JP2018522234A - マイクロウェル電極及び化学物質の分析のための方法 - Google Patents

Abstract

１つ又は複数の第１の電極（３０１）と；それぞれ第１の電極（３０１）に対向して配置された１つ又は複数の第２の電極（３０３）であって、各第１の電極（３０１）とそれに対向する第２の電極との間にチャネル（６０１）があり、チャネル（６０１）の少なくとも１つの端部は、チャンバと連通している、第２の電極（３０３）と；チャンバ（４０１）内に位置する１つ又は複数のガイド電極（５０１）とを備えるマイクロウェル電極が提供される。マイクロウェル電極は、高感度に信号を検出することができ、シーケンサの読み取り長さを大幅に増加させることができる。本発明は、マイクロウェル電極を製造するための方法、マイクロウェル電極アレイ、センサチップ、配列決定システム、並びに、マイクロウェル電極に基づく化学物質及び核酸分子の分析のための方法にさらに関する。【選択図】 図１Ａ

Description

発明の分野

本発明は、半導体技術及び化学物質分析の分野に関し、より詳細には、マイクロウェル電極及びそれを製造するための方法、マイクロウェル電極アレイ、センサチップ及び配列決定システム、並びに、マイクロウェル電極、マイクロウェル電極アレイ、センサチップ、又は配列決定システムに基づく化学物質及び核酸分子の分析のための方法に関する。

背景

過去１０年にわたる第二世代ＤＮＡ配列決定技術の絶え間ない改善の結果、１，０００ドルゲノム時代が近付きつつある。しかしながら、１，０００ドルゲノム配列決定を実施し、ＤＮＡ配列決定技術の応用を個別化医療において推し進めるには、依然として実質的な開発が必要とされている。第二世代の配列決定プラットフォームが直面している４つの主要な問題は、以下の通りである：（１）固有のデフェージングに起因する短い読み取り長さ；（２）塩基組み込みに必要な溶出ステップに起因する遅い読み取り速度；（３）増幅に必要な、労力及びコストのかかる試料調製；（４）高価な光学系。単分子配列決定技術は、上記問題の全てに同時に対応するための最も有望なアプローチであると考えられている。

新たな配列決定技術は、ナノ細孔ベースの配列決定技術である。この技術の基本的な考えは、個々のＤＮＡ分子がナノ細孔を通過する際、このナノ細孔構造が制限部位及び組み込み部位の両方として同時に機能することにある。ナノ細孔配列決定のリーダー的存在であるＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＯＮＴ）は、最近、１０，０００塩基の読み取り長さ及び１００塩基毎秒の読み取り速度を有する初のタンパク質ナノ細孔シーケンサを発表した。単分子配列決定のリーダー的存在であるＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）と比較して、ＯＮＴの技術は、光学デバイスを必要としないため、シーケンサのコスト及びサイズを大幅に削減し得る。

固体ナノ細孔は安定性及び拡張性の点ではるかに優れており、これは堅牢で低コストの配列決定デバイスにとって極めて重要であるというのが一般的に一致した意見であるにもかかわらず、タンパク質ナノ細孔ベース配列決定技術の開発は、固体ナノ細孔と比較してより速い。固体ナノ細孔は、タンパク質ナノ細孔と比較して、依然として原子レベルの精度及び化学的特異性に欠けている。化学的特異性は、一般に、様々な表面改質技術により得られる。しかしながら、大規模なナノ細孔アレイの再現性のある生成は、依然として、その製造プロセスの問題に直面している。現在のナノ細孔ベース配列決定法のほとんどは、３Ｄナノスケールサイズ構造に依存しており、細孔の直径が十分小さくなるべきであるだけでなく、細孔又は電極の厚さもまた、隣接する塩基間の距離と同程度に小さくなるべきである。そのようなナノ細孔を形成するための最も一般的な方法は、窒化ケイ素又はグラフェン等の薄い絶縁材料に対するイオンビームによるエッチング、又は電子ビームによる穿孔である。しかしながら、この方法は慣例的ではなく、標準的な半導体製造プロセスに適合しない。このため、ナノ細孔製造プロセスは、非常に高費用で再現性がない。商業的応用の点からは、ナノ細孔ベース技術は、他の現在の技術よりも優れた非常に長い読み取り長さを提供することができ、また配列決定コストを大幅に削減することができる。

固体ナノ細孔に必要な正確及び効果的な製造プロセスの要件を回避するためには、２つのアプローチが存在する。１つのアプローチは、塩基間の信号の差を改善するようにＤＮＡ試料を改質し、このようにしてナノ細孔の正確性及びサイズの要件を緩和することである。Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ及びＳｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ等、現在このアプローチを追及しているいくつかのナノ細孔ベース配列決定企業が存在する。例えば、増幅技術によるＳｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの配列決定では、独自の分子増幅方法を使用して、各塩基が強い信号を有する巨大レポーター分子で置き換えられる。Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、酵素的切断により生成された塩基特異的タグがナノ細孔により捕捉及び認識され得るため、ＤＮＡポリメラーゼを使用してテンプレートＤＮＡを配列決定する。これらの企業は、現在、タンパク質ナノ細孔に焦点を置いているが、いかなる技術的障害もなしに、固体ナノ細孔にも同じ考えが適用され得る。標準的な半導体製造プロセスは、ナノワイヤ、ナノチャネル、及びナノギャップ等の規則的な２Ｄナノ構造に適用可能となっているため、他のアプローチは、３Ｄナノ構造を２Ｄナノ構造に単純化することである。課題は、一次元ナノ構造の数が一桁に制限されることなく、いかにして１塩基解像度を達成するかという点に至っている。この問題に対応するためのいくつかのアプローチがすでに存在する。Ｎａｂｓｙｓは、ＤＮＡテンプレートがナノチャネル（約１００ｎｍ）を通過する際にＤＮＡテンプレートに結合した配列特異的タグを検出することにより、短いプローブ配列を有する長距離配列決定マップを生成する位置配列決定プラットフォームを開発している。

結論として、ナノ細孔ベースＤＮＡ配列決定は、依然として多くの技術的課題に直面している。したがって、いかにして上記問題を克服し、低コストでハイスループットのナノ細孔ベースＤＮＡ配列決定スキームを提案するかが、世界中の科学技術の焦点となっている。独立した知的所有権を有する単分子レベルでのＤＮＡ検出技術の新たな世代の開発は、将来の中国のハイテク産業の設計において重要な役割を担う。さらに、上記問題の解決策の統合及び携帯性は、疾患診断、食品試験及び環境モニタリング等の多くの分野においてプラスの推進効果を有する。

概要

本発明の一態様によれば、１つ又は複数の第１の電極と；それぞれ各第１の電極に対向して配置された１つ又は複数の第２の電極であって、各第１の電極とそれに対向する第２の電極との間にチャネルが設けられており、チャネルは、少なくとも１つの端部がチャンバと連通している、１つ又は複数の第２の電極と；チャンバ内に位置する１つ又は複数のガイド電極とを備える、マイクロウェル電極が提供される。

一実施形態において、ガイド電極は、荷電物質をチャネル内にガイドする、及び／又はチャネル内の荷電物質の動きを制御することができる。

一実施形態において、マイクロウェル電極は、１つ又は複数の第１の電極を支持するための第１の支持要素をさらに備える。第１の電極のそれぞれは、第１の支持要素の側壁上に位置することが好ましい。

一実施形態において、マイクロウェル電極は、複数の第１の電極と、複数の第１の支持要素とを備え、第１の電極のそれぞれは、対応する第１の支持要素により支持されている。

一実施形態において、マイクロウェル電極は、複数の第２の電極を備え、マイクロウェル電極は、複数の第２の支持要素をさらに備え、第２の電極のそれぞれは、対応する第２の支持要素により支持されている。第２の電極のそれぞれは、第２の支持要素の側壁上に位置することが好ましい。

一実施形態において、第１の電極は、互いに離間した複数のセグメントを備える。

一実施形態において、第２の電極は、互いに離間した複数のセグメントを備える。

一実施形態において、第１の電極は、互いに離間した複数のセグメントを備え、マイクロウェル電極は、複数の第１の支持要素をさらに備え、第１の電極の各セグメントは、対応する第１の支持要素により支持されている。

一実施形態において、第２の電極は、互いに離間した複数のセグメントを備え、マイクロウェル電極は、複数の第２の支持要素をさらに備え、第２の電極の各セグメントは、対応する第２の支持要素により支持されている。

一実施形態において、第１の支持要素は、導電性要素である。そのような実施形態において、第１の支持要素を介して第１の電極に電圧が印加され得る。

一実施形態において、第１の支持要素は、非導電性要素である。そのような実施形態において、第１の支持要素は、主に第１の電極を支持するために使用されることが好ましく、また、第１の支持要素に埋設されたワイヤを介して第１の電極に電圧が印加され得ることが好ましい。

一実施形態において、第２の支持要素は、導電性要素である。そのような実施形態において、第２の支持要素を介して第２の電極に電圧が印加され得る。

一実施形態において、第２の支持要素は、非導電性要素である。そのような実施形態において、第２の支持要素は、主に第２の電極を支持するために使用されることが好ましい。また、第２の支持要素に埋設されたワイヤを介して第２の電極に電圧が印加され得ることが好ましい。

一実施形態において、マイクロウェル電極は、酵素又は検出される化学物質を固定することができるナノ構造体をさらに備えてもよい。一実施形態において、ナノ構造体は、チャンバの底部若しくは側壁、又はチャネルの底部若しくは側壁、又はガイド電極上に位置する。

一実施形態において、ナノ構造体は、金属、金属酸化物、無機ポリマー、有機ポリマー、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成されている。

一実施形態において、チャネルは、０．５〜１００ｎｍ、例えば１ｎｍ、２ｎｍ、１０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ等の幅を有し；及び／又は、チャネルは、５０ｎｍ〜１００μｍ、例えば１００ｎｍ、５００ｎｍ、５μｍ、１０μｍ、３０μｍ等の長さを有し；及び／又は、チャネルは、０〜１０μｍ、例えば１００ｎｍ、３００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、８μｍ等の深さを有する。

一実施形態において、第１の電極は、１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さを有する。

一実施形態において、第２の電極は、１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さを有する。

一実施形態において、第１の電極及び第２の電極は、同じ材料により形成されている。

一実施形態において、第１の電極及び第２の電極は、異なる材料により形成されている。

一実施形態において、第１の支持要素、第１の電極及び第２の電極は、同じ材料により、又は異なる材料により形成されていてもよい。

一実施形態において、第１の電極は、白金、金、酸化インジウムスズ、炭素系材料（複数種可）、ケイ素若しくは他の導電性材料からなる群から選択される材料により形成されている；及び／又は、第２の電極は、白金、金、酸化インジウムスズ、炭素系材料（複数種可）、ケイ素若しくは他の導電性材料からなる群から選択される材料により形成されている；及び／又は、ガイド電極は、ケイ素、白金、金、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料（複数種可）からなる群から選択される材料により形成されている。

一実施形態において、導電性要素は、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、炭素系材料（複数種可）、又は他の導電性材料からなる群から選択される材料により形成されている。

一実施形態において、非導電性要素は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、オキシ窒化ケイ素、ホウリンケイ酸ガラス等からなる群から選択される材料により形成されている。

一実施形態において、第１の支持要素は、基板の表面と平行な方向において、楕円形、円形、多角形、又は歯車形の断面形状を有する。

一実施形態において、チャンバの底部表面及びチャネルの底部表面は、同じ面又は異なる面内にある。

一実施形態において、マイクロウェル電極は、基板と、基板上の絶縁層とをさらに備え、第１の電極、第２の電極及びガイド電極は、絶縁層上に位置する。

一実施形態において、ガイド電極は、第１の電極又は第２の電極に対して実質的に垂直である。すなわち、ガイド電極、第１の電極及び第２の電極に電圧を印加した後、ガイド電極間の電場の方向は、第１の電極と第２の電極との間の電場の方向に対して実質的に垂直である。

一実施形態において、マイクロウェル電極は、第１の電極及び／又は第２の電極の表面（複数可）上に位置する不動態化層をさらに備える。

本発明の別の態様によれば、上記実施形態のいずれか１つによる１つ又は複数のマイクロウェル電極を備える、マイクロウェル電極アレイが提供される。

一実施形態において、マイクロウェル電極アレイは、複数のマイクロウェル電極を備える。例えば、マイクロウェル電極の数は、１００、１００００、１０^６又は１０^８等であってもよい。

一実施形態において、マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極は、楕円形、円形、環状、扇形、長方形、正方形、ジグザグ形、若しくは歯車形で、又は行及び列の行列として、又は積層体等として配置されている。

一実施形態において、２つ以上のマイクロウェル電極が、互いに独立している、又は直列に接続されている、又は並列に接続されている。

一実施形態において、マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極は、１つのガイド電極を共有する。

本発明の別の態様によれば、上記実施形態によるマイクロウェル電極アレイを備えるセンサチップが提供される。

本発明において、センサチップ及び対応する集積回路は、ＣＭＯＳプロセスと適合するプロセスにおいて製造され得る。特定の用途において、センサチップのマイクロウェル電極アレイに含まれるマイクロウェル電極の数は、マイクロウェル電極のサイズ、検出される分子の特性、コスト、又は他の因子に従って決定され得る。例えば、マイクロウェル電極アレイは、例として、１０×１０アレイ、１００×１００アレイ、１０００×１０００アレイ又は１０^４×１０^４アレイ等であってもよい。

