JP2019002843A - 炎症性疾患の診断方法およびそのためのキット、ならびに炎症疾患の治療のための薬物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断方法およびそのためのキット、ならびに炎症疾患の治療のための薬物のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標とする診断方法およびそのためのキット、ならびにＳ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性および／または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標とする炎症性疾患の治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【選択図】図９
【解決手段】非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標とする診断方法およびそのためのキット、ならびにＳ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性および／または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標とする炎症性疾患の治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【選択図】図９
Description
本発明は、炎症性疾患の診断方法およびそのためのキットに関する。本発明はさらに、炎症性疾患の治療のための薬物のスクリーニング方法に関する。
炎症および炎症過程は、多くの疾患及び症状の病態生理において主要な役割を果たしている。炎症が関連する疾患の一つとして、動脈硬化症が挙げられる。動脈硬化症は、心疾患や脳血管疾患等の心血管疾患の原因となり得、がんと並んで大きな死亡原因の一つである。したがって、動脈硬化症等の炎症性疾患を適切に診断・治療する方法が強く望まれている。
従来、動脈硬化症の診断においては、まず、動脈硬化の危険因子として知られている脂質異常症の有無を調べ、脂質異常症の危険因子が見出された場合には、脈波測定や頸動脈エコー等の血管機能に関する詳しい検査を行うことが一般的であった。
一般に、脂質異常症は、血液中のリポタンパク質（Very Low-Density Lipoprotein（ＶＬＤＬ）、Low-Density Lipoprotein（ＬＤＬ）およびHigh-Density Lipoprotein（ＨＤＬ））に含まれるコレステロールや中性脂肪の量に基づいて判断されている。しかしながら、このようなコレステロールや中性脂肪の量に基づいて判断された脂質異常症の程度が、必ずしも動脈硬化症等の炎症性疾患の病態を反映しないことが明らかになりつつある。
一方、ＨＤＬとスフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）とが複合体（ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ）を形成すること、および、ＨＤＬ−Ｓ１ＰがＳ１Ｐ受容体の一つであるＳ１ＰＲ１と結合することにより、炎症促進性の接着分子ＩＣＡＭ−１の分泌抑制を介して抗炎症作用を示すことが知られている（非特許文献１）。しかしながら、ＶＬＤＬやＬＤＬとＳ１Ｐとの関連については知られていなかった。
Galvani et al., Science Signaling. 8(389): ra79（2015） "HDL-bound sphingosine 1-phosphate acts as a biased agonist for the endothelial cell receptor S1P1 to limit vascular inflammation." (doi: 10.1126/scisignal.aaa2581.)
このような状況下、本発明者らは、炎症性疾患を診断・治療するためのマーカーの探索に鋭意取り組んだ結果、ＶＬＤＬやＬＤＬとＳ１Ｐとが複合体（以下、「非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ」という）を形成すること、および、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐが、Ｓ１Ｐ受容体であるＳ１ＰＲ２および／またはＳ１ＰＲ３と結合することにより炎症が惹起されることを見出した。そして、本発明者らは、炎症性疾患の病態と血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルとの間に高い相関が存在すること、および、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、炎症性疾患の診断・治療のための精度の高いマーカーとして用いられ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
したがって、本発明は、炎症性疾患の診断方法およびそのためのキット、ならびに炎症性疾患の治療のための薬物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断のためのデータを収集する方法であって、
被検体から採取された血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを測定する工程、および
前記測定工程において得られた測定値を、予め設定した閾値と比較する工程
を含む、方法。
（２）前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度である、（１）に記載の方法。
（３）前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中のＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度の比である、（１）に記載の方法。
（４）Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、
Ｓ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性をスクリーニング指標として用いて、前記阻害活性を有する薬物を選定するか、または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルをスクリーニング指標として用いて、前記レベルを低下させる物質を前記薬物として選定する工程
を含む、方法。
（５）前記スクリーニング指標が前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルである場合において、前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度である、（４）に記載の方法。
（６）前記スクリーニング指標が前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルである場合において、前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中のＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐの比である、（４）に記載の方法。
（７）非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体および非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬を含む、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断用キット。
（８）ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体およびＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬をさらに含む、（７）に記載のキット。
（１）Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断のためのデータを収集する方法であって、
被検体から採取された血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを測定する工程、および
前記測定工程において得られた測定値を、予め設定した閾値と比較する工程
を含む、方法。
（２）前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度である、（１）に記載の方法。
（３）前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中のＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度の比である、（１）に記載の方法。
（４）Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、
Ｓ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性をスクリーニング指標として用いて、前記阻害活性を有する薬物を選定するか、または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルをスクリーニング指標として用いて、前記レベルを低下させる物質を前記薬物として選定する工程
を含む、方法。
（５）前記スクリーニング指標が前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルである場合において、前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度である、（４）に記載の方法。
