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JP2019062833A - ヒトｅｇｆｒのｃ７９７ｓ（ｔ２３８９ａ）変異検出用プローブ、ヒトｅｇｆｒのｃ７９７ｓ（ｔ２３８９ａ）変異検出用キット、及びヒトｅｇｆｒのｃ７９７ｓ（ｔ２３８９ａ）変異の検出方法 - Google Patents

ヒトｅｇｆｒのｃ７９７ｓ（ｔ２３８９ａ）変異検出用プローブ、ヒトｅｇｆｒのｃ７９７ｓ（ｔ２３８９ａ）変異検出用キット、及びヒトｅｇｆｒのｃ７９７ｓ（ｔ２３８９ａ）変異の検出方法 Download PDF

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JP2019062833A JP2017193289A JP2017193289A JP2019062833A JP 2019062833 A JP2019062833 A JP 2019062833A JP 2017193289 A JP2017193289 A JP 2017193289A JP 2017193289 A JP2017193289 A JP 2017193289A JP 2019062833 A JP2019062833 A JP 2019062833A
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JP2017193289A
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一喜 木寺
Kazuyoshi Kidera
一喜 木寺
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Arkray Inc
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Arkray Inc
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Abstract

【課題】操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法の提供。【解決手段】下記からなる群から選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブである。特定な配列からなる塩基配列を有し、５’末端又は３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び、特定な配列からなる塩基配列を有し、５’末端又は３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。【選択図】図５

Description

本開示は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法に関する。
ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）は、肺癌等の癌において重要な役割を果たすことから、ＥＧＦＲの機能を抑制して癌を治療することを目的とする薬剤が開発されている。そのような薬剤としては、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられ、例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ、及びＡＺＤ９２９１などが知られている。
しかし、近年、ヒトＥＧＦＲにおけるある種の変異が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を付与することが報告されており、例えば、ヒトＥＧＦＲにおけるＣ７９７Ｓ変異は、ＡＺＤ９２９１に耐性を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.（２００８） ４１５,１９７−２０６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１, ５６０−５６２（２０１５）
癌の治療剤としてヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を投与する前に、対象の患者においてＥＧＦＲにＣ７９７Ｓ変異を有するか否かを調べることは、適切な治療を提供する観点から有効であると考えられる。
しかしながら、非特許文献１では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異をダイレクトシークエンス法で検出しており、ダイレクトシークエンス法には、変異の検出感度が低いという問題がある。
また、非特許文献２では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異の検出にｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）及びＮＧＳ（次世代シーケンシング）の技術を用いているため、変異を高感度で検出できるものの、操作が煩雑で、高価な装置（すなわち、ｄｄＰＣＲ装置及びＮＧＳ装置）を必要とする問題がある。
本開示は、上記に鑑みてなされたものであり、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法の提供を目的とし、該目的を達成することを課題とする。
上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
＜１＞ 下記（Ｉ）〜（ＩＶ）からなる群から選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ。（Ｉ）配列番号２に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、（ＩＩ）配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、（ＩＩＩ）配列番号３に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び、（ＩＶ）配列番号３に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
＜２＞ 前記蛍光色素が、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、及びポリメチン色素誘導体からなる群から選択される、＜１＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ。
＜３＞ ＜１＞又は＜２＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、及び、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットを含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット。
＜４＞ 配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーを更に含む、＜３＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット。
＜５＞ ＜１＞又は＜２＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させること、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定すること、及び、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出すること、を含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
＜６＞ 前記一本鎖核酸が、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、＜５＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
＜７＞ 前記一本鎖核酸が、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセット、並びに、配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、＜５＞に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
