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JP2018533365A - 組換えタンパク質の生産プロフィールの調節方法 - Google Patents

組換えタンパク質の生産プロフィールの調節方法 Download PDF

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JP2018533365A JP2018524423A JP2018524423A JP2018533365A JP 2018533365 A JP2018533365 A JP 2018533365A JP 2018524423 A JP2018524423 A JP 2018524423A JP 2018524423 A JP2018524423 A JP 2018524423A JP 2018533365 A JP2018533365 A JP 2018533365A
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Abstract

本発明は、細胞培養プロセス中に哺乳動物宿主細胞により発現される組換えタンパク質のグリコシル化を調節するための方法及び組成物に関する。また、二糖類又は三糖類を含む細胞培養培地中で、浸透圧を一定に維持しながら組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養する方法も開示される。

Description

本発明は、細胞培養プロセス中に哺乳動物宿主細胞により発現される組換えタンパク質のグリコシル化を調節するための方法及び組成物に関する。また、二糖類又は三糖類を含む細胞培養培地中で、浸透圧を一定に維持しながら、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養する方法も開示される。
治療用タンパク質又は抗体などのタンパク質のグリコシル化プロフィールは、例えば折りたたみ、安定性、及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ、抗体の治療効果に関与する機構の１つ）に対する影響による半減期及び親和性の変化を介した、タンパク質の生物学的活性に影響を及ぼす重要な特性である。グリコシル化は、目的のタンパク質の生産に使用される細胞株に、並びに細胞培養プロセス（ｐＨ、温度、細胞培養培地組成、原料ロット間のばらつき、培地濾過材料、空気など）に、大きく依存する。
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域のオリゴ糖に結合したフコース及び／又はマンノースの量に影響され、フコースの減少及び／又はマンノースの増加で活性の増強が見られる。実際、例えばフコシル化ＩｇＧと比較して、非フコシル化型は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）又は抗原結合能力の検出可能な変化無しで、ＦｃγＲＩＩＩａ結合能力の増強により劇的に増強されたＡＤＣＣを示す（Yamane-Ohnuki and Satoh, 2009）。同様に、高レベルのマンノース−５グリカンを示す抗体も、より高いＡＤＣＣを示した（Yu et al., 2012）。従って、ＡＤＣＣ応答が抗体活性の主要な治療メカニズムである場合、フコシル化の低下及び／又はマンノシル化の上昇を特徴とするグリコシル化プロフィールを有する組換え治療用タンパク質の調製方法の提供は有益である。非フコシル化及び／又は高度にマンノシル化された抗体の利点には、低用量で治療効果が達成されることも含まれる。しかし現在市販されている多くの治療用抗体は、生成物のＦｃ Ｎ−グリカンのコアフコシル化を担う固有の酵素活性を有する哺乳動物細胞株により生産されるため、高度にフコシル化されている。
グリコシル化（マンノシル化及び／又はフコシル化など）は治療の有用性及び安全性に影響を及ぼす可能性があるため、タンパク質グリコシル化の調節は、市販の治療用タンパク質又は抗体にとって特に重要である。さらに、バイオ後続品化合物の枠内において、組換えタンパク質のグリコシル化プロフィールの制御は、その組換えタンパク質のグリコシル化プロフィールが対照生成物のグリコシル化プロフィールに匹敵しなければならないため、非常に重要である。
可能な限り高い生産性を得るための培養条件の最適化は、組換えタンパク質生産の他の主要な目的の１つである。経済的な観点からは、わずかな生産性の上昇でさえ重要な意味を持つ可能性がある。多くの商業的に関連するタンパク質が、宿主細胞中で組換え生産されている。これは、効率的かつ費用効果の高い方法でこれらのタンパク質を生産する必要性につながる。残念なことに、組換えタンパク質生産の欠点の１つは、細胞培養が行われる条件が、通常、経時的な細胞生存活性の低下を促進し、効率及び全体的生産性の両方を低下させることである。
灌流培養、バッチ培養、及び流加バッチ培養は、組換えタンパク質を生産するための動物細胞を培養する基本的な方法である。特に流加バッチ法及び灌流法では、細胞中のタンパク質の生産を上昇させるために、しばしば誘導剤が培養培地に添加される。これらの誘導物質は、より望ましい生成物を生産するように細胞を誘導する。そのような薬剤の１つは酪酸ナトリウムである。しかし、細胞培養において酪酸ナトリウムを使用することの欠点は、細胞生存活性に著しく影響することである。例えば、Kim et al (2004) は、酪酸ナトリウムが、バッチ培養で組換えＣＨＯ細胞中のタンパク質生産を上昇させることができたが、生産の終了時（培養８日後）に、細胞生存活性が４５％未満であることを示した。灌流バッチ培養で同じ実験を繰り返したところ、著者らは、処理の６日以内に、細胞生存活性が１５％と低いことに気づいた。
誘導物質の使用はタンパク質生産を上昇させることができるが、細胞生存活性に関する欠点を考慮しなければならない。実際に、酪酸ナトリウムなどのよく知られた誘導物質の使用は、培養の約５日後に非生産的であり得るが、典型的な生産期間は流加バッチ方式では１２〜１５日間であり、灌流方式では最大４０〜４５日となり得る。
多くのタンパク質は、６日間を超える培養で細胞中で組換え生産されるため、許容し得る細胞生存活性をより長期間維持しながら、より効率的な生産を可能にする方法が必要である。
また、生産期間にわたって、高い細胞密度を維持し、採取力価を上昇させ、又は細胞生存活性の大きな低下を回避することにより、組換えタンパク質生産性を上昇させるだけでなく、グリコシル化プロフィール（例えば、フコシル化及び／又はマンノシル化プロフィール）を制御することも可能とする、培養条件及び生産方法が必要とされている。本発明は、組換えタンパク質の生産を上昇させるための、及び／又は生産効率に悪影響を与えることなく組換えタンパク質グリコシル化を調節するための、方法及び組成物を提供することにより、これらのニーズに取り組む。
発明の概要
ある態様において本発明は、組換えタンパク質を流加バッチ方式又はバッチ方式で生産する方法を提供し、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養することを含む。
別の態様において本明細書には、組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を、流加バッチ方式又はバッチ方式で培養する方法が開示され、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記宿主細胞を培養することを含む。
さらなる態様において本発明は、組換えタンパク質の生産を流加バッチ方式又はバッチ方式で上昇させる方法を提供し、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養することを含む。
別の態様において本明細書には、調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を生産する方法が開示され、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む。
さらに別の態様において本発明は、調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を生産する方法を提供し、前記方法は、二糖類又は三糖類を含む少なくとも１つの供給物質が補足された細胞培養培地中で、培養培地の浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む。
さらに別の態様において本発明は、誘導物質としての、及び／又は効率又は生産を改善するための、三糖類の使用を提供する。
本発明によれば、二糖類は好ましくはスクロースであり、三糖類は好ましくはラフィノースである。
浸透圧が一定で糖濃度が上昇する実験手法１の図である（実施例１参照）。黒い棒＝塩化ナトリウムの濃度、灰色の棒＝糖の濃度。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。９６ディープウェルプレートで１４日間培養したｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、ａ．増殖プロフィール、及びｂ．生存活性。生存細胞の密度及び生存活性の試料（Guava）を、作業日３、５、７、１０、１２、及び１４日に採取した。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１／ｍＡｂ１細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。ｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、ａ．作業日１４日における絶対採取力価、ｂ．作業日１４日における比生産性［ｐｇ／細胞／日］。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１／ｍＡｂ１細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。ｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、ｃ．対照に対するグリコシル化の絶対的変化；Ｕｎｋｎｏｗｎ＝不明、Ｇａｌ＝ガラクトシル化、Ｍａｎ＝高マンノース、Ｓｉａｌ＝シアリル化、ＮｏｎＦｕｃ＝非フコシル化、Ｆｕｃ＝フコシル化糖型。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ２細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。９６ディープウェルプレートで１４日間培養したｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ａ．増殖プロフィール、及びｂ．生存活性。生存細胞密度及び生存活性の試料（Guava）は、作業日３、５、７、１０、１２、及び１４日に採取した。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ２／ｍＡｂ２細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。ｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ａ．作業日１４日における絶対採取力価、ｂ．比生産性［ｐｇ／細胞／日］。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ２／ｍＡｂ２細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。ｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ｃ．対照に対するグリコシル化の絶対的変化；Ｕｎｋｎｏｗｎ＝不明、Ｇａｌ＝ガラクトシル化、Ｍａｎ＝高マンノース、Ｓｉａｌ＝シアリル化、ＮｏｎＦｕｃ＝非フコシル化、Ｆｕｃ＝フコシル化糖型。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１細胞に対する様々な濃度のスクロースの影響を示す。９６ディープウェルプレートで１４日間培養したｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、ａ．増殖プロフィール、及びｂ．生存活性。生存細胞密度及び生存活性の試料（Guava）は、作業日３、５、７、１０、１２、及び１４日に採取した。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１／ｍＡｂ１細胞に対する様々な濃度のスクロースの影響を示す。ｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、ａ．作業日１４日における相対採取力価、ｂ．比生産性［ｐｇ／細胞／日］。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１／ｍＡｂ１細胞に対する様々な濃度のスクロースの影響を示す。ｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、ｃ．対照に対するグリコシル化の絶対的変化；Ｕｎｋｎｏｗｎ＝不明、Ｇａｌ＝ガラクトシル化、Ｍａｎ＝高マンノース、Ｓｉａｌ＝シアリル化、ＮｏｎＦｕｃ＝非フコシル化、Ｆｕｃ＝フコシル化糖型。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ２細胞に対する様々な濃度のスクロースの影響を示す。９６ディープウェルプレートで１４日間培養したｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、増殖プロフィール（ａ）及び生存活性（ｂ）。生存細胞密度及び生存活性の試料（Guava）は、作業日３、５、７、１０、１２、及び１４日に採取した。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ２／ｍＡｂ２細胞に対する様々な濃度のスクロースの影響を示す。ｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ａ．作業日１４日における絶対採取力価、ｂ．比生産性［ｐｇ／細胞／日］。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ２／ｍＡｂ２細胞に対する様々な濃度のスクロースの影響を示す。ｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ｃ．対照に対するグリコシル化の絶対的変化；Ｕｎｋｎｏｗｎ＝不明、Ｇａｌ＝ガラクトシル化、Ｍａｎ＝高マンノース、Ｓｉａｌ＝シアリル化、ＮｏｎＦｕｃ＝非フコシル化、Ｆｕｃ＝フコシル化糖型。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。スピンチューブで１４日間培養したｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞の、ａ．増殖プロフィール、ｂ．生存活性。生存細胞密度及び生存活性の試料（ＶｉＣｅｌｌ）は、作業日３、５、７、１０、１２、及び１４日に採取した、ｎ＝２。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１細胞に対する様々なラフィノース濃度の影響を示す。スピンチューブで１４日間培養したｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞の、ａ．ＷＤ１４（Ｂｉａｃｏｒｅ）での絶対採取力価、ｂ．１日当たりの比細胞生産性［ｐｇ／細胞／日］。作業日５、７、１０、１２、及び１４日に、ｎ＝２で試料を採取した。 一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）での、ｍＡｂ１グリコシル化に対する様々なラフィノース濃度の影響（ｍＡｂ１を発現するｍＡｂ１細胞から示される、対照に対するグリコシル化の絶対的変化）を示す。Ｕｎｋｎｏｗｎ＝不明、Ｇａｌ＝ガラクトシル化、Ｍａｎ＝高マンノース、Ｓｉａｌ＝シアリル化、ＮｏｎＦｕｃ＝非フコシル化、Ｆｕｃ＝フコシル化糖型。 種々の浸透圧での、ｍＡｂ２細胞に対する２つのラフィノース濃度（０又は３０ｍＭ）の影響を示す。９６ディープウェルプレートで１４日間培養したｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ａ．増殖プロフィール、及びｂ．生存活性。生存細胞密度及び生存活性の試料（Guava）は、作業日３、５、７、１０、１２、及び１４日に採取した。培地中のラフィノースの補足は、「３０ｍＭラフィノース」（空の記号）と記す。 種々の浸透圧での、ｍＡｂ２／ｍＡｂ２細胞に対する２つのラフィノース濃度（０又は３０ｍＭ）の影響を示す。ｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ａ．ＷＤ１４での絶対採取力価、ｂ．比生産性［ｐｇ／細胞／日］。 種々の浸透圧での、ｍＡｂ２／ｍＡｂ２細胞に対する２つのラフィノース濃度（０又は３０ｍＭ）の影響を示す。ｍＡｂ２を発現するｍＡｂ２細胞から示される、ｃ．対照に対するグリコシル化の絶対的変化；Ｕｎｋｎｏｗｎ＝不明、Ｇａｌ＝ガラクトシル化、Ｍａｎ＝高マンノース、Ｓｉａｌ＝シアリル化、ＮｏｎＦｕｃ＝非フコシル化、Ｆｕｃ＝フコシル化糖型。培地へのラフィノースの補足は、「３０ｍＭラフィノース」（破線で示す）と記す。
発明の詳細な説明
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照のためその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられる刊行物及び出願は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなる部分も、先行発明のために、本発明が、そのような刊行物に先行する資格を有さないことを認めるものとして、解釈されるものではない。さらに、その材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において、本発明の理解を容易にするために、以下の定義が与える。
本明細書及び請求項で使用される場合、本明細書における「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」、及び”Ｂ”を含むことが意図される。
明細書全体及び図中で使用可能な略語「ＷＤ」は、作業日を意味する。
明細書及び請求項において使用される用語「細胞培養」又は「培養」は、インビトロの、すなわち生物又は組織の外部での、細胞の増殖及び繁殖を意味する。哺乳動物細胞のための適切な培養条件は当該分野で公知であり、例えばCell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies (2005)に教示されている。哺乳動物細胞は、懸濁状態で又は固体基材に付着させて培養することができる。
用語「細胞培養培地」、「培養培地」、「培地」、及びこれらの複数形は、任意のタイプの細胞を培養することができる任意の培地を指す。「基本培地」は、細胞代謝に有用な必須成分のすべてを含む細胞培養培地を指す。これには、例えば、アミノ酸、脂質、炭素源、ビタミン、及び無機塩が含まれる。ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所培地）、又は培地Ｆ１２（ハムのＦ１２培地）は、市販の基本培地の例である。あるいは、前記基本培地は、完全に自社内で開発された独占的培地であってもよく、ここでは「化学的に規定された培地」又は「化学的に規定された培養培地」とも呼ばれ、その全ての成分を化学式で記述することができ、既知の濃度で存在する。培養培地は、タンパク質及び／又は血清を含まなくてもよく、培養される細胞の必要性に応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子などの任意の追加の標準化合物を補足することができる。
「標準培地」という用語は、浸透圧が３００〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ又は約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇである細胞培養培地を指す。本発明において用語「標準培地」は、二糖類又は三糖類を含まないが、それ以外では、二糖類又は三糖類を含む培養培地と、成分の点で完全に類似している培地に使用される。例えば標準培地「Ａ」を使用する場合、培地「Ａ’」との唯一の相違点は、スクロースなどの二糖類又はラフィノースなどの三糖類の存在であり、おそらく塩中の濃度であろう（本発明の浸透圧は、塩中の濃度を変化させることにより一定に維持されるため）。
「供給培地」（及びその複数形）という用語は、消費される栄養素を補足するために培養中に補足物として使用される培地を指す。供給培地は、市販されている供給培地でも又は独自の供給培地（本質的に化学的に規定された供給培地）でもよい。
「バイオリアクター」又は「培養系」という用語は、好ましくはバッチ方式又は流加バッチ方式で細胞を培養することができる任意の系を指す。この用語には、特に限定されるものではないが、フラスコ、スタティックフラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、振盪チューブ、振盪ボトル、ウェーブバッグ、バイオリアクター、繊維バイオリアクター、流動床バイオリアクター、及びマイクロキャリア有り又は無しの攪拌タンクバイオリアクターが含まれる。あるいは「培養系」という用語はまた、マイクロタイタープレート、キャピラリー、又はマルチウェルプレートも含む。例えば０．１ミリリットル（０．１ｍＬ、非常に小規模）から２００００リットル（２００００Ｌ又は２０ＫＬ、大規模）までの任意のサイズ、例えば、０．１ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、０．０１Ｌ、０．１Ｌ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ（又は１ＫＬ）、２０００Ｌ（又は２Ｋ）、５０００Ｌ（又は５ＫＬ）、１００００Ｌ（又は１０ＫＬ）、１５０００Ｌ（又は１５ＫＬ）、又は２００００Ｌ（２０ＫＬ）を使用することができる。
用語「流加バッチ培養 (fed-batch culture)」は、消費される栄養素を補足するためのボーラス供給又は連続供給的培地補足が行われる、細胞の増殖方法を指す。この細胞培養技術は、培地調製、細胞株、及び他の細胞増殖条件に応じて、１０×１０6〜３０×１０6細胞／ｍｌを超えるオーダーの高い細胞密度を得る可能性を有する。種々の供給戦略及び培地調製により、２相性培養条件を作成し及び維持することができる。