（６）前記スクリーニング指標が前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルである場合において、前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中のＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐの比である、（４）に記載の方法。
（７）非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体および非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬を含む、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断用キット。
（８）ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体およびＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬をさらに含む、（７）に記載のキット。
本発明によれば、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標として用いることにより、Ｓ１ＰＲ２および／またはＳ１ＰＲ３が関与する炎症性疾患の病態の診断や発症予測を、従来の方法より高い精度で、血液検査のような簡便な方法で実施することができる。また、本発明によれば、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベル、Ｓ１ＰＲ２および／またはＳ１ＰＲ３の阻害活性をスクリーニング指標として用いることにより、Ｓ１ＰＲ２および／またはＳ１ＰＲ３が関与する炎症性疾患を治療するための薬剤スクリーニングを簡便に実施することができる。
炎症性疾患の診断のためのデータの収集方法
本発明のデータの収集方法は、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断のためのデータを収集するものである。
本発明のデータの収集方法は、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断のためのデータを収集するものである。
本発明の方法は、被検体から予め取得されたもの、例えば血液、尿、細胞および組織等を処理する方法、またはこれらを分析する等して各種データを収集する方法を含む。
本発明の方法におけるＳ１ＰＲ２および／またはＳ１ＰＲ３が関与する炎症性疾患（以下、「Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患」ともいう）としては、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患であれば特に限定されないが、例えば、動脈硬化症および動脈硬化関連疾患が挙げられる。動脈硬化関連疾患としては、動脈硬化に起因する疾患であれば特に限定されないが、例えば、大動脈瘤、狭心症および心筋梗塞等の心疾患、ならびに脳梗塞、脳血栓、脳卒中、脳出血およびクモ膜下出血等の脳血管疾患が挙げられる。また、本発明における炎症性疾患の治療には、その疾患の根治のみならず、症状の改善も含まれ、例えば、血流の増加に起因する発赤および腫脹の抑制、マクロファージや白血球により産生される発熱物質に起因する発熱の抑制、および食細胞により産生されるプロスタグランジン等に起因する疼痛の抑制等が挙げられる。
本発明の方法においては、被検体から採取された血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルの測定を行う。
本発明の方法における「非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベル」とは、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐの絶対量、例えば、試料中に含まれる非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐの濃度等であってもよく、また、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐの相対量、例えば、試料中に含まれるＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐの量に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐの量（例えば、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ濃度／ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ濃度）であってもよい。
本発明の方法において、試料中に含まれる非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ量およびＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ量の測定は、当業者に公知のクロマトグラフィーおよび／または定量分析を用いて実施することができる。
本発明の方法においては、血液が試料として用いられ、好ましくは血漿が用いられる。なお、本発明の方法の実施を妨げない範囲内において、血液に代えて、血液以外の細胞や組織等を試料として用いることもできる。
血液を試料として用いる場合、まず、遠心分離により、血液から血漿を分離する。次いで、分離した血漿をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて、ＨＤＬ分画、ＬＤＬ分画およびＶＬＤＬ分画に分離する。得られたＬＤＬ分画およびＶＬＤＬ分画を併せて非ＨＤＬ分画とする。また、ＬＤＬやＶＬＤＬに特異的に含まれるアポタンパク質（アポリポタンパク質Ｂ）を特異的に吸着するカラムまたは粒子（デキストラン硫酸など）を用いて、血液中からＬＤＬやＶＬＤＬを特異的に分取することにより、血漿をＨＤＬ分画および非ＨＤＬ分画に分離することもできる。
得られた非ＨＤＬ分画を、クロマトグラフィーおよび／または定量分析にかける。クロマトグラフィーとしては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびガスクロマトグラフィー等が用いられ、好ましくはＨＰＬＣが用いられる。また、定量分析の方法としては、抗体や蛍光物質を用いた定量方法（ＥＬＩＳＡ法等）および赤外線を用いた定量方法（ＦＴ−ＩＲ法等）等が用いられる。また、カラムクロマトグラフィーと質量分析装置を用いた定量分析を一体的に行うＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用することもできる。
また、ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐの濃度の測定は、サイズ排除クロマトグラフィーにより得られたＨＤＬ分画を、上述したのと同様にクロマトグラフィーおよび／または定量分析にかけることにより行うことができる。
本発明の方法においては、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルの測定値と、予め設定した閾値との比較を行う。
本発明において、閾値は、人種、性別、年齢等に応じて設定された、健常時の被検体および／または健常者の集団において測定された非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベル（健常非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベル）に基づいて予め設定することができる。そして、健常非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルは、上述の手法により健常時の被検体および／または健常者の集団において測定されたＳ１Ｐの定量値を参照して、公知の統計的手法を用いて設定することができる。上記健常非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルの具体的な設定方法としては、例えば、（健常非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルの平均値±標準偏差）またはＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）分析等が挙げられ、好ましくはＲＯＣ分析である。
炎症性疾患の診断方法
本発明の診断方法は、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を診断するものである。本発明の診断方法では、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標として用いる。
本発明の診断方法は、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を診断するものである。本発明の診断方法では、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを指標として用いる。
本発明の診断方法は、上記炎症性疾患の診断のためのデータの収集方法の手順により収集された診断のためのデータに基づいて行われる。
本発明の診断方法において、例えば、被検体から採取された血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、予め設定した閾値と比較して低い場合には、被検体は炎症性疾患に罹患していないと判断する。一方、被検体から採取された血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、予め設定した閾値と比較して高い場合には、被検体は炎症性疾患に罹患していると判断する。また、ある期間の起点と終点における非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルの比較において、終点における非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが起点における非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルよりも低い場合には、被検体の炎症性疾患は寛解傾向にあると判断する。一方、終点における非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが起点における非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルよりも高い場合には、被検体の炎症性疾患は増悪傾向にあると判断する。閾値の設定は、上記炎症性疾患の診断のためのデータの収集方法における設定方法に準じる。
