JP2019010073A

JP2019010073A - 凍結乳酸菌の解凍方法

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Publication number: JP2019010073A
Application number: JP2017129643A
Authority: JP
Inventors: 奈緒高木; Nao Takagi; 堀内　啓史; Hiroshi Horiuchi; 啓史堀内
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-01-24

Abstract

【課題】本発明の第１の目的は、特別な添加剤を用いることなく、かつ飲食品における各種条件を制限することなく、簡易に飲食品中の乳酸菌の生残性を向上させることにある。本発明の第２の目的は、発酵乳の発酵時間を短縮し、高い生産効率を実現できるようにするため、乳酸菌スターターの活力を高めることにある。【解決手段】本発明は、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する、凍結乳酸菌の解凍方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、凍結乳酸菌の解凍方法に関する。詳細には、凍結乳酸菌を特定温度範囲内の温度条件下で解凍する方法、及びその解凍方法を用いて解凍した乳酸菌を含有する飲食品組成物の製造方法に関する。

近年、プロバイオティクス機能を有する菌株に注目が集められており、これらの菌の摂取による消化管内の改善・健常化とそれに伴う免疫調整作用による予防医学が盛んになってきている。その中でも特に乳酸菌はプロバイオティクス菌とも称され、古来より様々な飲食品として摂取されている。最近では、さらに以前よりもその機能開発が盛んになり、新規な機能性を盛り込んだ商品としての開発も進んでいる。その様な菌種としては例えばラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）やストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられる。

乳酸菌を摂取するために、乳酸菌を各種飲食品に含有させることがよく行われており、飲食品中での乳酸菌の生残性を向上させることは、乳酸菌が上記のようなプロバイオティクス機能を有するものであることから、予防医学にとって絶大な貢献をすることとなる。しかしながら、発酵乳を代表とする発酵飲食品においては低ｐＨ環境となっており乳酸菌の生存には適さないことが知られている。したがって、各種飲食品中において乳酸菌の生残性を向上させることが従来から求められており、これまで種々の研究が重ねられてきた。

非特許文献１には、システイン、ホエイ粉末、ＷＰＣ、カゼイン水和物、又はトリプトンを添加することで、ビフィズス菌やアシドフィラス菌を含むヨーグルトで、保存中における菌数維持が改善されたことが報告されている。
また、非特許文献２には、活性酸素除去剤としてのアスコルビン酸を添加することで、プロバイオティクス菌（アシドフィラス菌）の菌数消長が改善されたことが報告されている。

また、特許文献１にはラクトバシルス・ガセリを含む飲食品の製造方法であって、飲食品のｐＨや糖濃度を特定の範囲とし、ラクトバシルス・ガセリと特定の乳酸菌を混合する工程を含む上記製造方法が開示されている。

一方、ヨーグルト等の発酵乳は、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）やストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の乳酸菌スターターを原料乳に加え、所定の温度条件下で発酵が進むことで製造される。発酵乳を製造するにあたっては、急激な物量増加への対応と労務費・電熱費低減のために、品質を落とさず発酵時間を短縮することが求められている。発酵時間を短縮するためには、原料乳を発酵させる力を維持する乳酸菌スターターの「活力（発酵力）」を高める必要がある。

この乳酸菌スターターの「活力」を向上させ、高い発酵活性を発揮する方法として、例えば、特許文献２には、乳酸菌スターターを調製するための培養基が開示されており、この培養基は、脱脂粉乳又はホエー粉を３．５％以上含有し、さらにｐＨ調整のために炭酸カルシウムなどの不溶性のカルシウム塩と乳酸生産促進因子として可溶性マグネシウム塩を５０ｍＭ以上含有することを特徴としている。

