JP2019048867A - 精製カルジオジェニン異性体及び関連法 - Google Patents

Abstract

【課題】実質的に副異性体を含まないカルジオジェニン主異性体（「単離カルジオジェニン主異性体」と呼ぶ）の提供。【解決手段】ダイコンソウのメタノール抽出物から得られ、かつその副異性体から分離される、単離カルジオジェニン主異性体。２つの異性体は、キラル相クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＩＣ（商標）を使用する）によって達成され得る。単離したカルジオジェニン主異性体の純度は、結晶化によって更に増加させることが可能であり、２１０ｎｍで少なくとも９８．９７％（ａ／ａ）ＨＰＬＣ純度並びに９５．５０％（ｗ／ｗ）の効力を有する単離したカルジオジェニン主異性体。【選択図】なし

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１２月２３日に出願された、米国特許仮出願第６１／４２６，９２９号への優先権を主張するものである。

「ＥＧＪ」と示される、ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のメタノール性抽出物は、心筋の再生を促進することにおいて活性を有することが示されている。Ｃｈｅｎｇら著、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（２）：ｅ４４６１（２００９）を参照されたい。この活性は、ＥＧＪ成分である、「カルジオジェニン」（Ｃ_３６Ｈ_５８Ｏ_１１）と呼ばれる強心配糖体に起因し、これは（２α，３β，４α）−２，３，１９，２３−テトラヒドロキシ−ウルサ−１２−エン−２８−酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルである。カルジオジェニンに起因するこの化学構造は、１６個のキラル中心を有し、多くの立体異性体の理論的可能性が生じる。

これに関連して、Ｃｈｅｎｇらは、カルジオジェニンの単一の立体異性体の獲得を示唆する方法における手順を記載した。しかしながら、少なくとも９０％の純度によって特性化されるカルジオジェニン組成物の実用可能な単離には、不十分な内容が提供され、そしてＣｈｅｎｇら自身も「単離された」カルジオジェニンの純度を記載しなかった。したがって、Ｃｈｅｎｇの方法によれば、得られる組成物中に不純物が存在するかどうか又はどれほどの範囲で存在しているかが未知であった。

従来の技術のこの背景に対して、本発明者は、Ｃｈｅｎｇら（２００９）によって記載された方法を使用して、ＥＧＪから抽出かつ精製された「カルジオジェニン」が、実際には、同一の質量の、接近して溶出する２つの異性体を含むことを発見した。結果的に、本発明者は、今まで認められなかった、活性であると見出されたカルジオジェニンの主異性体を、不活性である副異性体から分離するためのアプローチを発見した。このアプローチを介して、本発明者は、実質的に副異性体を含まないカルジオジェニン主異性体組成物（以降、「単離カルジオジェニン主異性体と呼ぶ）をＥＧＪから抽出することで成功した。

したがって、本発明の方法は、２１０ｎｍで少なくとも９８％（ａ／ａ）ＨＰＬＣ純度を有する（以降、「実質的純度」と呼ぶ）、単離されたカルジオジェニン主異性体を提供する。実質的純度は、不純物を分離するために、単離されたカルジオジェニン主異性体を結晶化することによって達成される。これに関して、「ａ／ａ」とは、特定の波長にてのクロマトグラムにおける全ての他のピークの総面積に対するクロマトグラムにおける目的のピークの面積％を示す。このａ／ａ値は、ここでは、カルジオジェニン異性体に関する光学純度の単位測定値として役立つ。

本発明は、主異性体及び副異性体、対応するその無糖体、及び関連する組成物、並びにそれらの製造法及び使用法を包含する。したがって、１つのその態様によると、本発明は、単離されたカルジオジェニン主異性体を提供し、これは、例えば、式

に関して説明され得る。

別のその態様によると、本発明は、ＨＰＬＣによって少なくとも９２％の純度で、単離されたカルジオジェニン主異性体の無糖体を提供する。この無糖体は、例えば、式

に関して説明され得る。

カルジオジェニン主異性体は、実質的純度で存在する。この状態の例示的実施形態は、２１０ｎｍで９８．９７％（ａ／ａ）のＨＰＬＣ純度を有する化合物である。他の実施形態では、単離されたカルジオジェニン主異性体及び／又はその対応する無糖体、並びに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。

本発明はまた、カルジオジェニンの主異性体を単離するための方法も提供する。本発明の方法は、（Ａ）ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のメタノール抽出物から抽出物を生成することと、（Ｂ）この抽出物を、キラル相クロマトグラフィー又は超臨界液体クロマトグラフィーにかけることとを含み、これによって、主異性体は単離形態で得られる。キラル相クロマトグラフィーが関与する実施形態は、例えば、Ｃｈｉｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔａｒ，ＰＡ）の製品である、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＩＣ（商標）の使用を伴う。カルジオジェニン主異性体を単離するための本発明の方法はまた、組成物を結晶化することも含むことができる。

本発明の別の態様は、Ｃｈｅｎｇら（２００９）のクロマトグラフィー手順への改善に関し、これは、（Ａ）不必要な固体を除去するために、ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のメタノール性／水溶液を沈殿させかつ濾過すること、（Ｂ）ジクロロメタン及びｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で相分離的抽出を行うこと、次いで（Ｃ）ｎ−ブタノールで抽出することを含む。本発明の改善されたクロマトグラフィー手順はまた、カルジオジェニンの主異性体からなる組成物を、最適化された物質充填に対する樹脂の質量比（典型的には、約１５：１）及びメタノール／水の段階濃度を使用する低圧吸着クロマトグラフィー（Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ−２０及びシリカゲル）にかけ、続いて最適化された物質充填に対する樹脂の質量比（約２０：１）及びジクロロメタン／メタノールの段階濃度を使用する低圧シリカゲルクロマトグラフィーかけることを含んでもよい。別の実施形態では、Ｃｈｅｎｇら（２００９）についての改善は、主異性体含有組成物を、濃度勾配プログラムにおいて水性緩衝液及びメタノール移動相を使用する、高圧、逆相クロマトグラフィー（ＨＰＲＣ)にかけることを更に含む。この点に関して、ＨＰＲＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｉｎc.(Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）の製品であるＬｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）カラムを使用することを伴うことができる。

