JP2019086340A - 細胞検出方法および細胞検出システム - Google Patents

Abstract

【課題】標的細胞の検出を障害なく良好に行うことができ、標的細胞の検出に要する時間を短縮できる細胞検出方法および細胞検出システムを提供する。【解決手段】細胞検出方法は、標的細胞および非標的細胞を含む生体試料から、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料を得るステップＳ１の分離工程と、標的細胞含有試料から標的細胞の濃度が増した測定試料を得るステップＳ３の濃縮工程と、測定試料をイメージングフローサイトメーターに供して標的細胞を検出するステップＳ４の検出工程と、を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞検出方法および細胞検出システムに関する。

体液中には、血中循環癌細胞（Circulating Tumor Cell：ＣＴＣ）、血管内皮細胞、骨髄液中の造血幹細胞、妊婦の血液中に含まれる胎児赤芽球など、様々な希少細胞が存在しており、種々の疾患との関連性が知られている。特に、腫瘍から血液中に漏出したＣＴＣは、がん診断の因子として有用性が報告されており、非侵襲的な癌の検査として期待されている。しかしながら、ＣＴＣの血中の存在率は１０ｍＬあたり数個〜数十個であるなど、体液中の希少細胞の測定は極めて困難である。

希少細胞の一つであるＣＴＣを測定する方法として、CellSearchシステム（Veridex社製）が知られている（非特許文献１）。非特許文献１には、癌細胞に発現している細胞接着因子（ＥｐＣＡＭ）を標的として、抗ＥｐＣＡＭ抗体を固定した磁性粒子を使用して、ＣＴＣを回収して測定する方法が記載されている。また、非特許文献１の方法では、捕捉した細胞をサイトケラチンおよびＣＤ４５の発現量に基づいて、蛍光顕微鏡により白血球と区別してＣＴＣが検出される。

また、ＣＴＣを測定する方法として、イメージングフローサイトメーターを使用する方法が知られている（特許文献１）。特許文献１には、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラを備えたイメージングフローサイトメーターにより、細胞の形態的特徴と光学的特徴により白血球とＣＴＣとを区別する方法が記載されている。

"CELLSEARCH System Overview | CELLSEARCH"、［online］、［平成２９年１０月２６日検索］、インターネット<URL：https://www.cellsearchctc.com/product-systems-overview/cellsearch-system-overview>

米国特許第８８８５９１３号明細書

非特許文献１に記載の方法では、抗ＥｐＣＡＭ抗体でＣＴＣが捕捉されるため、ＥｐＣＡＭ発現を示さない癌種の癌細胞やＥｐＣＡＭ発現量が小さい癌細胞の回収が困難となる。また、標的細胞であるＣＴＣが抗体で捕捉されるため、標的細胞に対してストレスがかかり、このようなストレスが捕捉後の細胞を検出する上での障害となりうる。

また、特許文献１に記載の方法では、血液に含まれる赤血球がフィルター、溶血、音波等により除去されるものの、白血球とＣＴＣが分離することなくイメージングフローサイトメーターで測定される。上述の通り血液１０ｍＬ中に含まれるＣＴＣは僅か数個〜数十個であるのに対し、白血球は３０００万個〜９０００万個存在する。また、イメージングフローサイトメーターの撮像速度には限度がある。このため、実臨床において適切な時間で測定を完了することは困難である。

本発明の第１の態様は、細胞検出方法に関する。本態様に係る細胞検出方法は、標的細胞および非標的細胞を含む生体試料（２１）から、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）と、標的細胞含有試料（２２）から標的細胞の濃度が増した測定試料（２３）を得る工程（Ｓ３）と、測定試料（２３）をイメージングフローサイトメーター（１３）に供して標的細胞を検出する工程（Ｓ４）と、を含む。

本態様に係る細胞検出方法によれば、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、生体試料から非標的細胞の少なくとも一部の細胞が除かれる。これにより、標的細胞にストレスがかかることがなく、標的細胞の検出を障害なく良好に行うことができる。また、標的細胞含有試料を濃縮した測定試料がイメージングフローサイトメーターに供されるため、少ない容量の測定試料により適正に標的細胞を検出できる。よって、標的細胞の検出に要する時間を短縮できる。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いは、標的細胞および非標的細胞の形態の違いにより生じる。

この場合に、形態は、細胞の大きさとされ得る。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞含有試料を得る工程（Ｓ１）において、標的細胞を染色せずに標的細胞と非標的細胞とを分離する。標的細胞含有試料を得る工程の前に標的細胞が染色されると、染色処理により細胞が小さくなってしまう。したがって、標的細胞を染色せずに標的細胞と非標的細胞との分離が行われると、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、適正に分離を行うことができる。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞含有試料を得る工程（Ｓ１）前に標的細胞を染色してもよい。こうすると、たとえば、標的細胞を染色する工程で行う洗浄と、標的細胞含有試料を得る工程で行う洗浄とを、まとめて行うことができる。これにより、標的細胞の検出に要する時間を短縮できる。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞含有試料を得る工程（Ｓ１）前および標的細胞含有試料を得る工程（Ｓ１）後に標的細胞を染色してもよい。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）において、生体試料（２１）をマイクロ流路（１１０）に流すことにより標的細胞と非標的細胞とを分離する。こうすると、標的細胞と非標的細胞とを分離するための構成を小型化できる。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）において、曲線部（１１１）を有する流路（１１０）に生体試料（２１）を流すことにより標的細胞と非標的細胞とを分離する。こうすると、簡素な構成で効果的に標的細胞と非標的細胞とを分離できる。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）において、生体試料（２１）が流される流路（１１０）内で生じる速度分布に基づいて、標的細胞と非標的細胞とを分離する。こうすると、流路に生体試料を流すだけで標的細胞と非標的細胞とを分離できる。

本態様に係る細胞検出方法において、測定試料（２３）を得る工程（Ｓ３）において、標的細胞含有試料（２２）を濃縮する。こうすると、イメージングフローサイトメーターによる検出を適正かつ効率的に行うことができる。

この場合に、測定試料（２３）に含まれる細胞の濃度は、４．５×１０^９個／ｍＬ以下に設定される。

本態様に係る細胞検出方法において、測定試料（２３）を得る工程（Ｓ３）において、測定試料（２３）が所定の容量となるように、標的細胞含有試料を濃縮する。

この場合に、所定の容量は、標的細胞を検出する工程（Ｓ４）における測定試料（２３）の測定時間により規定される容量である。

また、所定の容量は、イメージングフローサイトメーター（１３）の最大被写体移動速度、最大被写界深度、最大撮像領域幅および測定時間を掛け合わせた値以下の容量である。こうすると、所定の測定時間内で検出を完了させることができる。

本態様に係る細胞検出方法において、測定試料（２３）を得る工程（Ｓ３）において、標的細胞含有試料（２２）を遠心し、上清を除去することにより、標的細胞含有試料（２２）を濃縮する。

本態様に係る細胞検出方法において、イメージングフローサイトメーター（１３）における撮像のために少なくとも標的細胞を染色する工程（Ｓ２）をさらに含む。

この場合に、標的細胞を染色する工程（Ｓ２）は、標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）よりも後に行われる。こうすると、染色試薬の使用量を少なくできる。

また、標的細胞を染色する工程（Ｓ２）において、遺伝子およびタンパク質の少なくとも一方を染色する。

また、標的細胞を染色する工程（Ｓ２）において、核および細胞質の少なくとも一方を染色する。

また、標的細胞を染色する工程（Ｓ２）において、標的細胞を蛍光色素で標識する。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞を検出する工程（Ｓ４）において、測定試料（２３）を得る工程（Ｓ３）で得られた測定試料（２３）の実質的に全量をイメージングフローサイトメーター（１３）に供して測定を行う。こうすると、少ない標的細胞をほぼ余すことなく検出できる。

本態様に係る細胞検出方法において、生体試料（２１）は、血液試料とされ得る。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞は、血中を循環する希少細胞とされ得る。血中を循環する希少細胞として、血中循環癌細胞（ＣＴＣ）、血管内皮細胞（ＣＥＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）などが挙げられる。