国際公開第２０１３／０８５００９号公報特開平０８−１１６８７２号公報

Ｒ．Ｉ．デイブ等（Ｒ．Ｉ．ＤａｖｅａｎｄＮ．Ｐ．Ｓｈａｈ），"ＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｆｆｅｃｔｓｏｎＶｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＰｒｏｂｉｏｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａｉｎＹｏｇｕｒｔ"，Ｊ．ＤａｉｒｙＳｃｉ８１，２８０４−２８１６（１９９８）Ｒ．Ｉ．デイブ等（ＲａｊｉｖＩ．ＤａｖｅａｎｄＮｅｇｅｎｄｒａＰ．Ｓｈａｈ），"ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄａｓａｎＯｘｙｇｅｎＳｃａｖｅｎｇｅｒｉｎＩｍｐｒｏｖｉｎｇＶｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＰｒｏｂｉｏｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎＹｏｇｈｕｒｔｓＭａｄｅｗｉｔｈＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＳｔａｒｔｅｒＣｕｌｔｕｒｅｓ"，Ｉｎｔ．ＤａｉｒｙＪｏｕｒｎａｌ７，４３５−４４３（１９９７）

上記非特許文献１及び非特許文献２においては乳タンパク質や活性酸素除去剤などを添加することで乳酸菌の生残性を改良しようとしていた。しかしながら、これらの物質は飲食品の風味や物性への影響が大きく、その使用には限界があった。また、抗酸化剤である活性酸素除去剤では自己酸化によりその効果を発揮することから、所定量の活性酸素除去剤ではその効果の持続性が期待できない。また、乳又は乳素材を用いる場合には、特定の処理が必要となり、その調整に手間がかかり、ひいてはコストアップにもつながる。また、上記特許文献１においても、飲食品のｐＨや糖濃度を特定の範囲とする必要があり、その調整に手間がかるものであった。

そこで本発明の第１の目的は、特別な添加剤を用いることなく、かつ飲食品における各種条件を制限することなく、簡易に飲食品中の乳酸菌の生残性を向上させることを目的とする。

一方、発酵乳の製造において使用される乳酸菌スターターは、発酵乳の発酵完了までの時間が３時間未満であれば、発酵乳の高い生産効率を実現できるとされている。しかしながら従来の乳酸菌では、３時間未満の発酵時間で原料乳の発酵を完了させることは困難であった。

そこで本発明の第２の目的は、発酵乳の発酵時間を短縮し、高い生産効率を実現できるようにするために、乳酸菌スターターの活力を向上させることを目的とする。

本発明者らは、飲食品中の乳酸菌の生残性を向上させるべく、あるいは、乳酸菌スターターの活力を向上させて、発酵乳の発酵時間を短縮するべく、凍結乳酸菌の解凍条件に着目した。これまで、凍結乳酸菌を解凍する場合、１５℃程度の水で凍結乳酸菌を流水解凍するのが一般的であった。本発明者らは、凍結乳酸菌を解凍する際の解凍温度を特定の範囲にして、凍結乳酸菌の解凍を行った結果、驚くべきことに、解凍した乳酸菌を飲食品に用いた際の乳酸菌の生残性を従来よりも顕著に向上させることができ、また、乳酸菌スターターの活力を向上させ、発酵乳の発酵時間を短縮できることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって本発明によれば、以下の発明が提供される。
１．凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する、凍結乳酸菌の解凍方法。
２．前記乳酸菌が、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）である、前記１に記載の凍結乳酸菌の解凍方法。
３．前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、及びストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌である、前記１に記載の凍結乳酸菌の解凍方法。
４．前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５：ＮＩＴＥＢＰ−７６）、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４：ＮＩＴＥＰ−７７）からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌である、前記１に記載の凍結乳酸菌の解凍方法。
５．凍結乳酸菌を解凍する工程を含む、乳酸菌を含有する飲食品組成物を製造する方法であって、
前記解凍する工程が、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程である、乳酸菌を含有する飲食品組成物の製造方法。