本発明のさらに別の態様によれば、上記実施形態によるセンサチップを備える配列決定システムが提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、マイクロウェル電極を製造するための方法であって、表面上に絶縁層を有する基板と、絶縁層上の第１の支持要素材料層とを備える基板構造体を用意するステップであって、第１の支持要素材料層は、その側壁上に、第１の電極材料層、犠牲材料層、第２の電極材料層及び第２の支持要素材料層を順次有する、ステップと；第１の支持要素材料層、第１の電極材料層、犠牲材料層、第２の電極材料層及び第２の支持要素材料層をパターニングして、１つ又は複数のチャンバ、第１の支持要素を形成し、第１の支持要素の側壁上に順次位置する第１の電極、犠牲層、第２の電極及び第２の支持要素を形成するステップと；チャンバ内に１つ又は複数のガイド電極を形成するステップと；第１の支持要素の側壁上の犠牲層を除去して、第１の電極と第２の電極との間にチャネルを形成するステップとを含み、チャネルは、少なくとも１つの端部がチャンバと連通している、方法が提供される。

一実施形態において、基板構造体を用意するステップは、表面上に絶縁層を有する基板を用意することと；絶縁層の一部上に第１の支持要素材料層を形成することと；第１の支持要素材料層の上表面及び側壁を被覆するように第１の電極材料層を堆積させることと；第１の支持要素材料層の上表面上の第１の電極材料層を除去することと；第１の支持要素材料層の上表面、残っている第１の電極材料層の上表面及び側壁を被覆するように犠牲材料層を堆積させることと；第１の支持要素材料層の上表面、及び残っている第１の電極材料層の上表面上の犠牲材料層を除去することと；第１の支持要素材料層の上表面、残っている第１の電極材料層の上表面、並びに残っている犠牲材料層の上表面及び側壁を被覆するように第２の電極材料層を堆積させることと；第１の支持要素材料層の上表面、残っている第１の電極材料層の上表面、及び残っている犠牲材料層の上表面上の第２の電極材料層を除去することと；第１の支持要素材料層、第１の支持要素材料層の側壁上の第１の電極材料層、第１の支持要素材料層の側壁の上の犠牲材料層、第１の支持要素材料層の側壁の上の第２の電極材料層、及び絶縁層の被覆されていない部分を被覆するように、第２の支持要素材料層を堆積させることと；堆積された第２の支持要素材料層を平坦化して、第１の支持要素材料層の側壁の上の犠牲材料層を露出させることとを含む。

一実施形態において、ガイド電極は、第１の電極に対して実質的に垂直であり；及び／又は、ガイド電極は、第２の電極に対して実質的に垂直である。

一実施形態において、第１の支持要素の側壁上の犠牲層を除去する前に、方法は、第１の支持要素、第２の支持要素、第１の電極又は第２の電極の少なくとも１つの表面上に不動態化層を形成するステップをさらに含む。

一実施形態において、第１の支持要素の側壁上の犠牲層を除去する前に、方法は、第１の支持要素の上部の一部、及び第２の支持要素の上部の一部を除去して、第１の電極の一部、犠牲層の一部、及び第２の電極の一部を露出させるステップと；残っている第１の支持要素、残っている第２の支持要素、第１の電極の露出部分、犠牲層の露出部分、及び第２の電極の露出部分上に、不動態化層を堆積させるステップと；堆積された不動態化層を平坦化して、第１の支持要素の残っている部分、及び第２の支持要素の残っている部分の上に不動態化層を形成し、犠牲層を露出させるステップとをさらに含む。

一実施形態において、第１の支持要素材料層、第１の電極材料層、犠牲材料層、第２の電極材料層及び第２の支持要素材料層をパターニングするステップは、第１の電極材料層及び／又は第２の電極材料層を複数のセグメントに分離し、これにより、形成された第１の電極及び／又は第２の電極が、互いに離間した複数のセグメントをそれぞれ備えることを含む。

一実施形態において、方法は、酵素又は検出される化学物質を固定することができるナノ構造体を、チャンバの底部若しくは側壁上、又はチャネルの底部若しくは側壁上又はガイド電極上に形成するステップをさらに含む。

一実施形態において、ナノ構造体は、金属、金属酸化物、無機ポリマー、有機ポリマー、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成される。

一実施形態において、チャネルは、０．５〜１００ｎｍ、例えば１ｎｍ、２ｎｍ、１０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ等の幅を有し；及び／又は、チャネルは、５０ｎｍ〜１００μｍ、例えば１００ｎｍ、５００ｎｍ、５μｍ、１０μｍ、３０μｍ等の長さを有し；及び／又は、チャネルは、０〜１０μｍ、例えば１００ｎｍ、３００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、８μｍ等の深さを有する。

一実施形態において、第１の電極は、１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さを有する。

一実施形態において、第１の電極及び第２の電極は、同じ材料により形成される。

一実施形態において、第１の電極及び第２の電極は、異なる材料により形成される。

一実施形態において、第１の電極は、ケイ素、白金、金、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料（複数種可）からなる群から選択される材料により形成される；及び／又は、犠牲層は、クロム、タングステン、アルミニウム、酸化アルミニウム、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素からなる群から選択される材料により形成される；及び／又は、第２の電極は、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料（複数種可）からなる群から選択される材料により形成される；及び／又は、ガイド電極は、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料（複数種可）からなる群から選択される材料により形成される。

一実施形態において、第１の支持要素及び第２の支持要素は、導電性要素を含む。

一実施形態において、導電性要素は、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料（複数種可）からなる群から選択される材料により形成される。

一実施形態において、第１の支持要素及び／又は第２の支持要素は、基板の表面と平行な方向において、楕円形、円形、長方形、正方形、又は歯車形の断面形状を有する。

本発明はまた、化学物質の分析のための方法であって、
（１）本発明によるマイクロウェル電極又はマイクロウェル電極アレイを用意するステップと；
（２）試験される化学物質を含有する反応溶液を、マイクロウェル電極又はマイクロウェル電極アレイに添加し、反応溶液を反応に供して荷電分子を生成するステップと；
（３）荷電分子を、ガイド電極及び／若しくは流体力学的効果の作用下でチャネルに進入させる、又はガイド電極の作用下でチャネル内に蓄積させるステップと；
（４）第１の電極、第２の電極及び／又はガイド電極を使用することにより、荷電分子の種類を特定し、それによって試験される化学物質の情報を得るステップと
を含む方法を提供する。

一実施形態において、ステップ（４）で、荷電分子の種類は、酸化還元効果、電気抵抗効果、静電容量効果、電界効果、及びトンネル効果からなる群から選択される１つ又は複数の効果に基づいて、第１の電極、第２の電極及び／又はガイド電極により特定される。
一実施形態において、試験される化学物質は、生体分子（例えば、核酸、タンパク質、脂質、及びポリサッカリド）、化合物、有機ポリマー等からなる群から選択される。一実施形態において、試験される化学物質は、核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。

一実施形態において、試験される化学物質は、１つ又は複数の基本単位（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、及び重合性モノマー）を含む、又はそれらからなる。一実施形態において、試験される化学物質の基本単位は、非修飾である。別の実施形態において、試験される化学物質の基本単位は、標識分子により修飾される。

一実施形態において、反応溶液は、反応後に遊離標識分子を放出する、標識分子により修飾された遊離基本単位を含有する。遊離標識分子は帯電しており（すなわち荷電分子であり）、ガイド電極の作用下でチャネルに進入し得る、又はガイド電極の作用下でチャネル内に蓄積され得ることが好ましい。したがって、第１の電極、第２の電極及び／又はガイド電極を使用することにより、荷電分子の種類を特定し、それによって試験される化学物質の情報を得ることができる。

一実施形態において、反応溶液は、１種又は複数種の遊離標識分子修飾基本単位を含有する。一実施形態において、反応溶液は、少なくとも２種類（例えば３種類、４種類又はそれ以上の種類）の遊離標識分子修飾基本単位を含有する。一実施形態において、同じ標識分子により異なる基本単位が修飾される。別の実施形態において、異なる標識分子により異なる基本単位が修飾される。

一実施形態において、遊離標識分子は、酸化還元活性物質であり、第１の電極及び第２の電極は、酸化還元効果により標識分子の種類を特定するための検出電極として使用される。

一実施形態において、ステップ（４）で、荷電分子の種類は、酸化還元効果に加えて、１つ又は複数の電気抵抗効果、静電容量効果、電界効果、及びトンネル効果に基づいて、第１の電極、第２の電極及び／又はガイド電極により特定され得る。そのような実施形態において、荷電分子は、検出結果の精度を改善するために、１つ又は複数の検出原理を使用することにより検出され得る。例えば、電場がガイド電極間で生成される場合、チャネル内の任意の分子が、イオン電流を物理的にブロックし、それによりイオン電流の検出可能な低減をもたらす。荷電分子の検出の精度は、好適なサイズの標識分子及び好適な長さのチャネルを選択することにより、並びに電気抵抗効果から得られる信号特性によりさらに改善され得る。したがって、当業者は、実際の必要性に依存して、荷電分子の種類を特定するための方法の組合せを選択することができる。例えば、電界効果及び酸化還元効果の組合せ、静電容量効果及び酸化還元効果の組合せ、電気抵抗効果及び酸化還元効果の組合せ、又は酸化還元効果、電気抵抗効果及び電界効果の組合せを使用して、荷電分子の種類を特定することができる。

一実施形態において、チャネルの底部における絶縁層の表面上に、改質フィルムが存在してもよい。第１の電極及び第２の電極は、それぞれソース電極及びドレイン電極として使用され、改質フィルムは、２つの電極間の導電チャネルとして使用されることが好ましい。標識分子の認識部位が導電チャネル上に形成されてゲート電極として使用されることにより、電界効果トランジスタを形成することがさらに好ましい。改質フィルム上に異なる標識分子が結合した場合、導電チャネルは異なる電気伝導性を有し、それにより、ソース電極とドレイン電極との間に異なる電流強度を生成する。したがって、電流強度の差に基づいて、異なる標識分子が区別され得る。

システムの信頼性に関して、検出手段は互いに重複又は影響しないため、それらの結果は、互いのバックアップとして使用され得、複数の検出手段の使用は、全システムの崩壊をもたらさない。

一実施形態において、第１の電極及び／又は第２の電極は、それぞれ、複数のセグメント、すなわち２つ以上のセグメント（例えば３〜４つのセグメント）に分離され得る。一実施形態において、分離後、電極の各セグメントは異なる電圧を有する。そのような実施形態において、電極の各セグメントの電圧は、標識分子の応答電圧（酸化還元電位窓）に対応することが特に好ましい。したがって、標的分子に対して、その電圧が標識分子の応答電圧に対応する電極のセグメントのみが、標識分子に応答して信号を生成することができ、一方、電極の他のセグメントは、標識分子に応答することも、また信号を生成することもできない。したがって、電極のセグメントの信号の存在又は非存在に基づいて、当該電極のセグメントに対応する標識分子が存在するか否かが決定され得る。そのような検出手段は、信号をノイズから区別するのに有利である。電極に対するそのような設計は、動的情報を提供することができ、従来のナノ細孔ベースの方法と大きく異なる。一実施形態において、同じチャネル内で、第１の電極及び／又は第２の電極は、複数のセグメント、例えば横方向の電極の２〜４つのセグメントに分離され、電極の各単一セグメントは、異なる電圧を生成するように独立して制御され得る。

さらに、一実施形態において、各マイクロウェル電極は、複数のチャネルを有してもよい。マイクロウェル電極に設けられた複数のチャネルは、検出のための表面積を大幅に増加させることができ、したがって、信号強度を改善するだけでなく、潜在的な汚染効果を低減することもできる。マイクロウェル電極アレイ及びチャンバの組合せはまた、試料注入のためのより制御可能な様式を提供する。

一実施形態において、チャネルは、開口式であってもよい。開口式チャネルを製造するためのプロセスは、より単純及びより容易であり、開口式チャネルは、試料及び液体の注入に便利であり、速度と精度との間のバランスをより良好に達成することができる。一実施形態において、チャネルは、閉鎖式であってもよい。閉鎖式チャネルは、外部不純物信号の干渉を制御及び低減するのに有利である。実際の用途においては、チャネルの構造（開口式チャネル、閉鎖式チャネル又はそれらの組合せ）は、特定の条件に依存して選択され得る。一実施形態において、マイクロウェル電極は、開口式チャネル（複数可）、又は閉鎖式チャネル（複数可）、又は開口式チャネル（複数可）及び閉鎖式チャネル（複数可）の両方を備える。