炎症性疾患を治療するための薬物のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための薬物をスクリーニングするものである。本発明のスクリーニング方法では、Ｓ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性（以下、「Ｓ１ＰＲ２／３阻害活性」ともいう）、または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルをスクリーニング指標として用いて、前記薬物を選定する。
本発明のスクリーニング方法は、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための薬物をスクリーニングするものである。本発明のスクリーニング方法では、Ｓ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性（以下、「Ｓ１ＰＲ２／３阻害活性」ともいう）、または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルをスクリーニング指標として用いて、前記薬物を選定する。
Ｓ１ＰＲ２／３阻害活性をスクリーニング指標として用いる場合、Ｓ１ＰＲ２／３阻害活性を有することが確認された候補物質を、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための薬物として特定する。候補物質がＳ１ＰＲ２／３阻害活性を有するかどうかの確認は、当業者であれば適切に実施することができる。例えば、Ｓ１ＰＲ２／３阻害活性をスクリーニング指標として用いた薬物のスクリーニング方法は、例えば、遺伝子導入により、ヒト体内と同じ環境下でＳ１ＰＲ２／３遺伝子が発現するように操作された細胞を用意し、候補物質の存在下または非存在下でＳ１ＰＲ２／３遺伝子の発現試験を行い、Ｓ１ＰＲ２／３のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を比較することにより、候補物質のＳ１ＰＲ２／３阻害活性を確認することができる。また、同様に、ヒト体内と同じ環境でＳ１ＰＲ２／３が機能するアッセイ系を用意し、候補薬物の存在下または非存在下で試験を行い、Ｓ１ＰＲ２／３タンパク質の機能（非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐによる炎症惹起作用）を比較することにより、候補物質のＳ１ＰＲ２／３阻害活性を確認することができる。
一方、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルをスクリーニング指標として用いる場合、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを低下させる活性を有することが確認された候補物質を、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための薬物として特定する。候補物質が非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを低下させる活性を有するかどうかの確認は、当業者であれば適切に実施することができる。例えば、炎症を惹起したマウス等の血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ濃度を測定し、その後、候補物質を投与し、投与後の血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ濃度を測定し、候補物質の投与前後における非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを構成するＳ１Ｐ濃度を比較することにより、候補物質が非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを低下させる活性を有するかどうかを確認することができる。
本発明のスクリーニング方法では、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質、ペプチド等、様々なタイプの物質を候補物質とすることができる。
さらに、Ｓ１ＰＲ２／３阻害活性を有する薬物および／または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを低下させる活性を有する薬物（以下、「本発明の薬物」ともいう）を含む、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための医薬組成物が提供される。また、本発明によれば、治療上有効な量の本発明の薬物を被検体に投与することを含む、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を治療するための薬物の使用が提供される。本発明の薬物としては、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質、ペプチド等、様々なタイプの物質を用いることができる。
治療または予防の対象となる被検体は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
炎症性疾患の診断用キット
本発明のキットは、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を診断するためのものである。本発明のキットは、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体および非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬を含む。非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体は、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを検出・定量することができるように、予め標識をされていることが好ましい。一方、キットは、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体に結合する標識された二次抗体をさらに含んでいてもよく、当該標識された二次抗体を用いて非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを検出・定量することもできる。
本発明のキットは、Ｓ１ＰＲ２／３関連炎症性疾患を診断するためのものである。本発明のキットは、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体および非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬を含む。非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体は、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを検出・定量することができるように、予め標識をされていることが好ましい。一方、キットは、非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体に結合する標識された二次抗体をさらに含んでいてもよく、当該標識された二次抗体を用いて非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを検出・定量することもできる。
実施例１：ＮＰＣ１Ｌ１が動脈硬化症に及ぼす影響を評価するモデルマウスの作製
本実施例では、以下の手順に従って、ＮＰＣ１Ｌ１が動脈硬化症に及ぼす影響を解析するための動脈硬化症モデルマウス（ＭＴ／ＮＰＣ１Ｌ１ ＫＯ（ＭＴ／ＫＯ）マウス）を作製した。
まず、ＮＰＣ１Ｌ１の発現が欠損したＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウス（ＮＰＣ１Ｌ１ ＫＯ）を、ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子のエキソンの一部をネオマイシンカセットに置換したターゲティングベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞に導入し、得られたＥＳ細胞を用いて、Science Translational Medicine, 7, 275ra 223 (2015)に記載の方法により作製した。
次いで、市販のＬＤＬ（低比重リポタンパク質）レセプター（ＬＤＬＲ）機能欠損マウス（ＭＴマウス）（ＲＢＲＣ−ＡＥＳ２２８１、理化学研究所バイオリソースセンター製）と、上記のように作製されたＮＰＣ１Ｌ１とを交配させて、ＭＴ×ＮＰＣ１Ｌ１ ＫＯ（ＭＴ／ＫＯ）マウスを作製した。
本実施例では、以下の手順に従って、ＮＰＣ１Ｌ１が動脈硬化症に及ぼす影響を解析するための動脈硬化症モデルマウス（ＭＴ／ＮＰＣ１Ｌ１ ＫＯ（ＭＴ／ＫＯ）マウス）を作製した。
