JP2019043961A - 医薬タンパク質の新規な安定化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を安定化する方法を提供する。【解決手段】分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を含む溶液にメレジトースを添加することにより、前記分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を安定化する。【選択図】なし

Description

本発明は、分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を安定化する方法、分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の固体状態または液体状態の組成物、およびヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を安定化するためのメレジトースの使用に関する。

今日の製薬業界の製剤科学者にとって、治療用タンパク質の安定化は大きな課題である。凝集、沈殿、または変性等のタンパク質の可逆的変化および不可逆的変化の両方を引き起こし得る多くの種類の応力がある。これらの困難のため、これらのデリケートなタンパク質を安定化する薬剤が必要となる。製剤開発は重要なステップであり、精製プロセス中および製剤化プロセス中ならびに最終製品として高い収率でタンパク質活性が得られるように補形剤を注意深く選択する必要がある。これは特にヒト血液タンパク質およびヒト血漿タンパク質に当てはまる。

タンパク質製剤の安定化剤として最も広く使用されているのは炭水化物であり、糖類とも呼ばれる。炭水化物は、単糖と呼ばれる基本的炭水化物構成要素が連結されて構成されており、様々な長さであり得、そのため様々な特徴を有し得る。

最も一般的に使用されている２つの安定化剤であるスクロースおよびトレハロースはどちらも二糖であるので、２つの単糖から構成されている。

最も一般的に使用されている炭水化物安定化剤のうちの２つであるスクロースおよびトレハロースが二糖であるのに対して、メレジトースは三糖である。溶液状態および凍結乾燥状態の両方でタンパク質を安定化するための第１選択肢は二糖であることが一般的に示されている（非特許文献１および２）。ラクトースまたはマルトース等の一部の二糖は、固体状態での保存中にメイラード反応によってタンパク質を分解し得る還元糖である。凍結乾燥標品中で安定化剤として、より大きな糖類を用いた場合、タンパク質−安定化剤相互作用の立体障害のためあまり効率的でないことが文献中に示唆されている（非特許文献２）。

概説論文である非特許文献１は、とりわけ、マルトース、グルコースおよびマルトトリオースが１ｍｇ・ｍｌ^−１でカタラーゼ活性の回復を増加させ得るが、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、およびマルトヘプタオースはそれほど有効でないことを開示している。より大きな糖類による効果がないことから、糖類によるタンパク質安定化は、安定化させる糖類とタンパク質との間の分子間水素結合に干渉し得る糖のグルコシド側鎖の長さに依存し得ることが示唆される。この概説論文は二糖類を安定化剤として推奨している（９／１０頁）。

特許文献１は、鼻腔内投与可能なポリペプチド標品を調製するための、スタキオース、メレジトースならびに種々の単糖類および二糖類を含む炭水化物の使用を開示している。上記糖類は、噴霧中の剪断応力の影響を低減する薬剤として機能する。

特許文献２は、とりわけ、クロマトグラフィープロセス中の水和添加剤としてメレジトースを使用する、第ＶＩＩＩ因子のクロマトグラフィー精製を開示している。

特許文献３は、（ａ）乾燥状態および／または（ｂ）高温および／または（ｃ）照射下でデリケートな生体物質または有機化合物を保存する方法を開示しており、当該方法は、前記物質または化合物を含む系に、（ｉ）糖アルコール類およびその他の直鎖ポリアルコール類から選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元性グリコシド、または（ｉｉ）ラフィノース、スタキオースおよびメレジトースから選択される非還元性オリゴ糖、から選択される糖または糖誘導体を入れることを含む。

非特許文献３は、メレジトースおよびデンプンを含む固形製剤中におけるインスリンの安定性について報告している。

国際公開第２００３／０８６４４３Ａ号パンフレット 国際公開第８６／０４４８６Ａ号パンフレット 国際公開第９１／１８０９１Ａ号パンフレット

Wang W, Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals, Int J Pharm 203, 1-60, 2000 Carpenter J. F., Chang B. S., Garzon-Rodriguez W., Randolph T. W., Rational design of stable lyophilized protein formulations: Theroy and practice, chapter 5, ed Carpenter and Manning, Kluiwer Academic / Plenum Publishers, New York, 2002 Mollmann, S. H . et al, Drug Dev. Ind . Pharm. 2006 Jul; (6) : 765-78

本発明は、分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を含む溶液にメレジトースを添加することにより、分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質を安定化する方法を提供する。

