[go: up one dir, main page]

JP2018531245A - オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2018531245A
JP2018531245A JP2018516673A JP2018516673A JP2018531245A JP 2018531245 A JP2018531245 A JP 2018531245A JP 2018516673 A JP2018516673 A JP 2018516673A JP 2018516673 A JP2018516673 A JP 2018516673A JP 2018531245 A JP2018531245 A JP 2018531245A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
group
solvent
conjugate
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2018516673A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6893505B2 (ja
JP2018531245A6 (ja
Inventor
デニス ユル ハンスン
デニス ユル ハンスン
クリストフ ローゼンバーム
クリストフ ローゼンバーム
ミカエル メルゴー
ミカエル メルゴー
Original Assignee
ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス
ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス, ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス filed Critical ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス
Publication of JP2018531245A publication Critical patent/JP2018531245A/ja
Publication of JP2018531245A6 publication Critical patent/JP2018531245A6/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6893505B2 publication Critical patent/JP6893505B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの分野およびその合成の方法に関する。本方法では、低含水量溶媒環境が、必要なコンジュゲート部分の量を低減しかつコンジュゲーション反応の速さを増す、より効率的なコンジュゲーションを可能にする。

Description

発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの分野およびその合成の手法に関する。本手法では、低含水量溶媒環境が、必要なコンジュゲート部分の量を低減しかつコンジュゲーション反応の速さを増す、より効率的なコンジュゲーションを可能にする。
発明の背景
近年、オリゴヌクレオチドにさらなる機能性を加える、例えばインビボで特定の臓器および組織を治療用オリゴヌクレオチドの標的とすることを可能にする非ヌクレオチド部分とのオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションに大きく焦点が当てられている。肝臓の肝細胞を標的とするために、アシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる三価GalNAcコンジュゲーション部分が、効果的な治療作用をもたらしつつ投薬量の大幅な低減を可能にすることが見出されており、例えばWO2014/118267（特許文献1）を参照されたい。WO2013/033230（特許文献2）も抗体、炭水化物、コレステロール、インスリン、PEG、トランスフェリンおよびビタミンを含む様々なオリゴヌクレオチドコンジュゲートを記載している。コンジュゲート基製造の増加した費用およびコンジュゲーションにおける追加の方法工程を特に考慮すると、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造は、したがって、非常に重要である。
Milesi et. al.,Methods in Enzymology (1999) 313, pp 164-173（非特許文献1）は、無水ジメチルスルホキシドにおけるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成について報告している。Milesiらによって用いられた手順は、親油性5'副溝結合コンジュゲートへのコンジュゲーション前に、10bpのDNAオリゴヌクレオチドをDMSOに溶解するためにトリエチルアンモニウム塩を用いており、親油性でありかつ流体静力学的に不安定な基との使用に推奨されている。Milesiらによると、オリゴヌクレオチドと比べて2.5モル当量のコンジュゲート基が用いられ、典型的には20モル当量以下のコンジュゲート基が用いられる。
WO2014/118267 WO2013/033230
Milesi et. al.,Methods in Enzymology (1999) 313, pp 164-173
発明の説明
本発明は、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程を含み、
反応工程が少なくとも約85%(v/v)の極性非プロトン性溶媒を含む溶媒組成物中で行われ、溶媒組成物中で用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比が約2未満、例えば約0.5〜約2であり、かつ溶媒組成物が親油性カチオンを含む、
アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法を提供する。
本発明は、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程を含み、
反応工程が少なくとも約85％のジメチルホルムアミド(DMF)(v/v)を含む溶媒組成物中で実施され、かつ溶媒組成物が親油性カチオンを含む、
アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法を提供する。
本発明は、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程を含み、
反応工程が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含む溶媒組成物中で実施され、かつ溶媒組成物が少なくとも1つの親油性C4〜36アルキル基を含む親油性カチオン、例えば少なくとも1つの親油性C4〜36アルキル基を含む第4級アンモニウムカチオンを含む、
アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法を提供する。
本発明は、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程を含み、
反応工程が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含む溶媒組成物中で実施され、溶媒組成物が親油性カチオンを含み、かつコンジュゲート基が非親油性部分である、
アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法を提供する。
本発明は、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程を含み、
反応工程が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含む溶媒組成物中で実施され、溶媒組成物が親油性カチオンを含み、かつコンジュゲート基がアシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、
アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法を提供する。
本発明は、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程を含み、
反応工程が少なくとも約85％(v/v)の極性非プロトン性溶媒含む溶媒組成物中で行われ、かつ溶媒組成物中で用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比が約2未満、例えば約0.5〜約2であり、溶媒組成物が親油性カチオンを含み；極性非プロトン性溶媒がジメチルホルムアミド(DMF)であり；かつ親油性カチオンが例えばセチルトリメチルアンモニウムである、
アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法を提供する。
本発明は、
(i)親油性カチオンと、極性非プロトン性溶媒と、反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドとを含む溶媒組成物を提供する工程、および
(ii)オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを製造するために、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
を含み、
溶媒組成物が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含み、かつ工程(ii)で用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比が約0.5〜約2である、
オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを合成する手法を提供する。
本発明は、
(i)親油性カチオンと、極性非プロトン性溶媒と、反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドとを含む溶媒組成物を提供する工程、および
(ii)オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを製造するために、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
を含み、
溶媒組成物が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒ジメチルホルムアミド(DMF)(v/v)を含む、
オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを合成する手法を提供する。
本発明は、
(i)親油性カチオンと、極性非プロトン性溶媒と、反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドとを含む溶媒組成物を提供する工程、および
(ii)オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを製造するために、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
を含み、
溶媒組成物が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含み；かつ親油性カチオンが少なくとも1つの親油性の1つのC4〜36アルキル基を含む、例えば少なくとも1つの親油性C4〜36アルキル基を含む第4級アンモニウムカチオンである、
オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを合成する手法を提供する。
本発明は、
(i)親油性カチオンと、極性非プロトン性溶媒と、反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドとを含む溶媒組成物を提供する工程、および
(ii)オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを製造するために、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
を含み、
工程(i)の溶媒組成物が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含み；かつコンジュゲート基が非親油性部分である、
オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを合成する手法を提供する。
本発明は、
(i)親油性カチオンと、極性有機溶媒と、反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドとを含む溶媒組成物を提供する工程、および
(ii)オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを製造するために、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
を含み、
工程(i)の有機溶媒組成物が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含み；かつコンジュゲート基がアシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、
オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを合成する手法を提供する。
本発明は、
(iii)親油性カチオンと、極性非プロトン性溶媒と、反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドとを含む溶媒組成物を提供する工程、および
(iv)オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを製造するために、オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
を含み、
溶媒組成物が少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒ジメチルホルムアミド(v/v)を含み、かつ工程(ii)で用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比が約0.5〜約2であり、かつ親油性カチオンが例えばセチルトリメチルアンモニウムである、
オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを合成する手法を提供する。
本発明の上記態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、例えば約15％以下、例えば約10％以下の、水またはアルコールのようなプロトン性溶媒を含んでもよい。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、極性非プロトン性溶媒と、水またはアルコールのようなプロトン性溶媒との混合物である。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、少なくとも85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)と、約15％以下の水との混合物である。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、少なくとも90％の極性非プロトン性溶媒(v/v)と、約10％以下の水との混合物である。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、例えば少なくとも0.05％、例えば少なくとも0.1％、例えば少なくとも0.5％、例えば少なくとも1％の、水またはアルコールのようなプロトン性溶媒を含む。
手法および方法という用語は、本発明の記載では区別なく用いられる。
脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成のために用い得る、市販のアミノリンカーであるリンカーホスホロアミダイトの例。 脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成のために用い得る、市販のアミノリンカーであるリンカーホスホロアミダイトの例。 脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成のために用い得る、市販のアミノリンカーであるリンカーホスホロアミダイトの例。 脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成のために用い得る、市販のアミノリンカーであるリンカーホスホロアミダイトの例。 GalNAcコンジュゲートの例。本発明の方法における使用のためには、これらのコンジュゲートの反応性エステル形態が用いられてもよい。 2h後の、水溶液中でのアミノ標識オリゴヌクレオチドとNHSエステルとの間の反応の通常の変換。オリゴヌクレオチドが水に溶解された場合にはアミノ標識オリゴヌクレオチドに対して少なくとも2倍モル過剰のNHSエステルが必要であることがはっきりと分かる。A＝アミノ標識オリゴヌクレオチド、およびC＝オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 2h後の、無水DMF中でのアミノ標識オリゴヌクレオチドのCTA塩のGalNAcコンジュゲートへの変換。変換は用いたモル当量と相関することが分かり、よってモル過剰の採用したNHSエステルを低減することが可能である。A＝アミノ標識オリゴヌクレオチド、およびC＝オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 2h後の、無水DMF中でのアミノ標識オリゴヌクレオチドのCTA塩のジゴキシゲニンコンジュゲートへの変換。変換は用いたモル当量と相関することが分かり、よってモル過剰の採用したNHSエステルを低減することが可能である。この実験は異なるNHSエステルを採用しており、よって異なるコンジュゲートタイプ(ジゴキシゲニン)をもたらす。これは反応が広く適用可能であることを裏付けている。A＝アミノ標識オリゴヌクレオチド、およびC＝オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 2h後の、無水DMF中でのアミノ標識オリゴヌクレオチドのCTA塩のフルオレセインコンジュゲートへの変換。変換は用いたモル当量と相関することが分かり、よってモル過剰の採用したNHSエステルを低減することが可能である。この実験は異なるNHSエステルを採用しており、よって異なるコンジュゲートタイプ(フルオレセイン)をもたらす。これは反応が広く適用可能であることを裏付けている。フルオレセインNHSエステルが2つの異性体の混合物であるため2つの生成物ピークがある。A＝アミノ標識オリゴヌクレオチド、およびC＝オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 1h後の、無水DMF(i)中でのアミノ標識オリゴヌクレオチドのCTA塩およびTEA塩のGalNAcコンジュゲートへの変換の比較。DMSO(ii)中では2つの塩の間にはっきりとした動力学的差異があり、CTA塩がより有利であることを示している。同じくCTA塩についてはDMF中で変換は向上する。24h後、完全な変換が全ての事例で観察された。A＝アミノ標識オリゴヌクレオチド、およびC＝オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 1h後の、無水DMF(i)中でのアミノ標識オリゴヌクレオチドのCTA塩およびTEA塩のGalNAcコンジュゲートへの変換の比較。DMSO(ii)中では2つの塩の間にはっきりとした動力学的差異があり、CTA塩がより有利であることを示している。同じくCTA塩についてはDMF中で変換は向上する。24h後、完全な変換が全ての事例で観察された。A＝アミノ標識オリゴヌクレオチド、およびC＝オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 オリゴヌクレオチドコンジュゲーションの効率に及ぼす含水量の影響。 実施例に用いた、例えば本発明のコンジュゲーション反応に用いてもよいNHSエステルの構造。
詳細な説明
本発明は、オリゴヌクレオチドコンジュゲーションの技術分野において多数の利点を提供し、コンジュゲート基のより効率的な使用を提供すること、ならびにコンジュゲーションの速度を向上させることが、水を含まないかまたは水を少しの割合で含む溶媒を用いた際に達成される。
オリゴヌクレオチド
本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ以上の共有結合的に連結したヌクレオシドを含む分子として、当業者によって一般的に理解されるように規定される。そのような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも呼ばれることがある。オリゴヌクレオチドは、実験室において固相化学合成に続き精製によって通常は作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する際は、共有結合的に連結したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾物の、配列または順序を指す。本発明のオリゴヌクレオチドは人工的なものであり、化学的に合成され、典型的には精製されているかまたは単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことがある。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本明細書において用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸に、特に標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして規定される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的には二本鎖ではなく、したがってsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。
オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。修飾オリゴヌクレオチドという用語は、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを表している。キメラオリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを備えたオリゴヌクレオチドを表すために文献で用いられてきた用語である。
いくつかの態様では、本発明の方法のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、LNAオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドである。
非限定的な態様では、オリゴヌクレオチドは以下：
Figure 2018531245
からなる群より選択されてもよく、ここで大文字は、ベータ-D-オキシ-LNA単位を表し；小文字は、DNA単位を表し；下付き文字「s」は、ホスホロチオエート連結を表し；上付き文字mは、5-メチルシトシン塩基を含有するDNAまたはベータ-D-オキシ-LNA単位を表す。オリゴヌクレオチドは、5'アミノヘキシルリンカーをさらに含んでもよい。これらは、例えば、以下のコンジュゲート：
Figure 2018531245
を形成するために、GalNAcコンジュゲート(例えばGalNAc2のNHS活性エステル)と共に本発明の方法で用いられてもよい。
GN2-C6は、C6リンカーを備えたGalNAc2担体成分を表す(図2に示す)。
他の例示的なオリゴヌクレオチドは、以下：
Figure 2018531245
を含む。
アミノリンカーを含むオリゴヌクレオチド
本発明の方法の工程(i)で提供されるオリゴヌクレオチドは、共有結合的に結合したアミノ基を含み、これは反応性アミノ基とも呼ばれることがあり、これは好適にはアミノリンカーの形態であってもよい。反応性アミノ基またはアミノリンカーは、オリゴヌクレオチドの任意の好適な基、例えば5'または3'末端基に付着してもよい。アミノ基は、脂肪族アミノ基であってもよい。アミノリンカーは、例えばアミノ-アルキルリンカーまたはエチレングリコールリンカーであってもよい。いくつかの態様では、アミノリンカーは、C2〜12アミノアルキルリンカー、例えばアミノヘキシルリンカーである。
例示的なアミノリンカーは、5'-アミノ-修飾物質-C12、アミノ-修飾物質C2、アミノ-修飾物質C6、N2-アミノ-修飾物質C6、3'-アミノ-修飾物質C7、3'-アミノ-修飾物質C6、3'-PT-アミノ-修飾物質C6；またはPC 5'-アミノ-修飾物質、5'-アミノ-修飾物質TEG、アミノ-修飾物質セリノール、および3'-アミノ-修飾物質-セリノールの群より選択されてもよい。
図1は、本発明で用いられるオリゴヌクレオチドの合成に用いられることがあるいくつかの市販のアミノリンカーを示す。
脂肪族アミノ基は、窒素原子上に芳香環が直接的に存在しないアミノ基であり、したがって典型的には非ヌクレオシドアミノ基である。ヌクレオシドアミノ基は、アミノ基の窒素原子がプリンまたはピリミジン塩基の芳香環に直接的に結合したアミノ基である。
脂肪族アミノ基は、第1級または第2級アミノ基であってもよい。
いくつかの態様では、脂肪族アミノ基は、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、およびイミダゾールからなる群より選択される。
親油性カチオン
溶媒組成物中の親油性カチオンの使用が、有機溶媒組成物でのオリゴヌクレオチドの溶解を可能にする。親油性カチオンは、典型的には親油性塩の形態で溶媒に加えられる。親油性塩は、親油性カチオンおよび好適なアニオンを含む。好適な親油性カチオンの例は、少なくとも1つの親油性置換基、例えばアルキル基を含む、第4級アンモニウムカチオンを含む。好適な親油性カチオンの別の例は、少なくとも1つの親油性置換基、例えばアルキル基を含む、第4級ホスホニウムカチオンである。いくつかの態様では、親油性カチオン、例えば第4級アンモニウム/ホスホニウムカチオンは、1つ、2つ、3つまたは4つの親油性置換基、例えば1つ、2つ、3つまたは4つのアルキル基を含む。いくつかの態様では、親油性置換基全体に存在する炭素原子の総数は6個より大きく、例えば7個〜40個である。いくつかの態様では、親油性置換基(例えば、アルキル置換基)のそれぞれに存在する炭素原子の総数は2個以上、例えば3個以上、例えば4個以上である。いくつかの態様では、親油性置換基(例えば、アルキル置換基)の少なくとも1つ、例えば1つ、2つ、3つまたは4つに存在する炭素原子の総数は2個以上、例えば2個〜36個、4個〜36個または6個〜36個である。いくつかの態様では、親油性カチオンは、トリエチルアンモニウムカチオンである。しかしながら、本発明ではより長いアルキル鎖、例えばC4〜36またはC6〜36アルキル基、例えばC6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35およびC36を備えた、親油性カチオンを用いることが有用であることが分かった。いくつかの態様では、親油性カチオンは、C4〜36アルキル基を少なくとも1つ含む。いくつかの態様では、親油性カチオンは、C4〜C36またはC6〜C36アルキル基を1つだけ含む。いくつかの態様では、親油性カチオンは、C4〜C36またはC6〜C36アルキル基を2つ含む。いくつかの態様では、親油性カチオンは、C4〜C36またはC6〜C36アルキル基を3つ含む。いくつかの態様では、親油性カチオンは、第4級アンモニウムまたはホスホニウムイオンであり、これは、C4〜36アルキル基を少なくとも1つ、および任意で他のアルキル基、例えばC1〜3、例えばメチルを、3つ以下含む。いくつかの態様では、前記少なくとも1つのC4〜C36アルキルは、C8〜C24アルキル、例えばC12〜C20アルキル、例えばC16アルキルである。いくつかの態様では、親油性カチオンは、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(セチルトリメチルアンモニウム)またはテトラブチルアンモニウムである。
親油性塩は、例えば単一のイオン、例えばハロゲンイオン、例えば臭素または塩素イオンであってもよい、好適なアニオンをさらに含む。
他の好適なアニオンは、スルホネートアニオン、例えばトシレート、メシレート；またはカルボキシレートを含む。
いくつかの態様では、親油性塩は、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、および塩化セチルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される。
