JP2019162038A - プレートの製造方法、製造装置、及び製造プログラム、並びに製造されたプレート - Google Patents

Abstract

【課題】目的の塩基配列の数が特定されている核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができるプレートの製造方法の提供。【解決手段】目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する標識付与工程と、前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、を含むプレートの製造方法である。【選択図】図４Ａ

Description

本発明は、プレートの製造方法、製造装置、及び製造プログラム、並びに製造されたプレートに関する。

近年、分析技術の高感度化により、測定対象を分子数単位で測定することが可能となっており、食品、環境検査、及び医療へ、微量核酸を検出する遺伝子検出技術の産業利用が求められている。

例えば、分子生物学研究分野で多く使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)は、その技術特性から、理論上１分子の核酸からでも増幅が可能とされている。
これらの微量の遺伝子検出においては、定量解析を行う場合に、標準試料を用いる必要がある。例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を限界希釈し、得られた希釈液のリアルタイムＰＣＲの結果から、目的とする分子数を含む希釈液を選別する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、特定のコピー数のＤＮＡ断片を細胞に遺伝子組み換え技術により導入し、培養した細胞を単離することにより、目的のコピー数のＤＮＡ断片を含有する標準試料の製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。

本発明は、目的の塩基配列の数が特定されている核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができるプレートの製造方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するための手段としての本発明のプレートの製造方法は、
目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する標識付与工程と、
前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、
を含むことを特徴とする。

本発明によると、目的の塩基配列の数が特定されている核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができるプレートの製造方法を提供することができる。

図１Ａは、電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 図１Ｂは、ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 図１Ｃは、図１Ｂにおけるピエゾ方式の液滴吐出の変形例の模式図である。 図２Ａは、液滴の状態の一例を示す模式図である。 図２Ｂは、液滴の状態の一例を示す模式図である。 図２Ｃは、液滴の状態の一例を示す模式図である。 図３は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるプレートの製造装置の一例を示す概略図である。 図４Ａは、液滴形成装置の一例を示す模式図である。 図４Ｂは、図４Ａの液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。 図５は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。 図６は、マイクロ流路中を通過してきた核酸をカウントする方法の一例を示す模式図である。 図７Ａは、マイクロ流路中を通過してきた核酸をカウントする方法の他の一例を示す模式図である。 図７Ｂは、マイクロ流路中を通過してきた核酸をカウントする方法の他の一例を示す模式図である。 図８は、マイクロ流路中を通過してきた核酸をカウントする方法の他の一例を示す模式図である。 図９は、プレートの製造装置における、プレートの製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。

従来のＰＣＲ装置を用いた個別の分析では、反応液の組成やＰＣＲ装置の性能の影響により１分子の検出が必ずしも可能とは言えない。そこで、個別の分析法について感度などの検証が求められるようになってきており、この傾向は国際的な市場の拡大を背景により強くなっている。
しかし、１分子あるいは極めて低分子数のＤＮＡの検出を対象とした方法は、いまのところ確立されていない。このような検出方法においては、含まれるＤＮＡの分子数がわかっているサンプル（標準試料）の提供が必要であるが、従来の技術では数分子レベルでの標準試料の供給は困難である。
上記特許文献２に記載の方法には、１分子の核酸の標準試料を作製する方法が記載されている。しかし、上記特許文献２に記載の方法では、２分子以上の核酸の標準試料の作製は難しい。また上記特許文献２に記載の方法では、対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入するため、細胞由来の核酸や細胞質などの夾雑物が含有する。細胞由来の夾雑物が含有された標準試料は、非特異的な増幅が起きたりＰＣＲなどの反応において反応効率が低下するなどの問題が生じるため、できるだけ標準試料には、細胞由来の夾雑物が含有されていないことが望ましい。
また、１分子あるいは極めて低分子数のＲＮＡの検出を対象とした方法はいまだ提供されていない。

本発明者らは、検討を重ねた結果、遺伝子検査に基づく分析検査等において標準試料として使用可能な、目的の塩基配列の数が既知の核酸が所定のウェルに配置されているプレートの製造方法として、以下の構成のプレートの製造方法が有効であることを見出した。
本発明のプレートの製造方法によれば、目的の塩基配列の数が特定された核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができる。これにより、精度の高い標準試料を作製することができる。このような高精度の標準試料を用いることで、ＤＮＡやＲＮＡを対象とした核酸増幅技術を含む遺伝子検査に基づく分析検査の性能評価や精度管理が良好に行える。