本態様に係る細胞検出方法において、非標的細胞は、赤血球とされ得る。

この場合に、標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）において、赤血球を溶血し除去した後で、非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去する。血液試料は、非標的細胞である赤血球を数多く含んでいる。非標的細胞の除去の前にあらかじめ赤血球が溶血され除去されると、非標的細胞を円滑に除去できるようになる。

本態様に係る細胞検出方法において、非標的細胞は、血小板とされ得る。

本態様に係る細胞検出方法において、非標的細胞は、白血球とされ得る。

本態様に係る細胞検出方法において、標的細胞は異常リンパ球とされ、非標的細胞はそれ以外の白血球とされ得る。

本態様に係る細胞検出方法において、イメージングフローサイトメーター（１３）は、細胞を撮像するためのＴＤＩカメラ（３５４）を備える。こうすると、細胞の撮像画像の品質を高めることができる。

本態様に係る細胞検出方法において、生体試料（２１）、標的細胞含有試料（２２）および測定試料（２３）を収容する容器（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）が、ブロッキング剤で処理されている。こうすると、容器の内壁に標的細胞が付着して標的細胞が検出に供されないことを抑制できる。したがって、生体試料、標的細胞含有試料および測定試料に含まれる少ない標的細胞を確実に検出できる。

本発明の第２の態様は、細胞検出方法に関する。本態様に係る細胞検出方法は、標的細胞および非標的細胞を含む生体試料（２１）から、標的細胞を染色せずに、非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料（２２）を得る工程（Ｓ１）と、標的細胞含有試料（２２）から標的細胞の濃度が増した測定試料（２３）を得る工程（Ｓ３）と、測定試料（２３）をイメージングフローサイトメーター（１３）に供して標的細胞を検出する工程（Ｓ４）と、を含む。

本態様に係る細胞検出方法によれば、第１の態様に係る細胞検出方法と同様の効果が奏される。また、本態様に係る細胞検出方法によれば、標的細胞を染色せずに標的細胞と非標的細胞との分離が行われるため、染色処理により細胞が小さくなった状態で分離処理が行われることを回避できる。よって、適正に分離を行うことができる。

本発明の第３の態様は、細胞検出システムに関する。本態様に係る細胞検出システム（１０）は、標的細胞および非標的細胞を含む生体試料（２１）から、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料（２２）を得る分離部（１００）と、標的細胞含有試料（２２）から標的細胞の濃度が増した測定試料（２３）を得る濃縮部（２０５）と、フローセル（３１０）を流れる測定試料（２３）に含まれる標的細胞を撮像する撮像部（３５４）と、撮像部（３５４）により取得された撮像画像に基づいて標的細胞を検出する検出部（３０１）と、を備える。

本態様に係る細胞検出システムによれば、第１の態様と同様の効果が奏される。

本発明によれば、標的細胞の検出を障害なく良好に行うことができ、標的細胞の検出に要する時間を短縮できる。

図１は、実施形態に係る細胞検出方法の工程を示すフローチャートである。 図２は、実施形態に係る分離工程を説明するための模式図である。 図３（ａ）は、実施形態に係る分離部の構成を示す模式図である。図３（ｂ）は、実施形態に係るマイクロ流路の断面を示す模式図である。 図４（ａ）は、実施形態に係るマイクロ流路の出力端部側の端部を示す模式図である。図４（ｂ）は、実施形態に係る白血球およびがん細胞の直径と細胞数との関係を示すグラフである。 図５は、実施形態に係る染色および濃縮工程を説明するための模式図である。 図６は、実施形態に係る染色および濃縮工程を説明するための模式図である。 図７は、実施形態に係る検出工程を説明するための模式図である。 図８は、実施形態に係る細胞検出システムの構成を示す模式図である。 図９は、実施形態に係る分離装置の構成を示す模式図である。 図１０は、実施形態に係る染色濃縮装置の構成を示す模式図である。 図１１は、実施形態に係るイメージングフローサイトメーターの構成を示す模式図である。 図１２（ａ）、（ｂ）は、変更例に係る細胞検出方法の工程を示すフローチャートである。

以下の実施形態は、標的細胞および非標的細胞を含む生体試料から、標的細胞を検出する方法に、本発明を適用したものである。以下の実施形態において、生体試料は、血液である。生体試料は、血液に限らず、体液試料であればよく、たとえば、尿や骨髄液などでもよい。標的細胞は、血中を循環する希少細胞とされる。以下の実施形態において、標的細胞は、血中循環癌細胞（ＣＴＣ）であり、非標的細胞は、赤血球、白血球、および血小板である。標的細胞は、ＣＴＣに限らず、ＣＴＣ以外のがん細胞や、血管内皮細胞（Circulating Endothelial Cell：ＣＥＣ）、造血幹細胞（Hematopoietic Stem Cell：ＨＳＣ）などでもよい。また、標的細胞は、異常リンパ球であってもよい。標的細胞が異常リンパ球である場合、非標的細胞は、それ以外の白血球とされる。

＜細胞検出方法＞
図１に示すように、実施形態の細胞検出方法は、ステップＳ１〜Ｓ５のステップを含む。以下には、オペレータが、細胞検出システムに指示を入力し、入力された指示に応じて、細胞検出システムが、図１のステップＳ１〜Ｓ５からなる検出方法を実行する場合について説明する。細胞検出システムについては、追って図８以降を参照して説明する。

ステップＳ１の分離工程において、細胞検出システムは、標的細胞および非標的細胞を含む生体試料から、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料を取得する。標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いは、標的細胞および非標的細胞の形態の違いにより生じる。この場合の細胞の形態とは、形態的特性のことであり、たとえば、細胞の大きさ、重量、比重などである。細胞の大きさとは、たとえば、細胞の直径や半径、平面視した場合の面積や周囲の長さなどである。

図２を参照してステップＳ１の分離工程を説明する。第１状態に示すように、実施形態の生体試料は血液である。血液は、たとえば全血である。血液は、標的細胞であるＣＴＣと、非標的細胞である赤血球、血小板、および白血球とを含む。図２において、ＣＴＣは黒丸で示され、赤血球は丸で示され、血小板は三角で示され、白血球は四角で示されている。

ステップＳ１において、細胞検出システムは、第１状態の生体試料において、赤血球を溶血させて遠心分離し上清を除去する。これにより、第２状態に示すように、第１状態の生体試料から赤血球がほぼなくなる。さらに、ステップＳ１において、細胞検出システムは、第２状態の生体試料において標的細胞と非標的細胞とを分離する。具体的には、細胞検出システムは、ＣＴＣ、赤血球、血小板、および白血球のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、第２状態の生体試料から赤血球、血小板、および白血球の一部の細胞を分離して除去する。実施形態では、細胞に作用する力の違いが細胞の直径の違いにより生じることを利用して、分離が行われる。これにより、第２状態の試料から非標的細胞の一部が除去され、第３状態に示すように、標的細胞含有試料が取得される。

上記のように、第１状態の血液において赤血球が溶血され除去された後で非標的細胞の除去が行われると、非標的細胞の除去時に、血液に数多く含まれる赤血球があらかじめ除かれた状態となる。これにより、非標的細胞の除去において、非標的細胞を円滑に除去できるようになる。

図２の第２状態の生体試料から非標的細胞を除去する際には、たとえば、図３（ａ）に示す分離部１００が用いられる。

図３（ａ）に示すように、分離部１００は、マイクロ流路１１０と、入力端部１２０と、出力端部１３０と、を備える。マイクロ流路とは、一般的に、深さおよび幅が１０μｍ〜１０００μｍの範囲の流路のことである。分離部１００は、たとえば、マイクロ流路１１０、入力端部１２０、および出力端部１３０に対応する溝が形成された薄い板状部材に、他の板状部材を重ね合わせることにより構成される。実施形態の非標的細胞の分離は、Dean Flow Fractionationと呼ばれる分離原理に基づくものである。