溶媒組成物中の親油性カチオンの量は、用いられる溶媒、塩およびオリゴヌクレオチドに応じて異なる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド中に存在するリンヌクレオシド間連結(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)あたり、少なくとも約0.5モル当量の親油性カチオンが用いられる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド中に存在するリンヌクレオシド間連結(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)あたり、少なくとも約0.7モル当量の親油性カチオンが用いられる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド中に存在するリンヌクレオシド間連結(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)あたり、少なくとも約1モル当量の親油性カチオンが用いられる。同様のモル当量の親油性カチオンが他の非リンヌクレオシド間連結に対して用いられてもよく、モル当量の親油性塩に適用されてもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する親油性カチオンの濃度は、1mM〜1M、例えば10mM〜300mMである。
溶媒
本発明の方法の溶媒組成物中で用いられる溶媒は、極性非プロトン性溶媒であるか、または少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒、例えば少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも99％の極性非プロトン性溶媒(v/v)を含むか、のいずれかである。溶媒は、親油性カチオンおよびオリゴヌクレオチドを溶解するその能力で選択されてもよい。溶媒は、一般的に極性によって分類され、誘電率によって表されるように極性または無極性のいずれかであるとみなされる。一般的に、誘電率が約5を超える溶媒は「極性」であるとみなされ、誘電率が5未満のものは「無極性」であるとみなされる。
プロトン性溶媒は、酸素(水酸基)または窒素(アミノ基)に結合した水素原子として不安定なH+を含有し、試薬にプロトンを容易に供与する溶媒である。逆に、非プロトン性溶媒は、不安定なH+を含有していないかまたは試薬にプロトンを容易に供与しない。本発明の方法で用いられる溶媒組成物は、少量の極性プロトン性溶媒(例えば水またはアルコール、例えばエタノールもしくはメタノール)を、例えば15％(v/v)以下または10％(v/v)以下含有してもよい。いくつかの態様では、溶媒組成物は、有機極性プロトン性溶媒を含まない。
本発明のいくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、例えば約15％以下、例えば約10％以下の、水またはアルコールのようなプロトン性溶媒を含んでもよい。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、極性非プロトン性溶媒と、水またはアルコールのようなプロトン性溶媒との混合物である。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、少なくとも85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)と、約15％以下の水との混合物である。いくつかの態様では、溶媒組成物中に存在する溶媒は、少なくとも90％の極性非プロトン性溶媒(v/v)と、約10％以下の水との混合物である。
溶媒組成物中で用いられる極性非プロトン性溶媒は、オリゴヌクレオチドおよび親油性塩を溶解するその能力で選択されてもよい。例示的な溶媒は、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびジメチルホルムアミド(DMF)を含む。実施例において説明するように、DMFは、本発明の方法における使用のために特に関心を引く溶媒である。いくつかの態様で用いられてもよい他の溶媒は、ジメチルアセトアミドおよびスルホランを含む。いくつかの態様では、溶媒組成物は、DMSOまたはDMFを含む。いくつかの態様では、溶媒組成物中で用いられる溶媒は、DMSOまたはDMFであり、任意で15％以下のプロトン性溶媒(例えば水またはアルコール、例えばエタノールもしくはメタノール)、例えば10％以下のプロトン性溶媒(例えば水またはアルコール、例えばエタノールもしくはメタノール)が存在する。
いくつかの態様では、溶媒組成物中で用いられる溶媒は、DMSOまたはDMFであり、任意で15％以下の水、例えば10％以下の水が存在する。
いくつかの態様では、本発明の方法において提供される溶媒組成物は、本質的には無水であり、例えば0.1％未満の水、例えば0.01％未満の水、例えば0.005％以下の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物は、0.01％より多くの水、例えば0.1％より多くの水、例えば0.1％より多くの水、例えば0.5％より多くの水を含む。シグマアルドリッチが販売するような無水DMFおよびDMSOは、0.005％未満の水を含有する。
いくつかの態様では、少量の水(または代替的なプロトン性溶媒、例えばアルコール、例えばエタノールもしくはメタノール)が有機溶媒組成物において許容可能である。実際に実施例で説明するように、少量のプロトン性溶媒、例えば水の存在が変換率を向上することがある。例えば、いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、水(またはいくつかの態様では代替的なプロトン性溶媒、例えばアルコール、例えばエタノールもしくはメタノール)を、15％未満、例えば14％未満、または13％未満、または12％未満、または11％未満、または10％未満、または9％未満、または8％未満、または7％未満、または6％未満、または5％未満、または4％未満、または3％未満、または2％未満、または1％未満含んでもよい。含水量は、水の体積/極性非プロトン性溶媒の体積に基づいて測定される。プロトン性溶媒含有量は、プロトン性溶媒の体積/極性非プロトン性溶媒の体積に基づいて測定される。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、少なくとも0.1％の水、例えば少なくとも0.5％の水、例えば少なくとも1％の水、例えば少なくとも2％の水、例えば少なくとも3％の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0％〜10％の水、例えば0％〜10％の水、例えば0％〜9％の水、例えば0％〜8％の水、例えば0％〜7％の水、例えば0％〜6％の水、例えば0％〜5％の水、例えば0％〜4％の水、例えば0％〜3％の水、および0％〜2％の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0.01％〜10％の水、例えば0.01％〜10％の水、例えば0.01％〜9％の水、例えば0.01％〜8％の水、例えば0.01％〜7％の水、例えば0.01％〜6％の水、例えば0.01％〜5％の水、例えば0.01％〜4％の水、例えば0.01％〜3％の水、および0.01％〜2％の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0.1％〜10％の水、例えば0.1％〜10％の水、例えば0.1％〜9％の水、例えば0.1％〜8％の水、例えば0.1％〜7％の水、例えば0.1％〜6％の水、例えば0.1％〜5％の水、例えば0.1％〜4％の水、例えば0.1％〜3％の水、および0.1％〜2％の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0.5％〜10％の水、例えば0.5％〜9％の水、例えば0.5％〜8％の水、例えば0.5％〜7％の水、例えば0.5％〜6％の水、例えば0.5％〜5％の水、例えば0.5％〜4％の水、例えば0.5％〜3％の水、および0.5％〜2％の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、1％〜10％の水、例えば1％〜9％の水、例えば1％〜8％の水、例えば1％〜7％の水、例えば1％〜6％の水、例えば1％〜5％の水、例えば1％〜4％の水、例えば1％〜3％の水、および1％〜2％の水を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、2％〜10％の水、例えば2％〜9％の水、例えば2％〜8％の水、例えば2％〜7％の水、例えば2％〜6％、例えば2％〜5％、例えば2％〜4％の水、例えば2％〜3％の水を含む。いくつかの態様では、与えられた％は厳密な値を指すが、別の態様では、％はおおよその値を指す、すなわち絶対値の前後+/-10％の変動を任意で提供すると認識されるであろう。さらに、いくつかの態様では、水の一部または本質的に全部に代えて代替的なプロトン性溶媒、例えばアルコール、例えばエタノールもしくはメタノールが用いられてもよいことが認識されるであろう。
いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、少なくとも0.1％のプロトン性溶媒、例えば少なくとも0.5％のプロトン性溶媒、例えば少なくとも1％のプロトン性溶媒、例えば少なくとも2％のプロトン性溶媒、例えば少なくとも3％のプロトン性溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0％〜9％のプロトン性溶媒、例えば0％〜8％のプロトン性溶媒、例えば0％〜7％のプロトン性溶媒、例えば0％〜6％のプロトン性溶媒、例えば0％〜5％のプロトン性溶媒、例えば0％〜4％のプロトン性溶媒、例えば0％〜3％のプロトン性溶媒、および0％〜2％のプロトン性溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0.01％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜9％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜8％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜7％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜6％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜5％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜4％のプロトン性溶媒、例えば0.01％〜3％のプロトン性溶媒、および0.01％〜2％のプロトン性溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0.1％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜9％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜8％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜7％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜6％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜5％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜4％のプロトン性溶媒、例えば0.1％〜3％のプロトン性溶媒、および0.1％〜2％のプロトン性溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、0.5％〜10％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜9％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜8％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜7％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜6％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜5％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜4％のプロトン性溶媒、例えば0.5％〜3％のプロトン性溶媒、および0.5％〜2％のプロトン性溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、1％〜10％のプロトン性溶媒、例えば1％〜9％のプロトン性溶媒、例えば1％〜8％のプロトン性溶媒、例えば1％〜7％のプロトン性溶媒、例えば1％〜6％のプロトン性溶媒、例えば1％〜5％のプロトン性溶媒、例えば1％〜4％のプロトン性溶媒、例えば1％〜3％のプロトン性溶媒、および1％〜2％のプロトン性溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒組成物/反応条件は、2％〜10％のプロトン性溶媒、例えば2％〜9％のプロトン性溶媒、例えば2％〜8％のプロトン性溶媒、例えば2％〜7％のプロトン性溶媒、例えば2％〜6％のプロトン性溶媒、例えば2％〜5％のプロトン性溶媒、例えば2％〜4％のプロトン性溶媒、例えば2％〜3％のプロトン性溶媒を含む。プロトン性溶媒は、単独でまたは溶媒組成物の一部である場合のいずれかで、親油性塩またはカチオンとオリゴヌクレオチドとを両方溶解できる。いくつかの態様では、プロトン性溶媒は、水およびアルコール(例えばエタノールもしくはメタノール)またはそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、プロトン性溶媒は、アルコール、例えばエタノールまたはメタノールまたはプロパノールである。
コンジュゲート基
