与することを特徴とする、ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患の治療方法。
［８］該ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患が、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害またはアルツハイマー病である、［７］記載の治療方法。
［９］該ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患が、統合失調症である、［８］記載の治療方法。
［１０］ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患を治療するための医薬の製造における、［１］〜［３］のいずれかの式（Ｉ）で示される化合物またはその塩の使用。
［１１］ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患の治療に使用するための［１］〜［３］のいずれかの式（Ｉ）で示される化合物またはその塩。
［１２］治療を必要とする患者に、治療上の有効量の［１］〜［３］のいずれかの式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を投与することを特徴とする、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ＫＡＴ２）の阻害方法。

本発明によれば、グリチルリチン酸またはその誘導体がキヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ＫＡＴ２）を効果的に阻害することにより、ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患、例えば統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害、アルツハイマー病などに対して優れた治療効果を発揮することが期待できる。

市販のＫＡＴ２阻害剤（PF-04859989、BFF-122および(S)-ESBA）および本発明化合物（グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロン）のlog換算濃度(nM)とその阻害率の関係図およびＩＣ_５０値（μＭ）を示す。 PF-04859989およびcontrolの基質濃度(mM)と反応速度(μM/min)の関係図（左図）およびLineweaver-BurkプロットによるPF-04859989のＫＡＴ２阻害（右図）を示す。グリチルリチン酸およびcontrolの基質濃度(mM)と反応速度(μM/min)の関係図（左図）およびLineweaver-Burkプロットによるグリチルリチン酸のＫＡＴ２阻害（右図）を示す。グリチルレチン酸およびcontrolの基質濃度(mM)と反応速度(μM/min)の関係図（左図）およびLineweaver-Burkプロットによるグリチルレチン酸のＫＡＴ２阻害（右図）を示す。カルベノキソロンおよびcontrolの基質濃度(mM)と反応速度(μM/min)の関係図（左図）およびLineweaver-BurkプロットによるカルベノキソロンのＫＡＴ２阻害（右図）を示す。対照（0mg/kg）群、グリチルリチン酸(25mg/kg)投与群、およびグリチルリチン酸(50mg/kg)投与群のマウスにおける、血清中キヌレン濃度(nM)の平均値（±標準偏差）を示す。

以下に、本発明について詳細に説明する。

本発明において、「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。

本発明において、「Ｃ_１−６アルキル」とは、炭素数１〜６個を有する直鎖状もしくは分枝状の飽和炭化水素基を意味する。「Ｃ_１−６アルキル」の具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルなどが挙げられる。好ましくは、メチルまたはエチルである。

本発明において、「グリチルリチン酸またはその誘導体」とは、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ^１は、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、グルクロン酸基またはジグルクロン酸基であり、ここで、Ｒ’は、ハロゲンまたはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルであり、ｎは１〜３であり；および
Ｒ^２は、水素またはハロゲンもしくはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルである］
で示される化合物またはその塩を意味する。グリチルリチン酸は、甘草の根に含まれる有効成分であって、消化性潰瘍や去痰薬としての効果を有する、以下の構造：
を有する化合物である。
グリチルレチン酸は、グリチルリチン酸の加水分解によって得られるβ−アミリン（オレアナン）系の５環式テルペノイド誘導体の一つであり、以下の構造：
を有する化合物である。アロエやキニーネのような薬品の苦味を緩和するための調味料として用いられ、胃潰瘍の治療に効果的であり、去痰薬としての特性もある。ＰＧＥ−２とＰＧＦ−２αを代謝する酵素を抑制する。
カルベノキソロンは、以下の構造：
を有する化合物である。

本発明において、グリチルリチン酸およびその誘導体は、塩形態であってもよく、医薬として許容される塩であれば特に限定されない。塩としては、例えば、アルカリ金属（例えば、カリウム、ナトリウム、リチウムなど）の塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウムなど）の塩、アンモニウム塩（例えば、テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩など）、有機アミン（例えば、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなど）の塩などが挙げられる。

グリチルリチン酸およびその誘導体は公知の方法により製造することができる。また、市販品を用いてもよい。

本発明において、「キヌレン酸（ＫＹＮＡ）産生増加に起因する疾患」とは、トリプトファン−キヌレニン代謝経路において、キヌレン酸濃度が上昇することによって引き起こされる疾患または障害およびその症状をいう。その具体例として、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害、アルツハイマー病およびそれらの症状などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、「治療」とは、哺乳動物、特にヒトにおける疾患または障害およびその症状の治癒および／または改善を意味する。また、ＮＹＮＡ産生増加に起因する疾患を予防、緩和および／または軽減することも含まれる。