一実施形態において、試験される化学物質は、核酸分子であり、ステップ（２）において、反応溶液は、ヌクレオチドの重合に供される。

一実施形態において、方法は、化学物質の組成、配列、電荷、サイズ又は濃度の分析に使用される。

本発明はまた、核酸分子の分析のための方法であって、
（１）本発明によるマイクロウェル電極又はマイクロウェル電極アレイを用意するステップと；
（２）マイクロウェル電極若しくはマイクロウェル電極アレイのチャンバ若しくはチャネル内に、又はマイクロウェル電極若しくはマイクロウェル電極アレイのガイド電極上に、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ）を固定するステップと；
（３）マイクロウェル電極又はマイクロウェル電極アレイに、試験される核酸分子、プライマー、及び少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）分子、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）分子又はそれらの類似体を含有する反応溶液を添加するステップであって、プライマーは、試験される核酸分子の部分配列にハイブリダイズ又はアニールすることができ、少なくとも１つのｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の各々は、それぞれ標識分子で修飾されており、その後、好適な条件下で、試験される核酸分子をプライマーとハイブリダイズし、複合体を形成するステップと；
（４）触媒としてのポリメラーゼの存在下で、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の１つをプライマーに組み込み、試験される核酸分子と相補的な伸長生成物を形成し、プライマーに組み込まれたｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体が保持する標識分子を除去し、遊離標識分子を生成するステップであって、遊離標識分子は帯電している、ステップと；
（５）遊離標識分子を、ガイド電極及び／若しくは流体力学的効果の作用下でチャネルに進入させる、又はガイド電極の作用下でチャネル内に蓄積させるステップであって、遊離標識分子は、その電気極性又は放出順序により異なるマイクロウェル電極チャネル内に進入又は蓄積するように制御されることが好ましい、ステップと；
（６）第１の電極及び第２の電極を使用することにより、遊離標識分子の種類を特定し、標識分子とｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体との間の対応に従って、プライマーに組み込まれたｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の種類をさらに特定し、相補的塩基対合の原理に従って、試験される核酸分子の対応する位置での塩基をさらに決定するステップと；
（７）複合体の伸長が終了するまで、ステップ（４）、（５）及び（６）を繰り返すステップと
を含む方法を提供する。

一実施形態において、ステップ（６）で、遊離標識分子の種類は、酸化還元効果、電気抵抗効果、静電容量効果、電界効果、及びトンネル効果のうちの１つ又は複数により特定される。

一実施形態において、標識分子の種類は、酸化還元効果により特定される。一実施形態において、遊離標識分子は、循環的酸化還元反応において反応性である酸化還元活性物質であってもよく、又は、循環的酸化還元反応において反応性である酸化還元活性物質に変換されてもよい。一実施形態において、遊離標識分子は、循環的酸化還元反応において反応性である酸化還元活性物質に物理的又は化学的に変換されてもよい。酸化還元活性物質は、第１の電極と第２の電極との間の循環的酸化還元反応に供されて、検出可能な電流を生じ得ることが好ましい。それによって、標識分子の種類は、当該検出可能な電流により特定され得る。一実施形態において、上述の酸化還元効果に加えて、標識分子の種類は、電気抵抗効果、静電容量効果、電界効果、及びトンネル効果のうちの１つ又は複数により特定され得る。

一実施形態において、遊離標識分子（例えば、酸化還元活性標識分子）の進入は、ガイド電極又は他の手段を使用することにより誘導及び／又は制御され、チャネルの第１の電極及び第２の電極にそれぞれ電位が印加される。第１の電極及び第２の電極の電位が当該標識分子の酸化還元電位窓に適合する場合、標識分子は、第１の電極と第２の電極との間の循環的酸化還元反応に供され得、検出可能な酸化還元電流パルス信号が生成される。当該検出可能な酸化還元電流パルス信号を使用することにより、標識分子は、特異的に特定及び検出され得る。第１の電極と第２の電極との間に適合する電位が提供されるがパルス信号が検出されない場合、これは、標識分子が存在しないことを示す。

一実施形態において、少なくとも１つのｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体のそれぞれは、異なる酸化還元電位窓を有する標識分子を保持する。好ましい実施形態において、チャネル内の標識分子の種類は、第１の電極及び／又は第２の電極の電位を変化させ、酸化還元電流パルス信号が様々な電位条件下で生成されるかどうかを決定し、任意選択で、パルス信号の信号振幅等の情報を決定することにより特定され得る。

一実施形態において、少なくとも１つのｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体のそれぞれは、異なる酸化還元電位窓を有する標識分子を保持する。好ましい実施形態において、チャネル内の第１の電極及び／又は第２の電極は、複数のセグメントに分離され、各セグメントには、異なる標識分子の酸化還元電位窓に対応する電位が印加される。したがって、標識分子がチャネルを通過すると、標識分子の酸化還元電位窓に対応する電位を有する電極セグメントにおいてのみ、酸化還元電流パルス信号が検出され、それによってチャネル内の標識分子の種類が特定され得る。

一実施形態において、反応溶液は、ホスファターゼをさらに含む。

一実施形態において、方法のステップ（４）で、遊離標識分子は、ホスファターゼの存在下で脱リン酸化される。

一実施形態において、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体は、正味電荷において中性である、又は負に帯電している。

一実施形態において、遊離標識分子は、正に帯電又は負に帯電している。

一実施形態において、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体は、正味電荷において中性である、又は負に帯電しており、遊離標識分子は、正に帯電している。そのような実施形態において、正に帯電した遊離標識分子は、電場の作用下でチャネルに沿って移動することができ、一方、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体は、中性又は負に帯電しているため、チャンバ又はチャネル内で移動しない。

一実施形態において、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体は、負に帯電しており、遊離標識分子は、負に帯電している。そのような実施形態において、全て負に帯電した遊離標識分子、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体、及び非修飾ｄＮＴＰ、ＮＴＰ分子は、電場の作用下でチャネルに沿って共に移動し得る。

一実施形態において、遊離標識分子のみが酸化還元活性であり、一方標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ分子及び非修飾ｄＮＴＰ、ＮＴＰ分子は、酸化還元活性ではない。そのような実施形態において、酸化還元電流信号は、遊離標識分子のみから生じ得る。

一実施形態において、標識分子は、ｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体のリン酸基、塩基又はサッカリド基に連結する。標識分子は、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、金属化合物、染料、化学発光化合物、ヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、アミノフェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、チオール基、シアノ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アジド、又はそれらの誘導体のうちの１つ又は複数から選択されることが好ましい。標識分子は、アミノフェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、変原子価金属化合物（例えばフェロセン、ヘキサシアノ鉄酸塩、及びフェロシアン化物）、アントラキノン、及びメチレンブルー、並びにそれらの誘導体のうちの１つ又は複数から選択されることが好ましい。一実施形態において、標識分子は、ｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体のγ−リン酸基に連結し、標識分子は、アミノフェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、及びそれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。一実施形態において、標識分子は、ｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の塩基又はサッカリド基に連結し、標識分子は、変原子価金属化合物（例えば、フェロセン、ヘキサシアノ鉄酸塩、及びフェロシアン化物）、アントラキノン、及びメチレンブルー、並びにそれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。

一実施形態において、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ）又はＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）分子の各種類は、酸化還元活性を有する特定の標識分子で標識化され、当該特定の標識分子は、循環的酸化還元反応に供されると、特定の酸化還元電気信号を生成し得る。

一実施形態において、ステップ（３）で、４種類のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ／ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる群から選択される）又はＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）分子の全てが、同時に添加される。そのような実施形態において、各塩基の組み込み後の洗浄ステップは省略されてもよく、それによって試薬のコストが大幅に削減され、検出速度が加速される。

一実施形態において、遊離標識分子が保持する電荷は、ガイド電極の作用下での遊離標識分子の移動速度を調節するように標識分子を選択することにより調節され得る。

一実施形態において、ステップ（１）で、ポリメラーゼは、チャンバ若しくはチャネルの底部における絶縁層上に固定される、又はガイド電極上に固定される。ポリメラーゼは、チャンバの底部におけるチャネルの入口ポートに近い場所に固定されることが好ましく；チャネルの入口ポートは、ポリメラーゼを保持するために様々な形状（例えば漏斗形状）で設計され得ることが好ましい。

一実施形態において、ポリメラーゼは、各チャンバ又はチャネル内に固定される。

一実施形態において、反応溶液中の試験される核酸分子は、一本鎖核酸分子である。

一実施形態において、各ポリメラーゼは、一本鎖核酸分子、又は核酸分子及びプライマーのハイブリダイゼーションから形成された複合体を獲得し得る。

本発明において、チャンバ又はチャネルの底部にポリメラーゼを固定するための方法は、当技術分野において周知である。

一実施形態において、絶縁層は、二酸化ケイ素、オキシ窒化ケイ素、窒化ケイ素又は他の絶縁材料（例えば、炭素ドープ酸化物（ＣＤＯ）、炭化ケイ素、有機ポリマー、例えばポリイミド、オクタフルオロシクロブタン若しくはポリテトラフルオロエチレン、フルオロシリケートガラス（ＦＳＧ）、及び有機シリケート、例えばシルセスキオキサン、シロキサン若しくは有機シリケートガラス）からなる群から選択される材料により形成される。

一実施形態において、絶縁層とポリメラーゼとの間に、官能化可能な領域及び／又は分子結合領域がさらに設けられてもよい。一実施形態において、官能化可能な領域は、二酸化ケイ素、酸化ハフニウム、酸化アルミニウム、酸化タンタル、及び／又は酸化ジルコニウム等の官能化可能な材料を含む。例えば、官能化可能な材料は、シリカン（例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、イソチオシアネート、アルケン及びアルキンからなる群から選択される連結分子で官能化されてもよい。一実施形態において、分子結合領域は、プローブ分子を含む。プローブ分子は、例えば、ビオチン、アビジン、抗体、抗原、受容体、リガンド、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質及びそのリガンドからなる群から選択されることが好ましい。

一実施形態において、結合分子は、ポリメラーゼが好適な方向に固定されるように選択され得る。

一実施形態において、方法は、核酸分子の配列、組成、電荷、サイズ又は濃度の分析に使用される。

本発明において、すべてのチャンバ及びチャネルが電解液及び反応溶液で充填されるように、電解液及び反応溶液がマイクロウェル電極の表面に添加されてもよい。異なる電極又は同じ電極の異なるセグメントに対して、それらの電位は、反応性分子を独立して制御又は検出するように独立して設定され得る。

酸化還元検出様式において、ガイド電極は、チャネル内への電解液及び酸化還元活性物質の進入を制御し、第１の電極及び第２の電極は、酸化還元活性物質を検出するための酸化還元反応検出デバイスとして使用される。

本発明において、ガイド電極により形成された電場は、チャネル内への荷電分子（例えば正に帯電した分子）の進入、及び分子がチャネルから外へ拡散する可能性を低減するようなチャネル内でのその蓄積に有利であり、これによって、検出された信号の強度が向上され得る。

単一ヌクレオチドの解像度を確保するために、ガイド電極の電圧は、荷電分子の運搬速度を制御するように調節され得る。さらに、ポリメラーゼはまた、最適な合成速度が分子の運搬速度に一致するように改質されてもよい。さらに、チャネル内の分子の移動を制御するために、マイクロ又はナノスケールの流体力学が使用されてもよい。

本発明において、核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びホスホジエステル結合を介して互いに連結した他の類似体のポリマーを含む。ポリヌクレオチドは、ゲノムの断片、遺伝子若しくはその一部、ｃＤＮＡ又は合成デオキシリボ核酸配列であってもよい。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドは、自然発生的デオキシリボヌクレオチド、例えば２’−デオキシリボースに連結したアデニン、シトシン、グアニン若しくはチミン、又はリボヌクレオチド、例えばリボースに連結したアデニン、シトシン、グアニン若しくはウラシルであってもよい。しかしながら、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（例えばプローブ又はプライマー）は、非自然発生的合成ヌクレオチド又は改質された自然発生的ヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体をさらに含み得る。

本発明において、酸化還元サイクルは、逆に酸化及び／又は還元され得る分子（すなわち酸化還元活性分子）が少なくとも２つの独立してバイアスされた電極の間で移動する電気化学的方法を指し、少なくとも２つの電極の１つは、検出される酸化還元活性分子の還元電位より低い電位を有し、一方少なくとも２つの電極の他方は、酸化還元活性分子の酸化電位より高い電位を有し、したがって、独立してバイアスされた電極の間を電子が行き交う（すなわち、分子及びバイアスされた際の電極の電位に依存して、分子は第１の電極で酸化され、次いで第２の電極まで拡散してそこで還元される、又はその逆に、分子は還元され、次いで酸化される）。したがって、酸化還元サイクルにおいて、同じ分子が記録された電流に複数の電子を供給し、信号の正味の増幅をもたらし得る。酸化還元活性物質から生じた信号は、酸化還元活性物質の安定性、及び検出可能領域に拡散する酸化還元活性物質の能力等の因子に依存して、潜在的に１００倍超増幅され得る。本発明において、チャネル内の酸化還元活性物質の有効濃度を増加させるために、ガイド電極を設けて酸化還元活性物質のチャネル外への拡散を防止してもよい。

本発明において、酸化還元活性物質（又は酸化還元活性分子）は、当技術分野における一般的な意味を有し、何回も逆に酸化及び／又は還元され得る分子である。

本発明において、ホスファターゼは、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、タンパク質ホスファターゼ、ポリホスファターゼ、糖ホスファターゼ及びピロホスファターゼからなる群から選択される。

本発明において、伸長生成物の合成中、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体の組み込みにより、標識分子−ピロホスフェート（ＰＰｉ）が溶液中に放出される。ホスファターゼは、標識分子−ピロホスフェートからピロホスフェートを除去するように機能する。リン酸基の除去により、酸化還元活性物質がさらに活性化され、したがって、酸化還元活性物質の存在が電気化学的手段により検出され得る。