「コンジュゲート」という用語は、1つまたは複数の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分への本明細書において記載されるようなオリゴヌクレオチドの共有結合的な付着(「コンジュゲーション」)によって形成される異成分からなる分子を表すよう意図される。コンジュゲート基は、非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分を含むかまたは非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分である。コンジュゲート基およびコンジュゲート部分という用語は、本明細書においては区別なく用いられることがある。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、炭水化物、非ヌクレオシド炭水化物、もしくは炭水化物複合体を含むかまたは炭水化物、非ヌクレオシド炭水化物、もしくは炭水化物複合体である。いくつかの態様では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-リン酸からなる群より選択される。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、酵素、および抗体断片を含むかまたはタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、酵素、および抗体断片の群より選択される。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、親油性部分、例えば脂質、リン脂質、脂肪酸、およびステロールからなる群より選択される部分である。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、小分子薬、毒素、レポーター分子、および受容体リガンドからなる群より選択される。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、ビタミンであるかまたはそれを含む。水溶性ビタミンは、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸またはナイアシン、ビタミンB6ピリドキサール群、パントテン酸、ビオチン、葉酸、イノシトール、コリンおよびアスコルビン酸を含む。脂溶性ビタミンは、ビタミンAファミリー、ビタミンD、ビタミンEトコフェロールファミリーおよびビタミンK(およびフィトール)を含む。
いくつかの態様では、レポーター分子は、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインより選択される。用いられてもよい他のレポーター分子は、蛍光プローブ、または蛍光タンパク質、例えばGFP、または酵素レポータータンパク質、例えばルシフェラーゼを含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールである。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、例えばガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンを含むことがあるアシアロ糖タンパク質受容体標的部分であるかまたはそれを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート基は、ガラクトースクラスター、例えばN-アセチルガラクトサミントライマーを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート基は、GalNAc(N-アセチルガラクトサミン)、例えば一価、二価、三価または四価GalNAcを含む。三価GalNAcコンジュゲートが、肝臓を化合物の標的とするために用いられてもよく(例えばUS 5,994517およびHangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701, WO2009/126933, WO2012/089352, WO2012/083046, WO2014/118267, WO2014/179620, &WO2014/179445を参照されたい)、図2の具体例を参照されたい。これらのGalNAc参考文献およびそれらに用いられた具体的なコンジュゲートは、参照により本明細書に組み入れられる。好適には、用いられるGalNAc部分は、反応性エステルの形態であってもよい。
いくつかの態様では、本発明の方法で用いられるGalNAcコンジュゲート基は：
Figure 2018531245
であるかまたはそれを含み、ここでT2は反応性エステル基である。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、親油性ではない。いくつかの態様では、コンジュゲート基は、副溝結合部分ではない。副溝結合分子は、回転が自由な一連の複素環式または芳香族炭化水素環からたいていは構成される。これは、水を排出してDNA二重螺旋の副溝へ分子が入り込むことを可能にする。いくつかの態様では、コンジュゲート基は、以下の：
Figure 2018531245
を含まない。
活性エステル
活性エステルは、カルボン酸のための活性化試薬として有機化学では慣例的に用いられている。例えば、活性化された酸は次いでアミンと反応してアミドを形成する。
いくつかの態様では、コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドアミド連結コンジュゲートを形成するためにアミノリンカーのアミノ基と反応するよう用いられる活性エステル基を含む。いくつかの態様では、活性エステルは、コンジュゲーション前にインサイチュで調製されてもよく、または別個の化学反応に続き精製されて調製されてもよい。
好適な活性エステル基は、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、スルホ-NHSエステル、ペンタフルオロフェニル(PFP)エステル、スルホテトラフルオロフェニル(STP)エステル、O-アシルイソ尿素、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)エステルおよび酸無水物からなる群より選択されてもよい。
コンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比
本発明の方法の利点の1つは、コンジュゲーション反応で要求されるコンジュゲート基の量の低減であり、オリゴヌクレオチドに対してコンジュゲートを2未満のモル比で用いた際でもオリゴヌクレオチドの非常に効率的なコンジュゲーションが達成される。いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約2未満、例えば約1.8未満、例えば約1.6未満、例えば約1.5未満、例えば約1.4未満、例えば約1.3未満、例えば約1.2未満、例えば約1.1未満、例えば約1である。
いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約0.25を超える、例えば約0.5を超える、例えば約0.75を超える。いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約0.25〜約2、例えば約0.5〜約2、例えば約0.75〜約2である。いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約0.25〜約1.5、例えば約0.5〜約1.5、例えば約0.75〜約1.5である。いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約0.25〜約1.5、例えば約0.5〜約1.5、例えば約0.75〜約1.5である。いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約0.25〜約1.25、例えば約0.5〜約1.25、例えば約0.75〜約1.25である。いくつかの態様では、用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比は、約0.8〜約1.2、または約0.9〜約1.1である。いくつかの態様では、コンジュゲート基およびオリゴヌクレオチドの化学量論量が用いられる(すなわち比が約1)。
溶媒組成物の調製
溶媒組成物は、例えば、以下の予備工程によって調製されてもよい：
(a)反応性アミノ基を含むオリゴヌクレオチドを含む水性組成物を提供する工程;
(b)オリゴヌクレオチド塩析出物を形成するために親油性塩を加える工程；
(b)水分が低減したかまたは本質的に乾燥した組成物を提供するために、工程(b)の生成物から水を除去する工程；
(c)溶媒組成物を提供するために、工程(b)で得られた、水分が低減したかまたは本質的に乾燥した組成物を、極性非プロトン性溶媒、例えばDMFまたはDMSOに溶解する工程。
水分は、当業者に公知の任意の好適な方法を用いて、例としては、溶媒とのろ過、例えば真空容器内でのもしくは凍結乾燥による蒸発、または遠心力を利用する蒸発によって、水性溶媒から除去されてもよい。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、溶媒、例えばブタノール、アセトニトリル、ジオキサン、THFまたはアセトンで洗浄され、遠心分離またはろ過によって収集されてもよい。これらの溶媒を用いるさらなる洗浄工程によってさらなる水分が除去されてもよく、洗浄溶媒は次いで、例えば真空下で、蒸発によって除去されてもよい。コンジュゲーション工程のための水/プロトン性溶媒のレベルを最適化するために水または代替的なプロトン性溶媒(例えばアルコール、例えばエタノールもしくはメタノール)を加えてもよい。
いくつかの態様では、工程(a)におけるオリゴヌクレオチドの水溶液のモル濃度は、約0.1mM〜約1M、例えば約1mM〜約100mM、例えば約10〜約20mMである。
いくつかの態様では、工程(c)におけるオリゴヌクレオチドの溶媒溶液のモル濃度は、約0.1mM〜約1M、例えば約1mM〜約100mM、例えば約10〜約20mMである。
いくつかの態様では、工程(a)におけるオリゴヌクレオチドの水溶液のモル濃度は、溶媒溶液(例えばDMFまたはDMSO)中でオリゴヌクレオチドが約10〜約20mM、およびオリゴヌクレオチドが約5〜10mM、例えば約9mM、例えば約8.8mMである。
変換率
変換率は、反応工程で用いられるオリゴヌクレオチドの量と比べたオリゴヌクレオチドコンジュゲートの量のモル比として決定される。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドコンジュゲート生成物の変換率は、少なくとも約50％、例えば少なくとも約75％、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％、例えば少なくとも約90％、例えば少なくとも約95％である。
定義
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的には天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドを両方含む。自然界では、ヌクレオチド、例えばDNAおよびRNAヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および1つまたは複数のリン酸基(これはヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドも「単位」または「モノマー」として区別なく呼ばれることがある。
修飾ヌクレオシド
本明細書において用いられる「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または(核酸)塩基部分の1つまたは複数の修飾の導入によって、同等のDNAまたはRNAヌクレオシドと比べて修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい態様では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含み、例えば、1つまたは複数の2'置換ヌクレオシドおよび/または1つまたは複数のLNAヌクレオシドを含むことがある。修飾ヌクレオシドという用語も「ヌクレオシドアナログ」または修飾「単位」または修飾「モノマー」という用語と本明細書においては区別なく用いられることがある。
修飾ヌクレオシド間連結
「修飾ヌクレオシド間連結」という用語は、ホスホジエステル(PO)連結以外の、2つのヌクレオシドを共有結合的に互いにカップリングする連結として当業者に一般的に理解されるように規定される。修飾ヌクレオシド間連結を備えたヌクレオチドは「修飾ヌクレオチド」とも称される。いくつかの態様では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結と比べてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドについては、ヌクレオシド間連結は隣接するヌクレオシド間にホスホジエステル結合を生じるリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボ使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化させるのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中のDNAまたはRNAヌクレオシドの領域にて、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内や修飾ヌクレオシドの領域においてヌクレアーゼ開裂に対する防護をする役目をすることがある。
ある態様では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステルから例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある連結へと修飾された、1つまたは複数のヌクレオシド間連結を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることによって、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ(例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ(SVPD))を用いることによって決定されてもよく、いずれも当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結と呼ばれる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列の少なくとも50％が修飾されており、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列の例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％または例えば少なくとも90％が修飾されている。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列のすべてが修飾されている。いくつかの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルであってもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列のすべてがヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。