本発明において、「患者」とは、ヒトおよび動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどを意味する。その中でも、ヒトが好ましい。

本発明において、「治療上の有効量」とは、組織、系、動物またはヒトにおいて、研究者または医師によって定められる生物学的または医薬的応答を誘発する有効成分の量を意味する。また、「治療上の有効量」とは、疾患を治療するために患者に投与する場合に、疾患に対して治療効果をもたらす有効成分の量の意味も含まれる。「治療上の有効量」は、有効成分、疾患の種類およびその重篤度、ならびに治療されるべき哺乳動物の年齢、体重などに依存して変化する。
かかる有効量としては、グリチルリチン酸またはその誘導体単独の量および／またはＫＡＴ２阻害作用を有する他の活性成分、例えば、ＰＦ−０４８５９９８９と組み合わせたグリチルリチン酸またはその誘導体の量が挙げられる。

本発明のキヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ＫＡＴ２）阻害剤とは、トリプトファン−キヌレニン代謝経路におけるＬ−ＫＹＮからＫＹＮＡへの変換に関与するＫＡＴ２の機能を阻害し、ＫＹＮＡ産生を阻害することによって、治療効果を発揮する薬剤を意味する。

本発明の医薬組成物およびＫＡＴ２阻害剤は、グリチルリチン酸またはその誘導体を有効成分として含むものであればよく、その有効成分の効果を妨げない限り、他の医薬活性成分をさらに含んでいてもよい。例えば、ＰＦ−０４８５９９８９、ＢＦＦ−１２２、Ｓ−ＥＳＢＡなどの既存のＫＡＴ２阻害剤を併用してもよい。本発明の医薬組成物中のグリチルリチン酸またはその誘導体の割合は特に限定されない。
また、本発明の医薬組成物は、グリチルリチン酸またはその誘導体のみからなるものであってもよい。

本発明の医薬組成物およびＫＡＴ２阻害剤は、経口または非経口（例えば、皮下、静脈、局所、経鼻、経肺、直腸など）投与することができる。

本発明の剤形は、対象の身体状況、健康状態などに応じて適宜選択し、調製することができる。例えば、錠剤（口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠、溶解錠）、カプセル剤、顆粒剤（発泡顆粒剤）、散剤、経口液剤（エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤）、シロップ剤（シロップ用剤）、経口ゼリー剤、口腔用錠剤（トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠、ガム剤）、口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、含嗽剤、注射剤（輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射剤）、透析用剤（腹膜透析用剤、血液透析用剤）、吸入剤（吸入粉末剤、吸入液剤、吸入エアゾール剤）、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤、点眼剤、眼軟膏剤、点耳剤、点鼻剤（点鼻粉末剤、点鼻液剤）、膣錠、膣用坐剤、外用固形剤（外用散剤）、外用液剤（リニメント剤、ローション剤）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（テープ剤、パップ剤）などの剤形に、公知の方法により調製されうる。

本発明の医薬組成物は、必要に応じ、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトールおよび微結晶セルロース）、崩壊剤（例えば、カルメロース、カルメロースナトリウムおよび低置換度ヒドロキシプロピルセルロース）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドンおよび結晶セルロース）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク）、溶剤（例えば、水、エタノールおよびプロピレングリコール）、緩衝剤（例えば、リン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム）、懸濁化剤（例えば、アラビアゴム、トラガントおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）、乳化剤（例えば、グリセリン脂肪酸エステルおよびソルビタン脂肪酸エステル）など１種以上の医薬的に許容される担体を含むものであってもよい。

グリチルリチン酸またはその誘導体および併用薬剤の投与期間は、特に限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差で投与してもよい。グリチルリチン酸またはその誘導体を、併用薬剤に対して先に、同時に、または後に投与してもよい。また、グリチルリチン酸またはその誘導体と併用薬剤の合剤としてもよい。

