JP2018522880A - デングウイルス及び樹状細胞による併用療法のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本明細書には、腫瘍抗原でパルスした樹状細胞とデングウイルスの組み合わせにより癌を処置するための組成物と方法が記載される。治療的介入の２つの形態の組み合わせにより、何れか単独と比べて癌細胞減少の強化がもたらされる。本明細書に記載される組成物及び方法により標的とされる癌は、固形癌又は血液癌であり得る。
【選択図】図１

Description

本出願は、２０１５年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／２３１，３５１号の利益を主張し、該仮出願は、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１６年６月２９日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、４８２５３−７０２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１，８７１バイトのサイズである。

免疫療法は、細胞障害性薬物、放射線、及び手術とは異なり、腫瘍細胞を認識且つ死滅させるために免疫系を刺激するものである。腫瘍細胞を認識且つ破壊するために免疫系を刺激する際に、多数の試みが行われてきた。これらは、免疫療法、免疫活性化の欠如、有害事象、及び／又は腫瘍免疫回避機構の標的として選択されるペプチドの同一性が原因で、成功が制限されてきた。

本明細書には、被験体の癌を処置する方法が記載され、該方法は以下を含む：少なくとも１つの腫瘍細胞抗原で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０を被験体に投与する工程；及びＤＣを被験体に投与する工程。本明細書には更に、少なくとも１つの腫瘍細胞抗原が、被験体の固形癌細胞又は血液癌細胞に由来する方法が提供される。本明細書には更に、血液癌が白血病又はリンパ腫である方法が提供される。本明細書には更に、固形癌が黒色腫、乳癌、前立腺癌、又は脳癌である方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが白血球除去により得られる方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣ又は少なくとも１つの腫瘍細胞抗原が被験体由来である方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣ及び少なくとも１つの腫瘍細胞抗原が被験体由来である方法が提供される。本明細書には更に、少なくとも１つの腫瘍細胞抗原が被験体由来である方法が提供される。本明細書には更に、少なくとも１つの腫瘍細胞抗原が単細胞を含む懸濁液に存在する方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが少なくとも１つの腫瘍細胞抗原でパルスされる方法が提供される。本明細書には更に、少なくとも１つの腫瘍細胞抗原がペプチドである方法が提供される。本明細書には更に、ペプチドが約９の長さのアミノ酸である方法が提供される。本明細書には更に、２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０が、全身感染を誘発するのに十分な量で存在する方法が提供される。本明細書には更に、被験体の体温が摂氏３８度以上に到達した後ＤＣが投与される方法が提供される。本明細書には更に、被験体の体温が摂氏３８．５度に到達した後にＤＣが投与される方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣを得るために被験体の単球を処理する方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが、抗原の取り込みが可能な成熟ＤＣである方法が提供される。

本明細書には、被験体の癌を処置する方法が記載され、該方法は以下を含む：アポトーシス性又は壊死性の小体（ｂｏｄｉｅｓ）を含む溶解生成物を形成するために被験体から腫瘍組織を溶解する工程；溶解生成物で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；デングウイルスを被験体に投与する工程；及び、被験体の体温が摂氏３８度以上に到達した後にＤＣを被験体に投与する工程。本明細書には更に、腫瘍組織が固形癌又は血液癌由来の細胞を含む方法が提供される。本明細書には更に、血液癌が白血病又はリンパ腫である方法が提供される。本明細書には更に、固形癌が黒色腫、乳癌、前立腺癌、又は脳癌である方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが被験体由来である方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが白血球除去により得られる方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが被験体由来ではない方法が提供される。本明細書には更に、腫瘍組織が、溶解前に単細胞を含む懸濁液に存在する方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが溶解生成物でパルスされる方法が提供される。本明細書には更に、デングウイルスが、全身感染を誘発するのに十分な量で投与される方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣの獲得が、樹状細胞を生成するために被験体の単球を処理することを含む方法が提供される。本明細書には更に、ＤＣが、抗原の取り込みが可能な成熟ＤＣである方法が提供される。本明細書には更に、腫瘍組織が０．５〜５グラムの量である方法が提供される。本明細書には更に、腫瘍組織が１〜２グラムの量である方法が提供される。本明細書には更に、デングウイルスが血清型１、２、３、４、又は５である方法が提供される。本明細書には更に、デングウイルスが血清型２である方法が提供される。本明細書には更に、デングウイルスが２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０である方法が提供される。本明細書には更に、被験体の体温が摂氏３８．５度に到達した後にＤＣが被験体に投与される方法が提供される。

本明細書には、癌細胞を標的とする方法が提供され、該方法は以下を含む：少なくとも１つの腫瘍細胞抗原で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０を被験体に投与する工程；及びＤＣを被験体に投与する工程。

本明細書には、癌細胞を標的とする方法が提供され、該方法は以下を含む：アポトーシス性又は壊死性の小体を含む溶解生成物を形成するために被験体から腫瘍組織を溶解する工程；溶解生成物で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；デングウイルスを被験体に投与する工程；及び、被験体の体温が摂氏３８．５度以上に到達した後にＤＣを被験体に投与する工程。

本明細書には、腫瘍細胞の減少のための組成物が提供され、該組成物は、免疫応答を起こすのに有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０を含み、ここで、２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０は、腫瘍抗原で刺激した樹状細胞の投与の前に投与された時、何れかの薬剤単独の投与と比べて、腫瘍細胞の減少の強化をもたらす。本明細書には更に、腫瘍細胞が固形癌又は血液癌由来である組成物が提供される。本明細書には更に、血液癌が白血病又はリンパ腫である組成物が提供される。本明細書には更に、固形癌が黒色腫、乳癌、前立腺癌、又は脳癌である組成物が提供される。

本明細書には、癌の処置用の薬物の製造のための、有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０の使用が提供される。本明細書には、癌の処置用の有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０の使用が提供される。本明細書には、癌の処置に使用される、有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０が提供される。

デングウイルス及び刺激された樹状細胞による処置方法を例示する。 様々な処置条件下での、マウスの黒色腫細胞からの肺転移の数に対応するプロットを示す。模様付きの棒は、各条件に対する肺転移の平均数を表わす。 様々な処置条件下での、マウスの黒色腫細胞からの肺転移の数に対応するプロットを示す。模様付きの棒は、各条件に対する肺転移の平均数を表わす。

定義
本開示の全体にわたり、様々な実施形態は、範囲フォーマット（ｒａｎｇｅ ｆｏｒｍａｔ）で提示されてもよい。範囲フォーマットでの記載は単に利便性と簡潔さのためのものであり、実施形態の範囲に対する確固たる制限として解釈されるべきでないことを、理解されたい。従って、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲、同様に、文脈が明確に指示していない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと考慮されねばならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６といった、具体的に開示されたサブ範囲、同様に、例えば１．１、２、２．３、５、及び５．９といった範囲内にある個々の値を有すると、考慮されねばならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。このような介在する範囲の上下限範囲は、より小さな範囲に独立して含まれ得、及び、明示された範囲における任意の明確に除外された制限に従い、本発明内にも包含される。述べられた範囲が制限の１つ又は両方を含む場合、そのような含まれる制限の何れか又は両方を除いた範囲も、文脈が明確に指示していない限り本発明に含まれる。