本発明において、シラン分子は、化学式Ｘ_３−Ｓｉ−ＹＲ’’、Ｘ２−Ｓｉ−（Ｎ）ＹＲ’’又はＸ−Ｓｉ−（Ｎ_２）ＹＲ’’を有し得、式中、Ｘは、脱離基、例えば−Ｃｌ、−ＯＣＨ_３又は−ＯＣＨ_２ＣＨ_３であり、Ｒ’’は、反応性カップリング基、例えば−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＨＣＨ_２又は−ＳＨであり、Ｙは、非反応性基、例えばアルキル基である。表面上に結合したシラン分子により示されるような、カップリングにおける使用のための有機基は、例えば、カルボキシル基、アルデヒド、エステル、アルケン、アルキン、チオール、イソチオシアネート、イソシアネート、置換アミン、エポキシド、小分子、例えばビオチン、又はエタノールであってもよい。一般に、Ｙは、非反応性基、例えば、１〜１６個の炭素原子を有する炭化水素化合物である。−ＹＲ’’の例は、−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ及び−（ＣＨ_２）_２ＳＨを含む。いくつかの例示的なシランは、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、メルカプトシラン及びグリシドキシトリメトキシシラン（エポキシドのカップリング基を有する）を含む。シリル化される表面は、例えば、溶液中のシラン分子、又はシランガスとしてのシラン分子と反応し得る。

本発明において、塩基は、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、及び５−メチルシトシンからなる群から選択される。

本発明において、プライマー（プライマー配列）は、一般に化学的に合成され、当技術分野において周知の好適な条件下で、標的核酸（例えば一本鎖ＤＮＡ）にハイブリダイズして、それへのヌクレオチド残基の付加、又はそれからのオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドの合成を可能にするのに十分な、好適な長さ（例えば約１８〜２４塩基の長さ）の短いオリゴヌクレオチドである。一実施形態において、プライマーは、ＤＮＡプライマー、すなわち、デオキシリボヌクレオチド残基からなる、又は主にそれからなるプライマーである。プライマーは、プライマーにハイブリダイズ可能なテンプレート／標的核酸（例えば一本鎖ＤＮＡ）の領域の逆相補配列を有するように設計される。ヌクレオチド残基は、伸長生成物を生成するように、ホスホジエステル結合の形成によりプライマーの３’末端に付加される；又は、ヌクレオチド残基は、別の伸長生成物を生成するように、ホスホジエステル結合の形成により伸長生成物の３’末端に付加される。

本発明において、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、プライマー、伸長生成物、プライマー及び試験される核酸分子から形成された複合体）へのｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体の組み込みとは、ポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチド残基の３’炭素原子と、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ又は類似体の５’炭素原子との間のホスホジエステル結合の形成を指す。

本発明において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等を含み、これらの機能又は種類は、当技術分野において周知である。ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有してもよく、又は有さなくてもよく、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、フューション（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、サーミネーター（Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ヴェント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ等を含む。

一実施形態において、ポリメラーゼの改質により、理想的な塩基組み込み速度（例えば、１〜１００塩基毎秒）が、リアルタイム配列決定において達成される。

一実施形態において、ポリメラーゼは、用途により好適となるように特に改質される。例えば、ポリマーを迅速に、連続的に、及び正確に合成するために使用され得るポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼのクローンバンクから選択又は入手されるが、但し、単一のＤＮＡポリメラーゼ分子が、テンプレート鎖からの解離なしに１〜１００ｋｂ ＤＮＡの合成を達成することができることを条件とする。ポリメラーゼは、エクソヌクレアーゼ活性を有さず、塩基組み込みのエラー率は、１０^−５〜１０^−６／組み込み塩基まで低いことが好ましい。それぞれの特定のヌクレオチドに対するポリメラーゼのバイアスは、配列決定特異性を大幅に向上させ得る。ＤＮＡ、ＲＮＡ及びメチル化塩基に対して異なる検出可能バイアスを有するポリメラーゼが、配列決定に有利である。上述した物理化学的及び酵素学的特性に加えて、他の特性は、熱安定性、安定な緩衝系、高分子の蓄積下での作用能力、及び多くの副生成物（ピロホスフェート）に対する耐性を含み得る。

一実施形態において、真の塩基組み込み及び非組み込みが互いに最大限に区別され得るように、検出デバイスの能力に適合する重合速度を有する好適な突然変異体が、ポリメラーゼのクローンバンクからスクリーニングされる。そのような単分子／リアルタイムポリメラーゼ法において、ポリメラーゼは、修飾ヌクレオチドの組み込みを可能にすることも必要とされる。したがって、検出デバイスの能力に適合するポリメラーゼ突然変異体及び修飾ヌクレオチドを選択する必要がある。

一実施形態において、最も好適なポリメラーゼ突然変異体の選択に加えて、塩基組み込み速度を変化させるために緩衝剤もまた使用され得る（例えば、特定のヌクレオチドの組み込み速度は、ｐＨ及びイオンにより減少又は増加され得る）。ポリメラーゼポケットにおけるヌクレオチドの滞留時間を決定することにより、ポリメラーゼ突然変異体は、その特定のヌクレオチドに対するより高い、又はより低いバイアスに基づき選択され得る。酵素反応速度測定により、偽陽性の組み込みの可能性を低減することができ、真の組み込みをデバイスノイズから区別することができる。

一実施形態において、ポリメラーゼ突然変異体の二元複合体及び三元複合体の結晶構造を分析及び比較し、それらを検出可能な組み込み事象と照合することにより、突然変異を特異的に標的化するために重要である、候補における残基を発見することができ、それによって新たな特異的及び安定な相互作用の発見が促進される。

酵素の別の特性は、新たなプライマー保持テンプレートＤＮＡの進入及び配列決定の開始を可能にするように、終点において核酸分子を放出することができることである。一実施形態において、十分に安定な酵素の存在下で、１−１０−１００−１０００ｋｂのテンプレートがチャネル内で配列決定され得る。

本発明の有利な効果

本発明のマイクロウェル電極は、次の利点を有する：マイクロウェル電極において複数のナノチャネルを備え、したがって電極表面の汚染の影響を低減することができること；ナノチャネルにおけるガイド電極によって生成された電場及び電気浸透流により試薬の流れをガイドすることができること；試薬相互作用の目的を達成するためにマイクロ流体と統合することが容易であること；電極アレイの大規模製造が容易であること；電子信号検出（例えば、酸化還元サイクル、ＦＥＴ（電界効果トランジスタ）、電気化学、電気インピーダンスに基づく）を含む、様々な信号検出機構と適合可能であること；信号の物理的増幅を可能にすること；モノリシックＣＭＯＳとの統合を可能にすること；電場により核酸分子の動きを制御することができること；標識分子の電気信号を検出することにより、検出される化学物質の単分子検出を可能にすること；読み取り長さを大幅に増加すること；並びに、検出信号に高感度であること。

本発明の化学物質の分析のための方法は、分子検出及び分析、分子診断、疾患検出、物質特定、並びにＤＮＡ検出及び配列決定等において使用され得る。

本発明の他の特徴、態様及び利点は、図面を参照しながら、以下の本発明の例示的実施形態の詳細な説明を参照することにより明らかとなる。

本明細書の一部を構成する図面は、本発明の例示的実施形態を示し、本明細書と併せて、本発明の原理を説明するのに役立つ。

本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極の上面図である。 図１Ａに示されるＢ−Ｂ’に沿った断面図である。 図１Ａに示されるＣ−Ｃ’に沿った断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極の動作原理を示す概略図である。 異なる塩基と、第１の電極及び第２の電極に印加された検出電圧との間の対応関係を示す概略図である。 第１の電極及び第２の電極がそれぞれ４つのセグメントを含む、本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を示す概略図である。 ２つのマイクロウェル電極からなるマイクロウェル電極アレイを示す概略図である。 ４つのマイクロウェル電極からなるマイクロウェル電極アレイを示す概略図である。 マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極の４つの配置を示す図である。 マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極の４つの配置を示す図である。 マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極の４つの配置を示す図である。 マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極の４つの配置を示す図である。 本発明の一実施形態による配列決定システムを示す概略図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法の単純化されたフローを示す概略図である。 本発明の一実施形態による基板構造体の断面図である。 図８Ａに示される基板構造体の上面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の上面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の上面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法のある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の一実施形態による基板構造体を形成するある段階における形成物の断面図である。 本発明の例示的マイクロウェル電極を使用することにより検出された異なる遊離標識分子の検出結果を示す図である。 本発明の例示的マイクロウェル電極を使用することにより検出された異なる遊離標識分子の検出結果を示す図である。 シミュレーション計算により得られた、本発明の例示的マイクロウェル電極における単一標識分子と電極との間の衝突数の分布を示す図である。

詳細な説明

ここで、図面を参照しながら、本発明の様々な例示的実施形態を詳細に説明する。これらの実施形態において記載される構成要素及びステップの相対的配置、数式及び数値は、別段に指定されない限り、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきである。実施形態において指定されていない具体的な条件に関しては、慣例的条件、又は製造者により推奨される条件が一般に使用される。製造者が指定されていない試薬又は機器は、全て市販で入手可能な製品である。

さらに、説明の便宜上、図面において示される様々な構成要素の寸法は、実際の割合に従って描かれているとは限らず、例えば、ある特定の層の厚さ又は幅は、他の層に比べて誇張されている場合があることが理解されるべきである。

以下の例示的実施形態の説明は、単に例示を目的とし、決して本発明及びその用途又は使用を限定するものとして解釈されることを意図しない。

関連技術における当業者に知られている技術、方法及び装置は、詳細に議論されていない場合があるが、これらの技術、方法及び装置は、適宜本明細書の一部として認識されるべきである。

以下の図面において、同様の項目を示すために同様の参照数字及び文字が使用され、したがって、図面において一旦項目が定義されたら、後続の図面の例示においてそれをさらに議論する必要はないことが留意されるべきである。

図１Ａは、本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極の上面図である。図１Ｂは、図１Ａに示されるＢ−Ｂ’に沿った断面図である。図１Ｃは、図１Ａに示されるＣ−Ｃ’に沿った断面図である。

図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを参照すると、マイクロウェル電極１００は、１つ又は複数の第１の電極（複数可）３０１を備えてもよい。異なる第１の電極３０１が互いに分離されてもよく、例えば、異なる第１の電極３０１は、その間にギャップを有してもよく、又は、ギャップは、絶縁層で充填されてもよい。例示的には、第１の電極３０１は、約１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さｄ１を有してもよい。一実施形態において、第１の電極３０１は、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、炭素系材料（例えば、ダイヤモンド、グラファイト、アモルファスカーボン、カーボンナノチューブ等）、ケイ素又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で形成されてもよい。

マイクロウェル電極１００は、それぞれ１つの第１の電極３０１に対向して配置された１つ又は複数の第２の電極３０３をさらに備える。チャネル６０１は、各第１の電極３０１とその対向する第２の電極３０３との間に設けられる。チャネル６０１は、少なくとも１つの端部がチャンバ４０１と連通している。例示的には、第２の電極３０３は、約１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さｄ２を有してもよい。一実施形態において、第２の電極３０３は、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、炭素系材料（例えば、ダイヤモンド、グラファイト、アモルファスカーボン、カーボンナノチューブ等）、ケイ素又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で形成されてもよい。一実施形態において、チャンバ４０１の底部表面及びチャネル６０１の底部表面は、同じ面内にあってもよい。別の実施形態において、チャンバ４０１の底部表面及びチャネル６０１の底部表面は、異なる面内にあってもよい。

マイクロウェル電極１００は、チャンバ４０１内に位置する１つ又は複数のガイド電極５０１をさらに備える。一実施形態において、ガイド電極５０１は、チャネル６０１内に荷電物質を誘導し得る。さらに、ガイド電極５０１はまた、チャネル６０１内の荷電物質の動きを制御し得る。異なる電圧がチャネル６０１の両端でのガイド電極５０１に印加された場合、ガイド電極５０１の間で生成された誘導電場は、荷電物質（例えば酸化還元活性分子）を、チャネル６０１内に進入するように制御し、チャネル６０１内の荷電物質（例えば酸化還元活性分子）の動きを、荷電物質がチャネル６０１から外に容易に動くことができないように制御し得る。チャンバ４０１内にただ１つのガイド電極５０１が設けられている場合、このガイド電極５０１は、チャンバ４０１と連通した１つ又は複数のチャネル６０１内での荷電物質の動きを制御するために使用され得る。チャンバ４０１内に複数のガイド電極５０１が設けられている場合、ガイド電極５０１の各々が、それぞれ隣接するチャネル６０１内での荷電物質の動きを制御し得る。例示的には、ガイド電極５０１は、ケイ素、白金、金、ＩＴＯ、炭素系材料又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成され得る。

ガイド電極５０１は、第１の電極３０１又は第２の電極３０３に対して実質的に垂直であることが好ましい（図１に示される通り）。しかしながら、ガイド電極５０１は、第１の電極３０１又は第２の電極３０３に対して垂直であるとは限らず、その間の他の角度もまた可能であることが理解されるべきである。

本発明において提供されるマイクロウェル電極は、これに限定されないが、核酸配列決定において使用されてもよく、その場合、チャンバ４０１は、マイクロ流体チャンバであってもよい。マイクロウェル電極の製造プロセスは、ＣＭＯＳプロセスと適合することができ、大量製造が容易である。さらに、複数の信号伝達機構を核酸配列決定に採用することができ、より長い読み取り長さを達成することができる。さらに、マイクロウェル電極は、複数のチャネルを同時に備えることができるため、配列決定結果に対する電極汚染の影響が低減され、したがって配列決定結果がより正確となり得る。