本発明のグリチルリチン酸またはその誘導体の投与量は、投与方法、対象の年齢、疾患の程度、症状、剤形などにより変化するが、例えば、１日あたり０．００１ｍｇ〜１０ｇの用量で投与することができる。１日あたりのグリチルリチン酸またはその誘導体の量を、１回〜数回に分けて投与してもよい。また、グリチルリチン酸またはその誘導体以外の薬剤と組み合わせて使用する場合、グリチルリチン酸またはその誘導体の投与量は、グリチルリチン酸またはその誘導体以外の薬剤の投与量に応じて減量することができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

実施例１：ＫＡＴ２阻害剤候補化合物のスクリーニング
以下の方法にしたがって、東京大学創薬機構にて提供されているValidated Compound LibraryおよびCore Libraryより入手した約13,000種類の化合物について予備的にスクリーニングを行い、39種類の予備的化合物を選別し、更に選別した化合物の中からＫＡＴ２阻害剤となり得る化合物を選定した。

［試薬］
・１５０ｍＭ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）緩衝液（ｐＨ９．５）：ＡＭＰ（１３．３７１ｇ；ＳＩＧＭＡ、No.08578）を超純水と混合し、ＨＣｌでｐＨ９．５に調整し、１５０ｍＭＡＭＰ緩衝液（ｐＨ９．５）を調製した。
・２００ｎｇ／μＬリコンビナントヒトＫＡＴ２（ｒｈＫＡＴ２）：バキュロウイルス・昆虫細胞発現系により精製したｒｈＫＡＴ２の濃度を測定し、ＡＭＰ緩衝液で希釈し、２００ｎｇ／μＬｒｈＫＡＴ２を調製した。
・２０ｍＭＬ−キヌレニン（ＫＹＮ）：ＫＹＮ（４．１６４ｇ；ＳＩＧＭＡ、No.K8625）をＡＭＰ緩衝液に溶解し、２０ｍＭＫＹＮを調製した。
・２０ｍＭ２（α）−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）：α−ＫＧ（２９２．２ｍｇ；ナカライテスク、No.19817-95）をＡＭＰ緩衝液に溶解し、２０ｍＭ α−ＫＧを調製した。
・１０ｍＭピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）：ＰＬＰ（２６５ｍｇ；ナカライテスク、No.29606-32）をＡＭＰ緩衝液に溶解し、１０ｍＭＰＬＰを調製した。
・０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０：Ｔｗｅｅｎ−２０（１００μＬ；ナカライテスク、No.23926-35）をＡＭＰ緩衝液と混合し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を調製した。
・３００ｍＭ酢酸亜鉛二水和物（ｐＨ５．０）溶液：酢酸亜鉛二水和物（６５．８５ｇ；ナカライテスク、No.36911-15）を超純水に溶解し、酢酸でｐＨ５．０に調整し、３００ｍＭ酢酸亜鉛二水和物（ｐＨ５．０）溶液を調製した。
［機器］
・ＦＬＵＯＲＡＣ，３８４ウェル，マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、No.781076）
・多検出モードプレートリーダーＰＨＥＲＡｓｔａｒＰｌｕｓ（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ、No.470-101）
・マルチラベルプレートリーダーＡＲＶＯ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、No.2030）
・多本架冷却遠心機（ＴＯＭＹ）

［方法］
１．予備的化合物の選定
以下の方法にしたがって、予備的スクリーニングを行い、予備的化合物を選定した。
（１）酵素阻害測定用プレートに、POD分注により各化合物（２ｍＭ）を１００ｎＬ／ウェル分注した（n=1、化合物の終濃度１０μＭ、DMSOの終濃度０．５％）。controlおよびbackground用として、同濃度のDMSOを含む水溶液を１００ｎＬ／ウェル分注した（n=16）。
（２）下記の酵素液を、被験化合物、controlおよびbackground用のウェルに添加した。background用では、rhKAT2の代わりにAMP緩衝液を１μＬ／ウェル加えた。

酵素液（被験化合物およびcontrol用）
200 ng/μL rhKAT2 １μＬ
0.1% Tween-20 ０．５μＬ
AMP緩衝液８．５μＬ
１０μＬ

酵素液（background用）
0.1% Tween-20 ０．５μＬ
AMP緩衝液９．５μＬ
１０μＬ

（３）下記の基質液を、被験化合物、controlおよびbackground用のウェルに添加した。

基質液
20 mM KYN １μＬ
20 mM α-KG １μＬ
10 mM PLP １μＬ
0.1% Tween-20 ０．５μＬ
AMP緩衝液６．５μＬ
１０μＬ