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、実施形態を制限するようには意図されていない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、同様に複数形を含むように意図される。用語「含む」及び／又は「含むこと」は、本明細書での使用時に、明示された特徴、整数、工程、操作、要素、及び／又はコンポーネントの存在を特定するが、１以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、コンポーネント、及び／又はそれらの群の存在又は追加を妨げないことが、更に理解される。本明細書で使用されるように、用語「及び／又は」は、関連する列挙された品目の１以上の、何れか及び全ての組み合わせを含む。

具体的に明示されていない、又は文脈から明白ではない限り、本明細書で使用されるように、数又はその範囲に関して用語「約」とは、数字又は数字の範囲に関して、明示された数及びその＋／−１０％の数を意味し、或いは、範囲について列挙された値に対する下限より１０％低い且つ上限より１０％高い数を意味する。

本明細書で使用されるような用語「被験体」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、ラット、マウス、非ヒト霊長類、及びヒトを含む霊長類を含む。

併用送達
本明細書には、腫瘍免疫回避機構を克服し且つ腫瘍細胞を枯渇させるために、樹状細胞のワクチン接種がデングウイルス（ＤＶ）の株のアジュバント効果と組み合わされる、組成物と方法が記載される。本明細書に記載される方法は、被験体（１０１）から樹状細胞（１０２）と腫瘍細胞（１０４）を得ること（１０１）、樹状細胞を刺激（又は「活性化」）するために腫瘍細胞又は腫瘍細胞溶解物（１０５）に樹状細胞を晒すこと（１０５）（樹状細胞を「パルスすること」とも称される）、結果として生じる刺激され且つ腫瘍を標的とする樹状細胞を被験体の免疫系がＤＶ（１０８）で刺激された後に被験体に送達すること（１０７）により、癌を患う被験体（１０１）を処置するために使用されてもよい（例えば、図１を参照）。随意に、被験体由来ではない腫瘍抗原が、樹状細胞のパルス化のために使用され得る。

腫瘍免疫回避機構は、大半の免疫療法プラットフォームに見られる効果の不足に起因する。本明細書に記載される組成物と方法は、腫瘍細胞を破壊するために、生理学的（腫瘍灌流の温熱減少（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ））経路、免疫学的（適応性且つ先天性の免疫系のエフェクター細胞の活性化）経路、及びアポトーシス誘発経路（ｓＴＲＡＩＬ）を組み合わせる、多角的な手法を提供する。アジュバントとしてＤＶを使用し、相乗効果において作用する多くの経路を活性化することで、突然変異した腫瘍細胞の撲滅が支援され得、癌免疫療法の臨床効果が改善される。本明細書に記載される方法は、同時に作用の複数の機構に基づいた癌免疫療法を提供し、結果として、１つの方法のみの送達と比べて、腫瘍細胞が抵抗法を利用する能力の低下をもたらす。

本明細書には、被験体の癌を処置する方法が開示され、該方法は以下を含む：樹状細胞（ＤＣ）を得る工程；少なくとも１つの腫瘍細胞抗原でＤＣをインキュベートする工程；２型デングウイルスの血清型株を被験体に投与する工程；及びＤＣを被験体に投与する工程。幾つかの例において、２型デングウイルスの血清型株はＤＥＮＶ−２＃１７１０である。幾つかの例において、樹状細胞は自己樹状細胞である。幾つかの例において、樹状細胞は同種樹状細胞である。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞でＤＣをインキュベートすることを含む。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞溶解物でＤＣをインキュベートすることを含む。

腫瘍細胞を分離及び溶解する方法
本明細書には、腫瘍細胞を標的とするためにＤＶ及び活性化ＤＣによる併用療法のための方法が提供される。幾つかの例において、ＤＣは、被験体由来の腫瘍細胞で刺激される。幾つかの例において、腫瘍細胞は、本明細書において腫瘍支持細胞と称される、被験体の腫瘍微小環境から分離された細胞である。幾つかの例において、樹状細胞は、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、及び／又はそれらのペプチドに晒され／腫瘍細胞、腫瘍支持細胞及び／又はそのペプチドでパルスされ、それにより樹状細胞は、腫瘍細胞、及び／又は、腫瘍の増殖と転移を支持する腫瘍支持細胞（例えば内皮細胞、血管細胞、免疫細胞など）を標的とする。幾つかの例において、腫瘍細胞及び腫瘍支持細胞由来のペプチド／抗原は、腫瘍細胞と腫瘍支持細胞両方の上でペプチド／抗原に対する受容体を持つ樹状細胞又は細胞障害性リンパ球を誘発し、その結果、腫瘍細胞のみではなく腫瘍微小環境への樹状細胞又は細胞障害性リンパ球の標的化がもたらされる。幾つかの例において、腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞は腫瘍組織の生検から得られる。幾つかの例において、生検は、腫瘍細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、浸潤性免疫細胞、及びそれらの組み合わせから選択された細胞を含む。

本明細書には、腫瘍細胞を標的化するためにＤＶ及び活性化ＤＣによる併用療法のための方法が提供され、ＤＣは、溶解した腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞及び周囲の細胞外マトリックスにより活性化される。幾つかの例において、溶解は、赤血球を除去するために腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞をＮＨ_４Ｃｌ酵素溶液と接触させることを含む。幾つかの例において、溶解は、免疫原性細胞死を誘発するために腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を次亜塩素酸溶液と接触させることを含む。幾つかの例において、細胞は、ペプチドを破壊しないよう十分に優しく溶解される。幾つかの例において、細胞は、アポトーシス性又は壊死性の小体を生成するために溶解される。幾つかの例において、前記方法は、酵素溶液により腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。幾つかの例において、前記方法は、過酸化物を含まない溶液又は低過酸化物含有溶液により腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。幾つかの例において、前記方法は、洗浄剤溶液により腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。幾つかの例において、洗浄剤は、限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ ２０、及びＣＨＡＰＳＯから選択される。幾つかの例において、洗浄剤溶液は、過酸化物及び他の不純物から精製される。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約０．１％〜約１０％ ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約０．１％〜約５％ ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約０．５％〜約５％ ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約１％〜約１０％ ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約１％〜約５％ ｖ／ｖである。幾つかの例において、前記方法は、細胞の振盪、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、冷凍、解凍、剪断圧力、超音波処理、及び／又は加熱を行うことなく、細胞を溶解する工程を含む。

樹状細胞（ＤＣ）を分離及び刺激する方法
本明細書には、腫瘍細胞を標的とするためにＤＶ及び活性化ＤＣによる併用療法のための方法が提供され、ＤＣは自己又は同種の樹状細胞を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、同種の刺激された樹状細胞を被験体に投与する工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、自己の刺激された樹状細胞を被験体に投与する工程を含む。

幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、骨髄中のＣＤ３４^＋前駆細胞から樹状細胞を得る工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、末梢血中のＣＤ１^＋ＣＤ１４^＋未成熟単球から樹状細胞を得る工程を含む。幾つかの例において、樹状細胞を得る工程は白血球除去を含む。幾つかの例において、白血球除去は、被験体又はドナーから１ユニットの血液（ａ ｕｎｉｔ ｏｆ ｂｌｏｏｄ）を引き抜くこと、一連の血液成分：赤血球、血小板、及び血漿因子の大部分を分離することを含み、一連の血液成分は、白血球が残った状態で被験体に戻される。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、無菌のために白血球を試験する工程、白血球を冷たい状態（４℃）で運ぶ又は保存する工程、又はアフェレーシス生成物からＤＣを処理する工程を含む。

幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ペプチドでＤＣをパルスする工程含む。幾つかの例において、前記方法は、ＭＨＣクラスＩ分子（「ＭＨＣクラスＩペプチド」）に結合するペプチドでＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子（「ＭＨＣクラスＩＩペプチド」）に結合するペプチドでＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ＭＨＣクラスＩペプチドとＭＨＣクラスＩＩペプチドでＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、パルスする工程により、ＣＴＬを刺激し且つ腫瘍に対するＣＴＬを標的化する能力をＤＣに与える。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、製造された／合成のクラスＩ及び／又はクラスＩＩのペプチドでＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、クラスＩ及び／又はクラスＩＩのペプチドは、製造され、次いでＤＣ培地に添加され、随意にマイクログラム量以下である。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、持続した免疫応答のためのクラスＩＩペプチドを含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ペプチド（即ち腫瘍抗原）のＤＮＡ又はＲＮＡを配列決定する工程、及び／又は、抗原処理を引き起こすためにＤＮＡ又はＲＮＡをＤＣに挿入するためのエレクトロポレーションを使用する工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ＤＣに一致するＨＬＡを必要としない。幾つかの例において、ペプチド又はその一部は、ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、（ＴＡＹＲＹＨＬＬ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、又はそれらの組み合わせから選択されたアミノ酸配列により表される。

幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、樹状細胞を自己腫瘍細胞又はその溶解物と接触させる工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、広範囲且つ深い免疫応答のための潜在的な抗原の完全なアレイを含有する自己腫瘍細胞全体（例えば腫瘍細胞及び腫瘍支持細胞）又はその溶解物と、樹状細胞を接触させる工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、樹状細胞を、アポトーシス性又は壊死性の小体を含む腫瘍細胞溶解物と接触させる工程を含む。更なる例において、腫瘍細胞溶解物は、細胞外マトリックスタンパク質などの、腫瘍細胞を取り囲む微小環境からの腫瘍抗原を含む。幾つかの例において、接触させる工程はパルス化を含み、ここで、パルス化は、１以上の間隔で１回より多く樹状細胞を接触させることを含む。幾つかの例において、ＤＣの「パルス化」は、ＤＣを、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、及び／又は腫瘍支持細胞溶解物と接触させることを含む。幾つかの例において、腫瘍細胞を溶解する工程は、単純且つ迅速ではあるが、中にある繊細なペプチドを傷つけかねない、トリプシン酵素消化と凍結融解サイクルを含まない。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、限定されないが、サンプルを手で刻むために；ＰＢＳ溶液中で細胞を懸濁するために；及び／又は予め選択された組織特異的なソフトウェアにより制御されるローターシステムで腫瘍細胞を分離するために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムのような自動細胞処理装置を使用する工程を含む。幾つかの例において、単個細胞浮遊液は膜溶解され（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｌｙｓｅｄ）、腫瘍ペプチドへの損傷は最小限である。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約１時間〜約２４時間ＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約１２時間〜約４８時間ＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約８時間〜約２４時間ＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約１８時間ＤＣをパルスする工程を含む。

デングウイルス
本明細書には、腫瘍細胞を標的とするためにデングウイルス（ＤＶ）及び活性化ＤＣによる併用療法のための方法が提供され、ＤＶは被験体に投与される。本明細書で使用されるように、用語「デングウイルス」は、デングウイルスの血清型１、２、３、４、又は５の何れかの血清型を含む。

デングウイルスはアルボウイルスであり、ネッタイシマカ腫及びヒトスジシマカ種の蚊により排他的に伝搬される。ウイルスは、未確認の森林に生息する哺乳動物リザーバー（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）（恐らく霊長類）及びヒト宿主に関する、複雑な生活環を持つ。メスの蚊は感染した人から血液食料（ｂｌｏｏｄ ｍｅａｌ）を得て、ウイルスは腸管の上皮細胞において高感染力価（１０５／ｍｌ）にまで複製し、その後、蚊が別の血液食料の後に逆圧を使用して自身の口針を引っ込める時に、別の人に伝達される。デング熱伝染病は毎年５０００万人に感染し、うち数千人が死亡し、死亡者は通常、二次感染に関連するショックの処置が不適切な子供である。

デングウイルスゲノムは、構造タンパク質、カプシドタンパク質Ｃ、膜タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ、及び非構造タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、及びＮＳ５をコードする。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの生きた株である。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの弱毒化株である。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの弱められた株である。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの以下の血清型から選択される：ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、及びＤＥＮＶ−５、並びにそれらの組み合わせ。

デングウイルスは、トガウイルス・ファミリー（フラビウイルス科のサブファミリー）（群Ｂ）のプラス鎖ＲＮＡウイルスである．ウイルスは、正２０面体（ｉｃｏａｓｈｅｄｅｒａｌ）の幾何構造を有しており、直径およそ４０−４５ナノメートルである。１１，０００の塩基ゲノムは、ヌクレオカプシド（ＮＣ）、タンパク質、ｐｒＭ膜融合タンパク質、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、及び５つの非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ５をコードする。ＮＣタンパク質は、ｐｒＭ複合体を介して取り付けられたエンベロープスパイクを持つ、ウイルスコアを形成する。Ｅ糖タンパク質は中和抗体の主要標的であり、ＮＳ−３とＮＳ−４のタンパク質は、ＣＤ４＋とＣＤ８＋ＣＴＬのために主要標的を構築する。

デングウイルスは、５つの別個の血清型である、ＤＥＮＶ−１〜ＤＥＮＶ−５を構築する。血清型２と４は、ＩｇＧに対して交差中和性（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）であり、１と３も交差中和性である。免疫性は完全ではないが、デング熱は、非交差中和性の血清型による後の感染が、免疫の過剰活性化からのショック症候群に起因した死亡率の危険性の増大をもたらすという点で、ウイルス感染の中でも独特なものである。