あるいは、灌流培養を使用することができる。灌流培養は、細胞培養物が新鮮な灌流供給培地を受け取りながら、同時に使用済み培地を除去するものである。灌流は、連続的、段階的、断続的、又はこれらのいずれか又はすべての組み合わせであり得る。灌流速度は、１日あたり１作業容量未満から数作業容量まででもよい。好ましくは、細胞は培養物中に保持され、除去される使用済み培地は実質的に細胞を含まないか、又は培養物よりも著しく少ない細胞を有する。灌流は、遠心分離、沈降、又は濾過を含む多くの細胞保持技術により達成することができる（例えば、Voisard et al., 2003参照）。
本発明の方法及び／又は細胞培養技術を使用する場合、タンパク質は一般に培地中に直接分泌される。前記タンパク質が培地に分泌されると、そのような発現系からの上清は、まず市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮することができる。
生産作業の効率は、例えば生存細胞密度の上昇、細胞生存活性の低下、及び／又は採取力価の上昇により測定される。
本明細書で使用される「細胞密度」とは、所定容量の培養培地中の細胞の数を指す。「生存細胞密度」（ＶＣＤ）は、標準生存活性アッセイにより測定される、所定容量の培地中の生存細胞の数を指す。用語「より高い細胞密度」又は「より高い生存細胞密度」、及びその同等語は、対照培養条件と比較した場合、細胞密度又は生存細胞密度が少なくとも１５％上昇していることを意味する。細胞密度は、対照培養条件と比較して−１５％〜１５％の範囲内にある場合、維持されていると見なされる。用語「より低い細胞密度」又は「より低い生存細胞密度」、及びその同等語は、対照培養条件と比較した場合、細胞密度又は生存細胞密度が少なくとも１５％低下していることを意味する。
用語「生存活性 (viability)」又は「細胞生存活性 (cell viability)」は、培養中の細胞の総数に対する生存細胞の総数の比率を指す。生存活性は、培養開始時と比較して５０％以上であれば、通常許容される。生存活性は、しばしば採取時期を決定するために使用される。例えば流加バッチ培養では、生存活性が５０％に達するか又は培養後１４日後に、採取することができる。
用語「力価」は、溶液中の物質（ここでは目的のタンパク質）の量又は濃度を指す。本発明の文脈において、これは採取力価（採取時の力価）とも呼ばれる。これは、溶液を希釈しても依然として検出可能な量の目的の分子を含む、希釈の回数の指標である。これは日常的には、例えば目的のタンパク質を含む試料を連続希釈（１：２、１：４、１：８、１：１６など）し、次に適切な検出方法（比色法、クロマトグラフィーなど）を使用して、各希釈物を目的のタンパク質の検出可能なレベルの存在についてアッセイすることにより計算される。力価はまた、実施例の部で使用されているように、forteBIO Octet（登録商標）又は Biacore C（登録商標）などの手段により測定することもできる。
「比生産性 (specific productivity)」という用語は、１日に細胞１個について生産される物質（ここでは目的のタンパク質）の量を指す。
用語「より高い力価」又は「より高い比生産性」及びその同等語は、力価又は生産性が対照培養条件と比較して少なくとも１０％上昇していることを意味する。力価又は比生産性は、対照培養条件と比較して−１０％〜１０％の範囲にある場合、維持されていると見なされる。用語「より低い力価」又は「より低い生産性」及びその同等語は、力価又は生産性が、対照培養条件と比較した場合、少なくとも１０％低下していることを意味する。
「浸透圧（osmolality）」という用語は、溶液中の溶解粒子の総濃度を指し、１キログラムの溶媒中の溶質のオスモルで特定される。これは、通常ｍＯｓｍ／ｋｇとして表される。
本明細書及び請求項において使用される「調節されたグリコシル化プロフィール」は、スクロースなどの二糖類又はラフィノースなどの三糖類が補足されていない標準培地中で組換えタンパク質を発現する組換え細胞を培養することにより生産される同じタンパク質のグリコシル化プロフィールと比較して、調節されている組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質又は抗体）のグリコシル化プロフィールを含む。調節されたグリコシル化プロフィールは、前記タンパク質中のフコシル化レベル及び／又はマンノシル化レベルの調節を含み得る。ある実施態様において、調節されたグリコシル化プロフィールは、タンパク質のマンノシル化レベルの全体的な上昇及びフコシル化レベルの全体的な低下を含み得る。
本明細書で使用される用語「タンパク質」は、ペプチド及びポリペプチドを含み、２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物を指す。本発明によるタンパク質は、特に限定されるものではないが、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、融合タンパク質、抗体又はその断片を含む。治療用タンパク質は、治療に使用できるか又は使用されるタンパク質を指す。
用語「組換えタンパク質」は、組換え技術により生産されるタンパク質を意味する。組換え技術は十分に当業者の知識の範囲内である（例えば、Sambrook et al., 1989 及びその更新を参照）。
明細書及び請求項において使用される用語「抗体（antibody）」及びその複数形「抗体（antibodies）」は、特にポリクローナル抗体、親和性精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合断片、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂタンパク質分解断片、及び１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。キメラ抗体、ｓｃＦｖ及びＦａｂ断片、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドなどの遺伝子工学作成されたインタクトな抗体又は断片も含まれる。
「ヒト化（humanized）」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（通常マウス又はラット）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを与える非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを与えるヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる（ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒトＣＤＲを移植することによるヒト化、又はヒト定常領域に全非ヒト全体可変ドメインを導入（キメラ化）することによるヒト化）。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、これらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上が同一でなければならない。従って、エフェクター機能の調節が必要である場合、おそらくＣＤＲ及び重鎖定常領域のいくつかの残基を除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体を介して、生物学的半減期が延長し、ヒトへの投与時の有害な免疫反応の可能性が低下し得る。
明細書及び請求項において使用される用語「完全ヒト」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域とヒトＣＤＲとの両方を含む免疫グロブリンを指す。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、これらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。従って、エフェクター機能又は薬物動態学的特性の調節が必要とされる場合には、重鎖定常領域の恐らくわずかな残基を除いて、完全なヒト免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。いくつかの例では、結合親和性を改善し、及び／又は免疫原性を低下させ、及び／又は抗体の生化学的／生物物理学的特性を改善するために、ＣＤＲ、フレームワーク領域、又は定常領域内にアミノ酸変異を導入することができる。
用語「組換え抗体」は、組換え技術により生産される抗体を意味する。抗体の生成における組換えＤＮＡ技術の関連性のために、天然抗体に見出されるアミノ酸の配列に限定する必要はない。所望の特性を得るために抗体を再設計することができる。可能な変化は多くあり、わずか１個又は数個のアミノ酸の変化から、例えば可変ドメイン又は定常領域の完全な再設計までの範囲である。定常領域における変化は一般に、補体結合（例えば、補体依存性細胞毒性、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体との相互作用、及び他のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣ）、薬物動態学的特性（例えば、新生児Ｆｃ受容体への結合；ＦｃＲｎ）などの特性を改善、低下、又は改変するために行われる。可変ドメインの変化は、抗原結合特性を改善するために行われる。抗体に加えて、免疫グロブリンは、例えば１本鎖、又はＦｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ’）２、並びにダイアボディ、線状抗体、多価又は多重特異性ハイブリッド抗体を含む様々な他の形態で存在し得る。
本明細書で使用される用語「抗体部分」は、インタクトな又は完全長の鎖又は抗体の断片、通常は結合又は可変領域をいう。前記部分又は断片は、完全な鎖／抗体の少なくとも１つの活性を維持するはずであり、すなわち、これらは「機能的部分」又は「機能的断片」である。これらが少なくとも１つの活性を維持する場合、これらは標的結合特性を維持することが好ましい。抗体部分（又は抗体断片）の例には、特に限定されるものではないが、「１本鎖Ｆｖ」、「１本鎖抗体」、「Ｆｖ」、又は「ｓｃＦｖ」が含まれる。これらの用語は、重鎖と軽鎖の両方からの可変ドメインを含むが、定常領域（全て１つのポリペプチド鎖内である）が欠如した抗体断片を指す。一般に１本鎖抗体は、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、抗原結合を可能にする所望の構造を形成することが可能になる。特定の実施態様において、１本鎖抗体はまた、二重特異的及び／又はヒト化抗体であり得る。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖の可変ドメイン及びＣＨ１ドメインとからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。１つの軽鎖と１つの重鎖を含み、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成され得るように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間により多くの定常領域を含む「Ｆａｂ’断片」は、Ｆ（ａｂ’）２分子と呼ばれる。「Ｆ（ａｂ’）２」は、２つの軽鎖と、、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含み、こうして、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。いくつかの重要な用語を定義したため、ここで本発明の具体的な実施態様に注目することが可能になった。