好ましくは、上記ヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の分子量は１０ＫＤａを超える。より好ましくは、分子量は１０ＫＤａ〜３００ＫＤａである。最も好ましくは、分子量は２０ＫＤａ〜２００ＫＤａである。ヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の分子量が５０ＫＤａ〜１００ＫＤａ、１００ＫＤａ〜１５０ＫＤａ、または１５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであることが有益であり得る。

特に、分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質は薬学的または生物学的意義のあるタンパク質である。本発明によって安定化され得る分子量が１０ＫＤａを超える薬学的または生物学的意義のあるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質は、組換えにより生成されたヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質であってよい。

「タンパク質」という用語は、化学合成されたタンパク質、培養細胞の遺伝子にコードされる天然合成タンパク質および細胞によって分泌された組換えタンパク質を含む。組換えタンパク質とは、分子生物学的技術により細胞中に導入された導入遺伝子にコードされるものである。タンパク質は化学的方法によってまたは翻訳後プロセス中に酵素によって修飾されてよい。

本発明において、「タンパク質」は、ヒトのタンパク質、特に細胞培養によって産生されたものを含むが、更に、植物、昆虫等のその他の供給源のタンパク質および変異タンパク質、人工タンパク質、合成タンパク質、融合タンパク質またはキメラタンパク質も含む。

「分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質」という用語は、特に、ヒト血液凝固因子、例えばフィブリノーゲン、フィブリンモノマー、プロトロンビン、トロンビン、ＦＶ、ＦＶａ、ＦＸ、ＦＸａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、ＦＸＩＩＩ、ＦＸＩＩＩａ、フォン・ヴィルブランド因子、ＡＤＡＭＴＳ１３等、輸送タンパク質、例えばアルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモグロビン、ヘモペキシン等、プロテアーゼ阻害剤、例えば６−アンチトロンビン、α−アンチトロンビン、α２−マクログロブリン、Ｃ１インヒビター、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣインヒビター（ＰＡＩ−３）、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ等、免疫グロブリン、例えばポリクローナル抗体（ＩｇＧ）、モノクローナル抗体、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ベンス・ジョーンズタンパク質等、細胞関連血漿タンパク質、例えばフィブロネクチン、トロンボグロブリン、血小板因子４等、アポリポタンパク質、例えばａｐｏＡ−Ｉ、ａｐｏＡ−ＩＩ、ａｐｏＥ、補体因子、例えば因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｈ、因子Ｉ、Ｃ３ｂ不活性化因子、プロペルジン、Ｃ４結合タンパク質等、成長因子、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および肝細胞成長因子、抗血管新生タンパク質、例えばｌａｔｅｎｔ−アンチトロンビンおよびｐｒｅｌａｔｅｎｔ−アンチトロンビン等、高グリコシル化タンパク質、例えばアルファ−１−酸糖タンパク質、アンチキモトリプシン、インター−α−トリプシンインヒビター、α−２−ＨＳ糖タンパク質、Ｃ反応性タンパク質、ならびにその他の分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質、例えばヒスチジンリッチ糖タンパク質、マンナン結合レクチン、Ｃ４結合タンパク質、フィブロネクチン、ＧＣ−グロブリン、プラスミノーゲン、α−１ミクログロブリン、Ｃ反応性タンパク質、血液因子、例えばエリスロポイエチン、インターフェロン、腫瘍因子、ｔＰＡ、ｇＣＳＦならびにその誘導体および変異タンパク質を含む。特に興味深いのは、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｇ−ＣＳＦ、ｖＷＦ、アンチトロンビン（ＡＴ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ポリクローナルＩｇＧ、アルファ−１アンチトリプシン、因子Ｈ、因子Ｉ、Ｃ１−エステラーゼインヒビター、第ＶＩＩ因子およびこれらの組合せである。しかし、インスリンは単純に分子量が約５，７００Ｄａであるので、インスリン等のポリペプチドは「分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質」という用語に含まれない。

「ヒト血液タンパク質」および「ヒト血漿タンパク質」という用語は、誘導体、特に半減期が延長されるように改変された分子を含む。半減期延長のための改変としては、限定されるものではないが、融合タンパク質、突然変異誘発によって修飾されたタンパク質および共有結合または非共有結合によりコンジュゲートに連結されたタンパク質が含まれる。本発明によれば、ヒト血漿タンパク質またはヒト血液タンパク質は、特に分子の分子量を２０〜２００ＫＤａにするようにヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）分子に共有結合していてよい。