マイクロ流路１１０は、渦巻き形状の曲線部１１１を有する。入力端部１２０は、マイクロ流路１１０の渦巻き形状の中心側端部に設けられており、出力端部１３０は、マイクロ流路１１０の入力端部１２０とは反対側端部に設けられている。入力端部１２０は、入口１２１、１２２を備える。入口１２１、１２２は、分離部１００を構成する部材に設けられた孔により構成される。入口１２１は、渦巻き形状の外周側においてマイクロ流路１１０に接続されている。入口１２２は、渦巻き形状の内周側においてマイクロ流路１１０に接続されている。出力端部１３０は、出口１３１、１３２を備える。出口１３１、１３２は、分離部１００を構成する部材に設けられた孔により構成される。出口１３１は、渦巻き形状の内周側においてマイクロ流路１１０に接続されている。出口１３２は、渦巻き形状の外周側においてマイクロ流路１１０に接続されている。

非標的細胞を除去する際には、入口１２１に、図２に示した第２状態の生体試料が注入され、入口１２２には、シース液が注入される。そして、入口１２１、１２２にチューブを介して接続されたポンプにより、入口１２１、１２２に陽圧が加えられる。これにより、入口１２１に注入された試料と、入口１２２に注入されたシース液とが、マイクロ流路１１０内を出力端部に向かって流れる。出口１３１には、標的細胞含有試料を収容するための容器がチューブを介して接続されており、出口１３２には、分離された非標的細胞を含む液体を回収するための容器がチューブを介して接続されている。

第２状態の生体試料がマイクロ流路１１０に流されると、マイクロ流路１１０内において、図３（ｂ）に示すように、流路の向きに直交する方向に細胞の流れる位置を変化させる力が生じる。具体的には、細胞の径に応じて異なる大きさの揚力Ｆ_Ｌとディーン抗力Ｆ_Ｄとが生じる。一般的に、マイクロ流路においては、流路の断面中心の速度が大きく壁近傍の速度が小さくなるように流速が分布する。渦巻き状のマイクロ流路１１０においては、さらに上記の流速分布に起因して、図３（ｂ）において楕円状の矢印に示すように、ディーン渦と呼ばれる二次流が発生する。ディーン抗力Ｆ_Ｄと揚力Ｆ_Ｌは、以下の数１の式（１１）、（１２）により表すことができる。

生体試料内の細胞は、マイクロ流路１１０に沿って押し流されながら、揚力Ｆ_Ｌとディーン抗力Ｆ_Ｄにより、マイクロ流路１１０内において径の値に応じて分布するようになる。この結果、図４（ａ）に示すように、マイクロ流路１１０の出力端部１３０側の端部において、径の値に応じて細胞が分布する。こうして、出口１３１から、所定の径以上の細胞が取得される。出口１３１から取得される試料は、図２の第３状態の標的細胞含有試料である。

このように、マイクロ流路１１０によれば、簡素な構成で標的細胞と非標的細胞とを分離でき、標的細胞と非標的細胞とを分離するための構成を小型化できる。また、マイクロ流路１１０によれば、曲線部１１１内で生じる速度分布に基づいて標的細胞と非標的細胞とを分離できるため、マイクロ流路１１０に生体試料を流すだけで分離工程を実行できる。

図４（ｂ）は、発明者らが、あらかじめ調査した白血球およびがん細胞の直径である。図４（ｂ）において、左側の縦軸は白血球の細胞数を示しており、右側の縦軸はがん細胞の細胞数を示している。調査に用いられたがん細胞は、がん細胞を含む細胞株に由来するものである。

図４（ｂ）に示すように、大半の白血球の直径は、１０μｍ〜１５μｍ付近の値以下であり、大半のがん細胞の直径は、１０μｍ〜１５μｍ付近の値以上である。したがって、図２の第２状態から非標的細胞を除去する際には、１０μｍ〜１５μｍ付近の値をカットオフ値として、カットオフ値より小さい直径の細胞を除去して、カットオフ値以上の直径の細胞を取り出すのが好ましい。

以下の表１は、健常人の全血５ｍＬに対して、カットオフ値を１０μｍ〜１５μに変化させたときの、カットオフ値以上の白血球の個数を示す表である。なお、健常人の白血球数の基準値は、３５００〜９０００個／μＬである。

表１に示すように、カットオフ値が大きいと、取り出される白血球の数が少なくなるが、がん細胞を除去してしまう可能性が高くなる。一方、カットオフ値が小さいと、取り出される白血球の数が多くなってしまうが、がん細胞を除去してしまう可能性が低くなる。また、カットオフ値が小さい場合、検出工程に供される細胞数が多くなるため、検出工程において円滑に細胞を検出できなくなるおそれがある。したがって、これらを考慮した上で、マイクロ流路１１０を用いて分離する細胞数が決められる。分離部１００で分離される細胞数は、マイクロ流路１１０の長さ、断面積、断面形状や、マイクロ流路１１０の流速などにより調整可能である。

図１に戻り、ステップＳ２の染色工程において、細胞検出システムは、イメージングフローサイトメーターにおける撮像のために、標的細胞含有試料に含まれる標識細胞を染色する。

図５を参照してステップＳ２の染色工程を説明する。ステップＳ２において、細胞検出システムは、染色のための試薬を第３状態の標的細胞含有試料に混合して、標的細胞の標的部位を染色する。具体的には、標的部位が蛍光色素により蛍光標識される。実施形態では、染色対象となる標的部位は、核、Ｈｅｒ２遺伝子、および１７番染色体のセントロメア領域（ＣＥＰ１７）である。図５の上部の図に示すように、第３状態においては、核、Ｈｅｒ２遺伝子、およびＣＥＰ１７のいずれも染色されていない。ステップＳ２の染色工程が行われることにより、図５の下部の図に示すように、核、Ｈｅｒ２遺伝子、およびＣＥＰ１７がそれぞれ異なる蛍光色素で染色される。こうして、標的細胞含有試料は、第３状態から第４状態へと移行する。

実施形態の染色工程は、標的細胞含有試料を得るための分離工程よりも後に行われる。これにより、不要な細胞を除外した上で染色を行うことができるため、染色試薬の使用量を少なくできる。また、染色工程が分離工程の前に行われ場合、染色処理により細胞が小さくなってしまう。しかしながら、実施形態の分離工程では、標的細胞を染色せずに標的細胞と非標的細胞とが分離される。これにより、分離工程において、所定の大きさ以上の細胞を適正に分離できるようになる。

なお、上記染色工程において、染色される標的部位は、細胞の部位であればよい。染色される標的部位は、遺伝子や核に限らず、たとえば、細胞のタンパク質、細胞質、細胞膜、細胞膜上の表面抗原でもよい。標的部位の染色は、インサイチュハイブリダイゼーションや特異的な染色に基づいて行われることに限らず、抗原抗体反応に基づく免疫染色によって行われてもよい。標的部位が遺伝子の場合、Ｈｅｒ２遺伝子やＣＥＰ１７に限らず、他の遺伝子領域であってもよい。実施形態において、細胞の染色とは、上記のように、細胞の遺伝子、核、タンパク質、細胞質、細胞膜、表面抗原などを染色することを意味する。

上記染色工程において、細胞の遺伝子および核の染色に代えて、細胞のタンパク質および細胞質の染色を行ってもよい。また、細胞の遺伝子および核の染色とともに、細胞のタンパク質および細胞質の染色を行ってもよい。細胞質内に存在するタンパク質を染色する場合には、細胞質が染色されるのが好ましい。細胞質内に存在するタンパク質として、前立腺がん由来のＣＴＣに存在するＰＳＡや、肺がん由来のＣＴＣに存在するサイトケラチンなどが挙げられる。

