JP2019150002A - Primer sets for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and methods for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria - Google Patents
Primer sets for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and methods for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019150002A JP2019150002A JP2018039963A JP2018039963A JP2019150002A JP 2019150002 A JP2019150002 A JP 2019150002A JP 2018039963 A JP2018039963 A JP 2018039963A JP 2018039963 A JP2018039963 A JP 2018039963A JP 2019150002 A JP2019150002 A JP 2019150002A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dioxane
- degrading bacteria
- gene
- primer
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】１，４−ジオキサン分解菌の検出・定量を、高精度で行うことのできるプライマーセットを提供することを課題とする。【解決手段】特定の塩基配列を含むプライマーセット、及び、プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物が存在していたか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法、並びにｍｍｏＣ遺伝子の増幅量から、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物の定量を行う１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。【選択図】図１PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a primer set capable of detecting and quantifying 1,4-dioxane-degrading bacteria with high accuracy. SOLUTION: A primer set containing a specific base sequence and a primer set are used to perform PCR, and it is determined whether or not a microorganism having a mmoC gene is present depending on whether or not gene amplification has occurred 1,4. -A method for detecting a dioxane-degrading bacterium and a method for quantifying a 1,4-dioxane-degrading bacterium for quantifying a microorganism having a mmoC gene from the amplified amount of the mmoC gene. [Selection diagram] Fig. 1
Description
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという。）に用いるプライマーセットと、このプライマーセットを利用して１，４−ジオキサン分解菌を検出、定量する方法に関する。 The present invention relates to a primer set used for polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) and a method for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria using this primer set.
１，４−ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４−ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。 1,4-Dioxane is a cyclic ether represented by the following formula (1). 1,4-Dioxane is excellent in compatibility with water and organic solvents, and is mainly used as a reaction solvent for organic synthesis.
２０１０年度の日本国における１，４−ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４−ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４−ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４−ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４−ジオキサンの規制がなされている。 The production and import amount of 1,4-dioxane in Japan in FY2010 is about 4500 t / year, and it is estimated that about 300 t / year was released into the environment. Since 1,4-dioxane is water-soluble, it is diffused over a wide area when released into the water environment. Moreover, since all of volatile property, adsorptivity to solid, photodegradability, hydrolyzability, and biodegradability are low, removal from water is difficult. Since 1,4-dioxane has acute toxicity and chronic toxicity, and carcinogenicity has been pointed out, there is a concern that pollution of the water environment by 1,4-dioxane may adversely affect humans, animals and plants. . Therefore, in Japan, 1,4-dioxane is regulated by tap water quality standards (0.05 mg / L or less), environmental standards (0.05 mg / L or less), and wastewater standards (0.5 mg / L or less). ing.
従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４−ジオキサンを十分に除去することができない。過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、１，４−ジオキサン処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコストおよびランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献１では、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下すると報告されている。 Conventional processing methods such as activated sludge method and activated carbon adsorption method cannot sufficiently remove 1,4-dioxane from water. Multiple physical chemistry, including ozone treatment with hydrogen peroxide (O 3 / H 2 O 2 ), ozone treatment under ultraviolet irradiation (O 3 / UV), ozone treatment under radiation or ultrasonic irradiation The effectiveness of 1,4-dioxane treatment has been confirmed only in the accelerated oxidation method in combination with a typical oxidation method. However, the accelerated oxidation method has not been popularized because of high initial cost and running cost. Moreover, in nonpatent literature 1, when organic substances other than 1, 4- dioxane exist, it is reported that the processing efficiency of 1, 4- dioxane by an accelerated oxidation method will fall.