図２Ａは、本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極の動作原理を示す概略図である。図２Ａに示されるように、マイクロウェル電極は、１組の検出電極（第１の電極３０１及び第２の電極３０３）と、１組のガイド電極５０１とを備える。第１の電極３０１に電圧Ｖ_１が印加され、第２の電極３０３に電圧Ｖ_２が印加され、２つのガイド電極５０１間に電圧差Ｖ_ｇが生成される。２つのガイド電極５０１間の誘導電場は、検出される分子（例えば、酸化還元活性標識分子）を２つの検出電極間のチャネル内に引き込むことができる。標識分子は、２つの検出電極間で酸化還元サイクル反応を生じる。酸化還元サイクル反応は、対応する電流信号を生成し、これが２つの検出電極により検出され得る。異なる標識分子は異なる電流信号に対応し、したがって、検出された電流信号に従って標識分子の種類が決定され得る。

図２Ｂは、異なる塩基と、第１の電極及び第２の電極に印加された検出電圧との間の対応関係を示す概略図である。酸化還元反応の原理に従い、電圧Ｖ_１及びＶ_２が、検出される分子に対応する酸化還元電位窓内にある場合にのみ、検出される分子により生じる電流信号が検出され得る。したがって、電圧Ｖ_１及びＶ_２の値を期間ｔ_０において数回変化させることにより、電圧Ｖ_１及びＶ_２を、検出される分子に対応する酸化還元電位窓内に置くことができ、次いで、検出される分子の種類を特定することができる。このようにして、異なる検出される分子の電流信号が、異なる電圧Ｖ_１及びＶ_２において検出され得る。図２Ｂに示されるように、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧが、それぞれ異なる電圧Ｖ_１及びＶ_２に対応する。具体的には、塩基Ａは、電圧Ｖ_１Ａ及びＶ_２Ａに対応し、塩基Ｔは、電圧Ｖ_１Ｔ及びＶ_２Ｔに対応し、塩基Ｃは、電圧Ｖ_１Ｃ及びＶ_２Ｃに対応し、塩基Ｇは、電圧Ｖ_１Ｇ及びＶ_２Ｇに対応する。塩基Ａを一例として挙げると、電圧Ｖ_１がＶ_１Ａに設定され、電圧Ｖ_２がＶ_２Ａに設定された際、塩基Ａに対応する標識分子がチャネル内に存在する場合には、酸化還元反応において塩基Ａに対応する標識分子により生成された電流信号ｉが、検出電極により検出され得る。同様に、電圧Ｖ_１及びＶ_２の値を変化させることにより、電圧Ｖ_１及びＶ_２は、塩基Ｔ、Ｃ又はＧに対応する標識分子の酸化還元電位窓内に置くことができ、標識分子の種類を特定することができ、次いで、標識分子に対応する塩基の種類を特定することができる。

一実施形態において、図１Ｂ及び１Ｃを参照すると、マイクロウェル電極は、基板１０１と、基板１０１上の絶縁層１０２とをさらに備えてもよい。第１の電極３０１、第２の電極３０３及びガイド電極５０１は、絶縁層１０２上に配設されてもよい。基板１０１は、例えば、シリコン基板、ＩＩＩ〜Ｖ族半導体材料で作製された基板、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）基板であってもよく、又は、酸化物半導体（例えば、ＺｎＯ、ＣｄＯ、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、若しくはＳｎＯ）基板であってもよく、又は、石英ガラス若しくはソーダガラス等の絶縁材料で作製された基板であってもよい。絶縁層１０２は、典型的には、酸化ケイ素（例えば二酸化ケイ素）、窒化ケイ素（例えばＳｉＮ）、ケイ素窒素酸化物等であってもよい。

実際の用途において、上記の第１の電極３０１及び第２の電極３０３は、支持要素により支持されてもよい。一実施形態において、図１Ａを参照すると、マイクロウェル電極は、第１の電極３０１を支持するための第１の支持要素２０１をさらに備えてもよい。一実施形態において、マイクロウェル電極は、複数の第１の電極３０１を備えてもよく、それらの全てが第１の支持要素２０１により支持されてもよい。別の実施形態において、マイクロウェル電極は、複数の第１の電極３０１と、複数の第１の支持要素２０１とを備えてもよく、第１の電極３０１の各々は、それぞれ対応する第１の支持要素２０１により支持されてもよい。さらに別の実施形態において、マイクロウェル電極は、複数の第２の電極３０３と、複数の第２の支持要素３０４とを備えてもよく、第２の電極３０３の各々は、それぞれ対応する第２の支持要素３０４により支持されてもよい。

上記の第１の支持要素２０１及び第２の支持要素３０４は、導電性要素又は非導電性要素であってもよく、好ましくは導電性要素である。第１の電極２０１及び第２の電極３０４が非導電性要素である場合、第１の支持要素２０１及び第２の支持要素３０４は、主に、第１の電極３０１及び第２の電極３０３を支持するように機能する。第１の電極２０１及び第２の電極３０４が導電性要素である場合、第１の支持要素２０１及び第２の支持要素３０４への電圧の印加により、第１の電極３０１及び第２の電極３０３に電圧が印加され得る。一実施形態において、上記の導電性要素は、ケイ素（例えばポリシリコン）、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、又は炭素系材料（複数種可）等からなる群から選択される材料により形成されてもよい。上述の非導電性要素は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、オキシ窒化ケイ素、ホウリンケイ酸ガラス等から選択される材料により形成されてもよい。さらに、第１の支持要素２０１は、基板１０１の表面と平行な方向において、楕円形、円形、多角形、正方形又は歯車形の断面形状を有してもよい。本発明は、上記の例示的形状に限定されないことが理解されるべきである。

本発明のマイクロウェル電極の別の実施形態において、上記の第１の電極３０１の材料及び第２の電極３０３の材料は、同じであってもよく、又は異なってもよい。一実施形態において、第１の電極３０１及び第２の電極３０３の一方は、容易に酸化される電極材料で作製されてもよく、また他方は、還元されやすい電極材料で作製されてもよい。

本発明のマイクロウェル電極の別の実施形態において、図１Ｂに示されるように、マイクロウェル電極１００は、第１の電極３０１、第２の電極３０３、第１の支持要素２０１（存在する場合）、第２の支持要素３０４（存在する場合）の少なくとも１つの表面上に形成された不動態化層７０１をさらに備えてもよい。一実施形態において、不動態化層７０１は、窒化ケイ素（例えばＳｉＮ）、酸化ケイ素（例えばＳｉＯ_２）等であってもよい。不動態化層７０１は、マイクロウェル電極を保護するように機能し得る。具体的には、マイクロウェル電極により核酸配列決定を行う場合、マイクロウェル電極のある特定の構成要素に対する損傷が回避され得るように、不動態化層７０１により被覆されていない領域のみが反応溶液と接触し得る。さらに、不動態化層７０１はまた、配列決定プロセスにおいて生成されるノイズを低減し得る。

本発明のマイクロウェル電極のさらに別の実施形態において、マイクロウェル電極１００は、酵素又は検出される化学物質８０２を固定することができるナノ構造体８０１（例えばナノドット）をさらに備えてもよい。ナノ構造体８０１は、チャンバ４０１の底部若しくは側壁上（図１Ａ及び１Ｂに示されるように）、又はチャネル６０１の底部若しくは側壁上に（図示せず）、又はガイド電極２１１上に位置してもよい。例示的には、ナノ構造体８０１のサイズは、１〜１００ｎｍ、例えば８ｎｍ、２０ｎｍ、６０ｎｍ等であってもよい。ナノ構造体８０１は、金属酸化物により形成されることが好ましく、金属酸化物は、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ_２）又は二酸化ハフニウム（ＨｆＯ_２）等の遷移金属酸化物であることが好ましい。代替として、ナノ構造体８０１はまた、金属により形成されてもよく、金属は、金又は白金等の不活性金属であることが好ましい。代替として、ナノ構造体８０１はまた、無機ポリマー、有機ポリマー、又はそれらの任意の組合せから選択される材料により形成されてもよい。

いくつかの実施において、第１の電極３０１及び／又は第２の電極３０３は、互いに離間した複数のセグメント、例えば２つ以上のセグメントを備えてもよい。以下で、異なる実施を参照しながら説明する。

１つの実施において、第１の電極３０１は、互いに離間した複数のセグメントを備え、第２の電極３０３は、ただ１つのセグメントを備える。マイクロウェル電極は、複数の第１の支持要素２０１を備えてもよく、第１の電極３０１の各セグメントは、対応する第１の支持要素２０１により支持され得る。この場合、第２の電極３０３に電圧が印加され得、異なる検出される分子（例えば酸化還元標識分子）に対応する電圧が、第１の電極３０１の様々なセグメントに印加され得る。検出される分子が第１の電極３０１の様々なセクションを通過する際、検出される分子の電流信号情報に加えて、検出される分子が第１の電極３０１の１つのセグメントから別のセグメントに動く時間情報もまた得ることができ、これは、異なる検出される分子の検出解像度を改善するのに有用である。

別の実施において、第１の電極３０１は、互いに離間した複数のセグメントを備え、第２の電極３０３もまた、互いに離間した複数のセグメントを備え、第１の電極３０１の各セグメントは、第２の電極３０３の１つのセグメントに対向して配置されている。第１の電極３０１の各セグメントは、対応する第１の支持要素２０１により支持されてもよく、第２の電極３０３の各セグメントは、対応する第２の支持要素３０４により支持されてもよい。この場合、第１の電極３０１の各セグメント、及び第１の電極３０１のこのセグメントに対向して配置された第２の電極３０３のセグメントに、異なる電圧が印加されてもよく、検出される分子がガイド電場の制御下で様々な電極セグメントを逐次通過する際、分子の酸化還元電位窓に対応する電圧がその間に印加された電極セグメントのみが、電流信号を検出し得る。したがって、異なる検出される分子が、第１の電極３０１の異なるセグメント及び第２の電極３０３の対応するセグメントにより検出され得る。

さらに別の実施において、第１の電極３０１は、１つのセグメントを備えてもよく、第２の電極３０３は、互いに離間した複数のセグメントを備えてもよい。この場合、第１の電極３０１に電圧が印加され得、異なる検出される分子（例えば酸化還元標識分子）の酸化還元窓に対応する電圧が、第２の電極３０３の様々なセグメントに印加され得る。検出される分子が第２の電極３０３の様々なセグメントを通過する際、検出される分子の電流信号情報に加えて、検出される分子が第２の電極３０３の１つのセグメントから別のセグメントに動く時間情報もまた得ることができ、これは、異なる検出される分子の検出解像度を改善するのに有用である。

図３は、第１の電極及び第２の電極がそれぞれ４つのセグメントを含む、本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を示す概略図である。図３に示されるように、第１の電極３０１は、第１の電極の第１のセグメント３１１と、第１の電極の第２のセグメント３２１と、第１の電極の第３のセグメント３３１と、第１の電極の第４のセグメント３４１とを備える。第１の電極の第１のセグメント３１１から第１の電極の第４のセグメント３４１に印加される電圧は、それぞれＶ_１１、Ｖ_２１、Ｖ_３１、及びＶ_４１である。第２の電極３０３は、第２の電極の第１のセグメント３１３と、第２の電極の第２のセグメント３２３と、第２の電極の第３のセグメント３３３と、第２の電極の第４のセグメント３４３とを備える。第２の電極の第１のセグメント３１３から第２の電極の第４のセグメント３４３に印加される電圧は、それぞれＶ_１２、Ｖ_２２、Ｖ_３２、及びＶ_４２である。第１の電極３０１の各セグメントは、第２の電極３０３の１つのセグメントに対向して配置され、第１の電極３０１の各セグメント及びそれに対向して配置された第２の電極３０３のセグメントは、１組の検出電極として使用される。例えば、第１の電極の第１のセグメント３１１は、第２の電極の第１のセグメント３１３に対向して配置され、これらの２つのセグメントは、１組の検出電極として使用される。検出電極の各組に印加される検出電圧は、検出される標識分子に対応する。２つのガイド電極５０１の間の電圧差は、Ｖ_ｇである。検出される標識分子がガイド電極５０１のガイド電場の制御下で４組の検出電極を逐次通過すると、検出される標識分子の酸化還元窓に対応する検出電圧が印加された１組の検出電極のみが、電流信号を検出することができる。したがって、事前に検出電圧を設定した後、検出される標識分子の種類が、電流信号を検出する検出電極に従って決定され得る。例えば、第１の組の検出電極に印加された検出電圧が、検出されるある特定の標識分子の酸化還元窓に対応する場合、第１の組の検出電極による電流信号の検出後に、検出される標識分子が検出されたことが決定され得る。

本発明は、上記実施形態のいずれか１つによる１つ又は複数のマイクロウェル電極を備える、マイクロウェル電極アレイをさらに提供する。一実施形態において、複数のマイクロウェル電極は、ガイド電極を共有してもよい。

図４Ａは、２つのマイクロウェル電極からなるマイクロウェル電極アレイを示す概略図である。図４Ａに示されるように、マイクロウェル電極は、第１のマイクロウェル電極と、第２のマイクロウェル電極とを備え、第１のマイクロウェル電極及び第２のマイクロウェル電極は、中間ガイド電極５０１を共有している。第１のマイクロウェル電極の第１の電極３０１及び第２の電極３０３に印加される電圧は、それぞれＶ_１１及びＶ_１２であり、第２のマイクロウェル電極の第１の電極３０１及び第２の電極３０３に印加される電圧は、それぞれＶ_２１及びＶ_２２である。第１のマイクロウェル電極の２つのガイド電極５０１には電圧差Ｖ_ｇ１が印加され、第２のマイクロウェル電極の２つのガイド電極５０１には電圧差Ｖ_ｇ２が印加される。負に帯電した標識分子は、第１のマイクロウェル電極のチャネル内に引き込まれ、正に帯電した標識分子は、第２のマイクロウェル電極のチャネル内に引き込まれ、したがって標識分子のスクリーニングが達成される。このようにして、２つのマイクロウェル電極からなるマイクロウェル電極アレイは、標識分子の電荷極性を認識することができ、その電流信号に従って標識分子の種類を決定することができる。