本発明の凍結乳酸菌の解凍方法によれば、解凍した乳酸菌を飲食品に使用した場合に、飲食品中の乳酸菌の生残性を向上させることができる。従って、長期保存後にも高いプロバイオティクス機能を付与しうる飲食品等を提供することができる。
さらに、本発明の凍結乳酸菌の解凍方法によれば、乳酸菌スターターの活力を向上させることができ、その結果発酵乳の発酵時間を短縮することができ、高い生産効率を実現できる。

以下、本発明について詳細に説明する。

［凍結乳酸菌の解凍方法］
本発明は、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する、凍結乳酸菌の解凍方法である。
〈乳酸菌〉
本発明における乳酸菌とは、資化した乳糖に対し、乳酸の産生量が５０％以上となるものをいい、その種類は特に制限されるものではない。
本発明において好ましい乳酸菌は、例えば、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）等に属する微生物が例示できる。

ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、例えば、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）が好適に用いられる。
また、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が好適に用いられる。

なお、上記ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、及びストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は、乳酸菌スターターとして使用できる。

特に、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）としては、例えば、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）株が好適に用いられる。

ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）としては、例えば、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５：ＮＩＴＥＢＰ−７６）株が好適に用いられる。
また、ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（（登録商標）株式会社明治製）より単離して得られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ２０３８等を用いることもできる。

ストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４：ＮＩＴＥＰ−７７）株が好適に用いられる。
また、ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（（登録商標）株式会社明治製）より単離して得られるサーモフィルス菌ＯＬＳ３０５９（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３０５９）等を用いることもできる。

これらの菌株については、単独あるいは２種以上が組み合わされている場合であってもよい。

ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）株、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５：ＮＩＴＥＢＰ−７６）株、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４：ＮＩＴＥＰ−７７）株の寄託に関する情報は以下の通りである。

ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）株
（１）寄託機関名：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（現寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター）
（２）連絡先：〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号
電話番号０２９−８６１−６０２９
（現連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２０号室
電話番号０４３８−２０−５９１０）
（３）受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６９９９
（４）識別のための表示：ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６
（５）原寄託日：平成１１年５月２４日
（６）ブタペスト条約に基づく寄託への移管日：平成１２年１月１４日

ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５：ＮＩＴＥＢＰ−７６）株
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（現：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室）
（３）受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−７６
（４）識別のための表示：ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５（ＮＩＴＥＢＰ−７６）
（５）原寄託日：２００５年２月１０日
（６）ブタペスト条約に基づく寄託への移管日：２００９年４月３０日

ストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４：ＮＩＴＥＰ−７７）株
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（現：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室）
（３）受託番号：ＮＩＴＥＰ−７７
（４）識別のための表示：ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４
（５）原寄託日：２００５年２月１０日

〈凍結乳酸菌〉
本発明における凍結乳酸菌は、上記乳酸菌のうち凍結しているものをいい、凍結している状態であればその凍結温度は特に制限されず、例えば、−８０℃程度であってもよいし、−４０℃程度であってもよい。なお、本発明の効果の観点から、凍結温度は、後述する氷晶成長温度帯である−１５℃〜−３０℃よりも低い温度であることが好ましい。

凍結乳酸菌は、上記乳酸菌を培養して得られた乳酸菌培養物を、上記温度で凍結して得られたものであってよい。乳酸菌を培養する培地は、従来公知の乳酸菌を培養するための培地が挙げられ、培地の種類は特に制限されない。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能である。炭素源としては、例えばラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、澱粉加水分解物、及び廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えばカゼインの加水分解物、ホエイタンパク質加水分解物、及び大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに増殖促進剤としては、例えば肉エキス、魚肉エキス、及び酵母エキス等が用いられる。

培養は嫌気条件下で行うことが望ましいが、通常用いられる液体静置培養などによる微好気条件下でもよい。嫌気培養には窒素ガス気層下で培養する方法などの公知の手法を適用することができるが、他の方法でもよい。培養温度は一般に３０〜４０℃が好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でもよい。培養中の培地のｐＨは６．０〜７．０に維持することが好ましいが、菌が生育するｐＨであれば他のｐＨ条件でもよい。また、バッチ培養条件下で培養することもできる。培養時間は通常１０〜２４時間が好ましいが、菌が生育することができる時間であれば、他の培養時間であってもよい。