本発明に従って生産され得る既知の抗体の例には、特に限定されるものではないが、アダリムマブ、アレムツズマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、ペゴール、セツキシマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、又はベドリゾマブが挙げられる。
ほとんどの天然に存在するタンパク質は、一次ペプチド鎖の長さに沿って、選択された数のアミノ酸への特異的な結合を介してペプチドに結合した、炭水化物又は糖部分を含む。従って、多くの天然に存在するペプチドは、「糖ペプチド」又は「糖タンパク質」と呼ばれ、又は「グリコシル化」タンパク質若しくはペプチドと呼ばれる。糖タンパク質に見られる主な糖は、フコース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）、Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）、及びシアル酸である。ペプチド鎖に結合したオリゴ糖構造は、「グリカン」分子として知られている。グリカンの性質は、これらが結合しているタンパク質の三次元構造及び安定性に影響を与える。天然に存在する糖ペプチドに見出されるグリカン構造は、「Ｎ結合型グリカン」又は「Ｎ−結合型オリゴ糖」（真核細胞の主な形態）と、「Ｏ−結合グリカン」又は「Ｏ−結合型オリゴ糖」の、２つの主なクラスに分けられる。真核細胞で発現されるペプチドは、典型的にはＮ−グリカンを含む。Ｎ−結合型糖タンパク質の糖基のプロセシングは、小胞体（ＥＲ）の内腔で起こり、ゴルジ体で続行される。これらのＮ結合グリコシル化は、ペプチド一次構造のアスパラギン残基上で、アミノ酸配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（Ｘはプロリン及びアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸残基）を含む部位上で起きる。
ＣＨＯ細胞により分泌される抗体又はその断片上に見出され得る主なグリカンは、表１に示される：
表１−主要なグリカン構造（凡例：灰色の四角：ＧｌｃＮＡｃ；中灰色の円：マンノース、薄灰色の丸：ガラクトース；灰色の三角：フコース；灰色の菱形：シアル酸）
「糖型（glycoform）」とは、結合したグリカンの数及び／又はタイプのみが異なる抗体又はその断片などの、タンパク質のアイソフォームをいう。通常、糖タンパク質を含む組成物は、前記糖タンパク質の多数の異なる糖型を含む。
グリカンの一次構造の決定のための技術は当技術分野で周知であり、例えば、Roth et al. (2012) 又は Song et al. (2014) に詳細に記載されている。細胞により生産されたタンパク質を単離し、これらのＮ−グリカンの構造を決定することは日常的である。Ｎ−グリカンは、糖を含む分枝（「アンテナ」とも呼ばれる）の数、及び前記分枝の性質において異なり、これは、ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２コア構造に加えて、例えばＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、フコース、及び／又はシアル酸を含むことができる。標準的な糖鎖鎖命名法の総説については、Essentials of Glycobiology, 1999を参照されたい。
フコシル化タンパク質は、少なくとも１つのフコース残基を含み、例えばＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及び／又はＧ２Ｆなどのグリカンを含む（表１参照）。
タンパク質上のＮ−グリカン構造は、少なくとも３つのマンノース残基を含む。これらの構造は、さらにマンノシル化することができる。Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、又はＭａｎ７などのマンノシル化グリカンは、高マンノースグリカンと呼ばれる（表１参照）。
「被験体(subject)」という用語は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、又はラットなどの哺乳類を含むことが意図される。より好ましくは、被験体はヒトである。
「誘導剤 (inducing agent)」、「誘導物質 (inducer)」、又は「生産増強剤 (productivity enhancer)」という用語は、細胞培養物に添加された場合に、生産能力又はタンパク質生産の上昇を可能にする化合物又は組成物（例えば培養培地）を指す。例えば、大腸菌（E. coli）生産について知られている誘導物質の１つは、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）であり、ＣＨＯ生産の誘導物質は、特に酪酸ナトリウム、ドキシサイクリン、又はデキサメタゾンである。
本発明は、生産作業の効率を高め、及び／又は治療用タンパク質又は抗体などの組換えタンパク質のグリコシル化プロフィールを調節するための、方法及び組成物を提供する。本発明は、抗体又は抗原結合断片の生産などのタンパク質製造のための細胞培養条件の最適化に基づき、生産の効率に悪影響を及ぼすことなく、より効率的な生産作業及び／又は調節されたグリコシル化プロフィール（好ましくはフコシル化の低下及び／又はマンノシル化の上昇）（すなわちＭａｎ５などの高マンノースグリカンの上昇）を有する組換えタンパク質の効率的な生産を与える。
驚くべきことに、スクロースなどの二糖類又はラフィノースなどの三糖類（これらは、培養培地又は供給培地の標準成分ではない）を補足し、培養培地の浸透圧を制御する細胞培養条件下では、組換えタンパク質の高マンノシル化糖型含量及び／又は組換えタンパク質のフコシル化糖型を調節することができることが示された。従って、細胞培養生産作業中、組換えタンパク質のグリコシル化プロフィール、例えば生産されている組換えタンパク質中のフコシル化レベル及び／又はマンノシル化レベルを調節することが望ましい場合、細胞培養物に、スクロースなどの二糖類又はラフィノースなどの三糖類が補足された細胞培養培地を供給して、浸透圧に作用しながら、前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地と比較して、好ましくはこれを一定に維持することができる（すなわち、浸透圧を、前記二糖類又は前記三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持する）。あるいは、前記培地の浸透圧が、前記二糖類又は前記三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持される限り、細胞培養培地は前記二糖類又は三糖類を既に含むことができる。また、二糖類又は三糖類が補足された細胞培養条件下で、前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地と比較して浸透圧を一定に維持しながら、より効率的な運転が達成され得ることも示された（例えば、より高いいＶＣＤ及び／又は細胞生存活性及び／又は全体の力価）。
Ｄ−（＋）−ラフィノース（本明細書ではラフィノース）：（Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシド）
Ｄ−（＋）−スクロース（本明細書ではスクロース）：α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシド
ある態様において本発明は、流加バッチ方式又はバッチ方式で組換えタンパク質を生産する方法を提供し、前記方法は、前記組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持しながら、培養することを含む。いくつかの好適な実施態様において、二糖類はスクロースであり、三糖類はラフィノースである。
あるいは本発明は、流加バッチ方式又はバッチ方式で組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養する方法を記載し、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その小有機分子を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持しながら、前記組宿主細胞を培養することを含む。いくつかの好適な実施態様において、二糖類はスクロースであり、三糖類はラフィノースである。
さらなる態様において本発明は、流加バッチ方式又はバッチ方式で組換えタンパク質の生産を上昇させる方法を提供し、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養することを含む。いくつかの好適な実施態様において、二糖類はスクロースであり、三糖類はラフィノースである。
さらに別の態様において、本発明は、得られる培養培地の浸透圧を標準培地の浸透圧と同様に維持しながら、誘導物質としての及び／又は少なくとも1つの生産作業の効率を改良するための、細胞培養培地中の二糖類又は三糖類の使用を提供する。
別の態様において本発明は、調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を生産する方法を提供し、前記方法は、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、培養培地の浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む。いくつかの好適な実施態様において、二糖類はスクロースであり、三糖類はラフィノースである。
さらに別の態様において本明細書には、調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を生産する方法が記載され、前記方法は、二糖類又は三糖類を含む少なくとも１つの供給物質が補足された細胞培養培地中で、前記培養培地の浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地の浸透圧と同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む。いくつかの好適な実施態様において、二糖類はスクロースであり、三糖類はラフィノースである。
好ましくは、全体として本発明の文脈において、タンパク質の調節されたグリコシル化プロフィールは、前記タンパク質におけるフコシル化レベル及び／又はマンノシル化レベルの調節を含む。特にフコシル化レベルの調節は、組換えタンパク質中の全フコシル化レベルの低下であり、及び／又はマンノシル化レベルの調節は、組換えタンパク質中の全マンノシル化レベルの上昇である。より詳しくは、フコシル化レベルの低下は、少なくともＧ０Ｆ及び／又はＧ１Ｆ形態の低下によるものであり、より詳しくは、フコシル化レベルの低下は、少なくともＧ０Ｆ形態の低下によるものである。より詳しくは、マンノシル化レベルの上昇は、少なくともＭａｎ５などの高マンノ−ス型の上昇によるものである。好ましくは、全フコシル化レベルは、約０．１％〜約９０％低下し、例えば約０．１％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％低下する。フコシル残基が完全に消失した場合、タンパク質はフコシル化されない。別の実施態様において、全マンノシル化量又はレベルは、約０．１％〜約１００％上昇し、例えば０．１％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％上昇する。あるいは、両方の修飾（すなわちフコシル化の低下とマンノシル化の上昇）は同時に起こる。