本明細書には、デングウイルスの血清型１、２、３、４、又は５を含む組成物、及びそのような組成物の使用方法が提供される。幾つかの例において、ＤＶは血清型２である。幾つかの例において、ＤＶの血清型２は、ＤＥＮＶ−２株＃１７１０である。この株は、１９８５年にプエルトリコから採取され、且つ、エンベロープ遺伝子領域に特異的な４つのプライマー（表１を参照）を使用した制限部位に特異的なＲＴ−ＰＣＲ分析からＡ型として特徴化された、サンプル由来のものである。Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５３， ８６−９５（１９９９）を参照。このようなプライマーを持つ制限部位に特異的なＲＴ−ＰＣＲは、５８２の塩基対、７５４の塩基対、及び恐らく６７６の塩基対の増幅産物を生成する。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、エントリーナンバー５５５としてＣＤＣのデータベースに記録されている。Ｈａｒｒｉｓ（１９９９）を参照。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、プエルトリコの伝染病中に隔離された。この大流行により、感染の疑いはあるがウイルスによる死亡が確認されない、ＤＶと疑われた９，５４０の症例が存在し、このことは、ＤＥＮ−２株＃１７１０の毒性が非常に低く、それ故本明細書に開示される方法に適していることを示している。

ＤＶは、癌免疫療法の強力な免疫刺激物質としての使用を支持する多くの特徴を有している。ＤＶは、未成熟のＢリンパ球、及び単球／マクロファージ及びＤＣの系列の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して親和性を持つ。ＤＶの特有の機能は、初期感染の結果、ＣＤ４＋とＣＤ８＋ヘルパー・誘導物質及び細胞傷害性・エフェクターＣＴＬの、Ｔ_Ｈ１型応答の活性化がもたらされるということである。感染により（但し、ＡＰＣを死滅させない）、ＤＶは、それらのＣＤ８０とＣＤ８３の発現をアップレギュレートし、その結果、炎症促進性Ｔ_Ｈ１サイトカインのプロファイルをもたらす。初期のＤＶ感染は、活性化ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞、同様にＬＡＫ細胞とのＴ_Ｈ１型応答を誘発する。この種の応答は、癌免疫療法に対する完全寛解を有している患者で確認される（表２を参照）。

初期感染において、ＤＶ由来の死亡率は非常に低い（マンソン熱帯病（Ｍａｎｓｏｎ’ｓ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）では６１，０００分の１）。ウイルスは、単球マクロファージと樹状細胞系列のＡＰＣを感染させるが、死滅させない。その後、このような感染したＡＰＣは、炎症性促進性（ＴＮＦ−アルファとＩＬ−１ベータ）、及びＴ_Ｈ１（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、及びＩＬ−２１）タイプのサイトカインカスケードを発生させる（ｂｅｇｉｎ）。このようなサイトカインの結果、適応性（ＣＴＬ）及び先天性（ＮＫ）両方の免疫系の強力な活性化がもたらされる。３−５日の潜伏期の後、発熱が３９．５−４０．５℃で生じ、４−５日間にわたり上昇し続ける。患者は、激しい頭痛、関節痛、倦怠感、及び光に対する敏感性を経験する。胸部と背部、時には脚と腕を覆う発疹が、発熱の３日目まで進行する。臨床的に、デング熱感染の結果として血小板数の低下がもたらされ、それにより出血が引き起こされ、これはショック症候群の場合に軽微なものから生命の危険があるものにまで及ぶ。賢明な流体管理に基づく適切な支援的ケアにより、回復は症例の９９％において達成される。

被験体の細胞における遺伝子の発現は、ＤＶ感染により増大される場合があり、限定されないが、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ ＣＤ８抗原、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＴＲＡＩＬ、ＩＰ１０、ＧＮＬＹ、ＧＺＭＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＰアルファ１、ＨＬＡ−ＤＰベータ１、及びＺＡＰ７０を含む。このような遺伝子に対応するタンパク質のレベルの増大は、被験体の循環体液において観察される場合もある。レベルは少なくとも２倍増大する場合がある。レベルは２倍−１０００倍増大する場合がある。レベルは２倍−１００倍増大する場合がある。レベルは２倍−１０倍増大する場合がある。ＤＶを投与される被験体の細胞型はＤＶ感染により増大される場合があり、限定されないが、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋６２Ｌ−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ細胞、ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ８＋細胞、Ｔｉａ−１ ＣＤ８＋細胞、ＶＬＡ−４ ＣＤ８＋細胞、ＩＣＡＭ−１ ＣＤ８＋細胞、及びＬＦＡ−１ ＣＤ８＋細胞を含む。幾つかの例において、ＴＮＦ−αは、ＤＶ感染中に免疫系により放出される。ＴＮＦαは、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦアポトーシス誘導リガンド）を介した腫瘍細胞の直接的な死滅を含む、多面的効果を持つ炎症性サイトカインである。

幾つかの例において、ＤＶは、γδＣＴＬ、活性化Ｍ１マクロファージ、及び形質細胞性ＤＣ（ｐＤＣ）を含む様々な細胞から、高レベルの可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）を誘発する。幾つかの例において、ＤＶは、ＩＦＮβ、即ち、ＩＦＮαと同じ受容体に対して１０倍高い親和性を持つ多機能性サイトカインを活性化する。ＩＦＮβは、ウイルスＲＮＡの転写を抑止する際に同様の抗ウイルス特性を有しているが、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発においてはＩＦＮαよりもはるかに強力である。窒素酸化物とＩＦＮβは、デング熱感染中に相乗的な様式で作用することができる。このような分子は、Ｍ_１マクロファージ、ｐＤＣ、及びδγＣＴＬにより誘発された高レベルのｓＴＲＡＩＬにより媒介されるアポトーシスに対する耐性を克服するために、縦一列になって作用する場合がある。

癌
本明細書に記載される方法は、癌を患う被験体の処置を提供する。本明細書に記載される方法はまた、癌細胞の除去を提供する。幾つかの例において、被験体へのＤＶの投与は免疫応答を誘発する。幾つかの例において、免疫応答は、風邪ウイルスなど一般のウイルスと比較して強力である。幾つかの例において、免疫応答の結果、腫瘍退縮がもたらされる。

ＤＮＡマイクロアレイ分析は、何百もの遺伝的に異なる腫瘍クローンが、進行した腫瘍を有する一人の患者に存在し得ることを明らかにした。Ｏ_２供給量と遺伝子突然変異速度との間に、負相関のパターンが存在する。細胞障害性薬物、抗体、及び小分子などの大多数の薬剤は、ほぼ常に血液感染性であり、治療機構を回避する腫瘍クローンにＤａｒｗｉｎｉａｎの選択圧を加える。最低の灌流量のクローンは、薬物曝露が低く、且つ免疫系検出を回避する能力が高いため、それらに従来の治療に対する耐性を持たせる。本明細書には、癌細胞の標的化の方法が提供され、該方法は、癌を患う被験体にＤＶを投与することにより高熱を誘発する工程、突然変異された表現型を持つ低流動性の耐性クローンを飢えさせる工程、活性化リンパ球及び免疫系の他のアームによる排除のためにより遺伝的に安定したクローンを残す工程を含む。幾つかの例において、前記方法は、パルスしたＤＣを投与することにより、ＣＴＬ及びリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）の活性化と発熱を組み合わせる工程を含み、これにより、従来の癌治療薬（例えば、抗体薬物抱合体、キナーゼ阻害剤、小分子など）と合わせた場合、又はＣＴＬ単独の場合よりも高い反応速度を引き起こす。癌が進行した患者に確認される免疫抑制は、複雑且つ動的なプロセスである。これは、通常はＣＴＬにより「自己」と認識される、腫瘍抗原自体に対する耐性に関係している。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、この耐性を壊す工程、及び、ＤＶ感染が誘発する高レベルのＴ_Ｈ１サイトカインを達成する工程を含む。