〈解凍温度〉
本発明において、上記凍結乳酸菌を解凍する温度は、２０℃〜５０℃の範囲内とする。上記凍結乳酸菌を解凍する温度が２０℃〜５０℃の範囲内であれば、解凍温度が一定であってもよいし、解凍温度が一定ではなく変動しても構わない。２０℃〜５０℃の範囲内で解凍温度が一定であるとは、凍結乳酸菌が解凍するまでの間、上記温度範囲内のある一定の温度（例えば、２５℃）のまま保持し続けることを指すが、±０．５℃の誤差を含んでもよいものとする。例えば、ある一定温度を２５℃に設定する場合は、２４．５℃〜２５．５℃の範囲をいう。
従来、凍結乳酸菌の解凍は、菌体損傷が起こるとされる−１５℃〜−３０℃（氷晶成長温度帯）を速やかに通過させるために流水解凍するのが一般的であったが、その解凍温度は１５℃程度であった。
本発明では、上記解凍温度を上記特定温度範囲内の温度条件下で凍結乳酸菌を解凍することにより、乳酸菌の生残性を顕著に向上させ、また、乳酸菌スターターの活力を向上させることが可能となったことを初めて見出したことに基づく。
凍結乳酸菌を解凍する温度は、好ましくは２１℃以上であり、より好ましくは２３℃以上であり、さらに好ましくは２５℃以上である。また、好ましくは４０℃以下であり、より好ましくは３５℃以下であり、さらに好ましくは３０℃以下である。

解凍方法としては、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍できるのであれば、特に制限されないが、例えば、恒温水槽（株式会社サイニクス社製、マルチサーマルユニット（ＣＨ−１５０ｉ））を用いて凍結乳酸菌を解凍する方法が挙げられる。

〈解凍時間〉
凍結乳酸菌を解凍する時間は、凍結乳酸菌が解凍できれば特に制限されるものではなく、凍結乳酸菌の菌数や、乳酸菌培養物の体積等に応じて、適宜調整すればよいが、例えば０．５時間以上、好ましくは０．８時間以上、より好ましくは１時間以上である。また、例えば５時間以下、好ましくは３時間以下、より好ましくは２時間以下である。

［乳酸菌を含有する飲食品組成物の製造方法］
本発明は、また、凍結乳酸菌を解凍する解凍工程を経て得られる解凍乳酸菌を用いて、乳酸菌を含有する飲食品組成物を製造する方法を提供する。
すなわち、凍結乳酸菌を解凍する工程を含む、乳酸菌を含有する飲食品組成物を製造する方法であって、上記解凍する工程が、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程である、乳酸菌を含有する飲食品組成物の製造方法を提供する。
凍結乳酸菌を解凍する工程は、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程であり、上述したとおりである。上記解凍した乳酸菌を用いるのであれば、従来公知の乳酸菌を含む飲食品と同様にして本発明の飲食品組成物を製造することができる。

本発明の乳酸菌を含有する飲食品組成物を製造する方法においては、製造される飲食品組成物全体における乳酸菌生菌の菌数が、例えば、３×１０^７ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは５×１０^７ｃｆｕ／ｇ以上、より好ましくは１０×１０^７ｃｆｕ／ｇ以上となるように、上記解凍乳酸菌を用いることが好ましい。生菌数は常法に従い求めることができる。

上記解凍した乳酸菌を飲食品に適用する形態としては、乳酸菌生菌を含む発酵乳、飲料等を挙げることができ、その他健康食品、特定保健用食品、栄養補助食品等として使用できる。そして、これらには食品衛生上許容できる配合物、例えば、安定化剤、保存料、着色料、香料、ビタミン等の配合物を上記リン酸化多糖類に適宜添加し、混合し、定法により、錠剤、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル状、液状、ゼリー状、クリーム状、飲料等の食品とすることができる。