まず、ＮＰＣ１Ｌ１の発現が欠損したＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウス（ＮＰＣ１Ｌ１ ＫＯ）を、ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子のエキソンの一部をネオマイシンカセットに置換したターゲティングベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞に導入し、得られたＥＳ細胞を用いて、Science Translational Medicine, 7, 275ra 223 (2015)に記載の方法により作製した。
次いで、市販のＬＤＬ（低比重リポタンパク質）レセプター（ＬＤＬＲ）機能欠損マウス（ＭＴマウス）（ＲＢＲＣ−ＡＥＳ２２８１、理化学研究所バイオリソースセンター製）と、上記のように作製されたＮＰＣ１Ｌ１とを交配させて、ＭＴ×ＮＰＣ１Ｌ１ ＫＯ（ＭＴ／ＫＯ）マウスを作製した。
作製された８〜１０週齢のＭＴ／ＫＯマウスを、高脂肪食（ウェスタンダイエット、ＥＰＳ益新株式会社製、０．２１％コレステロール＋４１％ｋｃａｌ乳脂肪含有）の自由摂取条件下で２０週間飼育した（ＭＴ／ＫＯ Ｅｚｅ（−）マウス）。
また、８〜１０週齢のＭＴマウスを上記と同様の摂取条件下で２０週間飼育したマウス（ＭＴ Ｅｚｅ（−）マウス）、および８〜１０週齢のＭＴマウスをエゼチミブ（KEMPROTEC社製）２０μｇ／ｇ高脂肪食で混合した高脂肪食の自由摂取条件下で２０週間飼育したマウス（ＭＴ Ｅｚｅ（−）マウス）を対照群として準備した。
飼育開始２０週間後の各マウスの腹部大動脈から切片を採取し、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液に浸けて４℃条件下で一晩インキュベーションした。インキュベーション終了後、以下の手順に従って、動脈硬化巣の形成をOil Red Oにより染色して解析した。まず、動脈切片をＰＢＳ中で１０分間室温インキュベーションし、６０％イソプロパノールに置換して１０分間室温でインキュベーションした。次いで、Oil Red O溶液に置換して３０分間室温インキュベーションした。最後に、６０％イソプロパノール溶液で動脈切片を洗浄し、ＰＢＳ中で４℃保存した。動脈切片のOil Red O染色像を、一眼レフカメラ（EOS Kiss X4、キヤノン株式会社製）を用いて撮影し、画像編集ソフト（Photoshop Extended CS6、Adobe Systems社製）を用いて動脈切片全面積中の染色面積の割合を算出した。
腹部大動脈切片のOil Red O染色像、および染色像に基づく動脈硬化巣面積の定量結果を表すグラフを図１に示す。
また、飼育開始２０週間後に、各マウスから採血し、１３，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、血漿およびリポタンパク質を分離した。血漿およびリポタンパク質分離後の各フラクション中のコレステロールおよび中性脂肪の濃度測定を、それぞれコレステロールＥ−テストワコーおよびトリグリセライドＥ−テストワコー（いずれも、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。測定結果を表すグラフを図２に示す。
図１の結果から、ＮＰＣ１Ｌ１の機能が欠損していないＭＴマウス（図１のＭＴ Ｅｚｅ（−））においては、広範囲にわたり動脈硬化巣が形成されていた。一方、エゼチミブによりＮＰＣ１Ｌ１の機能を阻害したＭＴマウス（図１のＭＴ Ｅｚｅ（＋））、およびＮＰＣ１Ｌ１の機能を欠損したＭＴ／ＫＯマウス（図１のＭＴ／ＫＯ Ｅｚｅ（−））においては、ＭＴ Ｅｚｅ（−）と比べて動脈硬化巣の面積割合が有意に低かった。これらの結果から、ＮＰＣ１Ｌ１が、動脈硬化巣の増大、ひいては動脈硬化症の発症および増悪に影響を及ぼし得ることが明らかとなった。
また、図２の結果から、ＮＰＣ１Ｌ１の機能が欠損していないＭＴマウス（図２のＭＴ Ｅｚｅ（−））においては、血漿中のコレステロール濃度および中性脂肪濃度が高かった。一方、エゼチミブによりＮＰＣ１Ｌ１の機能を阻害したＭＴマウス（図２のＭＴ Ｅｚｅ（＋））、およびＮＰＣ１Ｌ１の機能を欠損したＭＴ／ＫＯマウス（図２のＭＴ／ＫＯ Ｅｚｅ（−））においては、ＭＴ Ｅｚｅ（−）と比べて血漿中のコレステロール濃度および中性脂肪濃度のいずれも有意に低かった。これらの結果から、ＮＰＣ１Ｌ１が、動脈硬化巣の増大、ひいては動脈硬化症の発症および増悪に影響を及ぼし得る、血液中脂質濃度の上昇に関与することが明らかとなった。
したがって、図１および２の結果から、ＮＰＣ１Ｌ１が動脈硬化症に及ぼす影響を解析するための動脈硬化症モデルマウスとして、ＭＴ／ＫＯマウスを使用できることが分かった。
実施例２：ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたＮＰＣ１Ｌ１基質の分布の解析
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたＮＰＣ１Ｌ１基質（コレステロール）の挙動について確認を行った。
実施例１で使用したのと同じＭＴマウスおよびＭＴ／ＫＯマウスに、マウス血漿ブランクまたは、３ｍｇ／ｍｌのエゼチミブ溶液（マウス血漿ブランクにエゼチミブを溶解して作製）を１００μｌ／２０ｇ体重にて静脈内投与した。次いで、それぞれのマウスに、［３Ｈ］で標識したコレステロール（［３Ｈ］コレステロール）を十二指腸カニューレ法により経腸投与した。投与２時間後に、マウスから採血し、１３，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿のリポタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。具体的には、得られた血漿３００μｌをSuperose 6カラム（GE Healthcare社製）にインジェクションし、AKTA Prime（GE Healthcare社製）を用いてＰＢＳを０．２ｍｌ／分の流速で送液し、モデル2110フラクションコレクター（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてカラム溶出液を５００μｌずつ採取し、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたＮＰＣ１Ｌ１基質（コレステロール）の挙動について確認を行った。
実施例１で使用したのと同じＭＴマウスおよびＭＴ／ＫＯマウスに、マウス血漿ブランクまたは、３ｍｇ／ｍｌのエゼチミブ溶液（マウス血漿ブランクにエゼチミブを溶解して作製）を１００μｌ／２０ｇ体重にて静脈内投与した。次いで、それぞれのマウスに、［３Ｈ］で標識したコレステロール（［３Ｈ］コレステロール）を十二指腸カニューレ法により経腸投与した。投与２時間後に、マウスから採血し、１３，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿のリポタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。具体的には、得られた血漿３００μｌをSuperose 6カラム（GE Healthcare社製）にインジェクションし、AKTA Prime（GE Healthcare社製）を用いてＰＢＳを０．２ｍｌ／分の流速で送液し、モデル2110フラクションコレクター（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてカラム溶出液を５００μｌずつ採取し、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。
得られた各分画中の［３Ｈ］コレステロール関連化合物の量を、液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer社製）を使用して、［３Ｈ］カウントとして測定した。結果を図３に示す。
図３に示されるように、エゼチミブによりＮＰＣ１Ｌ１の機能を阻害したＭＴマウス（ＭＴ Ｅｚｅ（＋））、およびＮＰＣ１Ｌ１の機能を欠損したマウス（ＭＴ／ＫＯ Ｅｚｅ（−））においては、ＮＰＣ１Ｌ１の機能が阻害されていないＭＴ Ｅｚｅ（−）と比べて、ＶＬＤＬ分画中の［３Ｈ］コレステロール関連化合物含有量が低下した。一方、ＨＤＬ分画中の［３Ｈ］コレステロール関連化合物含有量は、いずれのマウスにおいても同程度であった。血液中において、ＶＬＤＬ中の中性脂肪がリポプロテインリパーゼによって加水分解されることで、ＶＬＤＬがＬＤＬに代謝されることを考慮すると、上記の結果から、ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたコレステロールが、ＶＬＤＬ／ＬＤＬ分画に存在するリポタンパク質に分布することが示された。また、ＮＰＣ１Ｌ１以外の経路を介して吸収されたコレステロールは、ＨＤＬ分画に存在するリポタンパク質に分布することが示された。
実施例３：ＮＰＣ１Ｌ１を介したスフィンゴ脂質の吸収に関するin vitroにおける解析
本実施例では、スフィンゴ脂質がＮＰＣ１Ｌ１の基質であることを、in vitroで確認した。
エタノールに溶解させたコレステロール溶液（１μＭ）、メタノールに溶解させたホスファチジルコリン（５０μＭ）、９６％エタノールに溶解させたタウロコール酸ナトリウム（２ｍＭ）、および各種［３Ｈ］ラベル体（［１，２，６，７−３Ｈ（Ｎ）］コレステロール（０．０４μＣｉ／ｍｌ）、スフィンゴミエリン（ウシ）［コリンメチル−３Ｈ］（０．０４μＣｉ／ｍｌ）、またはスフィンゴシンＤ−エリスロ−［３−３Ｈ］）（０．０４μＣｉ／ｍｌ）を混合させた溶液を作製し、エゼチミブ添加群（Ｅｚｅ（＋））群に関してはメタノールに溶解させたエゼチミブ（４０μＭ）を添加した。そして、Ｎ２ガスを用いてこれら混合液を乾固させた。ここに、トランスポートバッファー(１１８ｍＭ ＮａＣｌ、２３．８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、４．３８ｍＭ ＫＣｌ、０．９６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭグルコース、１．５３ｍＭ ＣａＣｌ２溶液をｐＨ７．４に調整)を加えた後、１０分間の撹拌および３時間の振盪過程を経て、これを各種化合物の細胞内取り込み実験のミセル溶液として用いた。
本実施例では、スフィンゴ脂質がＮＰＣ１Ｌ１の基質であることを、in vitroで確認した。