修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエートおよびボラノホスフェートを含む群より選択されてもよい。いくつかの態様では、修飾ヌクレオシド間連結、例えばホスホロチオエート、ジホスホロチオエートまたはボラノホスフェートは、本発明のオリゴヌクレオチドのRNaseH動員と適合性がある。いくつかの態様では、ヌクレオシド間連結は硫黄(S)を含み、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造しやすさのために特に有用である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列の少なくとも50％がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列の例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％または例えば少なくとも90％がホスホロチオエートである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結またはその連続するヌクレオチド配列のすべてがホスホロチオエートである。
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の中性ヌクレオシド間連結、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタールまたはチオホルムアセタールより選択されるヌクレオシド間連結を含む。
さらなるヌクレオシド間連結は、WO2009/124238(参照により本明細書に組み入れられる)に開示されている。ある態様では、ヌクレオシド間連結は、WO2007/031091(参照により本明細書に組み入れられる)に開示のリンカーより選択される。特に、ヌクレオシド間連結は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-より選択されてもよく、かつ/またはヌクレオシド間リンカーは、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-からなる群より選択されてもよく、ここでRHは水素およびC1〜4-アルキルより選択される。
ヌクレアーゼ耐性連結、例えばホスホチオエート連結は、標的核酸との二重鎖を形成する際にヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーのための領域G、またはヘッドマーおよびテイルマーの非修飾ヌクレオシド領域において特に有用である。ホスホロチオエート連結は、しかしながら、非ヌクレアーゼ動員領域および/または親和性増強領域、例えばギャップマーのための領域FおよびF'、またはヘッドマーおよびテイルマーの修飾ヌクレオシド領域においても有用なことがある。
設計領域のそれぞれは、しかしながら、特に修飾ヌクレオシド、例えばLNAがヌクレアーゼ分解から連結を防護する領域において、ホスホロチオエート以外のヌクレオシド間連結、例えばホスホジエステル連結を含んでもよい。特に修飾ヌクレオシド単位間または修飾ヌクレオシド単位に隣接したホスホジエステル連結、例えば1つまたは2つの連結の包含(典型的には非ヌクレアーゼ動員領域において)が、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能および/または生体分布を修飾し得る。参照により本明細書に組み入れられるWO2008/113832を参照されたい。
ある態様では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合はすべて、ホスホロチオエートおよび/またはボラノホスフェート連結である。好ましくは、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合はすべて、ホスホロチオエート連結である。
核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシドおよびヌクレオチド中に存在する、プリン(例えばアデニンおよびグアニン)ならびにピリミジン(例えばウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含む。本発明の文脈では、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なることがあるが核酸ハイブリダイゼーションの際に機能する修飾核酸塩基も包含する。いくつかの態様では、核酸塩基部分は、核酸塩基を修飾するかまたは置換することによって修飾される。この文脈では、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンや、天然に存在しない変異体を両方指す。そのような変異体は、例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
いくつかの態様では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、5-メチルシトシン、5-チアゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、5-プロピニル-ウラシル、5-ブロモウラシル、5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2'チオ-チミン、イノシン、ジアミノプリン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンより選択される核酸塩基に変更することによって修飾される。
核酸塩基部分は、それぞれの対応する核酸塩基毎に文字コード、例えばA、T、G、CまたはUによって表されることがあり、それぞれの文字は、機能が同等の修飾核酸塩基を任意で含むことがある。例えば、例示のオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分はA、T、G、C、および5-メチルシトシンより選択される。任意で、LNAギャップマーの代わりに5-メチルシトシンLNAヌクレオシドが用いられてもよい。
LNAオリゴヌクレオチド
LNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである。発明はしたがって、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製する方法に関する。LNAオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドという用語は、2つ以上の共有結合的に連結したヌクレオシドを含む分子として、当業者に一般的に理解されるように規定される。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のためには、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド7〜30個分の長さで典型的に合成される。LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオシド間連結を典型的に含み、非限定的に、例えばLNAギャップマーまたはミックスドウイングギャップマー(mixed wing gapmer)の形態であってもよい。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、LNAミックスマー(LNAおよび非LNAヌクレオチド、例えばLNAおよびDNA(例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO2007/112754を参照されたい)、またはLNAおよび2'-O-MOEヌクレオチド、またはLNA、DNAおよび2'O-MOEヌクレオチド)、またはLNAトータルマー(LNAヌクレオチドのみ。参照により本明細書に組み入れられるWO2009/043353を参照されたい)であってもよい。
リンカー
連結またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して1つの目的の化学基またはセグメントをもう1つの目的の化学基またはセグメントに連結させる二原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接的にまたは連結部分(例えばリンカーまたはテザー)を通じて付着し得る。リンカーは、第3領域、例えばコンジュゲート基を、第1領域、例えばオリゴヌクレオチド(領域A)に共有結合的に接続するよう機能する。
本発明の文脈では、リンカーは、アミノ基、例えば脂肪族アミノ基、例えば第1級または第2級脂肪族アミノ基を含んでもよい。いくつかの態様では、リンカーは、脂肪族アミノアルキル、例えばC2〜C36脂肪族アミノアルキル基であり、例えばC6〜C12脂肪族アミノアルキル基を含む。いくつかの態様では、リンカーは、C6脂肪族アミノアルキル基である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、DNAホスホジエステルヌクレオチドの領域、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドと脂肪族アミノリンカーとの間、例えばオリゴヌクレオチドの5'または3'末端に配置される1〜5のDNA POヌクレオチドを含む。参照により本明細書に組み入れられるWO2014/076195を参照されたい。
ロックド核酸ヌクレオシド(LNA)
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のLNAヌクレオシドを含む。LNAヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間にリンカー基(ビラジクルまたはブリッジと呼ばれる)を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献では架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも称される。
例示的なLNAヌクレオシドは、以下の図式1：
スキーム1
Figure 2018531245
に示すものを含む。
実施例で説明するように、本発明のいくつかの態様では、オリゴヌクレオチド中のLNAヌクレオシドは、ベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドであるかまたはそれを含む。
ギャップマー
本明細書において用いられる「ギャップマー」という用語は、1つまたは複数の親和性増強修飾ヌクレオシド(隣接部)が5'および3'で隣接しているRNase H動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマー設計が本明細書において記載されている。ヘッドマーおよびテイルマーは、隣接部のうちの1つが欠けている、すなわちオリゴヌクレオチドの末端のうちの一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む、RNase Hを動員することができるオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーについては、3'隣接部が欠けており(すなわち、5'隣接部が親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)、テイルマーについては、5'隣接部が欠けている(すなわち、3'隣接部が親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)。
LNAギャップマー
LNAギャップマーという用語は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、本発明の方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、LNAギャップマーである。
ミックスドウイングギャップマー
ミックスドウイングギャップマーという用語は、隣接領域が少なくとも1つのLNAヌクレオシドと、少なくとも1つの非LNA修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2'置換修飾ヌクレオシド、例えば例としては2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA (MOE)、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANAおよび2'-F-ANAヌクレオシドとを含む、LNAギャップマーを指す。いくつかの態様では、ミックスドウイングギャップマーは、LNAヌクレオシド(例えば5'または3')を含む一方の隣接部と、2'置換修飾ヌクレオシドを含むもう一方の隣接部(それぞれ3'または5')を有する。
長さ
本明細書において言及するように、ヌクレオチド分子の長さに言及する際は、長さはモノマー単位すなわちヌクレオチドの数に対応し、それらのモノマー単位がヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであるかには関係はない。ヌクレオチドに関しては、モノマーおよび単位という用語は、本明細書においては区別なく用いられる。
本発明の方法は、例えば7〜30個のヌクレオチド、例えば7〜10個、例えば7個、8個、9個、10個または10〜20個のヌクレオチド、例えば12〜18個のヌクレオチド、例えば12個、13個、14個、15個、16個、17個または18個のヌクレオチドからなる短いオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製に特に好適である。
特に示した場合を除いて、実施例は20〜25℃の室温で実施した。eq＝当量、かつモル比である。
実施例で用いたアミノ標識オリゴヌクレオチドは：
Figure 2018531245
であり、ここで大文字は、ベータ-D-オキシ-LNA単位を表し；小文字は、DNA単位を表し；下付き文字「s」は、ホスホロチオエート連結を表し；上付き文字mは、5-メチルシトシン塩基を含有するDNAまたはベータ-D-オキシ-LNA単位を表す。AM-C6は、アミノへキシルリンカーである。
オリゴヌクレオチドのナトリウム塩のモル質量は、4398.3g/molである。オリゴヌクレオチドのCTA塩のモル質量は、7536.9g/molである。