本明細書で標的とされる癌は、再発性及び／又は難治性の癌の場合がある。幾つかの例において、癌は急性癌又は慢性癌である。幾つかの実施形態において、癌は急速進行型の難治性癌である。幾つかの例において、癌は寛解状態にある。幾つかの例において、癌は、第１期、第２期、第３期、又は第４期の癌である。幾つかの例において、癌は若年性癌又は成人癌である。癌の例は、限定されないが、肉腫、癌腫、リンパ腫、又は白血病を含む。幾つかの例において、癌は固形腫瘍又は脂肪肉腫である。

幾つかの実施形態において、癌は肉腫である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又は他の結合組織或いは支持組織の癌の場合がある。幾つかの例において、肉腫は、骨癌、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、両側性前庭シュワン腫（ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ）、骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば胞状軟部肉種、血管肉腫、葉状肉腫、皮幹線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨外性骨肉腫、繊維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、及び滑膜肉腫）を含んでいるが、これらに限定されない。肉腫はユーイング肉腫を含む場合がある。

幾つかの例において、癌は癌腫である。癌腫は、身体の表面を覆い、ホルモンを生成し、且つ腺を構築する細胞である上皮細胞に発生する癌である。限定されないが、癌腫は、乳癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頚部癌、消化管間質癌（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腺癌、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、肛門部の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盤の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頚の癌、脳下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、及び脊椎軸腫瘍を含む。幾つかの例において、癌は、基底細胞癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ）、黒色腫、非黒色腫、又は光線（日光）角化症などの皮膚癌である。

幾つかの例において、癌は神経内分泌癌である。幾つかの例において、癌は膵臓癌、甲状腺癌、又は前立腺癌である。幾つかの例において、癌は、上皮癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、間質卵巣癌、又は子宮頚癌である。幾つかの例において、癌は皮膚癌である。幾つかの例において、癌は血管新生（ｎｅｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）皮膚癌である。幾つかの例において、癌は黒色腫である。幾つかの例において、癌は腎臓癌、肺癌である。典型的な肺癌は、限定されないが、小細胞肺癌又は非小細胞肺癌を含む。幾つかの例において、癌は結腸直腸癌（例えば胃癌又は結腸癌）である。幾つかの例において、癌は脳癌である。幾つかの例において、癌は脳腫瘍である。幾つかの例において、癌は神経膠芽腫又は星状細胞腫である。

幾つかの例において、癌は肺癌である。幾つかの例において、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、又は中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍｉａ）である。ＮＳＣＬＣの例は、扁平上皮癌、腺癌、及び大細胞癌を含む。幾つかの例において、中皮腫は、肺と胸腔の内膜（胸膜）、又は腹部の内膜（腹膜）の癌腫瘍である。幾つかの例において、中皮腫はアスベスト曝露に起因する。

幾つかの例において、癌は中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍である。幾つかの例において、ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫又は非神経膠腫として分類される。幾つかの例において、神経膠腫は、悪性神経膠腫、高悪性度神経膠腫、びまん性内在性橋膠腫である。神経膠腫の例は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫（又は乏突起神経膠腫と星状細胞腫の要素の混合物）、及び上衣腫を含む。星状細胞腫は、限定されないが、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性神経膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、及び上衣下巨細胞神経膠星状細胞腫を含む。乏突起神経膠腫は、低悪性度乏突起神経膠腫（又は乏突起星状細胞腫）及びと未分化乏突起神経膠腫を含む。非神経膠腫は、髄膜腫、脳下垂体の腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、及び髄芽腫を含む。幾つかの例において、癌は脳膜腫である。

幾つかの実施形態において、癌は血液癌である。幾つかの例において、癌は白血病である。幾つかの例において、癌は骨髄性白血病である。幾つかの例において、癌はリンパ腫である。幾つかの例において、癌は非ホジキンリンパ腫である。幾つかの例において、癌は、骨肉腫性白血病、リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、好中球性白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、大細胞型リンパ腫、混合細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、再発性小リンパ球性リンパ腫、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、巨核芽球性白血病、単芽球性白血病、単球性白血病、赤白血病、赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、及び肝細胞癌から選択される。幾つかの例において、癌は血液悪性腫瘍である。幾つかの例において、血液悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍である。幾つかの例において、癌は慢性リンパ性白血病である。幾つかの例において、癌は急性リンパ芽球性白血病である。幾つかの例において、癌はＣＤ１９−陽性バーキットリンパ腫である。幾つかの実例において、白血病は、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、又は慢性骨髄性白血病である。白血病の更なるタイプは、限定されないが、有毛細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病、及び若年性骨髄単球性白血病を含む。

幾つかの例において、リンパ腫はＢリンパ球又はＴリンパ球から進行する。リンパ腫の２つの主なタイプは、以前はホジキン病として知られていたホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫である。幾つかの例において、非ホジキンリンパ腫は無痛性である。幾つかの例において、非ホジキンリンパ腫は活動的である。非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓周辺帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、及びリンパ腫様肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。

投与方法
本明細書には、デングウイルスと樹状細胞を、必要とする被験体に投与する工程を含む方法が提供される。幾つかの例において、ウイルスは水性形態で提供される。幾つかの例において、ウイルスは水溶液（例えば生理食塩水）中で凍結乾燥され且つ再構成される。幾つかの例において、ウイルスは、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮投与、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与、鼻腔内投与、リンパ管内注射、及び経口投与から選択された経路により投与される。幾つかの例において、被験体は、リンパ内マイクロカテーテルによりウイルスを注入される。

幾つかの例において、デングウイルスは、樹状細胞を投与する少なくとも２４時間前に最初に投与される。幾つかの例において、デングウイルスは、樹状細胞を投与する約１２時間前〜約９６時間前に最初に投与される。幾つかの例において、デングウイルスは、刺激された樹状細胞を投与する約２４時間前〜約７２時間前に最初に投与される。幾つかの例において、デングウイルスは、刺激された樹状細胞を投与する１日前〜４日前に最初に投与される。幾つかの例において、デングウイルスは１回だけ投与される。幾つかの例において、デングウイルスは１回より多く投与される。幾つかの例において、デングウイルスは、樹状細胞を受ける前にのみ投与される。幾つかの例において、デングウイルスは、刺激された樹状細胞を受けた後に投与される。幾つかの例において、デングウイルスは、刺激された樹状細胞を受ける前後に投与される。

幾つかの例において、前記方法は、１０^６ｐｆｕ／ｍｌの約０．５ｍｌの用量でデングウイルスを投与する工程を含む。幾つかの例において、用量は約１０^３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０^８ｐｆｕ／ｍｌである。幾つかの例において、用量は約１０^３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０^６ｐｆｕ／ｍｌである。