エタノールに溶解させたコレステロール溶液（１μＭ）、メタノールに溶解させたホスファチジルコリン（５０μＭ）、９６％エタノールに溶解させたタウロコール酸ナトリウム（２ｍＭ）、および各種［３Ｈ］ラベル体（［１，２，６，７−３Ｈ（Ｎ）］コレステロール（０．０４μＣｉ／ｍｌ）、スフィンゴミエリン（ウシ）［コリンメチル−３Ｈ］（０．０４μＣｉ／ｍｌ）、またはスフィンゴシンＤ−エリスロ−［３−３Ｈ］）（０．０４μＣｉ／ｍｌ）を混合させた溶液を作製し、エゼチミブ添加群（Ｅｚｅ（＋））群に関してはメタノールに溶解させたエゼチミブ（４０μＭ）を添加した。そして、Ｎ２ガスを用いてこれら混合液を乾固させた。ここに、トランスポートバッファー(１１８ｍＭ ＮａＣｌ、２３．８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、４．３８ｍＭ ＫＣｌ、０．９６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭグルコース、１．５３ｍＭ ＣａＣｌ２溶液をｐＨ７．４に調整)を加えた後、１０分間の撹拌および３時間の振盪過程を経て、これを各種化合物の細胞内取り込み実験のミセル溶液として用いた。
ヒト結腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞（対照細胞）、およびＮＰＣ１Ｌ１を高発現させたＣａｃｏ−２細胞（ＮＰＣ１Ｌ１高発現細胞）のそれぞれを、１２ウェルプレート（Falcon社製）に１×１０５細胞／ウェルの濃度で播種した後、２〜３日おきに培地交換を行い、１４日間培養した。次いで、細胞をトランスポートバッファーで２回洗浄した後、トランスポートバッファー下で細胞を３０分間インキュベーションした。そして、トランスポートバッファーを各種[３Ｈ]ラベル体含有ミセルに置換して２時間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷したトランスポートバッファーで細胞を２回洗浄し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して４℃で一晩インキュベーションして細胞を可溶化した。翌日、１Ｎ塩酸を用いて中和した。細胞可溶化液中の［１，２，６，７−３Ｈ（Ｎ）］コレステロール、スフィンゴミエリン（ウシ）［コリンメチル−３Ｈ］、スフィンゴシンＤ−エリスロ−［３−３Ｈ］の放射活性を、液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer社製）を用いて測定した。結果を図４に示す。
図４に示されるように、陽性対照としてのコレステロールと同様に、スフィンゴミエリンおよびスフィンゴシンのいずれも、ＮＰＣ１Ｌ１高発現細胞による取り込み量が有意に上昇し、エゼチミブ添加により取り込み量が有意に低下した。これらの結果から、スフィンゴ脂質がＮＰＣ１Ｌ１の基質となり得ることが示された。
実施例４：ＮＰＣ１Ｌ１を介したスフィンゴ脂質の吸収に関するin vivoにおける解析
本実施例では、スフィンゴ脂質がＮＰＣ１Ｌ１の基質であることを、in vivoで確認した。
実施例１で使用したのと同じＭＴマウスおよびＭＴ／ＫＯマウスに、実施例２と同様の方法でマウス血漿ブランクまたはエゼチミブ溶液を静脈内投与した。次いで、それぞれのマウスに、コリン部のメチル基を［３Ｈ］で標識したスフィンゴミエリン（［３Ｈ］スフィンゴミエリン）を十二指腸カニューレ法により経腸投与した。次いで、実施例２と同様の方法で血漿を得た。また、静脈内投与２時間後に肝臓を採取し、１００ｍｇ程度を計量した後、１ｍｌのSolvable（Perkin Elmer社製）を添加し、５５℃で肝臓が完全に溶解するまでインキュベーションした。得られた肝臓溶解液に１００μｌの過酸化水素水を添加して、５５℃で約１時間さらにインキュベーションして脱色した。最後に、１０ｍｌのHionic Fluor（Perkin Elmer社製）を添加してよく撹拌し、解析に用いる肝臓溶液とした。
本実施例では、スフィンゴ脂質がＮＰＣ１Ｌ１の基質であることを、in vivoで確認した。
実施例１で使用したのと同じＭＴマウスおよびＭＴ／ＫＯマウスに、実施例２と同様の方法でマウス血漿ブランクまたはエゼチミブ溶液を静脈内投与した。次いで、それぞれのマウスに、コリン部のメチル基を［３Ｈ］で標識したスフィンゴミエリン（［３Ｈ］スフィンゴミエリン）を十二指腸カニューレ法により経腸投与した。次いで、実施例２と同様の方法で血漿を得た。また、静脈内投与２時間後に肝臓を採取し、１００ｍｇ程度を計量した後、１ｍｌのSolvable（Perkin Elmer社製）を添加し、５５℃で肝臓が完全に溶解するまでインキュベーションした。得られた肝臓溶解液に１００μｌの過酸化水素水を添加して、５５℃で約１時間さらにインキュベーションして脱色した。最後に、１０ｍｌのHionic Fluor（Perkin Elmer社製）を添加してよく撹拌し、解析に用いる肝臓溶液とした。
血漿および肝臓溶液中の［３Ｈ］カウントを測定し、投与した［３Ｈ］スフィンゴミエリンの総［３Ｈ］カウントに対する割合をそれぞれ算出した。血漿および肝臓溶液についての算出値の合計値を、スフィンゴミエリンの吸収量の指標とした。各マウスにおける血漿および肝臓溶液における算出値、ならびに両者の合計値を図５に示す。
図５Ａ−Ｃに示されるように、ＭＴマウスと比べて、ＭＴ／ＫＯマウスでは、血漿および肝臓溶液、ならびにその合算値のいずれにおいてもスフィンゴミエリン由来化合物量が有意に低下した。また、エゼチミブの投与により、ＭＴマウスではスフィンゴミエリン由来化合物の量が有意に低下したのに対し、ＭＴ／ＫＯマウスにおいては有意な変動は認められなかった。これらの結果から、in vivoにおいて、スフィンゴミエリンがＮＰＣ１Ｌ１の基質となり得ることが示された。
実施例５：ＮＰＣ１Ｌ１基質の代謝の検証
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたスフィンゴ脂質がＳ１Ｐの供給源になり得ることを確認した。
スフィンゴミエリンは消化管腔内および体内において代謝されることが知られているため、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたスフィンゴミエリン代謝物の解析を行った。図６Ａに示すように、スフィンゴミエリン、ならびにスフィンゴミエリン代謝物であるスフィンゴシンおよびＳ１Ｐ（以下、スフィンゴミエリン関連化合物ともいう）の標本を用いて、それぞれについてＴＬＣによる分離を確認した。有機層に分布するスフィンゴミエリンおよびスフィンゴシンは、クロロホルム：メタノール＝８０：２０混合溶液を展開溶媒として用いて添加した。また、水層に分布するＳ１Ｐは、１−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１混合溶液を展開溶媒として用いて展開した。
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたスフィンゴ脂質がＳ１Ｐの供給源になり得ることを確認した。
スフィンゴミエリンは消化管腔内および体内において代謝されることが知られているため、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたスフィンゴミエリン代謝物の解析を行った。図６Ａに示すように、スフィンゴミエリン、ならびにスフィンゴミエリン代謝物であるスフィンゴシンおよびＳ１Ｐ（以下、スフィンゴミエリン関連化合物ともいう）の標本を用いて、それぞれについてＴＬＣによる分離を確認した。有機層に分布するスフィンゴミエリンおよびスフィンゴシンは、クロロホルム：メタノール＝８０：２０混合溶液を展開溶媒として用いて添加した。また、水層に分布するＳ１Ｐは、１−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１混合溶液を展開溶媒として用いて展開した。
実施例１で使用したのと同じＭＴマウスおよびＭＴ／ＫＯマウスに、実施例２と同様の方法でマウス血漿ブランクまたはエゼチミブ溶液を静脈内投与した。次いで、それぞれのマウスに、実施例４で使用したものと同じ［３Ｈ］スフィンゴミエリンを十二指腸カニューレ法により経腸投与した。投与２時間後に、各マウスから消化管腔液、小腸上皮細胞、肝臓および血漿を採取した。小腸上皮細胞および肝臓については、それぞれ１００ｍｇを細切した後、２００μｌのRIPA bufferに懸濁し、超音波破砕を行い、１５，０００ｒｐｍにて遠心後、上清を回収し各ホモジナイズ溶液とした。血漿５０μｌ、小腸上皮ホモジナイズ溶液１００μｌおよび肝臓ホモジナイズ溶液１００μｌのそれぞれに対して、２０倍量のクロロホルム：メタノール＝２：１溶液を添加し、１０〜２０分室温インキュベート後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心して水層を分取した。次いで、得られた水層に、添加したクロロホルム：メタノール＝２：１溶液の０．２倍量の生理食塩水をクロロホルム層に添加して、撹拌後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心して水層を分取した。さらに、得られた水層に、クロロホルム：メタノール＝２：１溶液の０．２倍量の７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ溶液をクロロホルム層に添加して、撹拌後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心して水層を分取した。得られた水層画分を、Amicon（登録商標） Ultra(10k)-0.5 Centrifugal Filter Devices（Millipore社製）により濃縮して、解析用の試料とした。クロロホルム層は、乾固させた後、クロロホルム：メタノール＝２：１溶液に再溶解させて、解析用の試料とした。