図１に戻り、ステップＳ３の濃縮工程において、細胞検出システムは、標的細胞含有試料から標的細胞の濃度が増した測定試料を得る。

図６を参照してステップＳ３の濃縮工程を説明する。ステップＳ３において、細胞検出システムは、第４状態の標的細胞含有試料に対して、遠心分離等の処理を行い、遠心分離後の標的細胞含有試料の上清を除去する。これにより、第４状態の標的細胞含有試料に含まれる細胞が残存した状態で液量が低下し、標的細胞の濃度が増加する。こうして、第４状態の標的細胞含有試料は、第５状態の測定試料となる。濃縮工程では、測定試料に含まれる細胞の濃度が所定の濃度となるように、標的細胞含有試料が濃縮される。

濃縮工程により、測定試料に含まれる細胞の濃度が所定の濃度となるため、後段の検出工程において、イメージングフローサイトメーターによる検出を適正かつ効率的に行うことができる。

なお、ステップＳ２の染色工程においても上清を除去するなどの処理により、試料の液量が減少する。ステップＳ３の濃縮工程では、染色のための液量減少とは別に、検出工程に用いるべき測定試料の液量に応じて標的細胞の濃度が高められる。

また、濃縮工程では、遠心分離後の標的細胞含有試料から上清が除去されることにより、標的細胞の濃度が増した測定試料が得られたが、濃縮工程で行う処理はこれに限らない。たとえば、標的細胞含有試料の上清が除去されることにより、測定試料が所定の容量となるように標的細胞含有試料が濃縮されてもよい。また、遠心分離後の標的細胞含有試料から液体成分が全て除去され、除去後の容器に所定量の懸濁液が混合されることにより、測定試料が得られてもよい。

図１に戻り、ステップＳ４の検出工程において、細胞検出システムは、濃縮工程で得られた測定試料をイメージングフローサイトメーターに供して標的細胞を検出する。

図７を参照してステップＳ４の検出工程を説明する。ステップＳ４において、細胞検出システムは、第５状態の測定試料をイメージングフローサイトメーターに供して、イメージングフローサイトメーターに設けられた撮像部により、測定試料に含まれる細胞から生じる蛍光を撮像する。これにより、測定試料に含まれる細胞ごとに蛍光画像が取得される。また、イメージングフローサイトメーターは、取得した蛍光画像に基づいて、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅しているか否かを判定し、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅している陽性細胞をＣＴＣとして検出する。

図１に戻り、ステップＳ５の解析工程において、細胞検出システムは、検出工程で検出した標的細胞の解析を行う。具体的には、標的細胞の検出を行ったイメージングフローサイトメーターは、標的細胞の数や、撮像部により撮像した全細胞における標的細胞の割合などを取得する。

なお、標的細胞が血管内皮細胞（ＣＥＣ）である場合、解析工程において、ＣＥＣに含まれるタンパク質であるＮＦκＢの、細胞内における局在が解析される。具体的には、染色工程において、ＣＥＣは、ＣＥＣに発現する抗体に特異的に結合するＣＤ１４６の標識抗体を介して蛍光標識され、ＮＦκＢは、ＮＦκＢに特異的に結合する標識抗体を介して蛍光標識される。検出工程において、ＣＥＣに基づく蛍光が撮像され、ＮＦκＢに基づく蛍光が撮像される。そして、蛍光画像に基づいてＣＥＣが検出される。解析工程では、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在しているか否かが判定され、ＣＥＣの活性化の有無が判定される。

また、標的細胞が肺がん由来のＣＴＣであり、標的部位がサイトケラチンである場合、検出工程において、サイトケラチンが細胞質内に存在している量に基づいて標的細胞の検出が行われる。そして、解析工程において、標的細胞の数や標的細胞の割合が取得される。

以上のように、標的細胞および非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、生体試料から非標的細胞の少なくとも一部の細胞が除かれる。これにより、標的細胞にストレスがかかることがなく、標的細胞の検出を障害なく良好に行うことができる。また、標的細胞含有試料を濃縮した測定試料がイメージングフローサイトメーターに供されるため、少ない容量の測定試料により適正に標的細胞を検出できる。よって、標的細胞の検出に要する時間を短縮できる。

＜細胞検出システム＞
次に、図１のステップＳ１〜Ｓ５の各工程を行うための細胞検出システム１０について説明する。

図８に示すように、細胞検出システム１０は、分離装置１１と、染色濃縮装置１２と、イメージングフローサイトメーター１３と、を備える。

標的細胞であるＣＴＣの血中濃度は、極めて低い。したがって、希少細胞であるＣＴＣを検出するためには、細胞検出システム１０に供される第１状態の生体試料２１すなわち血液は、５ｍＬ以上とされ、好ましくは７．５ｍＬ以上とされる。

分離装置１１は、容器Ｔ１に収容された生体試料２１を用いてステップＳ１の分離工程を行い、容器Ｔ２に収容された標的細胞含有試料２２を得る。染色濃縮装置１２は、容器Ｔ２に収容された標的細胞含有試料２２を用いてステップＳ２の染色工程およびステップＳ３の濃縮工程を行い、容器Ｔ３に収容された測定試料２３を得る。イメージングフローサイトメーター１３は、容器Ｔ３に収容された測定試料２３を用いてステップＳ４の検出工程およびステップＳ５の解析工程を行う。

容器Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３は、ブロッキング剤で処理されている。ブロッキング剤は、ポロキサマーまたは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー重合体である。容器Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３がブロッキング剤で処理されると、非特異吸着が抑制されるため、容器の内壁に標的細胞が付着して標的細胞が検出に供されないことを抑制できる。したがって、生体試料２１、標的細胞含有試料２２および測定試料２３に含まれる少ない標的細胞を確実に検出できる。

なお、細胞検出システム１０は、複数の装置により構成されたが、１つの装置により構成されてもよい。染色濃縮装置１２は、染色装置と濃縮装置により構成されてもよい。

図９に示すように、分離装置１１は、制御部１０１と、記憶部１０２と、表示入力部１０３と、試料調製部１０４と、分離部１００と、を備える。

制御部１０１は、ＣＰＵにより構成される。制御部１０１は、マイクロコンピュータにより構成されてもよい。制御部１０１は、記憶部１０２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部１０１は、分離装置１１内の各部に接続されており、各部からの信号を受信して各部を制御する。記憶部１０２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示入力部１０３は、タッチパネル式のディスプレイにより構成される。なお、表示入力部１０３に代えて、ディスプレイにより構成された表示部と、マウスやキーボードにより構成された入力部とが設けられてもよい。

試料調製部１０４は、図示しない分注部および混合チャンバなどを備える。試料調製部１０４は、図２で説明したように、第１状態の生体試料２１に対して赤血球の溶血および除去を行うための試料調製処理を行って、第２状態の生体試料２１を取得する。試料調製部１０４で取得された第２状態の生体試料２１は、分離部１００に移送される。なお、分離装置１１において試料調製部１０４は省略されてもよい。この場合、第２状態の生体試料２１が分離装置１１に供される。

分離部１００は、図３（ａ）で説明したマイクロ流路１１０、入力端部１２０、および出力端部１３０に加えて、入力端部１２０に陽圧を加えるための図示しないポンプを備える。分離部１００は、第２状態の生体試料２１を入口１２１に流すとともに、入口１２２にシース液を流す。このとき、分離部１００は、ポンプを駆動することにより、除去する細胞数に応じた陽圧を入口１２１、１２２に加える。これにより、マイクロ流路１１０を流れる生体試料２１の速度が決まり、所定数の細胞が除去される。

なお、オペレータは、分離部１００により取得する細胞数または細胞の大きさを、表示入力部１０３を介して入力できる。制御部１０１は、取得する細胞数または細胞の大きさを受け付けると、受け付けた値を記憶部１０２に記憶し、記憶した値に応じてマイクロ流路１１０を流れる生体試料２１の速度、すなわち入口１２１、１２２に付与する陽圧を決定する。また、上述したように、分離部１００により取得される細胞数および細胞の大きさは、マイクロ流路１１０の長さ、断面積、断面形状によっても調整可能である。オペレータは、マイクロ流路１１０、入力端部１２０、および出力端部１３０が形成された板状部材を交換することにより、分離部１００により取得される細胞数および細胞の大きさを変更してもよい。