Ｃｈｅｎｇら（２００９）の方法を介して、半精製されたカルジオジェニン組成物を得ることからの結果を示し、この中で、本発明者によって単離されたカルジオジェニンジアステレオマーは、他から分離されていない。 Ｃｈｅｎｇら（２００９）の方法で生成された半精製カルジオジェニン材料の本発明によるＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳからのデータを示す。他から分離された２つのピークに関して、この分析は、２つのカルジオジェニン異性体の存在を立証する。ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて明白である、接近して溶出するピークは、同一分子イオン酢酸塩及びトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）付加物を示し、これらが構造異性体であることを示唆する。 上述の半精製カルジオジェニン参照物質の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを提示する。このスペクトルは、２つのカルジオジェニン異性体の存在を立証する。 抽出、シリカゲルに引き続いてのＤｉａｎｉｏｎ ＨＰ−２０による更なる分離、並びに最終的に逆相クロマトグラフィーによる更なる分離によってカルジオジェニン組成物を生成することからの結果を図示する。示すように、この組成物は、２１０ｎｍでの９２．６％（ａ／ａ）のＨＰＬＣ純度が組み合わされて（前分離）、最適化純度ＨＰＬＣ法を介して完全に分離された、２つのカルジオジェニン異性体を含む。 本発明によるカルジオジェニン主異性体を単離するための方法の概略概要を示す。 最終的結晶化後の単離されたカルジオジェニン主異性体の純度が、２１０ｎｍで９８．９７％（ａ／ａ）であることを示す、ＨＰＬＣ純度報告からの結果を示す。 ２．３ＰＰＭ及び５．３７５ＰＰＭ付近における副異性体共鳴の除去を使用した、単離されたカルジオジェニン主異性体の同一性を立証する^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを提示する。 カルジオジェニン主異性体に関するＸ線結晶学的データの三次元骨格モデル（ａ）を示す。更に示されるものは、骨格式（ｂ）であり、これは（ａ）の二次元表示である。表現（ａ）は、カルジオジェニンの規定の酸素原子と結晶の水の水素原子との間の分子間水素結合（点線）を示す。 本発明により単離されたカルジオジェニン主異性体（「ＨＵＹＡ−１」）のＣ１８逆相クロマトグラフィープロファイルを示す（２４．２５４副ピークをどのように説明するべきであろうか？）。 本発明により単離されたカルジオジェニン主異性体（「ＨＵＹＡ−２」）のＣ１８逆相クロマトグラフィープロファイルを示す。ＨＵＹＡ−１及びＨＵＹＡ−２は、同一の保持時間を示す。 本発明により得られたカルジオジェニン主異性体（「ＨＵＹＡ−３」）の無糖体のＣ１８逆相クロマトグラフィープロファイルを示す。 本発明により得られたカルジオジェニン主異性体（「ＨＵＹＡ−４」）の無糖体のＣ１８逆相クロマトグラフィープロファイルを示す。ＨＵＹＡ−３及びＨＵＹＡ−４は、同一の保持時間を示す。 Ｃｈｅｎｇら（２００９）の方法により単離されたカルジオジェニン主異性体（「Ｃａｒ」）のＣ１８逆相クロマトグラフィープロファイルを示す。Ｃａｒの保持時間は、ＨＵＹＡ−１及びＨＵＹＡ−２のそれぞれのものと同様である。 間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の心原性形態学的移行の誘導における、Ｃａｒ、ＨＵＹＡ−１及びＨＵＹＡ−２（それぞれ１０μｇ／ｍｌ）の活性を示す顕微鏡写真を提示する。Ｄ０は、ＭＳＣsの培養がいずれの処置の前にセットアップされたものである。ＭＳＣｓの形態は、平坦、不規則、低屈折及び十分に広がった形状（円形）によって特性化された。Ｄ３は、培養されたＭＳＣｓが、それぞれ標識付けされたような化合物で３日間処置された試料である。Ｃａｒ−及びＨＵＹＡ−１ＭＳＣｓで処理されたいくつか（〜３１％）は、狭小化を起こし、より屈折するようになる（楕円形）ことが観察された。これとは対照的に、ＨＵＹＡ−２処置されたＭＳＣｓは、明白な形態学的変化を示さなかった（円形）。Ｄ７は、培養されたＭＳＣsが、それぞれ標識付けされたような化合物で７日間処置されたものである。Ｃａｒ−及びＨＵＹＡ−１で処置された培養物におけるより多くのＭＳＣｓ（〜４８％）が、狭小化を起こし、より屈折するようになった（円形）。再び、ＨＵＹＡ−２処置されたＭＳＣｓは、著しい形態学的変化を示さなかった（円形）。 ＭＳＣｓの心原性形態学的移行の誘導における、顕微鏡写真を介してのＨＵＹＡ−３（１０μｇ／ｍｌ）のＨＵＹＡ−４（１０μｇ／ｍｌ）との比較を提供する。Ｃｔｒｌは、ビヒクル（等量での１０％のＤＭＳＯ）で処置されたＭＳＣｓを示す。Ｄ０は、いずれかの処置の前にＭＳＣｓ培養がセットアップされたものである。ＭＳＣｓの形態は、平坦、不規則、低屈折及び十分に広がった形状（円形）によって特性化された。Ｄ３は、培養されたＭＳＣｓが、それぞれ標識付けされたような化合物で３日間処置されたものである。ＨＵＹＡ−４処置ＭＳＣｓのいくつか（〜２０％）は、狭小化及びより屈折した表現型（楕円形）を示した。しかしながら、ＨＵＹＡ−３処置及びビヒクル処置のＭＳＣｓは、著しい形態学的変化は示さなかった（円形）。Ｄ７は、培養されたＭＳＣｓが、それぞれ標識付けされたような化合物で７日間処置されたものである。ＨＵＹＡ−４処理培養中のＭＳＣｓの同様な量（〜２２％）が狭小化及びより屈折性となった（楕円）。これとは対照的に、ＨＵＹＡ−３処置及びビヒクル処置のＭＳＣｓは、著しい形態学的変化は示さなかった（円形）。 心原性分化マーカーであるＭｅｆ２ａ（Ｄ３における蛍光）及びβ、ＭＨＣβ（Ｄ７における蛍光）の発現に関する免疫蛍光染色を示す。Ｄ３及びＤ７は、培養されたＭＳＣｓが、標識付けされたような化合物で、それぞれ３日及び７日間処置されたものである。ＮｅｇはＭｅｆ２ａ又はＭＨＣβに特異的な一次抗体を使用しない、ＭＳＣｓ培養の陰性対照であり、Ｍｅｆ２ａ（Ｄ３）及びＭＨＣ（Ｄ７）染色の陰性シグナルを示す。Ｃｔｒｌは、陽性Ｍｅｆ２ａ（Ｄ３）及びＭＨＣβ（Ｄ７）シグナルがほぼ全く観測されないことを伴う、（１０％のＤＭＳＯの等量で処置された培養されたＭＳＣｓを表す。Ｃａｒはカルジオジェニンで処置されたＭＳＣｓ培養であり、蛍光（Ｄ３）によって指示されるように、処置細胞のおよそ１３％が、Ｍｅｆ２ａ陽性染色を表示し、細胞が７日間処置された場合（Ｄ７）、処置細胞の１７％が、ＭＨＣ陽性シグナル（蛍光）を示した。 初期心原性分化マーカーであるＭｅｆ２ａ（Ｄ３における蛍光）及び心筋特異ミオシン重鎖βであるＭＨＣ（Ｄ７における蛍光）の発現に関する免疫蛍光染色を示す。Ｄ３及びＤ７は、培養されたＭＳＣｓ試料が、標識付けされたような化合物で、それぞれ３日及び７日間処置されたものである。ＨＵＹＡ−１は、ＨＵＹＡ−１ｄｅｓｈｏｃｈｉｓａｒｅｔａ ＭＳＣｓ培養を表し、赤色シグナル（Ｄ３)によって指示されるように、処置細胞のおよそ１５％が、Ｍｅｆ２ａ陽性染色を示し、並びに細胞が７日間にわたって処置された場合（Ｄ７）、処置細胞の２０％がＭＨＣ陽性シグナル（蛍光）を示すことを表示する。ＨＵＹＡ−２は、ＨＵＹＡ−２で処置されたＭＳＣｓ培養であり、Ｍｅｆ２ａ（Ｄ３）に関する陽性シグナルがほぼ全くないこと並びにＭＨＣβに関する〜３％の陽性シグナル（Ｄ７）を示す。ＨＵＹＡ−３は、ＨＵＹＡ−３で処置されたＭＳＣｓ培養を表し、Ｍｅｆ２ａ（Ｄ３）及びＭＨＣβに関する陽性シグナルがほとんど観測されなかったことを示す。ＨＵＹＡ−４は、ＨＵＹＡ−４で処置されたＭＳＣｓ培養を示し、処理細胞のおよそ〜６％がＭｅｆ２ａ陽性シグナル（Ｄ３）を表し、並びに処理細胞の〜８％がＭＨＣβ陽性シグナル（Ｄ７）を示したことを表示する。 共培養系における拍動する心臓ミオサイトへのＧＦＰ−ＭＳＣｓのＨＵＹＡ−１誘導分化を示す。この動作画面は、ＧＦＰ−ＭＳＣｓから分化した拍動するＧＦＰ陽性ミオサイト（囲まれた領域）を示すビデオから取られ、このＧＦＰ−ＭＳＣｓは、ラット心臓ミオサイトと線維芽細胞で共培養され、次いでＨＵＹＡ−１で処置されたものである。この培養が非ＧＦＰミオサイト及び線維芽細胞並びにＧＦＰ−ＭＳＣｓを含有したために、同定されたＧＦＰ陽性シグナルを伴ういずれの拍動する細胞も、ＧＦＰ−ＭＳＣｓから分化したに違いない。このことは、ＨＵＹＡ−１が、拍動する心臓ミオサイトへのＭＳＣｓの心原性分化を増強させることを示している。 本発明による単離されたカルジオジェニン主異性体をその対応する無糖体に変換するための方法を提示する。