このようにして得られた小腸上皮細胞、肝臓および血漿のそれぞれの有機層試料および水層試料、ならびに消化管腔液について、上記と同様の展開条件でＴＬＣ展開を行った。展開後、スフィンゴミエリン、スフィンゴシンおよびＳ１Ｐのそれぞれに相当する部分の放射活性（［３Ｈ］カウント）を測定した。消化管腔液については、消化管腔液の放射活性に対する各化合物の放射活性の割合を算出した（図６Ｂ）。また、小腸上皮細胞、肝臓および血漿については、投与した［３Ｈ］標識スフィンゴミエリンの総［３Ｈ］カウントに対する割合をそれぞれ算出した（図６Ｃ−Ｅ）。
図６Ｂに示されるように、消化管腔液中の総［３Ｈ］カウントに対するスフィンゴミエリン関連化合物のそれぞれについて［３Ｈ］カウントを解析したところ、いずれのマウスにおいても４０〜５０％程度がスフィンゴミエリンで構成されていた。また、消化管腔内において、若干のスフィンゴシンの生成が確認された一方、Ｓ１Ｐはほとんど生成していないことが示された。
図６Ｃに示されるように、小腸上皮細胞へのスフィンゴミエリン関連化合物の移行量を解析したところ、スフィンゴミエリンの移行量はエゼチミブ投与およびＮＰＣ１Ｌ１のいずれの場合にも減少傾向であった。また、スフィンゴシン移行は、ＮＰＣ１Ｌ１依存的な制御を受けていることが示された。
図６Ｄに示されるように、肝臓へのスフィンゴミエリン関連化合物の移行量を解析したところ、スフィンゴミエリンはほとんど検出されなかった。一方、スフィンゴシンおよびＳ１Ｐの移行は、ＮＰＣ１Ｌ１依存的な制御を受けていることが示された。
図６Ｅに示されるように、血漿中のスフィンゴミエリン関連化合物を解析したところ、いずれのスフィンゴミエリン関連化合物の移行も、ＮＰＣ１Ｌ１依存的な制御を受けていることが示された。
上記の結果から、ＮＰＣ１Ｌ１を介して吸収されたスフィンゴミエリンおよび／またはスフィンゴシンが、血漿中のＳ１Ｐの供給源となり得ることが示された。
実施例６：ＮＰＣ１Ｌ１依存的な非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度変化の検証
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１がスフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の濃度に及ぼす影響について検討した。
まず、実施例１で使用したのと同じＭＴマウスを通常食（ＦＲ−１、フナバシファーム製）の自由摂取条件下で２０週間飼育した（通常食ＭＴ Ｅｚｅ（−）マウス）。飼育開始２０週間後に、マウスから採血し、１３，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿のリポタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。具体的には、得られた血漿３００μｌをSuperose 6カラム（GE Healthcare社製）にインジェクションし、AKTA Prime（GE Healthcare社製）を用いてＰＢＳを０．２ｍｌ／分の流速で送液し、モデル2110フラクションコレクター（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてカラム溶出液を５００μｌずつ採取し、ＶＬＤＬ分画（１３〜２０番目分画）、ＬＤＬ分画（２１〜３１番目分画）、ＨＤＬ分画（３２〜３９番目分画）およびアルブミン分画（４０番目以降分画）に分けて分離した。
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１がスフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の濃度に及ぼす影響について検討した。
まず、実施例１で使用したのと同じＭＴマウスを通常食（ＦＲ−１、フナバシファーム製）の自由摂取条件下で２０週間飼育した（通常食ＭＴ Ｅｚｅ（−）マウス）。飼育開始２０週間後に、マウスから採血し、１３，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿のリポタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。具体的には、得られた血漿３００μｌをSuperose 6カラム（GE Healthcare社製）にインジェクションし、AKTA Prime（GE Healthcare社製）を用いてＰＢＳを０．２ｍｌ／分の流速で送液し、モデル2110フラクションコレクター（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてカラム溶出液を５００μｌずつ採取し、ＶＬＤＬ分画（１３〜２０番目分画）、ＬＤＬ分画（２１〜３１番目分画）、ＨＤＬ分画（３２〜３９番目分画）およびアルブミン分画（４０番目以降分画）に分けて分離した。
得られた各フラクションに、内部標準物質としてのピオグリタゾンを終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して溶液を得た。得られた溶液に、溶液量の４倍量のアセトニトリルを添加して撹拌し、次いで、溶液量の４倍量のメタノールを添加して除タンパク質処理を行った。除蛋白処理後の溶液を乾固し、次いで、メタノールで再溶解して溶液を得た。ACQUITY UPLC（登録商標） sample managerおよびbinary solvent manager（いずれもWaters社製）で構成される液体クロマトグラフィーにより、ACQUITY UPLC BEH C18カラム（1.7μm、2.1mm×100mm）（Waters社製）を用いて、得られた溶液からＳ１Ｐおよびピオグリタゾンをそれぞれ分離した。分離されたＳ１Ｐおよびピオグリタゾンを、タンデム四重極質量分析計（Xevo（商標） TQ MS）を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、下記表１に示す条件で検出・測定した。測定結果を図７Ａに示す。
次に、実施例１で使用したのと同じＭＴ Ｅｚｅ（−）マウス、ＭＴ Ｅｚｅ（＋）マウスおよびＭＴ／ＫＯ Ｅｚｅ（−）マウスを用いて、通常食ＭＴ Ｅｚｅ（−）マウスについて行ったのと同様の方法により、それぞれのマウスの血漿中のＳ１Ｐを検出・測定した。測定結果を図７Ｂに示す。
図７Ａに示されるように、通常食の自由摂取条件下で２０週間飼育したＭＴマウスにおいては、ＨＤＬ結合型Ｓ１Ｐ（ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ）とアルブミン結合型Ｓ１Ｐ（アルブミン−Ｓ１Ｐ）が形成されていた。また、図７Ｂに示されるように、高脂肪食の自由摂取条件下で２０週間飼育したＭＴ／ＫＯマウスにおいても同様にＨＤＬ−Ｓ１Ｐとアルブミン−Ｓ１Ｐで構成されていた（ＭＴ／ＫＯ Ｅｚｅ（−））。一方、ＭＴマウスにおいては、ＶＬＤＬまたはＬＤＬ分画中に高濃度でＳ１Ｐが検出された（ＭＴ Ｅｚｅ（−））。そして、このＶＬＤＬ／ＬＤＬ結合型Ｓ１Ｐ（ＶＬＤＬ／ＬＤＬ−Ｓ１Ｐ）は、エゼチミブ混餌投与によりほぼ消失した（ＭＴ Ｅｚｅ（＋））。
これらの結果から、ＶＬＤＬ／ＬＤＬ分画中のＳ１Ｐ濃度は、ＮＰＣ１Ｌ１依存的に変動することが示された。
これらの結果から、ＶＬＤＬ／ＬＤＬ分画中のＳ１Ｐ濃度は、ＮＰＣ１Ｌ１依存的に変動することが示された。
実施例７：Ｓ１ＰＲ１阻害剤が非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ依存的な炎症に及ぼす影響の検証
本実施例では、Ｓ１ＰＲ１阻害剤が非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ依存的な炎症に及ぼす影響について検討した。
まず、ScienCell Research Laboratoriesより入手したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５％ＦＢＳ（ScienCell Research Laboratories製）、１％ Endothelial Cell Growth Supplement（ScienCell Research Laboratories製）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ScienCell Research Laboratories製））を添加したEndothelial Cell Medium（ScienCell Research Laboratories製）中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養して、本実施例で使用するＨＵＶＥＣを得た。
本実施例では、Ｓ１ＰＲ１阻害剤が非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ依存的な炎症に及ぼす影響について検討した。
まず、ScienCell Research Laboratoriesより入手したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５％ＦＢＳ（ScienCell Research Laboratories製）、１％ Endothelial Cell Growth Supplement（ScienCell Research Laboratories製）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ScienCell Research Laboratories製））を添加したEndothelial Cell Medium（ScienCell Research Laboratories製）中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養して、本実施例で使用するＨＵＶＥＣを得た。