分離部１００は、出口１３１から出た生体試料２１を、標的細胞含有試料２２として容器Ｔ２に移送する。こうして、第３状態の標的細胞含有試料２２が取得され、分離装置１１の処理が終了する。

図１０に示すように、染色濃縮装置１２は、制御部２０１と、記憶部２０２と、表示入力部２０３と、染色部２０４と、濃縮部２０５と、を備える。

制御部２０１は、ＣＰＵにより構成される。制御部２０１は、マイクロコンピュータにより構成されてもよい。制御部２０１は、記憶部２０２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部２０１は、染色濃縮装置１２内の各部に接続されており、各部からの信号を受信して各部を制御する。記憶部２０２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示入力部２０３は、タッチパネル式のディスプレイにより構成される。なお、表示入力部２０３に代えて、ディスプレイにより構成された表示部と、マウスやキーボードにより構成された入力部とが設けられてもよい。

オペレータは、分離装置１１において分離して取得した細胞数、すなわち第３状態の標的細胞含有試料２２に含まれる細胞数を、表示入力部２０３を介して入力する。制御部２０１は、入力された細胞数を記憶部２０２に記憶し、染色処理後の標的細胞含有試料２２を濃縮する際に用いる。なお、制御部２０１は、分離装置１１において分離して取得された細胞数を、通信により分離装置１１から受信してもよい。

染色部２０４は、図示しない分注部および加温部などを備える。染色部２０４は、図５で説明したように、第３状態の標的細胞含有試料２２に対して染色処理を行って、第４状態の標的細胞含有試料２２を取得する。染色部２０４で取得された第４状態の標的細胞含有試料２２は、濃縮部２０５に移送される。

濃縮部２０５は、遠心分離器２０５ａと分注部２０５ｂを備える。濃縮部２０５は、第４状態の標的細胞含有試料２２を所定の容器に分注し、遠心分離器２０５ａにより第４状態の標的細胞含有試料２２の遠心分離を行う。そして、濃縮部２０５は、遠心分離された容器内の上清を分注部２０５ｂにより除去する。詳細には、制御部２０１は、分離装置１１において取得された細胞数を記憶部２０２から読み出し、読み出した細胞数に基づいて、遠心分離後の容器内の細胞濃度が所定の濃度となるよう分注部２０５ｂにより上清を除去する。これにより、図６で説明したように、第４状態の標的細胞含有試料２２が濃縮される。濃縮部２０５により生成される測定試料２３の細胞の濃度については、追って説明する。

濃縮部２０５は、上清を除去した後の標的細胞含有試料２２を、測定試料２３として容器Ｔ３に移送する。こうして、第５状態の測定試料２３が取得され、染色濃縮装置１２の処理が終了する。

なお、濃縮部２０５により生成される測定試料２３の細胞の濃度は、染色濃縮装置１２において自動的に設定されることに限らず、オペレータが表示入力部１０３を介して設定してもよい。

図１１に示すように、イメージングフローサイトメーター１３は、検出部３０１と、記憶部２０２と、表示入力部３０３と、測定部３０４と、を備える。この他、イメージングフローサイトメーター１３は、容器Ｔ３内の測定試料２３を吸引するための吸引管や、吸引した測定試料２３をフローセル３１０に移送するための流路と、フローセル３１０から排出された測定試料２３を回収するための流路とを含む。

検出部３０１は、ＣＰＵにより構成される。検出部３０１は、マイクロコンピュータにより構成されてもよい。検出部３０１は、記憶部３０２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。検出部３０１は、イメージングフローサイトメーター１３内の各部に接続されており、各部からの信号を受信して各部を制御する。記憶部３０２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示入力部３０３は、タッチパネル式のディスプレイにより構成される。なお、表示入力部３０３に代えて、ディスプレイにより構成された表示部と、マウスやキーボードにより構成された入力部とが設けられてもよい。

測定部３０４は、フローセル３１０と、光源３２１〜３２４と、集光レンズ３３１〜３３４と、ダイクロイックミラー３４１〜３４３と、集光レンズ３５１と、光学ユニット３５２と、集光レンズ３５３と、撮像部３５４と、を備える。測定部３０４は、蛍光標識された複数種類の標的部位を含む測定試料２３に光を照射し、波長の異なる複数種類の蛍光を検出する。図１１の測定部３０４には、互いに直交するＸＹＺ軸が示されている。

フローセル３１０の流路３１１には、染色濃縮装置１２において得られた測定試料２３の実質的に全量が、Ｚ軸正方向に流される。ここで、測定試料２３は、容器Ｔ３内と、容器Ｔ３内の測定試料２３を吸引した吸引管からフローセル３１０に至るまでの流路とにおいて、僅かに残ることが想定される。したがって、「染色濃縮装置１２において得られた測定試料２３の実質的に全量」とは、容器Ｔ３内と、吸引管からフローセル３１０に至るまでの流路とにおいて残存し、フローセル３１０に供されなかった容量を除いた全量という意味である。具体的には、容器Ｔ３内の測定試料２３の９０％（ｖ／ｖ）以上がフローセル３１０に供される。このように、測定試料２３の実質的に全量がフローセル３１０に流されると、少ない標的細胞をほぼ余すことなく検出できる。

光源３２１〜３２４は、フローセル３１０を流れる測定試料２３に光を照射する。光源３２１〜３２４は、半導体レーザ光源により構成される。光源３２１〜３２４から出射される光は、それぞれ、波長λ１１〜λ１４のレーザ光である。集光レンズ３３１〜３３４は、それぞれ、光源３２１〜３２４から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー３４１は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を反射する。ダイクロイックミラー３４２は、波長λ１１、λ１２の光を透過させ、波長λ１３の光を反射する。ダイクロイックミラー３４３は、波長λ１１〜λ１３の光を反射させ、波長λ１４の光を透過する。こうして、波長λ１１〜λ１４の光が、フローセル３１０の流路３１１を流れる測定試料２３に対して、Ｙ軸正方向に照射される。

ここで、核と２つの遺伝子をそれぞれ標識する蛍光色素は、波長λ１１の励起光が照射されることにより波長λ２１の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ１２の励起光が照射されることにより波長λ２２の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ１３の励起光が照射されることにより波長λ２３の蛍光を生じる蛍光色素、の中から選択される。波長λ２１〜λ２３の蛍光がそれぞれ撮像されることにより、標的部位である核と２つの遺伝子に関する蛍光画像を取得できる。

フローセル３１０を流れる測定試料２３に波長λ１１〜λ１４の光が照射されると、ＣＴＣの標的部位を標識している蛍光色素から蛍光が生じる。また、フローセル３１０を流れる測定試料２３に波長λ１４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１４の光は、明視野画像の生成に用いられる。

集光レンズ３５１は、測定試料２３から生じた波長λ２１〜λ２３の蛍光と、測定試料２３を透過した波長λ１４の光とを集光する。光学ユニット３５２は、４枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット３５２の４枚のダイクロイックミラーは、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部３５４の受光面上において分離させる。集光レンズ３５３は、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを集光する。

撮像部３５４は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部３５４は、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを撮像して、波長λ２１〜λ２３の蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、波長λ１４の光に対応した明視野画像とを生成する。検出部３０１は、撮像部３５４により生成された蛍光画像および明視野画像を記憶部３０２に記憶させる。

ここで、撮像部３５４は、ＴＤＩカメラにより構成されるため、撮像部３５４の受光面で受光した蛍光を積算して蛍光画像および明視野画像を生成する。これにより、細胞の蛍光画像および明視野画像の品質を高めることができる。