＜８＞ 前記試料が、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、又はこれらの懸濁液である、＜５＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
本開示によれば、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット、及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法が提供される。
（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例を示すグラフであり、（Ｂ）は核酸混合物の微分融解曲線の一例を示すグラフである。 一実施態様における、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列におけるプローブ及びプライマー（セット）の位置関係を模式的に示した図である。 ヒトＥＧＦＲの野生型のヌクレオチド配列を有するテンプレート（ＷＴ、配列番号５）、又はヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異を含むヌクレオチド配列を有するテンプレート（Ｍｔ、配列番号６）に対する、プローブ（Ｐ１〜Ｐ４）のＴｍ値を示す図である。 配列番号１２及び１３のプライマーセット、配列番号６及び７のプライマーセット、又は配列番号８及び９のプライマーセットを使用した場合における検出感度及び検出特異性を解析した結果を示す図である。 ヒトゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）と合成ＤＮＡを用いてヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異（Ｍｔ）の検出限界を解析した結果を示す図である。
以下、本開示を実施するための形態について説明する。ただし、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。
本開示において、「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において、検出対象となる試料中の試料核酸、本開示のプローブ及びプライマーを含む本明細書に記載される全ての核酸配列又はヌクレオチド配列への言及は、特に断らない限り、それらの相補配列、及び当該核酸配列又はヌクレオチド配列とその相補配列とから形成される二本鎖についても言及できるものとする。
本開示において、「核酸」とは、全ての種類のＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。
本開示において、「核酸」と「ヌクレオチド」とは、互換的に使用する場合がある。
本開示において「Ｔｍ」又は「Ｔｍ値」とは、二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度をいい、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
本開示において、Ｔｍ値は、以下に詳細を説明する蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて測定することができる。
本明細書においてＴｍ値を算出する場合、得られたＴｍ値は、特に断らない限り、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した値とする。このソフトウェアは、当業界で公知のものであり、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ.５４, Ｎｏ.６, ｐｐ.９９０-９９９ （２００８）等でもプローブの設計に使用されている。
本開示において、ヌクレオチド配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合、ヌクレオチド配列の３’末端にある塩基を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合、ヌクレオチド配列の５’末端にある塩基を１番目として数える。
また、本開示において、例えば「ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３８９番目の塩基」とは、ヒトＥＧＦＲのタンパク質をコードする１番目の塩基から数えて２３８９番目の塩基を意味する。これは、コード領域（すなわち、エキソン）がイントロンによって分断されていても同様に適用される。すなわち、イントロンが存在していたとしても、ヒトＥＧＦＲタンパク質をコードする塩基配列のみを数え上げて２３８９番目に位置すれば足りることを意味する。それゆえ、例えば「ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３８９番目の塩基」は、ｃＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列のみならず、スプライシング前の塩基配列や、ゲノム配列おいても同様に適用され、ヒトＥＧＦＲタンパク質をコードする配列のみを数え上げて２３８９番目に位置することを意味する。
なお、本明細書において、塩基配列の文脈で使用される「コード領域」とは、タンパク質に翻訳される塩基配列の領域をいう。
本開示において、「オリゴヌクレオチド」の構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類の構成単位から構成されてもよいし、複数種類の構成単位から構成されてもよい。
本開示においてハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書において、「変異」とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。
本開示において、「ヒトＥＧＦＲ」とは、ヒト由来のＥＧＦＲを意味し、ヒト由来のＥＧＦＲのゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及びタンパク質の全てを包含する概念である。より具体的には、ヒトＥＧＦＲのゲノム配列は、アクセッションナンバー：
ＮＧ＿００７７２６（ＲＥＧＩＯＮ: ５００１．．１９３３０７）で表され、ヒトＥＧＦＲのｍＲＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＮＭ＿００５２２８で表され、ヒトＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＣＣＤＳ５５１４．１で表され、ヒトＥＧＦＲのタンパク質のアミノ酸配列は、アクセッションナンバー：ＮＰ＿００５２１９で表される。
本開示において、「ヒトＥＧＦＲのＴ２３８９Ａ変異」とは、野生型のヒトＥＧＦＲのｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡのコード領域の２３８９番目の塩基であるＴ（チミン）がＡ（アデニン）に置換された変異をいう。なお、ヒトＥＧＦＲの２３８９番目の塩基は、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸のコドンの第１番目の塩基である。従って、「ヒトＥＧＦＲのＴ２３８９Ａ変異」は、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異」に対応する。
本開示において、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異」とは、野生型のヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸であるＣ（システイン）がＳ（セリン）に置換された変異をいう。なお、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸は、ヒトＥＧＦＲの２３８９番目〜２３９１番目の塩基に対応するコドンによって指定される。従って、「ヒトＥＧＦＲのＴ２３８９Ａ変異」は、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異」の原因の１つとして挙げられる。
また、本開示において、「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異」とは、野生型のヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９７番目のアミノ酸であるＣ（システイン）がＳ（セリン）に置換された変異の原因が、ヒトＥＧＦＲのＴ２３８９Ａ変異であることを意味する。
本開示において、「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、及びｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖とｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖とにより形成される二本鎖、のいずれを指称することもできる。ｃＤＮＡは、公知の方法で、ｍＲＮＡから逆転写することにより得ることができる。
典型的には、「コード領域」を含む文脈において使用される「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）を意味する。
＜ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ＞
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブは、下記（Ｉ）〜（ＩＶ）からなる群から選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである。（Ｉ）配列番号２に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、（ＩＩ）配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、（ＩＩＩ）配列番号３に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び、（ＩＶ）配列番号３に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
癌の治療剤としてヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を投与する前に、対象の患者においてＥＧＦＲにＣ７９７Ｓ変異を有するか否かを調べることは、適切な治療を提供する観点から有効であると考えられる。
しかしながら、従来の方法では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異の検出感度が低いという問題、あるいは、変異を高感度で検出できるものの、操作が煩雑で、高価な装置（すなわち、ｄｄＰＣＲ装置及びＮＧＳ装置）を必要とする問題があった。
これに対し、本開示は、上記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを用いることにより、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にすることができる。
これは、Ｔ２３８９Ａ変異を含むヒトＥＧＦＲのヌクレオチド配列を有するプローブの結合力が、野生型のヌクレオチド配列と、変異が導入されたヌクレオチド配列との間で、異なることに基づく。すなわち、Ｔ２３８９Ａ変異を含むヒトＥＧＦＲのヌクレオチド配列を有するプローブは、変異が導入されたヌクレオチド配列との間では完全な相補性を有する（パーフェクトマッチ）のに対し、野生型のヌクレオチド配列との間では、コード領域の２３８９番目の塩基で相補性が完全には一致しない（ミスマッチ）。これにより、Ｔ２３８９Ａ変異を含むヒトＥＧＦＲのヌクレオチド配列を有するプローブは、変異が導入されたヌクレオチド配列との間では結合力が強くＴｍ値が高いのに対し、野生型のヌクレオチド配列との間では結合力が弱くＴｍ値が低くなる。本開示は、このＴｍ値の差異に基づき、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にすることができる。
本開示において、配列番号２に示す塩基配列は、「cttcggcAgcctcc」である。
本開示において、配列番号３に示す塩基配列は、「cccttcggcAgcc」である。
上記配列番号２及び配列番号３において、大文字で表されるＡは、ヒトＥＧＦＲのコード領域における２３８９番目の塩基（Ｔ２３８９Ａ変異）に対応する。
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。あるいは、プライマーは、プライマー合成を受託する企業（例えば、株式会社日本遺伝子研究所など）に依頼することもできる。
オリゴヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端を蛍光色素で標識する方法は、例えば、過剰量の蛍光標識したヌクレオチドを基質としてＰＣＲのポリメラ−ゼ反応溶液に含有させる方法などが挙げられる。あるいは、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光標識オリゴヌクレオチド合成を受託する企業（例えば、Ｊ−Ｂｉｏ２１センター（日鉄住金環境株式会社）など）に依頼することもできる。
好ましくは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブは、配列番号２に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブは、配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブは、配列番号３に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブは、配列番号３に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
本開示の蛍光色素は、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、及びポリメチン色素誘導体からなる群から選択される蛍光色素が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。
好ましくは、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていない場合には蛍光を発し、相補配列にハイブリダイズしてハイブリッドを形成した場合には蛍光が減少（例えば、消光）する。
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に蛍光消光プローブと称される。蛍光消光プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の塩基が蛍光色素で標識化され、標識化される塩基は、シトシン（Ｃ）である。この場合、蛍光消光プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、蛍光消光プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基又は当該対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このような蛍光消光プローブは、一般にグアニン消光プローブと称され、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）としても知られている。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動に基づき、グアニン消光プローブが標的配列とハイブリダイズしているか解離しているかを容易に確認することができる。蛍光色素は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
従って、蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて形成されたハイブリッドの蛍光のシグナル（例えば、蛍光強度）を解析することにより、二本鎖であるハイブリッドが一本鎖へ解離した割合、及びＴｍ値などを測定することができる。
蛍光色素は、特定の波長で発光するため、そのような波長を蛍光強度の検出に利用することができる。例えば、下記の蛍光色素において好ましい検出波長は、以下の通りである。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ〜７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）。
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、ＲＦＬＰ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ法等が挙げられる。
＜ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット＞
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キットは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、及び、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットを含む。
好ましくは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キットは、配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーを更に含む。
「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ」は、前掲の通りである。
本開示において、配列番号８に示す塩基配列は、「AGTCTagctcatCcccttcggcT」である。
本開示において、配列番号９に示す塩基配列は、「GATCAgcagctcatCcccttcggcA」である。
本開示において、配列番号１０に示す塩基配列は、「ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc」である。
配列番号８及び配列番号９において、３’末端に大文字で示されている塩基は、ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３８９番目の塩基に対応する。それゆえ、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにより野生型のヒトＥＧＦＲの配列を増幅させ、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによりＴ２３８９Ａ変異を有するヒトＥＧＦＲの配列を増幅させることができる。
配列番号８及び配列番号９のそれぞれ３’末端から１１番目に大文字で示されている塩基であるＣは、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列ではＧであった塩基が人工的に置換されている。この置換により、ＰＣＲ反応においてプライマーダイマーの形成が抑制され、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出効率を向上させることができる。
また、配列番号８及び配列番号９において、５’末端に大文字で示されている５文字の塩基は、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列には存在しない人工的に付加した配列である。この人工的配列の付加により、ＰＣＲにより標的以外の配列が増幅することを抑制することができる。
ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセット、及び任意にヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーは、野生型のヒトＥＧＦＲの核酸配列、及び存在する場合にはＴ２３８９Ａ変異を有するヒトＥＧＦＲの核酸配列を増幅させるために使用される。
ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キットは、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出に好ましく使用することができる。そのような検出方法の詳細は、以下の「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法」において説明する。
＜ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法＞
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法は、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させること（工程Ａ）、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること（工程Ｂ）、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定すること（工程Ｃ）、及び、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出すること（工程Ｄ）、を含む。
好ましくは、前記一本鎖核酸は、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である。
より好ましくは、前記一本鎖核酸は、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセット、並びに、配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である。
（工程Ａ）
工程Ａは、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させることを含む。
「ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ」は、前掲の通りである。
試料は、例えば生体試料であってよい。生体試料としては、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、又はそれらの懸濁液等が挙げられる。
また、生体試料から単離した核酸を試料として用いてもよい。例えば、全血からのゲノムＤＮＡの単離には、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを使用することができる。
また、生体試料に含まれるＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。あるいは、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。
核酸増幅法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。
核酸の増幅において、増幅反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．０５体積％以上であることがより好ましく、０．１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の上限は、２体積％以下であることが好ましく、１体積％以下であることがより好ましく、０．５体積％以下であることがさらに好ましい。
また、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを用いた光学的検出を行う場合、上記反応液における生体試料の添加割合は、例えば、０．１体積％〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。
また、核酸増幅反応の開始前に、上記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、かつ、増幅効率もさらに向上する。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％であり、好ましくは０．１質量％〜１質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
以下、増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本開示は、この例に制限されない。
まず、鋳型（テンプレート）核酸、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセット、及びヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３８９番目より下流の領域にアニーリングし得るリバースプライマー（好ましくは、配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー）を含むＰＣＲ反応液を調製する。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、上記プライマーセットを用いたときの２つのフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、２つのフォワードプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。リバースプライマーの添加割合は、０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
ＰＣＲ反応液におけるフォワードプライマーセット及びリバースプライマーの含有比率は特に限定されない。増幅効率及び野生型又は変異型への特異性を高くする観点から、前記フォワードプライマーセットの合計モル量と前記リバースプライマーの合計モル量との比は、１：１〜１：１０であることが好ましく、１：２〜１：５であることがより好ましく、１：３〜１：４．５であることがさらに好ましい。
また、前記フォワードプライマーセットに含まれる、野生型のヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３８９番目の塩基を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマー（すなわち、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、Ｔ２３８９Ａ変異を有するヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３８９番目の塩基を含む領域を特異的に増幅するためのフォワードプライマー（すなわち、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）とのＰＣＲ反応液における含有比率は特に限定されない。増幅効率及び特異性を高くする観点から、０．５：２〜１：０．５であることが好ましく、０．８〜１．２：１．２〜０．８であることがさらに好ましい。特に好ましくは１：１である。
ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
ＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、典型的な実施態様においては、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。
ＰＣＲは、通常、二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃〜９９℃、１秒間〜１２０秒間が好ましく、９２℃〜９５℃、１秒間〜６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃〜７０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜７０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃〜８０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜８０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。
例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。
以上のようにして、野生型のヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３８９番目の塩基を含む領域、及び存在する場合にはＴ２３８９Ａ変異を有するヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３８９番目の塩基を含む領域についての増幅産物を得ることができる。
このようにして得られた増幅産物は、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させることができる。
ハイブリッド形成工程では、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡのコード領域の２３８９番目の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能な本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブとのハイブリッドを形成させる。上記一本鎖増幅核酸は、例えば、反応液を加熱し、上記増幅工程で得られた増幅産物である二本鎖増幅核酸を解離することで調製することができる。
本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを反応液に添加するタイミングは特に制限されない。例えば、増幅工程前、増幅工程の開始時、増幅工程の途中、及び増幅工程後のいずれであってもよい。中でも、増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションとを連続的に行うことができるため好ましい。すなわち、上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行することが、処理効率の観点から好ましい。
上記反応液におけるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。
上記一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブとのハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖増幅核酸を解離して一本鎖増幅核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間〜１０分間であり、好ましくは１秒間〜５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃〜５０℃である。
上記増幅工程において、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットと、任意にヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーとを共存させる場合、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブがＤＮＡポリメラーゼの反応対象となって本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ自体が伸長することを予防するために、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブの３’末端側に前掲の蛍光色素が付加されているか、リン酸基が付加されていることが好ましい。
また、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと同じ配列を有するが蛍光標識されていないプローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度を調節することができる等の利点が得られる。このような未標識プローブは、その３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。
（工程Ｂ）
工程Ｂは、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定することを含む。
ハイブリッドの解離状態を示すシグナルの測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識した蛍光色素の波長に応じて適宜設定することが好ましい。標識した蛍光色素に応じた波長とすることで、検出感度を高めることができる。例えば、蛍光色素として、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅを用いる場合には、検出波長が４５０ｎｍ〜４８０ｎｍであることが好ましく、ＴＡＭＲＡを用いる場合には、検出波長が５８５ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましく、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ用いる場合には、検出波長が５１５ｎｍ〜５５５ｎｍであることが好ましい。
上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブとのハイブリッドを含む上記反応液を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸とハイブリダイズした状態では蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定することにより、解離に基づくシグナルの変動を測定することができる。
シグナルの変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、好ましくは２５℃〜７０℃であってよく、終了温度が４０℃〜１０５℃であってよい。
また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば０．１℃／秒〜２０℃／秒であってよく、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。
なお、以上の説明では、上記蛍光強度測定工程においてハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度変動を測定するものとしたが、ハイブリッド形成時における蛍光強度の変動を測定するようにしてもよい。つまり、本開示のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、温度降下に伴う蛍光強度の変動を測定してもよい。
具体例として、単独で蛍光強度を示し、かつハイブリッド形成により蛍光強度を示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発するが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の減少を測定することができる。
（工程Ｃ）
工程Ｃは、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定することを含む。
Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。
（工程Ｄ）
工程Ｄは、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出することを含む。
工程Ｄでは、工程Ｃにおいて決定されたＴｍ値に基づいて、ヒトＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ２３８９Ａ変異を検出することができる。
例えば、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ及び検出目的配列により形成されたハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいたヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異を有する塩基配列と完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値と同じ又は同程度であれば、前記検出目的配列は、Ｃ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型であると判断できる。
また、例えば、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ及び検出目的配列により形成されたハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた野生型の塩基配列とのハイブリッドのＴｍ値と同じ又は同程度であれば、前記検出目的配列は、野生型であると判断できる。
ここで、Ｔｍ値が同程度とは、測定試料を用いて得られたＴｍ値が、基準値のＴｍ値の±１０℃以内、好ましくは±５℃以内、より好ましくは±２℃以内、更に好ましくは±１℃以内であることを意味する。
典型的な実施態様において、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと野生型由来の検出目的配列とは、ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３８９番目の一塩基が異なるミスマッチを有する。それゆえ、前記ミスマッチに起因して、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと野生型の塩基配列とのハイブリッドのＴｍ値は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブとヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異を有する塩基配列とのハイブリッドのＴｍ値よりも、低くなる。
野生型のヒトＥＧＦＲの核酸配列と、及びＴ２３８９Ａ変異型のヒトＥＧＦＲの核酸配列とが混在している場合に、Ｔ２３８９Ａ変異の有無の判定を行うためには、温度と蛍光強度の微分値との関係で表される融解曲線（微分融解曲線ともいう）において、野生型ヒトＥＧＦＲ及びＴ２３８９Ａ変異型ヒトＥＧＦＲのそれぞれのＴｍ値のピーク面積を算出して、それらを比較することによって行うこともできる。
まず、例えば、野生型の核酸（Ｗｔ）とＴ２３８９Ａ変異型の核酸（Ｍｔ）との核酸混合物を含む試料について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号（検出シグナル）との関係で表された融解曲線、及び同図（Ｂ）微分融解曲線を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを検出して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。
ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を下限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を上限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。
なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定してもよい。
次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける検出信号の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔｓ＋１）−Ｂ（Ｔｓ＋１）｝＋｛ｆ（Ｔｓ＋２）−Ｂ（Ｔｓ＋２）｝＋｛ｆ（Ｔｅ−１）−Ｂ（Ｔｅ−１）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔｅは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔｓ）＋ｆ（Ｔｓ） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔｅ）−ｆ（Ｔｓ）｝／（Ｔｅ−Ｔｓ）である。
上記（１）式及び（２）式に従って、前記核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＭにおける面積ＳＭを求め、面積比によって野生型のヒトＥＧＦＲと、Ｔ２３８９Ａ変異型のヒトＥＧＦＲの存在の有無を判定することができる。
面積比は、下記（３）式により求めることができる。
面積比（％）＝（ＳＭ／ＳＷ）×１００ ・・・（３）
例えば、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のＴ２３８９Ａ変異型の存在の有無の判定は、上記（３）式の面積比のカットオフ値を１０％と設定し、１０％以上であればＴ２３８９Ａ変異型のヒトＥＧＦＲが存在する（陽性）であると判定してもよい。カットオフ値は、希望する検出感度及び特性に応じて適宜設定すればよい。
以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
図２には、一実施態様における、ヒトＥＧＦＲのＤＮＡ配列におけるプローブ及びプライマー（セット）の位置関係を模式的に示した。図２において、配列番号１は、ヒトＥＧＦＲのゲノムＤＮＡ由来の配列を示し、配列番号２はプローブを示し、配列番号８及び９はフォワードプライマーセットを示し、配列番号１０はリバースプライマーを示す。
配列番号２における丸部分は、一実施態様における蛍光色素の標識部位を示す。
配列番号８及び９に記載されている「×」部分は、プライマーダイマーの形成を抑制するために人工的に変異を導入した塩基部分に対応する。また、配列番号８及び９の３’末端部分に対応する塩基Ｔは、ヒトＥＧＦＲのＴ２３８９Ａ変異に対応する塩基部分である。
＜プローブのスクリーニング＞
ヒトＥＧＦＲのＴ２３８９Ａ変異の有無によってＴｍ値に差があり、かつ、野生型（ＷＴ）のＥＧＦＲ及びＴ２３８９Ａ変異型（Ｍｔ）のＥＧＦＲの両方にそれぞれ単一のＴｍ値のピークを示すプローブのスクリーニングを行った。
プローブの相補鎖として、野生型ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３８９番目の塩基を含むヌクレオチド配列（配列番号１４）、及びＴ２３８９Ａ変異型ヒトＥＧＦＲのコード領域の２３８９番目の塩基を含むヌクレオチド配列（配列番号１５）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に製造委託して人工的に合成したものを得た。配列番号１４及び配列番号１５の塩基配列を下記表１に示す。
また、配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ｐ１）、配列番号２に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ｐ２）、配列番号３に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ｐ３）、配列番号４に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ｐ４）を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。なお、Ｐ１とＰ２とは、塩基配列が同じ（配列番号２）であり、蛍光色素ＴＡＭＲＡが標識される末端のみが異なる。Ｐ１〜Ｐ４の塩基配列及び蛍光色素ＴＡＭＲＡの位置を下記表２に示す。
下記表３に示す組成で反応液を調製し、下記表４に示す温度条件でＴｍ値の測定を行った。なお、Ｔｍ値の測定は、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いて行った。

Ｔｍ値の測定結果を図３に示す。図３のグラフは、面積解析ソフトｉｄｅｎｓｙ ＡｒｅａＡｎａ（アークレイ社）で作製した。図３に示されているように、プローブ（Ｐｒｏｂｅ）としてＰ１又はＰ２を用いた場合には、ヒトＥＧＦＲにＴ２３８９Ａ変異の有無でＴｍ値に差があり、かつ、野生型（ＷＴ）のＥＧＦＲ及びＴ２３８９Ａ変異型（Ｍｔ）ＥＧＦＲの両方でそれぞれ単一のＴｍ値のピークを有することが示された（判定：○）。従って、Ｐ１及びＰ２は、本開示のプローブとして特に有用であることが示された。
また、プローブとしてＰ３を用いた場合には、Ｔｍ値のピークの単一性がＷＴで若干弱かったものの、実用的に使用できるレベルであり、有用であることが示された（判定：△）。
他方、プローブとしてＰ４を用いた場合には、ＷＴにおいて複数のＴｍ値のピークが示され、Ｍｔのピークに膨らみがあることから、プローブとしての実用性は不十分であると判断された（判定：×）。
＜プライマーのスクリーニング＞
ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異を特異的かつ高感度に検出し得るプライマーセットについて検討した。この検討に用いたプローブ及びプライマーの塩基配列、及びプローブ蛍光色素に関する情報は、下記表５に記載した通りである。
また、以下の表６〜表１２に示す組成で反応液を調製した。なお、Ｐ−ｍｉｘには、Ｐ−ｍｉｘＡ、Ｐ−ｍｉｘＢ、又はＰ−ｍｉｘＣのいずれかを使用した。
表１１において、「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」は、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から入手した。「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（１００００ｃｐ／μｌ）」は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡが１００００ｃｐ（コピー）／μｌであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ ３％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、３％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型合成ＤＮＡ（ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ）であり、残りが野生型合成ＤＮＡであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ ０．３％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、０．３％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型合成ＤＮＡ（ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ）であり、残りが野生型合成ＤＮＡであることを示す。
野生型合成ＤＮＡの塩基配列は配列番号１であり、変異型合成ＤＮＡの塩基配列は配列番号１６の通りである。野生型および変異型の合成ＤＮＡはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に製造委託して人工的に合成したものを得た。
上記反応液を用いて、下記表１３に示す条件でＰＣＲ反応を行った後、Ｔｍ値の解析を行った。
ＰＣＲ反応およびＴｍ値の測定には、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いた。
上記Ｔｍ値の解析結果を図４に示す。
リバースプライマーのセットとして配列番号１２及び１３のヌクレオチド配列を用いた場合、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型（Ｍｔ）がテンプレートに０．３％含まれる試料で、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型を示すピークが認められたが、テンプレートが野生型（ＷＴ）のみの試料では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型を示すピークが偽陽性として認められた。
従って、リバースプライマーのセットとして配列番号１２及び１３のヌクレオチド配列を用いる場合は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型の検出に不適切であると判断した。
フォワードプライマーのセットとして配列番号６及び７のヌクレオチド配列を用いた場合、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型（Ｍｔ）がテンプレートに３％含まれる試料であっても、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型を示すピークがほとんど検出されなかった。