（４）プレートを遠心機でスピンダウンし、室温で２時間インキュベートした。
（５）検出液（３００ｍＭ酢酸亜鉛二水和物（ｐＨ５．０）溶液）を２０μＬ／ウェル添加し、プレートを遠心機でスピンダウンした。
（６）多検出モードプレートリーダーＰＨＥＲＡｓｔａｒＰｌｕｓで各被験化合物、controlおよびbackgroundの蛍光強度を測定した（Ex 340 nm、Em 460 nm）。
（７）プレートのＳ／Ｂ、ＣＶ（backgroundおよびcontrol）およびＺ’を、backgroundおよびcontrolの測定値から下記の各式に基づき、算出した（ｎ≧４）。

・Ｓ／Ｂ＝Ｍｅａｎ_Ｃ／Ｍｅａｎ_Ｂ
・ＣＶ（％）＝１００ｘ（ＳＤ_Ｂ／Ｍｅａｎ_Ｂ）
１００ｘ（ＳＤ_Ｃ／Ｍｅａｎ_Ｃ）
・Ｚ’ ＝１−（３ＳＤ_Ｂ＋３ＳＤ_Ｃ）／（Ｍｅａｎ_Ｃ−Ｍｅａｎ_Ｂ）

Ｍｅａｎ_Ｂ： backgroundの平均値
Ｍｅａｎ_Ｃ： controlの平均値
ＳＤ_Ｂ： backgroundの標準偏差
ＳＤ_Ｃ： controlの標準偏差

（８）Controlを反応100%、Backgroundを反応0％として、下式に基づき、阻害率(ＩｎＨ（％）)を算出した。算出された阻害率の高い上位39種類の化合物を予備的化合物として選定した。

ＩｎＨ（％）＝１００ｘ｛１−（Ｓａｍｐｌｅ−Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）／（Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）｝

Ｓａｍｐｌｅ：被験化合物の蛍光強度
Ｃｏｎｔｒｏｌ：controlの蛍光強度の平均値
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：backgroundの蛍光強度の平均値

２．ＫＡＴ２阻害剤候補化合物の選定
以下の方法にしたがって、選別された39種類の化合物をスクリーニングし、ＫＡＴ２阻害剤として有用な化合物を選定した。
（１）酵素阻害測定用プレート（Plate A）および化合物の自家蛍光による蛍光値を差し引くためのcontrolプレート(Plate B)に、POD分注により各化合物(２ｍＭ)を１００ｎＬ／ウェル分注した（n=4、化合物の終濃度１０μＭ、DMSOの終濃度０．５％）。controlおよびbackground用として、同濃度のDMSOを含む水溶液を１００ｎＬ／ウェル分注した（n=16）。
（２）Plate AおよびBについて、以下の工程を行った。
(Plate A)
（ａ）被験化合物、controlおよびbackground用の各ウェルに、上記１と同様の組成を有する酵素液および基質液を１０μＬずつ添加した。
（ｂ）プレートを遠心機でスピンダウンし、室温で２時間インキュベートした。
（ｃ）検出液（３００ｍＭ酢酸亜鉛二水和物（ｐＨ５．０）溶液）を２０μｌ／ウェル添加し、プレートを遠心機でスピンダウンした。

(Plate B)
上記（ａ）〜（ｃ）の工程を試験管にて行い反応を終了させた後に、溶液をプレートに分注した。
（３）マルチラベルプレートリーダーＡＲＶＯで各被験化合物、controlおよびbackgroundの蛍光強度を測定した（Ex 340 nm、Em 460 nm）。
（４）各プレートのＳ／Ｂ、ＣＶ（backgroundおよびcontrol）およびＺ’を、backgroundおよびcontrolの測定値から上記１の各式に基づき、算出した（ｎ≧４）。
（５）Plate Bの蛍光強度からPlate Aの蛍光強度を差し引いた値を用い、controlを反応１００％、backgroundを反応０％として、下式に基づき、阻害率（ＩｎＨ（％））を算出した。ＩｎＨ（％）が２０％以上の化合物を候補化合物とし、更にＩｎＨ（％）が７０％〜１００％の化合物をＫＡＴ２阻害剤として有用な化合物として選定した。

ＩｎＨ（％）＝１００ｘ｛（Ｓ_ＲａｗＢ−Ｓ_ＲａｗＡ）／（Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）｝