幾つかの例において、デングウイルスによる被験体の感染又は接種の成功は、高熱又は発熱の進行により確認される。幾つかの例において、デングウイルスによる被験体の感染又は接種の成功は、被験体の血液／血漿中を循環するサイトカインの存在又は増加により確認される。サイトカインは、限定されないが、インターロイキン−２及びインターフェロン−ガンマを含む場合がある。

幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、刺激された樹状細胞を、必要とする被験体に投与する工程を含む。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は１回より多く投与される。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、第１の時間と第２の時間に投与され、第１の時間と第２の時間は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、又は約６日、約８日、約１０日、約１２日、又は約１８日で区切られる。幾つかの例において、第１の時間と第２の時間は、約１週、約２週、約３週、又は約１か月で区切られる。幾つかの例において、第１の時間と第２の時間は、１か月以上で区切られる。幾つかの例において、第１の時間と第２の時間は、１２か月未満で区切られる。幾つかの例において、第１の時間と第２の時間は、１２か月以上で区切られる。

幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、被験体の体温上昇時に、刺激された樹状細胞を被験体に投与する工程を提供する。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体が発熱した後に投与される。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体の体温が約３７．５℃〜約４２℃に上昇した後に投与される。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体の体温が約３８℃〜約４２℃に上昇した後に投与される。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体の体温が少なくとも約３８．５℃に上昇した後に投与される。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体の体温が３８．５℃に上昇した後に投与される。幾つかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体の体温が摂氏３８度以上に達した後に被験体に投与される。幾つかの例において、被験体の体温は、鼓膜又は経口の方法により測定される。

実施例１．樹状細胞（ＤＣ）の生成とパルス化
Ｌｕｔｚ Ｍ．， ｅｔ． ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：７７−９２， １９９９）に記載される方法を使用して、マウス骨髄から成熟したＤＣを生成した。骨髄懸濁液を１０日間、組換え型のマウスＧＭ−ＣＳＦで補足された培地中のペトリ皿においてインキュベートした。非付着性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びリポポリサッカリドを含有する培地の中に集め、遠心分離し、再懸濁した。２日後、ＤＣを採取し、トリパンブルー色素排除によりそれらの生存率を判定した。ＤＣの純度をフローサイトメトリー分析により判定した。ＤＣを１８時間、１０μｇ／ｍｌで合成ペプチドによりパルスした。１８時間のインキュベーション後、ＤＣを採取し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、更なる研究のためにＨＥＳＳ中で再懸濁した（実施例２と３を参照）。

実施例２．第１のマウスモデルの黒色腫の処置のためのデングウイルスと樹状細胞
マウスモデルのアッセイを行い、デングウイルス（ＤＶ）株、及び腫瘍抗原で刺激した樹状細胞（ＤＣ）を使用して、癌細胞の標的化の組み合わせから生じた結果を観察した。ＤＶ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾部の基部に、注射により１×１０^６又は１×１０^７ｐｆｕ／ｍ１で０．０５ｍｌのデングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０）を接種させた。組換え型マウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）とＩＦＮ−ガンマ（Ｓｉｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、デングウイルス（Ｄｒ． Ｄｕａｎｅ Ｇｕｂｌｅｒにより提供されるＤＥＮ−２株＃１７１０（ＣＤＣデータベースのエントリーナンバー５５５））の投与後５、１０、１５、及び２０日目に、２，０００（ｒＩＬ−２）及び５００ １Ｕ（ｒＩＦＮ−ガンマ）での静脈注射により投与した。デングウイルス投与の７日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２つのペプチドで別々にインキュベートされ且つ静脈内注入されたマウスＤＣで免疫化した。ペプチドを合成した。オボアルブミン（ＯＶＡ−８）からのＨ−２ｂを制限されたペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を対照として使用した。抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１））及びＴＲＰ−１／７５（ＴＡＹＲＹＨＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２））に由来する、Ｂ１６黒色腫に関連するＨ−２ｂを制限されたペプチドを使用して、マウスＤＣをパルスした（詳細に関しては実施例１を参照）。ＤＣによる２回の更なる免疫化を１４日の間隔で与えた。最後のＤＣの注入の３日後、マウスの外側尾静脈に５×１０^４の生存可能なＢ１６黒色腫細胞を静脈内で負荷し、その後生存させ、これを腫瘍注射の後の時間（数日）にわたり生存する動物のパーセンテージとして記録した。データを５匹以上のマウス／群から記録した（表３と図２を参照）。

群２において投与されたマウス（デングウイルス血清型２型株＃１７１０、及び腫瘍ペプチドで刺激されたＤＣ）に観察された肺転移の数は、デングウイルス無しで腫瘍ペプチドにより刺激されたＤＣを投与した群１の対照マウスよりも７．５％少なかった。

実施例３．第２のマウスモデルの黒色腫の処置のためのデングウイルスと樹状細胞
マウスモデルのアッセイを行い、デングウイルス（ＤＶ）株、及び腫瘍抗原で刺激した樹状細胞（ＤＣ）を使用して、癌細胞の標的化の組み合わせから生じた結果を観察した。マウスにサイトカインを投与し、ヒトで観察されたＤＶに対する応答と平行させた。

Ｈ−^２ｂを制限されたＢ１６マウス黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−６３２２）を使用して、腫瘍をマウスに確立させた。樹状細胞のパルス化のために使用されるペプチド（抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７及びＴＲＰ−１／ｇｐ７５に由来する、Ｂ１６黒色腫に関連したＨ−^２ｂを制限されたペプチド）を合成した。樹状細胞を、Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：７７−９２， １９９９）に記載される方法に従いマウス骨髄から生成した。

０日目、マウスの外部尾静脈に５×１０^４の生存可能なＢ１６黒色腫細胞を静脈内に受けさせ、転移性肺腫瘍を確立させた。７日目、マウスの尾部の基部に、注射により１×１０^６又は１×１０^７ｐｆｕ／ｍ１で０．０５ｍｌのデングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０（ＣＤＣデータベースのエントリーナンバー５５５））を接種させた。組換え型マウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）とＩＦＮ−ガンマ（Ｓｉｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、デングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０）の投与後、５日の間隔で２，０００ １Ｕ（ｒＩＬ−２）及び５００ １Ｕ（ｒＩＦＮ−ガンマ）での静脈注射により投与した。２１、３５、及び４９日目に、マウスＤＣを、２つのペプチドで別個にインキュベートし、同日に２つの連続投与で静脈内に注入して、患者における投与の経路とスケジュールを一致させた（更なる詳細に関しては実施例２を参照）。マウスの対照群は、デングウイルス、又は、オボアルブミン（ＯＶＡ−８）、ＳＩＩＮＦＫＥＬからのＨ−^２ｂを制限されたペプチドでパルスされた樹状細胞を受けなかった。処置群と対照群を表４に示す。

９０日目に、動物を屠殺し、肺腫瘍のコロニーを計数した。Ｆｅｋｅｔｔｅ溶液での肺の吸入と固定の後、盲検のコード化様式で、転移性肺腫瘍を数えた。データを、転移の平均数；４匹のマウス／群として報告した（表５と図３を参照）。以下の主要な臓器系：脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び生殖腺の組織検査を行った（データは示さず）。