図４Ｂは、４つのマイクロウェル電極からなるマイクロウェル電極アレイを示す概略図である。図４Ｂに示されるように、マイクロウェル電極は、第１のマイクロウェル電極と、第２のマイクロウェル電極と、第３のマイクロウェル電極と、第４のマイクロウェル電極とを備える。これらの４つのマイクロウェル電極は、中間ガイド電極５０１を共有している。第１のマイクロウェル電極の第１の電極３０１及び第２の電極３０３に印加される電圧は、それぞれＶ_１１及びＶ_１２であり；第２のマイクロウェル電極の第１の電極３０１及び第２の電極３０３に印加される電圧は、それぞれＶ_２１及びＶ_２２であり；第３のマイクロウェル電極の第１の電極３０１及び第２の電極３０３に印加される電圧は、それぞれＶ_３１及びＶ_３２であり；第４のマイクロウェル電極の第１の電極３０１及び第２の電極３０３に印加される電圧は、それぞれＶ_４１及びＶ_４２である。第１から第４のマイクロウェル電極のガイド電極５０１に印加される電圧差は、それぞれＶ_ｇ１、Ｖ_ｇ２、Ｖ_ｇ３及びＶ_ｇ４である。点線ボックス内の概略図は、Ｖ_ｇ１、Ｖ_ｇ２、Ｖ_ｇ３及びＶ_ｇ４の経時的変動を示す。周期的なガイド電場により、異なる標識分子が時間的周期における異なるタイミングで４つのマイクロウェル電極のチャネル内に引き込まれ得、これによってチャネル内での各標識分子の反応及び検出時間を効果的に増加させることができ、したがって、標識分子の検出信号が効果的に向上され得、検出の信号対ノイズ比が改善され得、隣接する標識分子間の信号干渉が回避され得る。

マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極は、異なる形状で配置されてもよい。

図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄは、それぞれ、マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極の４つの配置を示す。図５Ａでは、複数のマイクロウェル電極はリング状に配置されている。図５Ｂでは、複数のマイクロウェル電極は正方形又は長方形状に配置されている。図５Ｃでは、複数のマイクロウェル電極は、行及び列の行列として配置されている。しかしながら、本発明は、上記配置に限定されない。例えば、複数のマイクロウェル電極はまた、楕円形、円形、扇形、ジグザグ形、又は歯車形等で配置されてもよい。さらに、複数のマイクロウェル電極は、二次元配置を有することに限定されず、例えば、複数のマイクロウェル電極はまた、三次元配置である積層体として配置されてもよい。

さらに、マイクロウェル電極アレイにおける複数のマイクロウェル電極はまた、直列に接続されてもよく、すなわち、様々なマイクロウェル電極のチャネルは、図５Ａ又は５Ｂに示されるように、互いに直列に接続する。複数のマイクロウェル電極はまた、図５Ｃに示されるように互いに独立していてもよく、この場合、マイクロウェル電極はそれぞれ、異なる標識分子を検出するために使用され得る。代替として、複数のマイクロウェル電極はまた、並列で接続されてもよく、すなわち、様々なマイクロウェル電極のチャネルは、図５Ｄに示されるように、互いに並列に接続され、複数の（例えば４つの）マイクロウェル電極のガイド電極の全てに電圧差Ｖ_ｇが印加されており、複数のマイクロウェル電極は、それぞれの検出電圧（すなわち、第１の電極及び第２の電極に印加された電圧）により、標識分子を並行して検出し得る。

本発明は、上記実施形態によるマイクロウェル電極アレイを備えるセンサチップをさらに提供する。センサチップは、一実施形態において、マイクロウェル電極アレイを備えてもよく、電極（例えば、第１の電極、第２の電極、又はガイド電極）に電圧を印加するための回路、増幅デバイス、電流感知回路、電圧感知回路等をさらに備えてもよい。

本発明は、上記実施形態のセンサチップを備える配列決定システムをさらに提供する。

図６は、本発明の一実施形態による配列決定システムを示す概略図である。図６に示されるように、配列決定システムは、フローセルと、センサチップと、印刷回路板（ＰＣＢ）と、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）カードと、コンピュータ／携帯デバイスとを備える。フローセルは、マイクロ流体をセンサチップに供給し得る。パッケージ化されたセンサチップは、ＰＣＢボード上のソケットを用いてＰＣＢボード上に装着され得る。ＰＣＢボードは、電流及び／又は電圧感知回路チップ、電流及び／又は電圧増幅回路チップ、データ保存チップ、システム制御チップ等を備えてもよい。ＦＰＧＡカードは、ＰＣＢボードと統合されてもよく、また、配列決定システムを制御するためのコンピュータ又は携帯デバイス上のアプリケーション制御ソフトウェアを開発することができるように、インターフェースを介してコンピュータ／携帯デバイスに接続されてもよい。

実際の用途において、配列決定システムは、異なる形態、例えばパームトップ形態、ラップトップ形態、ベンチトップ形態、又はメインフレーム形態で設計されてもよい。マイクロウェル電極アレイは、配列決定システムのセンサチップに統合されてもよく、ＦＰＧＡカードによりソフトウェアプログラミングが実行され得、したがってハードウェア及びソフトウェアの統合が達成される。

本発明において提案されるマイクロウェル電極は、ＣＭＯＳプロセスと適合することができる。以下で、マイクロウェル電極を製造するための例示的方法を紹介する。

図７は、本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法の単純化されたフローを示す概略図である。図８Ａ〜８Ｋは、本発明の一実施形態によるマイクロウェル電極を製造するための方法の様々な段階における形成物を示す。マイクロウェル電極を製造するための方法を、以下で図７及び８Ａ〜８Ｋを参照しながら詳細に説明する。

まず、ステップ７０２において、基板構造体が用意される。

図８Ａは、本発明の一実施形態による基板構造体の断面図を示す。図８Ｂは、図８Ａに示される基板構造体の上面図を示す。図８Ａ及び８Ｂに示されるように、基板構造体は、表面上に絶縁層１０２を有する基板１０１と、絶縁層１０２上の第１の支持要素材料層２０１とを備える。さらに、第１の支持要素材料層２０１は、その側壁（例えば、第１の支持要素材料層２０１の片側又は両側の側壁（複数可））上に、第１の電極材料層３０１、犠牲材料層３０２、第２の電極材料層３０３及び第２の支持要素材料層３０４を順次有する。図８Ａ及び８Ｂに示される基板構造体では、第１の支持要素材料層２０１は、その片側の側壁上に、第１の電極材料層３０１、犠牲材料層３０２、第２の電極材料層３０３及び第２の支持要素材料層３０４を有することに留意されたい。いくつかの実施形態において、第１の支持要素材料層２０１はまた、その他方側の側壁上に、第１の電極材料層３０１、犠牲材料層３０２、第２の電極材料層３０３及び第２の支持要素材料層３０４を有してもよい。

限定されない例として、第１の電極材料層３０１は、約１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さを有してもよい。犠牲材料層３０２は、約０．５〜１００ｎｍ、例えば５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、４０ｎｍ、８０ｎｍ等の厚さを有してもよい。第２の電極材料層３０３は、約１〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ等の厚さを有してもよい。

第１の電極材料層３０１及び第２の電極材料層３０３は、同じ材料又は異なる材料により構成されてもよい。さらに、犠牲材料層３０２は、第１の電極材料層３０１及び第２の電極材料層３０３に従って選択され得る材料により形成されてもよい。例示的には、第１の電極材料層３０１及び第２の電極材料層３０３は、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、炭素系材料（例えば、ダイヤモンド、グラファイト、アモルファスカーボン等）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で形成されてもよい。犠牲材料層３０２は、クロム、タングステン、アルミニウム、酸化アルミニウム、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成されてもよい。具体的な実施形態において、第１の電極材料層３０１及び第２の電極材料層３０３は、白金により形成されてもよく、犠牲材料層３０２は、クロム又は酸化ケイ素により形成されてもよい。別の具体的な実施形態において、第１の電極材料層３０１及び第２の電極材料層３０３は、金により形成されてもよく、犠牲材料層３０２は、タングステンにより形成されてもよい。

次に、ステップ７０４において、第１の支持要素材料層２０１、第１の電極材料層３０１、犠牲材料層３０２、第２の電極材料層３０３及び第２の支持要素材料層３０４がパターニングされ、１つ又は複数のチャンバ４０１、第１の支持要素２０１が形成され、図８Ｃに示されるように、第１の支持要素２０１の側壁上に順次位置する第１の電極３０１、犠牲層３０２、第２の電極３０３及び第２の支持要素３０４が形成される。ここで、第１の支持要素２０１、第１の電極３０１、犠牲層３０２、第２の電極３０３及び第２の支持要素３０４は、それぞれ第１の支持要素材料層、第１の電極材料層、犠牲材料層、第２の電極材料層及び第２の支持要素材料層から形成される。形成されたチャンバ４０１は、その後形成されるチャネル６０１と連通している。さらに、このステップにおいて、第１の電極材料層３０１及び／又は第２の電極材料層３０３を複数のセグメントに分離し、これにより、形成された第１の電極３０１及び／又は第２の電極３０３が、互いに離間した複数のセグメントをそれぞれ備えることも可能である。

次いで、ステップ７０６において、図８Ｄに示されるように、１つ又は複数のガイド電極（複数可）５０１がチャンバ４０１内に形成される。例えば、ガイド電極５０１は、フォトリソグラフィー、堆積、及び剥離等のプロセスにより形成されてもよい。ガイド電極５０１はまた、堆積、平坦化、及びエッチング等のプロセスにより形成されてもよい。ガイド電極５０１は、第１の電極３０１に対して実質的に垂直であることが好ましい。代替として、ガイド電極５０１は、第２の電極３０３に対して実質的に垂直であってもよい。すなわち、ガイド電極５０１、第１の電極３０１及び第２の電極３０２に電圧を印加した後、ガイド電極５０１間の電場の方向は、第１の電極３０１と第２の電極３０３との間の電場の方向に対して実質的に垂直である。

次いで、ステップ７０８において、第１の支持要素２０１の側壁上の犠牲層３０２が除去されて、第１の電極３０１と第２の電極３０３との間にチャネル６０１が形成され、チャネル６０１は、図８Ｅに示されるように、少なくとも１つの端部がチャンバ４０１と連通している。

一実施形態において、第１の支持要素２０１の側壁から犠牲層３０２を除去する前に、図８Ｆに示されるように、第１の支持要素２０１、第２の支持要素３０４、第１の電極３０１、又は第２の電極３０３の少なくとも１つの表面上に、不動態化層７０１が形成されてもよい。例示的には、不動態化層７０１は、窒化ケイ素、酸化ケイ素等により形成され得る。例えば、不動態化材料は、第１の支持要素２０１、第１の電極３０１、第２の電極３０３及び第２の支持要素３０４の上に堆積されてもよい。次いで、堆積された不動態化材料は、パターン化されて、第１の支持要素２０１、第２の支持要素３０４、第１の電極３０１、又は第２の電極３０３の少なくとも１つの表面上に不動態化層７０１を形成し得る。次いで、犠牲層３０２は、選択的エッチングプロセスにより除去されて、図８Ｇに示されるように、第１の電極３０１と第２の電極３０３との間にチャネル６０１が形成され得る。

別の実施形態において、第１の支持要素２０１の側壁から犠牲層３０２を除去する前に、第１の支持要素２０１の上部の一部、及び第２の支持要素３０４の上部の一部が除去されて、図８Ｈに示されるように、第１の電極３０１の一部、犠牲層３０２の一部及び第２の電極３０３の一部が露出されてもよい。次いで、図８Ｉに示されるように、第１の支持要素２０１の残っている部分、第２の支持要素３０４の残っている部分、第１の電極３０１の露出部分、犠牲層３０２の露出部分、及び第２の電極３０３の露出部分上に、不動態化層７０１が堆積される。その後、堆積された不動態化層７０１は平坦化されて、図８Ｊに示されるように、第１の支持要素２０１の残っている部分及び第２の支持要素３０４の残っている部分の上に不動態化層７０１が形成され、犠牲層３０２が露出される。１つの実施において、平坦化プロセスは、第１の電極３０１の上表面、犠牲層３０２の上表面、及び第２の電極３０３の上表面で停止してもよい。代替として、平坦化プロセスは、不動態化層７０１の一部が第１の支持要素２０１の残っている部分、及び第２の支持要素３０４の残っている部分の上に維持される限り、第１の電極３０１の一部、犠牲層３０２の一部、及び第２の電極３０３の一部を除去してもよい。次いで、露出した犠牲層３０２は、選択的エッチングプロセスにより除去されて、図８Ｋに示されるように、第１の電極３０１と第２の電極３０３との間にチャネル６０１が形成され得る。