次に、実施例１で使用したのと同じＭＴマウスとＮＰＣ１Ｌ１トランスジェニックマウス（ＮＰＣ１Ｌ１ Ｔｇマウス、Jaxon Laboratory製）を交配させて、ＭＴ×ＮＰＣ１Ｌ１ Ｔｇマウスを作製した。作製された８〜１２週齢ＭＴ×ＮＰＣ１Ｌ１ Ｔｇマウスに高脂肪食（ウェスタンダイエット、ＥＰＳ益新株式会社製、０．２１％コレステロール＋４１％ｋｃａｌ乳脂肪含有）を６週間以上摂取させた後、採血を行い、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿のリポタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。具体的には、得られた血漿３００μｌをSuperose 6カラム（GE Healthcare社製）にインジェクションし、AKTA Prime（GE Healthcare社製）を用いてＰＢＳを０．２ｍｌ／分の流速で送液し、モデル2110フラクションコレクター（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてカラム溶出液を５００μｌずつ採取し、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。
得られたＶＬＤＬ分画およびＨＬＤ分画のそれぞれを、Amicon（登録商標） Ultra-15（Millipore社製）を用いて元の血漿と同じ体積まで濃縮して、本実施例で使用するＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液およびＨＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液を得た。濃縮後のＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度は５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度は３０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌであった。
上記のようにして得たＨＵＶＥＣを１２ウェルプレート（Falcon社製）に１×１０５細胞／ウェルの濃度で播種し、播種の翌日から、Recombinant human ＴＮＦ−α（RSD社製）を溶解した２００μｌのＦＢＳ非含有Endotherial Cell Medium（ＴＮＦ−α濃度：５ｎｇ／ｍｌ）に２００μｌのＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液またはＨＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液を混合した細胞培養培地に代えて培養した。次いで、Ｓ１ＰＲ１阻害剤（Ｗ１４６、Cayman社製）を、終濃度１０μＭとなるように添加した。
Ｓ１ＰＲ１阻害剤添加２４時間後に培養上清を採取し、Human sICAM-1/CD54 Quantikine ELISA Kit（RSD社製）を用いて、培養上清中の可溶性ICAM-1（ｓＩＣＡＭ−１）の量を、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液およびＨＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液のいずれも添加せず、ＴＮＦ−αのみを添加した場合を１００％とする相対値として測定した。測定結果を図８に示す。
図８に示されるように、ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを添加することにより、培養上清中のｓＩＣＡＭ−１濃度が低下した。一方、ＨＤＬ−Ｓ１Ｐによる培養上清中の濃度低下は、Ｓ１ＰＲ１阻害剤（Ｗ１４６）を添加し場合に抑制された。これらの結果から、ＨＤＬ−Ｓ１Ｐは、Ｓ１ＰＲ１を介して炎症を抑制し得ることが示された。また、ＨＤＬ−Ｓ１Ｐによる炎症抑制効果は、Ｓ１ＰＲ１阻害剤により抑制され得ることが示された。
また、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐを添加することにより、培養上清中のｓＩＣＡＭ−１濃度が上昇した。一方、Ｓ１ＰＲ１阻害剤（Ｗ１４６）を添加した場合でも、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐによる培養上清中のｓＩＣＡＭ−１濃度上昇は抑制されなかった。これらの結果から、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐにより惹起される炎症は、Ｓ１ＰＲ１介して惹起されるものではないことが示された。また、Ｓ１ＰＲ１阻害剤を使用しても、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐにより惹起される炎症は抑制されないことが示された。
実施例８：Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤が非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ依存的な炎症に及ぼす影響の検証
本実施例では、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤が炎症惹起に及ぼす影響について検討した。
まず、ScienCell Research Laboratoriesより入手したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５％ＦＢＳ（ScienCell Research Laboratories製）、１％ Endothelial Cell Growth Supplement（ScienCell Research Laboratories製）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ScienCell Research Laboratories製））を添加したEndothelial Cell Medium（ScienCell Research Laboratories製）中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養して、本実施例で使用するＨＵＶＥＣを得た。
本実施例では、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤が炎症惹起に及ぼす影響について検討した。
まず、ScienCell Research Laboratoriesより入手したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５％ＦＢＳ（ScienCell Research Laboratories製）、１％ Endothelial Cell Growth Supplement（ScienCell Research Laboratories製）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ScienCell Research Laboratories製））を添加したEndothelial Cell Medium（ScienCell Research Laboratories製）中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養して、本実施例で使用するＨＵＶＥＣを得た。
次に、８〜１２週齢のＬＤＬＲ−ＭＴ×ＮＰＣ１Ｌ１ Ｔｇマウスに高脂肪食（ウェスタンダイエット、ＥＰＳ益新株式会社製、０．２１％コレステロール＋４１％ｋｃａｌ乳脂肪含有）を６週間以上摂取させた後、採血を行い、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、血漿を得た。得られた血漿のリポタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。具体的には、得られた血漿３００μｌをSuperose 6カラム（GE Healthcare社製）にインジェクションし、AKTA Prime（GE Healthcare社製）を用いてＰＢＳを０．２ｍｌ／分の流速で送液し、モデル2110フラクションコレクター（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてカラム溶出液を５００μｌずつ採取し、ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画およびアルブミン分画に分けて分離した。
得られたＶＬＤＬ分画を、Amicon（登録商標） Ultra-15（Millipore社製）を用いて元の血漿と同じ体積まで濃縮して、本実施例で使用するＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液を得た。濃縮後のＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度は５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
上記のようにして得たＨＵＶＥＣを１２ウェルプレート（Falcon社製）に１×１０５細胞／ウェルの濃度で播種し、播種の翌日から、Recombinant human ＴＮＦ−α（RSD社製）を溶解した２００μｌのＦＢＳ非含有Endotherial Cell Medium（ＴＮＦ−α濃度：５ｎｇ／ｍｌ）に２００μｌのＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液を混合した細胞培養培地に変えて培養した。次いで、Ｓ１ＰＲ２阻害剤（ＪＴＥ−０１３、Cayman社製）またはＳ１ＰＲ３阻害剤（ＴＹ−５２１５６、RSD社製）を、終濃度５０μＭとなるように添加した。
Ｓ１ＰＲ２阻害剤またはＳ１ＰＲ３阻害剤添加２４時間後に培養上清を採取し、Human sICAM-1/CD54 Quantikine ELISA Kit（RSD社製）を用いて、培養上清中の可溶性ICAM-1（ｓＩＣＡＭ−１）の量を、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐ溶液を添加せず、ＴＮＦ−αのみを添加した場合を１００％とする相対値として測定した。測定結果を図９に示す。