（プレートの製造方法、製造装置、製造プログラム）
本発明のプレートの製造方法は、標識付与工程と、微小区画化工程と、標識検出工程と、塩基配列の数特定工程と、核酸配置工程と、を含む。本発明のプレートの製造方法は、必要に応じて、その他の工程を含むことができる。
本発明のプレートの製造装置は、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を用いて、微小区画化手段と、標識検出手段と、塩基配列の数特定手段と、核酸配置手段と、を有する。本発明のプレートの製造装置は、必要に応じて、その他の手段を有することができる。
本発明のプレートの製造プログラムは、核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配するプレートの製造方法に用いるプログラムである。
本発明のプレートの製造プログラムは、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分し、微小区画に区分する前、又は微小区画に区分した後に、標識を検出する、処理をコンピュータに実行させる。また本発明のプレートの製造プログラムは、標識を検出した結果をもとに、微小区画の１区画内に存在する核酸の目的の塩基配列の数を特定し、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配する、処理をコンピュータに実行させる。
本発明のプレートの製造方法は、本発明のプレートの製造装置を用い、本発明のプレートの製造装置は、本発明のプレートの製造方法を実施することと同義であるので、本発明の製造方法の説明を通じて本発明のプレートの製造装置の詳細についても明らかにする。また、本発明のプレートの製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明のプレートの製造装置として実現させることから、本発明のプレートの製造装置の説明を通じて本発明のプレートの製造プログラムの詳細についても明らかにする。

＜標識付与工程＞
標識付与工程とは、目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する工程である。
＜＜目的の塩基配列を有する核酸＞＞
目的の塩基配列とは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できるが、例えば、以下のものであると好ましい。
目的の塩基配列は、感染症検査に用いられる塩基配列（ウイルスの保存領域）、自然界に存在しない塩基配列、遺伝子組換えに用いられる塩基配列、動物由来の塩基配列、植物由来の塩基配列などが挙げられる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。
尚、本発明においては、目的とする塩基配列そのもの（例えば、１遺伝子であるいわゆる最小単位）を１コピーともいう。さらにこの目的の塩基配列である１コピーを有し、その他の塩基配列も含む、一つにつながれた核酸の一つの単位を１分子ともいう。本発明では、検出する核酸１つ（１分子の核酸）に対して、その核酸の中に含まれている目的の塩基配列は１コピーであるのが好ましい。

標識を付与するとは、例えば、光学的ラベル、電気的又は磁気的ラベル、あるいは放射線ラベルなどを付与することが挙げられる。光学的ラベルとしては、蛍光ラベルが好ましい。
標識物質が蛍光物質である場合、例えば、蛍光物質としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、シアニン、テキサスレッド、ジエチルアミノクマリン、リサミン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０などが挙げられる。

核酸に標識を付与する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
標識が付されたヌクレオシドを、ＰＣＲ反応で増幅させる方法、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて転写反応する方法、及びＴｄＴ反応１本鎖ＤＮＡの３’末端に目的のヌクレオチドを付加する方法のいずれかの方法を用いて、核酸に付加することなどが挙げられる。
尚、使用するプライマーは目的の塩基配列に応じて選択することができ、増幅反応条件もプライマーのＴｍ値から決定できる。
標識されたヌクレオチドを付加する数は、標識によって異なるが１００以上が好ましく、５００以上がより好ましく、１，０００以上がさらに好ましい。１００を下回ると検出下限となる可能性がある。
標識が付されたヌクレオチドとしては、例えば、標識が付されたデオキシウリジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸が挙げられる。
核酸に標識を付与する方法として、例えば、標識されたヌクレオチドと標識されていないヌクレオチドを混合してＰＣＲ増幅したり、ＰＣＲ増幅において、塩基配列におけるチミンを蛍光標識されたウラシルに置換する方法が好ましく挙げられる。