その他の成分についても特に限定されないが、例えば、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。

タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物（例えば、バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分）などが挙げられる。

糖質としては、例えば、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。

脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂や、例えば、パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。

ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられる。

ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。

有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。

これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

本発明においては、上記所定の温度条件で解凍した乳酸菌をそのまま各種飲食品や原料等に添加したものを本発明の飲食品組成物としてもよいし、発酵を必要とする飲食品（発酵乳等）の場合は、解凍した乳酸菌を、他の原料と混合し、発酵させることによって得られる飲食品組成物としてもよい。発酵を必要とする飲食品（発酵乳等）の製造は、従来公知の方法を用いて行うことができる。

ここで「発酵乳」とは、ヨーグルト、乳等省令で定義される「発酵乳」、「乳製品乳酸菌飲料」、「乳酸菌飲料」の何れであってもよい。ヨーグルトとしては、具体的には、セットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトヨーグルト（糊状発酵乳）又はドリンクヨーグルト（液状発酵乳）などのヨーグルトがあげられる。セットタイプヨーグルトには、プレーンヨーグルトなどが挙げられる。一般に、プレーンヨーグルトは、容器に原料を充填させ、その後に発酵させること（後発酵）により製造される。一方、ソフトヨーグルトやドリンクヨーグルトは、発酵させた発酵乳を微粒化処理や均質化処理した後に、容器に充填させること（前発酵）により製造される。本発明においては、上記のいずれの製造方法にも用いることができる。

以下具体的に、本発明の凍結乳酸菌の解凍方法により解凍し、得られた乳酸菌を用いて発酵乳を製造する方法について例示的に説明する。

発酵乳を製造する方法は、例えば以下の工程を含む。
（ｉ）原料乳を調製する工程
（ｉｉ）凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程
（ｉｉｉ）調製した原料乳に解凍した乳酸菌を播種し、発酵させる工程

（ｉ）原料乳を調製する工程
原料乳は、例えば、生乳、原乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイなどの乳成分を含む液体であり、その種類は特に制限されるものではなく、従来公知のものを使用することができる。また、原料乳を調製する方法も特に制限されず、従来一般の発酵乳製造工程と同じく、原料乳を調製し、均質化や殺菌・冷却などの処理を行って原料乳を調製する。

（ｉｉ）凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程
凍結乳酸菌を解凍する工程は、上述したとおりである。

（ｉｉｉ）調製した原料乳に解凍した乳酸菌を播種し、発酵させる工程
調製した原料乳に解凍した乳酸菌を播種し、発酵させる方法についても、その方法は特に制限されず、従来一般の発酵乳製造工程と同じく行うことができる。発酵工程では、必要に応じて別途乳酸菌スターターを用いてよい。例えば、実施例に示すように、所定の容器（容量：１００ｇ、プラスチック製）に充填し、４３℃の発酵室で発酵を行うこともできる。

また、上記（ｉｉ）で解凍した乳酸菌は、上記（ｉｉｉ）の工程の前に、従来公知の方法により培養を行い、菌数を必要な範囲にまで増加（スケールアップ）させてもよい。

上記発酵乳の製造方法は上記（ｉｉ）凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程を含むため、得られる発酵乳中の乳酸菌の生残性が向上する。

さらに、上記発酵乳の製造方法は上記（ｉｉ）凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程を含むため、当該方法で解凍した乳酸菌は、以下の測定方法によって測定される乳酸菌スターターの活力推定時間を３時間未満とすることができる。
［乳酸菌の活力推定時間の測定方法］
生乳：５００．０ｇ、脱脂粉乳：４９．８ｇ、生クリーム：２２．０ｇ、水道水：３９８．２ｇを混合して、原料乳を調製する。得られた原料乳を９５℃、５分間で加熱殺菌した後に、４３℃に冷却する。上記解凍した乳酸菌をラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）が４０．５×１０^８個、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が２５．５×１０^８個となるように、上記調製した原料乳に接種した後に、カップ容器（容量：１００ｇ、プラスチック製）へ充填し、室温４３℃の発酵室で乳酸酸度が０．７％に到達するまでの時間を計測し、活力推定時間とする。

