JP2019010115A - ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法及びキット - Google Patents
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Abstract
【課題】ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤の提供。【解決手段】式（１−２）又は（２−２）で表される化合物で代表される、特定の化学構造を有する化合物又はそれらの塩である、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤。【選択図】なし
Description
本発明は、光識別方法、物質の検出方法、レポーターアッセイ方法、キット、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法及び装置に関する。
発光タンパク質であるルシフェラーゼは、発光活性を測定するという簡便さと、高感度であることから、遺伝子発現や酵素活性、ＡＴＰ等の定量に広く用いられている。
正確な発光活性測定には、内在する比較標準（内部標準）が必要となる。そのためには、同時に複数の発光活性を測定できるアッセイ系であることが望ましい。そのような要求を満たす技術としてデュアルルシフェラーゼアッセイがあり、既存のデュアルルシフェラーゼアッセイとしては以下の手法のものが知られている。
正確な発光活性測定には、内在する比較標準（内部標準）が必要となる。そのためには、同時に複数の発光活性を測定できるアッセイ系であることが望ましい。そのような要求を満たす技術としてデュアルルシフェラーゼアッセイがあり、既存のデュアルルシフェラーゼアッセイとしては以下の手法のものが知られている。
従来のデュアルルシフェラーゼアッセイでは、基質が異なる２種類のルシフェラーゼを用いた方法（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ：ＤＬＲＡ、又はデュアルシーパンジー発光キットとして販売されている。）があり、遺伝子発現定量等に広く用いられている（非特許文献１）。図７左は、ＤＬＲＡの手順を説明する模式図である。
また、発光波長帯が異なる２種類のシフェラーゼを用いた方法もある。これは、マルチカラールシフェラーゼを用い、発光測定時に偏光フィルターを切り替えることによって、例えば、緑色発光と赤色発光を独立に測定することが可能であり、上記ＤＬＲＡとは異なり、同一の発光基質（Ｄ−ルシフェリン）を用いることが可能である。これは、Ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ（ＤＣＬＡ）又はマルチカラールックレポーターアッセイシステムと称され、市販されており、遺伝子発現定量等に広く用いられている（非特許文献２）。図７右は、ＤＣＬＡの手順を説明する模式図である。
また、発光波長帯が異なる２種類のシフェラーゼを用いた方法もある。これは、マルチカラールシフェラーゼを用い、発光測定時に偏光フィルターを切り替えることによって、例えば、緑色発光と赤色発光を独立に測定することが可能であり、上記ＤＬＲＡとは異なり、同一の発光基質（Ｄ−ルシフェリン）を用いることが可能である。これは、Ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ（ＤＣＬＡ）又はマルチカラールックレポーターアッセイシステムと称され、市販されており、遺伝子発現定量等に広く用いられている（非特許文献２）。図７右は、ＤＣＬＡの手順を説明する模式図である。
Matsuo N, Minami M, Maeda T, Hiratsuka K, Dual luciferase assay for monitoring gene expression in higher plants., Plant Biotechnology, 18, 71-75, 2001
Ogura R, Matsuo N, Wako N, Tanaka T, Ono S, Hiratsuka K, Multi-color luciferases as reporters for monitoring transient gene expression in higher plants. Plant Biotechnol. 22, 151-155. 2005
上記に挙げたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ： Ｆｌｕｃ）とウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ： Ｒｌｕｃ）の基質特異性と反応条件の差異を利用しており、一般的には、ルシフェリン添加によるＦｌｕｃ活性を測定後、続いてＲｌｕｃの基質であるセレンテラジン添加と同時にＦｌｕｃが不活性化される反応条件にすることで、Ｒｌｕｃ活性を測定している。したがって、この方法では、異なる２種類の発光基質と、それらに対応する緩衝液を準備する必要がある。
上記に挙げたＤＣＬＡでは、マルチカラールシフェラーゼを用いて、発光測定時に偏光フィルターを切り替えることによって、例えば緑色発光と赤色発光を独立に測定することが可能であり、ＤＬＲＡとは異なり、同一の発光基質（Ｄ−ルシフェリン）を用いることが可能である。しかし、ＤＣＲＡでは変更フィルターを装備した測定器を準備する必要がある、また、偏光フィルターの介在によって、発光活性の定量限界は大きく低下する。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来法であるＤＬＲＡよりも簡便で、ＤＣＬＡよりも高感度にルシフェラーゼアッセイを行うことを可能とする光識別方法の提供を課題とする。
上記に挙げたＤＣＬＡでは、マルチカラールシフェラーゼを用いて、発光測定時に偏光フィルターを切り替えることによって、例えば緑色発光と赤色発光を独立に測定することが可能であり、ＤＬＲＡとは異なり、同一の発光基質（Ｄ−ルシフェリン）を用いることが可能である。しかし、ＤＣＲＡでは変更フィルターを装備した測定器を準備する必要がある、また、偏光フィルターの介在によって、発光活性の定量限界は大きく低下する。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来法であるＤＬＲＡよりも簡便で、ＤＣＬＡよりも高感度にルシフェラーゼアッセイを行うことを可能とする光識別方法の提供を課題とする。
上記課題を解決するため、本発明は、下記の特徴を有する、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法及びキットを提供する。
＜１＞ 下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物又はそれらの塩であることを特徴とするルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤。
［式（１）中、
Ｘ１はＣＨ又はＮを表し、Ｒ１はハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｎはＲ１の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎが２以上のとき、Ｒ１同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｍはＲ２の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｍが２のとき、Ｒ２同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
［式（２）中、
Ｘ２はＣＨ又はＮを表し、Ｒ３はハロゲン原子を表し、Ｒ４は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｐはＲ３の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｐが２以上のとき、Ｒ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｑはＲ５の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｑが２のとき、Ｒ５同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
＜２＞ ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害する前記＜１＞に記載の阻害剤を用いることを特徴とするルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法。
＜３＞ 以下の工程；
第１ルシフェラーゼ、発光量の測定対象であり発光量測定時に前記第１ルシフェラーゼと反応して光Ａを発する第１発光物質である第１ルシフェリン、及び発光量の測定対象であり発光量測定時に光Ｂを発する第２発光物質（ただし、蛍光物質を除く）を含む測定対象物（ただし、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含むとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第２ルシフェラーゼとは異なる。）の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、予め取得された前記阻害剤による前記第１発光物質である第１ルシフェリンの発光量の低下率と、予め取得された前記阻害剤による前記第２発光物質の発光量の低下率と、に基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光量を算出し、前記光Ａの発光量と前記光Ｂの発光量とを識別する識別工程、
を含む光識別方法を行うためのキットであって、前記＜１＞に記載の阻害剤を備えることを特徴とするキット。
Ｘ１はＣＨ又はＮを表し、Ｒ１はハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｎはＲ１の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎが２以上のとき、Ｒ１同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｍはＲ２の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｍが２のとき、Ｒ２同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
Ｘ２はＣＨ又はＮを表し、Ｒ３はハロゲン原子を表し、Ｒ４は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｐはＲ３の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｐが２以上のとき、Ｒ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｑはＲ５の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｑが２のとき、Ｒ５同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
＜２＞ ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害する前記＜１＞に記載の阻害剤を用いることを特徴とするルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法。
＜３＞ 以下の工程；
第１ルシフェラーゼ、発光量の測定対象であり発光量測定時に前記第１ルシフェラーゼと反応して光Ａを発する第１発光物質である第１ルシフェリン、及び発光量の測定対象であり発光量測定時に光Ｂを発する第２発光物質（ただし、蛍光物質を除く）を含む測定対象物（ただし、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含むとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第２ルシフェラーゼとは異なる。）の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、予め取得された前記阻害剤による前記第１発光物質である第１ルシフェリンの発光量の低下率と、予め取得された前記阻害剤による前記第２発光物質の発光量の低下率と、に基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光量を算出し、前記光Ａの発光量と前記光Ｂの発光量とを識別する識別工程、
を含む光識別方法を行うためのキットであって、前記＜１＞に記載の阻害剤を備えることを特徴とするキット。
また、本発明は以下の光識別方法、レポーターアッセイ方法、キット、及び装置に関する。
（１） 以下の工程；
第１ルシフェラーゼ、発光量の測定対象であり発光量測定時に前記第１ルシフェラーゼと反応して光Ａを発する第１発光物質である第１ルシフェリン、及び発光量の測定対象であり発光量測定時に光Ｂを発する第２発光物質（ただし、蛍光物質を除く）を含む測定対象物（ただし、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含むとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第２ルシフェラーゼとは異なる。）の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、予め取得された前記阻害剤による前記第１発光物質である第１ルシフェリンの発光量の低下率と、予め取得された前記阻害剤による前記第２発光物質の発光量の低下率と、に基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光量を算出し、前記光Ａの発光量と前記光Ｂの発光量とを識別する識別工程、
を含むことを特徴とする光識別方法。
（２） 前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む、前記（１）に記載の光識別方法。
（３） 前記ルシフェリンが前記第１ルシフェリンと同じ物質である前記（２）に記載の光識別方法。