Ｓ_ＲａｗＢ：Plate Bの被験化合物の蛍光強度の平均値−Plate Bのbackgroundの平均値
Ｓ_ＲａｗＡ：Plate Aの被験化合物の蛍光強度の平均値−Plate Aのbackgroundの平均値
Ｃｏｎｔｒｏｌ：Plate Aのcontrolの蛍光強度の平均値
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Plate Aのbackgroundの蛍光強度の平均値

［結果］
各プレートのＳ／Ｂ比、ＣＶ（％）（controlおよびbackground）およびＺ’値を、表１に示す。

スクリーニングに用いた39種類の化合物におけるＩｎＨ（％）の平均値および標準偏差を、表２に示す。

上記結果より、ＩｎＨ（％）が７０％〜１００％を示す36、37および38をＫＡＴ２阻害剤候補化合物として同定した。これらの化合物は、カルベノキソロン、グリチルリチン酸およびグリチルレチン酸であり、非常に構造が類似していることが認められた。あらゆる構造を有する被験化合物の中で、驚くべきことにグリチルリチン酸やその誘導体が共通して優れたＫＡＴ２阻害作用を有し得ることが示された。すなわち、これらの化合物と構造が類似する化合物もまた、ＫＡＴ２阻害剤として有用であり得ると考えられる。

実施例２：既存薬剤および候補化合物のＫＡＴ２阻害活性の検討
実施例１の測定方法と同様の方法にしたがって、市販のＫＡＴ２阻害剤であるＰＦ−０４８５９９８９、ＢＦＦ−１２２およびＳ−ＥＳＢＡとスクリーニングで得られた化合物、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸およびカルベノキソロンの各測定濃度の蛍光強度を測定して、ＫＡＴ２阻害率を算出した。算出された阻害率および測定濃度（log濃度（ｎＭ）換算）に基づいて検量線を作成し、ＩＣ_５０値を算出した。

ＰＦ−０４８５９９８９、ＢＦＦ−１２２、Ｓ−ＥＳＢＡ、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸およびカルベノキソロンの各測定濃度の蛍光強度の平均値(n=3)を、表３に示す。

ＰＦ−０４８５９９８９、ＢＦＦ−１２２、Ｓ−ＥＳＢＡ、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸およびカルベノキソロンの各測定濃度のlog濃度（ｎＭ）およびその阻害率の平均値（n=3）を表４に示し、そして、各化合物のＩＣ_５０値（μＭ）を表５に示す。また、各化合物のlog濃度とその阻害率の関係およびＩＣ_５０値を図１に示す。

上記結果より、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンは、既存のBFF-122および(S)-ESBAに比べて、優れたＫＡＴ２阻害活性を有することが示された。

実施例３：既存薬剤および候補化合物のＫＡＴ２阻害活性の反応速度論的検討
既存薬剤としてPF-04859989、本願化合物としてグリチルリチン酸、グリチリレチン酸およびカルベノキソロンを用いて、Lineweaver-Burkプロットによる阻害様式の判定を行った。具体的には、１．５ｍＬチューブに、化合物溶液またはcontrolであるDMSO溶液（）、３０μＬの酵素液（実施例１の酵素液（被験化合物およびcontrol用）と同じ組成）、７０μＬの基質液（実施例１の基質液と同じ組成であるが、基質(KYN)の濃度を10 mM、5 mM、2.5 mM、1.25 mM、0.625 mMまたは0.3125 mMとした）、そして、化合物溶液またはcontrolとしてDMSO溶液を加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。さらに、該チューブに除タンパク液（3%過塩素酸；１００μＬ）を加えて撹拌し、次いで、14,000rpmで10分間遠心分離してタンパク質を沈殿させた。上清をHPLC用チューブに移し、キヌレン酸濃度を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定して、Lineweaver-Burkプロットによる各化合物のＫＡＴ２阻害の解析を行った。

PF-04859989、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンの基質濃度と酵素反応速度のグラフおよびLineweaver-Burkプロットを図２〜図５に示す。各化合物のLineweaver-Burkプロットから明らかなように、PF-04859989は非競合阻害剤としてＫＡＴ２活性を阻害するのに対し、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンは競合阻害剤としてＫＡＴ２阻害作用を有することが示された。
すなわち、グリチルリチン酸またはその誘導体は、既存薬剤とは異なり、競合阻害剤として機能するものと認められる。