標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を形成する具体的な態様としては、例えば、以下に記載の場合が挙げられる。
（ｉ）目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、蛍光標識されたデオキシウリジン三リン酸を用いて増幅処理することにより、標識が付与された目的の塩基配列を有するＤＮＡを得る。尚、該増幅処理後に、蛍光標識された鎖を除去するために、Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）処理を行なってもよい。
（ｉｉ）目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、標識が付されたヌクレオチドと、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとを用い反応させることにより、ＲＮＡを合成し、標識が付与されたＲＮＡを得る。尚、ＲＮＡ合成処理とともに、鋳型となるＤＮＡを除去するために、ＤＮａｓｅ処理を行なってもよい。

＜微小区画化工程＞
微小区画化工程とは、標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する工程である。
微小区画に区分するとは、目的の塩基配列を１コピー有する核酸とその核酸に付与される標識との対を１単位としてみたときに、その単位を基準に、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を微小区画内に配置することをいう。
本発明では、標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液が上記１単位を基準として微小区画内に配置されるように区分されればよく、微小区画の形態に特に制限はなく、例えば、核酸含有溶液が液体状態で区画化されても、ゲル状態で区画化されてもよい。
好ましい態様としては、核酸含有溶液が液体状態で、例えば、液滴として微小区画化されることが挙げられる。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりをいう。
本発明の微小区画化する好ましい態様として、プレートのウェルに着弾される１液滴内に、上記１単位を基準とする標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を配置する態様が挙げられる。
本発明では、目的の塩基配列を１コピー有する核酸とその核酸に付与される標識とからなる１単位が、その１単位を基準として液滴中に配置されるが、より好ましくは、１単位１液滴となるように区分されている態様である。
但し、１液滴に２単位入ってしまった場合を除く趣旨ではない。１液滴に２単位入っている場合でも、核酸に付与されている標識に対して行なった検出結果から、液滴中に目的の塩基配列が２コピー分入っていることを特定すれば、１液滴中に含まれる目的の核酸配列のコピー数を特定することができるからである。

本発明においては、核酸に標識を付与し、いったん上述した１単位の関係を形成した後は、プレート上の各ウェルに分注するまで、その１単位の数や量が変化するような一切の反応は行わない。つまり、いったん核酸に標識を付与した後は、プレート上の各ウェルに分注するまで、目的の塩基配列に対し増幅反応させたり、核酸に標識となる物質を追加で付与する等の追加の反応処理は行わない。
これにより、目的の塩基配列を１コピー有する核酸に対し、その核酸に付く標識となる物質の数（量）が対応付けられ、標識を検出することにより、その検出された結果から、目的の塩基配列のコピー数を正確に特定することができる。
また、本発明では、標識する物質は、核酸に直接付与しており、細胞を用いて標識を行なっていないため、細胞を含まない態様で液滴化している。したがって、液滴を分注した各ウェルの中には、細胞を構成する成分、例えば、細胞膜、細胞質、その他細胞から分解されたものなどの細胞由来のものは入っていない。これにより、製造されたプレートを使ってそれ以降の反応を行う際、細胞由来の夾雑物が含有されていないため、反応効率の低下等の問題を防止することができる。

微小区画に区分する方法として、以下、液滴に区分する場合を例に説明する。
液滴に区分する方法としては、プレートのウェルに着弾させる１液滴内に、上記１単位を基準とする標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を配置することができる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて各種の方法が選択できる。
例えば、液滴を吐出する方法が挙げられる。液滴を吐出する方法としては、例えば、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する液滴形成装置を用いて液滴を吐出する方法や、フローサイトメーター／セルソーターを用いて液滴を吐出する方法などが挙げられる。
液滴に区分する方法の具体的実施形態については、後述する。

＜標識検出工程＞
標識検出工程とは、微小区画に区分する前、又は微小区画に区分した後に、標識を検出する工程である。
微小区画に区分する前、又は微小区画に区分した後に、標識を検出する具体的実施形態については、後述する。
標識を検出する方法としては、例えば、光学的ラベルを光学的に検出する、電気的又は磁気的ラベルを検出する、あるいは放射線ラベルの放射線量を検出等が挙げられる。
中でも、蛍光ラベルを光学的に検出することが、好ましい。