群Ｃのマウス（腫瘍抗原で刺激されたＤＣを投与したが、ウイルスは投与していない）に観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（対照ペプチドに晒されたＤＥＮＶ−２＃１７１０とＤＣを投与）よりも４７％少なかった。群Ａのマウス（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、及び腫瘍抗原で刺激されたＤＣを投与）に観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（対照ペプチドに晒されたＤＥＮＶ−２＃１７１０とＤＣを投与）よりも５４％少なかった。群Ｂのマウス（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、及び腫瘍抗原で刺激されたＤＣを投与）に観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（対照ペプチドに晒されたＤＥＮＶ−２＃１７１０とＤＣを投与）よりも５１％少なかった。群ＡとＢにおける平均減少は、群Ｄと比べて５２．８％であった。

実施例４．デングウイルスの製造と使用
Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓細胞）由来の、検証され且つ認証された細胞株を持つＭａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋを設けて、汚染物質と外来性の生体の不在について試験する。Ｖｅｒｏ株は、様々なウイルス性ワクチンを生成するために世界保健機関により使用されている。ＦＤＡ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（ＣＢＥＲ）により確立されたガイドラインに従い、デングウイルスを、Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ由来の検証されたＶｅｒｏ株において継代させ、ワーキングセルバンクとして確立させた。最初の種子ストックからの１型、２型、３型、又は４型のデングウイルスを、１０^−５のＭＯＩでＷＣＢのＶｅｒｏ細胞に加える。

第１の４ｍｌの重層培地（１リットルにつき、培養液（０．１６５％のラクトアルブミン加水分解物［Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｍｉｃｈ．］）中の１％のＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｍａｉｎｅ）、０．０３３％の酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、アール平衡塩類溶液、２５ｍｇの硫酸ゲンタマイシン［ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．］、及び１．０ｍｇのアムホテリシンＢ［Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ； Ｅ． Ｒ． Ｓｑｕｉｂｂ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．］、及び２％のＦＢＳを含有している）を、３７℃で１．５時間、２００ｍｌのウイルス接種材料の吸着後に加える。７日間３７℃でのインキュベーションの後、１ｍｌにつき更に８０ｍｇのニュートラルレッド生体染色（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）を含有している第２の２ｍｌの重層培地を加える。プラークを感染の８〜１１日後に計数する。

最終のウイルス培養物上でのプラークアッセイを、標準用量として１０^６ｐｆｕ／ｍｌの標的をもって行った。この標的が到達しない場合、超遠心分離を使用して、ウイルスを濃縮させる。ウイルス力価の確認後、最終生成物を濾過して細胞破片を取り除き、外来性の生体の不在について試験し、最終ロットの後に放出し、ＢＳＬ−２レベルの病原体としてのラベルを含む５ｍｌのボトルに入れ、搬送と投与の用意ができるまで４℃で保管した。

実施例５．腫瘍抗原でパルスされた樹状細胞の製造と使用
単球を他の白血球（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、及び好塩基球）から分離する。これは、免疫磁気選別、又は代替的に付着特性により達成される。免疫磁気選別は、免疫細胞のＣＤ表面タンパク質（ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ５６など）について抗体で覆われたプラスチックビーズを含む滅菌プラスチックカラムに白血球を注ぐことを含む。望まれない細胞はビーズに付着し、単球を通過させて集める。正の選別において、ＣＤ１^＋／ＣＤ１４^＋で覆われた磁気ビーズは単球を捕らえ、磁石はカラムに対して配され、望まれない細胞はＰＢＳ溶液を含むカラムから洗い流される。その後、単球は次の工程のためにビーズから洗い流される。付着選別において、特定の表面に付く単球の特性を使用して、傾斜させたカラムの下にアフェレーシス生成物を流すことによりそれらを分離する。

代替的に、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８のためのモノクローナル抗体での蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、リンパ球とＭＨＣクラス陽性細胞のために骨髄細胞を枯渇させる。１ｍｌの培養培地／ウェルにおよそ１００万個の細胞を含む２４ウェルのプレートにおいて、５％のＣＯ_２雰囲気の中３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２−ＭＥ、及び１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０ｕＭの非必須アミノ酸で補われた、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）において、残りの細胞を一晩培養した。２４時間後、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び９００Ｕ／ｍｌでの組換え型ＩＬ−４の存在下で、細胞を再び播種して培養する。３〜４日後、培地を新鮮なサイトカイン培地と交換した。

代替的に、経皮樹状細胞（ＤＤＣ）を、以下の方法を使用して調製する：健康なヒトボランティアから角化腫（Ｋｅｒａｔｏｍｅｓ）を、３７℃で１時間にわたり、ＲＰＭＩ１６４０において１．２Ｕ／ｍｌの終末濃度で、細菌プロテアーゼであるＤｉｓｐａｓｅ２型の溶液中でインキュベートする。潜伏期間後、上皮と真皮は容易に分けられる。その後、上皮及び真皮のシートを、ＰＢＳで数回洗浄した後に小さな（１−１０ｍｍ）片に切り、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補われたＲＰＭＩ１６４０に配し、１０ｃｍの組織培養プレートに配する。２−３日後、組織の片を取り除き、培地を集める。組織切片から培地へと移動する細胞を沈降させ、１−２ｍｌの新鮮培地において再懸濁し、トリパンブルーで染色する。更なる豊富化を、メトリザミド勾配上での分離により達成する。高浸透圧性の１４．５％のメトリザミドの３ｍｌのカラムに細胞を重ね、室温で１０分間にわたり６５０ｇで沈殿させる。低密度の間期細胞を集め、あまり高浸透圧性でない洗浄剤（１０％のＦＢＳと４０ｍＭのＮａＣｌを含むＲＰＭＩ１６４０）で連続して２回洗浄し、細胞を等張性に戻す。

単球の収集時、数が数千にしかならない場合もある。組換え型ヒト成長因子ｒｈｕインターロイキン−４（ＩＬ−４）、及びｒｈｕ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を、複数工程のプロトコルに使用して、５０００万の範囲までのＤＣの数の拡大を達成する。ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの添加は、成熟したＤＣマーカー：（ＣＤ１１^＋、ＣＤ８０^＋、ＣＤ８３^＋）の数と発達を拡張し、同様に、クラスＩのＭＨＣ複合体（ＣＤ８^＋に対する短ペプチドの提示のため）とクラスＩＩのＭＨＣ複合体（ＣＤ４^＋ヘルパー・インデューサーＴリンパ球に対するより長いペプチドの提示のため）の両方の発現を増大させた。およそ４日後、成熟したＤＣの数を測定する。

樹状細胞のパルス化
全体の自己腫瘍細胞溶解物を様々な方法により調製する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムのような自動細胞処理装置の開発により、サンプルを手で刻み、ＰＢＳ溶液中で懸濁させることが可能となり、次いで予め選択された組織特異的ソフトウェアにより制御されるローターシステムが腫瘍細胞を分離する。単個細胞浮遊液は膜溶解され得、腫瘍ペプチドへの損傷は最小限である。代替的に、サンプルは腫瘍細胞を分離しない。代わりに、サンプルは、腫瘍細胞と支持細胞（例えば、腫瘍微小環境の細胞）を含むように残される。誘発に必要とされるペプチドを破壊することなく、細胞をＮＨ_４Ｃｌで溶解して、赤血球を除去し、及び、ＣＴＬのアポトーシス性及び壊死性の小体を生成する。