（４） 前記阻害剤非存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、
前記阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２としたときに、
光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比が１．１倍以上である前記（２）又は（３）に記載の光識別方法。
（５） 前記第１ルシフェリンが、Ｄ−ルシフェリン、又はＤ−ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼと反応して光を生み出すことのできる化合物であるＤ−ルシフェリン類縁体である前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の光識別方法。
（６） 前記第１ルシフェラーゼがＦｌｕｃ、Ｌｕｃ２、ＳＬＯ、ＳＬＧ又はＣＢＲである前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の光識別方法。
（７） 前記測定対象物が細胞であり、測定対象物の前記細胞から発せられた光を、細胞非破壊的に測定する前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の光識別方法。
（８） 前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法を用いることを特徴とするレポーターアッセイ方法。
（９） 第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むことを特徴とする前記（８）に記載のレポーターアッセイ方法。
（１０） 前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法、又は前記（８）又は（９）に記載のレポーターアッセイ方法を行うためのキットであって、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と、
前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法、又は前記（８）又は（９）に記載のレポーターアッセイ方法を行うための内容を説明した取扱い説明書と、
を備えることを特徴とするキット。
（１１） 前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法を行うための装置であって、（ａ）前記測定対象物から発せられた光の発光量を測定する測定手段と、（ｂ）前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ１の値と、前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別するための算出手段と、を備えることを特徴とする装置。
第１ルシフェラーゼ、発光量の測定対象であり発光量測定時に前記第１ルシフェラーゼと反応して光Ａを発する第１発光物質である第１ルシフェリン、及び発光量の測定対象であり発光量測定時に光Ｂを発する第２発光物質（ただし、蛍光物質を除く）を含む測定対象物（ただし、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含むとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第２ルシフェラーゼとは異なる。）の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、予め取得された前記阻害剤による前記第１発光物質である第１ルシフェリンの発光量の低下率と、予め取得された前記阻害剤による前記第２発光物質の発光量の低下率と、に基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光量を算出し、前記光Ａの発光量と前記光Ｂの発光量とを識別する識別工程、
を含むことを特徴とする光識別方法。
（２） 前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む、前記（１）に記載の光識別方法。
（３） 前記ルシフェリンが前記第１ルシフェリンと同じ物質である前記（２）に記載の光識別方法。
（４） 前記阻害剤非存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、
前記阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２としたときに、
光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比が１．１倍以上である前記（２）又は（３）に記載の光識別方法。
（５） 前記第１ルシフェリンが、Ｄ−ルシフェリン、又はＤ−ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼと反応して光を生み出すことのできる化合物であるＤ−ルシフェリン類縁体である前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の光識別方法。
（６） 前記第１ルシフェラーゼがＦｌｕｃ、Ｌｕｃ２、ＳＬＯ、ＳＬＧ又はＣＢＲである前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の光識別方法。
（７） 前記測定対象物が細胞であり、測定対象物の前記細胞から発せられた光を、細胞非破壊的に測定する前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の光識別方法。
（８） 前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法を用いることを特徴とするレポーターアッセイ方法。
（９） 第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むことを特徴とする前記（８）に記載のレポーターアッセイ方法。
（１０） 前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法、又は前記（８）又は（９）に記載のレポーターアッセイ方法を行うためのキットであって、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と、
前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法、又は前記（８）又は（９）に記載のレポーターアッセイ方法を行うための内容を説明した取扱い説明書と、
を備えることを特徴とするキット。
（１１） 前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の光識別方法を行うための装置であって、（ａ）前記測定対象物から発せられた光の発光量を測定する測定手段と、（ｂ）前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ１の値と、前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別するための算出手段と、を備えることを特徴とする装置。
本発明によれば、ルシフェラーゼ阻害活性を有するルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を提供でき、上記光識別方法及び上記キットに用いることができる。
＜光識別方法＞
本発明の光識別方法は、
以下の工程；
第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、を含む。
本発明の光識別方法は、
以下の工程；
第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、を含む。
（第１測定工程）
本実施形態の光識別方法は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質であるルシフェリン、前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程を含む。
本実施形態の光識別方法は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質であるルシフェリン、前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程を含む。
図１は、本発明に係る第１実施形態における光識別方法の手順を模式的に示した図である。本実施形態の測定対象物、第１発光物質である第１ルシフェラーゼとしてＦｌｕｃを、第１ルシフェリンとしてＤ−ルシフェリンを、第２ルシフェラーゼとしてＣＢＧ（Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｇｒｅｅｎ）を含む。また、本実施形態においては、前記ルシフェリンと前記第１ルシフェリンとは同じ物質であり、Ｆｌｕｃ（第１ルシフェラーゼ）及びＣＢＧ（第２ルシフェラーゼ）ともにＤ−ルシフェリンと反応して、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光が生じる。Ｆｌｕｃと反応したＤ−ルシフェリンが第１発光物質であり、ＣＢＧと反応したＤ−ルシフェリンが第２発光物質である。
本実施形態において、測定対象物は細胞抽出物の調整物である。細胞抽出物の由来となる細胞には、細胞内で発現させたＦｌｕｃ及びＣＢＧが含まれている。当該細胞抽出物、Ｄ−ルシフェリン、及びバッファーを混合し、Ｆｌｕｃ、ＣＢＧ及びＤ−ルシフェリンを含む液である第１測定工程の測定対象物を得る。第１測定工程の測定対象物は、後述する阻害剤を含まない液であり、発光量Ｌ１の測定は、阻害剤非存在下における測定となる。
本実施形態において、測定対象物は細胞抽出物の調整物である。細胞抽出物の由来となる細胞には、細胞内で発現させたＦｌｕｃ及びＣＢＧが含まれている。当該細胞抽出物、Ｄ−ルシフェリン、及びバッファーを混合し、Ｆｌｕｃ、ＣＢＧ及びＤ−ルシフェリンを含む液である第１測定工程の測定対象物を得る。第１測定工程の測定対象物は、後述する阻害剤を含まない液であり、発光量Ｌ１の測定は、阻害剤非存在下における測定となる。
次いで、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する。発光量の測定は、公知のルミノメーターを用いて行うことができる。第１測定工程の測定対象物中では、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応により光Ａが生じ、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンの反応により光Ｂが生じている。阻害剤非存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とすると、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１の値は、発光量Ｌ１ ＝ 発光量Ａ１ ＋ 発光量Ｂ１である。
（第２測定工程）
本実施形態の光識別方法は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程を含む。
本実施形態の光識別方法は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程を含む。
図１に示すように、本実施形態では、第１測定工程の測定対象物である液に、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を添加し、第２測定工程の測定対象物を得る。第２測定工程の測定対象物は、阻害剤を含む液であり、発光量Ｌ２の測定は、阻害剤存在下における測定となる。
次いで、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２を測定する。発光量の測定は、公知のルミノメーターを用いて行うことができる。
阻害剤存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とすると、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２の値は、発光量Ｌ２ ＝ 発光量Ａ２＋ 発光量Ｂ２である。
阻害剤は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害するので、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２は、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１よりも低下している。本実施形態では、阻害剤として、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応を阻害する阻害剤を用い、該阻害剤は発光量Ａ２の値をＡ１の１／１０にする作用がある場合を例示する（図１）。
阻害剤存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とすると、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２の値は、発光量Ｌ２ ＝ 発光量Ａ２＋ 発光量Ｂ２である。
阻害剤は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害するので、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２は、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１よりも低下している。本実施形態では、阻害剤として、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応を阻害する阻害剤を用い、該阻害剤は発光量Ａ２の値をＡ１の１／１０にする作用がある場合を例示する（図１）。
なお、本実施形態においては、第１測定工程に用いられた第１測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第２測定工程の測定対象物を得たが、第２測定工程の測定対象物に含まれる第１測定工程の測定対象物の要素は、必ずしも第１測定工程を経たものでなくともよい。