分子量に言及する場合、これは化合物の分子量を指す（すなわち、タンパク質に共有結合した任意の化学物質の分子量を含む）。

本発明は、特に、溶液を固体状態に転移させる方法を提供する。

本発明は、医薬品のための分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の新規な安定化剤の発見に関する。

驚くべきことに、組換え第ＶＩＩＩ因子（１７０ＫＤａ）、第ＩＸ因子（５５ｋＤａ）およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ（１２０ｋＤａ）等の分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の安定化剤としてメレジトースを用いることができることが見出された。同様な分子量のヒト血液タンパク質およびヒト血漿タンパク質は同様な安定化要件を有することが予想される。例えば、第ＩＸ因子は、ビタミンＫ依存性のヒト血漿タンパク質であり、他の全てのビタミンＫ依存性のヒト血漿タンパク質と生化学的類似点を有する。Ｇｌａドメインはこれら全てのビタミンＫ依存性タンパク質に共通する構造的特徴であり、Ｇｌａドメインのすぐ後ろに各タンパク質（プロトロンビンを除く）は１または複数のＥＧＦ様ドメインを有する。ビタミンＫ依存性タンパク質はその生理学的機能を発揮するためにＣａ^２＋イオンを必要とし、カルシウム結合部位には少なくともＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメインが含まれる。カルシウム結合により、これらのタンパク質はリン脂質／細胞膜に結合でき、したがってその生物学的活性を完全に発揮することができる。７個のヒト血漿タンパク質がその生合成についてビタミンＫ依存性であることが知られている。これらは、プロトロンビン（第ＩＩ因子、７２ＫＤａ）、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子（５０／５０ＫＤａ）、第ＩＸ因子（５５ＫＤａ）または第ＩＸａ因子、第Ｘ因子（５９ＫＤａ）または第Ｘａ因子、プロテインＣ（６２ＫＤａ）、プロテインＳ（６９ＫＤａ）およびプロテインＺ（６２ＫＤａ）である。

驚くべきことに、分子量が２０〜２００ＫＤａのヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）分子に共有結合したヒト血液タンパク質およびヒト血漿タンパク質がメレジトースを用いた安定化に適していることが見出された。

メレジトースは、凍結乾燥製剤および溶液の両方においてタンパク質活性を維持する優れた能力を示した。

本発明において、溶液を固体状態に転移させるステップは、メレジトース添加後の凍結乾燥である。メレジトースをトレハロースまたはスクロース等のその他の糖と併用してもよい。メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅまたはｍｅｌｉｃｉｔｏｓｅ）は、例えばＣｉｎａｒａ ｐｉｌｉｃｏｒｎｉｓ等のアブラムシを初めとする植物の樹液を食べる多くの昆虫により酵素反応で生成される非還元性の三糖である。ＩＵＰＡＣ名は（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−［［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，５−ビス（ヒドロキシメチル）−３−［［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシルメチル）−２−テトラヒドロピラニル］オキシ］−２−テトラヒドロフラニル］オキシ］−６−（ヒドロキシルメチル）−テトラヒドロピラン−３，４，５−トリオールである。

メレジトースの分子量は５０４．４４ｇ／ｍｏｌである。

代表的な構造は以下の式で表される。

通常、メレジトースは約１０００ｍＭまでの量で存在する。下限は目的のタンパク質に対する十分な安定化効果が得られるメレジトースの量によって異なる。実施例の方法論および当業者の通常の知識を用いて当業者は好適な量を容易に決定することができる。可能な範囲は、例えば、最終製剤に関連して、１０ｍＭ〜約２００ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭである。

好ましくは、量は２０ｍＭ超または３０ｍＭ超である。

好ましくは、ヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の量に対するメレジトースの量は、重量に基づく計算で、１：１０〜１：５０００、好ましくは１：５０〜１：１５０または１：１０００〜１：３０００であり、すなわち、メレジトースの量はタンパク質の量より多い。

好ましい実施形態では、薬学的１回投与量のタンパク質中に１０〜１００ｍｇのメレジトースが含まれる。

本発明の主題は、分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質およびメレジトースを含む組成物である。当該組成物は液体または固体状態で存在し得る。