従って、フォワードプライマーのセットとして配列番号６及び７のヌクレオチド配列を用いる場合は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型の検出に不適切であると判断した。
フォワードプライマーのセットとして配列番号８及び９のヌクレオチド配列を用いた場合、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型（Ｍｔ）がテンプレートに３％含まれる試料において、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型を示すピークがはっきりと検出された。これに対し、テンプレートが野生型（ＷＴ）のみの試料では、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型を示すピークが認められなかった。
従って、フォワードプライマーのセットとして配列番号８及び９のヌクレオチド配列を用いる場合は、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型の検出に適切であると判断した。
＜最小検出感度に基づく性能評価＞
上記実施例において優れた効果を示したプローブ、及びプライマーセットを用いて、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の最小検出感度を検討した。上記検討に用いたプローブ及びプライマーの塩基配列、及びプローブ蛍光色素に関する情報は、下記表２０に記載した通りである。

以下の表１５〜表１９に示す組成で反応液を調製した。
「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（１００００ｃｐ／μｌ）」は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡが１００００ｃｐ（コピー）／μｌであることを示す。
また、「ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ ０．３％（１００００ｃｐ／μｌ）」は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡのうち、０．３％がヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型合成ＤＮＡ（ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ）であり、残りが野生型合成ＤＮＡであることを示す。同様に、Ｍｔについての「％」部分は、野生型合成ＤＮＡに含まれるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型（ＥＧＦＲ−Ｔ２３８９Ａ−Ｍｔ）の割合を示す。
野生型合成ＤＮＡの塩基配列は配列番号１であり、変異型合成ＤＮＡの塩基配列は配列番号１６である。野生型および変異型の合成ＤＮＡはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に製造委託して人工的に合成したものを得た。
上記反応液を用いて、下記表２０に示す条件でＰＣＲ反応を行ない、Ｔｍ値の解析を行った。ＰＣＲ反応およびＴｍ値の測定には、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いた。
上記Ｔｍ値の解析結果を図５に示す。この結果、ヒトＥＧＦＲの野生型の塩基配列を有するテンプレートに、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異型の塩基配列を有するテンプレートが０．０１２５％（Ｍｔ ０．０１２５％）以上含まれている場合に、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異が良好に検出されることが示された。
本開示によれば、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度なＣ７９７Ｓ変異の検出を可能にする、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ及びヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キットを提供することができる。

Claims (8)

  1. 下記（Ｉ）〜（ＩＶ）からなる群から選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ。
    （Ｉ）配列番号２に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
    （ＩＩ）配列番号２に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
    （ＩＩＩ）配列番号３に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び、
    （ＩＶ）配列番号３に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
  2. 前記蛍光色素が、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、及びポリメチン色素誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ。
  3. 請求項１又は請求項２に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブ、及び、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットを含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット。
  4. 配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーを更に含む、請求項３に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用キット。
  5. 請求項１又は請求項２に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させること、
    前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
    前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定すること、及び、
    前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出すること、
    を含む、ヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
  6. 前記一本鎖核酸が、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、請求項５に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
  7. 前記一本鎖核酸が、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含むヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用フォワードプライマーセット、並びに、配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異増幅用リバースプライマーを用いたＰＣＲにより得られた二本鎖核酸を解離した産物である、請求項５に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
  8. 前記試料が、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、又はこれらの懸濁液である、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載のヒトＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ（Ｔ２３８９Ａ）変異の検出方法。
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