上記乳酸菌の活力推定時間は、好ましくは１７０分以内であり、より好ましくは１６０分未満である。

［乳酸菌を含有する飲食品組成物］
本発明の乳酸菌を含有する飲食品組成物は、上述したように、特定の温度条件下で解凍した乳酸菌を含有することにより、乳酸菌の生残性が従来よりも向上したものであり、また、活力が向上したスターターを使用して得られる生産効率の高い飲食品組成物である。

本発明の乳酸菌を含有する飲食品組成物の形態等は、「乳酸菌を含有する飲食品組成物の製造方法」の項で上述したものを同様に適用できる。

本発明において「乳酸菌の生残性」とは、生菌乳酸菌を含有する飲食品組成物を製造して保存後にどの程度生菌が存在しているかを示すものであり、生菌数は常法に従い求めることができる。例えば、保存に用いた飲食品を適宜希釈し、ＢＬ培地に塗沫して、３７℃で７２時間嫌気的に培養した後の培地上のコロニーを測定することによって求めることができる。保存に用いた培養液や飲食品の保存前の生菌数に対する保存後の生菌数の割合によって、生残率を示すことができる。
具体的には、実施例で後述するように、例えば、１２１℃、１５分間のオートクレーブ殺菌したＢＬ培地（栄研化学株式会社）：３８０ｇに馬脱繊維血液（株式会社日本バイオテスト研究所）：２０ｇを混釈し平板培地を作製し、そこに、解凍した生菌乳酸菌含有培養液を生理食塩水にて希釈して表面塗抹し、３７℃で７２時間培養後、出現したラフ型コロニーを生菌乳酸菌として計測できる。
乳酸菌の生残率は、例えば、下記式で表すように、飲食品組成物を製造して１日後の乳酸菌生菌数に対する、飲食品組成物を製造して８日後の乳酸菌生菌数の割合を求め評価することができる。
生残率（％）＝｛乳酸菌を含む飲食品組成物の製造８日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）／乳酸菌を含む飲食品組成物の製造１日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）｝×１００

上記乳酸菌の生残率（％）は、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、よりさらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上である。

以下、実施例及び比較例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

試験例１乳酸菌の生残性向上試験
本試験例では、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６）株について、当該菌の生残性に対して解凍温度が与える影響について調べた。

［実施例１−１］
（凍結乳酸菌の解凍）
ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌を水温２５℃の恒温水槽（株式会社サイニクス社製、マルチサーマルユニット（ＣＨ−１５０ｉ））にて解凍した。解凍時間は１時間とした。また、１時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。

（ヨーグルトの作製）
生乳：６１０ｇ、脱脂粉乳：２０ｇ、砂糖：３６ｇ、水道水：１０７ｇを混合して、原料乳（ヨーグルトミックス）を調製した。調製した原料乳を９５℃、５分間で加熱・殺菌した後に、４３℃に冷却した。その後、１０％脱脂粉乳で構成される乳酸菌スターター（明治十勝ヨーグルト（株式会社明治製）から分離した乳酸菌を培養したスターター）を２４ｇ（原料乳の合計の３重量％）と共に、上述の方法で解凍した「ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌」０．２４ｇ（原料乳の合計の０．０３重量％）を接種した後に、紙カップ容器（容量：１００ｇ）へ原料乳（乳酸菌スターターを含む）を充填し、４３℃の発酵室に静置して発酵させた。そして、乳酸酸度が０．７％に到達した時点で発酵を終了し、冷蔵室にて５℃に冷却してヨーグルトを作製した。

（ヨーグルト中のラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株の生残性の評価）
上述の方法で作製したヨーグルトを５℃で保存し、製造後の保存日数１日、及び８日時点でのラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株の菌数を計測した。菌数計測は下記方法で実施した。