本発明の一実施形態では、本発明の組成物は、増量剤、界面活性剤、緩衝剤、更なる安定化剤および／または浸透圧調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を更に含んでいる。

本発明に係る界面活性剤は、表面および界面に吸着し、それにより、吸着によるタンパク質の活性消失を抑制する化合物である。この種の活性消失は、製薬プロセス全体ならびに患者への投与前および投与中における再構成された製品の取扱い中に起こり得る。一般的に用いられている界面活性剤はポリソルベート８０、ポリソルベート２０およびポロキサマー、特にポロキサマー１８８である。更に、アルブミン、特に組換えアルブミン等のタンパク質も界面活性剤として用いることができる。組換えアルブミンも本発明の実施形態に従って用いることができる。

ｐＨ緩衝剤とは、製剤化するタンパク質の最適なｐＨ範囲に緩衝する能力を有する化合物を指す。本発明は、適宜、クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、またはＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）をｐＨ緩衝剤として含む。緩衝剤は、タンパク質の機能性が維持される範囲にｐＨを維持する量で存在する。これはタンパク質によって異なる。各タンパク質の好ましい範囲、特に分子量が１０ＫＤａを超えるヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質の好ましい範囲は当業者に知られている。例として、クエン酸ナトリウムはｐＨを６．５〜７．５に維持する。クエン酸ナトリウムの好適な形態は二水和物の形態である。一般的に、本発明に係る組成物は、凍結乾燥形態であり得るが、凍結乾燥される溶液、凍結乾燥された組成物から再構成された溶液等の溶液形態も取り得る。

浸透圧調節剤とは、浸透圧のバランスをとるために製剤中に存在する化合物を指す。本発明は、適宜、塩化ナトリウム、アルギニン、グリシン、塩化カリウム、糖または糖アルコールを浸透圧調節剤として含む。

メレジトースは凍結乾燥保護特性を示すが、更なる凍結乾燥保護剤（ｃｒｙｏ／ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）が存在してもよい。これは、凍結乾燥プロセスの凍結ステップおよび乾燥ステップ中ならびにその後の凍結乾燥生成物の保存中におけるタンパク質活性の消失を更に低減または防止するために製剤中に存在する化合物である。本発明は、適宜、スクロースおよびトレハロース等の非還元性二糖ならびにマルトースおよびラクトース等の還元性二糖を更なる凍結乾燥保護剤として含む。

増量剤とは、凍結乾燥ケーキを機械的に支えるためおよび乾燥重量を増やすために製剤中に存在する補形剤を指す。増量剤は、塩化ナトリウムのように結晶状であってもよく、アルギニンのようにアモルファス状であってもよい。増量剤の量は、最終製剤に対して１０重量％まで可能である。本発明は、適宜、塩化ナトリウム、グリシン、マンニトール、スクロースまたはアルギニンを増量剤として含む。

本発明の更なる主題は、凍結乾燥製剤等の乾燥状態のタンパク質を長期間、少なくとも６ヶ月、好ましくは少なくとも１２ヶ月、より好ましくは少なくとも１８ヶ月、更により好ましくは２４ヶ月安定化するためのメレジトースの使用である。

以下に非限定的な例を用いて本発明を更に説明する。

活成分析−第ＶＩＩＩ因子
発色性アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）または１段階アッセイ（ｏｎｅ ｓｔａｇｅ ａｓｓａｙ）を用いて第ＶＩＩＩ因子活性を測定し、第ＶＩＩＩ因子の単位を国際単位（ＩＵ）で表した。

発色性アッセイは欧州薬局方に記載されている方法である。この方法は、補因子としての第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を測定する２段階の測光法である。第ＶＩＩＩ因子は第Ｘ因子を第Ｘａ因子へと活性化し、これが酵素切断されて、分光測定で定量可能な生成物が生じる。

１段階凝固アッセイ（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）は、リン脂質、コンタクトアクチベーター（ｃｏｎｔａｃｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）およびカルシウムイオンの存在下で第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の凝固時間を補正する第ＶＩＩＩ因子含有サンプルの能力に基づく。フィブリン塊（ｆｉｂｒｉｎ ｃｌｏｔ）が出現するまでの時間を１段階で測定する。

活成分析−第ＩＸ因子
１段階凝固アッセイおよび／または発色性アッセイを用いて第ＩＸ因子の生物学的活性を測定し、現在のＷＨＯの第ＩＸ因子濃縮物標準によって定義される国際単位（ＩＵ）で第ＩＸ因子の単位を表した。