低コストかつ安定的に１，４−ジオキサンを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献２では、１，４−ジオキサン分解菌による生物処理が提案されている。生物処理は、１，４−ジオキサン分解菌を、曝気槽、土壌、地下水等へ投入し、これらに含まれる１，４−ジオキサンを分解する方法である。しかし、１，４−ジオキサン分解菌の菌体量は日々変動する。１，４−ジオキサン分解菌が減少すると処理能力が低下するため、１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を把握し、菌体量が少なければ追加する必要がある。 There is a demand for a method for stably treating water containing 1,4-dioxane at low cost, and in Patent Document 1 and Non-Patent Document 2, biological treatment with 1,4-dioxane-degrading bacteria is proposed. Biological treatment is a method in which 1,4-dioxane degrading bacteria are introduced into an aeration tank, soil, groundwater, etc., and 1,4-dioxane contained therein is decomposed. However, the amount of 1,4-dioxane-degrading bacteria varies from day to day. When 1,4-dioxane-degrading bacteria decrease, the processing capacity decreases, so the amount of 1,4-dioxane-degrading bacteria needs to be grasped, and if the amount of bacteria is small, it needs to be added.
ここで、非特許文献３、４には、１，４−ジオキサン分解菌が有するＴＨＦモノオキシゲナーゼが１，４−ジオキサンの分解に関与していることが報告されている。
本発明者らは、分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子のなかで、ＴＨＦモノオキシゲナーゼを構成するタンパク質の一つであるＭｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＭｍｏＢ／ＤｍｐＭをコードするｔｈｍＣ遺伝子により、分解菌を検出、定量することができることを報告している（特許文献２）。
Here, Non-Patent Documents 3 and 4 report that THF monooxygenase possessed by 1,4-dioxane degrading bacteria is involved in the degradation of 1,4-dioxane.
Among the genes involved in 1,4-dioxane degradation possessed by the degrading bacteria, the present inventors use the thmC gene encoding Monoxygenase component MmoB / DmpM, which is one of the proteins constituting THF monooxygenase. Has been reported to be able to be detected and quantified (Patent Document 2).
ここで、ＴＨＦモノオキシゲナーゼは、多様な炭化水素類の初発酸化を担っている可溶性鉄（ＩＩ）モノオキシゲナーゼ（ＳＤＩＭＯ）の一種に分類されており、ＳＤＩＭＯには他にメタン／プロパンモノオキシゲナーゼ等が含まれている（非特許文献５）。
そして、ｔｈｍ遺伝子群を有さない１，４−ジオキサン分解菌の存在が確認されており、これらｔｈｍ遺伝子群を有さない１，４−ジオキサン分解菌が有する分解遺伝子は特定されていない。そのため、ｔｈｍ遺伝子群を有していない分解菌の検出、定量方法が求められていた。
Here, THF monooxygenase is classified as a kind of soluble iron (II) monooxygenase (SDIMO) responsible for the initial oxidation of various hydrocarbons, and SDIMO includes methane / propane monooxygenase and the like. (Non-patent Document 5).
The presence of 1,4-dioxane-degrading bacteria that do not have the thm gene group has been confirmed, and the degradation genes that the 1,4-dioxane-degrading bacteria that do not have the thm gene group have not been identified. Therefore, there has been a demand for a method for detecting and quantifying degrading bacteria that do not have the thm gene group.
１，４−ジオキサン分解菌の検出・定量を、高精度で行うことのできるプライマーセットを提供することを課題とする。 It is an object to provide a primer set capable of detecting and quantifying 1,4-dioxane-degrading bacteria with high accuracy.
１．配列番号：１に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：２に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
２．配列番号：３に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：４に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
３．１．または２．に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物が存在していたか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法。
４．１．または２．に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲで得られたｍｍｏＣ遺伝子の増幅量から、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物の定量を行うことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。
1. A primer set comprising a primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
2. A primer set comprising a primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
3.1. Or 2. A method for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria, wherein PCR is performed using the primer set described in 1), and it is determined whether or not a microorganism having an mmoC gene is present depending on whether or not gene amplification has occurred.
4.1. Or 2. A method for quantifying 1,4-dioxane-degrading bacteria, comprising quantifying a microorganism having an mmoC gene from the amplification amount of the mmoC gene obtained by real-time PCR using the primer set described in 1.
本発明のプライマーセットにより、１，４−ジオキサン分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子である、ＳＤＩＭＯの一種であるＭｅｔｈａｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃをコードすると推定されるｍｍｏＣ遺伝子を特異的に増幅することができる。
ｍｍｏＣ遺伝子が増幅されることで、１，４−ジオキサン分解菌が存在しているかを判定することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法でのＣｔ値から、サンプル中に存在する１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を、精度よく推定することができる。１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を迅速に精度よく定量することができるため、菌体量が少なければ、すぐに１，４−ジオキサン分解菌を追加することができ、１，４−ジオキサンの処理能力を安定して維持することができる。
By using the primer set of the present invention, the mmoC gene presumed to encode Methane monooxygenase component C, a kind of SDIMO, which is a gene involved in 1,4-dioxane degradation possessed by 1,4-dioxane-degrading bacteria Can be amplified.
By amplifying the mmoC gene, it can be determined whether 1,4-dioxane degrading bacteria are present. In addition, the amount of 1,4-dioxane-degrading bacteria present in the sample can be accurately estimated from the Ct value in the real-time PCR method. Since the amount of 1,4-dioxane-degrading bacteria can be quickly and accurately quantified, if the amount of cells is small, 1,4-dioxane-degrading bacteria can be added immediately, The processing capacity of dioxane can be stably maintained.
１，４−ジオキサン分解菌（以下、分解菌という。）は自然界に存在しており、１，４−ジオキサンで汚染された汚泥等を、炭素源として１，４−ジオキサンのみを含む培地で培養することでスクリーニングすることができる。分解菌は、これまで１０数種の存在が報告されているが、本発明者らが保有しているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｄ６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｄ１１は、ｔｈｍ遺伝子群を有していない。なお、以下では各菌をそれぞれＤ６株、Ｄ１１株という。 1,4-Dioxane degrading bacteria (hereinafter referred to as degrading bacteria) exist in nature, and sludge contaminated with 1,4-dioxane is cultured in a medium containing only 1,4-dioxane as a carbon source. Can be screened. The presence of more than 10 types of degrading bacteria has been reported so far, but Mycobacterium sp. D6, Mycobacterium sp. D11 does not have a thm gene group. Hereinafter, each bacterium is referred to as D6 strain and D11 strain, respectively.
本発明者らは、ｔｈｍ遺伝子群を有さない分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与すると推定される遺伝子のなかで、Ｍｅｔｈａｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃをコードすると推定されるｍｍｏＣ遺伝子により、ｔｈｍ遺伝子群を有さない分解菌を検出、定量することができることを見出した。
具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１に示す塩基配列（５’−ＣＣＡＣＡＣＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣ−３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２に示す塩基配列（５’−ＧＣＡＣＡＧＧＴＡＧＧＣＧＴＣＡＴＡＧＡＧ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセット、または、フォワードプライマーとして配列番号３に示す塩基配列（５’−ＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧ−３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４に示す塩基配列（５’−ＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ｍｍｏＣ遺伝子を増幅することができ、１，４−ジオキサン分解菌を検出することができる。
Among the genes presumed to be involved in 1,4-dioxane degradation of a degrading bacterium that does not have the thm gene group, the present inventors have used the thm gene by the mmoC gene presumed to encode Methane monooxygenase component C. It was found that degrading bacteria having no group can be detected and quantified.
Specifically, a primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5′-CCACACGGTTGAAGGATTTC-3 ′) as a forward primer and a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (5′-GCACAGGGTAGGCGTCATAGAG-3 ′) as a reverse primer A primer set comprising a primer, or a primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (5′-GGCACGCGTCCTTACATCAAG-3 ′) as a forward primer and a base sequence shown in SEQ ID NO: 4 as a reverse primer (5′-TGAACATCCCCCACTGAAAC-3 The mmoC gene can be amplified by PCR using a primer set comprising a primer containing '), and 1,4-dioxane degrading bacteria can be detected.
ＰＣＲ法としては、ＭＰＮ−ＰＣＲ法、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法のいずれを用いてもよいが、迅速に高精度な結果が得られることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法は、増幅産物を蛍光によって検出する。検出方法としては、蛍光を発する色素をインターカレートするインターカレーター法や蛍光色素を結合させる蛍光プローブ法等を特に制限することなく利用することができる。
すなわち、ｍｍｏＣ遺伝子が増幅・検出されることにより、サンプル中に、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物である１，４−ジオキサン分解菌が存在しているかを判定することができる。
As the PCR method, any of the MPN-PCR method, the competitive PCR method, and the real-time PCR method may be used, but the real-time PCR method is preferable because a highly accurate result can be obtained quickly. In the real-time PCR method, amplification products are detected by fluorescence. As a detection method, an intercalator method for intercalating a fluorescent dye or a fluorescent probe method for binding a fluorescent dye can be used without any particular limitation.
That is, by amplifying and detecting the mmoC gene, it can be determined whether or not 1,4-dioxane degrading bacteria, which are microorganisms having the mmoC gene, are present in the sample.
ここで、リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。リアルタイムＰＣＲ法により、サンプルに含まれる特定の塩基配列を有するＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法により、特定のＤＮＡが増幅され、蛍光検出可能な量に達すると、急激な蛍光強度の増加が観察される。このときのサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（以下、Ｃｔ値という。）という。ＰＣＲ法では１サイクルごとにＤＮＡが２倍となり、ＤＮＡは指数関数的に増幅する。サンプル中に含まれる当初ＤＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光検出可能な量に達するため、Ｃｔ値は小さくなる。
Ｃｔ値と当初ＤＮＡ量の常用対数との間には直線関係があり、これを基に検量線を作成することができる。すなわち、異なるＤＮＡ濃度を有する複数個のサンプルのリアルタイムＰＣＲ法でＣｔ値を測定し、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の当初ＤＮＡ量を横軸にプロットすることで、検量線を作成できる。この検量線は、試料のＤＮＡ濃度とＣｔ値との関係を表し、濃度未知のサンプルのＣｔ値をリアルタイムＰＣＲ法により測定することで、サンプルに含まれるＤＮＡ量を決定することができる。
すなわち、定量されたｍｍｏＣ遺伝子量と１，４−ジオキサン分解菌の菌体量との間には直線関係があるため、リアルタイムＰＣＲ法で定量された、ｍｍｏＣ遺伝子量から、サンプル中の１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を推定することができる。
Here, the real-time PCR method is a technique for monitoring and analyzing the amount of DNA fragment amplification by PCR in real time. By the real-time PCR method, quantitative analysis of the concentration of DNA having a specific base sequence contained in a sample can be performed.
When a specific DNA is amplified by the real-time PCR method and reaches a fluorescence detectable amount, a rapid increase in fluorescence intensity is observed. The number of cycles at this time is referred to as Threshold Cycle (hereinafter referred to as Ct value). In the PCR method, DNA is doubled every cycle, and DNA is amplified exponentially. As the initial amount of DNA contained in the sample increases, the amount of fluorescence that can be detected with a smaller number of cycles is reached, so the Ct value decreases.
There is a linear relationship between the Ct value and the common logarithm of the initial DNA amount, and a calibration curve can be created based on this. In other words, a calibration curve can be created by measuring the Ct value of a plurality of samples having different DNA concentrations by the real-time PCR method, and plotting the Ct value on the vertical axis and the initial DNA amount before starting PCR on the horizontal axis. . This calibration curve represents the relationship between the DNA concentration of the sample and the Ct value, and the amount of DNA contained in the sample can be determined by measuring the Ct value of a sample whose concentration is unknown by the real-time PCR method.
That is, since there is a linear relationship between the quantified amount of mmoC gene and the amount of 1,4-dioxane-degrading bacteria, the amount of 1,4 in the sample is determined from the amount of mmoC gene determined by the real-time PCR method. -The amount of dioxane-degrading bacteria can be estimated.
分解菌は、食物連鎖でより上位に位置する生物に捕食されたり、増殖したりするため、菌体量は日々変動する。分解菌による１，４−ジオキサンの浄化処理において、その処理能力は菌体量に比例し、菌体量が減少すると処理能力が低下してしまう。リアルタイムＰＣＲ法で、ｍｍｏＣ遺伝子のＣｔ値を観測することで、分解菌の菌体量を迅速に、かつ高精度で定量することができるため、菌体量が１，４−ジオキサン処理に必要な量よりも少ないときには、１，４−ジオキサン分解菌を追加することで、処理能力を増大することができる。
次に、本発明を実施例に基づいて、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
Since the degrading bacteria are preyed on and propagated by organisms located higher in the food chain, the amount of bacterial cells varies from day to day. In the purification process of 1,4-dioxane by degrading bacteria, the processing capacity is proportional to the amount of bacterial cells, and the processing capacity decreases when the amount of bacterial cells decreases. By observing the Ct value of the mmoC gene by the real-time PCR method, the amount of cells of the degrading bacteria can be quantified quickly and with high accuracy, so the amount of cells is necessary for 1,4-dioxane treatment. When the amount is less than the amount, the treatment capacity can be increased by adding 1,4-dioxane degrading bacteria.
Next, the present invention will be described more specifically based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
「実験１：プライマーの設計」
Ｄ６株、Ｄ１１株について、ドラフトゲノムデータが取得されている。総塩基配列は、Ｄ６株が７．４Ｍｂｐ、Ｄ１１株が８．６Ｍｂｐである。Ｒａｐｉｄ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｓｕｂｓｙｓｔｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＲＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｒａｓｔ．ｎｍｐｄｒ．ｏｒｇ／）を用いて遺伝子推定を行い、ＳＤＩＭＯ遺伝子を探索した結果、Ｄ６株、Ｄ１１株は、ＳＤＩＭＯに分類される可溶性メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子群を有していたが、ＴＨＦ／１，４−ジオキサンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子群を有していなかった。可溶性メタンモノオキシゲナーゼは、ＴＨＦ／１，４−ジオキサンモノオキシゲナーゼとは塩基・アミノ酸配列が大きく異なっていることから、Ｄ６株、Ｄ１１株は、ｔｈｍＣ遺伝子をターゲットとするモニタリング手法が適用できなかったと推察される。
“Experiment 1: Primer design”
Draft genome data has been acquired for strains D6 and D11. The total base sequence is 7.4 Mbp for the D6 strain and 8.6 Mbp for the D11 strain. As a result of gene estimation using Rapid Annotation using Subsystem Technology version 2.0 (RAST; http://last.nmpdr.org/), the SDIMO gene was searched. As a result, D6 strain and D11 strain are classified as SDIMO. Although it had a gene group encoding soluble methane monooxygenase, it did not have a gene group encoding THF / 1,4-dioxane monooxygenase. Since soluble methane monooxygenase is greatly different in base / amino acid sequence from THF / 1,4-dioxane monooxygenase, it was inferred that the monitoring method targeting thmC gene could not be applied to D6 and D11 strains. Is done.
一方、可溶性メタンモノオキシゲナーゼが、Ｄ６株、Ｄ１１株による１，４−ジオキサン分解に関与しているものと推察されることから、可溶性メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列を対象として、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（T. KORESSAAR, M. REMM: Bioinformatics, 23, 10, 1289-1291 (2007) “Enhancements and modifications of primer design program Primer3”、A. UNTERGASSER, I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, B.C. FAIRCLOTH, M. REMM, S.G. ROZEN: Nucleic Acids Res. 40, 15, e115 (2012) “Primer3 - new capabilities and interfaces”）を用いてリアルタイムＰＣＲプライマー候補を抽出した。次に、Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂｌａｓｔプログラム（J. YE, G. COULOURIS, I. ZARETSKAYA, I. CUTCUTACHE, S. ROZEN, T.L. MADDEN: BMC Bioinformatics, 13, 134 (2012) “Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction”）を用いて、プライマー候補の配列とＧｅｎＢａｎｋ登録配列との相同性を検索し、特異性の高いＰＣＲプライマーセット候補を設計した。
設計したＰＣＲプライマーセット候補を、下記表１に示す。なお、ＰＣＲプライマーセット候補１〜３は、両菌株に共通であり、候補４はＤ６株のみ、候補５はＤ１１株のみの配列から抽出された。
On the other hand, since soluble methane monooxygenase is presumed to be involved in 1,4-dioxane degradation by strains D6 and D11, the Primer3 program (T. KORESSAAR, M. REMM: Bioinformatics, 23, 10, 1289-1291 (2007) “Enhancements and modifications of primer design program Primer3”, A. UNTERGASSER, I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, BC FAIRCLOTH, M. REMM, SG ROZEN: Nucleic Acids Res. 40, 15, e115 (2012) “Primer3-new capabilities and interfaces”), real-time PCR primer candidates were extracted. Next, the Primer-Blast program (J. YE, G. COULOURIS, I. ZARETSKAYA, I. CUTCUTACHE, S. ROZEN, TL MADDEN: BMC Bioinformatics, 13, 134 (2012) “Primer-BLAST: A tool to design target -Specific primers for polymerase chain reaction ") were used to search for homology between the primer candidate sequences and GenBank registered sequences, and to design PCR primer set candidates with high specificity.
The designed PCR primer set candidates are shown in Table 1 below. PCR primer set candidates 1 to 3 are common to both strains, candidate 4 was extracted from the sequence of only the D6 strain, and candidate 5 was extracted from the sequence of only the D11 strain.
「実験２：プライマーの選定」
Ｄ６株、Ｄ１１株と、ｔｈｍＣ遺伝子を有する１，４−ジオキサン資化菌であるＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．Ｄ１７、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．Ｎ２３、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＢ１１９０、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ１４３４３、ＴＨＦを一次基質とする１，４−ジオキサン共代謝菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ Ｔ１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ Ｔ５、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｃａｃｉａｅ ＪＣＭ１６７０７、ＴＨＦは分解可能であるが１，４−ジオキサンを分解しないＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ ＪＣＭ３３９２、１，４−ジオキサンもＴＨＦも分解しないＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ＪＣＭ１３１１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＪＣＭ３２０５を用いて、設計した各ＰＣＲプライマーセット候補を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、特異性の検証を行った。ＰＣＲは、下記表２に示す条件で行った。
“Experiment 2: Selection of primers”
D6 strain, D11 strain, and Pseudocardia sp., Which is a 1,4-dioxane-utilizing bacterium having thmC gene. D17, Pseudonocardia sp. N23, Pseudocardia dioxanivorans CB1190, Rhodococcus aetherivorans JCM14343, Rhodicoccus ruber T1 which is a 1,4-dioxane co-metabolite that uses THF as a primary substrate, Rhodococcus ruber T70 Using each of the PCR primer set candidates designed using Pseudocardia hydrocarboxydans JCM3392, which does not decompose 1, Rhodiococcus equi JCM1311, which does not decompose 1,4-dioxane or THF, and Rhodococcus rubber JCM3205 Time PCR was performed to verify specificity. PCR was performed under the conditions shown in Table 2 below.
ＰＣＲプライマーセット候補２、４、５は、標的以外の１，４−ジオキサン資化菌あるいは１，４−ジオキサン共代謝菌において非特異的な増幅が観察され、標的とするｔｈｍ遺伝子群を有さない分解菌であるＤ６株、Ｄ１１株の特異的検出には適さなかった。 PCR primer set candidates 2, 4, and 5 have non-specific amplification observed in 1,4-dioxane-utilizing bacteria or 1,4-dioxane co-metabolizing bacteria other than the target, and have a target thm gene group. It was not suitable for specific detection of D6 strain and D11 strain, which are not degrading bacteria.
ＰＣＲプライマーセット候補１、３は、非特異的な増幅はなく、予想された長さの増幅産物のみが検出された。ＰＣＲ増幅結果を図１、２、表３に示す。 PCR primer set candidates 1 and 3 had no non-specific amplification, and only an amplification product of the expected length was detected. The PCR amplification results are shown in FIGS.
ＰＣＲプライマーセット候補１は、供試菌株の中で、Ｄ６株、Ｄ１１株でのみ増幅産物が検出され、他の菌株では非特異的なものを含め、増幅産物が確認されなかった。このことから、本プライマーセット１は本来の標的である２菌株に非常に特異性の高いプライマーセットであると考えられた。
ＰＣＲプライマーセット候補３は、Ｄ６株、Ｄ１１株以外に、１，４−ジオキサン資化菌であるＲ．ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ１４３４３においても１６５ｂｐ辺りに増幅産物が確認された。Ｒ．ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ１４３４３はプロパンモノオキシゲナーゼ（ＰＭＯ）／ＭＭＯに属するＳＤＩＭＯを保有するため、増幅産物が得られることは妥当な結果と考えられる。
As for PCR primer set candidate 1, amplification products were detected only in the D6 strain and D11 strain among the test strains, and amplification products were not confirmed in other strains, including non-specific ones. From this, it was considered that this primer set 1 is a primer set having very high specificity to the two strains that are the original target.
PCR primer set candidate 3 includes R. cerevisiae that is 1,4-dioxane-utilizing bacteria in addition to D6 strain and D11 strain. In aetherivorans JCM14343, an amplification product was confirmed around 165 bp. R. Since aetherivorans JCM14343 possesses SDIMO belonging to propane monooxygenase (PMO) / MMO, obtaining an amplification product is considered to be a reasonable result.
「実験３：リアルタイムＰＣＲ」
ＰＣＲプライマーセット候補１、３の、リアルタイムＰＣＲへの適用性を検討した。
ＰＣＲプライマーセット候補１、３を用いてＤ６株とＤ１１株のゲノムＤＮＡから得た増幅産物をプラスミドｐＴＡＣ−１に挿入してクローン化し、抽出した挿入プラスミドより希釈列を作成し、実験２と同じＰＣＲ条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。いずれの組み合わせにおいても、ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ解析では各々１つのピークが検出され、増幅終了後のサンプルをアガロースゲル電気泳動に供した結果からも、特異的な増幅が行われていることが確認された。また、各々についてＤＮＡ濃度（−ｌｏｇ希釈倍率）とＣｑ値との関係を調べた結果、図３、４に示す通り、直線性が確認された。
“Experiment 3: Real-time PCR”
The applicability of PCR primer set candidates 1 and 3 to real-time PCR was examined.
Amplification products obtained from genomic DNA of strains D6 and D11 using PCR primer set candidates 1 and 3 were inserted and cloned into plasmid pTAC-1, and a dilution sequence was prepared from the extracted insertion plasmid. Real-time PCR was performed under PCR conditions. In any combination, one peak was detected in the melting curve analysis, and specific amplification was confirmed from the result of subjecting the sample after amplification to agarose gel electrophoresis. Moreover, as a result of investigating the relationship between the DNA concentration (-log dilution rate) and the Cq value for each, linearity was confirmed as shown in FIGS.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018039963A JP2019150002A (en) | 2018-03-06 | 2018-03-06 | Primer sets for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and methods for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018039963A JP2019150002A (en) | 2018-03-06 | 2018-03-06 | Primer sets for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and methods for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019150002A true JP2019150002A (en) | 2019-09-12 |
Family
ID=67946265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018039963A Pending JP2019150002A (en) | 2018-03-06 | 2018-03-06 | Primer sets for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and methods for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2019150002A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023085924A (en) * | 2021-12-09 | 2023-06-21 | 株式会社大林組 | 1,4-dioxane-degrading bacteria, 1,4-dioxane-decomposing agent, method for producing 1,4-dioxane-decomposing agent, and method for treating 1,4-dioxane |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09121868A (en) * | 1995-11-06 | 1997-05-13 | Kankyocho Kokuritsu Kankyo Kenkyusho | Oligonucleotide for detecting methane-assimilating bacterium having decomposing ability for organic chlorine compound and detection using the same |
| JP2014060966A (en) * | 2012-09-21 | 2014-04-10 | Ritsumeikan | System of detecting novel petroleum decomposing bacteria from environment |
| US20150184232A1 (en) * | 2013-12-05 | 2015-07-02 | William Marsh Rice University | Monitoring of 1,4-dioxane biodegradation in various environments |
| JP2017006069A (en) * | 2015-06-24 | 2017-01-12 | 大成建設株式会社 | Primer set for detection of 1,4-dioxane degrading bacteria, and method for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria |
-
2018
- 2018-03-06 JP JP2018039963A patent/JP2019150002A/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09121868A (en) * | 1995-11-06 | 1997-05-13 | Kankyocho Kokuritsu Kankyo Kenkyusho | Oligonucleotide for detecting methane-assimilating bacterium having decomposing ability for organic chlorine compound and detection using the same |
| JP2014060966A (en) * | 2012-09-21 | 2014-04-10 | Ritsumeikan | System of detecting novel petroleum decomposing bacteria from environment |
| US20150184232A1 (en) * | 2013-12-05 | 2015-07-02 | William Marsh Rice University | Monitoring of 1,4-dioxane biodegradation in various environments |
| JP2017006069A (en) * | 2015-06-24 | 2017-01-12 | 大成建設株式会社 | Primer set for detection of 1,4-dioxane degrading bacteria, and method for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY LETTERS, vol. 4, JPN6021051693, 2017, pages 494 - 499, ISSN: 0004811492 * |
| ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY LETTERS, vol. 5, JPN6021051692, 2018, pages 86 - 91, ISSN: 0004811493 * |
| GENBANK[ONLINE], ACCESSION NO.CP020812.1, JPN7021005667, ISSN: 0004811494 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023085924A (en) * | 2021-12-09 | 2023-06-21 | 株式会社大林組 | 1,4-dioxane-degrading bacteria, 1,4-dioxane-decomposing agent, method for producing 1,4-dioxane-decomposing agent, and method for treating 1,4-dioxane |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shaw et al. | Using amplicon sequencing to characterize and monitor bacterial diversity in drinking water distribution systems | |
| Liang et al. | Development of a common oligonucleotide reference standard for microarray data normalization and comparison across different microbial communities | |
| Saikaly et al. | Use of 16S rRNA gene terminal restriction fragment analysis to assess the impact of solids retention time on the bacterial diversity of activated sludge | |
| Gonzalez et al. | Amplification by PCR artificially reduces the proportion of the rare biosphere in microbial communities | |
| Pellicer‐Nàcher et al. | Sequentially aerated membrane biofilm reactors for autotrophic nitrogen removal: microbial community composition and dynamics | |
| Ishii et al. | Identification of key nitrous oxide production pathways in aerobic partial nitrifying granules | |
| JP6479336B2 (en) | Internal standard gene for 16S rRNA gene quantification of microorganisms | |
| Piterina et al. | Use of PCR‐DGGE based molecular methods to analyse microbial community diversity and stability during the thermophilic stages of an ATAD wastewater sludge treatment process as an aid to performance monitoring | |
| Han et al. | More refined diversity of anammox bacteria recovered and distribution in different ecosystems | |
| Matturro et al. | Quantitative estimation of Dehalococcoides mccartyi at laboratory and field scale: Comparative study between CARD-FISH and Real Time PCR | |
| JP6632228B2 (en) | Primer set for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and method for detecting and quantifying 1,4-dioxane-degrading bacteria | |
| Liebich et al. | Structural and functional approach to studying pesticide side‐effects on specific soil functions | |
| Zhu et al. | Molecular microbiology techniques | |
| JP2019150002A (en) | Primer sets for detecting 1,4-dioxane-degrading bacteria and methods for detecting and quantifying 1,4-dioxane degrading bacteria | |
| Kelly | Molecular techniques for the analysis of soil microbial processes: functional gene analysis and the utility of DNA microarrays | |
| Jung et al. | Assessment of microbial diversity bias associated with soil heterogeneity and sequencing resolution in pyrosequencing analyses | |
| Sasi et al. | Wastewater microbial diversity versus molecular analysis at a glance: a mini-review | |
| Han et al. | Improved detection of microbial risk of releasing genetically modified bacteria in soil by using massive sequencing and antibiotic resistance selection | |
| CN111254208A (en) | Polymerase chain reaction primer and kit for quantitatively detecting ochrobactrum and method for quantitatively detecting ochrobactrum | |
| Leddy et al. | High-throughput DNA sequencing to profile microbial water quality of potable reuse | |
| Bhadury et al. | The use of molecular tools to characterize functional microbial communities in contaminated areas | |
| Chakraborty et al. | Application of molecular techniques for the assessment of microbial communities in contaminated sites | |
| Jiang et al. | A microbial analysis primer for biogeochemists | |
| JP4701352B2 (en) | Biological species detection method, microarray used therefor, and biological species detection kit | |
| Zafra et al. | Use of molecular tools to monitor microbial communities during the bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soils |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210301 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20211215 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220105 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220628 |