例えば、第１測定工程で測定する第１測定工程の測定対象物の液と、第１測定工程の測定対象物の組成であって第１測定工程で測定しない液との、２つの液を予め用意しておき、第１測定工程で測定しない液に阻害剤を添加して、これを第２測定工程の測定対象物としてもよい。
例えば、第１測定工程で測定する第１測定工程の測定対象物の液と、第１測定工程の測定対象物の組成であって第１測定工程で測定しない液との、２つの液を予め用意しておき、第１測定工程で測定しない液に阻害剤を添加して、これを第２測定工程の測定対象物としてもよい。
なお、本実施形態においては、第１測定工程に用いられた第１測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第２測定工程の測定対象物を得たために、第１測定工程の後に、第２測定工程を行った。しかし、必ずしも、第１測定工程の後に、第２測定工程を行う必要は無く、第１測定工程の前に、第２測定工程を行なってもよく、第１測定工程と同時に第２測定工程を行なってもよい。
（識別工程）
本実施形態の光識別方法は、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ｂを識別する識別工程、を含む。
本実施形態の光識別方法は、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ｂを識別する識別工程、を含む。
ここで、光を識別するとは、測定対象物から光Ａと光Ｂとを区別せずに検出した場合であっても、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、検出された発光量のうち、光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量とを算出することにより、光Ａと光Ｂを識別することである。
光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量との算出には、阻害剤による光Ａの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）が予め既知である必要がある。
光Ａの発光量の低下率を求めるには、第２発光物質を含まないこと以外は同様の条件で、前記第１測定工程及び前記第２測定工程を行えばよい。この場合、測定対象物から発せられる光は光Ａのみに由来するものであるので、阻害剤非存在下での発光量Ａ１及び阻害剤存在下での発光量Ａ２を測定し、発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）を求めればよい。
光Ａの発光量の低下率を求めるには、第２発光物質を含まないこと以外は同様の条件で、前記第１測定工程及び前記第２測定工程を行えばよい。この場合、測定対象物から発せられる光は光Ａのみに由来するものであるので、阻害剤非存在下での発光量Ａ１及び阻害剤存在下での発光量Ａ２を測定し、発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）を求めればよい。
なお、本実施形態では、阻害剤Ａが第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応のみを阻害し、第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応は阻害しない場合を示している。しかし、本発明に用いられる阻害剤としては、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応のみならず、第２発光物質の発光量を変化させるものであってもよく、例えば、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応のみならず、第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応を阻害するものであってもよい。
この場合も、阻害剤による第２発光物質の発光量の変化率が予め既知である必要がある。例えば、第２発光物質が第２ルシフェラーゼと反応する第１ルシフェリンであり、阻害剤が第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応を阻害する場合には、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）が予め既知である必要がある。
光Ｂの発光量の低下率を求めるには、第１発光物質及び第１ルシフェリンを含まないこと以外は同様の条件で、前記第１測定工程及び前記第２測定工程を行えばよい。この場合、測定対象物から発せられる光は光Ｂのみに由来するものであるので、阻害剤非存在下での発光量Ｂ１及び阻害剤存在下での発光量Ｂ２を測定し、発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）を求めればよい。
この場合も、阻害剤による第２発光物質の発光量の変化率が予め既知である必要がある。例えば、第２発光物質が第２ルシフェラーゼと反応する第１ルシフェリンであり、阻害剤が第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応を阻害する場合には、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）が予め既知である必要がある。
光Ｂの発光量の低下率を求めるには、第１発光物質及び第１ルシフェリンを含まないこと以外は同様の条件で、前記第１測定工程及び前記第２測定工程を行えばよい。この場合、測定対象物から発せられる光は光Ｂのみに由来するものであるので、阻害剤非存在下での発光量Ｂ１及び阻害剤存在下での発光量Ｂ２を測定し、発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）を求めればよい。
光Ａの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）がｘ％であり、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）がｙ％であるとすると、下記式（Ｉ）で示されるように、Ｌ１ ＝ Ａ１ ＋ Ｂ１、Ｌ２ ＝ ｘ／１００Ａ１＋ｙ／１００Ｂ１となり、Ａ１及びＢ１を計算できる。
阻害剤による光Ａの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）や光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）の差は、阻害剤の特異性を反映している。発光量の低下率は、同様の反応条件下においてほぼ一定であるので、これらの低下率についての情報が既知であれば、本発明の光識別方法を行う際に、これらの低下率を改めて求める必要はない。
光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比の値は、大きいほうが好ましい。これは、阻害剤の効果が誤差範囲内となるおそれが低減され、光分離の精度をより向上させることができる。光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比は、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上が好ましく、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上がより好ましく、９倍以上、９．５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上がさらに好ましい。
なお、上記発光量を発光強度として、本発明の光識別方法を行ってもよい。発光量はRLU（relative light unit）として測定されたものであってもよい。
（発光物質）
ルシフェラーゼは生物発光を触媒する酵素の総称であり、ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して光を生み出す化合物の総称である。
これまでに様々な種類のルシフェラーゼ及びルシフェリンが発見されており、代表的なルシフェラーゼとしては、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）、ヒカリコメツキ（Click beetle）由来の緑色発光タンパク質（ＣＢＧ：Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｇｒｅｅｎ）及び赤色発光タンパク質（ＣＢＲ：Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｒｅｄ）が挙げられる。代表的なルシフェリンとしては、ウミシイタケルシフェリン、ホタルルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
ルシフェラーゼには、基質特性がある。特定のルシフェラーゼと反応して光を生み出すルシフェリンは、当業者によって適宜選択することができる。
ルシフェラーゼは、天然に存在する天然型のタンパク質であっても、天然型とは異なるアミノ酸配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型のタンパク質であってもよい。ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して光を生み出すものであれば、天然に存在する天然型の化合物であっても、天然型とは異なる構造を有する化合物であってもよい。
ルシフェラーゼは生物発光を触媒する酵素の総称であり、ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して光を生み出す化合物の総称である。
これまでに様々な種類のルシフェラーゼ及びルシフェリンが発見されており、代表的なルシフェラーゼとしては、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）、ヒカリコメツキ（Click beetle）由来の緑色発光タンパク質（ＣＢＧ：Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｇｒｅｅｎ）及び赤色発光タンパク質（ＣＢＲ：Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｒｅｄ）が挙げられる。代表的なルシフェリンとしては、ウミシイタケルシフェリン、ホタルルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
ルシフェラーゼには、基質特性がある。特定のルシフェラーゼと反応して光を生み出すルシフェリンは、当業者によって適宜選択することができる。
ルシフェラーゼは、天然に存在する天然型のタンパク質であっても、天然型とは異なるアミノ酸配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型のタンパク質であってもよい。ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して光を生み出すものであれば、天然に存在する天然型の化合物であっても、天然型とは異なる構造を有する化合物であってもよい。
本明細書中において前記第１ルシフェラーゼとは、ルシフェラーゼのうち、阻害剤によってルシフェラーゼとルシフェリンとの反応が阻害されるルシフェラーゼである。本明細書中において、第１発光物質である第１ルシフェリンとは、前記第１ルシフェラーゼと反応して光を生み出す化合物である。第１ルシフェリンは、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。Ｄ−ルシフェリンの類縁体は、Ｄ−ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼが反応して光を生み出す化合物が好ましく、Ｄ−ルシフェリンの類縁体としては、例えば、アカルミネ（登録商標）が挙げられる。第１ルシフェラーゼは、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体を基質とするルシフェラーゼであることが好ましい。
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａは、第１ルシフェリンから発生られた光そのものに限定されない。同じく、第２発光物質により生じた光Ｂは、第２発光物質から発生られた光そのものに限定されない。例えば、光Ａとしては、生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence resonance energy transfer：BRET）により生じたものであってもよく、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光がエネルギー転移して生じた光も包含される。
第２発光物質は、光を発する物質であれば特に制限されない。第２発光物質として用いられる物質としては、フルオロセイン、ローダミン、シアニン等の蛍光色素、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質、イクオリン等の発光タンパク質、ルシフェリン等を挙げることができる。
本発明の光識別方法で用いられる第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む場合、上記第１実施形態で説明したように、前記ルシフェリンが前記第１ルシフェリンと同じ物質であることが好ましい。
従来用いられてきたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase:Fluc）とウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase: Rluc）を用い、基質特異性と反応条件の差異を利用するので、異なる２種類の発光基質と、それらに対応する緩衝液を準備する必要がある。
一方、本実施形態の光識別方法では、適切なルシフェラーゼ及びルシフェリンを選択することにより、第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼをともに第１ルシフェリンと反応させることが可能であるので、ルシフェラーゼの反応条件を変更することなく、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリン及び第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの両方の反応を同一反応系で行うことができる。そのため、緩衝液を変更する必要もなく、より簡便にルシフェラーゼアッセイを行うことができる。
共通のルシフェリンと反応する第１ルシフェラーゼ、第２ルシフェラーゼ及びルシフェリンの組合せとしては、種々の組み合わせが例示できるが、Ｄ−ルシフェリンと反応するルシフェラーゼとしては、例えば、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧ、ＳＬＧ（緑色発光ルシフェラーゼ）、ＳＬＯ（橙色発光ルシフェラーゼ）、及びＳＬＲ（赤色発光ルシフェラーゼ）からなる群から、それぞれ異なるものをそれぞれ第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼとして選択すればよい。
従来用いられてきたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase:Fluc）とウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase: Rluc）を用い、基質特異性と反応条件の差異を利用するので、異なる２種類の発光基質と、それらに対応する緩衝液を準備する必要がある。
一方、本実施形態の光識別方法では、適切なルシフェラーゼ及びルシフェリンを選択することにより、第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼをともに第１ルシフェリンと反応させることが可能であるので、ルシフェラーゼの反応条件を変更することなく、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリン及び第２ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの両方の反応を同一反応系で行うことができる。そのため、緩衝液を変更する必要もなく、より簡便にルシフェラーゼアッセイを行うことができる。
共通のルシフェリンと反応する第１ルシフェラーゼ、第２ルシフェラーゼ及びルシフェリンの組合せとしては、種々の組み合わせが例示できるが、Ｄ−ルシフェリンと反応するルシフェラーゼとしては、例えば、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧ、ＳＬＧ（緑色発光ルシフェラーゼ）、ＳＬＯ（橙色発光ルシフェラーゼ）、及びＳＬＲ（赤色発光ルシフェラーゼ）からなる群から、それぞれ異なるものをそれぞれ第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼとして選択すればよい。
（測定対象物）
本発明の光識別方法に係る測定対象物は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含むものであれば特に制限されないが、好ましい測定対象物として、細胞又は、細胞由来の物質が挙げられる。細胞を測定対象とすることは、細胞の集合である細胞集団、組織、器官、又は生物個体を測定対象とすることを包含する。細胞としては、例えば、植物細胞、植物体、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌などの真核細胞であり、単細胞生物、微生物等も含む。細胞由来の物質としては、細胞抽出物、細胞培養上清、それらの調整物等が挙げられる。
測定対象物中には、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質が均一に含まれていなくともよい。例えば、測定対象物が個体である場合、個体を構成する一部の細胞にのみ第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質が含まれていてもよい。他の例としては、個体を構成する一部の細胞にのみ第１ルシフェラーゼ及び第１発光物質である第１ルシフェリンが含まれており、さらに前記部分とは異なる部分に第２発光物質が含まれていてもよい。
本発明の光識別方法に係る測定対象物は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含むものであれば特に制限されないが、好ましい測定対象物として、細胞又は、細胞由来の物質が挙げられる。細胞を測定対象とすることは、細胞の集合である細胞集団、組織、器官、又は生物個体を測定対象とすることを包含する。細胞としては、例えば、植物細胞、植物体、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌などの真核細胞であり、単細胞生物、微生物等も含む。細胞由来の物質としては、細胞抽出物、細胞培養上清、それらの調整物等が挙げられる。
測定対象物中には、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質が均一に含まれていなくともよい。例えば、測定対象物が個体である場合、個体を構成する一部の細胞にのみ第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質が含まれていてもよい。他の例としては、個体を構成する一部の細胞にのみ第１ルシフェラーゼ及び第１発光物質である第１ルシフェリンが含まれており、さらに前記部分とは異なる部分に第２発光物質が含まれていてもよい。
本発明の光識別方法は、測定対象物が細胞であって、測定対象物の細胞から発せられた光を、細胞非破壊的に測定してもよい。
上記に挙げたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase:Fluc）とウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase: Ｒluc）を用い、Flucに対する基質としてホタルルシフェリンを用い、Ｒｌｕｃに対する基質としてはセレンテラジンを用いる場合がある。しかし、セレンテラジンは比較的高分子なため、細胞への浸透が起こり難い。そのため、細胞内で発現させたＲｌｕｃとセレンテラジンとを反応させるため、測定対象物としては細胞を破壊して得た細胞抽出物としなければならない。
一方、本発明の光識別方法では、上述のように第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼは、同一種のルシフェリンを用いて反応系を構築することも可能であるため、細胞浸透性に劣るルシフェリンを選択しなければならない必要性を低くすることができる。
例えば、上記第１実施形態では、細胞抽出物の調整物を測定対象物としていたが、上記第１実施形態では、細胞浸透性に優れるホタルルシフェリンのみを発光基質として用いているため、測定対象物を細胞とし、測定対象物の細胞から発生られた光を細胞非破壊的に測定することも可能である。また、後述する本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤が、細胞浸透性に優れていることによっても、測定対象物の細胞から発生られた光を細胞非破壊的に測定することを可能とする。
上記に挙げたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase:Fluc）とウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase: Ｒluc）を用い、Flucに対する基質としてホタルルシフェリンを用い、Ｒｌｕｃに対する基質としてはセレンテラジンを用いる場合がある。しかし、セレンテラジンは比較的高分子なため、細胞への浸透が起こり難い。そのため、細胞内で発現させたＲｌｕｃとセレンテラジンとを反応させるため、測定対象物としては細胞を破壊して得た細胞抽出物としなければならない。
一方、本発明の光識別方法では、上述のように第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼは、同一種のルシフェリンを用いて反応系を構築することも可能であるため、細胞浸透性に劣るルシフェリンを選択しなければならない必要性を低くすることができる。
例えば、上記第１実施形態では、細胞抽出物の調整物を測定対象物としていたが、上記第１実施形態では、細胞浸透性に優れるホタルルシフェリンのみを発光基質として用いているため、測定対象物を細胞とし、測定対象物の細胞から発生られた光を細胞非破壊的に測定することも可能である。また、後述する本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤が、細胞浸透性に優れていることによっても、測定対象物の細胞から発生られた光を細胞非破壊的に測定することを可能とする。
＜物質の検出方法＞
本発明の物質の検出方法は、本発明の光識別方法を用いるものである。検出とは、測定及び定量を含む。本発明の光識別方法は、従来ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用して行われてきた物質の検出方法に幅広く用いることができる。
例えば、ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンの発光反応は、ＡＴＰ存在下でのみ生じる反応であるので、本発明の光識別方法を用いれば、測定対象物中のＡＴＰの存在を検出することができる。検出対象をＡＴＰとする場合、本発明の物質の検出方法の一実施形態としては、
以下の工程；
検出対象であるＡＴＰを含み得る被験試料、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含むものとすることができる。
また、ＡＴＰと同様に、ＡＴＰase等の酵素活性の測定、ＡＴＰを生産する細胞の測定、微生物の測定等を行うことができる。
本発明の物質の検出方法は、本発明の光識別方法を用いるものである。検出とは、測定及び定量を含む。本発明の光識別方法は、従来ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用して行われてきた物質の検出方法に幅広く用いることができる。
例えば、ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンの発光反応は、ＡＴＰ存在下でのみ生じる反応であるので、本発明の光識別方法を用いれば、測定対象物中のＡＴＰの存在を検出することができる。検出対象をＡＴＰとする場合、本発明の物質の検出方法の一実施形態としては、
以下の工程；
検出対象であるＡＴＰを含み得る被験試料、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含むものとすることができる。
また、ＡＴＰと同様に、ＡＴＰase等の酵素活性の測定、ＡＴＰを生産する細胞の測定、微生物の測定等を行うことができる。
本発明の物質の検出方法では、例えば、第１発光物質又は第２発光物質を標準物質（コントロール）としてもよいため、簡便で高精度に物質を検出することが可能となる。
上記に挙げたＡＴＰ以外にも、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必須な要素が反応系に存在することを検出検出対象とすることができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必須な要素としては、ＡＴＰの他、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Ｍｇ２＋、酸素が挙げられる。
測定対象の物質がルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必須な上記要素を反応系に生じさせることを利用して、物質の検出を行ってもよい。例えば、検出対象の酵素が触媒する反応によってルシフェラーゼの基質となるルシフェリンが産生されるような反応系を測定対象物中に構築すれば、該酵素の存在を検出することが可能である。
本発明の光識別方法は、他のルシフェラーゼアッセイ方法と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の光識別方法に加えて、ＤＬＲＡを行うことを例示できる。例えば、本発明の光識別方法において反応させる第１ルシフェラーゼとは異なるルシフェリンを基質とする第３ルシフェラーゼが測定対象物に含有されており、本発明の光識別方法を行った測定対象物に、第３ルシフェラーゼ用の反応溶液及び第３ルシフェラーゼと反応させるルシフェリンを添加し、第３ルシフェラーゼとルシフェリンとを反応させる。
図２には、第３ルシフェラーゼとしてＲｌｕｃを用いる場合を例示する。このようにして、識別して検出可能な光の種類を増やすことができる。
図２には、第３ルシフェラーゼとしてＲｌｕｃを用いる場合を例示する。このようにして、識別して検出可能な光の種類を増やすことができる。
＜レポーターアッセイ方法＞
本発明のレポーターアッセイ方法は、本発明の光識別方法を用いるものである。レポーターアッセイは、レポーターからのシグナルを介して、遺伝子の発現、遺伝子調節、細胞応答等を検出する手法である。本発明の光識別方法は、従来ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用して行われてきたレポーターアッセイに幅広く用いることができる。
例えば、本発明の光識別方法における前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。ここで、遺伝子調節領域とは、下流に連結された遺伝子の転写を制御可能な配列であればよく、例えば、プロモーター、エンハンサー、ホルモン応答配列等である。
ルシフェラーゼ遺伝子は、天然に存在する天然型の塩基配列を有するものであっても、天然型とは異なる塩基酸配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型の塩基配列を有するものであってもよい。例えば、Ｌｕｃ２は、ホタルルシフェラーゼの哺乳類細胞での発現効率化を目的としてコドンが最適化されている。ルシフェリンについても、天然に存在する天然型の化合物であっても、ルシフェラーゼと反応して光を生み出すものであれば、天然型とは異なる構造を有する化合物であってもよい。
本発明のレポーターアッセイ方法は、本発明の光識別方法を用いるものである。レポーターアッセイは、レポーターからのシグナルを介して、遺伝子の発現、遺伝子調節、細胞応答等を検出する手法である。本発明の光識別方法は、従来ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用して行われてきたレポーターアッセイに幅広く用いることができる。