例として、図１Ａ及び１Ｂを参照すると、形成されたチャネル６０１は、約０．５〜１００ｎｍ（例えば、１ｎｍ、２ｎｍ、１０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ等）の幅Ｗを有してもよく、チャネル６０１は、約５０ｎｍ〜１００μｍ（例えば、１００ｎｍ、５００ｎｍ、５μｍ、１０μｍ、３０μｍ等）の長さＬを有してもよく、またチャネル６０１は、約０〜１０μｍ（例えば、１００ｎｍ、３００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、８μｍ等）の深さＨを有してもよい。ここで、チャネル６０１の幅は、第１の電極３０１と第２の電極３０３との間の距離であり、チャネル６０１の長さは、第１の支持要素２０１の周りに延在する長さであり、チャネル６０１の深さは、第１の電極３０１又は第２の電極３０３の上表面と絶縁層１０２との間の距離である。

上記方法により、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示されるマイクロウェル電極が形成される。しかしながら、本発明は、マイクロウェル電極を製造するための上記の方法に限定されないことが理解されるべきである。実際の用途において、マイクロウェル電極を製造するための方法は、マイクロウェル電極の具体的な構造に基づいて採用することができ、例えば、いくつかのステップは、上記方法に基づいて追加されてもよく、又は、上記方法のいくつかのステップは、調節され得る。例えば、第１の支持要素の側壁の上に第１の電極材料層を形成する場合、第１の電極の必要な数に基づいて、第１の電極材料層が第１の支持要素の片側又は両側の側壁（複数可）の上に形成されるかどうかが決定され得る。

マイクロウェル電極を形成した後、酵素又は検出される化学物質８０２を固定することができるナノ構造体８０１は、チャンバ４０１の底部若しくは側壁上、又はチャネル６０１の底部若しくは側壁上、又はガイド電極５０１上に形成され得る。図１Ｃは、ナノ構造体がチャンバ４０１の底部上に位置する状況を示す。一実施形態において、ナノ構造体８０１は、ナノドットであってもよい。例示的には、ナノ構造体８０１のサイズは、１〜１００ｎｍ、例えば８ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ等であってもよい。一実施形態において、ナノ構造体８０１は、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ_２）若しくは二酸化ハフニウム（ＨｆＯ_２）等の遷移金属酸化物、不活性金属、無機ポリマー、有機ポリマー、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成されてもよい。

図８Ａ及び８Ｂに示される基板構造体は、異なる様式で形成され得る。以下で、図９Ａ〜９Ｊを参照しながら、基板構造体の形成の具体的な実施を紹介する。

まず、図９Ａに示されるように、表面上に絶縁層１０２を有する基板１０１が用意される。基板１０１は、例えば、シリコン基板、ＩＩＩ〜Ｖ族半導体材料で作製された基板、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）基板であってもよく、又は、ＺｎＯ、ＣｄＯ、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、ＳｎＯ等の酸化物半導体基板であってもよく、又は、石英ガラス若しくはソーダガラス等の絶縁材料で作製された基板であってもよい。絶縁層１０２は、熱酸化により、又は堆積（例えば、物理気相堆積（ＰＶＤ）、化学気相堆積（ＣＶＤ）等）により、基板１０１上に形成され得る。典型的には、絶縁層１０２は、二酸化ケイ素層であってもよい。

次に、図９Ｂに示されるように、第１の支持要素材料層２０１が、絶縁層１０２の一部上に形成される。第１の支持要素材料層２０１は、導電性材料、又は非導電性材料、好ましくは導電性材料により形成されてもよい。例えば、導電性材料は、堆積（例えばＰＶＤ又はＣＶＤ）により絶縁層１０２上に堆積されてもよく、次いで、導電性材料がパターン化されて、第１の支持要素材料層２０１が形成される。限定されない例として、基板１０１の表面に平行な方向における第１の支持要素材料層２０１の断面は、楕円形、正方形、円形、又は多角形である。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、第１の支持要素材料層２０１はまた、他の好適な形状を有してもよいことが理解されるべきである。

次いで、図９Ｃに示されるように、第１の電極材料層３０１は、第１の支持要素材料層２０１の上表面及び側壁を被覆するように堆積される。ここで、第１の電極材料層３０１はまた、絶縁層１０２の露出部分の全て又は一部を被覆してもよい。

次いで、図９Ｄに示されるように、第１の支持要素材料層の上表面上の第１の電極材料層３０１は、異方性乾式エッチング、例えば反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）、イオンビームエッチング（ＩＢＥ）により除去され、第１の支持要素材料層２０１の側壁上に第１の電極材料層３０１のみが保存されてもよい。一実施形態において、絶縁層１０２上にも第１の電極材料層３０１を堆積させた場合、絶縁層１０２上の第１の電極材料層３０１は除去される。

次に、図９Ｅに示されるように、第１の支持要素材料層２０１の上表面、並びに残っている第１の支持要素材料層３０１（すなわち、第１の支持要素材料層２０１の側壁上の第１の電極材料層３０１）の上表面及び側壁を被覆するように、犠牲材料層３０２が堆積される。ここで、犠牲材料層３０２はまた、絶縁層１０２の露出部分の全て又は一部を被覆してもよい。

次に、図９Ｆに示されるように、第１の支持要素材料層２０１の上表面及び残っている第１の電極材料層３０１の上表面上の犠牲材料層３０２が除去され、残っている第１の電極材料層３０１の側壁上の犠牲材料層３０２のみが保存される。一実施形態において、絶縁層１０２上にも犠牲材料層３０２を堆積させた場合、絶縁層１０２上の犠牲材料層３０２は除去される。

次いで、図９Ｇに示されるように、第１の支持要素材料層２０１の上表面、残っている第１の電極材料層３０１の上表面、並びに残っている犠牲材料層３０２の上表面及び側壁を被覆するように、第２の電極材料層３０３が堆積される。ここで、第２の電極材料層３０３はまた、絶縁層１０２の露出部分の全て又は一部を被覆してもよい。

次いで、図９Ｈに示されるように、第１の支持要素材料層２０１の上表面、残っている第１の電極材料層３０１の上表面、残っている犠牲材料層３０２の上表面上の第２の電極材料層３０３が除去され、残っている犠牲材料層３０２の側壁上の第２の電極材料層３０３が保存される。一実施形態において、絶縁層１０２上にも第２の電極材料層３０３を堆積させた場合、絶縁層１０２上の第２の電極材料層３０３は除去される。

次いで、図９Ｉに示されるように、第１の支持要素材料層２０１、第１の支持要素材料層２０１の側壁上の第１の電極材料層３０１、第１の支持要素材料層２０１の側壁の上の犠牲材料層３０２、第１の支持要素材料層２０１の側壁の上の第２の電極材料層３０３、及び絶縁層１０２の被覆されていない部分を被覆するように、第２の支持要素材料層３０４が堆積される。

次いで、図９Ｊに示されるように、堆積された第２の支持要素材料層３０４が平坦化されて、第１の支持要素材料層２０１の側壁の上の犠牲材料層３０２が露出され、基板構造体が形成される。１つの実施において、この平坦化プロセスは、第１の支持要素材料層２０１、第１の支持要素材料層２０１の側壁の上の第１の電極材料層３０１、犠牲層３０２、及び第２の電極材料層３０３の上表面、並びに第２の支持要素材料層３０４の上表面を実質的に同一平面とし得る。

後続のステップ７０４〜７０８は、本明細書において繰り返されないが、図９Ａ〜９Ｊに従う基板構造体を形成した後に、上述の方法に従って実行され得る。

一実施形態において、循環的酸化還元反応における使用のための標識分子は、例えば、

から選択され得る。

一実施形態において、標識分子で修飾されたｄＮＴＰ又はその類似体は、例えば、以下の方法により合成され得る。

本発明において、４つの異なるｄＮＴＰ分子、ＮＴＰ分子又はそれらの類似体を修飾するために異なる標識分子が設計されてもよく、それにより、異なる遊離標識分子が異なる酸化還元電位を有し、さらに、異なるｄＮＴＰ分子、ＮＴＰ分子又は類似体が区別され得る。一実施形態において、異なる標識分子は、以下のように示され得る。

異なる遊離標識分子が保持する電荷の数が異なる場合、それらは、ガイド電極の作用下で異なる移動速度を有し、一実施形態において、異なる標識分子が保持する電荷は、以下の通りである。

一実施形態において、標識分子により修飾された非荷電又は負に帯電したｄＮＴＰは、以下に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼの存在下で、正に帯電した酸化還元活性物質を放出する。

一実施形態において、第１の電極と第２の電極との間に生じる循環的酸化還元反応の原理は、以下の通りである。

図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、本発明の例示的マイクロウェル電極を使用することにより検出された異なる遊離標識分子の検出結果を示し、図１０Ａは、本発明のマイクロウェル電極により検出されたヘキサシアノ鉄酸塩分子の酸化還元電流曲線であり、図１０Ｂは、本発明のマイクロウェル電極により検出されたフェロセン分子の酸化還元電流曲線である。図１０Ａ及び図１０Ｂにおける結果は、ヘキサシアノ鉄酸塩分子及びフェロセン分子が、酸化還元電位窓及び曲線形状の点で互いに大きく異なることを示している。結果は、本発明のマイクロウェル電極により検出される電流信号によって、様々な遊離標識分子が区別及び特定され得ることを示している。反応溶液中の基本単位（例えば、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ又はそれらの類似体）のそれぞれが異なる標識分子で修飾されている場合、本発明のマイクロウェル電極を使用して、検出された固有の電気信号により標識分子の種類を区別及び特定し、反応に関与する反応溶液中の基本単位（例えば、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ又はそれらの類似体）の種類をさらに区別及び特定し、また最終的に、試験される化学物質（例えば核酸）の分析を達成することができる。

図１１は、シミュレーション計算により得られた、本発明の例示的マイクロウェル電極における単一標識分子と電極との間の衝突数の分布を示す。分子吸収等の非理想的条件を考慮せずに、電気化学的に活性な分子が電極と１回衝突した際に１つの電子が交換される場合、単位時間内の衝突数は、生成される最大理論電流値に直接変換され得る。したがって、チャネルの最小サイズをさらに減少させる、標識分子の化学構造を変化させる、各衝突の電子交換数を増加させる、及び分子吸収を低減するように電極表面を処理する等の手段によって、電気信号の検出の精度を向上させるために電流信号をさらに増幅させることができる。

本明細書において、本発明の実施形態によるマイクロウェル電極及びそれを製造するための方法、並びにマイクロウェル電極に基づく核酸の分析のための方法を詳細に説明した。当技術分野において周知であるいくつかの詳細は、本発明の概念が不鮮明となることを避けるために説明されていない。上記説明に従って、本明細書において開示された技術的解決策をどのように実施するかが当業者に十分に認識される。さらに、本明細書において教示される様々な実施形態は、自由に組み合わせることができる。添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、上述の実施形態に様々な修正が行われてもよいことが、当業者に理解されるべきである。

Claims (59)