本明細書において、二糖類又は三糖類を含まない標準培地中で増殖させた細胞と比較した時、「細胞生存活性は実質的に又は顕著に低下しない」という用語は、細胞生存活性が対照培養物（すなわち二糖類又は三糖類なしで増殖した細胞）と比較して約１５％以上は低下しないことを意味する。
本明細書において、「生産の効率に負の影響を与えることなく」という用語又はその同等語は、生産の効率が、対照培養物（すなわち二糖類又は三糖類無しで増殖させた細胞）と比較して約１５％以上は低下させないことを意味する。本発明の文脈において、生産作業の効率は、細胞生存活性、生存細胞密度、及び／又は採取力価に基づいて測定することができるため、例えばＶＣＤが対照と比較して約−５％であるか、又は採取力価が対照と比較して約−１０％である場合、生産効率に悪影響はないと考えられる。
全体として本発明の文脈において、生産される組換えタンパク質は、治療用タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、例えばヒト抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、キメラ抗体又はその抗原結合部分であり得る。好ましくは、これは、抗体又はその抗原結合断片である。
本発明の方法は、低下したフコシル残基の量又はレベル及び／又は上昇したマンノシル残基の量又はレベルを有する、抗体などのタンパク質を生産するために使用され得る。そのような調節されたグリコシル化プロフィールを有する抗体は、ＡＤＣＣが上昇していることが実証されている。
全体として本発明の文脈において、ラフィノースなどの三糖類化合物は、好ましくは培養培地又は供給培地中に存在するか、又は培地若しくは供給培地に（例えば、補足物質として）、約０．００１ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度、さらに好ましくは約０．０１〜１００ｍＭの濃度、例えば約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、又は１００mMの濃度（培養培地又は供給培地中の、しかし培養系に入る前、すなわち接種前の三糖類の濃度）で加えられる。例えば、特に限定されるものではないが、三糖類の濃度を調整することにより、培養培地の浸透圧を一定に維持しながら、グリコシル化プロフィール及び生産作業の効率を調節することができる。あるいは、三糖類を補足供給物質として添加することができる。そのような場合、それは上記と同様の開始濃度で添加される。
全体として本発明の文脈において、スクロースなどの二糖化合物は、好ましくは培養培地若しくは供給培地中に存在するか、又は培地若しくは供給培地に例えば補足物質として）、約０．００１ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度、さらに好ましくは約０．０１〜１３０ｍＭの濃度、例えば約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、１００、又は１３０mMの濃度（培養培地又は供給培地中の、しかし培養系に入る前、すなわち接種前の三糖類の濃度）で加えられる。例えば、特に限定されるものではないが、二糖類の濃度を調整することにより、培養培地の浸透圧を一定に維持しながら、グリコシル化プロフィール及び生産作業の効率を調節することができる。あるいは、二糖類を補足供給物質として添加することができる。そのような場合、それは上記と同様の開始濃度で添加される。
本発明の目的において、細胞培養培地は、インビトロ細胞培養における哺乳動物細胞などの動物細胞の増殖に適した培地である。細胞培養培地の調製は当該分野で公知である。細胞培養培地は、培養中の細胞の必要性に応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、及び増殖因子などの追加の標準成分を補足することができる。好ましくは、細胞培養培地は動物成分を含まない。これらは、無血清及び／又は無タンパク質であり得る。標準培地は、３００〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、例えば約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。使用される培養培地が二糖類又は三糖類を含み、標準培地の浸透圧と同様の浸透圧を有する場合、前記培地は好ましくは、前記媒体中に通常存在する塩に応じて、好ましくはＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、及び／又はＣａＣｌ２などの塩が枯渇した培地である。二糖類又は三糖類が必要な濃度で添加されると、浸透圧は少なくとも１つの塩の導入により制御される。
本発明の特定の実施態様において、例えば培養の開始時に、及び／又は流加バッチで又は連続的に、細胞培養培地に二糖類又は三糖類が補足される。二糖類又は三糖類補足物質の添加は、測定された中間グリコシル化プロフィール、又は少なくとも１つの生産作業の測定された中間効率に基づくことができる。
全体として本発明の文脈において、組換え細胞、好ましくは哺乳動物細胞は、バイオリアクターなどの培養系で培養される。バイオリアクターには、スクロースなどの二糖類又はラフィノースなどの三糖類を含むか又は補足された培地中で生存細胞が接種される。好ましくは、培地は無血清及び／又は無タンパク質である。生産バイオリアクターに一旦接種されると、組換え細胞は指数増殖期を経る。増殖期は、場合により前記二糖類又は三糖類が補足された供給培地のボーラス供給を用いる流加バッチプロセスを使用して、維持することができる。好ましくは、供給培地は無血清及び／又は無タンパク質である。これらの補足ボーラス供給は典型的には、細胞培養が供給を必要とすると予想されるか又は決定された時点で、細胞がバイオリアクターに接種されたまもなく後に始まる。例えば補足供給は、培養のほぼ３日目又は４日目に、又は１日又は２日前若しくはそれ以降に開始することができる。培養物は、増殖期の間に２回、３回、又はそれ以上の回数、ボーラス供給を受けることができる。これらのボーラス供給の任意の１つは、場合により二糖類又は三糖類を含むか又はこれが補足され得る。二糖類又は三糖類の補足又は供給は、培養開始時に、流加バッチ培養で、及び／又は連続的に行うことができる。培養培地は、グルコースを含むことができ、又はグルコースを補足することができる。前記補足は、培養開始時、流加バッチ培養で、及び／又は連続的に行うことができる。
本発明の方法、組成物、及び使用は、多段階培養プロセスにおける組換えタンパク質の生産を改善するために使用され得る。多段階プロセスでは、細胞は２つ以上の異なる相で培養される。例えば細胞は、最初に1つ以上の増殖期で、細胞増殖及び生存活性を改善する条件下で培養され、次に生産期に移され、タンパク質生産を改善する条件下で培養される。多段階培養プロセスでは、培地の組成、ｐＨのシフト、温度のシフトなどの条件は、ある工程（又はある期）から他の工程に変化する。増殖期は、生産期より高い温度で実行できる。例えば増殖期は、約３５℃〜約３８℃の第１温度で実施され、次に温度は生産期のために約２９℃〜約３７℃の第２の温度にシフトされる。細胞培養物は、採取前数日又は数週間の生産期で維持することができる。
本発明のある実施態様において、宿主細胞は好ましくは、特に限定されるものではないが、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えばＮＳ０、ＳＰ２／０）、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。好適な実施態様において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
本発明で使用される細胞株（「組換え細胞」とも呼ばれる）は、商業的又は科学的に興味のあるタンパク質を発現するように遺伝子工学的に作成される。目的のポリペプチドを発現する細胞及び／又は細胞株を遺伝子工学作成するための方法及びベクターは、当業者に公知である；例えば様々な技術が、Ausubel et al. (1988, 及び更新版) 又は Sambrook et al.（1989、及び更新版）に記載されている。本発明の方法は、目的の組換えタンパク質を発現する細胞を培養するために使用することができる。組換えタンパク質は、通常培地中に分泌され、ここから回収することができる。次に、回収されたタンパク質は、商業的供給業者から入手可能な既知の方法及び生成物を使用して、精製又は部分的に精製することができる。次に精製されたタンパク質を医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物に適した製剤には、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1995に記載されているものが挙げられる。
調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質、例えば、低下したフコシル化レベル又は量及び／又は上昇したマンノシル化レベル又は量を有する、本発明の方法により生産される抗体又はその抗原結合断片を使用して、その組成物中の治療用タンパク質（抗体又はその抗原結合断片など）が治療に適切である被験体の任意の障害を治療することができる。
さらなる態様において、本発明の方法により生産された調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質と、医薬的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物も開示される。組換えタンパク質は、好ましくは治療用タンパク質であり、抗体又はその抗原結合部分、例えばヒト抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、キメラ抗体又は抗原結合部分であり得る。好ましくは、これは、低下したフコシル化レベル又は量及び／又は上昇したマンノシル化レベル又は量を有する抗体又はその抗原結合断片である。
特定の実施態様において、調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を含む本発明の医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体とともに医薬（治療用）組成物として調製することができ、当該分野で公知の様々な方法により投与することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1995 参照）。このような医薬組成物は、塩、緩衝剤、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール、アミノ酸、防腐剤、適合性担体、任意に他の治療薬、及びこれらの組合せの任意の１つを含むことができる。調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を含む本発明の医薬組成物は、当該分野で公知の形態で、液体製剤又は凍結乾燥製剤のような治療用途に許容される形態で存在する。当業者であれば、本明細書に記載された本発明は、具体的に記載されたもの以外の変形及び修飾が可能であることを理解するであろう。本発明は、その精神又は本質的な特性から逸脱することなく、すべてのかかる変形及び修飾を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書中で個別に又は集合的に記載された工程、特徴、組成物、及び化合物のすべて、及び前記工程又は特徴の任意の及び全ての組合せ又はその任意の２つ以上の組合せを含む。
従って本開示は、全ての態様で例示されており、添付の請求項に記載された本発明の範囲を制限されるものではなく、同等語の意味及び範囲内に入るすべての変更は、本発明に包含されることが意図される。
上記の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしかかるかかる実施例は、本発明の実施方法の例示であり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
材料と方法
Ｉ．細胞、細胞拡張、及び細胞増殖
１）細胞
アッセイは、２つのＣＨＯ細胞株を用いて行った：
・ ＩｇＧ１ ｍＡｂ１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞、本明細書では「細胞ｍＡｂ１」又は「ｍＡｂ１細胞」。「ｍＡｂ１」は、可溶性タンパク質に対する完全なヒトモノクローナル抗体である。その等電点（ｐＩ）は、約８．２０〜８．３０である。
・ ＩｇＧ１ ｍＡｂ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞、本明細書では「細胞ｍＡｂ２」又は「ｍＡｂ２細胞」。「ｍＡｂ２」は、細胞膜上に見られる受容体に対するヒト化モノクローナル抗体である。その等電点（ｐＩ）は、約９．３０である。
２）細胞の拡張
細胞の拡張は、細胞の拡張に適した培地でチューブ内で行った。少なくとも１週間の拡張後に、流加バッチでアッセイを開始した。
３）接種
ディープウェルプレート：ｍＡｂ２を発現する細胞を０．２×１０6細胞／ミリリットル（ｍＬ）で接種し、ｍＡｂ１を発現する細胞は０．３×１０6細胞／ｍＬで接種した。
スピントチューブ：ｍＡｂ１ｔｍＡｂ２の両方を発現する細胞を、０．３×１０6細胞／ｍＬで接種した。
４）流加バッチ
すべてのアッセイは流加バッチ培養で行った。
無血清の化学的に規定された培地を使用した。これをそのまま使用するか、Ｄ−（＋）−ラフィノース五水和物（Sigma-Aldrich, 83400-25G）を異なる濃度（０〜４５ｍＭ）で補足した。化学的に規定された供給培地並びにグルコースを、培養培地に定期的に供給して、グルコースレベルを＞０〜約８ｇ／Ｌの範囲に維持した。
培養を行った：
・ ４５０μＬの作業容量を有するディープウェルプレート内。これらを３６．５℃、５％ＣＯ2、湿度９０％でインキュベートし、３２０ｒｐｍで振盪した。流加バッチ培養のそれぞれは１４日間持続した。
・ 作業容量が３０ｍＬのスピンチューブ（ＳＴ）内（蓋は透水性）。これらに０．３×１０6細胞／ｍＬの細胞密度で接種し、３６．５℃、３２０ｒｐｍ、５％ＣＯ2及び湿度９０％で１４日間維持した。
ＩＩ．分析方法
生存細胞密度及び生存活性は、Guava easyCyte（登録商標）フローサイトメーターで測定した。
抗体力価は、ｆorteBIO Octet（登録商標）で測定した。
グリコシル化プロフィールは、レーザー誘導蛍光（ＣＧＥ−ＬＩＦ）を用いるキャピラリーゲル電気泳動により確立した。グリカンのグループは以後表２に定義した。
表２−同定されたグリカンの主要なグループ（凡例：灰色の四角：ＧｌｃＮＡｃ；中灰色の丸：マンノース、薄灰色の丸：ガラクトース、灰色の三角：フコース）
実施例１：浸透圧を一定に維持している間の二糖類若又は三糖類の添加の影響（ディープウェルプレート中、実験手法１）
高い浸透圧又は高い糖濃度が、細胞の生存活性、ＶＣＤ、及び高マンノース（ＨＭ）種の量に影響を及ぼすかどうかを調べるために、実験を行った。図１に例示されるように、標準培地と比較して低い浸透圧（ＰＭ−２００）を有する化学的に規定された独自の培地を使用して、糖濃度を１〜１５０ｍＭ（緑色）で変化させながら、標準培地の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）を、ＮａＣｌ（青色）を補足して維持した。標準培地とＰＭ−２００は組成が異なるため、原材料の欠如している量を追加した（ＮａＣｌを除く）。糖としてラフィノース（三糖類）及びスクロース（二糖類）が選択された。ストック溶液（ラフィノース２２ｍＭ、ラフィノース２２０ｍＭ、スクロース５０ｍＭ、スクロース１Ｍ、及びＮａＣｌ １Ｍ）を調製し、接種前に培地に添加した。
表３は、実験手法１及び２の異なる条件を要約する。ストック溶液は、希釈を防ぐために培地を使用して調製した。所定の濃度は、接種前の培地中の濃度と等しい。ｍＡｂ１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞（＝ｍＡｂ１細胞）を４９日間拡張させ、ｍＡｂ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（＝ｍＡｂ２細胞）を２８日間拡張した。

表３：実験手法１と２：１：浸透圧一定（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）であるが、糖濃度は上昇（０〜１２７．５ｍＭ）、２：糖濃度一定（０又は３０ｍＭ）で、浸透圧上昇（３００〜３７５ｍＯｓｍ／ｋｇ）、ｎ＝５〜６
結果：培養液中のｍＡｂ１細胞へのラフィノースの添加
浸透圧一定（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）であるがラフィノース濃度が上昇する場合の、ｍＡｂ１細胞増殖に対する影響は図２に示される。糖濃度が上昇すると、細胞増殖が阻害された。対照と濃度１ｍＭのラフィノースにより１６．２±１．０×１０6細胞／ｍＬの最大細胞濃度に達したが、１００ｍＭのラフィノースのみでは２．３±２．１×１０6細胞／ｍＬに達した。作業日０７日から、高いラフィノース濃度で細胞生存活性は低かった。最も高い生存活性は５ｍＭのラフィノースで達成され（約５７％）、対照は作業日１４日に約５３％を与えた。
図３ａは、一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）及び培地中のラフィノースの補足による、ＣＨＯ−Ｓ細胞の稼働日１４における絶対採取力価を示す。高濃度のラフィノース（８０〜１２７．５ｍＭ）を用いる条件は８２５〜９７５ｍｇ／Ｌの力価をもたらしたが、対照は約１８５０ｍｇ／Ｌに達した。１０ｍＭのラフィノースを用いる条件は、約２６５０ｍｇ／Ｌの最高力価を達成した。すべてをまとめると、１〜６５ｍＭのラフィノースを用いる条件は、対照より高い生成力価を与えた（データは示されていない）。比生産性［ｐｇ／細胞／日］を図３ｂに示す。ラフィノース濃度が上昇すると、比生産性も同様に上昇した。最高の比生産性（約４５ｐｇ／細胞／日）は、１００ｍＭのラフィノースで達成された。
５０ｍＭのラフィノースの補足は、ＨＭ種の量の最も高いパーセント上昇（６．８％）を達成した（図３ｃ）。糖濃度が上昇すると、ガラクトシル化、ＨＭ、及び非フコシル化種の上昇、並びにフコシル化種の低下が観察された。
要約すると実施例１は、一定の浸透圧でラフィノース濃度が上昇すると、増殖速度、生存活性、抗体生産、並びにｍＡｂ１のグリコシル化プロフィールに影響を及ぼすことを示す。１〜３０ｍＭのラフィノースを用いた培養は、作業日１４日に最高のＶＣＤ、生存活性、及び抗体濃度を示す．５０ｍＭのラフィノースでは、ＨＭの最大上昇（６．８％）が観察された。これは、高い糖濃度が細胞増殖を低下させるだけでなく、特異的抗体産生を上昇させ、ｍＡｂ１のグリコシル化プロフィールの顕著な変化をもたらすことを示す。
結果：培養液中のｍＡｂ２細胞へのラフィノースの添加
ｍＡｂ２細胞の増殖及び細胞の生存活性に対する一定の浸透圧とラムノース濃度の上昇の影響は、図４に示される。
図４ａは、糖濃度が上昇すると、ｍＡｂ２細胞の細胞増殖が低下することを示す。５ｍＭのラフィノースで、１１．８５±１．１×１０6細胞／ｍＬの最大細胞濃度が得られたが、対照は１１．３±１．４×１０6細胞／ｍＬの最大ＶＣＤに達した。最も低いＶＣＤは、追加の８０ｍＭラフィノースを用いる条件で得られた（６．４±１．７×１０6細胞／ｍＬ）。７日目から、糖濃度の上昇した条件の生存活性は低下した（図４ｂ）。高濃度のラフィノースを用いた培養物の生存活性は、作業日１４日における対照よりも顕著に低かった。
図５ａは、培地にラフィノースを補足した場合の、ｍＡｂ２細胞の作業日１４日の相対的な採取力価を示す。ラフィノース濃度が上昇すると相対採取力価は低下したが、５０ｍＭ及び１００ｍＭのラフィノースを含む条件では、最も高い抗体濃度を得た。１００ｍＭのラフィノースを用いる条件は約２３５０ｍｇ／Ｌを与えたが、対照は作業日１４日に約２１５０ｍｇ／ＬのｍＡｂ２を生産した。
比生産性は図５ｂに示される。対照と比較して、１００ｍＭのラフィノースを使用した条件を除いて、ラフィノースを上昇させた場合、ｍＡｂ２の生産性に変化はなかった。この条件は最も高い生産性を与えた（約３０ｐｇ／細胞／日）が、対照は約２２ｐｇ／細胞／日に達した。
より高い糖濃度では、ガラクトシル化、ＨＭ、及び非フコシル化種の上昇並びにフコシル化種の低下が観察された（図５ｃ）。１００ｍＭラフィノースの補足は、ＨＭ種を６．３％増加させた。
要約すると、ｍＡｂ１細胞の場合と同様に、一定の浸透圧でラフィノース濃度が上昇すると、増殖速度、生存活性、及び作業日１４日の絶対力価に影響を与える。グリコシル化の絶対的変化を示す図（図２４ｃ）は、ｍＡｂ１細胞を使用した実験手法と比較して、同様の傾向を示す。ガラクトシル化糖型が糖濃度の上昇とともに上昇するが、ｍＡｂ２細胞では上昇がより高かった。非フコシル化糖型は上昇し、フコシル化糖型はラフィノース濃度の上昇とともに低下した。ｍＡｂ２細胞を有する培養物のＨＭ種の最も高い上昇は、１００ｍＭにより得られた（６．３％）。
結果：培養中のｍＡｂ１細胞へのスクロースの添加
ｍＡｂ１細胞増殖に対する、一定の浸透圧を有するがスクロース濃度が上昇している実験手法の結果は、図６に示される。同様に、糖濃度の上昇とともに、細胞増殖は阻害された。１ｍＭスクロースで最大細胞濃度１８．２±１．７×１０6細胞／ｍＬに到達したが、試験した最大スクロース濃度（１２７ｍＭ）の条件では、９．６±３．２×１０6細胞／ｍＬに達した。
作業日７日以後、１ｍＭ、８０ｍＭ、及び１２７．５ｍＭスクロースを含む条件を除いて、生存活性は、スクロース濃度が高いほど対照よりも低かった。最高生存活性は１ｍＭ及び１２７．５ｍＭスクロースで得られ（約６３５％及び６４％）、対照では約５３％であった。
スクロースの濃度が上昇すると、１ｍＭ及び８０ｍＭ補足の条件を除いて、絶対採取力価は低下した。これらの条件は、作業日１４日に最高の絶対採取力価（約２８００ｍｇ／Ｌ及び２５５０ｍｇ／Ｌ）をもたらしたが、対照中の力価は約１８５０ｍｇ／Ｌであった（図７ａ）。
スクロース濃度が上昇しても、１ｍＭ及び８０ｍＭスクロースを用いる条件を除いて、作業日１４日の比生産性に変化はなかった（図７ｂ）。最も高い生産性は、８０ｍＭスクロースで得られた（約２６ｐｇ／細胞／日）。
１００ｍＭ及び１２７．５ｍＭのスクロースの補足は、ＨＭ種を１４．２％及び１４．３％上昇させた（図７ｃ）。より高い糖濃度では、ガラクトシル化、ＨＭ、及び非フコシル化種の上昇並びにフコシル化種の低下が観察された。