溶解物の添加後、ＤＣは、ＣＴＬへの提示のためにペプチドを呑み込み（ｅｎｇｕｌｆ）且つ処理する。最終の工程は、炎症シグナルによる成熟である。好ましい薬剤は、細菌細胞壁からのリポ多糖（ＬＰＳ）である。ＬＰＳへの曝露後、ＤＣは、それらのＣＤ８０／ＣＤ８３^＋活性化マーカーをアップレギュレートし、１型ＣＴＬ応答を誘発するためにＩＬ−１２ｐ７０の産生を増大させ、更なる抗原の取り込みと処理に耐性を持つようになる。

最終的な無菌性、特異性、及び生存率の試験後、液体Ｎ_２中の−７０℃の冷凍、最大１年の保管、及び使用のための診療所への搬送に適したポリマーバッグにＤＣを移す。バッグは冷たい状態で一晩運ばれ、その後、同時の０．９％のＮａＣＬ溶液による静脈内投与の前に、温水槽中で３７℃に再び暖められる。静脈内のＤＣは肺を通り（ｔｒａｆｆｉｃ）、そこではＤＣの一部が捕捉されるが、大半は、ＣＴＬを刺激するために肝臓及び脾臓の白髄Ｔ細胞領域（ｗｈｉｔｅ ｐｕｌｐ Ｔ−ｃｅｌｌ ｚｏｎｅｓ）などの二次的なリンパ器官を通る。

実施例６．癌の処置のための併用送達
デングウイルスの投与は、他のウイルス性ワクチン注射の投与に類似する。被験体には、アルコールで清潔にされた肩（三角筋）領域の皮膚領域があり、その後、０．５ｍｌのウイルスを皮膚の下に注入して、蚊咬傷を模倣する。一旦、被験体が発熱して３８．５℃に到達すると、２−３日後、ＤＶ注射から、パルスした（刺激した）樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓ）をリンパ内マイクロカテーテルにより患者に注入する。患者が疾患に対し陰性になるまで、注射を繰り返す。ＤＣ融合は、実施例５で製造された細胞を使用する。

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され且つ記載されてきた一方で、このような実施形態がほんの一例として提供されることは、当業者に明白であろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。

Claims (44)

1. 被験体の癌を処置する方法であって：
   （ａ）少なくとも１つの腫瘍細胞抗原で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；
   （ｂ）２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０を被験体に投与する工程；及び
   （ｃ）ＤＣを被験体に投与する工程
   を含む、方法。
2. 少なくとも１つの腫瘍細胞抗原は被験体の固形癌細胞又は血液癌細胞に由来する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 血液癌は白血病又はリンパ腫である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 固形癌は黒色腫、乳癌、前立腺癌、又は脳癌である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. ＤＣは白血球除去により得られる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ＤＣ又は少なくとも１つの腫瘍細胞抗原は被験体由来である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ＤＣ及び少なくとも１つの腫瘍細胞抗原は被験体由来である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 少なくとも１つの腫瘍細胞抗原は被験体由来である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 少なくとも１つの腫瘍細胞抗原は、単細胞を含む懸濁液に存在する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. ＤＣは、少なくとも１つの腫瘍細胞抗原でパルスされる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 少なくとも１つの腫瘍細胞抗原はペプチドである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. ペプチドは約９の長さのアミノ酸である、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. ２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０は、全身感染を誘発するのに十分な量で存在する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 被験体の体温が摂氏３８度以上に到達した後にＤＣが投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 被験体の体温が摂氏３８．５度に到達した後にＤＣが投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 被験体の単球はＤＣを得るために処理される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. ＤＣは、抗原の取り込みが可能な成熟ＤＣである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
18. 被験体の癌を処置する方法であって：
    （ａ）アポトーシス性又は壊死性の小体を含む溶解生成物を形成するために被験体から腫瘍組織を溶解する工程；
    （ｂ）溶解生成物で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；
    （ｃ）デングウイルスを被験体に投与する工程；及び
    （ｄ）被験体の体温が摂氏３８度以上に到達した後にＤＣを被験体に投与する工程
    を含む、方法。
19. 腫瘍組織は被験体の固形癌又は血液癌由来の細胞を含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 血液癌は白血病又はリンパ腫である、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 固形癌は黒色腫、乳癌、前立腺癌、又は脳癌である、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
22. ＤＣは被験体由来である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
23. ＤＣは白血球除去により得られる、ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
24. ＤＣは被験体由来ではない、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
25. 腫瘍組織は、溶解前に単細胞を含む懸濁液に存在する、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
26. ＤＣは溶解生成物によりパルスされる、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
27. デングウイルスは全身感染を誘発するのに十分な量で投与される、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
28. 被験体の単球はＤＣを得るために処理される、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
29. ＤＣは、抗原の取り込みが可能な成熟ＤＣである、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
30. 腫瘍組織は０．５〜５グラムの量である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
31. 腫瘍組織は１〜２グラムの量である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
32. デングウイルスは、血清型１、２、３、４、又は５である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
33. デングウイルスは血清型２である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
34. デングウイルスは、２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
35. 被験体の体温が摂氏３８．５度に到達した後にＤＣが被験体に投与される、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
36. 癌細胞を標的化する方法であって：
    （ａ）少なくとも１つの腫瘍細胞抗原で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；
    （ｂ）２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０を被験体に投与する工程；及び
    （ｃ）ＤＣを被験体に投与する工程
    を含む、方法。
37. 癌細胞を標的化する方法であって：
    （ａ）アポトーシス性又は壊死性の小体を含む溶解生成物を形成するために被験体から腫瘍組織を溶解する工程；
    （ｂ）溶解生成物で樹状細胞（ＤＣ）をインキュベートする工程；
    （ｃ）デングウイルスを被験体に投与する工程；及び
    （ｄ）被験体の体温が摂氏３８．５度以上に到達した後にＤＣを被験体に投与する工程
    を含む、方法。
38. 腫瘍細胞の減少のための組成物であって、該組成物は、免疫応答を起こすのに有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０を含み、ここで、２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０は、腫瘍抗原で刺激した樹状細胞の投与の前に投与された時、何れかの薬剤単独の投与と比べて、腫瘍細胞の減少の強化をもたらす、ことを特徴とする組成物。
39. 腫瘍細胞は固形癌又は血液癌由来である、ことを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
40. 血液癌は白血病又はリンパ腫である、ことを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
41. 固形癌は黒色腫、乳癌、前立腺癌、又は脳癌である、ことを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
42. 癌の処置用の薬物の製造のための、有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０の使用。
43. 癌の処置用の有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０の使用。
44. 癌の処置に使用される、有効な量の２型デングウイルス血清型株ＤＥＮＶ−２＃１７１０。