図９に示されるように、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐを添加することにより、培養上清中のｓＩＣＡＭ−１濃度が上昇した。一方、Ｓ１ＰＲ２阻害剤（ＪＴＥ−０１３）およびＳ１ＰＲ３阻害剤（ＴＹ−５２１５６）のいずれを添加した場合にも、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐによる培養上清中のｓＩＣＡＭ−１濃度上昇は有意に抑制された。さらに、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤を併用した場合には、ｓＩＣＡＭ−１濃度上昇がほぼ完全に抑制された。これらの結果から、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐは、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３のそれぞれを介して炎症を惹起し得ることが示された。また、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤を単独使用または併用することにより、ＶＬＤＬ−Ｓ１Ｐにより惹起される炎症が抑制され得ることが示された。
実施例９：Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤が動脈硬化症に及ぼす影響の検証
本実施例では、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤が動脈硬化症の発症・増悪に及ぼす影響について検討した。
まず、実施例１で使用したものと同じＭＴマウス（８〜１０週齢）を３群に分け、それぞれ、高脂肪食（ウェスタンダイエット、ＥＰＳ益新株式会社製、０．２１％コレステロール＋４１％ｋｃａｌ乳脂肪含有）（対照群）、Ｓ１ＰＲ２阻害剤（ＪＴＥ−０１３）を２０μｇ／ｇ高脂肪食で混合した高脂肪食（ＪＴＥ−０１３混餌群）、およびＳ１ＰＲ３阻害剤（ＴＹ−５２１５６）を２０μｇ／ｇ高脂肪食で混合した高脂肪食（ＴＹ−５２１５６混餌群）の自由摂取条件下で２０週間飼育した。
本実施例では、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤が動脈硬化症の発症・増悪に及ぼす影響について検討した。
まず、実施例１で使用したものと同じＭＴマウス（８〜１０週齢）を３群に分け、それぞれ、高脂肪食（ウェスタンダイエット、ＥＰＳ益新株式会社製、０．２１％コレステロール＋４１％ｋｃａｌ乳脂肪含有）（対照群）、Ｓ１ＰＲ２阻害剤（ＪＴＥ−０１３）を２０μｇ／ｇ高脂肪食で混合した高脂肪食（ＪＴＥ−０１３混餌群）、およびＳ１ＰＲ３阻害剤（ＴＹ−５２１５６）を２０μｇ／ｇ高脂肪食で混合した高脂肪食（ＴＹ−５２１５６混餌群）の自由摂取条件下で２０週間飼育した。
飼育開始２０週間後の各群のマウス腹部大動脈から切片を採取し、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液に浸けて４℃条件下で一晩インキュベーションした。インキュベーション終了後、以下の手順に従って、動脈硬化巣の形成をOil Red Oにより染色して解析した。まず、動脈切片をＰＢＳ中で１０分間室温インキュベーションし、６０％イソプロパノールに置換して１０分間室温でインキュベーションした。次いで、Oil Red O溶液に置換して３０分間室温インキュベーションした。最後に、６０％イソプロパノール溶液で動脈切片を洗浄し、ＰＢＳ中で４℃保存した。動脈切片のOil Red O染色像を、一眼レフカメラ（EOS Kiss X4、キヤノン株式会社製）を用いて撮影し、画像編集ソフト（Photoshop Extended CS6、Adobe Systems社製）を用いて動脈切片全面積中の染色面積の割合を算出した。
腹部大動脈切片のOil Red O染色像、および染色像に基づく動脈硬化巣面積の定量結果を表すグラフを図１０に示す。
また、飼育開始２０週間後に、各マウスから採血し、１３，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、血漿およびリポタンパク質を分離した。血漿およびリポタンパク質分離後の各フラクション中のコレステロールおよび中性脂肪の濃度測定を、それぞれコレステロールＥ−テストワコーおよびトリグリセライドＥ−テストワコー（いずれも、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。測定結果を表すグラフを図１１に示す。
図１０に示されるように、ＪＴＥ−０１３混餌群およびＴＹ−５２１５６混餌群のいずれにおいても、動脈硬化巣面積が有意に低下した。一方、図１１に示されるように、ＪＴＥ−０１３混餌群およびＴＹ−５２１５６混餌群のいずれにおいても、血漿中のコレステロール濃度および中性脂肪濃度が上昇傾向を示した。これらの結果から、Ｓ１ＰＲ２阻害剤およびＳ１ＰＲ３阻害剤は、血漿中のコレステロール濃度および中性脂肪濃度を低下させることなく、動脈硬化症の進行を抑制し得ることが示された。
Claims (8)
- Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断のためのデータを収集する方法であって、
被検体から採取された血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルを測定する工程、および
前記測定工程において得られた測定値を、予め設定した閾値と比較する工程
を含む、方法。 - 前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度である、請求項１に記載の方法。
- 前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中のＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度の比である、請求項１に記載の方法。
- Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、
Ｓ１ＰＲ２もしくはＳ１ＰＲ３の少なくとも一つの阻害活性をスクリーニング指標として用いて、前記阻害活性を有する薬物を選定するか、または非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルをスクリーニング指標として用いて、前記レベルを低下させる物質を前記薬物として選定する工程
を含む、方法。 - 前記スクリーニング指標が前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルである場合において、前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中の非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度である、請求項４に記載の方法。
- 前記スクリーニング指標が前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルである場合において、前記非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐレベルが、血液中のＨＤＬ−Ｓ１Ｐ濃度に対する非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐの比である、請求項４に記載の方法。
- 非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体および非ＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬を含む、Ｓ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３の少なくとも一つが関与する炎症性疾患の診断用キット。
- ＨＤＬ−Ｓ１Ｐと特異的に結合する抗体およびＨＤＬ−Ｓ１Ｐを精製するための試薬をさらに含む、請求項７に記載のキット。
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| JP2002504999A (ja) * | 1997-06-10 | 2002-02-12 | メドライト・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド | 心疾患の早期発見のための方法 |
| WO2008148857A1 (en) * | 2007-06-07 | 2008-12-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for assessing the risk of a cardiovascular disease and for diagnosing dyslipidemia |
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|---|
| MI-HYE LEE ET AL., JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 58, JPN6021010397, 2017, pages 325 - 338, ISSN: 0004474274 * |
| SYLVAIN GALVANI ET AL., SCIENCESIGNALING, vol. Vol.8, Issue 389 ra79, JPN6021010393, 2015, pages 1 - 10, ISSN: 0004474273 * |
| 木村孝穂,他, 臨床病理, vol. 第54巻補冊, JPN6021010391, 2006, pages 62, ISSN: 0004474271 * |
| 高田龍平,鈴木洋史, 膜（MEMBRANE）, vol. 33, no. 3, JPN6021010398, 2008, pages 88 - 93, ISSN: 0004474272 * |
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