［菌数計測］
１２１℃、１５分間のオートクレーブ殺菌したＢＬ培地（栄研化学株式会社）：３８０ｇに馬脱繊維血液（株式会社日本バイオテスト研究所）：２０ｇを混釈し平板培地を作製した。そこに、上記作製したヨーグルトを生理食塩水にて１０^５倍希釈したサンプル１００μＬを表面塗抹し、３７℃で７２時間培養後、出現したラフ型コロニーをラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株として計測した。
結果を表１に示す。

［生残率］
上記計測したラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株をもとに、下記式で表される生残率を計算した。
生残率（％）＝｛乳酸菌を含む飲食品組成物の製造８日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）／乳酸菌を含む飲食品組成物の製造１日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）｝×１００
結果を下記表１に示す。

［実施例１−２］
解凍時間を３時間としたことを除いては、実施例１−１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。また、３時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表１に示す。

［実施例１−３］
ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌を水温３０℃の恒温水槽にて解凍したことを除いては、実施例１−１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。また、１時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表１に示す。

［実施例１−４］
解凍時間を３時間としたことを除いては、実施例１−３と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。また、３時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表１に示す。

［実施例１−５］
解凍時間を５時間としたことを除いては、実施例１−３と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。また、５時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表１に示す。

［実施例１−６］
ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌を水温４０℃の恒温水槽にて解凍したことを除いては、実施例１−１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。また、１時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表１に示す。

［比較例１−１］
ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌を水温１５℃の恒温水槽にて解凍したことを除いては、実施例１−１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。また、１時間の解凍後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６凍結菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表１に示す。

上記結果から分かるように、凍結乳酸菌を２０〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍することで（実施例１−１〜１−６）、凍結乳酸菌を１５℃で保持した場合（比較例１−１）と比較して、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株の生残性が顕著に向上することが分かった。
なお、製造後の保存日数が８日を超えた場合も、実施例１−１〜１−６は比較例１−１と比較して、製造１日後に対する生残性は顕著に向上したことを確認した。

試験例２乳酸菌スターターの活力向上試験
本試験例では、乳酸菌スターターである、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）と、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）について、当該スターター菌の活力向上に対して解凍温度が与える影響について調べた。

［実施例２−１］
（凍結乳酸菌の解凍）
凍結乳酸菌（明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１プレーン（株式会社明治製）から分離した、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＮＩＴＥＢＰ−７６）株、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＮＩＴＥＰ−７７）株）を水温２０℃の恒温水槽にて解凍した。解凍時間は１時間とした。また、１時間の解凍後、当該凍結菌スターターが完全に解凍されたことを確認した。

（解凍済み乳酸菌の培養）
ステンレス容器にて、脱脂粉乳：１００ｇ、水道水：８７０ｇを混合して培地を調製し、９５℃、５分間で加熱殺菌した後に、４０℃に冷却した。その後、培地に上記解凍済みの乳酸菌スターターを３０ｇ（３重量％）で接種した。この乳酸菌スターター３０ｇに含まれる乳酸菌の菌数の目安は、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＮＩＴＥＢＰ−７６）株が１３．５×１０^７ｃｆｕ／ｇ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＮＩＴＥＰ−７７）株が８５．０×１０^７ｃｆｕ／ｇとした。この乳酸菌スターターを、培地内の温度が４０℃で、乳酸酸度が０．７０％に到達するまで静置して培養した。培養を終えた培地の容器を冷水に浸し、培地を５℃まで冷却し、スケールアップした新たな乳酸菌を得た。