検出部３０１は、記憶部３０２に記憶された蛍光画像に基づいて、図７で説明したように陽性判定を行って、ＣＴＣを検出する。具体的には、検出部３０１は、Ｈｅｒ２遺伝子を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像と、ＣＥＰ１７を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像において、輝点を抽出する。検出部３０１は、細胞ごとに、Ｈｅｒ２遺伝子に基づく輝点数をＣＥＰ１７に基づく輝点数で除算し、算出した値が１より大きい場合に、この細胞においてＨｅｒ２遺伝子が増幅していると判定する。そして、検出部３０１は、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅している陽性細胞をＣＴＣとして検出する。そして、検出部３０１は、検出したＣＴＣの数や、撮像部３５４により撮像した全細胞におけるＣＴＣの割合などを取得する。

次に、イメージングフローサイトメーター１３に供される測定試料２３の濃度について説明する。

上述したように、染色濃縮装置１２の濃縮部２０５は、染色部２０４による染色後の標的細胞含有試料２２を濃縮して、測定試料２３を生成する。このとき、濃縮部２０５は、測定試料２３がイメージングフローサイトメーター１３の流路系に流されたときに細胞が詰まらないように、第４状態の標的細胞含有試料２２を濃縮して測定試料２３を取得する。イメージングフローサイトメーター１３の流路系とは、イメージングフローサイトメーター１３に供された測定試料２３が、測定試料２３を吸引するための吸引管からフローセル３１０を通って最終的に回収されるまでの流路のことである。イメージングフローサイトメーター１３の流路系に測定試料２３の細胞が詰まらないようにするために、制御部２０１は、測定試料２３の細胞の濃度を、流路系に適する濃度の上限以下に設定する。たとえば、測定試料２３の細胞の濃度は、４．５×１０^９個／ｍＬ以下に設定される。

このように、測定試料２３の細胞の濃度が設定されることにより、測定試料２３をイメージングフローサイトメーター１３の流路系に適正に流すことができる。よって、イメージングフローサイトメーター１３による検出を良好に行うことができる。

また、フローセル３１０に流れる測定試料２３の単位時間当たりの流量をＶ１、測定試料２３をフローセル３１０に流す時間すなわち測定時間をＴ、フローセル３１０に流す測定試料２３の容量をＶとすると、Ｖ１、Ｔ、Ｖの関係は以下の式（２１）により表される。

Ｖ＝Ｖ１×Ｔ …（２１）

フローセル３１０に流れる測定試料２３の流速すなわち最大被写体移動速度をＶ２、フローセル３１０の最大撮像領域幅をＷ、最大被写界深度をＤＯＦとすると、Ｖ１、Ｖ２、Ｗ、ＤＯＦの関係は以下の式（２２）により表される。なお、図１１に示すように、最大撮像領域幅Ｗは流路３１１のＸ軸方向の幅に相当し、最大被写界深度ＤＯＦは流路３１１のＹ軸方向の幅に相当する。ＤＯＦ×Ｗの値は、コア断面積である。

Ｖ１＝Ｖ２×ＤＯＦ×Ｗ …（２２）

測定試料２３に含まれる細胞数をＮ、測定試料２３の濃度をＣとすると、Ｖ、Ｎ、Ｃの関係は以下の式（２３）により表される。

Ｃ＝Ｎ／Ｖ …（２３）

上記式（２１）〜（２３）に基づいて、濃度Ｃは以下の式（２４）により表される。

Ｃ＝Ｎ／（Ｖ２×ＤＯＦ×Ｗ×Ｔ） …（２４）

上記式（２４）において、最大被写体移動速度Ｖ２は、検出部３０１が、フローセル３１０に測定試料２３を流すための図示しないポンプ等を制御することにより決められる。最大被写界深度ＤＯＦと最大撮像領域幅Ｗは、フローセル３１０の形状、レンズの倍率、レンズのＮＡ、撮像部３５４の受光面のサイズなどにより決められる。測定時間Ｔは、検出部３０１が、フローセル３１０に測定試料２３を流す制御を行う時間により決められる。最大被写体移動速度Ｖ２と測定時間Ｔは、オペレータにより表示入力部３０３を介して設定されてもよく、イメージングフローサイトメーター１３の検出部３０１により自動的に設定されてもよく、あらかじめイメージングフローサイトメーター１３の記憶部３０２に記憶されてもよい。

染色濃縮装置１２の制御部２０１は、上記式（２４）に示すように、分離装置１１で取得された第３状態の標的細胞含有試料２２に含まれる細胞数Ｎと、イメージングフローサイトメーター１３において設定される最大被写体移動速度Ｖ２および測定時間Ｔとに基づいて、生成する測定試料２３の濃度Ｃを決める。なお、最大被写体移動速度Ｖ２および測定時間Ｔは、オペレータにより表示入力部２０３を介して染色濃縮装置１２に入力されてもよく、通信によりイメージングフローサイトメーター１３から染色濃縮装置１２へと送信されてもよく、あらかじめ染色濃縮装置１２の記憶部２０２に記憶されてもよい。

染色濃縮装置１２の制御部２０１は、測定試料２３の濃度が上記式（２４）に基づく濃度Ｃとなるように、言い換えれば、測定試料２３が所定の容量となるように遠心分離後の上清を除去して、第４状態の標的細胞含有試料２２を濃縮する。このときの濃縮された測定試料２３の容量は上記式（２１）の容量Ｖに相当するため、測定試料２３の所定の容量は、測定試料２３の測定時間Ｔにより規定される。

より詳細には、上記式（２１）、（２２）に基づいて、容量ＶはＶ２×ＤＯＦ×Ｗ×Ｔにより表される。すなわち、測定試料２３の所定の容量は、最大被写体移動速度Ｖ２、最大被写界深度ＤＯＦ、最大撮像領域幅Ｗ、および測定時間Ｔを掛け合わせた値となる。よって、測定試料２３の所定の容量は、Ｖ２×ＤＯＦ×Ｗ×Ｔの値以下の容量とされる。このように測定試料２３の容量が規定されると、所定の測定時間内で検出を完了させることができる。

＜検証＞
次に、発明者らが行った実施形態の検証について説明する。この検証は以下に示す手順１〜４からなる。

１．生体試料の調製
CellHunt Greenの添付プロトコルに従い細胞を染色したものをＣＴＣとした。このＣＴＣをヒト新鮮血７．５ｍＬに添加して、第１状態の生体試料とした。なお、この場合のＣＴＣは、乳がん細胞株であるSK-BR3から取り出した細胞である。また、この場合のＣＴＣは、便宜上、元の血液中に含まれる細胞と区別するためにあらかじめ染色されているが、実際に被検者から採取した生体試料に基づいてＣＴＣを検出する場合には、このような染色を省略してもよい。

２．分離工程
CBB社のRBC lysis bufferを、生体試料の３倍量添加し、室温で１０分間振盪した。そして、遠心して上清を除去した。この処理により赤血球が溶血され、溶血された赤血球が除去される。CBB社のResuspension buffer ４ｍＬで再懸濁し、第２状態の生体試料とした。図３（ａ）に示した分離部１００により、所定数の細胞を分離して除去した。分離濃縮が完了すると、回収用チューブ内の標的細胞含有試料の体積は１０ｍＬとなった。そして、遠心して上清を除去した。２８０μＬの０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを用いて再懸濁し、第３状態の標的細胞含有試料とした。

３．ＦＩＳＨ染色工程および濃縮工程
１．５ｍＬチューブに２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー重合体を含む溶液を添加した。この試薬はブロッキング剤に相当する。転倒混和し、その後、スピンダウンしてコート剤を除去した。これにより、細胞の吸着ロスを抑制するために、染色工程で使用するチューブの壁面が親水コートされた。

手順２の分離工程で取得した第３状態の標的細胞含有試料の全量を、吸着抑制コートを施した１．５ｍＬチューブへ移した。終濃度３０％（ｖ／ｖ）となるように氷冷カルノア液、すなわちメタノール７５％（ｖ／ｖ）／酢酸２５％（ｖ／ｖ）を添加し、懸濁した。その後、終濃度７０％（ｖ／ｖ）となるように氷冷カルノア液、すなわちメタノール７５％（ｖ／ｖ）／酢酸２５％（ｖ／ｖ）を添加し、懸濁した。その後、遠心して上清を除去した。