１段階凝固アッセイは欧州薬局方に記載されている方法である。当該アッセイの原理は、リン脂質、コンタクトアクチベーターおよびカルシウムイオンの存在下で第ＩＸ因子欠乏血漿の凝固時間を補正する第ＩＸ因子含有サンプルの能力に基づく。フィブリン塊が出現するまでの時間を１段階で測定する。第ＩＸ因子活性は凝固時間に反比例する。

発色性アッセイは２段階の測光法である。第１段階では、トロンビン、リン脂質およびカルシウムの存在下で活性化第ＸＩ因子（ＸＩａ）が第ＩＸ因子を活性化して第ＩＸａ因子にする。第ＩＸａ因子はトロンビン活性化第ＶＩＩＩ因子（ＶＩＩＩａ）と酵素複合体を形成し、これがリン脂質およびカルシウムの存在下で第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子にする。第２段階では、第Ｘａ因子が第Ｘａ因子特異的発色基質を加水分解することにより、分光測定で定量可能な発色団基ｐＮＡを遊離させる。第ＩＸ因子活性は、生成した第Ｘａ因子の量に正比例する。

分析−組換えＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ
ＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ＨＰＬＣ分析
溶離液Ａでサンプルを０．１ｍｇ／ｍＬに希釈する。２０μｇをＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ １ｍＬカラム（ＧＥヘルスケア社、ドイツ、ミュンヘン）に注入する。
溶離液Ａ：２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
溶離液Ｂ：２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
流量：１ｍＬ／分
グラジエント：
０％〜８％、１．８〜２．０分
８％〜５２％、２．０〜１３．０分
５２％〜１００％、１３．０〜１３．６分

凝集したＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦはピーク幅が大きくなることが示されているので、ＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦのピーク幅を品質基準として取る。ピーク幅の増加は、熱応力または剪断応力の前後のＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦピーク幅の差として定義される。

実施例
組換え第ＶＩＩＩ因子
実験に用いる第ＶＩＩＩ因子は、欧州特許出願公開第１７３９１７９Ａ号（Schroder et al）に記載のプロセスに従ってヒト細胞系ＨＥＫ２９３Ｆ中で産生された組換えヒトＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。精製プロセスは、５つのクロマトグラフィーステップからなり、ヒトグリコシル化様パターン（Sandberg et al、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６０８２９号）を示す高純度の第ＶＩＩＩ因子タンパク質標品が得られた（Winge et al、国際公開第２００９／１５６４３０Ａ号）。

血漿由来第ＩＸ因子
これらの実験に用いる材料は、ＳＤ処理およびナノ濾過された高純度の第ＩＸ因子濃縮物である市販の製品Ｎａｎｏｔｉｖ（登録商標）に由来する。これらの実験に使用する前に、ゲル濾過カラムを用いて材料を更に精製し、第ＩＸ因子のモノマーピークをその後の実験に用いた。

組換えＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ
用いる細胞系は、無血清増殖に適応させたヒト胚腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）に由来する細胞系である。この宿主、ＨＥＫ２９３Ｆを、Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡコード配列を有する発現カセットで安定的にトランスフェクトした。カセットに強力なプロモーターを用いた。一般的なプロセスは欧州特許第１７３９１７９（Schroder et al）にも記載されている。

精製プロセスは、４つのクロマトグラフィーステップからなり、高純度なＧ−ＣＳＦタンパク質標品が得られた。Ｇ−ＣＳＦタンパク質を、分子量が約１００ＫＤａのヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体に結合させた。最後に、１ステップのクロマトグラフィーにより未反応ＨＥＳ誘導体およびＧ−ＣＳＦからＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦを精製し、全体の分子量が約１２０ＫＤａの分子を得た。

実施例１：溶液中でのメレジトースによるｒＦＶＩＩＩの安定化
調製
上記実験セクションの記載に従って組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を調製した。この実験では、溶液中のｒＦＶＩＩＩに対するメレジトースの安定化効果を、一般的に用いられている安定化剤であるトレハロースと比較した。ｒＦＶＩＩＩ濃度は１００ＩＵ／ｍｌとした。本実験で調べた製剤の組成を表１に示す。

製剤を＋２５℃で７日間保存して経時的タンパク質活性を評価した。一定の間隔でサンプルを取り、上記実験セクションに記載の通り、発色性アッセイで分析した。結果を、初期値に対するパーセンテージとして表２に要約する。