＜塩基配列の数特定工程＞
塩基配列の数特定工程とは、標識を検出した結果をもとに、微小区画の１区画内に存在する核酸の目的の塩基配列の数を特定する工程である。
上述したように、目的の塩基配列を１コピー有する核酸に対し、その核酸に付く標識（具体的には、標識物質、例えば、蛍光物質）の数（量）は対応付けられている。目的の塩基配列を１コピー有する核酸とその核酸に付いている標識物質とが対になり１単位を形成し、その１単位を基準に１区画内に含まれている。したがって、その標識を検出し、その結果（検出量）をもとにすれば、目的の塩基配列のコピー数を正確に特定することができる。例えば、蛍光強度を測定することにより、その蛍光強度の結果をもとに、どのくらいの標識物質が付与されているかが特定でき、さらにはその標識物質が付いている目的の塩基配列のコピー数を特定することができる。

＜核酸配置工程＞
核酸配置工程とは、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配する工程である。
上述したように、＜塩基配列の数特定工程＞において、１液滴中に存在する目的の塩基配列のコピー数が特定できる。したがって、プレート上の所望の位置のウェルに、目的の塩基配列の数が所望の数となるよう、液滴を所定の数分注することができる。
ウェルに配される核酸における目的の塩基配列のコピー数としては、一般的に感染症の検量線用途、例えばノロウイルスの通知法では１０^０から１０^７までの領域で検量線が作製されることから、１０^０コピー以上１０^７コピー以下が好ましい。

＜プレートの製造方法、製造方法の具体的な実施形態＞
以下、本発明のプレートの製造方法、製造装置の具体的な実施形態について、説明する。

＜＜（１）液滴吐出後に標識を検出する実施形態＞＞
＜＜＜液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する液滴形成装置を用いて液滴を吐出し、液滴吐出後に標識を検出する方法＞＞＞
液滴吐出後に標識を検出する方法の一例として、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する液滴形成装置を用いて液滴を吐出し、その後、標識を検出する方法が挙げられる。
これは、液滴を吐出後、プレート上のウェル内に液滴が着弾する前に、標識を検出する方法である。
−液滴形成方法−
標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸の溶液（以下、特定の核酸溶液ともいう）を、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を用いて、液滴として吐出する。
吐出とは、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸の溶液を液滴として飛翔させることをいう。

液滴を吐出する方式としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。

圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。
液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）の構成例を図１Ａ〜図１Ｃに示す。
図１Ａは、電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１２、液室１０、特定の核酸溶液１４、及びノズル１１を有する。
電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図１Ｂは、ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１０、特定の核酸溶液１４、及びノズル１１を有する。
ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
また、より好ましい構成として図１Ｃに示した構成なども挙げられる。図１Ｃは、図１Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の液滴吐出ヘッドの変形例の模式図である。図１Ｃの液滴吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１０、特定の核酸溶液１４、及びノズル１１を有する。
図１Ｃの液滴吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。

本発明において使用することができる液滴吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。
液滴吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図２Ａ〜図２Ｃは、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。図２Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１５が急激に変形することによって、液室１０内に保持された特定の核酸溶液とメンブレン１５との間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。次に、図２Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図２Ｃに示すように、メンブレン１５が元の状態に戻る際に特定の核酸溶液とメンブレン１５との界面近傍の液圧力が低下し、液滴１６が形成される。

本発明のプレートの製造方法では、凹部が形成されたプレートを移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と液滴吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、凹部に順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら液滴吐出ヘッドを移動させてもよい。

図３は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるプレートの製造装置の一例を示す概略図である。
図３に示すように、液滴を着弾させるプレートの製造装置２は、液滴形成装置１と、プレート２３と、ステージ２４と、制御装置２５とを有している。

プレートの製造装置２において、プレート２３は、移動可能に構成されたステージ２４上に配置されている。プレート２３には液滴形成装置１の液滴吐出ヘッドから吐出された液滴２２が着滴する複数のウェル２０（凹部）が形成されている。制御装置２５は、ステージ２３を移動させ、液滴形成装置１の液滴吐出ヘッドとそれぞれのウェル２０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置１の液滴吐出ヘッドからそれぞれのウェル２０中に順次、蛍光標識された目的の塩基配列を有する核酸（以下、特定の核酸ともいう）２１を含む液滴２２を吐出することができる。

制御装置２５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置２５の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置２５の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御装置２５は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。