1. １つ又は複数の第１の電極と；
   それぞれ１つの第１の電極と対向して配置された１つ又は複数の第２の電極であって、各第１の電極とそれに対向する前記第２の電極との間にチャネルが設けられており、前記チャネルは、少なくとも１つの端部がチャンバと連通している、１つ又は複数の第２の電極と；
   前記チャンバ内に位置する１つ又は複数のガイド電極と
   を備えるマイクロウェル電極。
2. 前記１つ又は複数の第１の電極を支持するための第１の支持要素をさらに備える、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
3. 前記マイクロウェル電極が、複数の第１の電極と、複数の第１の支持要素とを備え、各電極は、対応する第１の支持要素により支持されている、請求項２に記載のマイクロウェル電極。
4. 前記マイクロウェル電極が、複数の第２の電極と、複数の第２の支持要素とを備え、各第２の電極は、対応する第２の支持要素により支持されている、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
5. 前記第１の電極が、互いに離間した複数のセグメントを備える、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
6. 前記第２の電極が、互いに離間した複数のセグメントを備える、請求項１又は請求項５に記載のマイクロウェル電極。
7. 複数の第１の支持要素をさらに備え、前記第１の電極の各セグメントは、対応する第１の支持要素により支持されている、請求項５に記載のマイクロウェル電極。
8. 複数の第２の支持要素をさらに備え、前記第２の電極の各セグメントは、対応する第２の支持要素により支持されている、請求項６に記載のマイクロウェル電極。
9. 前記第１の支持要素が、導電性要素である、請求項３又は請求項７に記載のマイクロウェル電極。
10. 前記第２の支持要素が、導電性要素である、請求項４又は請求項８に記載のマイクロウェル電極。
11. 酵素又は検出される化学物質を固定することができるナノ構造体をさらに備え、前記ナノ構造体は、前記チャンバの底部若しくは側壁、又は前記チャネルの底部若しくは側壁、又は前記ガイド電極上に位置する、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
12. 前記ナノ構造体が、金属、金属酸化物、無機ポリマー、有機ポリマー、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成されている、請求項１１に記載のマイクロウェル電極。
13. 前記チャネルが、０．５〜１００ｎｍの幅を有する；及び／又は
    前記チャネルが、５０ｎｍ〜１００μｍの長さを有する；及び／又は
    前記チャネルが、０〜１０μｍの深さを有する、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
14. 前記第１の電極が、１〜１０００ｎｍの厚さを有する；及び／又は
    前記第２の電極が、１〜１０００ｎｍの厚さを有する、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
15. 前記第１の電極及び前記第２の電極が、同じ材料により形成されている、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
16. 前記第１の電極及び前記第２の電極が、異なる材料により形成されている、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
17. 前記第１の電極が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成されている；及び／又は
    前記第２の電極が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成されている；及び／又は
    前記ガイド電極が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成されている、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
18. 前記導電性要素が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成されている、請求項９に記載のマイクロウェル電極。
19. 前記導電性要素が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成されている、請求項１０に記載のマイクロウェル電極。
20. 前記第１の支持要素が、基板の表面と平行な方向において、楕円形、円形、多角形、又は歯車形の断面形状を有する、請求項２に記載のマイクロウェル電極。
21. 前記チャンバの底部表面及び前記チャネルの底部表面が、同じ面又は異なる面内にある、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
22. 基板と、前記基板上の絶縁層とをさらに備え、
    前記第１の電極、前記第２の電極及び前記ガイド電極は、前記絶縁層上に位置する、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
23. 前記第１の電極及び／又は前記第２の電極の表面上に位置する不動態化層をさらに備える、請求項１に記載のマイクロウェル電極。
24. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載のマイクロウェル電極を備える、マイクロウェル電極アレイ。
25. 前記マイクロウェル電極アレイが、複数のマイクロウェル電極を備え、
    前記複数のマイクロウェル電極は、楕円形、円形、環状、扇形、長方形、正方形、ジグザグ形、若しくは歯車形で、又は行及び列の行列として、又は積層体として配置されている、請求項２４に記載のマイクロウェル電極アレイ。
26. 前記複数のマイクロウェル電極が、互いに独立している、又は直列に接続されている、又は並列に接続されている、請求項２５に記載のマイクロウェル電極アレイ。
27. ２つ以上のマイクロウェル電極が１つのガイド電極を共有する、請求項２５に記載のマイクロウェル電極アレイ。
28. 請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のマイクロウェル電極アレイを備える、センサチップ。
29. 請求項２８に記載のセンサチップを備える、配列決定システム。
30. マイクロウェル電極を製造するための方法であって、
    表面上に絶縁層を有する基板と、前記絶縁層上の第１の支持要素材料層とを備える基板構造体を用意するステップであって、前記第１の支持要素材料層は、その側壁上に、第１の電極材料層、犠牲材料層、第２の電極材料層及び第２の支持要素材料層を順次有する、ステップと；
    前記第１の支持要素材料層、前記第１の電極材料層、前記犠牲材料層、前記第２の電極材料層及び前記第２の支持要素材料層をパターニングして、１つ又は複数のチャンバ、第１の支持要素を形成し、前記第１の支持要素の側壁上に順次位置する第１の電極、犠牲層、第２の電極及び第２の支持要素を形成するステップと；
    前記チャンバ内に１つ又は複数のガイド電極を形成するステップと；
    前記第１の支持要素の側壁上の前記犠牲層を除去して、前記第１の電極と前記第２の電極との間にチャネルを形成するステップと
    を含み、前記チャネルは、少なくとも１つの端部が前記チャンバと連通している、方法。
31. 前記基板構造体を用意する前記ステップが、
    表面上に絶縁層を有する基板を用意することと；
    前記絶縁層の一部上に第１の支持要素材料層を形成することと；
    前記第１の支持要素材料層の上表面及び側壁を被覆するように第１の電極材料層を堆積させることと；
    前記第１の支持要素材料層の上表面上の前記第１の電極材料層を除去することと；
    前記第１の支持要素材料層の上表面、残っている第１の電極材料層の上表面及び側壁を被覆するように犠牲材料層を堆積させることと；
    前記第１の支持要素材料層の上表面、及び残っている第１の電極材料層の上表面上の前記犠牲材料層を除去することと；
    前記第１の支持要素材料層の上表面、残っている第１の電極材料層の上表面、並びに残っている犠牲材料層の上表面及び側壁を被覆するように第２の電極材料層を堆積させることと；
    前記第１の支持要素材料層の上表面、残っている第１の電極材料層の上表面、及び残っている犠牲材料層の上表面上の前記第２の電極材料層を除去することと；
    前記第１の支持要素材料層、前記第１の支持要素材料層の側壁上の前記第１の電極材料層、前記第１の支持要素材料層の側壁の上の前記犠牲材料層、前記第１の支持要素材料層の側壁の上の前記第２の電極材料層、及び前記絶縁層の被覆されていない部分を被覆するように、第２の支持要素材料層を堆積させることと；
    前記堆積された第２の支持要素材料層を平坦化して、前記第１の支持要素材料層の側壁の上の前記犠牲材料層を露出させることと
    を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記犠牲層を除去する前に、
    前記第１の支持要素、前記第２の支持要素、前記第１の電極又は前記第２の電極の少なくとも１つの表面上に不動態化層を形成するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
33. 前記犠牲層を除去する前に、
    前記第１の支持要素の上部の一部、及び前記第２の支持要素の上部の一部を除去して、前記第１の電極の一部、前記犠牲層の一部、及び前記第２の電極の一部を露出させるステップと；
    残っている第１の支持要素、残っている第２の支持要素、前記第１の電極の露出部分、前記犠牲層の露出部分、及び前記第２の電極の露出部分上に、不動態化層を堆積させるステップと；
    前記堆積された不動態化層を平坦化して、前記第１の支持要素の残っている部分、及び前記第２の支持要素の残っている部分の上に不動態化層を形成し、前記犠牲層を露出させるステップと
    をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
34. パターニングする前記ステップが、
    前記第１の電極材料層及び／又は前記第２の電極材料層を複数のセグメントに分離し、これにより、形成された前記第１の電極及び／又は前記第２の電極が、互いに離間した複数のセグメントをそれぞれ備えることを含む、請求項３０に記載の方法。
35. 酵素又は検出される化学物質を固定することができるナノ構造体を、前記チャンバの底部若しくは側壁上、又は前記チャネルの底部若しくは側壁上又は前記ガイド電極上に形成するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
36. 前記ナノ構造体が、金属、金属酸化物、無機ポリマー、有機ポリマー、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料により形成される、請求項３５に記載の方法。
37. 前記チャネルが、０．５〜１００ｎｍの幅を有する；及び／又は
    前記チャネルが、５０ｎｍ〜１００μｍの長さを有する；及び／又は
    前記チャネルが、０〜１０μｍの深さを有する、請求項３０に記載の方法。
38. 前記第１の電極が、１〜１０００ｎｍの厚さを有する；及び／又は
    前記犠牲層が、０．５〜１００ｎｍの厚さを有する；及び／又は
    前記第２の電極が、１〜１０００ｎｍの厚さを有する、請求項３０に記載の方法。
39. 前記第１の電極及び前記第２の電極が、同じ材料により形成される、請求項３０に記載の方法。
40. 前記第１の電極及び前記第２の電極が、異なる材料により形成される、請求項３０に記載の方法。
41. 前記第１の電極が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成される；及び／又は
    前記犠牲層が、ケイ素、クロム、タングステン、アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化ケイ素、若しくは窒化ケイ素からなる群から選択される材料により形成される；及び／又は
    前記第２の電極が、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成される；及び／又は
    前記ガイド電極が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成される、請求項３０に記載の方法。
42. 前記第１の支持要素が、導電性要素を含む；及び／又は
    前記第２の支持要素が、導電性要素を含む、請求項３０に記載の方法。
43. 前記導電性要素が、ケイ素、白金、金、銀、酸化インジウムスズ、若しくは炭素系材料からなる群から選択される材料により形成される、請求項４２に記載の方法。
44. 前記第１の支持要素及び／又は前記第２の支持要素の断面形状が、前記基板の表面と平行な方向において、楕円形、円形、長方形、正方形、又は歯車形の断面形状を有する、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 化学物質の分析のための方法であって、
    （１）請求項１〜２３のいずれか一項に記載のマイクロウェル電極、又は請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のマイクロウェル電極アレイを用意するステップと；
    （２）試験される化学物質を含有する反応溶液を、前記マイクロウェル電極又はマイクロウェル電極アレイに添加し、前記反応溶液を反応に供して荷電分子を生成するステップと；
    （３）前記荷電分子を、前記ガイド電極及び／若しくは流体力学的効果の作用下で前記チャネルに進入させる、又は前記ガイド電極の作用下で前記チャネル内に蓄積させるステップと；
    （４）前記第１の電極、前記第２の電極及び／又は前記ガイド電極を使用することにより、前記荷電分子の種類を特定し、それによって試験される前記化学物質の情報を得るステップと
    を含む方法。
46. 前記ステップ（４）で、前記荷電分子の種類が、酸化還元効果、電気抵抗効果、静電容量効果、電界効果、及びトンネル効果からなる群から選択される１つ又は複数の効果に基づいて、前記第１の電極、前記第２の電極及び／又は前記ガイド電極により特定される、請求項４５に記載の方法。
47. 化学物質の組成、配列、電荷、サイズ又は濃度の分析に使用される、請求項４５に記載の方法。
48. 核酸分子の分析のための方法であって、
    （１）請求項１〜２３のいずれか一項に記載のマイクロウェル電極、又は請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のマイクロウェル電極アレイを用意するステップと；
    （２）前記マイクロウェル電極若しくはマイクロウェル電極アレイの前記チャンバ若しくはチャネル内に、又は前記マイクロウェル電極若しくはマイクロウェル電極アレイの前記ガイド電極上に、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ）を固定するステップと；
    （３）前記マイクロウェル電極又はマイクロウェル電極アレイに、試験される核酸分子、プライマー、及び少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）分子若しくはヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）分子又はそれらの類似体を含有する反応溶液を添加するステップであって、前記プライマーは、試験される前記核酸分子の部分配列にハイブリダイズ又はアニールすることができ、前記少なくとも１つのｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の各々は、それぞれ標識分子で修飾されており、その後、好適な条件下で、試験される前記核酸分子を前記プライマーとハイブリダイズし、複合体を形成するステップと；
    （４）触媒としての前記ポリメラーゼの存在下で、前記標識分子で修飾されたｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の１つを前記プライマーに組み込み、試験される前記核酸分子と相補的な伸長生成物を形成し、前記プライマーに組み込まれた前記ｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体が保持する前記標識分子を除去し、遊離標識分子を生成するステップであって、前記遊離標識分子は帯電している、ステップと；
    （５）前記遊離標識分子を、前記ガイド電極及び／若しくは流体力学的効果の作用下で前記チャネルに進入させる、又は前記ガイド電極の作用下で前記チャネル内に蓄積させるステップであって、前記遊離標識分子は、その電気極性又は放出順序により異なるマイクロウェル電極チャネル内に進入又は蓄積するように制御されることが好ましい、ステップと；
    （６）前記第１の電極及び前記第２の電極を使用することにより、前記遊離標識分子の種類を特定し、前記標識分子と前記ｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体との間の対応に従って、前記プライマーに組み込まれたｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体の種類をさらに特定し、相補的塩基対合の原理に従って、試験される前記核酸分子の対応する位置での塩基をさらに決定するステップと；
    （７）前記複合体の伸長が終了するまで、前記ステップ（４）、（５）及び（６）を繰り返すステップと
    を含む方法。
49. 前記遊離標識分子が、循環的酸化還元反応において反応性である酸化還元活性物質であってもよく、又は、循環的酸化還元反応において反応性である酸化還元活性物質に変換されてもよく；前記酸化還元活性物質は、前記第１の電極と前記第２の電極との間の循環的酸化還元反応に供されて、検出可能な電流を生じ得ることが好ましい、請求項４８に記載の方法。
50. 前記反応溶液が、ホスファターゼをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
51. 前記ステップ（４）で、前記遊離標識分子が、ホスファターゼの存在下で脱リン酸化される、請求項４８に記載の方法。
52. 前記遊離標識分子が、正又は負に帯電している、請求項４８に記載の方法。
53. 前記標識分子が、前記ｄＮＴＰ若しくはＮＴＰ分子又は類似体のリン酸基、塩基又はサッカリド基に連結している、請求項４８に記載の方法。
54. 前記遊離標識分子が保持する電荷が、前記ガイド電極の作用下での前記遊離標識分子の移動速度を調節するように、標識分子を選択することにより調節される、請求項４８に記載の方法。
55. 前記ステップ（１）で、前記ポリメラーゼは、前記チャンバ若しくはチャネルの底部における絶縁層上に固定され、又は前記ガイド電極上に固定され；前記ポリメラーゼは、前記チャンバの底部における前記チャネルの端部に近い場所に固定されることが好ましい、請求項４８に記載の方法。
56. 前記絶縁層が、二酸化ケイ素、オキシ窒化ケイ素、窒化ケイ素又は他の絶縁材料からなる群から選択される材料により形成される、請求項５５に記載の方法。
57. 前記絶縁層と前記ポリメラーゼとの間に、官能化可能な領域及び／又は分子結合領域がさらに設けられ；
    前記官能化可能な領域は、二酸化ケイ素、酸化ハフニウム、酸化アルミニウム、酸化タンタル、及び／又は酸化ジルコニウムを含むことが好ましく；前記官能化可能な材料は、シリカン（例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、イソチオシアネート、アルケン及びアルキンからなる群から選択される連結分子で官能化されることがより好ましく；
    前記分子結合領域は、プローブ分子を含むことが好ましく；前記プローブ分子は、例えば、ビオチン、アビジン、抗体、抗原、受容体、リガンド、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質及びそのリガンドからなる群から選択されることが好ましい、請求項５５に記載の方法。
58. 前記ステップ（６）で、前記遊離標識分子の種類は、酸化還元効果、電気抵抗効果、静電容量効果、電界効果、及びトンネル効果のうちの１つ又は複数により特定される、請求項４８に記載の方法。
59. 前記核酸分子の配列、組成、電荷、サイズ又は濃度の分析に使用される、請求項４８に記載の方法。