（ヨーグルトの作製）
まず、生乳：５００．０ｇ、脱脂粉乳：４９．８ｇ、生クリーム：２２．０ｇ、水道水：３９８．２ｇを混合して、原料乳を調製した。得られた原料乳を９５℃、５分間で加熱殺菌した後に、４３℃に冷却した。つづいて上記作製した新たな乳酸菌をラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＮＩＴＥＢＰ−７６）株が４０．５×１０^８個、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＮＩＴＥＰ−７７）株が２５．５×１０^８個となるように、上記調製した原料乳に接種した後に、カップ容器（容量：１００ｇ、プラスチック製）へ充填し、室温４３℃の発酵室で乳酸酸度が０．７％に到達するまで発酵し、ヨーグルトを作製した。このとき、原料乳に乳酸菌を接種してから、乳酸酸度が０．７％に到達するまで時間（活力推定時間）を計測した。
結果を下記表２に示す。

［実施例２−２］
凍結乳酸菌を水温２５℃の恒温水槽にて解凍したことを除いては、実施例２−１と同様に新たな乳酸菌を製造し、活力推定時間を計測した。また、１時間の解凍後、凍結乳酸菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表２に示す。

［実施例２−３］
凍結乳酸菌を水温３０℃の恒温水槽にて解凍したことを除いては、実施例２−１と同様に新たな乳酸菌を製造し、活力推定時間を計測した。また、１時間の解凍後、凍結乳酸菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表２に示す。

［実施例２−４］
解凍時間を３時間としたことを除いては、実施例２−１と同様に新たな乳酸菌を製造し、活力推定時間を計測した。また、３時間の解凍後、凍結乳酸菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表２に示す。

［実施例２−５］
解凍時間を３時間としたことを除いては、実施例２−２と同様に新たな乳酸菌を製造し、活力推定時間を計測した。また、３時間の解凍後、凍結乳酸菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表２に示す。

［実施例２−６］
解凍時間を３時間としたことを除いては、実施例２−３と同様に新たな乳酸菌を製造し、活力推定時間を計測した。また、３時間の解凍後、凍結乳酸菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表２に示す。

［比較例２−１］
凍結乳酸菌を水温１５℃の恒温水槽にて解凍したことを除いては、実施例２−１と同様に新たな乳酸菌を製造し、活力推定時間を計測した。また、１時間の解凍後、凍結乳酸菌が完全に解凍されたことを確認した。
結果を下記表２に示す。

上記結果から分かるように、凍結乳酸菌を２０〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍することで（実施例２−１〜２−６）、凍結乳酸菌を１５℃で解凍した場合（比較例２−１）と比較して、乳酸菌スターターの活力推定時間が短くなり、３時間未満とすることができた。すなわち、凍結乳酸菌を２０〜５０℃の範囲内の温度条件で解凍することで、乳酸菌スターターの活力が向上し、高い生産効率が得られることがわかった。

ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）としては、例えば、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５：ＮＩＴＥＢＰ−７６）株が好適に用いられる。

ストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４：ＮＩＴＥＰ−７７）株が好適に用いられる。

［実施例２−１］
（凍結乳酸菌の解凍）
凍結乳酸菌（ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＮＩＴＥＢＰ−７６）株、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＮＩＴＥＰ−７７）株）を水温２０℃の恒温水槽にて解凍した。解凍時間は１時間とした。また、１時間の解凍後、当該凍結菌スターターが完全に解凍されたことを確認した。

Claims

凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する、凍結乳酸菌の解凍方法。
前記乳酸菌が、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）である、請求項１に記載の凍結乳酸菌の解凍方法。
前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、及びストレプトコッカス・サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌である、請求項１に記載の凍結乳酸菌の解凍方法。
前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）、ラクトバシルス・ブルガリカスＯＬＬ１２５５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１２５５：ＮＩＴＥＢＰ−７６）、及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３２９４：ＮＩＴＥＰ−７７）からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌である、請求項１に記載の凍結乳酸菌の解凍方法。
凍結乳酸菌を解凍する工程を含む、乳酸菌を含有する飲食品組成物を製造する方法であって、
前記解凍する工程が、凍結乳酸菌を２０℃〜５０℃の範囲内の温度条件下で解凍する工程である、乳酸菌を含有する飲食品組成物の製造方法。