例えば、本発明の光識別方法における前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。ここで、遺伝子調節領域とは、下流に連結された遺伝子の転写を制御可能な配列であればよく、例えば、プロモーター、エンハンサー、ホルモン応答配列等である。
ルシフェラーゼ遺伝子は、天然に存在する天然型の塩基配列を有するものであっても、天然型とは異なる塩基酸配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型の塩基配列を有するものであってもよい。例えば、Ｌｕｃ２は、ホタルルシフェラーゼの哺乳類細胞での発現効率化を目的としてコドンが最適化されている。ルシフェリンについても、天然に存在する天然型の化合物であっても、ルシフェラーゼと反応して光を生み出すものであれば、天然型とは異なる構造を有する化合物であってもよい。
組み換え細胞となる細胞としては、特に制限されず、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌などの真核細胞が好ましく、植物細胞であることがより好ましい。植物細胞の形質転換体を得る場合、融合遺伝子が導入される細胞としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態の植物細胞を含めることができる。例えば、培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルス等が挙げられる。また、形質転換される植物種としては、特に限定されるものではなく、単子葉植物でも双子葉植物でもよいが、農作物あるいは園芸用作物であることが好ましい。たとえば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビなどの穀類、じゃがいも、さつまいもなどの根茎又は塊根を形成する作物、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウなどのマメ科植物、ピーナッツ、ごま、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワーなどの種子作物、リンゴ、メロン、ブドウなどの果実を有する作物、トマト、ナスなどの作物、各種花卉植物であることが好ましい。植物の形質転体は、所定の再生工程を実施することで細胞を植物体に変換することができる。再生の方法は、植物の種類によって異なるが、各種公知の方法を使用できる。
また、組み換え細胞としては、特に限定しないで全ての種類、形態の細胞を包含し、各種細胞の他、動植物個体、その動植物個体を構成しうる真核細胞、およびその一部である組織や器官ならびに生殖細胞を含む。また、ウイルス粒子も包含する。さらに、また植物個体の一部であるその繁殖媒体（種子、根茎、果実、切穂等）も包含する。
検出対象物は第２発光物質を含む。第２発光物質としては、光を発する物質であれば特に制限されず、上記＜光識別方法＞において説明したものを同様に用いることができる。
本発明のレポーターアッセイ方法において、前記測定対象物は、例えば、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、さらに、遺伝子調節領域の下流にレポーター遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼ及び前記レポーター遺伝子を発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。
レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼが挙げられ、ルシフェラーゼであることが好ましい。ルシフェラーゼとしては、上記と同様のものが挙げられる。
よって、前記検出対象物は、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、さらに、遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼ及び前記第２ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。遺伝子調整領域としては、上記と同様のものが挙げられる。以下に本発明のレポーターアッセイ方法の実施態様の一例を示す。
レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼが挙げられ、ルシフェラーゼであることが好ましい。ルシフェラーゼとしては、上記と同様のものが挙げられる。
よって、前記検出対象物は、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、さらに、遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼ及び前記第２ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。遺伝子調整領域としては、上記と同様のものが挙げられる。以下に本発明のレポーターアッセイ方法の実施態様の一例を示す。
まず、遺伝子発現量を測定したい目的遺伝子の遺伝子調節領域を第１ルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、第１ルシフェラーゼ融合遺伝子を得る。第１ルシフェラーゼ融合遺伝子は、該遺伝子を測定対象物の細胞内で発現可能な発現ベクターとして構築されていてもよい。同様に、内部コントロールとしたい遺伝子の遺伝子調節領域を第２ルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、第２ルシフェラーゼ融合遺伝子を得る。第２ルシフェラーゼ融合遺伝子は、該遺伝子を測定対象物の細胞内で発現可能な発現ベクターとして構築されていてもよい。
前記発現ベクターは、染色体外で自律複製できるものの他、染色体組込み型ベクターとして構築されていてもよい。また、形態としては、線状の断片、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）や植物人工染色体（ＰＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）等を採ることができる。これらの中でも、プラスミドベクターが好ましい。
前記発現ベクターは、染色体外で自律複製できるものの他、染色体組込み型ベクターとして構築されていてもよい。また、形態としては、線状の断片、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）や植物人工染色体（ＰＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）等を採ることができる。これらの中でも、プラスミドベクターが好ましい。
第１ルシフェラーゼ融合遺伝子及び第２ルシフェラーゼ融合遺伝子を細胞に導入する。
当該融合遺伝子の細胞への導入方法は、常法により行えばよく、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の物理的手段、アグロバクテリウム法等による生物的手段を用いることが挙げられる。必要により細胞をインキュベートし、第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼを発現させる。
次いで、該細胞を前記第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼと反応するルシフェリンを含む溶液に浸し、細胞内にルシフェリンを導入する。このようにして、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質であるルシフェリン、前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む測定対象物である細胞を得ればよい。
次いで、本発明の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂを識別する。光Ａは目的遺伝子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表す。
当該融合遺伝子の細胞への導入方法は、常法により行えばよく、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の物理的手段、アグロバクテリウム法等による生物的手段を用いることが挙げられる。必要により細胞をインキュベートし、第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼを発現させる。
次いで、該細胞を前記第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼと反応するルシフェリンを含む溶液に浸し、細胞内にルシフェリンを導入する。このようにして、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質であるルシフェリン、前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む測定対象物である細胞を得ればよい。
次いで、本発明の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂを識別する。光Ａは目的遺伝子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表す。
なお、上述の例では、レポーターアッセイの検出の対象は目的遺伝子の発現量であり、目的遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結される場合を例示したが、例えば、上述の目的遺伝子の調節領域に代えて、各種細胞応答又はシグナル伝達に係る因子の遺伝子調節領域とすることで、細胞応答、シグナル伝達等の細胞情報を取得することができる。細胞情報の例としては、免疫応答、アポトーシス、細胞毒性、細胞増殖、細胞分化、細胞周期等が挙げられる。
本発明の物質のレポーターアッセイ方法では、例えば、第１発光物質又は第２発光物質を標準物質（コントロール）としてもよいため、簡便で高精度に物質を検出することが可能となる。
本発明のレポーターアッセイ方法は、他のルシフェラーゼアッセイ方法と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の光識別方法を用いた本発明のレポーターアッセイ方法に加えて、ＤＬＲＡを行うことを例示できる。例えば、本発明の光識別方法において反応させる第１ルシフェラーゼとは異なるルシフェリンを基質とする第３ルシフェラーゼが測定対象物に含有されており、本発明の光識別方法を行った測定対象物に、第３ルシフェラーゼ用の反応溶液及び第３ルシフェラーゼと反応させるルシフェリンを添加し、第３ルシフェラーゼとルシフェリンとを反応させる。
図２には、第３ルシフェラーゼとしてＲｌｕｃを用いる場合を例示する。このようにして、識別して検出可能な光の種類を増やすことができる。
図２には、第３ルシフェラーゼとしてＲｌｕｃを用いる場合を例示する。このようにして、識別して検出可能な光の種類を増やすことができる。
（スクリーニング方法）
更には、本発明のレポーターアッセイ方法を用いることで、化合物の細胞に与える影響を評価することや、生理活性物質、薬物等のスクリーニングを行うことも可能である。
以下に、免疫応答に係る生理活性物質のスクリーニングを行う場合について説明する。
更には、本発明のレポーターアッセイ方法を用いることで、化合物の細胞に与える影響を評価することや、生理活性物質、薬物等のスクリーニングを行うことも可能である。
以下に、免疫応答に係る生理活性物質のスクリーニングを行う場合について説明する。
例えば、まず、細胞に免疫応答関連因子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を導入し、さらに、内部コントロールとする遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を導入し、前記第１ルシフェラーゼ及び前記第２ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞を用意する。続いて、生理活性物質であることが疑われる被験物質と当該組み換え細胞とを接触させ、ルシフェリンと当該組み換え細胞とを接触させる。被験物質としては特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、等が挙げられる。被験物質と細胞との接触は、被験物質を含む被験試料と細胞との接触であってもよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等である。被験物質が免疫応答に係る生理活性物質である場合には、第１ルシフェラーゼが細胞内に発現が誘導され、ルシフェリンは第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼと反応する。
次いで、本発明の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂを識別する。光Ａは免疫応答関連因子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表す。そして、例えば、予め被験物質の非存在下で同様のアッセイを行って光Ａ及び光Ｂの発光量を取得しておき、被験物質の存在下と非存在下での光Ａ及び光Ｂの発光量の変化に基づいて、被験物質が免疫応答に係る生理活性物質であるかを判別して被験物質を選択すればよい。例えば、被験物質を組み換え細胞と接触させない場合の光Ｂの発光量により補正した後の光Ａの発光量と比較して、光Ｂの発光量により補正した後の光Ａの発光量を増加させる被験物質を、免疫応答に係る生理活性物質の候補として選択すればよい。
次いで、本発明の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂを識別する。光Ａは免疫応答関連因子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表す。そして、例えば、予め被験物質の非存在下で同様のアッセイを行って光Ａ及び光Ｂの発光量を取得しておき、被験物質の存在下と非存在下での光Ａ及び光Ｂの発光量の変化に基づいて、被験物質が免疫応答に係る生理活性物質であるかを判別して被験物質を選択すればよい。例えば、被験物質を組み換え細胞と接触させない場合の光Ｂの発光量により補正した後の光Ａの発光量と比較して、光Ｂの発光量により補正した後の光Ａの発光量を増加させる被験物質を、免疫応答に係る生理活性物質の候補として選択すればよい。
＜キット＞
本発明のキットは、本発明の光識別方法、本発明の物質の検出方法、又は、本発明のレポーターアッセイ方法を行うためのキットであって、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を備えるものである。
当該阻害剤は、本発明の光識別方法に係る第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害するものであればよく、上述の＜光識別方法＞で説明した阻害剤を好適なものとして例示できる。
本発明のキットは、上記阻害剤の他に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応のためのバッファー及び試薬類、反応容器および取扱い説明書を備えていてもよい。
バッファーは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応系となる液のｐＨを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に適したｐＨに保つ役割を有する。バッファーの種類は、反応させるルシフェリン、ルシフェラーゼの種類及び測定対象物の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。バッファーにはルシフェリン等の試薬が予め含まれていてもよい。
本発明のキットは、本発明の光識別方法、本発明の物質の検出方法、又は、本発明のレポーターアッセイ方法を行うためのキットであって、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を備えるものである。
当該阻害剤は、本発明の光識別方法に係る第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害するものであればよく、上述の＜光識別方法＞で説明した阻害剤を好適なものとして例示できる。
本発明のキットは、上記阻害剤の他に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応のためのバッファー及び試薬類、反応容器および取扱い説明書を備えていてもよい。
バッファーは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応系となる液のｐＨを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に適したｐＨに保つ役割を有する。バッファーの種類は、反応させるルシフェリン、ルシフェラーゼの種類及び測定対象物の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。バッファーにはルシフェリン等の試薬が予め含まれていてもよい。
本発明のキットは、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を備えていてもよく、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子、及び遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を備えていてもよい。融合遺伝子は、該遺伝子を測定対象物の細胞内で発現可能な発現ベクターとして構築されていてもよい。
或いは、本発明のキットは、検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターを備えていてもよく、検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクター、及び検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターを備えていてもよい。遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターの一例としては、第１ルシフェラーゼタンパク質をコードする第１ルシフェラーゼ遺伝子を含むものであり、第１ルシフェラーゼ遺伝子の上流に検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域を挿入することにより、融合遺伝子を構築することができる。
また、本発明のキットは、免疫応答、アポトーシス、細胞毒性、細胞増殖、細胞分化、細胞周期等の細胞情報を取得するために用いられる試薬類をさらに備えていてもよい。
或いは、本発明のキットは、検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターを備えていてもよく、検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクター、及び検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターを備えていてもよい。遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターの一例としては、第１ルシフェラーゼタンパク質をコードする第１ルシフェラーゼ遺伝子を含むものであり、第１ルシフェラーゼ遺伝子の上流に検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域を挿入することにより、融合遺伝子を構築することができる。
また、本発明のキットは、免疫応答、アポトーシス、細胞毒性、細胞増殖、細胞分化、細胞周期等の細胞情報を取得するために用いられる試薬類をさらに備えていてもよい。
＜ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤＞
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤は、下記一般式（１）で表される化合物若しくはその塩、又は下記一般式（２）で表される化合物若しくはその塩である。
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤は、下記一般式（１）で表される化合物若しくはその塩、又は下記一般式（２）で表される化合物若しくはその塩である。
［式（１）中、
Ｘ１はＣＨ又はＮを表し、Ｒ１はハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｎはＲ１の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎが２以上のとき、Ｒ１同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｍはＲ２の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｍが２のとき、Ｒ２同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
Ｘ１はＣＨ又はＮを表し、Ｒ１はハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｎはＲ１の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎが２以上のとき、Ｒ１同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｍはＲ２の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｍが２のとき、Ｒ２同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
Ｒ１の前記ハロゲン原子は、Ｆ，Ｃｌ, Ｂｒ, Ｉ等の周期表において第１７族に属する元素である。
Ｒ２の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示できる。Ｒ２の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数１〜３が好ましく、炭素数１又は２がより好ましい。
Ｒ２の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示できる。Ｒ２の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数１〜３が好ましく、炭素数１又は２がより好ましい。
［式（２）中、
Ｘ２はＣＨ又はＮを表し、Ｒ３はハロゲン原子を表し、Ｒ４は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｐはＲ３の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｐが２以上のとき、Ｒ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｑはＲ５の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｑが２のとき、Ｒ５同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
Ｘ２はＣＨ又はＮを表し、Ｒ３はハロゲン原子を表し、Ｒ４は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｐはＲ３の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｐが２以上のとき、Ｒ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｑはＲ５の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｑが２のとき、Ｒ５同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
Ｒ３の前記ハロゲン原子は、Ｆ，Ｃｌ, Ｂｒ, Ｉ等の周期表において第１７族に属する元素である。
Ｒ４の２価の連結基としては、アルキレン基、ＮＨを含む２価の連結基又はこれらの組合せが挙げられる。Ｒ４がアルキレン基である場合、炭素数１〜３が好ましく、炭素数１〜２がより好ましい。
Ｒ４がＮＨを含む２価の連結基である場合、ＮＨを含む２価の連結基としては、−ＮＨ−、−Ｃ−ＮＨ−等が挙げられる。
Ｒ５の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示できる。Ｒ５の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数１〜３が好ましく、炭素数１又は２がより好ましい。
Ｒ４の２価の連結基としては、アルキレン基、ＮＨを含む２価の連結基又はこれらの組合せが挙げられる。Ｒ４がアルキレン基である場合、炭素数１〜３が好ましく、炭素数１〜２がより好ましい。
Ｒ４がＮＨを含む２価の連結基である場合、ＮＨを含む２価の連結基としては、−ＮＨ−、−Ｃ−ＮＨ−等が挙げられる。
Ｒ５の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示できる。Ｒ５の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数１〜３が好ましく、炭素数１又は２がより好ましい。
一般式（１）で表される化合物において、Ｘ１がＮである場合、下記一般式（１−１）で表される化合物が挙げられる。
［式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（１）におけるものと同じである。］
Ｒ１がＣｌであり、Ｒ２がメチル基である場合、前記一般式（１−１）で表される化合物としては、下記式（１−２）で表される化合物が挙げられる。
一般式（２）で表される化合物において、Ｘ２がＣＨである場合、下記一般式（２−１）で表される化合物が挙げられる。
［式中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、前記一般式（２）におけるものと同じである。］
Ｒ３がＣｌであり、Ｒ４が−Ｃ−であり、Ｒ５がメチル基である場合、前記一般式（２−１）で表される化合物としては、下記式（２−２）で表される化合物が挙げられる。
上記一般式（１）で表される化合物は、ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害することができ、本発明の光識別方法における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤として、好適に用いることができる。
上記一般式（１）で表される化合物が反応を阻害する前記第１ルシフェリンとしては、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。
上記一般式（１）で表される化合物が反応を阻害する前記第１ルシフェリンとしては、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。
本発明の光識別方法において、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含み、前記ルシフェリンが前記第１ルシフェリンと同じ物質であるとき、上記一般式（１）で表される化合物が反応を阻害する前記第１ルシフェリンとしては、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。このとき、光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比の値を大きくするとの観点から、第１ルシフェラーゼとしては、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ又はＣＢＲが好ましく、第２ルシフェラーゼとしては、ＣＢＧ又はＳＬＲが好ましい。
上記一般式（２）で表される化合物は、ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害することができ、本発明の光識別方法における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤として、好適に用いることができる。
上記一般式（２）で表される化合物が反応を阻害する前記第１ルシフェリンとしては、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。
上記一般式（２）で表される化合物が反応を阻害する前記第１ルシフェリンとしては、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。
本発明の光識別方法において、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含み、前記ルシフェリンが前記第１ルシフェリンと同じ物質であるとき、上記一般式（２）で表される化合物が反応を阻害する前記第１ルシフェリンとしては、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。このとき、光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比の値を大きくするとの観点から、第１ルシフェラーゼとしては、ＣＢＲが好ましく、第２ルシフェラーゼとしては、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＧ又はＳＬＲが好ましい。
上記一般式（１）で表される化合物又は上記一般式（２）で表される化合物は、比較的低分子なため、細胞への浸透が起こり易い。そのため、本発明の光識別方法に、これらの化合物を用いることにより、測定対象物の細胞から発生られた光を細胞非破壊的に測定することができる。
発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤は、本発明の光識別方法における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤として、好適に用いることができるので、デュアルルシフェラーゼアッセイ用試薬として用いることができる。また、後述する色調制御方法において、発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤は、色調制御試薬として好適に用いることができる。
＜ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法＞
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法は、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を用いる。
例えば、第１ルシフェラーゼ、及び第１発光物質である第１ルシフェリンを含む反応系に、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を添加することで、第１ルシフェラーゼと第１発光物質である第１ルシフェリンとの反応を阻害することができる。
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法は、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を用いる。
例えば、第１ルシフェラーゼ、及び第１発光物質である第１ルシフェリンを含む反応系に、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を添加することで、第１ルシフェラーゼと第１発光物質である第１ルシフェリンとの反応を阻害することができる。
また、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む反応系に、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を添加することで、第１ルシフェラーゼと第１発光物質である第１ルシフェリンとの反応を阻害することができる。
このとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光波長が異なっている場合、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を添加することで、反応系から発せられた光の色調を、阻害剤存在下と阻害剤非存在下とで変化させることができる。
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を用いた色調制御方法としては、例えば、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含み、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光波長が異なる反応液に、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を接触させて、前記反応液から発せられる光の色調を変化させる色調制御方法とすることができる。
このとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光波長が異なっている場合、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を添加することで、反応系から発せられた光の色調を、阻害剤存在下と阻害剤非存在下とで変化させることができる。
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を用いた色調制御方法としては、例えば、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含み、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光波長が異なる反応液に、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を接触させて、前記反応液から発せられる光の色調を変化させる色調制御方法とすることができる。
＜装置＞
本発明の装置は、本発明の光識別方法を行うための装置であって、（ａ）前記測定対象物から発せられた光の発光量を測定する測定手段と、（ｂ）前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ１の値と、前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別するための算出手段と、を備えるものである。測定手段は、前記測定対象物から発せられた光の発光量又は発光強度を測定するものであってもよい。
本発明の装置は、本発明の光識別方法を行うための装置であって、（ａ）前記測定対象物から発せられた光の発光量を測定する測定手段と、（ｂ）前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ１の値と、前記測定手段によって測定された前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別するための算出手段と、を備えるものである。測定手段は、前記測定対象物から発せられた光の発光量又は発光強度を測定するものであってもよい。
図３は、本発明の装置の構成を模式的に示す図である。装置１は、測定手段１０と、算出手段２０を備えている。測定手段１０は、測定対象物から発せられた光の発光量又は発光量を測定するものであり、例えば光検出器、光センサーである。なお、測定対象物は本発明の装置の構成要素ではない。測定手段１０は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定可能である。また、測定手段１０は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定可能である。
測定手段１０によって測定された発光量Ｌ１の値及び発光量Ｌ２の値は、算出手段２０によって、測定された発光量のうち、光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量とが算出され、光Ａと光Ｂを識別することが可能である。算出手段は、例えばコンピュータである。光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量の算出方法については、上述した＜光識別方法＞における（識別工程）で説明したものが挙げられる。
測定手段１０によって測定された発光量Ｌ１の値及び発光量Ｌ２の値は、算出手段２０によって、測定された発光量のうち、光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量とが算出され、光Ａと光Ｂを識別することが可能である。算出手段は、例えばコンピュータである。光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量の算出方法については、上述した＜光識別方法＞における（識別工程）で説明したものが挙げられる。
本発明の装置は、測定対象物を支持する支持部、測定対象物に阻害剤を接触させるために測定対象物に阻害剤を添加する阻害剤添加ノズル、阻害剤を保持しており前記ノズルへと阻害剤を供給する阻害剤保持部、発光量Ｌ１、発光量Ｌ２、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの発光量の低下率等を記憶する記憶手段等をさらに備えていてもよい。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜各種ルシフェラーゼに対する反応阻害−（１）＞
反応容器にルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）２．５μＬ、測定バッファー５０μＬ、阻害剤のＤＭＳＯ溶液３μＬを加えて混合し反応溶液を調製した。ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）のルシフェラーゼは、TnT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systems（プロメガ社製）によって、添付の説明書に沿って合成した。測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。ルシフェラーゼは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの計４種を用意し、阻害剤を含まないコントロールの反応溶液（阻害剤（−））を含め、計５種の反応溶液を用意した。阻害剤は、上記式（１−２）で表される化合物である。各反応溶液中の阻害剤の終濃度は、いずれも２ｍＭとなるように調整した。反応溶液中でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。
反応容器にルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）２．５μＬ、測定バッファー５０μＬ、阻害剤のＤＭＳＯ溶液３μＬを加えて混合し反応溶液を調製した。ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）のルシフェラーゼは、TnT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systems（プロメガ社製）によって、添付の説明書に沿って合成した。測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。ルシフェラーゼは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの計４種を用意し、阻害剤を含まないコントロールの反応溶液（阻害剤（−））を含め、計５種の反応溶液を用意した。阻害剤は、上記式（１−２）で表される化合物である。各反応溶液中の阻害剤の終濃度は、いずれも２ｍＭとなるように調整した。反応溶液中でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。
測定結果を図４に示す。図４のグラフは、阻害剤（−）の反応溶液から得られた発光の発光量を１とした相対発光活性を示す。阻害剤は緑色発光型ルシフェラーゼであるＣＢＧの発光活性にはあまり影響せず、ＣＢＧの発光活性は０．８程度となったが、阻害剤はＬｕｃ２及びＦｌｕｃの発光活性を０．３程度に低下させ、ＣＢＲの発光活性を０．１程度に低下させた。
＜各種ルシフェラーゼに対する反応阻害−（２）＞
反応容器にルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）２．５μＬ、測定バッファー５０μＬ、阻害剤のＤＭＳＯ溶液３μＬを加えて混合し反応溶液を調製した。ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）のルシフェラーゼは、TnT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systems（プロメガ社製）によって、添付の説明書に沿って合成した。測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。ルシフェラーゼは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの計４種を用意し、阻害剤を含まないコントロールの反応溶液（阻害剤（−））を含め、計５種の反応溶液を用意した。阻害剤は、上記式（２−２）で表される化合物である。各反応溶液中の阻害剤の終濃度は、いずれも１００μＭとなるように調整した。反応溶液中でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。
反応容器にルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）２．５μＬ、測定バッファー５０μＬ、阻害剤のＤＭＳＯ溶液３μＬを加えて混合し反応溶液を調製した。ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ ｅｘｔｒａｃｔ）のルシフェラーゼは、TnT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systems（プロメガ社製）によって、添付の説明書に沿って合成した。測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。ルシフェラーゼは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの計４種を用意し、阻害剤を含まないコントロールの反応溶液（阻害剤（−））を含め、計５種の反応溶液を用意した。阻害剤は、上記式（２−２）で表される化合物である。各反応溶液中の阻害剤の終濃度は、いずれも１００μＭとなるように調整した。反応溶液中でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。