実施例４：候補化合物のＫＡＴ２選択性の検討
グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンについて、ＫＡＴ１、ＫＡＴ２、ＫＡＴ３およびＫＡＴ４の阻害活性を測定し、候補化合物のＫＡＴ２選択性を検討した。
キヌレン酸の定量化に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた以外は、実施例１の方法と同様の方法にしたがって、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンのＫＡＴ１（ヒトＫＡＴ１）およびＫＡＴ２（ヒトＫＡＴ２、マウスＫＡＴ２）に対する阻害活性（ＩＣ_５０値（μＭ））を測定した。ＫＡＴ１酵素阻害活性の測定には、基質としてキヌレニンおよびピルビン酸ナトリウムを用い、ＫＡＴ２酵素阻害活性の測定（ヒトおよびマウス）には、基質としてキヌレニンおよびα−ＫＧを用いた。
また、実施例３の測定方法と同様の方法にしたがって、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンの各測定濃度におけるＫＡＴ３基質溶液およびＫＡＴ４基質溶液中のキヌレン酸濃度を測定して、GraphPad Prism v6.07を用いて非線形回帰から各化合物のＫＡＴ３（ヒトＫＡＴ３）およびＫＡＴ４（ヒトＫＡＴ４）に対する阻害活性（ＩＣ_５０値（μＭ））を測定した。

グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンのＫＡＴ１、ＫＡＴ２、ＫＡＴ３およびＫＡＴ４阻害活性（ＩＣ_５０値（μＭ））を表６に示す。

グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびカルベノキソロンは、ＫＡＴアイソザイムの中でＫＡＴ２に対する阻害活性が高いことが示された。すなわち、グリチルリチン酸および誘導体は、高いＫＡＴ２選択性を示すと認められる。

実施例５：in vivoにおけるグリチルリチン酸のＫＡＴ２阻害作用の検討
８週齢のC57BL/6N雄性マウスに、生理食塩水に溶解したグリチルリチン酸（25mg/kg(n=7)または50mg/kg(n=8)）を３日間経口投与した。また、対照として生理食塩水を３日間経口投与した(n=7)。最終投与の翌日（投与開始から４日目）に、マウスの腹部大静脈から血液を採取し、実施例３の測定方法と同様の方法にしたがって、採取した血液から血清中のキヌレン酸濃度を測定した。

対照群、グリチルリチン酸(25mg/kg)投与群、およびグリチルリチン酸(50mg/kg)投与群のマウスにおける、血清中キヌレン濃度（ｎＭ）の平均値（±標準偏差）を表７および図６に示す。

上記結果より、グリチルリチン酸は、濃度依存的に血清中キヌレン酸の濃度を低下させることが示された。すなわち、グリチルリチン酸およびその誘導体は、in vivoにおいてもＫＡＴ２阻害活性を示すと認められる。

本発明は、トリプトファン−キヌレニン代謝経路におけるＬ−ＫＹＮからＫＹＮＡへの変換に関与するＫＡＴ２の機能を阻害し、ＫＹＮＡ産生増加を抑制することにより、ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患、例えば統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害、アルツハイマー病などの治療に有用である。

Claims

式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１は、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、グルクロン酸基またはジグルクロン酸基であり、ここで、Ｒ’は、ハロゲンまたはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルであり、ｎは１〜３であり；および
Ｒ^２は、水素またはハロゲンもしくはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルである］
で示される化合物またはその塩を含む、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）産生増加に起因する疾患を治療するための医薬組成物。
Ｒ^１が、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３またはジグルクロン酸基であり；および
Ｒ^２が、水素またはＣＨ_３である、請求項１記載の医薬組成物。
化合物が、以下：
から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
該ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患が、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳マラリア、ＨＩＶ脳症、ダウン症候群、双極性障害またはアルツハイマー病である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
該ＫＹＮＡ産生増加に起因する疾患が、統合失調症である、請求項４記載の医薬組成物。
式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１は、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、グルクロン酸基またはジグルクロン酸基であり、ここで、Ｒ’は、ハロゲンまたはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルであり、ｎは１〜３であり；および
Ｒ^２は、水素またはハロゲンもしくはアミノで置換されていてもよいＣ_１−６アルキルである］
で示される化合物またはその塩を含む、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ２（ＫＡＴ２）阻害剤。