コンジュゲートしたオリゴヌクレオチド(コンジュゲートとも称される)へのアミノ標識オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート基の変換は、コンジュゲートおよびアミノ標識オリゴヌクレオチドの総ピーク下面積で、コンジュゲートのピーク下面積を除算したものとして決定した。
実施例1 ナトリウム塩からのオリゴヌクレオチドのCTA塩の形成
方法1：固体CTAClの使用
水2.5mL中のアミノ標識オリゴヌクレオチド(250mg、56.8μmol)の溶液に塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTACl)(220mg、688μmol)を撹拌しながら加えた。この量は、オリゴヌクレオチド中に存在する「リン酸」基あたり1当量に相当する(12個のホスホロチオエート基が存在した：688μmol/(56.8mmol*12)＝1.01)。CTAClの添加が、オリゴヌクレオチドの所望のセチルトリメチルアンモニウム塩を析出させた。析出物は遠心分離によって単離し、水で洗浄した。固形物は一晩凍結乾燥により乾燥させた。オリゴヌクレオチドのCTA塩の単離収量は414mgであり、97％の収率に相当した。
260nmでのUV吸光度によって決定されるように、上清はアミノ標識オリゴヌクレオチドを本質的に含んでおらず、オリゴヌクレオチドがすべてCTA塩として析出したことを示した。
方法2：CTAClの水溶液の使用
水2.5mL中のアミノ標識オリゴヌクレオチド(250mg、56.8μmol)の溶液に水1mL中の塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTACl)(220mg、688μmol)の水溶液を撹拌しながら加えた。この量はオリゴヌクレオチド中に存在する「リン酸」基あたり1当量に相当する(12個のホスホロチオエート基が存在した:688μmol/(56.8mmol*12)=1.01)。CTACl溶液の添加がオリゴヌクレオチドの所望のセチルトリメチルアンモニウム塩を析出させた。析出物は遠心分離によって単離し、この後に水で洗浄した。固形物は一晩凍結乾燥により乾燥させた。オリゴヌクレオチドのCTA塩の単離収量は419mgであり、98％の収率に相当した。
260nmでのUV吸光度によって決定されるように、上清はオリゴヌクレオチドを本質的に含んでおらず、オリゴヌクレオチドがすべてCTA塩として析出したことを示した。
析出がより容易に取り扱われ、CTAClが既に溶液状であり、オリゴヌクレオチドCTA塩が析出するのと同時に溶液にする必要がないため、方法2が好ましい。
実施例2 GalNAc2 NHSエステルの調製
Figure 2018531245
DMF(0.9mL)中のGalNAc2(45mg、31μmol)のカルボン酸の溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(3.9mg、34μmol)およびN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)(6.5mg、34μmol)を加えた。溶液を放置して16時間反応させ、オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのために直接用いた。
実施例3 水溶液中のアミノ標識オリゴヌクレオチドナトリウム塩へのGalNAc2 NHSエステルのコンジュゲーション
20mM NaHCO3緩衝液(pH8.5)100μL中のアミノ標識オリゴヌクレオチドナトリウム塩(4.4mg、1.0μmol)の溶液にジイソプロピルエチルアミン(1.8μL、10μmol、10eq)および、下の表1に示すように、34mMの原液(実施例2に記載のように調製)からの所望の当量のGalNAc2 NHSエステルを加えた。反応を2h進行させ、その後に反応混合物を逆相LC-MSによって分析した。
（表１）水中のアミノ標識オリゴヌクレオチドおよびGalNAc2 NHSエステルの当量
Figure 2018531245
図3に示すように、オリゴヌクレオチドを水のみに溶解した場合、アミノ標識オリゴヌクレオチドに対して少なくとも2倍モル過剰のNHSエステルが必要であった。
実施例4 N,N-ジメチルホルムアミド溶液中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩へのGalNAc2 NHSエステルのコンジュゲーション
無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)1.5mL中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(実施例1の方法2に従って調製)(100mg、13.2μmol)の原液を調製し、濃度が8.8mMの溶液を得た。
アミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(0.88μmol)のこの溶液100μLにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.4μL、7.9μmol、9当量)および、下の表2に記載のように、濃度が34mMのDMF中の原液から所望量のGalNAc2 N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(実施例2に記載のように調製)を加えた。反応は24h以下で進行させた。反応は1h、2hおよび24h後に分析した。コンジュゲーション効率は逆相LC-MSによって分析した。結果は図4にグラフで示す。変換率はオリゴヌクレオチドに対して用いたコンジュゲート基のモル当量と相関し、よってオリゴヌクレオチドコンジュゲートへのコンジュゲート基の100％の変換が達成されたことが分かる。変換は用いたモル当量に対応し、よって実施例3と比較して著しい向上であることが分かる。
（表２）DMF中のアミノ標識オリゴヌクレオチド、およびGalNAc2 NHSエステルの当量
Figure 2018531245
実施例5 N,N-ジメチルホルムアミド溶液中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩へのジゴキシゲニンNHSエステルのコンジュゲーション
無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)1.5mL中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(100mg、13.2μmol)の原液を実施例4に記載のように調製した。
アミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(0.88μmol)のこの溶液100μLにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.4μL、7.9μmol、9当量)および、下の表3に記載のように、濃度が40mMのDMF中の原液から所望量のジゴキシゲニンN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを加えた。反応は2h進行させた。反応は2h後に分析した。コンジュゲーション効率は逆相LC-MSによって分析した。結果は図5にグラフで示す。変換率はオリゴヌクレオチドに対して用いたコンジュゲート基のモル当量と相関することが分かり、よってオリゴヌクレオチドコンジュゲートへのコンジュゲート基の変換が100％達成された。変換は用いたモル当量に対応することが分かる。この実験は実施例4とは異なるNHSエステルを採用しており、よって異なったコンジュゲートタイプ(ジゴキシゲニン)をもたらす。これは反応条件が広く適用可能であることを裏付けている。
（表３）DMF中のアミノ標識オリゴヌクレオチドおよびジゴキシゲニンNHSエステルの当量
Figure 2018531245
実施例6 N,N-ジメチルホルムアミド溶液中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩へのフルオレセインNHSエステルのコンジュゲーション
無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)1.5mL中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(100mg、13.2μmol)の原液を実施例4に記載のように調製した。
アミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(0.88μmol)のこの溶液100μLにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.4μL、7.9μmol、9当量)および、下の表4に記載のように、濃度が40mMのDMF中の原液から所望量のフルオレセインN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を加えた。反応は2h進行させた。反応は2h後に分析した。コンジュゲーション効率は逆相LC-MSによって分析した。結果は図6にグラフで示す。変換率はオリゴヌクレオチドに対して用いたコンジュゲート基のモル当量と相関することが分かり、よってオリゴヌクレオチドコンジュゲートへのコンジュゲート基の変換が100％達成された。変換は用いたモル当量に対応することが分かる。この実験は実施例4および5とは異なるNHSエステルを採用しており、よって異なるコンジュゲートタイプ(フルオレセイン)をもたらす。これは反応条件が広く適用可能であることを裏付けている。
（表４）DMF中のアミノ標識オリゴヌクレオチドおよびフルオレセインNHSエステルの当量
Figure 2018531245
実施例7 CTA塩からのオリゴヌクレオチドのナトリウム塩の形成
コンジュゲーション反応が完了した後、2つの方法のうちの1つを用いてオリゴヌクレオチドはナトリウム塩として析出され、アニオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどの常法によって精製した。
方法1) NaClおよびエタノールの水溶液の使用
コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドCTA塩のDMF溶液1mL(例えば実施例4〜6のように調製)にNaCl(2M)の水溶液を0.2mL、続いてエタノール(5mL)を加え、オリゴヌクレオチドのナトリウム塩を析出させた。析出物は遠心分離を用いて回収した。
方法2) アセトン中の2％NaClO4(w/v)の使用
コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドCTA塩のDMF溶液1mL(例えば実施例4〜6のように調製)にアセトン(5mL)中の2％NaCl04(w/v)を加え、オリゴヌクレオチドのナトリウム塩を析出させた。析出物は遠心分離を用いて回収した。
実施例8 1h後の無水N,N-ジメチルホルムアミド中および無水ジメチルスルホキシド中のGalNAc2コンジュゲートへのアミノ標識オリゴヌクレオチドのCTA塩およびTEA塩の変換の比較
アミノ標識オリゴヌクレオチドのトリエチルアンモニウム(TEA)塩は、Milesiら(Methods in Enzymology (1999) 313, pp 164-173)の手順にしたがって調製した。TEA塩の溶液は、無水DMFおよび無水DMSOそれぞれにおいて8.8mMの濃度で調製した。
CTA塩の溶液は、無水DMFおよび無水DMSOそれぞれにおいて8.8mMの濃度で調製した。
GalNAc2 NHSエステルの溶液は、実施例2に記載のようにDMF中で34mMの濃度で調製した。
上記のように調製した溶液を採用し、次の標準プロトコルにしたがって4種類の反応物を調製した。
アミノ標識オリゴヌクレオチド(0.88μmol)の溶液100μLにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.4μL、7.9μmol、9当量)、GalNAc2 N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(26μL、0.884μmol)を加えた。反応は1h後に分析した。コンジュゲーション効率は逆相LC-MSによって分析した。結果は図7および下の表5に示す。
1時間後ではCTA塩の変換がTEA塩よりも多いことが分かる。この効果は溶媒としてDMSOを採用した際に特に顕著であり、CTA塩の変換速度がTEA塩よりも概して高いこと、および、さらに、溶媒としてのDMFがより高い反応速度をもたらすことを示している。
24hの反応時間後、全ての事例で完全な変換が観察された。
（表５）GalNAc2 NHSエステルと反応させたアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩およびTEA塩の変換
Figure 2018531245
実施例9 - オリゴヌクレオチドコンジュゲーションの効率に及ぼす含水量の影響
無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)1.5mL中のアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(100mg、13.2μmol)の原液を調製し、濃度が8.8mMの溶液を得た。
GalNAc2 NHSエステルの溶液は、実施例2に記載のようにDMF中34mMの濃度で調製した。
下の表6にしたがって、水分の量が異なる10種類の反応混合物を調製した。
アミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩(0.35μmol)の溶液40μLに、水分を下の表にしたがって、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(0.6μL、3.4μmol、10当量)、およびGalNAc2 N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(9.5μL、0.32μmol)を加えた。反応を24h進行させた。
この後、反応混合物は、0.5mLのDMFで希釈して確実に試料を完全に均質化した。オリゴヌクレオチドは、2.5mLの2％NaClO4を用いて反応混合物から析出させ、遠心分離によって回収した。得られたペレットを1mLのH2Oに溶解し、逆相LC-MSによって分析した。結果は図8および下の表6に示す。反応混合物中の水分が14％以下では、85％以上の変換が達成され得ることが分かる。これは反応に用いられる溶液が100％無水である必要がないので利点となる。
（表６）様々な水分の量でGalNAc2 NHSと反応させたアミノ標識オリゴヌクレオチドCTA塩の変換
Figure 2018531245