測定結果を図５に示す。図５のグラフは、阻害剤（−）の反応溶液から得られた発光の発光量を１とした相対発光活性を示す。阻害剤は緑色発光型ルシフェラーゼであるＣＢＧの発光活性にはほとんど影響せずにＣＢＧの発光活性は１程度のままであった。阻害剤はＬｕｃ２及びＦｌｕｃの発光活性を０．８程度に低下させ、ＣＢＲの発光活性を０．１程度に低下させた。
＜ホウレンソウへの一過性遺伝子導入＞
光によって誘導されることが知られている光誘導性プロモーターＣＡＢ１について、異なる光条件下での該プロモーター活性を確認した。
まず、光誘導性プロモーターＣＡＢ１とＣＢＧとの融合遺伝子（ＣＡＢ−ＣＢＧ）、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターＣａＭＶ−３５ＳとＣＢＲとの融合遺伝子（３５Ｓ−ＣＢＲ）、及びＣａＭＶ−３５ＳとＣＢＧの融合遺伝子（３５Ｓ−ＣＢＧ）をOgura et al., Plant Biotechnology 22(2), 151-155 (2005)（非特許文献２）に記載の方法により作製した。
ＣＡＢ１プロモーターが遺伝子発現量を測定したい目的遺伝子のプロモーターであり、３５Ｓプロモーターは、内部コントロールとなるプロモーターである。
光によって誘導されることが知られている光誘導性プロモーターＣＡＢ１について、異なる光条件下での該プロモーター活性を確認した。
まず、光誘導性プロモーターＣＡＢ１とＣＢＧとの融合遺伝子（ＣＡＢ−ＣＢＧ）、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターＣａＭＶ−３５ＳとＣＢＲとの融合遺伝子（３５Ｓ−ＣＢＲ）、及びＣａＭＶ−３５ＳとＣＢＧの融合遺伝子（３５Ｓ−ＣＢＧ）をOgura et al., Plant Biotechnology 22(2), 151-155 (2005)（非特許文献２）に記載の方法により作製した。
ＣＡＢ１プロモーターが遺伝子発現量を測定したい目的遺伝子のプロモーターであり、３５Ｓプロモーターは、内部コントロールとなるプロモーターである。
続いて、遺伝子銃によりこれらの融合遺伝子をホウレンソウ細胞に同時に導入した。導入条件はOgura et al., Plant Biotechnology 22(2), 151-155 (2005) （非特許文献２）に準拠する。融合遺伝子の導入された細胞を明条件処理群と暗条件処理群とに分け、明条件処理群は１２時間の連続白色照明下（５０ μｍｏｌｍ−２ ｓｅｃ−１）で処理し、暗条件処理群は１２時間の連続暗期で処理した。Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＰＬＢバッファーを用い、細胞抽出液を作製した。
細胞抽出液は、
・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下、・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下、・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下、・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下、
の計４種を得た。
反応容器に上記の各細胞抽出液１０μＬ、測定バッファーを加え、反応溶液とした。測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ１）をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。次いで、各反応溶液に阻害剤を添加し、各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ２）を、ルミノメーターを用いて発光を測定した。阻害剤は、上記式（１−２）で表される化合物である。
細胞抽出液は、
・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下、・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下、・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下、・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下、
の計４種を得た。
反応容器に上記の各細胞抽出液１０μＬ、測定バッファーを加え、反応溶液とした。測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ１）をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。次いで、各反応溶液に阻害剤を添加し、各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ２）を、ルミノメーターを用いて発光を測定した。阻害剤は、上記式（１−２）で表される化合物である。
ＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の、阻害剤による低下率が１０％、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の、阻害剤による低下率が１００％（阻害なし）として、各反応液中の阻害剤非存在下におけるＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光量、及びＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量をそれぞれ求めた。
結果を図６に示す。図６のグラフは、各反応液中の阻害剤非存在下におけるＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の値を、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光量の値で除算した値である。
図６のグラフ中、
・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「ＣＡＢ１−Ｌｉｇｈｔ」、
・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「ＣＡＢ１−Ｄａｒｋ」、
・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「３５Ｓ−Ｌｉｇｈｔ」、
・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「３５Ｓ−Ｄａｒｋ」と表記した。
図６のグラフ中、
・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「ＣＡＢ１−Ｌｉｇｈｔ」、
・ＣＡＢ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「ＣＡＢ１−Ｄａｒｋ」、
・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・明条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「３５Ｓ−Ｌｉｇｈｔ」、
・３５Ｓ−ＣＢＧ及び３５Ｓ−ＣＢＲ導入細胞・暗条件下処理の細胞抽出物を含む反応溶液に対する上記値を「３５Ｓ−Ｄａｒｋ」と表記した。
このようにして、内部標準によって正規化されたプロモーター活性の値を算出できた。
図６のグラフから、光誘導性プロモーターＣＡＢ１の活性が、暗条件下よりも明条件下で高められていることが読み取れる。
以上のことから、測定対象物の細胞抽出物からＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による光とＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による光とを区別せずに検出した場合であっても、発光量Ｌ１の値と、発光量Ｌ２の値とに基づいて両光を識別でき、２種類のルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイを実施可能であることが実証された。
図６のグラフから、光誘導性プロモーターＣＡＢ１の活性が、暗条件下よりも明条件下で高められていることが読み取れる。
以上のことから、測定対象物の細胞抽出物からＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による光とＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による光とを区別せずに検出した場合であっても、発光量Ｌ１の値と、発光量Ｌ２の値とに基づいて両光を識別でき、２種類のルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイを実施可能であることが実証された。
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
本発明は、ルシフェラーゼ発光を利用したあらゆる活性評価に応用可能である。ルシフェラーゼレポーターを用いたデュアルルシフェラーゼ法等による遺伝子発現定量技術のほか、酵素活性定量技術あるいは微生物検出技術等への応用があり、それらを利用した創薬技術等への応用も考えられる。
また、多色ルシフェラーゼの組成を変化させずに，ルシフェラーゼ発光の色調を変化させる一般的手法としても用いることが出来る。
また、多色ルシフェラーゼの組成を変化させずに，ルシフェラーゼ発光の色調を変化させる一般的手法としても用いることが出来る。
１…装置、１０…測定手段、２０…算出手段
Claims (3)
- 下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物又はそれらの塩であることを特徴とするルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤。
Ｘ１はＣＨ又はＮを表し、Ｒ１はハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｎはＲ１の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎが２以上のとき、Ｒ１同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｍはＲ２の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｍが２のとき、Ｒ２同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
Ｘ２はＣＨ又はＮを表し、Ｒ３はハロゲン原子を表し、Ｒ４は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。
ｐはＲ３の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｐが２以上のとき、Ｒ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。ｑはＲ５の数を表し、０〜２のいずれかの整数であり、ｑが２のとき、Ｒ５同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］ - ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害する請求項１に記載の阻害剤を用いることを特徴とするルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害方法。
- 以下の工程；
第１ルシフェラーゼ、発光量の測定対象であり発光量測定時に前記第１ルシフェラーゼと反応して光Ａを発する第１発光物質である第１ルシフェリン、及び発光量の測定対象であり発光量測定時に光Ｂを発する第２発光物質（ただし、蛍光物質を除く）を含む測定対象物（ただし、前記第２発光物質がルシフェリンであり、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、前記ルシフェリン、及び前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含むとき、前記第１ルシフェラーゼと前記第２ルシフェラーゼとは異なる。）の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、予め取得された前記阻害剤による前記第１発光物質である第１ルシフェリンの発光量の低下率と、予め取得された前記阻害剤による前記第２発光物質の発光量の低下率と、に基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光量を算出し、前記光Ａの発光量と前記光Ｂの発光量とを識別する識別工程、
を含む光識別方法を行うためのキットであって、請求項１に記載の阻害剤を備えることを特徴とするキット。
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|---|
| PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 22, no. 2, JPN6018016802, 2005, pages 151 - 155, ISSN: 0004104776 * |
| PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 28, JPN6018016800, 2011, pages 423 - 426, ISSN: 0004104774 * |
| PROMEGA NOTES MAGAZINE, JPN6018016803, 1996, pages 02, ISSN: 0004104775 * |
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