−液滴の吐出後に標識を検出する検出方法：光学的な検出方法−
図４Ａを用いて、液滴の吐出後に標識を検出する方法であって、光学的に標識を検出する方法について、以下説明する。
図４Ａは、液滴形成装置の一例を示す模式図である。図４Ｂは、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。図４Ａに示すように、液滴形成装置１は、液滴形成手段である液滴吐出ヘッド３０と、駆動手段３４と、標識物質の検出手段である光照射手段（光源）３５及び受光手段（受光素子）３６と、制御手段３７とを有する。
駆動手段３４によって液滴吐出ヘッド３０から液滴が吐出され、駆動手段３４からの駆動信号と同期して発光する光Ｌによって飛翔液滴中の蛍光標識が蛍光を発する。その蛍光を受光素子３６が受光し、受光素子３６からの標的物質の検出結果の情報をもとに、飛翔液滴中の目的の塩基配列のコピー数がカウントされる。
図４Ａ及び図４Ｂを用いて、さらに詳しく説明する。

図４Ａでは、目的の塩基配列を有する核酸を蛍光ラベルによって付加した後に所定の溶液に分散した液（特定の核酸溶液）を用いている。液体吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し標識物質から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。

液体吐出ヘッド３０は、液室１０と、メンブレン３１と、駆動素子１３ｂとを有しており、特定の核酸溶液３２を液滴として吐出することができる。

駆動素子１３ｂに駆動手段３４から駆動信号を供給することにより、メンブレン３１を振動させることができる。メンブレン３１の振動により、特定の核酸溶液３２の液滴２２を、ノズル３３から吐出させることができる。

光源３５は、飛翔中の液滴２２に光Ｌを照射する。

受光素子３６は、飛翔中の液滴２２に蛍光ラベルが付与された目的の塩基配列を有する核酸（特定の核酸）２１が含有されていた場合に、蛍光ラベルが光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。

制御手段３７は、駆動手段３４及び光源３５を制御する機能を有している。

図４Ｂは、図４Ａの液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。図４Ｂに示すように、液滴形成装置１は、特定の核酸２１から発せられる蛍光Ｌｆ_１を受光する受光素子３６−１に加え、特定の核酸２１から発せられる蛍光Ｌｆ_２を受光する受光素子３６−２を設けた点が、図４Ａの液滴形成装置１と相違する。

ここで、蛍光Ｌｆ_１及びＬｆ_２は、特定の核酸２１から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子３６−１及び３６−２は、特定の核酸２１から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。

制御手段３７のコピー数を計数する手段は、受光素子３６からの情報に基づいて、液滴２２に含有された特定の核酸２１における目的の塩基配列のコピー数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子３６からの情報とは、蛍光標識された目的の塩基配列を有する核酸２１に付与されている蛍光物質にもとづく輝度値（光量）である。
コピー数を計数する手段は、例えば、受光素子３６が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光標識された目的の塩基配列を有する核酸２１のコピー数を特定（計数）することができる。

＜＜＜液滴を吐出する方式の別態様＞＞＞
上述した、オンデマンド方式以外の方式で液滴を吐出する方法として、例えば、連続的に液滴を吐出させるコンティニュアス方式による液滴形成方法が挙げられる。
コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向を電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。
このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。
尚、セルソーター、又はフローサイトメーターは、液滴吐出前に標識を検出する態様で使用することもできる。よって、その場合の態様については、下記＜＜（２）液滴吐出前に標識を検出する実施形態＞＞の欄で詳しく説明する。

＜＜＜電気的又は磁気的な検出による態様＞＞＞
上述した光学的な検出を、電気的又は磁気的な検出に変えることもできる。電気的又は磁気的に検出する方法としては、図５に示すように、液室１０から特定の核酸溶液を液滴２２としてプレート３９に吐出する液滴吐出ヘッドの直下に、コピー数計数のためのコイル３８がセンサとして設置されている。核酸には特定の磁気ビーズが付加されており、磁気ビーズが付着した核酸がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の目的の塩基配列の有無を検出することができる。

＜＜（２）液滴吐出前に標識を検出する実施形態＞＞
＜＜＜フローサイトメーター／セルソーターを用いて、液滴吐出前に標識を検出する方法＞＞＞
液滴を吐出する前に標識を検出する方法としては、図６に示すマイクロ流路４１中を通過してきた特定の核酸２１をカウントする方法が挙げられる。図６はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。図６では、マイクロ流路４１中に光源４４からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ４３を用いて検出器４２により検出することによって目的の塩基配列を有する核酸の有無を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路４１中に通過した目的の塩基配列のコピー数を特定することができる。特定の核酸２１が存在する領域、存在しない領域のそれぞれに対応した液滴が吐出されるため、特定の核酸２１が液滴内に配置されている液滴を選択することができ、特定の核酸２１が液滴内に配置されている液滴のみをウェル中に着弾させることができる。これにより、所定のコピー数の目的の塩基配列を有する核酸を、ウェル中に着弾させることができる。

−フローサイトメーター／セルソーターの形態−
フローサイトメーター／セルソーターの形態としては、図７Ａに示すキャピラリー方式のフローセル、図７Ｂに示すシース液方式のフローセル、いずれも用いることができる。
図７Ａ、及び図７Ｂにおいて、符号４１はマイクロ流路を、符号２１は目的の塩基配列を有する核酸（特定の核酸）を、符号４５は光源を、符号４６は分光器・検出器を、符号４７は荷電手段を、符号４８はシース液導入を示す。
荷電手段４７は、水流が液滴に分かれる直前に＋又は−の荷電を加える手段である。これにより、特定の核酸が含まれている液滴を＋又は−に帯電させることができる。例えば、液滴が偏光板の間を落下するとき、帯電されている液滴は＋に荷電した液滴は−極板側に、−に荷電した液滴は＋極板側に、引き寄せられる。これにより、特定の核酸が含まれる液滴をプレートのウェル上に着弾させることができる。一方、帯電されなかった液滴はそのまま落下するため、回収して廃棄することができる。

＜＜＜ドロップレットジェネレータを用いて、液滴吐出前に標識を検出する方法＞＞＞
ドロップレットジェネレータを用いて、液滴吐出前に標識を検出することもできる。ドロップレットジェネレータでは、例えば、図８で示すように、液滴吐出前にマイクロ流路内で標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸（特定の核酸）２１を含む液滴５１が形成されている。マイクロ流路内で液滴状態を形成する方法としては、特許第３７４６７６６号の方法等を用いることができる。
図８において、符号２１は特定の核酸を、符号５１は液滴を、符号５２は光源を、符号５３は分光器・検出器を、符号５４は負電極を、符号５５は正電極を、符号５６はオイル導入を示す。
ドロップレットジェネレータでは、特定の核酸が含まれる液滴を含まれていない液滴と区別した後、該液滴を吐出することにより、特定の核酸が含まれる液滴をプレートのウェル上に着弾させることができる。

＜プレートの製造プログラム＞
プレートの製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明のプレートの製造装置において、プレートの製造方法を実行させるものである。
プレートの製造プログラムによる処理は、プレートの製造装置を構成する制御部を有するコンピュータを用いて実行することができる。
プレートの製造装置は、例えば、図３で示すように、液滴形成装置１と、プレート２３と、ステージ２４と、制御装置２５とを有する。液滴形成装置１は、図４Ａで示すように、液滴吐出ヘッド３０と、駆動手段３４と、光源３５と、受光素子３６と、制御手段３７とを有する。ここで、プレートの製造装置における制御装置２５は、液滴形成装置１の制御手段３７を兼ねることもできる。
そして、このプレートの製造装置における制御装置２５において、プレートの製造プログラムを実行することができる。

本発明のプレートの製造プログラムの処理手順の一例を示す。図９は、本発明のプレートの製造装置を用いて、液滴吐出ヘッドから吐出された液滴に含まれる特定の核酸のコピー数を特定し、液滴をプレートのウェルに着弾させるまでの、プレートの製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。

（製造されたプレート）
上記本発明のプレートの製造方法により、以下のプレートが製造される。
本発明のプレートは、少なくとも１つのウェルを有する。
プレートにおけるウェルには、目的の塩基配列の数が特定された核酸が含まれており、細胞を構成する成分、例えば、細胞膜、細胞質、その他細胞から分解されたものなどの細胞由来のものは入っていない。
プレートは、プレートを認識するための認識手段と、ウェルに含まれている核酸に関する情報を保持する情報保持手段とを有する。

＜ウェル＞
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ウェルの形状としては、核酸などを配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、プレート上の区画などが挙げられる。
ウェルの数は、少なくとも１つであり、２以上の複数であることが好ましい。
ウェルの容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、一般的な核酸検査装置に用いられる試料量を考慮すると、１０μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。
ウェルの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。

＜プレート＞
プレートの材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
プレートの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。

＜認識手段＞
認識手段は、プレートに設けられ、プレートを認識するための手段である。
認識手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷などが挙げられる。
認識手段を設ける位置及び認識手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

＜情報保持手段＞
情報保持手段は、プレートの測定領域以外の部位に、複数のウェルに収容されている核酸に関する情報を記憶する手段である。なお、プレートの測定領域とは、測定対象物を保持可能なウェル部をいう。
情報保持手段としては、例えば、メモリ、ＩＣチップなどが挙げられる。
プレートの測定領域以外の部位としては、測定する領域以外の部位であれば、プレートの内部であってもプレートの外部であってもよい。
情報保持手段は、プレートから着脱可能に設けられていることが好ましい。情報保持手段の着脱方法としては、プレートと情報保持手段の境界部にミシン目を設けておくことにより、必要に応じてミシン目に沿って情報保持手段を切り離すことができる。これにより、プレートを分析装置に挿入する際には、情報保持手段をプレートから切り離して、切り離した情報保持手段を読み取り装置に入れて、両者を対応付けすることができる。
情報保持手段は、結合部材によりプレートに取り付けられていることが好ましい。これにより、情報保持手段の紛失を防止することができる。結合部材としては、例えば、紐、磁石などが挙げられる。
認識手段に記憶させる情報としては、ウェルに含まれている核酸に関する情報であり、各ウェルにおける、目的の塩基配列のコピー数の情報や、その他、例えば、分析結果（発光強度等）、核酸の種類、測定日時、測定者の氏名などの情報が挙げられる。

認識手段の読み取りは、目視、プレートを分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。また、分析装置の外部にある読み取り装置を用いることもできる。
情報保持手段に記憶されている情報の読み取りは、外部の情報読み取り装置を用いて行うことができ、プレートを分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。

認識手段と情報保持手段との対応付け方法は、情報保持手段にも認識手段と同じ認識表示を記憶させたり、認識手段が有する認識情報を情報保持手段が記憶することで行われる。

上述したように、本発明のプレートの製造方法においては、標識する物質は、核酸に直接付与しており、細胞を用いて標識を行なっていない。したがって、液滴を分注した各ウェルの中には、細胞を構成する成分、例えば、細胞膜、細胞質、その他細胞から分解されたものなどの細胞由来のものは入っていない。これにより、製造されたプレートを使ってそれ以降の反応を行う際、細胞由来の夾雑物が含有されていないため、反応効率の低下等の問題を有効に防止することができる。

本発明のプレートの製造方法により得られたプレートは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、装置構成や感染症の検量線作成などの標準プレート等に好適に用いることができる。

＜標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸の作製＞
目的の塩基配列を有する核酸（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）としてＣＲＭ ６２０４−ｂ（産業技術総合研究所：配列番号１）に、２μＭのＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ、Ｈ_２Ｏを、下記表１で示す処方で加えた。そして、６５℃、５分間処理し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１を得た。
ここで、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製（配列番号３）を用いた。ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘは、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。

次いで、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ Ｂｕｆｆｅｒ、１００ｍＭ ＤＴＴ、ＲｎａｓｅＯＵＴ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを、下記表２で示す処方で加えた。そして、５５℃、３０分間処理後、８０℃、１０分間処理し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２を得た。
ここで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製を用いた。

Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２に、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ_２、２μＭのＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ、２μＭのＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘを、下記表３で示す処方で分注し、混合した。
ここで、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ_２は、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製（配列番号２）を用いた。Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製（配列番号３）を用いた。ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘは、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。

次いで、サーマルサイクラー（Ｂｉｏ ｒａｄ製 Ｔ１００）を用いて、下記表４で示す条件で蛍光標識核酸を合成した。

次いで得られた蛍光標識核酸を含む溶液の液滴を、セルソーター（Ｓｏｎｙ製ＳＨ８００）を用いて形成した。液滴吐出前に、蛍光標識を検出することにより、蛍光標識核酸に含まれる目的の塩基配列のコピー数を特定した。目的の塩基配列の数が既知の核酸が含まれている液滴をプレート上のウェル内に着弾させた。プレートは、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製)を用いた。
液滴内における目的の塩基配列の数がわかっているので、プレートの全てのウェルに対し、目的の塩基配列が１０コピーになるよう、液滴を分注した。
これにより、目的の塩基配列の数が既知である核酸をウェルに配したプレートを作製できた。