要約すると、最も高いＶＣＤは、対照及び以下の条件により得られる：１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭ、及び６５ｍＭスクロース。１ｍＭ、８０ｍＭ、及び１００ｍＭのスクロースを用いる条件は、作業日１４日に最も高い生存活性を示した。より高いスクロース濃度を用いる条件では、生存活性の上昇はおそらく培養中の細胞密度の低下によるものであった。最高のグリコシル化プロフィールは、最高のスクロース濃度（１００ｍＭ及び１２７．５ｍＭ）を用いる条件により得られ、１４．２％及び１４．３％ＨＭの上昇を示した。
これは、高い糖濃度が細胞増殖を低下させ比生産性を上昇させるという、上記実験（ＤＷＰ中のｍＡｂ１細胞 − ラフィノースの補給）の推定を確認している。
結果：培養中のｍＡｂ２細胞へのスクロースの添加
図８は、一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）と上昇したスクロース濃度を用いる実験手法のｍＡｂ２細胞からのＶＣＤ及び生存活性を示す。
１１．３±１．４×１０6細胞／ｍＬの最大細胞濃度が対照で得られたが、１０ｍＭスクロースの条件では１１．１±１．６×１０6細胞／ｍＬのＶＣＤに達した。最も低いＶＣＤは１２７．５ｍＭスクロース（６．９±１．１×１０6細胞／ｍＬ）の条件で得られた。作業日０７日から、糖の増加に伴う生存活性の低下が観察された。
図９ａは、培地にラフィノースを補足した場合の、作業日１４日のｍＡｂ２細胞の絶対採取力価を示す。スクロースの補足は、対照に対する抗体産生の低下をもたらした。対照（約２１５０ｍｇ／Ｌ）と５０ｍＭスクロース（約２１００ｍｇ／Ｌ）により最高の絶対力価が得られ、最低濃度は５ｍＭスクロースで得られた（約７００ｍｇ／Ｌ）。
作業日１４日の５０ｍＭ（約２１ｐｇ／細胞／日）及び１２７．５ｍＭスクロース（約２４ｐｇ／細胞／日）を用いる条件を除いて、対照（約２２ｐｇ／細胞／日）と比較して比生産性は低かった（図９ｂ）。
図９ｃは、対照に対するグリコシル化プロフィールの変化を示す。１２７．５ｍＭスクロースの補足は、ＨＭ種を９．１％増加させた；１００ｍＭスクロースは、ＨＭ種の量を６．０％増加させた。より高い糖濃度では、ガラクトシル化、ＨＭ、及び非フコシル化種の増加並びにフコシル化種の減少が観察された。
要約すると、培養の過程で、スクロース補足培養物の生存活性は対照の生存活性よりも低かった。作業日７日以後、週末にわたる低すぎると思われるグルコースレベル又は他の培地成分の限界のために、ＶＣＤが顕著に低下した。この推定は、グルコース及び主供給物質が再び供給された後の作業日１２日におけるＶＣＤの上昇により確認される。スクロースが補足された培養物の作業日１４日の絶対採取力価及び比生産性は、対照の力価より顕著に低かった。ｍＡｂ１細胞と比較して、ＨＭ及び非フコシル化糖型の上昇は低かった。同様に、フコシル化グリカンの低下はより低かったが、ガラクトシル化の上昇はｍＡｂ２細胞でのみ得られた。
実施例２：浸透圧を一定に維持している間の二糖類若又は三糖類の添加の影響（スピンチューブ中、実験手法１）
実施例１の結果を検証するために、５０ｍＬのスピンチューブ中で細胞ｍＡｂ１（２７日間の拡張）を用いて、実験手法１を表４に与えられた条件を用いて繰り返した。再度、所定の浸透圧及び濃度は、接種前の条件と等しい。

表４：浸透圧一定（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）であるがラフィノースの濃度（０〜１００ｍＭ）を上昇させた４つの実験条件。ｎ＝２
結果：培養中のｍＡｂ１細胞へのラフィノースの添加
一定の浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）及びラフィノース濃度の上昇を用いる第２の実験を、作業容量３０ｍＬ及びｍＡｂ１細胞とを有するスピンチューブ中で行った。図１０ａは、スピンチューブ中で一定の浸透圧と上昇したラフィノース濃度を用いる実験手法のｍＡｂ１細胞からのＶＣＤ及び生存活性を示す。最大細胞濃度１７．８±０．２×１０6細胞／ｍＬが、対照と１０ｍＭラフィノースで得られた（１７．８±０．２×１０6細胞／ｍＬ）。最低ＶＣＤは、図１０ｂに示すように、１００ｍＭラフィノース（１０．２±０．２×１０6細胞／ｍＬ）で得られた。しかしこの条件は、培養終了時に最良の生存活性（約８６％）を示し、最悪の生存活性（約５２％）は対照で観察された。
図１１ａに示すように、作業日１４日の抗体の最高濃度（約２２００ｍｇ／Ｌ）は、１０ｍＭラフィノースの条件により達成されたが、対照では約１８４０ｍｇ／Ｌに達し、従って最も低い力価に達した。ラフィノースの補足を用いる条件では全て、対照より良好な生産性を示した（図１１ｂを参照）。対照は約１４ｐｇ／細胞／日の比生産性を有したが、細胞の１日当たりの最高生産性（ＰＣＤ）は１００ｍＭラフィノースを用いる条件で得られ（約２３ｐｇ／細胞／日でピーク）、生産性の上昇を達成した（約６４％）。５０ｍＭ及び１００ｍＭラフィノースを有する培養物のＰＣＤは、１０ｍＭのラフィノースを用いる条件及び対照よりも急な傾きを示した。
ラフィノースの補足は、Ｍａｎ５及び非フコシル化の量の増加並びにフコシル化糖型の減少を可能にした（図１２）。１００ｍＭのラフィノースでは、Ｍａｎ５が７．７％増加し、フコシル化グリカンが１５．９％減少した。未知のガラクトシル化及びシアリル化糖型の絶対変化は影響を受けなかった。
ラフィノース濃度が上昇すると、アルカリアイソフォームの量は減少したが、酸アイソフォーム及び凝集物の量が増加した（データは示していない）。
補足されたラフィノースを含む培養物からの絶対採取力価は、対照よりも高かった（図１１ａ）。ＤＷＰでの同じ実験手法と比較して、この培養物は同様の挙動を示したが、１〜６５ｍＭのラフィノースの場合みであった。１００ｍＭラフィノースの条件のＶＣＤは最低であったが、作業日１４日の抗体濃度は対照と同じ範囲であり、対照よりも高い生産性をもたらした。１つの可能な説明は、より大きな細胞直径によりより多くの抗体が生産されるということであり得る。
一定の浸透圧でのラフィノース濃度の上昇は、ＨＭ及び非フコシル化の増加、並びにフコシル化糖型の減少をもたらす。シアリル化及びガラクトシル化糖型は影響を受けなかった。
実施例３：浸透圧を変化させている間の二糖類又は三糖類の添加の影響（ディープウェルプレート；実験手法２）：
浸透圧を上昇させ及び糖濃度を一定にして、第２の実験手法を実施した（表３及び実施例１の方法を参照）。
結果：培養中のｍＡｂ２細胞へのラフィノースの添加
図１３は、培養物のＶＣＤ及び生存活性を示す。追加のラフィノースを用いた培養物を「３０ｍＭラフィノース」と呼ぶ。対照は、１１．７±２．７×１０6細胞／ｍＬの最高のＶＣＤを与えた。浸透圧の上昇は、最大細胞密度の低下をもたらした。ラフィノースの追加補足は、ＶＣＤの低下と関係がなかった。最も低いＶＣＤは、４２５ｍＯｓｍ／ｋｇで３０ｍＭラフィノースを使用して得られた（８．２±２．３×１０6細胞／ｍＬ）（図１３ａ参照）。実験の最後に、３７５ｍＯｓｍ／ｋｇと３０ｍＭラフィノース（約５９％）及び３００ｍＯｓｍ／ｋｇ（約５８％）を用いた培養物は、最も高い生存活性を示した（図１３ｂ）。３７５ｍＯｓｍ／ｋｇで３０ｍＭラフィノースの場合を除いて、生存活性は浸透圧の上昇と共に低下した。
図１４ａは、作業日１４日における絶対採取力価を示す。抗体の最高濃度（約２０５０ｍｇ／Ｌ）は対照により生成されたが、４２５ｍＯｓｍ／ｋｇと３０ｍＭラフィノースの補足を用いる条件は、約１１５０ｍｇ／Ｌを与えたのみである。従って、浸透圧が上昇すると絶対採取力価は低下した。比生産性（図１４ｂ）は、約１８ｐｇ／細胞／日〜約２４ｐｇ／細胞／日の範囲にとどまった。
対照（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）に対するグリコシル化プロフィールの変化は、図１４ｃに見ることができる。浸透圧が上昇すると、フコシル化された糖型の量は減少したが、非フコシル化された糖型及びガラクトシル化された糖型は増加した。同様にＨＭ種の増加が観察される。３０ｍＭラフィノースを用いる４２５ｍＯｓｍ／ｋｇの条件は、８．５％の最高の増加を達成した。ラフィノースを添加すると、各糖型の増加／減少がさらに大きくなる。
要約すると、高い浸透圧と追加のラフィノースは細胞増殖を阻害するようであり、これはチューブリンのダウンレギュレーションにより説明し得る。実験手法１（実施例２及び３参照）と比較して、浸透圧が高い条件の生存活性は、糖濃度が高い条件の生存活性と同じままである。対照と比較して作業日１４日に抗体濃度は上昇しなかったが、作業日１４日で同様の比生産性があった。浸透圧が上昇すると、全ての条件においてＨＭ種の量は増加した。
全体的な結論：
実施例１及び２は、一定の浸透圧で細胞培養培地にラフィノース又はスクロースを添加すると、増殖速度、生存活性、並びにｍＡｂ１及びｍＡｂ２のグリコシル化プロフィールに影響を与え得ることを強調している。ｍＡｂ１については、ラフィノース又はスクロースを添加した場合に、ＨＭのそれぞれ７％又は１４％の増加が得られた。ｍＡｂ２については、ラフィノース又はスクロースを添加した場合、ＨＭのそれぞれ６％又は９％の増加が得られた。比生産性は糖の補足によっては影響されなかった。従って二糖類又は三糖類の濃度が高いと細胞増殖が低下し、比生産性が上昇することが示された。ＤＷＰとスピンチューブの両方で同様の結果が得られた。
ここで示した結果は、二糖類（例えばスクロース）又は三糖類（例えばラフィノース）のような化合物を補足することにより、浸透圧に作用しながら、好ましくは標準培地と比較して一定の浸透圧を維持しながら、生産作業の効率を制御し、ＨＭ種の量を制御することが可能であることを示す。
実施例３に示された結果に基づいて、高い糖濃度だけでなく高い浸透圧も、細胞増殖を低下させ比生産性を上昇させると仮定することができる。
驚くべきことに本発明は、二糖類又は三糖類中の濃度及び培養培地の浸透圧を制御することにより、少なくとも１つの生産作業の効率を調節すること、及び／又は抗体などのタンパク質のグリコシル化プロフィールを調節することが可能であることを示す。すなわち、培養条件を、量及び／又は質の点で特定の目標に適合させることが可能である。
当業者は、生産に使用される細胞株が何であれ、少なくとも１つの生産作業の効率及び／又は任意の抗体及び任意のタンパク質のグリコシル化プロフィールを修飾するために、標準培地と比較して培地の浸透圧を一定に維持しながら、二糖類（例えばスクロース）又は三糖類（例えばラフィノース）を使用することができることを、実施例１〜３の結果から理解できるであろう。所定の浸透圧で細胞培養培地中に添加される二糖類（スクロースなど）又は三糖類（ラフィノースなど）の正確な濃度は、当業者が所望する生産の性能及び／又は分子毎のグリコシル化に応じて、１件ずつ決定されなければならない。この決定は、いかなる独創的な技術も伴わずに、本発明の教示に基づいて行うことができる。当業者はまた、一定の浸透圧を有する培地中で、抗体などのタンパク質を生産するための任意の方法において、特定のグリコシル化プロフィールに到達することを目指していなくても、単に少なくとも1つの生産作業の効率を改善するために、ラムノース又はスクロースに限定されることなく、任意の二糖類又は三糖類を使用することができることを理解するであろう。
参考文献
1) N. Yamane-Ohnuki et M. Satoh, 2009. Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation; mAbs, 1(3): 230‐236
2) Yu et al., 2012. Characterization and pharmacokinetic properties of antibodies with N-linked Mannose-5 glycans”; mAbs, 4(4):475-487.
3) Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Sadettin Ozturk, Wei-Shou Hu, ed., CRC Press (2005)
4) Kim et al., 2004, Biotechnol. Prog., 20:1788-1796
5) Stettler et al., 2006. Biotechnol Bioeng. 95(6): 1228-1233
6) Ziv Roth et al., 2012. Identification and Quantification of Protein Glycosylation; International Journal of Carbohydrate Chemistry, Article ID 640923.
7) Ting Song et al., 2014. In-Depth Method for the Characterization of Glycosylation in Manufactured Recombinant Monoclonal Antibody Drugs; Anal. Chem., 86(12):5661-5666
8) Essentials of Glycobiology, Varki et al. eds., 1999, CSHL Press
9) Voisard et al., 2003, Biotechnol. Bioeng. 82:751-765
10) Ausubel et al., 1988 and updates, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Wiley & Sons, New York.
11) Sambrook et al., 1989 and updates, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press.
12) Remington's Pharmaceutical Sciences, 1995, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA

Claims (16)

  1. 組換えタンパク質を流加バッチ方式又はバッチ方式で生産する方法であって、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養することを含む、方法。
  2. 流加バッチ方式又はバッチ方式で組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養する方法であって、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記宿主細胞を培養することを含む、方法。
  3. 組換えタンパク質の生産を流加バッチ方式又はバッチ方式で上昇させる方法であって、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養することを含む、方法。
  4. 少なくとも１つの生産作業の効率を上昇させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 生産作業の効率が、生存細胞密度の上昇及び／又は細胞生存活性の低下により測定される、請求項４に記載の方法。
  6. 調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を生産する方法であって、二糖類若しくは三糖類を含むか又は二糖類若しくは三糖類が補足された細胞培養培地中で、その浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む、方法。
  7. 調節されたグリコシル化プロフィールを有する組換えタンパク質を生産する方法であって、二糖類又は三糖類を含む少なくとも１つの供給物質が補足された細胞培養培地中で、培養培地の浸透圧を前記二糖類又は三糖類を含まない標準培地のものと同様に維持しながら、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む、方法。
  8. 調節されたグリコシル化プロフィールを有する前記組換えタンパク質を精製することをさらに含む、請求項６又は請求項７に記載の方法。
  9. 前記タンパク質の調節されたグリコシル化プロフィールが、前記タンパク質におけるフコシル化レベル及び／又はマンノシル化レベルの調節を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記タンパク質において、フコシル化レベルの調節がフコシル化レベルの低下であり、マンノシル化レベルの調節がマンノシル化レベルの上昇である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記二糖類がスクロースであり、前記三糖類がラフィノースである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記組換えタンパク質が、組換え融合タンパク質、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体又はその抗原結合断片、例えばヒト抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、キメラ抗体又はその抗原結合部分から成る群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  14. 誘導物質としての、細胞培養培地中の二糖類又は三糖類の使用。
  15. 少なくとも１つの生産作業の効率を改善するための、細胞培養培地中の二糖類又は三糖類の使用。
  16. 前記細胞培養培地中の二糖類又は三糖類の濃度が約０．１ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１４及び１５のいずれか１項に記載の使用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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US12325737B2 (en) * 2018-03-26 2025-06-10 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
WO2022256484A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Xl7 Group Llc Aerosol to inhibit the infection of microorganisms using spike proteins, specifically covid-19

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013240353A (ja) * 2007-03-19 2013-12-05 Okayama Univ タンパク質産生用およびウイルス増殖用の培地
WO2014085213A1 (en) * 2012-11-29 2014-06-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Improved cultivation media and process for improved protein production by pichia strains
WO2014151878A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
WO2016007764A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 Abbvie Inc. Methods for modulating the glycosylation profile of recombinant proteins using non-commonly used sugars

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013240353A (ja) * 2007-03-19 2013-12-05 Okayama Univ タンパク質産生用およびウイルス増殖用の培地
WO2014085213A1 (en) * 2012-11-29 2014-06-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Improved cultivation media and process for improved protein production by pichia strains
WO2014151878A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
WO2016007764A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 Abbvie Inc. Methods for modulating the glycosylation profile of recombinant proteins using non-commonly used sugars

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUA F. ET AL., J. BIOTECHNOL., vol. 37 (1994), JPN6021013042, pages 265 - 275, ISSN: 0004484798 *
HOSSLER P. ET AL., BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. Vol.30 No.6 (2014), JPN6020033632, pages 1419 - 1431, ISSN: 0004630711 *
LOHR J. W. ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. Vol.78 (1986), JPN6020033633, pages 1165 - 1172, ISSN: 0004484795 *
PACIS E. ET AL., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. Vol.108 No.10 (2011), JPN6021013040, pages 2348 - 2358, ISSN: 0004484797 *
ST AMAND M. M. ET AL., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. Vol.111 No.10 (2014), JPN6020033636, pages 1957 - 1970, ISSN: 0004484796 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022549329A (ja) * 2019-09-26 2022-11-24 アムジェン インコーポレイテッド 抗体組成物を製造する方法
JP7762143B2 (ja) 2019-09-26 2025-10-29 アムジェン インコーポレイテッド 抗体組成物を製造する方法

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