冠動脈疾患のための心筋梗塞は、早期死の主要原因である。１つの解決策は、梗塞した心臓組織を、内因性前駆体プールからの再生した心筋で又は外因的に導入された幹細胞で置き換えることである。ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｎｏｎｉｕｍ）のメタノール性抽出物が、Ｃｈｅｎｎｇらによって、このような潜在能力を有することが示された。

上述したように、Ｃｈｅｎｇらは、カルジオジェニンの単一の立体異性体の獲得を示唆する方法において彼らの手順を記載しているが、現在の小分子医薬品物質の典型的承認期待値である、２１０ｎｍで少なくとも９５〜９８％（ａ／ａ）のＨＰＬＣ純度によって特性化されるカルジオジェニン組成物の実用可能な単離には不十分な詳説があった。更には、Ｃｈｅｎｇらは、「単離された」カルジオジェニンの純度を記載しなかった。Ｃｈｅｎｇの方法によると、得られた組成物中に不純物が存在したかどうか、及び存在した場合は、このような不純物の範囲が未知である。

ＥＧＪからカルジオジェニンを抽出する従来の方法の評価の過程中に、抽出した組成物がカルジオジェニンの単一の立体異性体を含むだろうという予想で、抽出したカルジオジェニンの純度を分析するようＨＰＬＣアッセイ法が開発された。驚くべきことに、Ｃｈｅｎｇらによって採用されたものに改良を加えたＨＰＬＣアッセイ法を使用して、本発明者は、カルジオジェニンを抽出する従来法が、同一の質量を有する接近して溶出する２つの異性体をむしろ生成することを観察した。引き続いて、ＬＣ−ＭＳ及び^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の双方が実施され、それぞれの方法は、Ｃｈｅｎｇの方法を介して生成された「カルジオジェニン」が、２つのカルジオジェニン異性体を実際に含むことの発見を個々に立証した。このＬＣ−ＭＳの結果が、図２に示され、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが図３に示されている。

本発明者はまた、Ｃｈｅｎｇの方法に続いて、主異性体に起因し得る約１６．７８％のＨＰＬＣ不純物を伴い、単離されたカルジオジェニン主異性体のＨＰＬＣ純度が、２１０ｎｍで約７５．７３％（ａ／ａ）にすぎない所見を見出した。更に、単離されたカルジオジェニン主異性体が生物学的に活性であり、不純物が生物学的に不活性であることも見出された。

カルジオジェニンの主異性体の単離
実質的な純度を有する単離されたカルジオジェニン主異性体を得るために、今まで認められなかったカルジオジェニン副異性体を含む不純物を除去するよう、方法が開発された。Ｃｈｅｎｇら（２００９）によって教示された抽出手順は、水に対するクロロホルム、酢酸エチル及び最終的にｎ−ブタノール相分離抽出を利用する。ｎ−ブタノール相が、更なる精製のために保持され、他の有機相は廃棄された。カルジオジェニンのかなりの損失が酢酸エチル抽出で見られたので、本発明者は、毒性リスクを考えて、工業的製造スケールではクロロホルムは使用され得ないことを決定した。

結果的に、抽出プロセスの最適化は実施されなかった。先ず初めに、ＥＧＪ抽出プロセスが、ＥＧＪのメタノールレスラリーの導入、それに続く濾過、濃縮及び水での希釈並びにセライト補助濾過の導入によって改善された。これらの工程は、ＥＧＪ抽出物から、望ましくない物質である、およそ５０％の固体を除去し、以下の有機相分離の際の後続のエマルジョン形成を低減するよう補助する。濾過固体が分析される場合、フィルターケーキはカルジオジェニンを含まない。次の水性／メタノール濾液のクロロホルム抽出が、操作者の安全性リスク及び環境的リスクの双方を提示する溶媒である高い毒性のクロロホルムを使用することを回避するために、ジクロロメタンで置き換えられた。ＴＢＭＥでの抽出が追加され、これは、この抽出が、メタノール／水の濾液からカルジオジェニンを相当量を除去することなく、カルジオジェニンのものに接近した保持時間でのＨＰＬＣ精製中に溶出する不純物を除去することが示されたためである。水性メタノール性相を飽和塩化ナトリウム溶液に変換し、ｎ−ブタノールで抽出し、これによって、カルジオジェニンの良好な全体の回収率で、水性／メタノール相からカルジオジェニンを除去した。

Ｃｈｅｎｇら（２００９）によって教示されたクロマトグラフィー分離は、異性体混合物の全体の純度を増加させるために、低圧Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ−２０吸着クロマトグラフィー、これに続いて低圧順相シリカ、及び最終的に高圧逆相クロマトグラフィー含むように組み込まれた。Ｄｉａｉｏｎ及び順相シリカクロマトグラフィーは、Ｃｈｅｎｇらによって教示されたように全般的に実行されるが、条件が最適化される。特に、Ｄｉａｉｏｎクロマトグラフィーが、物質充填に対する樹脂の最適質量比（１５：１）の画定によって、並びに１０％増加量で８０％のＭＥＯＨ／水まで増加する、２０％のＭＥＯＨ／水で開始する段階濃度の使用によって最適化された。シリカゲルクロマトグラフィーは、物質充填に対する樹脂の最適質量比（２０：１）の画定によって、並びに上記記載の操作者及び環境的安全性の観点のために移動相においてクロロホルムをジクロロメタンに置き換えて、ジクロロメタン／メタノール９０％：１０％〜ジクロロメタン／メタノール８０％：２０％の範囲であるジクロロメタン／メタノールの段階濃度の使用によって、最適化された。

このプロセスは、高圧逆相クロマトグラフィーの後に、キラル相クロマトグラフィー又は貯臨界液体クロマトグラフィーのいずれかの導入によって更に改善され、カルジオジェニンの、接近して溶出する２つのエナンチオマーの分離を可能にした。最終的に、分離されたカルジオジェニンの主異性体が、その純度を増加させるためにメタノール／水から結晶化され、ＨＰＬＣ純度法の溶出プロファイル全体を通して見られた低レベルの不純物を除去した。この方法によると、本発明は、Ｃｈｅｎｇらによって報告されたものを超えるカルジオジェニンに対するＥＧＪからの全収率で、少なくとも９８％ＨＰＬＣ純度でのカルジオジェニンの主異性体を提供する。

この点に関して、好適な逆相クロマトグラフィー技術の部類は、非極性固定相を使用する任意のクロマトグラフィー法を包含する。極性化合物は、非極性化合物が保持されている一方で、早期に溶出される。このカラムは、オクタデシル炭素鎖（Ｃ１８）が結合したシリカであることができる。溶離液は、ＡＣＮ及び２０ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７）の混合物であることができる。次いで試料がＭｅＯＨ：緩衝液＝５０：５０（ｖ：ｖ）中に４７ｇ／Ｌで溶解される。溶出に関する温度は、室温であり得る。移動相濃度勾配は、線形様式で、８０％の２０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル〜６５％の２０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリルで移行する。カラムの流速は、ＩＤ＝２ｃｍカラム上で１５ｍＬ／分であり得る。カルジオジェニンの存在は、２１０ｎｍでＨＰＬＣによって検出され得る。図４に示すデータから計算されることができるように、主異性体の副異性体に対する吸収単位ピーク比は、２つのカルジオジェニン異性体の分離前に、ほぼ４．５：１である。

２つのカルジオジェニン異性体は、キラル相クロマトグラフィーによって分離される。この点に関して、キラル相クロマトグラフィー技術の部類は、その中で固定相が、アキラルであるよりはむしろキラル化合物の単一のエナンチオマーを含有する任意のカラムクロマトグラフィーを包含する。キラル固定相の選択は、適切な分離を達成するために重要である。カルジオジェニンの２つの異性体は、キラルカラム固定相に結合される場合、それらの一過的に異なる溶解度特性のために、異なる時間でカラムから溶出する。このカラムは、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＩＣ（商標）カラムであることができる。溶離液は、ＩＰＭ：ＭＴＢＥ＝５０：５０（ｖ：ｖ）の混合物であり得る。試料は、ＩＰＡ／ＭＴＢＡ＝５０：５０（ｖ：ｖ）又はニートなＩＰＡ中に溶解されることができる。溶出の温度は室温であり得る。カラムの流速は、ＩＰＡ：ＭＴＢＥ＝５０：５０（ｖ：ｖ）の無勾配移動相を使用して、分析カラム上では１ｍＬ／分であり得るか、又は半分取カラム上ではより速い流速であり得る。カルジオジェニンの存在は、２１０ｎｍでＨＰＬＣによって検出され得る。

２つのカルジオジェニン異性体はまた、例えば、Ａｎｔｏｎ ＆ Ｂｅｒｇｅｒによる、ＳＵＰＥＲＣＲＩＴＩＣＡＬ ＦＬＵＩＤ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＷＩＴＨ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＵＮ（第１版、１９９７）に記載されるような、超臨界液体クロマトグラフィーによって分離されることも可能である。この点に関して、好適な超臨界液体クロマトグラフィー技術の部類は、キラル化合物を分離するための順相の移動相を包含する。したがって、このカラムは、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＩＣ（商標）カラム、他のＣｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）固定相カラム又はＣ１８カラムであることができるが、好ましくはＣｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＩＣ（商標）カラムである。濃度勾配溶離液は、ＣＯ_２／ＭｅＯＨ又はＣＯ_２／ＡＣＮであることができる。カルジオジェニンの存在は、２１０ｎｍでＨＰＬＣによって検出され得る。

単離したカルジオジェニン主異性体の純度は、結晶化によって更に増加され得る。この点に関して、「結晶化」の部類は、カルジオジェニン主異性体の固体結晶を形成するための任意の方法を包含するが、典型的には、溶液、溶解物、又は気体から沈殿させることである。好ましい実施形態では、カルジオジェニン主異性体は、４０℃でメタノールの１０容量に溶解される。次いで４０容量の水が同時に、約５０分間の時間にわたって、ゆっくりと添加され、この間、カルジオジェニン主異性体の結晶化が起こる。

上述の方法によると、カルジオジェニン主異性体は、２１０ｎｍで９８．９７％（ａ／ａ）のＨＰＬＣ純度で、並びに９５．５０％（ｗ／ｗ）のＮＭＲアッセイによる効力で、ＥＧＪから単離されることが可能である。単離したカルジオジェニン主異性体は、ＭＴＢＥ／ＩＰＡ＝５０：５０中又は固体としてのいずれかで保存される場合、安定な化合物である。これはまた、４０℃での熱ストレスに耐性である。

カルジオジェニン主異性体の構造は、以下に示される。

カルジオジェニンの主異性体の無糖体
対応する無糖体が、糖部分を分子の多環のコアに連結させるエステル結合の加水分解によって、多環式配糖体である単離されたカルジオジェニン主異性体から変換され得る。このような加水分解は、２つのアプローチのいずれかによって達成され得る：
（ａ）酸触媒された加水分解であり、これはエステルを効果的に開裂するための鉱酸の希水溶液の使用を含む。得られる生成物は、糖と、カルジオジェニンの遊離カルボン酸形態である。
（ｂ）塩基触媒された加水分解（鹸化）であり、この中で、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基が、エステルを加水分解するために使用される。典型的には、このような加水分解は、水性媒質中で実行されるか、又は水と適切なアルコールとの混合物である溶媒系が使用される。塩基触媒された加水分解から得られる生成物は、カルジオジェニンのカルボン酸基の塩の形態である。この塩は、鉱酸を使用して、遊離酸に容易に変換され得る。

図１９は、カルジオジェニン主異性体の対応する無糖体への変換を図示する。このように得られた無糖体の構造は、以下に示される：

心原性分化の誘導又は増強
カルジオジェニン主異性体及び対応する無糖体は、インビトロ及びインビボの双方で、心原性分化を誘導又は増強するために使用され得る。この有用性は、カルジオジェニン主異性体又はその無糖体を含む組成物の存在下で培養されたＭＳＣｓが、心臓ミオサイトへの実質的に増強された分化を呈するという事実によって立証される。これに加えて、ＭＳＣｓがカルジオジェニン主異性体又はその無糖体の存在下で心臓ミオサイトと共に共培養される場合、拍動する心臓ミオサイトがＭＳＣｓから分化する。

医薬組成物及び投与量
単離されたカルジオジェニン主異性体及び／又はその対応する無糖体は、単独で、又は同様な又は異なる生物学的活性を有する他の化合物と共に投与され得る。例えば、本発明の化合物及び医薬組成物は、併用療法で投与され得、すなわち、単一又は別個の投与形態で同時に投与されるか、又は別個の投与形態で互いに数時間又は数日以内に投与され得る。このような併用療法の例としては、脳卒中、骨格筋再生、創傷治癒、又は心臓疾患の問題を治療するために、カルジオジェニン主異性体及び／又はその対応する無糖体の化合物を、脳卒中、他の薬剤と共に投与することが挙げられる。

したがって、一実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能な担体で混合された、カルジオジェニン主異性体、その加水分解遊離酸生成物（すなわち、無糖体）、又はこの遊離酸の薬学的に許容可能な塩、並びにその溶媒和物、互変異性体、多形体、水和物、構造誘導体又はプロドラッグを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、医薬品配合の一般的に受容されているやり方に従って、１つ以上の追加的治療薬剤、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、アジュバント、安定化剤、乳化剤、防腐剤、着色剤、緩衝剤、風味付与剤、吸収増強剤、錯化剤、可溶化剤、湿潤剤及び界面活性剤を更に含有する。

一実施形態では、医薬組成物は、カルジオジェニン主異性体の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、互換異性体、多形体、水和物、構造誘導体又はプロドラッグ、並びに薬学的に許容可能な担体を含む。

別の実施形態では、医薬組成物は、カルジオジェニン主異性体の無糖体又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、互換異性体、多形体、水和物、構造誘導体又はプロドラッグ、並びに薬学的に許容可能な担体を含む。

本発明の組成物は、投与単位処方物で、経口的、非経口的、吸入又は噴霧、経皮的、膣内、又は直腸から投与され得る。本明細書で使用するとき、用語非経口的とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、クモ膜下、心室内、腹膜、心臓内注射又は灌注技術並びに任意の多数の追加的組織又は臓器への直接注射を介することを包含する。

経口的使用に好適な本発明の組成物は、医薬組成物の製造のために当該技術分野で既知の任意の方法により調製され得る。例えば、本発明の組成物の液体処方物は、薬学的に有効かつ口当たりがよい異性体の調製物をもたらすために、甘味剤、可溶化剤、分散剤、風味剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有する。

錠剤組成物については、非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物での活性成分が、錠剤を製造するために使用される。このような賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マンニトール、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤又は崩壊剤、例えばコーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア；及び滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクが挙げられるが、これらに限定されない。この錠剤はコーティングされなくてもよく、又は胃腸管内での崩壊又は吸収を遅延させるために既知のコーティング技術によってコーティングされてもよく、これによって、所望の時間にわたる持続的治療効果をもたらすことができる。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートなどの徐放化物質が使用されてもよい。活性成分の遅延浸出をもたらす追加的錠剤処方物は、ヒドロゲル、浸透圧ポンプ錠剤、ワックスマトリックスの使用を含む、徐放性をもたらすよう使用され得る。

経口使用のための処方物はまた、活性成分が、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳糖、マンニトール、メチルセルロース又はその誘導体、若しくはカオリンと混合されている硬質又は軟質ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が水又は油媒質、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン又はオリーブ油と混合されている軟質ゼラチンカプセルとして存在することができる。

水性懸濁液については、本発明の化合物が、安定な懸濁液を維持するために安定である賦形剤と混合される。このような賦形剤の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。

経口懸濁液もまた、レシチン、又は脂肪酸との酸化アルキレンの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、又はヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの長鎖脂肪族アルコールとの酸化エチレンの生成物、若しくはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート又はポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの化合物などの分散剤又は湿潤剤を含むことができる。水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、並びに１つ以上の着色剤、１つ以上の風味剤、並びにショ糖又はサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含有してもよい。

上述したものなどの甘味剤、及び風味剤は、口当たりの良い経口調製物をもたらすよう添加され得る。これら組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって、保存されることが可能である。

水の添加によって水性懸濁液の調製に好適である分散性粉末又は顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の防腐剤と混合された活性成分をもたらす。好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、既に上記で述べられたものによって例示される。甘味剤、風味剤及び着色剤などの追加的賦形剤もまた存在してもよい。

本発明の医薬組成物は、水中油エマルジョンの形態であってもよい。この油相は、植物油、例えば、オリーブ油、ゴマ油、ピーナッツ油又はアラキス油、若しくは鉱油、例えば液体パラフィン又はこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤としては、天然ゴム、例えば、アカシアゴム又はトラガカントゴム、他の天然化合物、例えば、ダイズ、レシチン、Ｔｗｅｅｎ、並びに脂肪酸及びヘキシトールに由来のエステル又は部分的エステル、無水物、ソルビタンモノオレエート及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられるが、これらに限定されない。

シロップ及びエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はショ糖で処方され得る。このような処方物はまた、粘滑剤、防腐剤、並びに風味剤及び着色剤を含有してもよい。この医薬組成物は、無菌の注射可能な水性懸濁液又は油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記で述べたこれら好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術により処方され得る。無菌の注射可能な調製物もまた、非毒性の非経口の許容し得る希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。使用され得る許容可能なビヒクル又は溶媒の中には、水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。これに加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁溶媒質として通常使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の不揮発性油が使用されてもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能な調製物における使用に有用である。

実施例−カルジオジェニン主異性体及び対応する無糖体の単離及び活性
１．抽出
図５は、ＥＧＪからカルジオジェニン主異性体を生成するプロセスの概略概要を示す。それからＥＧＪメタノール抽出物を調製する全植物を、中国の貴州省から収集した。この植物は、日本、韓国、及び北アメリカの地域の固有種としても知られていて、これらの地域から収集した材料は、本発明に記載の精製プロセスを介して、高純度のカルジオジェニンをもたらすことが可能なＥＧＪの供給源として好適であるカルジオジェニンのレベルを同様に含有することが期待される。

収集した材料を乾燥し、室温で３回、それぞれを６日間ずつ、メタノールで浸透させた。ＥＧＪ抽出物を、スプレー乾燥手順を使用して、減圧下で乾燥して、粉末残渣を生成した。５００ｇのＥＧＪ抽出物を、メタノール中で、Ｔｉ＝４１℃で１時間攪拌した。室温までゆっくりと冷やした後に、懸濁液を濾別し、２００ｍｌのメタノールで濯いだ。フィルターケーキを、１．５Ｌのメタノール中に、Ｔｉ＝４１℃で１時間再懸濁し、室温で更に２０時間攪拌した。濾過後に、フィルターケーキを７５０ｍｌのメタノールで濯いだ。合わせたメタノール濾液を濃縮し、２８０ｇの粗生成物＃１を得た。

粗生成物＃１を、１ＬのＴＢＭＥ＋１．２Ｌの水中で攪拌し、濃厚なエマルジョンを得た。この濃厚なエマルジョンを、０．５Ｌのメタノールで希釈し、濾過して、フィルターケーキを０．５Ｌのメタノールで集中的に濯ぎ、合わせた濾液（３．２Ｌ）を２Ｌの最終容量まで濃縮した。この時点で、微細な水性メタノール性懸濁液が形成され、これを、圧力を加えることなく、紙フィルター上を通して濾過し、透明な暗色の均質溶液に仕上げることができた。次いで、この水性メタノール性溶液を、０．３Ｌのジクロロメタンで３回抽出した。残留する水性メタノール性層を０．９Ｌのｎ−ブタノールで、続いて０．８Ｌの水で希釈し、良好な相分離^１をもたらした。次いでこの水性層を０．３Ｌのｎ−ブタノールで洗浄した。合わせたｎ−ブタノール層（およそ３．５Ｌ）を、０．５Ｌの食塩水で洗浄し、１．４Ｌの水性層と２．５Ｌのｎ−ブタノール層とに仕上げた。このｎ−ブタノールをロータリーエバポレータで濃縮し、およそ０．５Ｌの溶媒を除去した。残留するｎ−ブタノール層（およそ２Ｌ）を、０．３Ｌの塩水で２回抽出した。ｎ−ブタノール層の完全な濃縮によって、最終的に３６．４ｇの粗生成物＃２に仕上げた。
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良好な相分離^１：あるいは、水性メタノール性懸濁液を、セライトの補助で、洗浄されたケーキで濾過することができる。次に、この水性メタノール性相を０．３〜０．６Ｌのジクロロメタンで３回抽出し、０．３〜０．６ＬのＴＢＭＥ部分で５回抽出する。この水性メタノール性相は、塩化ナトリウム飽和溶液に加えられ、最終的にｎ−ブタノールで抽出される。このプロセスは、ＤＣＭ抽出中のエマルジョン形成を低減し、激しい発泡を回避しつつ、メタンールを除去しようとする場合に、水性メタノール性相を濃縮する必要性を回避する。

２．ＨＰ−２０吸着クロマトグラフィー
５４５ｇの量の乾燥ＨＰ−２０樹脂（粗生成物＃２当たり、およそ１５質量等価物の乾燥樹脂）をメタノール中でスラリー化し、カラム（７．５ｃｍ×２１ｃｍ＝９２７ｍｌのカラム容量）に移し、２０％メタノール／水に交換した。粗生成物＃２を、１〜１．５容量の２０％メタノール／水に再懸濁させて、カラムにかけた。これを水中メタノールの増加する濃度（１０％段階）で溶出させた。２０〜３０％メタノール／水の段階については、２Ｌの２つフラクションを採取し、４０〜７０％メタノール／水の段階については、１Ｌの４つのフラクションを採取した。

フラクションをＨＰＬＣにより分析した。ほとんどのカルジオジェニン含量は、フラクション９〜１７中にある。フラクション９及び１０をプール−１として一緒にプールし、フラクション１１〜１７をプール−２としてプールし、フラクション１〜８及び１８〜２０は廃棄した。濃縮乾固後に、プール−１は、およそ３７０ｍｇのカルジオジェニンを含有する３．１７ｇの固体を産生し、一方プール−２は、およそ１．２ｇのカルジオジェニンを含有する５．４８ｇの固体を産生した。

３．順相フラッシュクロマトグラフィー
プール−２固体（５．４ｇ）を、３０ｍｌの出発溶離液ＤＣＭ／メタノール９０：１０中でスラリー化し、供給物を調製した。ＤＣＭ／メタノール９０：１０（ｖ：ｖ）で平衡化した１００ｇのシリカゲル（およそ２０質量等価物）上で、分離を実施した。１５０ｍｌの前溶出液を溶出させた後に、フラクションを５０ｍｌのアリコートで、フラクション３２まで採取し、次いで溶離液をＤＣ／メタノール８５：１５に変更して、１００ｍｌサイズのフラクションを採取した。フラクション４２で、溶離液をＤＣＭ／メタノール８０：２０に変更した。

フラクション３８及び３９を、プール−１１として一緒にプールし、フラクション４０〜４４をプール−２２としてプールし、並びにフラクション４５〜５１をプール−３３としてプールした。濃縮乾固後に、プール−１１は、およそ２１ｍｇのカルジオジェニン（１８．９％ｗ／ｗ）を含有する０．１１ｇの固体を産生し、プール−２２は、およそ３９１ｍｇのカルジオジェニン（５８．４％ｗ／ｗ）を含有する０．６７ｇの固体を産生し、並びにプール−３３は、およそ７７５ｍｇのカルジオジェニン（５７．０％ｗ／ｗ）を含有する１．３６ｇの固体を産生した。

４．逆相クロマトグラフィー
カルジオジェニンの全体の純度を増加させるために、以下のパラメータを使用して、逆相分離を実施した。

単離手順は、ＡＣＮをロータリーエバポレータで４０℃及び減圧で蒸発させること、引き続いて残留溶液を凍結乾燥することからなる。単離された泡状物を、ＡＣＮ／水中におよそ１：２（ｖ：ｖ）で再懸濁し、再度凍結乾燥して、ＮＨ_４ＯＡｃの残留痕跡を除去した。プール−２２及びプール３３を合わせて、６０ランで分離し、１．２９ｇの白色泡状物を産生した。図４に示すように、１．２９ｇの混合物は、９２．６％（ａ／ａ）の合わせたＨＰＬＣ純度を有する２つの異性体を含む。

５．キラル相クロマトグラフィー
１．２９ｇの混合物中の２つの異性体を分離するために、以下のパラメータを使用して、キラル相分離を実施した。

フラクション３及び４は、主としてカルジオジェニンの主異性体を含むが、フラクション１及び２は、主としてカルジオジェニンの副異性体を含む。フラクションを蒸発乾固し、同様な方法で再処理し、最大収率を確保した。フラクション１及び２並びにフラクション３及び４をそれぞれ合わせて、ワークアップした。このワークアップは、再度の蒸発乾固、これに続く、水：ＡＣＮ＝７５：２５（ｖ：ｖ）中の溶解後の凍結乾燥工程で構成された。このワークアップは、主異性体（９６．４９％ａ／ａ）については９００ｍｇの白色粉末を、副異性体については１８０ｍｇの白色粉末をもたらした。

６．負荷試験
互いから分離された２つのカルジオジェニン異性体が安定でありかつ互いに変換することがないかどうかを決定するために、負荷試験を実施した。具体的には、２つのカルジオジェニン異性体は、ＭＴＢＥ／ＩＰＡ＝５０：５０中に、又は４０℃で固体として２４時間保存されることで（主異性体が溶液中又は固体として、副異性体が溶液中のみで保存）、ストレス負荷された。

カルジオジェニン異性体の全ての単一の不純物ピーク及び２つの異性体の比もまた、測定の精度内で同一であった。組成物における変化も、方法の精度内で認められなかった。２つのカルジオジェニン異性体は安定な化合物であり、熱的ストレスに十分に耐えることとを結論付けることができた。

７．結晶化 単離された白色固体としてのカルジオジェニン主異性体（９００ｍｇ）を、透明な溶液が得られるまで、Ｔｏ＝４０℃で１０容量のメタノール中で攪拌した。水（４０容量）を、Ｔｏ＝４０℃で、５０分以内にゆっくりと加えた。水を約６滴加えた後に、結晶化が開始した。添加が完了後、濃厚な白色懸濁液を室温に冷やし、濾過して、残留固体を少量の母液でフラスコから流出させた。フィルターケーキを、メタノール／水（１：４）で洗浄し、ロータリーエバポレータで乾燥して、７５６ｍｇのカルジオジェニンを白色固体結晶として供給した。

結晶化後の単離したカルジオジェニン主異性体の純度は、２１０ｎｍでのＨＰＬＣによって示すように（図６参照）、９８．９７％ａ／ａであり、その同一性は^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析（図７参照）によって確認される。精製したカルジオジェニン主異性体の構造は、Ｘ線結晶解析法によって確認され、図８に図示する。これに加えて、^１Ｈ−ＮＭＲアッセイは、精製したカルジオジェニン主異性体の効力が９５．５０％ｗ／ｗであることを示す。

８．鹸化
単離したカルジオジェニン主異性体を、図１９に示すように、過剰のＮａＯＨを使用して、ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ １：１中で鹸化を受けさせた。単離したカルジオジェニン主異性体の得られた無糖体は、ＨＰＬＣによる少なくとも９２％の純度を有する。

９．生物学的活性
ＭＳＣｓの心原性分化を誘導することの活性に関して試験されたものは、５つの化合物であり、これは単離したカルジオジェニン主異性体（ＨＵＹＡ−１）、単離したカルジオジェニン副異性体（ＨＵＹＡ−２）、カルジオジェニン副異性体の無糖体（ＨＵＹＡ−３）、カルジオジェニン主異性体の無糖体（ＨＵＹＡ−４）、及びＣｈｅｎｇら、２００９の方法に従って調製されたカルジオジェニン組成物（Ｃａｒ）であった。図９〜１３のそれぞれで、Ｃ１８逆相クロマトグラフィープロファイルが、これら化合物に関して示されている。

試験は、以下に記載される手順に従って実施された：ラットの頸骨／大腿骨を除去し、αＩＭＤＭ培養基でＢＭ（骨髄）を骨から流出させた。このＢＭを十分に混合し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを３ｍｌの培養基で懸濁させて、形成した細胞懸濁液を、撹乱を最小限に抑えて、４ｍｌのＦｉｃｏｌｌ溶液上に注意深く配置し、次いで２００ｒｐｍで３０分にわたって遠心分離した。第２層を管に移し、ＰＢＳで二回洗浄してＦｉｃｏｌｌを除去した（１，２００ｒｐｍで５分間）。得られた細胞ペレットを、１０％の熱不活性化ＦＢＣ（ＧＩＢＣＯ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン抗生剤混合物を含有するＩＭＤＭ培養基中に再懸濁させて、これを試験用に使用した。２４時間の培養後に、非接着細胞を廃棄した。培地を３日毎に交換して、接着細胞を培養した。この細胞は、１４日間の培養後に、ほぼ集密状態になった。心原性形態学的移行を活性化するために、ＭＳＣｓをＨＵＹＡ−１、ＨＵＹＡ−２、ＨＵＹＡ−３、ＨＵＹＡ−４又はＣａｒ（ＩＭＤＭ培養基中１０μｇ／ｍｌ）の存在下で７日間培養した。処置時間依存的形態学的移行を、位相差顕微鏡で、経時的ベースで評価した。

ＨＵＹＡ−１、ＨＵＹＡ−２、ＨＵＹＡ−３、ＨＵＹＡ−４又はＣａｒ（ＩＭＤＭ培養基中１０μｇ／ｍｌ）を有する培養中のＭＳＣｓの３日又は７日処置後に、それぞれで、インビトロでの処置されたＭＳＣｓの心原性分化を立証するために、処置後３日では初期心原性分化因子２（ＭＥＦ２ａ）に特異的な抗体を使用して、並びに処置後７日では収縮タンパク質ミオシン重鎖β（ＭＥＦ２ａ β）蛍光免疫細胞化学法を実施した。蛍光免疫染色に関する方法が簡単に概説される：培養した細胞をＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定化し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間、透過性にした。抗体の希釈物は以下のようである：ラットＭＥＦ２ａに特異的なウサギポリクローナル抗体（１：５００）及びＭＨＣに特異的なマウスモノクローナル抗体（１：５００）（両抗体はａｂｃａｍ（登録商標）から入手）。二次抗体は、フルオロホア（ＦＩＴＣ ４９６／５２８及びＣｙ５ ６５０／６６７、ａｂｃａｍ（登録商標）の製品）と複合化した、それぞれヤギ抗−マウス及びウサギ抗−ＩｇＧ抗体であった。核はＤＡＰＩで染色された。蛍光顕微鏡で検証されたものは、培養されたＭＳＣｓの心原性分化に関連する形態学的移行及び特異的マーカータンパク質の発現であった。

骨髄ＧＦＰ−ＭＳＣｓを、ＧＦＰ−遺伝子導入マウスの脛骨／大腿骨から単離した。このＧＦＰ−ＭＳＣｓを、ＨＵＹＡ−１（ＩＭＤＭ培養基中１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、新生児ＳＤラットから単離した心臓ミオサイトと共培養し、心臓の微細環境を疑似した。この培養を、蛍光顕微鏡下で毎日観察し、拍動するＧＦＰ−陽性細胞を同定し、培養したＧＦＰ−ＭＳＣｓの形態学的移行を測定した。

図１４及び１５に示すように、単離したカルジオジェニン主異性体（ＨＵＹＡ−１）が最も活性な化合物であって、これは培養したＭＳＣｓの２０％以上を、細胞培養において心原性分化へと誘導した。ＨＵＹＡ−１は、Ｃｈｅｎｇら ２００９により生成されたカルジオジェニン組成物（Ｃａｒ）よりも活性であった。カルジオジェニン主異性体の無糖体（ＨＵＹＡ−４）もまた、ＭＳＣｓを心原性分化へと誘導した。ＨＵＹＡ−１と比較されるこの低い活性は、ＨＵＹＡ−４の細胞培養基中のより低い溶解度のためであり得る。ＨＵＹＡ−４の溶解度を増加させるために、ＤＭＳＯ濃度が５％から１０％まで増加された。これらと比較して、単離されたカルジオジェニン副異性体（ＨＵＹＡ−２）及びその無糖体（ＨＵＹＡ−３）は、本質的に不活性であって、心原性ＭＳＣ分化の観察された誘導のみに関しては、本質的に不活性であった。

図１８は、共培養系において、ＨＵＹＡ−１がＧＦＰ−ＭＳＣｓの心原性分化を誘導し、拍動する心臓ミオサイトを形成することを立証する。

Claims (16)

1. 式
   
   を有する単離した化合物であり、２１０ｎｍで少なくとも９８％（ａ／ａ）ＨＰＬＣ純度を有する化合物。
2. 前記化合物が、２１０ｎｍで少なくとも９８．９７％（ａ／ａ）ＨＰＬＣ純度を有する、請求項１に記載の化合物。
3. 請求項１に記載の前記化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
4. ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から請求項１に記載の前記化合物を抽出する改善された方法であり、（Ａ）ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のメタノール性／水溶液を沈殿させかつ濾過して不必要な固体を除去することと、（Ｂ）ジクロロメタン及びＴＢＭＥで、前記メタノール／水溶液を相分離抽出することと、（Ｃ）ｎ−ブタノールで抽出することと、の工程を含む方法。
5. 請求項１に記載の化合物組成物を、物質充填に対する樹脂の最適質量比（１５：１）及びメタノール／水の段階濃度を使用する、低圧Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ−２０吸着クロマトグラフィーにかけること、続いて物質充填に対する樹脂の最適質量比（２０：１）及びジクロロメタン／メタノールの段階濃度を使用する低圧シリカゲルクロマトグラフィーにかけることを更に含む、請求項４に記載の方法。
6. 請求項１に記載の化合物組成物を、濃度勾配プログラムで水性緩衝液及びメタノール移動相を使用する、高圧逆相クロマトグラフィーにかけることを更に含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記高圧逆相クロマトグラフィーが、Ｌｕｎa（登録商標）Ｃ１８（２）カラムを使用することを含む、請求項６に記載の方法。
8. 請求項１に記載の化合物を単離する方法であって、（Ａ）ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のメタノール抽出物から抽出物を得ることと、（Ｂ）前記抽出物をキラル相クロマトグラフィー又は超臨界液体クロマトグラフィーにかけること、の工程を含み、これによって前記化合物が獲得される、方法。
9. 前記キラル層クロマトグラフィーが、Ｃｈｉｒａｌａｋ ＩＣカラムを使用することを含む、請求項８に記載の方法。
10. （Ｃ）前記化合物を結晶化することを更に含む、請求項８に記載の方法。
11. 請求項１に記載の化合物を加水分解することによって得られる単離した無糖体。
12. 式
    
    を有する単離した無糖体であり、少なくとも９２％の純度を有する無糖体。
13. 請求項１２に記載の前記無糖体と薬学的に許容可能な担体とを有する医薬組成物。
14. 請求項３に記載の前記医薬組成物を、これを必要とする患者に投与することを含む、心筋を再生するための方法。
15. 請求項１３に記載の前記医薬組成物を、これを必要とする患者に投与することを含む、心筋を再生するための方法。
16. 間葉幹細胞を請求項１又は１２に記載の化合物を含む組成物に接触させることを含む、心原性分化を誘導又は増強するための方法。