本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する標識付与工程と、
前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、
を含むことを特徴とするプレートの製造方法である。
＜２＞ 前記標識付与工程は、標識が付されたヌクレオシドを、増幅反応、転写反応、及びＴｄＴ反応のうちいずれかの反応を用いて、前記核酸に付加することにより行う、前記＜１＞に記載のプレートの製造方法である。
＜３＞ 前記ヌクレオシドが、ウリジンである、前記＜２＞に記載のプレートの製造方法である。
＜４＞ 目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、前記標識が付されたヌクレオシドと、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとを反応させることにより、ＲＮＡを合成し、標識が付与されたＲＮＡを合成する工程をさらに含む、前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載のプレートの製造方法である。
＜５＞ 前記微小区画化工程が、液滴を形成することにより行われる、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のプレートの製造方法である。
＜６＞ 前記標識の検出が、光学的ラベルの検出、電気的又は磁気的ラベルの検出、及び放射線ラベルの検出のいずれかである、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のプレートの製造方法である。
＜７＞ 標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化手段と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出手段と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定手段と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置手段と、
を有することを特徴とするプレートの製造装置である。
＜８＞ 核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配するプレートの製造方法に用いるプレートの製造プログラムであって、
標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分し、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出し、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定し、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とするプレートの製造プログラムである。
＜９＞ 少なくとも１つのウェルを有するプレートであって、
前記ウェルが、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含み、
前記ウェルには、細胞を構成する成分は含まれておらず、
前記プレートは、前記プレートを認識するための認識手段と、前記ウェルに含まれている前記核酸に関する情報を保持する情報保持手段とを有することを特徴とするプレートである。

前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のプレートの製造方法、前記＜７＞に記載のプレートの製造装置、前記＜８＞に記載のプレートの製造プログラム、及び前記＜９＞に記載のプレートによると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。

１ 液滴形成装置
２ プレートの製造装置
２３ プレート
２４ ステージ
２５ 制御装置
３０ 液滴吐出ヘッド
３４ 駆動手段
３５ 光源
３６ 受光素子
３７ 制御手段

特開２０１４−３３６５８号公報 特開２０１５−１９５７３５号公報

Claims (9)

1. 目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する標識付与工程と、
   前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、
   前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、
   前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、
   前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、
   を含むことを特徴とするプレートの製造方法。
2. 前記標識付与工程は、標識が付されたヌクレオシドを、増幅反応、転写反応、及びＴｄＴ反応のうちいずれかの反応を用いて、前記核酸に付加することにより行う、請求項１に記載のプレートの製造方法。
3. 前記ヌクレオシドが、ウリジンである、請求項２に記載のプレートの製造方法。
4. 目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、前記標識が付されたヌクレオシドと、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとを反応させることにより、ＲＮＡを合成し、標識が付与されたＲＮＡを合成する工程をさらに含む、請求項２から３のいずれかに記載のプレートの製造方法。
5. 前記微小区画化工程が、液滴を形成することにより行われる、請求項１から４のいずれかに記載のプレートの製造方法。
6. 前記標識の検出が、光学的ラベルの検出、電気的又は磁気的ラベルの検出、及び放射線ラベルの検出のいずれかである、請求項１から５のいずれかに記載のプレートの製造方法。
7. 標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化手段と、
   前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出手段と、
   前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定手段と、
   前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置手段と、
   を有することを特徴とするプレートの製造装置。
8. 核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配するプレートの製造方法に用いるプレートの製造プログラムであって、
   標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分し、
   前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出し、
   前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定し、
   前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する、
   処理をコンピュータに実行させることを特徴とするプレートの製造プログラム。
9. 少なくとも１つのウェルを有するプレートであって、
   前記ウェルが、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含み、
   前記ウェルには、細胞を構成する成分は含まれておらず、
   前記プレートは、前記プレートを認識するための認識手段と、前記ウェルに含まれている前記核酸に関する情報を保持する情報保持手段とを有することを特徴とするプレート。