Claims (22)

  1. オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基にコンジュゲート基を反応させる工程
    を含み、
    該反応工程が少なくとも約85％(v/v)の極性非プロトン性溶媒を含む溶媒組成物中で実施され、溶媒組成物中で用いられるコンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比が約0.5〜約2であり、かつ溶媒組成物が親油性カチオンを含む、
    アミド連結オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する方法。
  2. コンジュゲート基が、活性エステル基を含む、請求項1記載の方法。
  3. 溶媒組成物中に存在する溶媒が、少なくとも約85％の極性非プロトン性溶媒(v/v)と、約15％(v/v)以下の、水またはアルコール(例えばエタノールもしくはメタノール)からなる群より選択されるプロトン性溶媒またはこれらの混合物とを含む、請求項1または2記載の方法。
  4. 親油性カチオンが、第4級アンモニウムカチオンまたは第4級ホスホニウムカチオンである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. 親油性カチオンが、少なくとも1つの親油性C4〜36アルキル基を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 親油性カチオンが、少なくとも1つの親油性C4〜36アルキル基を含む第4級テトラアルキルアンモニウム塩、例えばテトラブチルアンモニウムまたはセチルトリメチルアンモニウムである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. オリゴヌクレオチドが、
    ホスフェート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群より独立してまたは依存して選択されるヌクレオシド間連結を利用する、6〜30個のリン連結ヌクレオシド
    を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、いずれかの請求項7記載の方法。
  9. オリゴヌクレオチド中に存在するリンヌクレオシド間連結あたり少なくとも0.5モル当量の親油性カチオンが用いられる、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 極性非プロトン性溶媒が、ジメチルアセトアミド、スルホラン、ジメチルホルムアミド(DMF)およびジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  11. 極性非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドより選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  12. 極性非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミドである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  13. 活性エステル基が、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、スルホ-NHSエステル、ペンタフルオロフェニル(PFP)エステル、スルホテトラフルオロフェニル(STP)エステル、O-アシルイソ尿素、酸無水物からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. オリゴヌクレオチドの反応性アミノ基が、アミノリンカー、例えばアミノ-C1〜6-アルキルリンカーまたはアミノエチレングリコールリンカー上に存在する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. アミノリンカーが、アミノヘキシルリンカーを含む、請求項14記載の方法。
  16. コンジュゲート基が、タンパク質、例えば酵素、抗体もしくは抗体断片、またはペプチド；親油性部分、例えば脂質、リン脂質、ステロール；ポリマー、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール；受容体リガンド；小分子；レポーター分子；ビタミン；および非ヌクレオシド炭水化物からなる群より選択される非ヌクレオチド部分であるかまたはそれを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
  17. コンジュゲート基が、炭水化物部分であるかまたはそれを含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
  18. 炭水化物基が、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、請求項17記載の方法。
  19. コンジュゲート基が、1つまたは複数のN-アセチルガラクトース残基、例えば1つまたは複数のGalNAc残基を含む、請求項16〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. コンジュゲート基が、三価GalNAc炭水化物部分を含む、請求項16〜19記載の方法。
  21. コンジュゲート基/オリゴヌクレオチドのモル比が、1.5未満、例えば1.2未満、例えば約1である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
  22. オリゴヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドコンジュゲート生成物の変換率が、少なくとも50％、例えば少なくとも75％である、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
JP2018516673A 2015-10-02 2016-09-29 オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法 Expired - Fee Related JP6893505B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15188120 2015-10-02
EP15188120.8 2015-10-02
PCT/EP2016/073224 WO2017055423A1 (en) 2015-10-02 2016-09-29 Oligonucleotide conjugation process