実施例１の結論：本実験は、驚くべきことに、メレジトースが、より低いモル濃度にも関わらず、溶液中のｒＦＶＩＩＩに対してトレハロースと同等な安定化効果を有することを示している。

実施例２：凍結乾燥形態でのメレジトースによるｒＦＶＩＩＩの安定化
調製
上記実験セクションの記載に従って組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を調製した。本実験では、凍結乾燥プロセス中および凍結乾燥製剤中でのメレジトースの安定化効果を、一般的に用いられている安定化剤であるトレハロースと比較した。ｒＦＶＩＩＩ濃度は１００ＩＵ／ｍｌとした。本実験で調べた製剤の組成を表３に示す。

溶液を１．５ｍｌずつ実験室規模の凍結乾燥器で凍結乾燥した。凍結乾燥ステップのタンパク質回収率は製剤２Ｂで９３％、製剤２Ａで８６％であった。経時的タンパク質活性を評価するために、凍結乾燥サンプルを＋２５℃および＋４０℃で最大４週間保存した。サンプルを注射用蒸留水１．５ｍＬで再構成し、上記実験セクションに記載の発色性アッセイで分析した。結果を表４に要約する。

実施例２の結論：驚くべきことに、本実験は、凍結乾燥ステップにおいてメレジトースがトレハロースより低いモル濃度でｒＦＶＩＩＩを保護できること、および保存中にメレジトースがトレハロースよりも良くｒＦＶＩＩＩを安定化することを示している。

実施例３：凍結乾燥形態でのメレジトースによるｒＦＶＩＩＩの安定化
調製
上記実験セクションの記載に従って組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を調製した。本実験では、凍結乾燥プロセスおよび凍結乾燥製剤中における種々の濃度のメレジトースの安定化効果を比較し、更に安定化効果を四糖であるスタキオースと比較した。ｒＦＶＩＩＩ濃度は１７０ＩＵ／ｍｌでとした。本実施例で調べた製剤の組成を表５に示す。

溶液を１．５ｍｌずつ実験室規模の凍結乾燥器で凍結乾燥した。凍結乾燥ステップのタンパク質回収率はメレジトースを含む製剤で９１〜１００％、安定化剤としてスタキオースを含む製剤３Ｄでは８４％であった。経時的タンパク質活性を評価するために、凍結乾燥サンプルを＋２５℃および＋４０℃で最大１２ヶ月保存した。

サンプルを注射用蒸留水１．５ｍＬで再構成し、上記実験セクションに記載の発色性アッセイで分析した。結果を表６にまとめる。

実施例３の結論：本実験は、メレジトースが凍結乾燥ステップおよび凍結乾燥形態中でのｒＦＶＩＩＩの安定化剤として極めて良く機能することを示している。本実験は更に、スタキオースがメレジトース含有製剤と比べて２５℃および４０℃の両方で保存中にあまり十分な結果を示していないことから、スタキオースが凍結乾燥製剤のための好ましい安定化剤でないことを示している。

実施例４：凍結乾燥形態でのメレジトースによる血漿第ＩＸ因子の安定化
調製
上記実験セクションの記載に従って血漿由来第ＩＸ因子（ｐＦＩＸ）を調製した。本実験は、ｐＦＩＸに対するメレジトースの安定化効果を調べる。ｐＦＩＸ濃度は１００ＩＵ／ｍｌとした。本実験で調べた製剤の組成を表７に示す。

溶液を１．５ｍｌずつ実験室規模の凍結乾燥器で凍結乾燥した。凍結乾燥サンプルを＋５℃、＋２５℃および＋４０℃で最大６ヶ月保存して経時的タンパク質活性を評価した。注射用蒸留水１．５ｍｌでサンプルを再構成し、上記実験セクションに記載の発色性アッセイで分析した。

結果
凍結乾燥ステップのタンパク質回収率は約１００％であった。安定性試験の結果を表８に示す。

実施例４の結論：本実験は、驚くべきことに、メレジトースが凍結乾燥形態の第ＩＸ因子の安定化剤として良く機能することを示している。

実施例５：凍結乾燥形態でのメレジトースによるＨＥＳ化組換えＧ−ＣＳＦの安定化
調製
上記実験セクションの記載に従って組換えＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ（ｒＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦ）を調製した。本実験では、凍結乾燥形態のｒＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦに対するメレジトースの安定化効果を、一般的に用いられている安定化剤トレハロースと比較した。ｒＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦ濃度は０．３ｍｇ／ｍｌとし、調べた製剤の組成を表９に示す。

溶液を１．５ｍｌずつ実験室規模の凍結乾燥器で凍結乾燥した。＋４０℃で４週間保存後に、上記実験セクションに記載のＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ法を用いてタンパク質回収率を測定した。結果を表１０に要約する。

実施例５の結論：本実験は、メレジトースが、ｒＨＥＳ−Ｇ−ＣＳＦに対して、等モル濃度の一般的に用いられている安定化剤トレハロースよりも優れた安定化効果を有することを示している。

実施例６：凍結乾燥ステップでのメレジトースによる血漿第ＩＸ因子の安定化
調製
上記実験セクションの記載に従って、血漿由来第ＩＸ因子（ｐＦＩＸ）を調製した。本実験では、四糖であるスタキオースと比べた凍結乾燥ステップでのｐＦＩＸに対するメレジトースの安定化効果を調べた。ｐＦＩＸ濃度は１００ＩＵ／ｍｌとした。本実験で調べた製剤の組成を表１１に示す。

溶液を１．５ｍｌずつ実験室規模の凍結乾燥器で凍結乾燥した。上記実験セクションに記載の発色アッセイで、凍結乾燥ステップ前後にサンプルを分析した。

結果
凍結乾燥ステップのタンパク質回収率は、製剤６Ａでは約１００％であったが、製剤６Ｂでは８４％であった。

実施例６の結論：本実験は、凍結乾燥ステップにおける第ＩＸ因子の安定化剤としてメレジトースが良く機能することを示している。しかし、スタキオースは、凍結乾燥ステップで有意な活性の消失が生じていることから、安定化剤として好適な候補ではない。

実施例６の結論：本実験は、凍結乾燥ステップにおける第ＩＸ因子の安定化剤としてメレジトースが良く機能することを示している。しかし、スタキオースは、凍結乾燥ステップで有意な活性の消失が生じていることから、安定化剤として好適な候補ではない。
（付記）本開示は以下の態様を含む。
＜１＞ 第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにそれらの変異タンパク質または誘導体からなる群より選択される、薬学的または生物学的意義のあるヒト血漿タンパク質または組換えヒト血漿タンパク質であり、分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を安定化する方法であって、
前記分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を含む溶液に、メレジトースを１０ｍＭ〜２００ｍＭとなるように添加すること、を含み、
塩化ナトリウム、アルギニン、およびグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の増量剤を添加すること、
ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、およびポリソルベート２０からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を添加すること、
クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ緩衝剤を添加すること、
をさらに含む、前記分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を安定化する方法。
＜２＞ 前記溶液を固体状態に転移させる、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 凍結乾燥により前記溶液を固体状態に転移させる、＜１＞に記載の方法。
＜４＞ 前記ヒト血漿タンパク質が溶液中で安定化される、＜１＞に記載の方法。
＜５＞ 前記メレジトースが、前記分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を含む溶液に、１０ｍＭ〜１００ｍＭとなるように添加される、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜６＞ 前記少なくとも１種の界面活性剤がポロキサマー１８８を含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７＞ 前記少なくとも１種の界面活性剤がポリソルベート８０を含む、＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜８＞ 前記少なくとも１種の界面活性剤がポリソルベート２０を含む、＜１＞〜＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９＞ 前記少なくとも１種のｐＨ緩衝剤がクエン酸ナトリウムを含む、＜１＞〜＜８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０＞ 前記少なくとも１種の増量剤が塩化ナトリウムを含む、＜１＞〜＜９＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１＞ 前記少なくとも１種の増量剤がアルギニンを含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２＞ メレジトース以外の少なくとも１種の安定化剤、および少なくとも１種の浸透圧調節剤を添加することをさらに含む、＜１＞〜＜１１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１３＞ 第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにそれらの変異タンパク質または誘導体からなる群から選択される、分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質と、
１０ｍＭ〜２００ｍＭのメレジトースと、
塩化ナトリウム、アルギニン、およびグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の増量剤と、
ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、およびポリソルベート２０からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤と、
クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ緩衝剤と、
を含む組成物。
＜１４＞ 液体または固体状態である、＜１３＞に記載の組成物。
＜１５＞ 液体状態である、＜１４＞に記載の組成物。
＜１６＞ メレジトース以外の安定化剤、および／または浸透圧調節剤を更に含む、＜１３＞〜＜１５＞のいずれか一項に記載の組成物。
＜１７＞ 第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにそれらの変異タンパク質または誘導体からなる群から選択される、分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を、プロセス内安定化中、凍結乾燥プロセス中、溶液中、精製中、もしくは産生中において安定化するための、または少なくとも６ヶ月である長期間安定化するための、
１０ｍＭ〜２００ｍＭのメレジトース；
塩化ナトリウム、アルギニン、およびグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の増量剤；
ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、およびポリソルベート２０からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤；ならびに
クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ緩衝剤、
の使用。
＜１８＞ 前記ヒト血漿タンパク質が溶液中で安定化される、＜１７＞に記載の使用。
＜１９＞ 前記産生が細胞培養での産生である、＜１７＞または＜１８＞に記載の使用。
＜２０＞ 有効期間を延長するために前記長期間安定化が行われる、＜１７＞〜＜１９＞のいずれか一項に記載の使用。
＜２１＞ 前記長期間安定化が行われ、前記長期間が少なくとも１２ヶ月である、＜１７＞〜＜２０＞のいずれか一項に記載の使用。

Claims (21)

1. 第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにそれらの変異タンパク質または誘導体からなる群より選択される、薬学的または生物学的意義のあるヒト血漿タンパク質または組換えヒト血漿タンパク質であり、分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を安定化する方法であって、
   前記分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を含む溶液に、メレジトースを１０ｍＭ〜２００ｍＭとなるように添加すること、を含み、
   塩化ナトリウム、アルギニン、およびグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の増量剤を添加すること、
   ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、およびポリソルベート２０からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を添加すること、
   クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ緩衝剤を添加すること、
   をさらに含む、前記分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を安定化する方法。
2. 前記溶液を固体状態に転移させる、請求項１に記載の方法。
3. 凍結乾燥により前記溶液を固体状態に転移させる、請求項１に記載の方法。
4. 前記ヒト血漿タンパク質が溶液中で安定化される、請求項１に記載の方法。
5. 前記メレジトースが、前記分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を含む溶液に、１０ｍＭ〜１００ｍＭとなるように添加される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記少なくとも１種の界面活性剤がポロキサマー１８８を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記少なくとも１種の界面活性剤がポリソルベート８０を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記少なくとも１種の界面活性剤がポリソルベート２０を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記少なくとも１種のｐＨ緩衝剤がクエン酸ナトリウムを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記少なくとも１種の増量剤が塩化ナトリウムを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記少なくとも１種の増量剤がアルギニンを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. メレジトース以外の少なくとも１種の安定化剤、および少なくとも１種の浸透圧調節剤を添加することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにそれらの変異タンパク質または誘導体からなる群から選択される、分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質と、
    １０ｍＭ〜２００ｍＭのメレジトースと、
    塩化ナトリウム、アルギニン、およびグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の増量剤と、
    ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、およびポリソルベート２０からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤と、
    クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ緩衝剤と、
    を含む組成物。
14. 液体または固体状態である、請求項１３に記載の組成物。
15. 液体状態である、請求項１４に記載の組成物。
16. メレジトース以外の安定化剤、および／または浸透圧調節剤を更に含む、請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦ、ならびにそれらの変異タンパク質または誘導体からなる群から選択される、分子量が５０ＫＤａ〜２００ＫＤａであるヒト血漿タンパク質を、プロセス内安定化中、凍結乾燥プロセス中、溶液中、精製中、もしくは産生中において安定化するための、または少なくとも６ヶ月である長期間安定化するための、
    １０ｍＭ〜２００ｍＭのメレジトース；
    塩化ナトリウム、アルギニン、およびグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の増量剤；
    ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、およびポリソルベート２０からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤；ならびに
    クエン酸ナトリウム、マレイン酸、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ緩衝剤、
    の使用。
18. 前記ヒト血漿タンパク質が溶液中で安定化される、請求項１７に記載の使用。
19. 前記産生が細胞培養での産生である、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
20. 有効期間を延長するために前記長期間安定化が行われる、請求項１７〜請求項１９のいずれか一項に記載の使用。
21. 前記長期間安定化が行われ、前記長期間が少なくとも１２ヶ月である、請求項１７〜請求項２０のいずれか一項に記載の使用。