１回目の洗浄として、０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを１ｍＬ添加し、遠心して上清を除去した。２回目の洗浄として、０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを１ｍＬ添加し、遠心して上清を除去した。３回目の洗浄として、Ventana社 1x Reaction bufferを１ｍＬ添加し、遠心して上清を除去した。０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを１００μＬ添加し、再懸濁した。

遠心および上清除去後、OGT社のCytocell FISH probe 反応液を、OGT社のCytocell FISH probeの添付資料に従い添加した。この反応液は、細胞の標的部位の遺伝子を蛍光標識するための試薬である。具体的には、この反応液により、Ｈｅｒ２遺伝子が蛍光標識される。OGT社のCytocell FISH probeの添付資料に基づいて、熱変性工程およびハイブリダイズ工程を実施した。0.4x SSC／０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを用いて洗浄した。あらかじめ７２℃に温めた0.4x SSC／０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを添加し、攪拌した。遠心して上清を除去した。2x SSC／０．０５％（ｖ／ｖ）Tween20／０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを用いて洗浄した。遠心して上清を除去した。DRAQ5／０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを１００μＬ添加した。この試薬は、細胞の核を蛍光標識するための試薬である。遠心して上清を除去した。こうして、容器内の標的細胞は、第４状態と同様に染色された状態となった。

０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを２００μＬ添加し、懸濁した。この処理により、所定濃度となった第５状態の測定試料を取得した。

上記のとおり、手順３においては、図１のステップＳ２の染色工程およびステップＳ３の濃縮工程が並行して行われた。すなわち、手順３のＦＩＳＨ染色工程および濃縮工程は、ステップＳ２、Ｓ３の工程を含む工程である。

４．検出工程
手順３で取得した測定試料をイメージングフローサイトメーターに供した。イメージングフローサイトメーターとして、Ammnis社のImageStreamを用いた。測定量をインプットした測定試料の全量、に設定した。得られた画像情報に基づいて、イメージングフローサイトメーターにより、ＣＴＣの検出を行った。

以上の手順１〜４によれば、発明者らは、標的細胞であるＣＴＣを適正に検出できることを確認できた。

なお、発明者らは、上記手順３においてＦＩＳＨ染色を行ったが、これに代えて免疫染色についても検討した。免疫染色を行う場合、上記手順１におけるＣＴＣは、肺がん細胞株であるA549から取り出した細胞とした。そして、上記手順３に代えて以下の手順５を行った。

５．免疫染色工程および濃縮工程
１．５ｍＬチューブに２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー重合体を含む溶液を添加した。転倒混和し、その後、スピンダウンしてコート剤を除去した。これにより、細胞の吸着ロスを抑制するために、染色工程で使用するチューブの壁面が親水コートされた。

手順２の分離工程で取得した第３状態の標的細胞含有試料の全量を、吸着抑制コートを施した１．５ｍＬチューブへ移した。パラホルムアルデヒドを含む溶液で処理することで細胞を固定した。０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを用いて洗浄し、遠心して上清を除去した。Triton X-100を含む溶液を用いて膜透過処理を行った。遠心して上清を除去した。０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを１ｍＬ添加して洗浄し、遠心して上清を除去した。１％（ｗ／ｖ）BSA／０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを添加してブロッキングした。遠心して上清を除去した。

抗体染色液１００μＬを添加し、懸濁した。抗体染色液は、CK Alexa647、CD45 PE-Cy7 mouse IgG、HOECHST、およびBlocking bufferを含む。抗体染色液は、細胞の標的部位を蛍光標識するための試薬である。具体的には、抗体染色液により、ＣＴＣのサイトケラチン（ＣＫ）が蛍光標識され、白血球のＣＤ４５抗原が蛍光標識され、核内のＤＮＡが蛍光標識される。遠心して上清を除去した。染色後の洗浄として、０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを１ｍＬ添加し、遠心して上清を除去した。こうして、容器内の標的細胞は、第４状態と同様に標的細胞が染色された状態となった。

０．２％（ｖ／ｖ）Pluronic/PBSを２００μＬ添加し、懸濁した。この処理により、所定濃度となった第５状態の測定試料を取得した。

上記のとおり、手順５においても、図１のステップＳ２の染色工程およびステップＳ３の濃縮工程が並行して行われた。すなわち、手順５の免疫染色工程および濃縮工程は、ステップＳ２、Ｓ３の工程を含む工程である。

この場合の手順４の検出工程においては、手順５で取得した測定試料を、上記ＦＩＳＨ染色の場合と同様に、イメージングフローサイトメーターに供して、ＣＴＣの検出および解析を行った。この場合、イメージングフローサイトメーターは、サイトケラチンが細胞内に存在している量に基づいて、ＣＴＣの検出を行った。

以上のように免疫染色工程を行った場合も、手順１、２、５、４によれば、発明者らは、標的細胞であるＣＴＣを適正に検出できることを確認できた。

＜細胞検出システムの評価＞
発明者らは、比較例と実施形態とで細胞回収率を比較することにより、実施形態の細胞検出システムの評価を行った。

比較例では、Veridex社製のCellSearchシステムを用いた。実施形態では、図８に示した細胞検出システム１０を用いた。細胞回収率は、以下の表２に示す値となった。

表２において、細胞株「HCC1569」は、乳がん細胞株に基づくがん細胞を血液に添加した生体試料を用いた場合を示す。細胞株「A549」は、肺がん細胞株に基づくがん細胞を血液に添加した生体試料を用いた場合を示す。比較例の生体試料に含まれるがん細胞数と、実施形態の生体試料に含まれるがん細胞数とは同じとした。

比較例では、がん細胞に発現している細胞接着因子（ＥｐＣＡＭ）を標的として、抗ＥｐＣＡＭ抗体を固定した磁性粒子を使用してがん細胞を回収し、回収したがん細胞を蛍光顕微鏡により検出した。実施形態では、図１のステップＳ１〜Ｓ４の処理を行った。実施形態では、細胞株「HCC1569」の場合、Ｈｅｒ２遺伝子を蛍光標識し、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅に基づいてがん細胞を検出した。細胞株「A549」の場合、サイトケラチンを蛍光標識し、サイトケラチンの存在量に基づいてがん細胞を検出した。

また、比較例の「顕微鏡検出後」の列に示す細胞回収率は、「CellSearchにおいて顕微鏡により検出されたがん細胞数」を「生体試料に含まれるがん細胞数」で除算した値である。実施形態の「細胞分離後」の列に示す細胞回収率は、「分離工程後に回収されたがん細胞数」を「生体試料に含まれるがん細胞数」で除算した値である。実施形態の「ＦＣＭ検出後」の列に示す細胞回収率は、「イメージングフローサイトメーターにおいて実施形態と同様の検出工程で検出されたがん細胞数」を「染色工程後に標的細胞含有試料に含まれるがん細胞数」で除算した値である。実施形態の「全体」の列に示す細胞回収率は、「細胞分離後の列に示す細胞回収率」と「ＦＣＭ検出後の列に示す細胞回収率」とを乗算した値である。

細胞株「A549」の場合、比較例では、検出されたがん細胞数が、生体試料に含まれるがん細胞数の１．０％と極端に少なくなっている。これは、肺がん細胞においては、ＥｐＣＡＭの発現量が小さいためである。一方、実施形態では、検出されたがん細胞数が、生体試料に含まれるがん細胞数の約４０．０％であり、比較例に比べて顕著に多くなっている。このように、実施形態よれば、ＥｐＣＡＭの発現量が小さいがん細胞であっても、比較例に比べて確実に検出可能である。

細胞株「HCC1569」の場合、比較例では、検出されたがん細胞数が、生体試料に含まれるがん細胞数の５３．１％と比較的多い。一方、実施形態では、検出されたがん細胞が、生体試料に含まれるがん細胞数の約３２．８％であり、比較例に比べてやや少なくなっている。しかしながら、実施形態と比較例との差は２０．３％程度小さい値にとどまっているため、実施形態によっても、細胞株「HCC1569」に基づくがん細胞の検出は十分に可能と言える。

また、細胞株「A549」の細胞回収率と細胞株「HCC1569」の細胞回収率との開きは、比較例における「顕微鏡検出後」の列の場合５２．１％と大きいが、実施形態における「全体」の列の場合７．２％程度と顕著に小さい。したがって、実施形態によれば、がん細胞の種類が異なる場合であっても、安定してがん細胞数を検出できると言える。

＜変更例＞
上記実施形態では、標的細胞が染色されずにステップＳ１の分離工程が行われたが、染色を行う順序はこれに限らない。

図１２（ａ）に示す変更例の場合、図１の各ステップと比較して、ステップＳ１の分離工程の前にステップＳ６の染色工程が追加されている。この変更例では、たとえば、ステップＳ６の染色工程において標的細胞の核が染色され、ステップＳ２の染色工程において遺伝子が染色される。一般的に、遺伝子を染色する試薬は、核を染色する試薬に比べて高価である。したがって、遺伝子の染色は分離工程の後で行われ、遺伝子を染色する試薬の消費が抑えられるのが好ましい。

図１２（ｂ）に示す変更例の場合、図１２（ａ）の各ステップと比較して、ステップＳ２の染色工程が省略されている。この変更例では、全ての染色が、分離工程の前のステップＳ６で行われる。この場合、試薬の消費量が多くなってしまうものの、たとえば、標的細胞を染色するステップＳ６の染色工程で行う洗浄と、標的細胞含有試料を得るステップＳ１の分離工程で行う洗浄とを、分離工程後に、まとめて行うことができる。これにより、標的細胞の検出に要する時間を短縮できる。

１０ 細胞検出システム
１３ イメージングフローサイトメーター
２１ 生体試料
２２ 標的細胞含有試料
２３ 測定試料
１００ 分離部
１１０ マイクロ流路
１１１ 曲線部
２０５ 濃縮部
３０１ 検出部
３１０ フローセル
３５４ 撮像部
Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３ 容器

Claims (32)

1. 標的細胞および非標的細胞を含む生体試料から、前記標的細胞および前記非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、前記非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料を得る工程と、
   前記標的細胞含有試料から前記標的細胞の濃度が増した測定試料を得る工程と、
   前記測定試料をイメージングフローサイトメーターに供して前記標的細胞を検出する工程と、を含む、細胞検出方法。
2. 前記標的細胞および前記非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いは、前記標的細胞および前記非標的細胞の形態の違いにより生じる、請求項１に記載の細胞検出方法。
3. 前記形態は、細胞の大きさである、請求項２に記載の細胞検出方法。
4. 前記標的細胞含有試料を得る工程において、前記標的細胞を染色せずに前記標的細胞と前記非標的細胞とを分離する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞検出方法。
5. 前記標的細胞含有試料を得る工程前に前記標的細胞を染色する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞検出方法。
6. 前記標的細胞含有試料を得る工程前および前記標的細胞含有試料を得る工程後に前記標的細胞を染色する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞検出方法。
7. 前記標的細胞含有試料を得る工程において、前記生体試料をマイクロ流路に流すことにより前記標的細胞と前記非標的細胞とを分離する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の細胞検出方法。
8. 前記標的細胞含有試料を得る工程において、曲線部を有する流路に前記生体試料を流すことにより前記標的細胞と前記非標的細胞とを分離する、請求項１ないし７の何れか一項に記載の細胞検出方法。
9. 前記標的細胞含有試料を得る工程において、前記生体試料が流される流路内で生じる速度分布に基づいて、前記標的細胞と前記非標的細胞とを分離する、請求項１ないし８の何れか一項に記載の細胞検出方法。
10. 前記測定試料を得る工程において、前記標的細胞含有試料を濃縮する、請求項１ないし９の何れか一項に記載の細胞検出方法。
11. 前記測定試料に含まれる細胞の濃度は、４．５×１０^９個／ｍＬ以下に設定される、請求項１０に記載の細胞検出方法。
12. 前記測定試料を得る工程において、前記測定試料が所定の容量となるように、前記標的細胞含有試料を濃縮する、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の細胞検出方法。
13. 前記所定の容量は、前記標的細胞を検出する工程における前記測定試料の測定時間により規定される容量である、請求項１２に記載の細胞検出方法。
14. 前記所定の容量は、前記イメージングフローサイトメーターの最大被写体移動速度、最大被写界深度、最大撮像領域幅および前記測定時間を掛け合わせた値以下の容量である、請求項１３に記載の細胞検出方法。
15. 前記測定試料を得る工程において、前記標的細胞含有試料を遠心し、上清を除去することにより、前記標的細胞含有試料を濃縮する、請求項１ないし１４の何れか一項に記載の細胞検出方法。
16. 前記イメージングフローサイトメーターにおける撮像のために少なくとも前記標的細胞を染色する工程をさらに含む、請求項１ないし１５の何れか一項に記載の細胞検出方法。
17. 前記標的細胞を染色する工程は、前記標的細胞含有試料を得る工程よりも後に行われる、請求項１６に記載の細胞検出方法。
18. 前記標的細胞を染色する工程において、遺伝子およびタンパク質の少なくとも一方を染色する、請求項１６または１７に記載の細胞検出方法。
19. 前記標的細胞を染色する工程において、核および細胞質の少なくとも一方を染色する、請求項１６ないし１８の何れか一項に記載の細胞検出方法。
20. 前記標的細胞を染色する工程において、前記標的細胞を蛍光色素で標識する、請求項１６ないし１９の何れか一項に記載の細胞検出方法。
21. 前記標的細胞を検出する工程において、前記測定試料を得る工程で得られた測定試料の実質的に全量を前記イメージングフローサイトメーターに供して測定を行う、請求項１ないし２０の何れか一項に記載の細胞検出方法。
22. 前記生体試料は、血液試料である、請求項１ないし２１の何れか一項に記載の細胞検出方法。
23. 前記標的細胞は、血中を循環する希少細胞である、請求項１ないし２２の何れか一項に記載の細胞検出方法。
24. 前記非標的細胞は、赤血球である、請求項１ないし２３の何れか一項に記載の細胞検出方法。
25. 前記標的細胞含有試料を得る工程において、赤血球を溶血し除去した後で、前記非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去する、請求項２４に記載の細胞検出方法。
26. 前記非標的細胞は、血小板である、請求項１ないし２５の何れか一項に記載の細胞検出方法。
27. 前記非標的細胞は、白血球である、請求項１ないし２６の何れか一項に記載の細胞検出方法。
28. 前記標的細胞は異常リンパ球であり、前記非標的細胞はそれ以外の白血球である、請求項１ないし２７の何れか一項に記載の細胞検出方法。
29. 前記イメージングフローサイトメーターは、細胞を撮像するためのＴＤＩカメラを備える、請求項１ないし２８の何れか一項に記載の細胞検出方法。
30. 前記生体試料、前記標的細胞含有試料および前記測定試料を収容する容器が、ブロッキング剤で処理されている、請求項１ないし２９の何れか一項に記載の細胞検出方法。
31. 標的細胞および非標的細胞を含む生体試料から、前記標的細胞を染色せずに、前記非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料を得る工程と、
    前記標的細胞含有試料から前記標的細胞の濃度が増した測定試料を得る工程と、
    前記測定試料をイメージングフローサイトメーターに供して前記標的細胞を検出する工程と、を含む、細胞検出方法。
32. 標的細胞および非標的細胞を含む生体試料から、前記標的細胞および前記非標的細胞のそれぞれに作用する力の違いに基づいて、前記非標的細胞の少なくとも一部の細胞を除去して標的細胞含有試料を得る分離部と、
    前記標的細胞含有試料から前記標的細胞の濃度が増した測定試料を得る濃縮部と、
    フローセルを流れる前記測定試料に含まれる前記標的細胞を撮像する撮像部と、
    前記撮像部により取得された撮像画像に基づいて前記標的細胞を検出する検出部と、を備える、細胞検出システム。

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