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018531245A true JP2018531245A (ja) 2018-10-25
JP2018531245A6 JP2018531245A6 (ja) 2018-12-13
JP6893505B2 JP6893505B2 (ja) 2021-06-23

Family

ID=54288639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018516673A Expired - Fee Related JP6893505B2 (ja) 2015-10-02 2016-09-29 オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10577388B2 (ja)
EP (1) EP3355932B1 (ja)
JP (1) JP6893505B2 (ja)
KR (1) KR20180073584A (ja)
CN (1) CN108136041B (ja)
WO (1) WO2017055423A1 (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5645840B2 (ja) 2008-12-02 2014-12-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ リン原子修飾核酸の合成方法
EP2451461A4 (en) 2009-07-06 2013-05-29 Ontorii Inc NOVEL NUCLEIC ACID PRODRUGS AND METHOD OF USE THEREOF
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
WO2013012758A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Ontorii, Inc. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
RU2693381C2 (ru) 2012-07-13 2019-07-02 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Асимметричная вспомогательная группа
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
CN108136041B (zh) 2015-10-02 2022-12-30 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合方法
CN108779465B (zh) 2016-03-14 2022-05-13 豪夫迈·罗氏有限公司 用于减少pd-l1表达的寡核苷酸
WO2018215049A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
BR112021003998A2 (pt) * 2018-10-24 2021-05-25 F. Hoffmann-La Roche Ag processo para a purificação de oligonucleotídeos
US11510939B1 (en) 2019-04-19 2022-11-29 Apellis Pharmaceuticals, Inc. RNAs for complement inhibition
CN118165059A (zh) * 2024-03-11 2024-06-11 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种n2-c6氨基修饰脱氧鸟苷单体的合成方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004500006A (ja) * 1998-06-22 2004-01-08 ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア 核酸が結合した比色アナライト検出器
JP2012530059A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 改善された脂質製剤
WO2013033230A1 (en) * 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2014118267A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3390468B2 (ja) * 1991-10-16 2003-03-24 バイエル コーポレーション 新規の無水混合物法による遺伝子プローブの結合方法
WO1997020563A1 (en) 1995-11-22 1997-06-12 The Johns-Hopkins University Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
WO1999067423A1 (en) 1998-06-22 1999-12-29 The Regents Of The University Of California Nucleic acid-coupled colorimetric analyte detectors
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
EA015570B1 (ru) 2006-04-03 2011-10-31 Сантарис Фарма А/С Фармацевтическая композиция
WO2008113832A2 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S SHORT RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF TARGET mRNA
US8440637B2 (en) 2007-10-04 2013-05-14 Santaris Pharma A/S Combination treatment for the treatment of hepatitis C virus infection
EP2285819B1 (en) 2008-04-04 2013-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
AU2009234266B2 (en) 2008-04-11 2015-08-06 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
AU2011343664B2 (en) 2010-12-17 2015-10-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for siRNA
BR122020024388B1 (pt) 2010-12-29 2021-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotídeo e composição farmacêutica
DK2920307T3 (en) 2012-11-15 2018-07-16 Roche Innovation Ct Copenhagen As ANTI-APOB, ANTISENSE CONJUGATE RELATIONSHIPS
WO2014118272A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
JP6649248B2 (ja) 2013-05-01 2020-02-19 レグルス セラピューティクス インコーポレイテッド 細胞取り込みの向上のための化合物および方法
KR20160002977A (ko) 2013-05-01 2016-01-08 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 조성물 및 방법
CN108136041B (zh) 2015-10-02 2022-12-30 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004500006A (ja) * 1998-06-22 2004-01-08 ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア 核酸が結合した比色アナライト検出器
JP2012530059A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 改善された脂質製剤
WO2013033230A1 (en) * 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2014118267A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILESI, D. ET AL.: "Synthesis of oligonucleotide conjugates in anhydrous dimethyl sulfoxide", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 313, JPN6020022419, 1999, pages 164 - 173, ISSN: 0004434641 *
村上 章 ほか: "機能性アンチセンスＤＮＡの化学合成", 有機合成化学, vol. 48, no. 3, JPN6020022420, 1990, pages 180 - 193, ISSN: 0004434642 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180305392A1 (en) 2018-10-25
EP3355932B1 (en) 2023-04-12
US10577388B2 (en) 2020-03-03
CN108136041B (zh) 2022-12-30
CN108136041A (zh) 2018-06-08
KR20180073584A (ko) 2018-07-02
JP6893505B2 (ja) 2021-06-23
US20210040137A1 (en) 2021-02-11
US11555050B2 (en) 2023-01-17
EP3355932A1 (en) 2018-08-08
WO2017055423A1 (en) 2017-04-06
HK1255466A1 (zh) 2019-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6893505B2 (ja) オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法
JP2018531245A6 (ja) オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法
JP6758335B2 (ja) テロメラーゼ阻害のための改変オリゴヌクレオチド
CA2071483C (en) Oligonucleotide analogs with novel linkages
JP5812478B2 (ja) 抗癌剤結合性核酸アプタマー及びその利用
JP6704196B2 (ja) オリゴヌクレオチド
US20210388359A1 (en) Oligonucleotide formulation method
JP2023504186A (ja) 標的化された核酸送達のためのペプチドドッキング賦形剤
US20240384269A1 (en) Compositions containing nucleic acid nanoparticles and processes related to alteration of their physiochemical characteristics
KR20140044324A (ko) 페길화된 올리고뉴클레오티드의 제조방법
KR20130068032A (ko) 안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법
US20170015667A1 (en) Thiol-x click foldamers for polymer affinity and catalysis libraries
US11987904B2 (en) Oligonucleotides and methods for preparing
HK1255466B (en) Oligonucleotide conjugation process
Copp Repair of Intrastrand Alkylene Cross-links in Various DNA Structures by O6-Alkylguanine DNA Alkyltransferases
JP2025529283A (ja) 眼への投与のための二本鎖ｒｎａ分子
WO2024069235A2 (en) Compositions containing oligonucleotides with theranostic applications
WO2024015924A2 (en) Hybrid oligonucleotides
HK40060206A (en) Oligonucleotide formulation method

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190722

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200625

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200923

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201218

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210201

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210311

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210416

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210510

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210601

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6893505

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees