JP2018518188A - 細胞療法のための細胞集団を調整するための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

多能性細胞または細胞培地の調整のためのバイオリアクターシステムを提供する。更なる態様において、調整した多能性細胞及びそのような細胞を作成するための方法を提供する。本発明の実施形態は、幹細胞含有液の状態に影響する、少なくとも１つの機械的因子の制御を可能にする装置を含む。更に具体的には、本発明の実施形態は、幹細胞含有液内の幹細胞に適用される剪断応力の速度の制御を可能にする装置を含む。本発明の実施形態は、流動断面積に対する非常に高い層流境界層周長の比を提供して、それによって、チャンバーへ接着する幹細胞の機械的力（剪断）の調整効果を最大にするように成形された、１つ以上の流体チャンバーを通って培地液を流すために使用することができる。【選択図】【図１６】

Description

本出願は、２０１５年６月２３日出願の米国特許仮出願第６２／１８３，２７３号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の実施形態は、治療薬として使用するため、細胞集団を改善された特性へ調整する方法と装置に関する。更に具体的には、本発明の実施形態は、幹細胞が配置される流体チャンバーの境界に沿って配置された幹細胞に、制御された剪断応力を加えることによって幹細胞を調整するための装置と方法に関する。

系列特異的に分化した細胞集団は、疾患または障害のある患者のために細胞補充療法に使用することが企図される。特異的細胞型（幹細胞）に分化する及び／または特定因子を分泌する能力を保持する細胞集団は、様々な疾患または障害のある患者のための細胞療法に使用することが企図されてきた。

幹細胞の定方向分化に関する研究及び技術開発は、多くの疾患及び障害の治療を提供すると推察されてきた。しかし、その治療効果が予測可能であるように確実に調整された、十分なドナー細胞集団を得る能力の必要性が依然として存在している。本方法と装置はこれらの課題への解決法を提供して、したがって細胞治療薬としてまたは可溶性因子の発生源としての細胞の使用を促進する。

バイオリアクターは、生体物質（例えば幹細胞含有液）の成分が物質に影響する因子の操作によって調整され得る装置である。幹細胞含有液の状態は、ｐＨ、老廃物含量、栄養素含量、ならびに溶存ガス（例えば酸素）の種類及び濃度を含む、複数の因子に影響される。これらの要因は一般的に、幹細胞含有液の幹細胞の状態に影響する化学的因子と称されることができる。

バイオリアクターは、非化学的因子を制御することによって、幹細胞含有液の状態の操作を可能にすることができる。従来の細胞療法のための細胞集団を調整する従来の装置及び方法は、調整される細胞への機械的剪断力の精密な調整ができない。したがって、大規模な細胞生成が可能なバイオリアクター流体チャンバー内で調整される細胞に、剪断応力を制御可能に適用するための装置及び方法が求められている。

本発明の実施形態は、幹細胞含有液の状態に影響する、少なくとも１つの機械的因子の制御を可能にする装置を含む。更に具体的には、本発明の実施形態は、幹細胞含有液内の幹細胞に適用される剪断応力の速度の制御を可能にする装置を含む。本発明の実施形態は、流動断面積に対する非常に高い層流境界層周長の比を提供して、それによって、チャンバーへ接着する幹細胞の機械的力（剪断）の調整効果を最大にするように成形された、１つ以上の流体チャンバーを通って培地液を流すために使用することができる。

対応する流動断面積に対する非常に高い境界層周長は、所与の流路に対して、流体チャンバーの周囲長さを流動断面積で除したものとして計算される。例えば円形流路は、対応する流動断面積に対して最小限達成可能な層流境界層周長を提供し、それは２πｒ÷πｒ^２＝２／ｒとして計算される。したがって、他のすべての因子（乱流または層流の水量の状況、表面粗さなど）が同じで流路を介して流れる場合、最小の周長対流動断面積比を有する流路は、流体に付与される最小剪断応力を一般的に提供することになる。

対応する流動断面積に対する最大層流境界層周長は、例えば無限に広くかつ限りなく細い流路によって提供され、その対応する流動断面積に対する達成可能な層流境界層周長は、理論的に∞に近づく。もちろん、無限に広くかつ限りなく細い流路は、流動への無限の抵抗力を課すので非実用的だが、対応する流動断面積に対する非常に高い層流境界層周長は、広いが細い流路を提供して、それを通して移動する幹細胞含有液に層流境界層周長に沿った剪断力の適用を促進することによって成し遂げられる。

本発明の装置の一実施形態において、第１端と、第２端と、それらの間の壁と、第１端の近位にある流体入口コネクタと、第１端の近位にある立孔と、立孔を流体入口コネクタとの流体連通に配置するために流体入口コネクタから立孔へ延在する供給路と、を有する第１キャップ；第１端と、第２端と、それらの間の壁と、第２端の近位にある流体出口コネクタと、第２端の近位にある立孔と、立孔を流体出口コネクタとの流体連通に配置するために立孔から流体出口コネクタへ延在するドレイン路と、を有する第２キャップ；及び第１キャップの壁と第２キャップの壁の中間に第１キャップと第２キャップのそれぞれと装置の組み立て時に封止係合する、少なくとも１つの中間モジュールであって、各中間モジュールは、第１端、第２端を有するフレームと、第１キャップの壁側に配置された第１側面及び第２キャップの壁側に配置された第２側面を有するその間の障壁と、を含み、第１キャップの封止面と中間モジュールの第１側面の封止面を密閉するように係合する際、第１キャップの壁と中間モジュールの障壁の間に第１流体チャンバーを形成するため、及び中間モジュールの第２側面の封止面を有する第２キャップの封止面と中間モジュールの第２キャップの封止面を密閉するように係合する際、第２のキャップの壁と中間モジュールの障壁の間に第２流体チャンバーを形成するため、障壁がフレーム内かつ第１端と第２端の間に配置されている、中間モジュール；装置の組み立ての際、第１キャップの立孔を密閉するように係合するための中間モジュールの第１端の近位にあるフレームのモジュール供給孔；モジュール供給孔から分配チャネル内に受けた流量を分配するための、中間モジュールの第１端の近位にあるフレーム内にあって、モジュール供給孔と流体連通する分配チャネル；第１及び第２流体チャンバー内に受けた流量を導入するための、中間モジュールの第１端の近位に配置され及び分配チャネルとの流体連通の複数の流体チャンバー供給口；中間モジュールの第２端の近位に配置され、ならびに第１及び第２流体チャンバーと流体連通する複数の流体チャンバードレイン口；中間モジュールの第２端に沿って配置され、ならびに流体チャンバードレイン口を通って第１及び第２流体チャンバーと流体連通する収集チャネル；装置の組み立ての際、第２キャップの立孔を密閉するように係合するための、中間モジュールの第２端の近位に配置され、ならびに収集チャネルと流体連通するモジュールドレイン孔；を含む、装置を提供し、第１キャップと第２キャップの中間に配置された１つ以上の中間モジュールを備えた装置の組み立ての際、第１キャップ上の封止面を備えた１つ以上の中間モジュール上の第１側面封止面を密閉するように係合するために、及び第２キャップ上の封止面を備えた１つ以上の中間モジュール上の第２側面封止面を密閉するように係合するために、第１キャップの入口流体コネクタを第２キャップ上の出口流体コネクタとの封止係合に配置して、複数の流体チャンバー供給口のうちの少なくともいくつかと複数の流体チャンバードレイン口のうちの少なくともいくつかの中間、ならびに少なくとも１つの中間モジュール第１側面と第１キャップの中間に配置した、第１流体チャンバー、ならびに複数の流体チャンバー供給口のうちの少なくともいくつかと複数の流体チャンバードレイン口のうちの少なくともいくつかの中間ならびに少なくとも１つの中間のモジュール第２側面と第２キャップの中間に配置した第２流体チャンバーを含む、分岐流路を提供し；装置の入口流体コネクタと出口流体コネクタにわたって液圧差を提供する際に、分配チャネルに沿って配置される複数の流体チャンバー供給口、及び中間モジュールの収集チャネルに沿って配置される複数の流体チャンバードレイン口は、流体チャンバー内に均一の局所的流体速度を提供し；第１流体チャンバーの流動断面積に対する第１流体チャンバー周長の比はより大きくなる。

本発明のある特定の実施形態は、調整組成物を生成する方法に関する。本明細書中で使用する場合、調整組成物とは、機械的力の調整効果を受けた組成物を意味する。例えば機械的力は、調整組成物を生成するのに十分な力を有する制御された剪断応力の適用であり得る。いくつかの態様において、調整組成物は、調整した多能性細胞（例えば、ＭＳＣ）集団を含む。したがってある特定の態様は、調整した多能性細胞集団の単離に関する。更なる態様において、調整組成物は、制御された剪断応力を受けた多能性細胞から分泌因子を含む培地（例えば無細胞培地）である。

実施形態の態様は、細胞接着を許容する基質上の幹細胞の培養を含む。場合によっては、基質は、単層での幹細胞の増殖を支持する表面である。例えばいくつかの態様で、表面は、プラスチックまたはガラス面（例えば細胞外基質材料（例えばコラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン及び／またはビトロネクチン）でコーティングした表面）である。更なる態様において、基質は、増加もしくは減少した表面エネルギーを有する表面（または表面コーティング）を組み込むために改質されることができる。表面または表面コーティングとして使用され得る低エネルギー材料の例としては、炭化水素ポリマー（例えばポリエチレンまたはポリプロピレン）及び窒化物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば表面または表面コーティングは、ポリヘキサフルオロプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（メチルメタクリレート）−ＰＭＭＡ、ポリスチレン、ポリアミド、ナイロン−６，６、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（エチレンテレフタラート）、エポキシ（例えば、ゴム強化またはアミン硬化）、フェノール−レゾルシノール樹脂、ユリア−ホルムアルデヒド樹脂、スチレン−ブタジエンゴム、アクリロニトリル−ブタジエンゴム及び／または炭素繊維強化プラスチックを含むことができる。表面または表面コーティングとして使用され得る高エネルギー材料の例としては、金属及び酸化物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば表面または表面コーティングは、酸化アルミニウム、酸化ベリリウム、銅、黒鉛、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）、鉛、水銀、雲母、ニッケル、プラチナ、二酸化ケイ素−シリカ及び／または銀を含むことができる。

実施形態の更なる態様は、調整組成物を生成するのに十分な力を有する制御された剪断応力の適用に関する。ある特定の態様において、剪断応力は、層流剪断応力の形で加えられる。例えば剪断応力の力は、１平方センチメートル当たり少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ダインである。ある特定の場合には、剪断応力の力は、１平方センチメートル当たり少なくとも５、１０または１５ダインであり、例えば１平方センチメートル当たり約５〜２０、５〜１５、１０〜２０または１０〜１５ダインの間である。いくつかの態様において、制御された剪断応力は、約１分と２日の間の期間、適用される。例えば制御された剪断応力は、５分〜２４時間、１０分〜２４時間、０．５時間から２４時間または１時間〜８時間の間の期間、適用される。更なる態様において、実施形態の細胞は高圧力に曝露される。

他の更なる態様において、実施形態の培養からの細胞または培地は、調整のレベルを決定するために定期的に試験される。例えば細胞または培地を含む試料は、約１０分、１５分、３０分毎または毎時間、培養からとられることができる。そのような試料は、例えば抗炎症因子（例えば転写因子またはサイトカイン）の発現レベルを測定するために試験することができる。特定の態様において、細胞または培地は、例えば流体が装置を通るように配向するために構成したポンプの入口近くを含む、低い流体圧の位置に配置される試料口から取ることができる。

ある特定の態様において、幹細胞の出発集団が得られる。例えば出発幹細胞集団は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むことができる。いくつかの態様において、ＭＳＣは組織から分離される。例えばいくつかの態様で、組織は、骨髄、臍帯血、末梢血、卵管、胎児の肝臓、肺、歯髄、胎盤、脂肪組織または羊水を含む。更なる態様において、細胞はヒト細胞である。例えば細胞は、自家幹細胞であり得る。いくつかの態様において、幹細胞はトランスジェニック細胞である。

実施形態の更なる態様において、調整組成物を生成する方法は、制御された剪断応力の適用のため幹細胞上に流体を通過させることを含む。例えば幹細胞上を通過する流体は、細胞増殖培地であり得る。いくつかの態様において、増殖培地は、少なくとも第１の外因性サイトカイン、増殖因子、ＴＬＲアゴニストまたは炎症の刺激物質を含む。例えば増殖培地は、ＩＬ１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、リポ多糖体（ＬＰＳ）、ホルボールミリステート酢酸塩（ＰＭＡ）及び／またはプロスタグランジンを含むことができる。ある特定の具体的な態様において、プロスタグランジンは、１６，１６’−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である。

ある特定の態様において、実施形態の調整した幹細胞は、幹細胞の出発集団と比べて少なくとも２、３、４、５または６倍高い抗炎症性遺伝子の発現を有している。例えば抗炎症性遺伝子は、ＴＳＧ−６、ＰＧＥ−２、ＣＯＸ−２、ＩＬ１Ｒａ、ＨＭＯＸ−１、ＬＩＦ及び／またはＫＬＦ２であり得る。

更なる実施形態では、調整組成物は調整した培地組成物を含む。したがってある特定の態様は、剪断応力の適用後の調整培地の単離に関する。場合によっては、調整培地は細胞を実質的に含まない。

実施形態の更なる態様は、バイオリアクター（例えば本明細書で詳述されるバイオリアクター）の剪断応力の適用に関する。ある特定の態様において、バイオリアクターシステムは、入口流体供給プレート、底部プレート、入口流体供給プレートと底部プレートの間に配置した複数の中間プレートを含む。例えば中間プレートは、第１端、第２端、第１側面及び第２側面、第１端の近位にある分配チャネル、ならびに第２端の近位にある収集チャネルを含む。更なる態様において、分配チャネルは、中間プレートの第１側面と第２側面の間に延在する。ある特定の態様において、収集チャネルは、中間プレートの第１側面と第２側面の間に延在する。場合によっては、バイオリアクターシステムは、収容容器、第１導管及び第２導管を更に含む。ある特定の態様において、入口流体供給プレートは、第１流体入口、第１流体出口、第２流体入口及び第２流体出口を含む。例えば収容容器は、第１導管を介して第１流体入口に連結し、第２導管を介して第２流体出口に連結する。

実施形態の更なる態様において、バイオリアクターシステムは、入口流体供給プレートの第１流体出口及び第２流体入口に連結したポンプを含む。ある特定の態様において、ポンプは、第１流体入口と第１流体出口を通って収容容器から流体を出し、及び第２流体入口に流体を配向し、複数の中間プレートをわたって、第２入口を出て収容容器に戻るように構成される。いくつかの態様において、第２流体入口を通る流体速度は、ポンプの転動体の回転速度によって制御される。ある特定の態様において、バイオリアクターシステムは、高い層流境界層周長対流動断面積の比を提供する。いくつかの態様において、バイオリアクターシステムは、大規模な細胞生成が可能である。例えば調整組成物を生成する方法は自動化される。

実施形態のある特定の態様は、調整した幹細胞の治療に有効な量の組成物を提供する。いくつかの態様は、調整した幹細胞の治療に有効な量を投与することを含む、そのような治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。例えば細胞は、実施形態による方法によって得た調整組成物（例えば、細胞組成物または調整培地）を含むことができる。本明細書で示されるように、そのような調整組成物は、いくつかの態様において、対象の幹細胞の強化された移植を提供できる。例えばいくつかの態様で、対象は、慢性または急性炎症、移植片対宿主病、神経損傷（例えば、脳卒中などの虚血傷害または外傷性脳損傷）、筋骨格外傷または自己免疫不全を有する。いくつかの態様において、調整した幹細胞は、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与される。

他の更なる実施形態で、患者に幹細胞（例えば間葉系幹細胞）の有効量を投与することを含む、患者の骨髄のＣＤ１０５^＋細胞を増加させる方法を提供する。例えば細胞は、実施形態による方法によって得た調整組成物（例えば、細胞組成物または調整培地）を含むことができる。いくつかの態様において、患者は、虚血傷害などの神経損傷（例えば脳卒中から）または外傷性脳損傷を有する。ある特定の態様において、患者は、細胞投与前の２４、１８、１２または６時間未満に神経損傷を受けている。

ある特定の態様において、実施形態は、細胞及び／または調整組成物の投与に関する。いくつかの態様において、投与は局所（例えば疾患のあるもしくは損害を受けた組織の中、またはそれに隣接する）であり得る。更なる態様において、投与は全身である。例えば投与は、組成物の注入（例えば静脈注射）によることができる。

本発明のその他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すが、本発明の趣旨及び範囲の範囲内の様々な変更及び修正が当該詳細な説明から当業者に明らかとなるため、説明するためだけに示されていることを理解されたい。

本方法、システム及び装置の目的ならびに利点は、本システム及び方法の好ましい実施形態を例示説明する以下の詳細な説明及び添付の図面と併せて考慮すると、一層よく理解されて、より容易に明らかになるだろう。

本開示によるバイオリアクターケースの供給キャップの平面図である。 図１の供給キャップの側面図である。 立孔を通って取った図１及び図２の供給キャップの正面断面図である。 図１〜図３の供給キャップの端面図である。 本開示によるバイオリアクターケースの中間モジュールの平面図である。 図５の中間モジュールの側面図である。 図６の中間モジュールの側面図の第２端における流路の拡大図である。 図５〜図７の中間モジュールの第２端の端面図である。 本発明のバイオリアクターケースのドレインキャップの平面図である。 図１０のドレインキャップの側面図である。 立孔を通って取った図１０及び図１１のドレインキャップの正面断面図である。 図１０〜図１２のドレインキャップの端面図である。 バイオリアクターを使用して調整された流体を含有する容器（図示せず）に接続可能な、及びバイオリアクターからの流体を受ける収集容器（図示せず）に接続可能な分岐流路を備えた、本開示の組み立てたバイオリアクターケースの正面断面図である。 図１３のバイオリアクターケースの側面図である。 図１３のバイオリアクターケースの透視図である。 本開示による細胞調製システムの一実施形態の分解図である。 図１６の細胞調製システムの透視組立て図である。 複数のモジュラー細胞調製装置を含む、細胞調製システムの第１の斜視図である。 図１８の細胞調製システムの第２の斜視図である。 転写誘導が、流体剪断応力がかかったヒトＭＳＣのＣＯＸ２、ＴＳＧ６、ＨＭＯＸ１、ＩＬ１ＲＮに強固であることを示すグラフである（ｈＢＭ ＭＳＣ、ヒト骨髄ＭＳＣ（各グラフの最初の４つの棒）；ｈＡＦ ＭＳＣ、羊水ＭＳＣ（各グラフの最後から２番目の棒）；ｈＡＤ ＭＳＣ、脂肪由来ＭＳＣ（各グラフの最後の棒））。ｐ値は対応ｔ検定によって算出した（等分散性）。 増加した細胞内ＣＯＸ２タンパク質（それはＮＦ−ｋＢ拮抗剤ＢＡＹ１１−７０８５（１０μＭ）によって減らされる）を示す、代表的なウエスタンブロットを示す。 ＭＳＣ免疫修飾の機能強化を強調表示する、ＴＮＦ−αサイトカイン抑制を示す。機械的力（３時間の１５ダイン／ｃｍ２の剪断応力）で前処理したヒトＭＳＣを、リポ多糖（ＬＰＳ）、またはマクロファージ、好中球、ＮＫ、Ｂ及びＴ細胞を含むフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）活性化脾細胞を有する静的な共培養に入れた。アッセイの結果は、ＭＳＣが剪断応力で一時的に調製された場合、脾細胞によるＴＮＦ−α分泌が１０〜５０％減少することを示す。低下した値はより大きな抗炎症効力と一致する（ｈＢＭ ＭＳＣ、ヒト骨髄ＭＳＣ；ｈＡＦ ＭＳＣ、羊水ＭＳＣ（グラフで「^＊」で示す）；ｈＡＤ ＭＳＣ、脂肪由来ＭＳＣ（グラフで「＾」で示す））。ｐ値は対応ｔ検定によって算出した（等分散性）。 ＣＯＸ２（インドメタシン、１０μＭ、ＮＳ−３９８、１０μＭ）及びＮＦ−ｋＢ（ＢＡＹ１１−７０８５、１０μＭ）の阻害は剪断応力の好ましい効果を抑止し、一方異所性ｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）はＭＳＣ抑制を模倣することを示す。アスタリスクは、静的溶媒と比較してｐ＜０．００１を示す。ｎ＝６は、示されるデータに含まれる６つの異なるＭＳＣドナー株を示す。 プライミング剤が剪断誘起性抗炎症シグナル伝達を補完することを示す。暗色の棒は、剪断応力及びサイトカイン（ＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ））による経路の実質的誘導を示す、処理の組み合わせを表す。この低能力のヒト羊膜ＭＳＣ株において、ＴＳＧ６は剪断応力だけによって誘発された。ＩＤＯは、ＩＦＮ−γのみ、ｈＡＦ ＭＳＣ、ヒト羊水ＭＳＣによって誘発された。 図２５Ａ〜図２５Ｄは、ラットの外傷性脳損傷によって生じた骨髄の細胞組成物の破壊が、ＷＳＳ前処理したヒトＭＳＣの静脈内投与により抑止されることを示す。（Ａ）ＣＣＩによる外傷性脳損傷の２４時間後、骨髄の内因性ラットＭＳＣの免疫検出は、ＣＤ１０５^＋集団の減少を明らかにする（対比染色はｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄに由来する）。（Ｂ）より少量のＣＤ１０５^＋ＭＳＣが、ＣＣＩ後、骨髄中に存在する。（Ｃ）ＣＤ１０５は、損傷の７２時間後に検出される（ヘマトキシリン対比染色）。（Ｄ）ＣＣＩの２４時間後に静脈内に投与した場合、ＣＣＩの７２時間後のＣＤ１０５ＭＳＣ頻度の定量化は、ＭＳＣ治療による骨髄細胞組成物の保護を明らかにする。ＣＤ１０５^＋ＭＳＣ集団の保護効果が、治療的に使用するＭＳＣのＷＳＳ前処理により強化される（一元配置分散分析、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

多能性幹細胞（例えば間葉系幹細胞）（ＭＳＣ）を扱うとき、分化の結果を調整することは、細胞療法を開発する際の非常に重要なステップである。一貫した結果を生成することは、いくつかのパラメーターを含む、細胞の環境の精密な制御を必要とする。これらは、化学的因子（例えば栄養素、老廃物、ｐＨ及び溶存ガス）を含む。多くの従来技術のバイオリアクターは、これらの化学的パラメーターを制御して監視するように、設計かつ製造されている。

しかし機械的環境も、幹細胞の結果に重要な役割を果たす。機械的環境は、２つの主要な要素、すなわち周囲の培地の基質及び動態に依存する。基質の剛性は、表面処理またはコーティングの精選により調整することができ、それは基質への細胞接着及び分化結果の両方に影響し得る。

細胞集団が基板に接着した後、それらは、細胞が浸漬する培地によって加えられる機械的力を受ける。従来の細胞培養で、これらの力は、培地のバルク流量がないので基本的にゼロである。既存のバイオリアクターシステムは、恒常的または可変的な流量（培地）を有するが、流れのパターン（単または２方向層流対乱流）、または細胞と相互作用する剪断力の程度の設計管理を欠いている。移動液は、流体速度及び粘性と比例する剪断応力を細胞に加える。ほとんどのメカノトランスダクション研究は、剪断応力挙動が周知で、単純な方程式によって特徴づけられる、層流状況で実施されている。層流は、流路の断面にわたる不均一な速度プロファイルによって特徴づけられる。境界（例えば壁）の流体速度はゼロであると仮定されることができ、「無滑り状態」または「境界状態」として周知である。層流のニュートン流体で剪断応力（τ）を説明する単純な式は、τ＝−μ（ｄｕ／ｄｙ）であり、μは粘性であり、ｕはチャネルの特定の深さでの流体の速度である。培地の粘性及び流体速度がわかれば、加えられた剪断応力を計算できる。

複数の細胞型（例えば幹細胞）に分化する能力を保持する細胞集団は、系列特異的に分化した多数の細胞集団を発生させるために有用であることを証明した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はそのような幹細胞の一種であり、多能性かつ自己複製の両方で知られている。したがってＭＳＣは候補細胞治療薬として浮上しており、生理活性免疫調節分子の持続的供給源を場合により提供できる可能性がある。しかし、現在、ＭＳＣの使用の臨床的有効性を制限している障壁の１つは、ＭＳＣ機能の誘発が、ＭＳＣの免疫調節効果をそれにより開始する活性化免疫細胞によって生成されるサイトカイン及びシグナルの存在に大いに依存するということである。本方法に先だって、例えばこの変動性は、幹細胞組成物の予測不可能な治療効果に転換された。

いくつかの態様において、本明細書に記載のバイオリアクターシステムは、増加した数の幹細胞（例えば、ＭＳＣ）を提供し、それは更に免疫調節機能について予測どおりかつ確実にｉｎ ｖｉｔｒｏ調整されている。こうして得られた幹細胞は、免疫調節機能について確実かつ一貫して調整したＭＳＣの治療に有効な数を提供する。他の実施形態において、システムは、治療法として使用するために単離かつ精製されることができる分泌因子の供給元を提供する。

いくつかの実施形態で、そのような方法は、治療、ならびに例えば損傷（例えば神経損傷）、移植片対宿主病及び自己免疫と関連した慢性または急性炎症の抑制に使用するための調整細胞細胞（例えばＭＳＣ）を提供することができる。そのような調整組成物は、投与の際、細胞の強化した生着能を提供することが本明細書で示されており、それは治療法の効果を著しく強化できる。

ある特定の実施形態は、細胞療法に使用するための、限定的ではないがＭＳＣなどの治療的に予測どおりに調整した細胞の増加数を生成するために使用するシステムを含む。いくつかの実施形態で、記載されているシステムは、とりわけ抗炎症性及び免疫調節特性を示すＭＳＣを調整して、例えば生成したこのような調整細胞または因子が傷害の部位に注入されるとき、多くの種類の筋骨格外傷及び炎症状態を治療するために使用可能である。いくつかの実施形態では、このシステムは、限定的ではないがＭＳＣなどの細胞の直接の機械による調整に流体力学微小環境の制御を統合する、モジュラーバイオリアクターシステムを含む。

バイオリアクターケースが、本発明に従って培地液の流れ内で細胞を調整するために使用される（例えば、培地は接着細胞上を通過させて、加えた剪断力を提供する）。バイオリアクターケースの実施形態が、以下で論じる添付の図面に示される。

図１は、バイオリアクターケースの実施形態の供給キャップ１２の平面図である。供給キャップ１２は、第１端１５及び第２端１８ならびにそれらの間の壁１３を含む。供給キャップ１２は、第１端１５の近位にあり、流体入口コネクタ１１で始まって、図１の観察者に向かって供給路１６から延在する立孔１７で終わる供給路１６（点線）を更に含む。図１の供給キャップ１２の実施形態の供給路１６の短い部分１９は、立孔１７に接続するため供給路１６に対して垂直に曲がる。供給キャップ１２は、壁１３を囲む封止面１４を含む。位置５０に供給キャップ１２上の第２の立孔がないことに注意しなければならない。この不在を注意する理由は、以下の本開示の考察で明らかになる。

図２は、流体の加圧供給源に接続する流体導管（図示せず）を密閉するように係合するための、流体入口コネクタ１１内側の封止１６を明らかにする、図１の供給キャップ１２の側面図である。矢印は、供給キャップ１２の第１端１５の近位にある立孔１７の位置を示す。供給キャップ１２の壁１３は、図２及び図３で、供給キャップ１２の底面にあると示される供給キャップ１２の外面２０の反対側の供給キャップ１２の上部にあると示される。本発明の装置の実施形態のキャップ及びモジュールは、その機能を損なうことなく、別のやり方で配向され得ることが理解されるであろう。

図３は、供給キャップ１２の第１端１５の近位にある立孔１７を通ってとった、図１及び図２の供給キャップ１２の断面図である。立孔１７は供給路１６から流体を受けて、その少なくとも１つが封止面１４に対して密閉するように受ける１つ以上の中間モジュール（図３に示されない）に流体の流れを送達する。

図４は、図１〜図３の供給キャップ１２の端面図である。図４は、供給キャップ１２の第１端１５の近位にある流体入口コネクタ１１、流体入口コネクタ１１から立孔１７まで延在する供給路１６の位置を示す。供給キャップ１２の流体入口コネクタ１１、供給通過１６及び立孔１７が供給キャップ１２の第１端１５の近位に配置されており、対応する流路が供給キャップ１２の第２端１８の近位に配置されていないことに留意する必要がある。

図５は、供給キャップ１２を密閉するようにかつ作動可能に係合するように適合された、本発明のバイオリアクターケースの中間モジュール３０の平面図である。中間モジュール３０は、第１側面３１及び第２側面３２（図５に示されない）を含み、それぞれは供給キャップ１２の封止面１４と係合する封止面４４を有する。中間モジュール３０は、中間モジュール３０を通過して、中間モジュール３０の第１端４７の近位にある第１モジュール孔３４を更に含む。モジュール孔３４は、中間モジュール３０の第１側面３１上の封止面４４と供給キャップ１２の対応する封止面１４の間の密閉するような係合の際、図１〜図４の供給キャップ１２の立孔１７と合流し、かつ一致するために配置される。中間モジュール３０は、中間モジュール３０を通過して、中間モジュール３０の第２端４８の近位にあり、及び第２供給キャップ１２と一致しかつ係合するための位置の第２モジュール孔１３４を更に含む（第２供給キャップ１２は第１供給キャップ１２と同一であり得るが、図１の軸６０の周囲で１８０度を回転させてもよい）。第２供給キャップ１２が中間モジュール３０の第２側面３２上の封止面４４と係合し、及び第１供給キャップ１２が中間モジュール３０の第１側面３１の封止面４４と係合することが理解されるであろう。供給キャップ１２の第２端１８の近位の第２立孔１７の不存在によって、供給キャップ１２の封止面１４が、中間モジュール３０の第２端４８の近位にある中間モジュール３０の第２モジュール孔１３４を密封するのを可能にすることが更に理解されるであろう。供給キャップ１２はしたがって、本発明の装置の一実施形態で、供給キャップ１２が中間モジュール３０の第１側面３１を係合する第１モードにおいて、流量を受けて、流れを中間モジュール３０の第１端４７に送達するように機能するように、第２供給キャップ１１２が中間モジュール３０の第２側面３２を係合する逆の第２モードにおいて、第１供給キャップ１２の封止面１４と逆の第２供給キャップ１１２の封止面４４を係合する際に、第１供給キャップ１２の壁１３と中間モジュール３０の障壁３９の間に形成される第１流体チャンバー３８Ａ、及び第２供給キャップ１１２の封止面１４と逆の第２供給キャップ１１２の封止面１４４を係合する際に、逆の第２供給キャップ１１２の壁１３と中間モジュール３０の障壁３８の間に形成される第２流体チャンバー３８Ｂ、を少なくとも含む、複数の流体チャンバーからの流量を受けるように、構築することができる。第２供給キャップ１１２の構造を、図９〜図１２と関連して更に考察する。

図５の中間モジュール３０は、中間のモジュール３０の第１端４７の近位にあって、モジュール孔３４で始まり、分配チャネル３６で終わる拡散供給チャネル３５を更に含む。拡散供給チャネル３５は、分配チャネル３６に対して、中間モジュール３０の第１端４７の近位にある第１モジュール孔３４の先端に一般的に延びる。中間モジュール３０の分配チャネル３６は、拡散供給チャネル３５からの流量を受けて、中間モジュール３０の第１端５７に向かって拡散チャネル３５から、更に中間モジュール３０の第２端５８に向かって拡散チャネル３５から延在する。同様に図５の中間モジュール３０は、中間モジュール３０の第２端４８の近位にあって、注入器１３３で始まり、収集チャネル１３６で終わる注入ドレインチャネル１３５を更に含む。注入ドレインチャネル１３５は、収集チャネル１３６に対して、中間モジュール３０の第２端４８の近位にある第２モジュール孔１３４の近位に一般的に延在する。中間モジュール３０の収集チャネル１３６は、注入器１３３からの流量を受けて、注入ドレインチャネル１３５を通って第２モジュール孔１３４に流量を向ける。

図６は、第１流体チャンバー３８Ａ内に配置された複数の流体拡散器３３、第２流体チャンバー３８Ｂ内に配置された複数の流体拡散器３３、第１流体チャンバー３８Ａ内に配置された複数の流体注入器１３３及び第２流体チャンバー３８Ｂ内に配置された複数の流体注入器１３３、中間モジュール３０の第１端４７の近位にある複数の流体拡散器３３及び中間モジュール３０の第２端４８の近位にある複数の流体拡散器１３３の配置を明らかにする、図５の中間モジュール３０の側面図である。本明細書で使用する場合「拡散器」という用語は、流体の速度を低減して、静圧を増加させる装置を意味することが理解されるであろう。本明細書で使用する場合「注入器」という用語は、低速度、高圧流量を受けて、より高速度、より低圧流量に変換させる装置を意味することが理解されるであろう。

図７は、図６の中間モジュール３０の側面図の第２端４８の複数の接続した流路及び注入器１３３の拡大図である。添付の図面に示す本発明の装置の実施形態の流路の配置が、その機能を実質的に変更することなく、異なる方向に配置され得ることが理解されるであろう。図７は、中間モジュール３０が、それを通して第２モジュール孔３４を有することを明らかにする。第２モジュール孔１３４は、注入ドレインチャネル１３５を通って収集チャネル１３６に流体的に接続される。収集チャネル１３６は、図７の観察者に見えるようにページ内及びページ外に延在して、対応する複数の出入口チャネル１３７を通って複数の拡散器１３３と流体的に連結する。流体は第１流体チャンバー３８Ａ及び第２流体チャンバー３８Ｂに入り、それらは、他から障壁３９によって注入器１３３、出入口チャネル１３７、収集チャネル１３６、注入器ドレインチャネル１３５、第２モジュール孔１３４へ分離される。複数の出入口チャネル１３７の一部４０が、第１及び第２チャンバー３８Ａ及び３８Ｂ内に延在するのを、図７が示すことに留意されたい。

図８は、第１流体チャンバー３８Ａ及び第２流体チャンバー３８Ｂからの流量を受ける、注入器１３３の位置を明らかにする、図５〜図７の中間モジュールの断面端面図である。図８は、第１流体チャンバー３８Ａ及び第２流体チャンバー３８Ｂ内に流量を導入する、拡散器３３の位置を明らかにする、中間モジュール３０の断面端面図でもディフューザーあると理解されるであろう。図８は、注入器１３３（中間モジュール３０の第２端４８で）、及び拡散器３３（中間モジュール３０の第１端４７で）の間隔を示す。

図９は、本発明のバイオリアクターケースの実施形態のドレインキャップ１１２の平面図である。ドレインキャップ１１２は、第１端１１５及び第２端１１８、ならびにそれらの間の壁１１３を含む。ドレインキャップ１１２は、第１端１１５の近位にあって、立孔１１７で始まり、流体出口コネクタ１１１で終わるドレイン路１１６（点線）を更に含む。立孔１１７は、ドレイン路１１６から図９の観察者に向かって延在する。図９のドレインキャップ１１２の実施形態のドレイン路１１６の短い部分１１９は、立孔１１７に接続するためドレイン路１１６に対して垂直に曲がる。ドレインキャップ１１２は、壁１１３を取り囲む封止面１１４を含む。

図１０は、収集器に接続する流体導管（図示せず）を密閉するように係合してバイオリアクター１０からの調整された流体を受けるための、流体出口コネクタ１１１内側の封止１１６を明らかにする、図９のドレインキャップ１１２の側面図である。矢印は、立孔１１７の位置を示す。ドレインキャップ１１２の壁１１３は、ドレインキャップ１１２の底面にあると示されるドレインキャップ１１２の外面１２０の反対側のドレインキャップ１１２の上部にあると示される。本発明の装置の実施形態のキャップ及びモジュールは、その機能を損なうことなく、別のやり方で配向され得ることが理解されるであろう。

図１１は、立孔１１７を通って取った図９及び図１０のドレインキャップ１１２の側面断面図である。立孔１１７は、中間モジュール３０（図５〜図８を参照）の第２モジュール孔１３４を通して第１流体チャンバー３８Ａ及び第２流体チャンバー３８Ｂからの流体を受けて、中間モジュール３０の第１側面３１の封止面４４に対して密閉するように受けた封止面１１４を有するドレインキャップ１１２に流れを送達する。

図１２は、図９〜１１のドレインキャップ１１２の端面断面図である。図１２は、ドレインキャップ１１２の第１端１１５の近位にある流体出口コネクタ１１１、及び流体出口コネクタ１１１から立孔１１７まで延在するドレイン路１１６の位置を示す。ドレインキャップ１１２の流体出口コネクタ１１１、ドレイン路１１６及び立孔１１７が、ドレインキャップ１１２の第１端１１５の近位に配置されており、対応する流路が第２端１１８の近位に配置されていないことに留意する必要がある。

図１３は、供給キャップ１２及びドレインキャップ１１２の流体入口コネクタ１１ならびに流体出口コネクタ１１１を備える、本発明の組み立てたバイオリアクターケース１０の斜視図であって、供給キャップ１２の立孔１７、ドレインキャップ１１２立孔１１７、容器（図示せず）バイオリアクター１０の流体チャンバー３８Ａ及び３８Ｂ内に配置した幹細胞を調整する際に使用する流体を含有する容器（図示せず）に接続可能な第１のモジュール孔、ならびにバイオリアクターからの調整液を受ける容器に接続可能な流体出口コネクタ１１１（図示せず）の位置を一層明らかにするために、図１３からそれぞれ省略されている。

図１３に図示される組み立てたバイオリアクターケース１０が、供給キャップ１２、ドレインキャップ１１２及びそれらの間の中間モジュール３０を有することが理解されるであろう。バイオリアクターケース１０による流体の速度及び方向が、圧力差（流体入口コネクタ１１の圧力と流体出口コネクタ１１１の圧力の違い）、バイオリアクター１０による流量への抵抗、流体の粘性及び他の要因に依存することが更に理解されるであろう。供給キャップ１２、中間モジュール３０及びドレインキャップ１１２は、クランプ、バンド、つなぎ材などの使用を含む種々の方法で図１３のバイオリアクターケース１０の組み立てられた形状に固定されることができる。

代わりに供給キャップ１２、中間モジュール３０及びドレインキャップ１１２は、互いの吸引力に配向する埋め込まれたまたは接続した磁気要素を有する供給キャップ１２、ドレインキャップ１１２及び中間モジュール３０を提供することによって、図１３のバイオリアクターケース１０の組み立てられた形状に固定されることができる。図１４及び図１５は、供給キャップ１２の周辺に沿って複数の位置に埋め込まれた複数の希土類磁石４９を有するバイオリアクターケース１０の実施形態を示し、対応する複数の希土類磁石はドレインキャップ１１２の周辺に沿って位置を合わせて埋め込まれることができる。

ここで図１６及び図１７を参照すると、バイオリアクターケース２００の別の実施形態は、透視図及び分解図のそれぞれで示される。明瞭にするために、すべての要素が各図の参照番号で標識されているとは限らない。バイオリアクターケース２００は、入口流体供給プレート２１２、複数の中間モジュールプレート２３２及び底部モジュールプレート２３４を含む。各中間モジュールプレート２３２は、第１端２３３、第２端２３５、第１側面２７３、及び第２側面２７５を含む。更に中間モジュールプレート２３２は、入口流体供給プレート２１２と底部モジュールプレート２３４の間に垂直に積み重なる。

図１８及び図１９に示すように、バイオリアクターケース２００は、モジュラー細胞調製装置３００の要素として組み立てられることができる。図１８及び図１９に示す実施形態では、複数のモジュラー細胞調製装置３００は、細胞調製システム４００の要素として組み立てられる。細胞調製システム４００は、複数のモジュラー細胞調製装置３００を支持するように構成される底部４５０を含む。示される実施形態では、各細胞調製システムは、バイオリアクターケース２００、収容容器２２０、第１ハウジング２７１、第２ハウジング２７２及びポンプ２５０を含む。収容容器２２０は、供給導管２１５及び戻し導管２２５を介してバイオリアクターケース２００と流体連通する。

ここで特に現在図１６及び図１７を参照すると、バイオリアクターケース２００は、第１流体入口２１１及び第１流体出口２２１を有する中央チャネル２１７を備えた入口流体供給プレート２１２を含む。入口流体供給プレート２１２は、第２流体入口２３１及び第２流体出口２４１も含む。図１８及び図１９に示すように、第１流体入口２１１及び第２流体出口２４１は収容容器２２０に連結されることができ、その一方で第１流体出口２２１及び第２流体入口２３１はポンプ２５０に連結され得る。ある特定の実施形態で、ポンプ２５０はローラー（例えば蠕動）ポンプとして構成され得る。ポンプ２５０は、転動体２５２と圧縮性導管２５４を含む。動作中、転動体２５２は電動モータ２６０によって回転する。収容容器２２０からの流体は、導管２１５を通って第１流体入口２１１へ、中央チャネル２１７及び第１流体出口２２１を通って圧縮性導管２５４へ流される。それから流体は、第２流体入口２３１に、及び中間モジュールプレート２３２と流体連通する分配口２３８に向かう。

中間モジュールプレート２３２は、分配口２３８と流体連通する入口２３７をそれぞれ含む。各中間モジュールプレート２３２は、入口２３７と流体連通する分配チャネル２５３を更に含む。各分配チャネル２５３及び入口２３７は、中間モジュールプレート２３２の第１端２３３の近位にある。各分配チャネル２５３は、培養プレート２３９にわたって延在して、流体を培養プレート２３９に分配する。培養プレート２３９全体に流れた後、流体は、各中間モジュールプレート２３２の戻り口２６１と流体連通する収集チャネル２６３によって収集される。収集チャネル２６３及び戻り口２６１は、中間モジュールプレート２３２の第２端２３５の近位にある。したがって流体は、収集チャネル２６３に入るために、培養プレート２３９全体に流れなければならない。戻り口２６１は更に第２流体出口２４１と流体連通しており、それは戻り導管２２５を介して収容容器２２０と流体連通する。

分配チャネル２５３から収集チャネル２６３への流体培養プレート２３９の流れは、培養プレート２３９上の細胞に剪断応力をかける。収容容器２２０から、及びポンプ２５０を介したバイオリアクターケース２００（複数の中間モジュールプレート２３２及び培養プレート２３９を含む）を通った流体を再循環する能力によって、剪断応力が長い（理論的に無制限の）期間、加えられることができる。

例示的実施形態において、培養プレート２３９の細胞に加えられる剪断応力の量を均一レベルで制御して、培養プレート２３９上の異なる位置で適用される剪断応力の差を最小化することが望ましい。細胞に均一で適用した剪断応力を維持する際の一因子は、細胞及び培養プレート２３９に対する流体培地の速度である。流体速度の偏差を低減することにより、より均一の適用された剪断応力を維持するのを助けることができる。図１６に示すように、分配チャネル２５３及び収集チャネル２６３は、中間モジュールプレート２３２の表面の幅Ｗ全体（例えば、中間モジュールプレート２３２の第１側面２７３と第２側面２７５の間の寸法）に実質的に延在する。ある特定の実施形態で、分配チャネル２５３及び収集チャネル２６３の長さＬ（例えば、中間モジュールプレート２３２の寸法Ｗと平行して測定した、チャネルの各先端の間の距離）は、中間モジュールプレート２３２の大部分の幅Ｗにわたって延在する。特定の実施形態において、長さＬは、幅Ｗの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。この構成は、例えば大部分の培養プレート２３９にわたって延在しない入口及び出口と比較して、培養プレート２３９にわたる流体培地のより均一な速度を提供できる。培養プレート２３９に接着する細胞は、それによって、より均一の剪断応力を受ける。

細胞に加えた剪断応力のレベルは、種々の動作パラメーターを調整することによって制御され得る。例えばポンプ２５０を介して流体に加えられる圧力は、転動体２５２が圧縮可能な導管２５４を圧縮する量を調製することによって変えることができる。培養プレート２３９にわたって流れる流体の量及び速度は、電動モータ２６０の速度を変えること、次いでそれが転動体２５２の回転速度を変えることにより調整することもできる。追加の調整は、培養皿２３９の表面仕上げ（例えば粗さ）、長さ及び幅ならびに中間モジュールプレート２３２の間の距離を含むがこれらに限定されない、要素の具体的な寸法及び形状の選択により達成可能である。

更に、垂直積層物の培養プレート２３９を有する複数の中間モジュールプレート２３２の使用によって、増加した数の細胞が剪断応力を受けるのを可能にする。更に、細胞調製システム４００で平行して作動する複数のモジュラー細胞調製装置３００の使用は、更なる処理または解析に備えて剪断応力を受ける細胞数を更に増加させることができる。

ある特定の実施形態で、モジュラー細胞調製装置３００（個々に、または細胞調製システム４００の要素として作動する）は、流体力学微小環境を制御して、調整された方法で、例えば限定されないがＭＳＣなどの細胞のメカノトランスダクション調整を誘導するために機能することができる。例として、本明細書において開示される試験は、記載した本方法と装置が、このような細胞を調整して、限定されないが免疫調節因子の誘発及び放出を含む特定の活性を発現させる必要に応じて、それらに均一かつ制御可能な剪断応力をかけることによって、例えばＭＳＣを含む細胞集団を調整することを実証する。

剪断応力を適用する能力の規模においてはるかに限定的でかつより少ない調製である装置を使用する、順応性に劣るシステムを使用するにもかかわらず、ヒト細胞培養（例えばＭＳＣ）は本装置によって提供されるものと類似の種類の剪断応力を受ける方法を、下記の実施例で提供する試験は実証する。しかし、限定されないが免疫調節因子の誘発及び放出などの特定の活性を発現するために細胞を調整するために、剪断応力を使用することができることを、これらの試験は示す。

機能的ＭＳＣが抗炎症及び免疫調節因子を発現するように直接的に調整され得ることを、本明細書に示す結果は実証する。細胞療法に関して、本技術は、損傷または疾患と関連する炎症の影響を受ける、またはそのリスクがある患者に緩和を提供することが見込まれる。現在のシステムにより提供される種類の剪断応力を使用したＭＳＣの調整が、既存の炎症環境の炎症細胞を阻害するその能力を実質的に増加させて、炎症の予防及び消散に役立つことができることを、これは示している。

更に本明細書に記載のシステムを用いて、調整は、例えば抗炎症分子の生成を含む、ＭＳＣ細胞の免疫調整活性を誘発する利用可能な代替技術を使用する場合よりも、より迅速、均一かつ確実に完了することができる。細胞を調整について述べられるシステムは、対象自身の（自己由来の）細胞が治療薬として使用されて、細胞の増殖及び調整のための方法が必要とされるとき、特に有利であり得る。

調整がない状態で、未処理のＭＳＣは、多機能抗炎症性タンパク質である、ＴＮＦ−α促進タンパク質６（ＴＳＧ−６）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びインターロイキン（ＩＬ）−１受容体拮抗剤（ＩＬ１ＲＮ）などの免疫抑制の重要なメディエータをほとんど何も発現しない。下記の実施例で詳述されるように、免疫調節シグナル伝達の活性化が種々の範囲で検出可能となるように、３つのヒト組織源（骨髄、脂肪及び羊水）に由来するＭＳＣはすべて、剪断応力を用いた調整の本システムに反応することがわかった。具体的には、本システムにより提供される種類の層流剪断応力を使用した、調整したヒト骨髄に由来するＭＳＣの評価は、ＴＳＧ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ１Ｒａ、ＨＭＯＸ−１、ＬＩＦ及びＫＬＦ２をコードするＭＳＣ遺伝子の転写で６倍〜１２０倍の増加で遺伝子発現の重大な上方調節を促進した。

例示的実施形態は、調整細胞の集団を提供する方法が含まれており、この方法は、細胞集団を得ること及び細胞に制御された剪断応力を加えることを含む。ある特定の実施形態は、調整細胞の集団を提供する方法が含まれており、この方法は、細胞集団を得ること、前記細胞を細胞培地で培養すること、及び、細胞を調整するのに十分な力の制御された剪断応力を細胞に加えることを含む。いくつかの実施形態で、細胞は哺乳動物から最初は得られる。いくつかの実施形態で、細胞はコンパニオンアニマルから最初は得られる。好ましい実施形態で、細胞はヒトから最初は得られる。いくつかの実施形態で、細胞は骨髄から最初は得られる。いくつかの実施形態で、同時に他の実施形態において、細胞は羊水から最初は得られる。一方でいくつかの実施形態において、細胞は脂肪組織から最初は得られる。いくつかの実施形態で、制御された剪断応力を受ける細胞はＭＳＣである。

追加の実施形態に、調整細胞の治療に有効な数を得る方法がある。いくつかの実施形態に、本明細書に記載の装置及び方法を使用して調整した細胞の治療的に有効な数を得る方法がある。いくつかの実施形態に、細胞集団を得ること、所望のとおり機能するようにこのような細胞を調整するために十分な力の制御された剪断応力を加えることを含む方法を使用して、調整した細胞の治療に有効な数を得る方法がある。いくつかの他の実施形態に、細胞集団を得ること、所望のとおり機能するようにこのような細胞を調整するために十分な力の制御された剪断応力を加えることを含む方法を使用して、調整した細胞の治療に有効な数を得る方法がある。いくつかの実施形態に、細胞集団を得ること、細胞が第１培養面に接着するように細胞培地の第１培養面で細胞を培養すること、及び所望のとおり機能するようにこのような細胞を調整するために十分な力の制御された剪断応力を加えること、を含む方法を使用して調整した細胞の治療に有効な数を得る方法がある。いくつかの実施形態に、細胞集団を得ること、細胞が障壁に接着するように細胞培地の第１培養面で細胞を培養すること、及び所望のとおり機能するようにこのような細胞を調整するために十分な力の制御された剪断応力を加えること、を含む方法を使用して調整した細胞の治療に有効な数を得る方法がある。

類似の実施形態に、細胞集団を得ること、細胞が障壁に接着するように細胞培地の培養系で細胞を培養すること、前記細胞上に細胞培地を通過させて前記細胞を調整するために十分な力の制御された層流剪断応力を加えること、を含む、調整細胞の集団を提供するための方法がある。いくつかの実施形態で、調整細胞は抗炎症活性を発現する。いくつかの実施形態において、抗炎症活性は、ＴＳＧ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ１ＲＮ、ＨＭＯＸ−１、ＬＩＦまたはＫＬＦ２をコードするものを含む群から選択される遺伝子の増加した発現を含む。いくつかの実施形態で、活性は、調整細胞によるＣＯＸ２タンパク質の増加した発現を含む。

追加の実施形態は、請求項１〜１０に記載の装置の制御された剪断応力を使用して調整した細胞を含む、組成物を含む。いくつかの実施形態は、細胞集団を得ること、細胞が障壁に接着するように細胞培地の培養系で前記細胞を培養すること、前記細胞を調整するために十分な力の制御された層流剪断応力を加えること、を含む方法を使用して調整した細胞を含む組成物を含む。類似の実施形態に、細胞集団を得ること、細胞が障壁に接着するように細胞培地の培養系で細胞を培養すること、前記細胞上に細胞培地を通過させて前記細胞を調整するために十分な力の層流剪断応力を加えること、を含む、調整細胞の集団を提供するための方法を使用して調製した細胞を含む組成物がある。いくつかの実施形態で、組成物は、抗炎症活性を発現する調整細胞を含む。いくつかの実施形態において、抗炎症活性は、ＴＳＧ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ１ＲＮ、ＨＭＯＸ−１、ＬＩＦまたはＫＬＦ２をコードするものを含む群から選択される遺伝子の増加した発現を含む。いくつかの実施形態で、組成物は、ＣＯＸ２タンパク質の増加したレベルを発現する調整細胞を含む。追加の実施形態において、記載した装置及び方法は、培地から単離されかつ治療薬として使用することができる、抗炎症性因子の発現及び放出を促進するために用いることができる。

追加の実施形態に、記載した方法によって調整した細胞による、このような治療を必要とする対象を治療する方法がある。代替的実施形態において、このような治療を必要とする対象を治療する方法は、記載した方法を使用して調整した細胞によって放出される因子を含むことができる。

いくつかの実施形態で、対象を治療する方法は、記載したシステムに従って生成した調整細胞の集団を得ること、及び治療を必要とする対象に細胞を投与すること、を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は抗炎症治療を必要としており、細胞の集団はヒトＭＳＣであり、その抗炎症活性は記載したシステムを使用して誘導された。いくつかの実施形態では、このような細胞の治療用量は、治療を必要とする対象内へ導入される、少なくとも１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５または１×１０^６細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、調整細胞集団の抗炎症活性は、限定されないが筋肉骨格の損傷（例えば肢体もしくは脊髄損傷、または外傷性脳損傷）などの急性疾患を治療するために用いることができる。

細胞培養調整システムが本明細書の種々の実施形態に記載されており、細胞を培養し維持する追加の方法は当業者に周知であり、本発明の実施形態で使用してもよいことが理解される。ある特定の実施形態で、培養において、種々の培地成分を、ヒト幹細胞を培養する、維持する、または分化させるのに使用することができる。下記の実施例に記載されるものに加えて、例えばコラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン及びビトロネクチンを、固体支持体を多能性細胞に提供する手段として培養面をコーティングするために使用することができる。マトリゲル（商標）も、ヒト多能性幹細胞の細胞培養及び維持を基質に提供するために使用することができる。マトリゲル（商標）はマウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞培養のための基質として、細胞生物学者によって使用されている。

細胞培養のいくつかの実施形態において、一旦培養容器が満杯になれば（例えば、コンフルエント）、コロニーは解離に好適な任意の方法によって凝集細胞または単細胞に分割されて、それから細胞は継代培養のための新しい培養容器に入れられる。細胞の継代培養または分割は、細胞が、長時間、培養条件下で生存かつ増殖するのを可能にする技術である。細胞は通常、約７０％〜１００％コンフルエントであるとき、継代培養される。

ある特定の態様において、本調整システムの出発細胞は、少なくとももしくは約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３つの細胞、またはそこから導き出せる任意の範囲を含む。出発細胞集団は、少なくとももしくは約１０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８細胞／ｍＬ、またはそこから導き出せる任意の範囲の播種密度を有することができる。

基礎培地として、下記の実施例に記載されているものに加えて、限定培地（例えば、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ハム、ＲＰＭＩ１６４０及びＦｉｓｃｈｅｒ培地）を含む様々な培地が利用できる。実施形態に従って使用し得る培地の追加の例としては、Ｌｏｎｚａ Ｔｈｅｒａｐｅａｋ（合成）培地、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅ−ＸＶ（ＳＦＭまたはＸＳＦＭ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＭＳＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＸＦ）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ（ＡＣＦ）、またはヒト血小板もしくは血小板溶解物強化培地が挙げられるが、これらに限定されない。

更なる実施形態において、培地は、栄養補助剤（例えばＢ−２７サプリメント、インスリン、トランスフェリン及びセレニウム（ＩＴＳ）サプリメント、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２サプリメント（５μｇ／ｍＬのインスリン、１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭのセレニウム、１００μＭのプトレシン）ならびにβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ））も含むことができる。これらに限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、硫酸ヘパリン、レチノイン酸を含む追加の因子を、加えてもまたは加えなくてもよいことが企図されている。

追加の因子を、調整組成物（例えば調整細胞の集団）を生成するため剪断応力と共に使用するために、培地に加えることができる。したがっていくつかの実施形態で、血液生成の少なくとも１つの化学調整物質を、生体力学的刺激の前に、その間、またはその後に使用することができる。培地に加えられることができる追加成分の例としては、アテノロール、ジゴキシン、ドキサゾシン、ドキシサイクリン、フェンジリン、ヒドララジン、１３−ヒドロキシオクタデカジエン酸（１３（ｓ）−ＨＯＤＥ）、ラナトシドＣ、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ｎｍｍａ）、メトプロロール、ネリイホリン、ニカルジピン、ニフェジピン、一酸化窒素（ＮＯ）またはＮＯシグナル経路作用物質、１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ−［４，３−ａ］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）、ペルボシド、ピンドロール、プロネタロール、シナプトソームタンパク質（ＳＮＡＰ）、ニトロプルシドナトリウム、ストロファンチジン、トドララジン、１，５−ペンチレンテトラゾール、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＰＧＥ２メチルエステル、ＰＧＥ２セリノールアミド、ｌｌ−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、プロスタグランジンＢ２、プロスタシクリン（ＰＧＩ２、エポプロステノール）、４−アミノピリジン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、ＰＧＥ２受容体作動剤、Ｂａｐｔａ−ＡＭ、ベンフォチアミン、ビククリン、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、ブラジキニン、ブタプロスト、ＣａｙｌＯ３９７、クロロトリアニセン、クロルプロパミド、ジアゾキシド、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、フルランドレノリド、フォルスコリン、ガボキサドール、ガラミン、インダニルオキシ酢酸９４（ＩＡＡ９４）、イミプラミン、キヌレン酸、Ｌ−アルギニン、リノール酸、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、メベベリン、１２メトキシドデセン酸、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、プロスタグランジンＥ２受容体ＥＰ２−選択的作動剤（ＯＮＯ−ＡＥ１−２５９）、ペルボシド、ピモジド、ピンドロール、ニトロプルシドナトリウム、バナジウム酸ナトリウム、ストロファンチジン、スルプロストン、チアベンダゾール、ベサミコール、１，２−ジデカノイル−グリセロール（１０：０）、１１，１２エポキシエイコサトリエン酸，１−ヘキサデシル−２−アラキドノイル−グリセロール、５−ヒドロキシデカノエート、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール、アナンダミド（２０：３，ｎ−６）、カルバサイクリン、カルバミル−血小板活性化因子（Ｃ−ＰＡＦ）またはＳ−ファルネシル−Ｌ−システインメチルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。

更なる態様において、培地は、１つ以上の成長因子（例えば、上皮成長因子ファミリー（例えばＥＧＦ）のメンバー、ＦＧＦ２及び／またはＦＧＦ８を含む線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、これらに限定されないがノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピンアムニオンレスを含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖及び分化（ＧＤＦ）因子ファミリー拮抗物質を含むことができ、ＴＧＦ、ＢＭＰ及びＧＤＦ拮抗物質はＴＧＦ、ＢＭＰ及びＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形で加えることもできる。加えてもまたは加えらなくてもよい他の因子は、これらに限定されないが、デルタ様及びＪａｇｇｅｄファミリータンパク質ならびにγセクレターゼ阻害剤及びＤＡＰＴなどのノッチ処理または開裂の他の阻害剤を含む、ノッチ受容体ファミリーによるシグナル伝達を活性化または不活性化できる分子を含む。追加の成長因子は、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＦ）、無羽関連（ＷＮＴ）因子ファミリー及びヘッジホッグ因子ファミリーのメンバーを含むことができる。

他の更なる態様において、培地は、１つ以上のプライミング剤（例えば炎症性サイトカイン、ＬＰＳ、ＰＨＡ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ及び／またはＣｏｎＡ）を含むことができる。実施形態に従って使用し得る追加のプライミング剤はＷａｇｎｅｒら（２００９）に詳述されているものを含み、それは参照により本明細書に組み込まれる。追加の因子を、細胞の前駆細胞増殖及び生存ならびに自己複製及び分化を促進するため、更なる分化培地に特に加えることができ、それはジメチル−プロスタグランジンＥ２、イロプロスト及びアラキドン酸代謝の他の類似の生成物を含むがこれらに限定されない。

培地は、血清を含むまたは無血清培地であってもよい。無血清培地は、未処理または未精製の血清を含まない培地を指し得、したがって精製された血液由来成分または（例えば、増殖因子など）、動物組織由来成分を含む培地を含むことができる。異種の動物由来成分の混入を防止する観点から、血清は細胞（複数可）と同じ動物に由来してもよい。

培地は、血清の代替物を含んでいても、含んでいなくてもよい。血清の代替物は、アルブミン（例えば脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物などのアルブミン代替物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールまたはこれらの等価物を適正に含有する、材料を含むことができる。血清の代替物は、例えば国際特許公開第ＷＯ９８／３０６７９号に開示される方法によって調製することができる。あるいは任意の市販の材料を、更なる便宜のために使用することができる。市販の材料は、ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含む。

培地は、脂肪酸または脂質，アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン（複数可）、成長因子、サイトカイン、酸化防止剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤及び無機塩も含むことができる。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５、または０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０ｍＭ、または任意の中間値であり得るが、濃度は、それが幹細胞を培養するのに適切である限り、特に限定されない。

細胞は、培養の必要に応じて、少なくとももしくは約０．００５、０．０１０、０．０１５、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、８００、１０００、１５００ｍＬ、またはそこから導き出せる任意の範囲の量で培養されることができる。バイオリアクターは、少なくとももしくは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはそこから導き出せる任意の範囲の容積を有することができる。

装置が組み立てられるとき、供給キャップ１２の壁と中間モジュール１３の障壁３９の間に形成した培養面及びチャンバーは、目的に応じてではなく、細胞接着により調製することができる。細胞接着培養容器は、細胞接着に好適な基質（例えば細胞外基質［ＥＣＭ］）でコーティングされて、細胞への容器面の接着を改善できる。細胞接着に使用する基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用する場合）を付着するための任意の材料であり得る。細胞接着のための非限定的な基質は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｄ−オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン及びフィブロネクチン、ならびにこれらの混合物（例えば、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＧｅｌｔｒｅｘ）及び溶解細胞膜調製物からのタンパク質混合物）を含む。特定の実施形態で、培養は、ポリ−Ｌ−リジン（またはポリ−Ｄ−リジン）及びラミニンを含む基質を含む。

他の培養条件は、適切に定めることができる。例えば培養温度は、約３０〜４０℃、例えば少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であるが、特にそれらは限定されない。ＣＯ_２濃度は、約１〜１０％、例えば約２〜７％またはそこから導き出せる任意の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとももしくは約１、５、８、１０、２０％、またはそこから導き出せる任意の範囲であり得る。

「外部から添加した」成分を本質的に含まないとは、基質の細胞以外の供給源からの特定の成分を有さない、または本質的に有さない培地を指す。外部から添加した成長因子またはポリペプチド（例えばＦＧＦもしくはＥＧＦなど）を「本質的に含まない」とは、外部から加えた成分の最小量または検出不可能な量を意味し得る。例えば、ＦＧＦまたはＥＧＦポリペプチドを本質的に含まない培地または環境は、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／ｍＬ未満、またはそこから導き出せる任意の範囲であり得る。

いくつかの実施形態において、記載したシステムを使用して調整した細胞は、種々の治療上の使用を有する。特に、細胞がヒトＭＳＣの場合、疾患または障害のために、このような調整細胞は治療的にもしくはそれに代わって使用することができ、限定されないが、記載したシステムによる調整を受けたＭＳＣを含む培養細胞から生成及び単離した因子で治療される、これらの疾患または障害は、自己免疫不全（関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））を含むが、これらに限定されない）、移植片対宿主病、クローン病、炎症性腸疾患、神経変性障害、神経機能障害、脳の疾患、中枢神経系の疾患、末梢神経系の障害、神経疾患、記憶及び学習障害、心臓不整脈、パーキンソン病、眼疾患、脊髄損傷、神経治癒及び再生を必要とする疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性または急性損傷、骨修復、外傷性脳損傷、肢体及び脊髄症状、軟骨格または筋疾患、骨関節炎、骨壊死、心血管疾患、重症下肢虚血などの心臓発作または疾患と連結する血管損傷、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ならびに新血管形成、損傷、火傷及び潰瘍から影響を受けたものを含むが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態で、本明細書にて開示するシステムを、細胞を調整して、その免疫調整特性を改善するために適用できる。ある特定の実施形態で、このような組成物は、とりわけ自己免疫疾患及び障害の治療、管理及び／または予防のための１つ以上の追加の化合物または薬（「追加の活性剤」）と組み合わせて投与されることができる。そのような治療薬は、とりわけ免疫調節性疾患もしくは障害を治療するまたは改善するために、治療に有効な量で患者に投与することができる。

このような調整細胞の毒性及び治療有効性は、例えばＬＤ_５０（母集団の５０％にとって致死量）及びＥＤ_５０（母集団の５０％で治療上有効な量）を測定するために、例えば細胞培養または実験動物を使用する標準薬学的手順で測定されることができる。毒性と治療効果との用量比は、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表される治療指数である。治療指数が大きい組成物が好ましい。毒性副作用を示す化合物をある特定の実施形態で使用してもよいが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化して、それにより副作用を減らすために、そのような化合物を罹患した組織の部位に標的として設定する送達システムを設計するために、通常注意する必要がある。

細胞培養アッセイ及び動物実験から得たデータは、ヒトで用いる様々な範囲を定めるために使用できる。そのような組成物の投与量は好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性のないＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路によってこの範囲内で変わり得る。任意の組成物について、治療有効量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は動物モデルで配合されて、細胞培養で測定されるように、ＩＣ_５０（すなわち、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得ることができる。そのような情報を、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。

とりわけ自己免疫不全の治療的処置が企図されるとき、適切な用量は、試験対象物のｋｇ重量当たりの生物活性剤の最大耐容量またはＭＴＤを決定するために、動物実験を使用して決定することもできる。一般的に試験される少なくとも１つの動物種は、哺乳動物である。当業者は、ヒトを含む他の種に有効であり及び毒性を回避するための用量を通常推定する。有効性のヒト試験を実施する前に、第Ｉ相臨床試験は安全な用量を確立するのに有用である。

さらに、生物活性剤は、例えば生物活性剤の安定性を強化する、もしくはその薬学的特性（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させて、毒性を低減するなど）を強化することができる、様々な十分に確立した組成物または構造体と併用または混合することができる。

本システムを使用して調整した細胞またはそのような細胞から放出された因子、及び他のそのような治療薬は、手術中の細胞挿入、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または髄腔内注射、吸入、皮下（ｓｕｂ−ｑ）または局所投与（トランスダーム、軟膏、クリーム、油剤、点眼薬など）を含むがそれらに限定されない当業者に周知の任意の数の方法によって投与することができる。

以下の実施例セクションは、種々の実施形態の例について詳細を提供する。以下の実施例で開示する技術は発明者らによって発見された技術及び／または組成物を表すことを、当業者は理解するであろう。しかしながら、当業者であれば、本開示に鑑み、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、開示されている具体的な実施形態に多くの変更を加えることができ、その変更によっても、同様または類似の結果が得られることがわかるはずである。これらの実施例は、本明細書に記載の方法及びシステムの例示説明であり、本発明の範囲を制限することを意図していない。そのようなものの非限定例として、以下に提示したものが挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、「治療する」「治療すること」「治療」及び「療法」という用語は、患者が疾患または障害に罹患する際に生じて、このような疾患もしくは障害の１つ以上の症状もしくは影響の重篤度を低減する処置を企図する。状況が許せば、「治療する」「治療すること」及び「治療」という用語は、疾患または障害の危険性の増加が高い個人が、疾患または障害の発症前に適切な外科的及び／または他の医療介入を受けるのが可能なことを確実にすることに対してとられる処置も指す。本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、「予防する」「予防すること」及び「予防」という用語は、患者が疾患または障害を罹患する前に生じて、疾患もしくは障害の発症を遅らせる及び／またはその重篤度を抑制するまたは低減することを企図する。

本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、「管理する」「管理すること」及び「管理」は、疾患もしくは障害の再発の重症度をそのような疾患、障害もしくは状態を既に罹患している患者において予防する、遅延させるまたは低減することを包含する。これらの用語は、疾患または障害の許容限界、発現及び／または持続期間を調整すること、または患者が疾患または障害にいかに反応するかを変えることを含む。

本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、細胞、因子または化合物の「治療に有効な量」は、疾患もしくは障害の治療もしくは管理で任意の治療効果を提供する、または疾患もしくは障害に関連する１つ以上の症状を遅延させるもしくは最小化するのに十分な量である。治療に有効な量とは、単独で、または疾患もしくは障害の治療もしくは管理で任意の治療効果を提供する１つ以上の他の治療法及び／または治療薬と組み合わせた、細胞、因子または化合物の量を意味する。「治療に有効な量」という用語は、疾患もしくは障害を緩和する、疾患もしくは障害を改善するもしくは低減する、治療全体を改善する、または別の治療薬の治療効果を強化する量を包含することができる。

本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、細胞、因子または化合物の「予防的に有効な量」は、疾患もしくは障害、もしくは疾患もしくは障害に関連する１つ以上の症状の発症を予防するもしくは遅延させる、またはその再発を予防するもしくは遅延させるのに十分な量である。細胞、因子または化合物の予防的に有効な量とは、単独で、もしくは疾患もしくは障害の防止で予防効果を提供する１つ以上の他の治療及び／または予防薬と組み合わせた、細胞、因子または化合物の量を意味する。「予防的に有効な量」という用語は、疾患もしくは障害を予防する、予防全体を改善する、もしくは別の予防薬の予防効果を強化する、細胞、因子または合成物の量を含むことができる「予防的に有効な量」は、例えば疾患または障害に先だって定めることができる。

本明細書で使用する場合「患者」または「対象」とは、本明細書に記載されるように疾患または障害を患うことができるヒト及び非ヒト哺乳動物などの哺乳動物の生命体（例えばこれらに限定されないが、げっ歯類、マウス、ラット、非ヒト霊長類、コンパニオンアニマル（例えばイヌ及びネコ）、ならびに家畜（例えばヒツジ、ウシ、ウマなど））を含む。

本明細書で使用する場合「ＭＳＣ」とは間葉系幹細胞であり、このような細胞は、間葉系間質細胞とも称されている。

本明細書で使用する場合「制御された剪断応力」とは、表面全体の培地の流量を調整することによって、細胞に加えられる剪断応力の量を設定する能力を意味する。応力は、プレートの表面領域全体に均一に加えられる。

本明細書で使用する場合「調整細胞」とは、剪断応力にさらされた結果として、更なる機能性を発現する細胞を意味する。

以下の請求項で手段またはステップ及び機能要素の対応する構造、材料、行為及び等価物は、具体的に請求されている他の請求要素と組み合わせて機能を実施するための任意の構造、材料または行為を含むことを意図している。本発明の記載は例示説明及び説明の目的で提示しているが、包括的であることまたは本発明で開示される形状に限定されることを意図しない。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、多くの改変や変更は当業者にとって明らかであろう。実施形態は、本発明の原理及び実際的な用途を最も良く説明し、様々な変更形態を伴う様々な実施形態について、他の当業者が本発明を理解することを可能にするために選択かつ説明されたものであり、企図される特定の使用に適したものである。

更なる詳述がなくても、当業者は、本明細書の記載を使用して、本方法を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に記載の実施形態は例示説明として解釈すべきであり、いかなることがあっても以下の開示を限定するものではない。好ましい実施形態が示されかつ記載されているが、その多くの変更及び改良が、本開示の方法の趣旨及び教示を逸脱しない範囲で、当業者によってなされることができる。

したがって保護の範囲は上述の説明により制限されず、請求項の内容の等価物を含む請求項によって制限されるだけである。本明細書で引用したすべての特許、特許出願及び刊行物の開示は、それが本明細書に記載の本開示と一致する限りにおいて、参照によって本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証する目的で含まれている。以下の実施例に開示されている技法は、本発明の実施において十分に機能することを本発明者が見出した技法を表しているので、本発明を実施するための好ましい態様を構築するとみなすことができることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に鑑み、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しなければ、開示されている具体的な実施形態に多くの変更を加えることができ、その変更によっても、同様または類似の結果が得られることがわかるはずである。

実施例１
幹細胞を調整して、遺伝子発現を変えて、機能的能力を強化するために流体剪断応力を使用できるという原則の証明を提供するために、パイロット試験を実施した。本システムにより提供される種類の剪断応力の調整能力を例証するために、大幅に小さい分析規模で、カスタムメイドのスライド、またはＩＢＩＤＩ、ＬＬＣ（Ｖｅｒｏｎａ、ＷＩ、ＵＳＡ）から得たＩＢＩＤＩ（登録商標）小規模マイクロ流体チャネルスライドを用いて、力（剪断応力）を加えた。ヒト試料は、骨髄（ＢＭ）、羊水（ＡＦ）または脂肪（ＡＤ）組織から採取されて、ｈＭＳＣの単離及び増殖のために処理されて、凍結保存した。凍結ｈＭＳＣを解凍して、５０ｍｌの最小必須培地（ＭＥＭ−α）（２０％のＦＢＳ、５％のペニシリン／ストレプトマイシン、５％のグルタミン）入りのＴ２２５細胞培養フラスコに播種した。培地は３〜４日毎に交換した。ｈＭＳＣは、それらがほぼ１００％コンフルエントになるまで、培養で維持された。細胞は、線維芽細胞表現型を有した。既成のシステムによって提供されるものよりはるかに制限された規模で、類似の流層剪断応力を提供する装置（ＩＢＩＤＩ（登録商標）マイクロ流体チャネルスライドまたはカスタムメイドのスライド）上へ細胞を播種する前に、細胞が播種のために調製される間、培養面は、細胞を播種する前に３７℃にて３０〜４５分間ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでプレコートされて、２×ＰＢＳで洗浄され、３０〜４５分間のインキュベーターに放置された。培養ｈＭＳＣを、真空及びガラスパスツールピペットを用いてＴ２２５フラスコから培地を除去することによって調製して、細胞は、室温のＰＢＳ×１で洗浄され、それは吸引によって除去した。０．２５％のトリプシン溶液３ｍｌを加えて、フラスコを５分間３７℃にてインキュベートした。このインキュベーションの後、フラスコをインキュベーターから取り出して、細胞を取り出すために激しく叩いた。すべての細胞が分離して浮動性であることを確実にするために、フラスコと解剖顕微鏡下で調べた。この時点で９ｍｌのＭＥＭをフラスコに加えて、全容量（１２ｍｌ）を除去して、１５ｍｌの円錐管に入れた。管を遠心分離機に入れて、室温にて５分間の３００ＲＣＦで回転させた。細胞ペレット上の少量の培地を残して、上清を吸引し、３ｍｌのＭＥＭ−αを加えて、細胞ペレットをこの培地で再懸濁した。存在する生細胞の数を、トリパンブルー色素排除を使用して測定した。生細胞数は血球計で測定されて、各アッセイ（表１を参照）の望ましい濃度を得るために、細胞は再懸濁された。ＩＢＩＤＩチャネルを利用して、既成のシステムにより提供される種類と類似しているが、それより調整が劣る流層剪断応力を提供した。細胞を３０〜４５分間放置して、その後、ウェル当たり６０μｌの培地でウェルを充填した（時間が経ちすぎている場合、媒体はチャネルから蒸発し始める）。細胞を１２〜１８時間インキュベートさせた。それから管を、清潔な三方コックで安全キャビネットのＩＢＩＤＩ（登録商標）スライドに取り付けて（すべて事前にオートクレーブ処理またはＥｔＯ殺菌し、蠕動ポンプと共に使用するのに必要な三方コックは、ＥｔＯまたはＵＶ殺菌され得る）、それからインキュベーターへ移した。ＩＢＩＤＩチャネル実験は総体積６ｍｌを再循環させて、大規模スライド実験は総体積５０ｍｌを再循環させた。蠕動ポンプまたはハーバードシリンジポンプを、１５ダイン／ｃｍ２で培養面にわたって培地を広げるようにプログラムした。流体剪断応力を３、６または８時間加えた。

層流剪断応力による免疫調整の変化
未処理のＭＳＣは、多機能抗炎症性タンパク質（例えばＴＮＦ−α促進タンパク質６（ＴＳＧ−６）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びインターロイキン（ＩＬ）−１受容体拮抗剤（ＩＬ１ＲＮ））などの免疫抑制の重要なメディエータを発現しない。３つのヒト組織源（骨髄、脂肪及び羊水）に由来するＭＳＣはすべて、剪断応力に様々な程度で反応することがわかった。例えば１５ダイン／ｃｍ^２の力で加えた剪断応力は、複数のヒト組織から採取したＭＳＣの免疫調節シグナル伝達を活性化した。骨髄に由来するＭＳＣ、層流剪断応力の評価は、ＴＳＧ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ１ＲＮ、ＨＭＯＸ−１、ＬＩＦ及びＫＬＦ２をコードするＭＳＣ遺伝子の転写で、６倍〜１２０倍の増加で遺伝子発現の重大な上方調節を促進した。例えば（図２０）を参照のこと。

同様に、流体剪断応力を受けたヒトＭＳＣ培養液からの培地が免疫調節タンパク質（例えばプロスタグランジンＥ２）も含有することが、市販のＥＬＩＳＡを利用して判定された。更にウエスタンブロット法は、ＣＯＸ２、ＴＳＧ６及びＩＬ１ＲＮの高いタンパク質レベル（翻訳）を確認した。アクチンタンパク質発現レベル（それは一定である）を、ベースラインのタンパク質発現の対照として使用した。この実験において、８時間の流体剪断応力に対すヒトＭＳＣ（ｈＢＭ（ヒト骨髄ＭＳＣ）、ｈＡＦ ＭＳＣ（羊水ＭＳＣ）、ｈＡＤ ＭＳＣ（脂肪由来ＭＳＣ）に由来）の曝露の後、流体剪断応力を受けなかったＭＳＣから得た培地と比較して、ＣＯＸ２タンパク質発現の著しい増加があることがわかった。この誘発は１０μＭのＮＦ−κＢ拮抗剤ＢＡＹ１１−７０８５を加えることによって抑制され得ることもわかった（図２１）。更に市販のＥＬＩＳＡを利用することによって、処理済みｈＭＳＣを脾臓からの活性化免疫細胞と共培養したとき、ＴＮＦの１０〜５０％の減少によって明示されるように、わずか３時間だけ流体剪断応力を受けたヒトＭＳＣ培養液が免疫抑制活性を有することがわかった（図２２）。サイトカイン抑制アッセイを使用して、ＣＯＸまたはＮＦ−ｋＢ阻害剤の適用が、ＴＮＦーαの生成を抑制する剪断処理したＭＳＣの能力を抑止する一方で、ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）の安定化合成体の添加が、剪断処理したＭＳＣの存在下で生成されたレベルまでＴＮＦ−αを減少させることもわかった（図２３）。ＣＯＸ２及びＨＭＯＸ１のより大きな誘発がＩＦＮ−γの添加によって生じたので、剪断処理したＭＳＣが、流体剪断応力を受けなかったＭＳＣより他のプライミング剤に更に応答し得ることを、追加の証拠が更に示唆する（図２４）。したがって、流体剪断応力を行けたヒトＭＳＣは、例えば併用療法が存在する場合、サイトカインによって相乗的に作用し得ることを示唆する。

剪断応力にさらされた未処理のＭＳＣが、炎症性サイトカインによる前処理がない状態で、リポ多糖類（ＬＰＳ）活性化マウス脾細胞によるＴＮＦ−α分泌をブロックすることが可能である（ＭＳＣドナー及びドナー源の変動に応じて、完全な阻害から静的条件下で培養したＭＳＣ未満の１／２の減少までの範囲）ことも更にわかった。

神経保護能力：
制御された剪断応力にさらされるＭＳＣなどの細胞が、例えば外傷性脳損傷（ＴＢＩ）後に神経保護を提供できることを証明するために、実験を実施した。そのために、ラットモデルを、機能的結果を評価するために利用した。ネズミの制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）は、ヒトの頭部損傷に似ている形態学的及び脳血管損傷反応を示す。したがって、神経損傷及び炎症を高める細胞及び分子改変の特性決定は、ＭＳＣ前処理の潜在的臨床有効性を測定するための強力なツールを提供する。

１２匹のラットが、０．０５のα過誤レベルで８０％の検知力を得るのに状態当たり必要であると予測された（ＳＡＳ予測解析ソフトウェア）。細胞療法で投与される細胞は、骨髄由来ＭＳＣであった。ＭＳＣは、静的条件で、またはＣＯＸ２、ＴＳＧ６、ＩＬ１ＲＮ及びＨＭＯＸ１の強力な誘発を生成して、活性化免疫細胞のサイトカイン産生を抑制する流量及び持続期間である１５ダイン／ｃｍ２、３時間の剪断応力にさらされた。大容量の側方流システムによる力の適用の直後、１０×１０^６細胞／ｋｇのＭＳＣを、尾部静脈注入を介して、レシピエントのラットへ移した（ラット当たりの２．５×ｌ０^６ＭＳＣのおよその投与量）。

血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を、脈管構造全体の漏出を調べる標準方法を使用して測定した（本明細書に記載の懸濁液中のデキストランビーズを利用する）。右頭頂連合野の損傷を、ＣＣＩ装置（Ｌｅｉｃａ Ｉｍｐａｃｔｏｒ１）によって、雄ラット（２２５〜２５０ｇ）に加えた。平行して、対照ラットは、ＣＣＩだけで処置した、または単に麻酔をかけた（シャム対照）。損傷の４８時間後に、ＭＳＣを投与した。ＭＳＣ注入の２４時間後に、蛍光複合型Ａｌｅｘａ６８０−デキストランビーズ（１０ｋＤａ、１ｍｇ／ｍｌの０．５ｍｌ）を、尾静脈を介して送達した。この染料が注入された３０分後に、動物を安楽死させ、４％のパラホルムアルデヒドで灌流した。固定した脳を、１ｍｍの厚さで冠状に切断した。血管からの漏出を、７００及び８００ｎｍチャンネルを使用して（８００ｎｍの信号をバックグラウンド除去のために使用した）ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ赤外線レーザスキャナの脳切片の蛍光強度で測定した。神経炎症に反応して急速に変化する周知で、予後の重要なインジケータである、特定の免疫及び神経細胞型の頻度の組織学的分析。将来の実験において、ラットの独立コホートで、

８〜５０μｍの間の脳切片を、ＣＮＳの炎症性表現型について、小膠細胞（Ｉｂａ１、ＥＤ１またはＣＤ６３）、浸潤好中球（ＲＰ−３）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）及び神経細胞（ＮｅｕＮ）、ならびに細胞死の指標（開裂カスパーゼ３）を検出する抗体を使用して、免疫組織化学により分析する。脳切片の染色は、標準浮遊染色方法またはスライド装着凍結切片を使用して実施する。

処置された及び対照ラットの認知回復は、従来の海馬依存性空間学習課題（モーリスの水迷路であって、ここでラットは迷路外の手がかりに基づき水中プラットフォームの位置を示す）により評価することができる。これらの試験において、損傷の２週間後、各象限の速度、費やす時間及びプラットフォームを見つけるためにかかる経路の距離で、学習を測定する。同じ個体を、迷路の同じ測定法によって、記憶機能について損傷の４週間後に試験する。予想される結果は、剪断処理したＭＳＣの送達が、未処理の静的培養したＭＳＣと比較して、脳のＢＢＢ透過性及び炎症性細胞表現型を減らして、改善した認識回復ももたらことである。

実施例２−傷害は骨髄のＭＳＣ頻度を変える
外傷性脳損傷の慢性炎症は、自然及び適応免疫系の単球及びリンパ球によって永続化する。ＭＳＣは、骨髄から損傷及び炎症部位へ誘導されることが報告されているが、それでもこれに関して骨髄からのＭＳＣ輸送の詳細な分析は欠如している。損傷によって生じるＭＳＣ頻度の変化をモニターするために、ヒト頭部損傷に類似する形態学的及び脳血管損傷反応を示す外傷性脳損傷のラットモデルが確立された。簡潔には、制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）を、正中線縫合に隣接した露出した右頭頂連合野に供給した。平行して、シャム対照を麻酔し、切開を損傷なしで行った。ＣＤ１０５＋ＭＳＣの頻度を骨髄内で試験して、ＣＤ１０５＋ＭＳＣの絶対数が損傷の２４時間後に著しく減少することがわかった（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。造血幹細胞または前駆細胞で観察されるように、ＭＳＣは骨髄からの放出による損傷に反応し、したがってＭＳＣが血流内及び血管壁に存在する血行力に直接さらされるという可能性を増加させることを、これらのデータは示唆する。重要なことに、３時間の１５ダイン／ｃｍ^２のＷＳＳによって前処理したヒトＭＳＣの静脈内投与は、ＣＣＩの２４時間後に投与したとき、損傷したラットの骨髄のＣＤ１０５＋ＭＳＣ頻度を著しく上昇させた（図２５Ｃ及び図２５Ｄ）。ＣＣＩの７２時間後、ＣＤ１０５＋細胞頻度は、静的培養またはＷＳＳ曝露ＭＳＣを投与したときのいずれでも、著しくより高くなり、ＭＳＣがＷＳＳによって前処理されるとき、骨髄への保護効果は著しくより大きかった。

材料及び方法
細胞培養−細胞培養−骨髄ＭＳＣは、独立したヒトドナーからの全骨髄に由来した（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）。簡潔には、単核球細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの相分離によって、全骨髄のバフィー層に濃縮された。細胞は、ＭＥＭ−α（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０％のウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）からなる完全培養培地の早急な増殖のために凍結保存または再懸濁した。非付着性細胞を、２日後除去した。付着性コロニーを更に増殖させて、継代１として凍結させた。解凍したＭＳＣを１×１０^５細胞／ｍｌで蒔いて、培地を３日毎に変えた。８０％のコンフルエンスで、細胞を、ＩＢＩＤＩチャネル（マイクロスライドＶＩ０．４）内で、ｑＲＴ ＰＣＲ、免疫ブロット法及びマウスＣＣＩ実験にのために密度３×１０^６細胞／ｍｌにて、ＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光実験にのために密度５×１０^５細胞／ｍｌで継代培養した。培養面に取り付けた後、シリンジポンプ（プログラム可能なＰｈＤ ＵＬＴＲＡ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）または蠕動ポンプ（ＲＥＧＬＯ類似体ＭＳ４／１２、Ｉｓｍａｔｅｃ）を、１５ダイン／ｃｍ^２の層流剪断応力を作成するために使用した。

制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）−６ｍｍのインパクター先端を使用して、雄ラット（２２５〜２５０ｇ）の露出した脳の右頭頂連合野（ブレグマとラムダの間の正中縫合部に隣接）に６ｍ／秒で圧迫３．１ｍｍの単回衝撃を加えるために、ＣＣＩ装置（Ｌｅｉｃａ ＩＭＰＡＣＴ ＯＮＥ（商標））を使用した。平行して、対照ラットは、ＣＣＩだけ処理した、または単に麻酔をかけた（シャム対照）。細胞療法実験において、低継代（Ｐ２〜５）のＭＳＣを、静的条件下または３時間１５ダイン／ｃｍ^２の剪断応力下で培養した。レシピエントラットは、２時間の剪断への曝露内に、尾静脈を介してＭＳＣ（１０×１０^６細胞／ｋｇ）を受けた。屠殺時に、ラットを４％のパラホルムアルデヒドで灌流し、組織を収集後更に固定した。すべての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅからのガイドラインに従って行われた。

ラット組織の組織標本調製−ラット脛骨を採取して、骨を囲んでいる筋肉を慎重に除去した。骨を更に４％のパラホルムアルデヒドに固定して、１０％のＥＤＴＡを使用して用いて脱灰した。脱灰すると、グロスイン、パラフィン包埋及び薄片作成のために、ＵＴ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅへ骨を転送した。

骨髄の免疫染色−パラフィン包埋した切片を２０分間６０℃にて焼き、キシレン及び様々なグレードのエタノール中に順次再水和した。熱誘導エピトープ賦活化を、ＤＡＫＯ標的抗原賦活化液（ｐＨ６．１）を使用して実施した。内在性ペルオキシダーゼを０．３％のＨ_２Ｏ_２でブロックした。スライドを１時間２．５％のＢＳＡでブロックして、２．５％ＢＳＡ中、抗ＣＤ１０５抗体（１：２００、ＳＮ６、Ａｂ１４１４）とともに一晩インキュベートした。免疫ペルオキシダーゼ検出を、製造業者の指示事項に従ってＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣキット及びＤＡＫＯ ＤＡＢキット（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、ＰＫ−６１０２、Ｄａｋｏ ＤＡＢキット、Ｋ３４６８）を使用して実施し、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ ＲｅｄまたはＣＡＴ Ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｈ−３４０３、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、０１２２１５）で対比染色した。最適な細胞対比を確実にするために、ブルーイング試薬をヘマトキシリン（Ｓｔａｔｌａｂ、ＳＬ２０３）と共に使用した。スライドは空気乾燥して、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｅｃｏｍｏｕｎｔ（ＥＭ８９７Ｌ）でカバーガラス処理した。

画像収集及び解析−免疫組織染色の顕微鏡写真を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１Ｐ偏光顕微鏡（ＤＰ７１ Ｃｏｌｏｒ Ｃａｍｅｒａ）及びＤＰコントローラーソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｖｅｒｓｏｎ３．３．１．２９２）で得た。画像を、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を使用して定量的に分析した。処理群及び試料識別に対して盲検化されている研究者が、ＣＤ１０５＋ＭＳＣｓを計数した。乱数発生器を８つのランダムな画像セットを選択するために使用し、画像セットを続いて統計解析に供した。

統計解析−すべてのデータは、統計的有意性についてＳＩＧＭＡＰＬＯＴ（登録商標）１２．５ソフトウェアで分析し、平均値±標準誤差として報告される。多比較のための一元配置分散分析及びＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を、組織学的測定値の違いを評価するために使用した。Ｐ＜０．００１の有意水準を、３つのアスタリスク^＊＊＊でグラフに表す。特に明記しない限り、少なくとも３つの別個の生物学的複製物からの代表的結果を示す（図２５Ｂ及び図２５Ｄを参照のこと）。

本明細書で開示及び特許請求されている方法はすべて、本開示に鑑みれば、過度の実験なしに作成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されたが、変形が、本発明の概念、趣旨、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法に及びステップにおいてまたは方法のステップの順序において適用されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同じまたは類似の結果を得られる限りは、本明細書に記載されている作用剤の代わりに、化学的にも生理学的にも関連するある特定の作用剤を用いてよいことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代用形態及び改変形態はすべて、添付の特許請求の範囲に定められている、本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内とみなされる。

本明細書で用いられている、節の見出しは、構成上の目的のためのみであり、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。限定されないが特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含む本出願で引用されるすべての文書またはその一部は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれる文献、特許及び同様の資料のうちの１つ以上が、本出願の用語の定義と矛盾するやり方で用語を定義する場合、本出願が優先される。

参照文献
下記の参照文献が、本明細書に定められている内容に対して、例示的、手順的またはその他の詳細な補足を行う範囲において、参照により、本明細書に具体的に援用される。
国際特許公開第ＷＯ９８／３０６７９号。
Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０（５）：５３１−５３６，２００９。

Claims (91)

1. 装置であって、
   入口流体供給プレートと；
   底部プレートと；
   前記入口流体供給プレートと前記底部プレートの間に配置した複数の中間プレートであって、前記複数の中間プレートのそれぞれは、
   第１端、第２端、第１側面及び第２側面；
   前記第１端の近位にある分配チャネル；ならびに
   前記第２端の近位にある収集チャネル；を含む、中間プレートと；を含む、前記中間プレートであって、
   前記分配チャネルは、前記中間プレートの前記第１側面と前記第２側面の間に延在し、及び
   前記収集チャネルは、前記中間プレートの前記第１側面と前記第２側面の間に延在する、前記装置。
2. 前記各中間プレートの前記分配チャネルは第１の長さを有し、
   前記各中間プレートの前記収集チャネルは第２の長さを有し、
   前記中間プレートのそれぞれは前記第１側面と前記第２側面の間に幅を有し、
   前記分配チャネルの前記第１の長さは、前記中間プレートの前記幅の大部分にわたって延在し、及び
   前記収集チャネルの前記第２の長さは、前記中間プレートの前記幅の大部分にわたって延在する、請求項１に記載の装置。
3. 前記各中間プレートの前記分配チャネルは第１の長さを有し、
   前記各中間プレートの前記収集チャネルは第２の長さを有し、
   前記中間プレートのそれぞれは前記第１側面と前記第２側面の間に幅を有し、
   前記分配チャネルの前記第１の長さは、前記中間プレートの前記幅の少なくとも７０％にわたって延在し、及び
   前記収集チャネルの前記第２の長さは、前記中間プレートの前記幅の少なくとも７０％にわたって延在する、請求項１に記載の装置。
4. 収容容器；
   第１導管及び
   第２導管を更に含み、
   前記入口流体供給プレートは第１流体入口、第１流体出口、第２流体入口及び第２流体出口を含み、
   前記収容容器は、前記第１導管を介して前記第１流体入口に連結し、
   前記収容容器は、前記第２導管を介して前記第２流体出口に連結する、請求項１に記載の装置。
5. 前記入口流体供給プレートの前記第１流体出口及び前記第２流体入口に連結したポンプを含む、請求項４に記載の装置。
6. 前記ポンプが
   転動体及び
   可撓性導管を含み、前記可撓性導管は前記入口流体供給プレートの前記第１流体出口及び前記第２流体入口に連結する、請求項５に記載の装置。
7. 前記転動体に連結した電動モータを更に含む、請求項５に記載の装置。
8. 使用中、前記ポンプが、
   前記第１流体入口と前記第１流体出口を通って前記収容容器から流体を出し、及び
   前記第２流体入口に前記流体を配向し、複数の前記中間プレートをわたって、前記第２入口を出て前記収容容器に戻るように構成される、請求項５に記載の装置。
9. 前記第２流体入口を通る前記流体の速度が、前記ポンプの前記転動体の回転速度によって制御される、請求項８に記載の装置。
10. 前記複数の中間プレートは少なくとも３つの中間プレートを含む、請求項１に記載の装置。
11. 細胞調製システムであって、
    底部；
    前記底部と連結した複数のモジュラー細胞調製装置であって、各前記モジュラー細胞調製装置は、
    入口流体供給プレートと；
    底部プレートと；
    入口流体供給プレートと底部プレートの間に配置した複数の中間プレートと；を含む前記モジュラー細胞調製装置；
    収容容器；及び
    ポンプ；を含む、前記細胞調製システム。
12. 前記複数のモジュラー細胞調製装置は少なくとも３つの前記モジュラー細胞調製装置を含む、請求項１１に記載の細胞調製システム。
13. 使用中、前記複数のモジュラー細胞調製装置は細胞の調製に平行して作動するように構成される、請求項１１に記載の細胞調製システム。
14. 前記複数の中間プレートは少なくとも３つの中間プレートを含む、請求項１１に記載の細胞調製システム。
15. 前記複数の中間プレートの前記中間プレートのそれぞれは、
    第１端、第２端、第１側面及び第２側面；
    前記第１端の近位にある分配チャネル；ならびに
    前記第２端の近位にある収集チャネル；を含み、
    前記分配チャネルは、前記中間プレートの前記第１側面と前記第２側面の間に延在し、及び
    前記収集チャネルは、前記中間プレートの前記第１側面と前記第２側面の間に延在する、請求項１１に記載の細胞調製システム。
16. 前記各中間プレートの前記分配チャネルは第１の長さを有し、
    前記各中間プレートの前記収集チャネルは第２の長さを有し、
    前記中間プレートのそれぞれは前記第１側面と前記第２側面の間に幅を有し、
    前記分配チャネルの前記第１の長さは、前記中間プレートの前記幅の大部分にわたって延在し、及び
    前記収集チャネルの前記第２の長さは、前記中間プレートの前記幅の大部分にわたって延在する、請求項１５に記載の細胞調製システム。
17. 前記各中間プレートの前記分配チャネルは第１の長さを有し、
    前記各中間プレートの前記収集チャネルは第２の長さを有し、
    前記中間プレートのそれぞれは前記第１側面と前記第２側面の間に幅を有し、
    前記分配チャネルの前記第１の長さは、前記中間プレートの前記幅の少なくとも７０％にわたって延在し、及び
    前記収集チャネルの前記第２の長さは、前記中間プレートの前記幅の少なくとも７０％にわたって延在する、請求項１５に記載の細胞調製システム。
18. 前記各モジュラー細胞調製装置が、
    第１導管及び
    第２導管を更に含み、
    前記入口流体供給プレートは第１流体入口、第１流体出口、第２流体入口及び第２流体出口を含み、
    前記収容容器は、前記第１導管を介して前記第１流体入口に連結し、及び
    前記収容容器は、前記第２導管を介して前記第２流体出口に連結する、請求項１１に記載の細胞調製システム。
19. 前記各モジュラー細胞調製装置のポンプが、前記入口流体供給プレートの前記第１流体出口及び前記第２流体入口に連結する、請求項１８に記載の細胞調製システム。
20. 前記ポンプが、
    転動体及び
    可撓性導管を含み、前記可撓性導管は前記入口流体供給プレートの前記第１流体出口及び前記第２流体入口に連結する、請求項１１に記載の細胞調製システム。
21. 前記転動体に連結した電動モータを更に含む、請求項２０に記載の細胞調製システム。
22. 前記第２流体入口を通る前記流体の速度が、前記ポンプの前記転動体の回転速度によって制御される、請求項２１に記載の装置。
23. 使用中、前記ポンプが、
    前記第１流体入口と前記第１流体出口を通って前記収容容器から流体を出し、及び
    前記第２流体入口に前記流体を配向し、複数の前記中間プレートをわたって、前記第２入口を出て前記収容容器に戻るように構成される、請求項２０に記載の細胞調製システム。
24. 装置であって、
    第１端と、第２端と、それらの間の壁と、前記第１端の近位にある入口流体コネクタと、前記第１端の近位にある立孔と、前記立孔を前記入口流体コネクタとの流体連通に配置するために前記入口流体コネクタから前記立孔へ延在する供給路と、を有する第１キャップ；
    第１端と、第２端と、それらの間の壁と、前記第２端の近位にある出口流体コネクタと、前記第２端の近位にある立孔と、前記立孔を前記出口流体コネクタとの流体連通に配置するために前記立孔から前記出口流体コネクタへ延在するドレイン路と、を有する第２キャップ；
    前記第１キャップの壁と前記第２キャップの壁の中間に配置されて、装置の組み立てで前記第１キャップと前記第２キャップのそれぞれと封止係合する、少なくとも１つの中間モジュールであって、各前記中間モジュールは、
    第１端、第２端を有するフレームと、前記第１キャップの壁側に配置された第１側面及び前記第２キャップの壁側に配置された第２側面を有するその間の障壁と、を含み、前記第１キャップの封止面と前記中間モジュールの第１側面の封止面を密閉するように係合する際、前記第１キャップの壁と前記中間モジュールの障壁の第１側面の間に第１流体チャンバーを形成するため、及び前記中間モジュールの第２側面の封止面を有する前記第２キャップの封止面と前記中間モジュールの前記第２キャップの封止面を密閉するように係合する際、前記第２キャップの壁と中間モジュールの障壁の第２側面の間に第２流体チャンバーを形成するため、前記障壁が前記フレーム内かつ第１端と第２端の間に配置されている、前記中間モジュール；
    装置の組み立ての際、第１キャップの立孔を密閉するように係合するための中間モジュールの第１端の近位にあるフレームの流体入口；
    前記流体入口から前記分配チャネル内に受けた流量を分配するための、前記中間モジュールの前記第１端の近位にある前記フレーム内にあって、前記流体入口と流体連通する分配チャネル；
    前記第１及び前記第２流体チャンバー内に受けた流量を導入するための、前記中間モジュールの前記第１端の近位に配置され及び前記分配チャネルと流体連通する複数の流体チャンバー供給口；
    前記中間モジュールの前記第２端の近位に配置され、ならびに前記第１及び前記第２流体チャンバーと流体連通する複数の流体チャンバードレイン口；
    前記中間モジュールの前記第２端に沿って配置され、ならびに前記第１及び前記第２流体チャンバーと流体連通する収集チャネル；
    装置の組み立ての際、前記第２キャップの前記立孔を密閉するように係合するための、前記中間モジュールの前記第１端の近位に配置され、ならびに前記収集チャネルと流体連通する立孔；を含む、前記装置であって、
    第１キャップと第２キャップの中間に配置された１つ以上の中間モジュールを備えた装置の組み立ての際、第１キャップ上の封止面を備えた１つ以上の中間モジュール上の第１側面封止面を封止可能に係合するために、及び第２キャップ上の封止面を備えた１つ以上の中間モジュール上の第２側面封止面を封止可能に係合するために、第１キャップの入口を第２キャップ上の出口と封止係合に配置して、複数の流体チャンバー供給口のうちの少なくともいくつかと複数の流体チャンバードレイン口のうちの少なくともいくつかの中間、ならびに少なくとも１つの中間モジュール第１側面と第１キャップの中間に配置した、第１流体チャンバー、ならびに複数の流体チャンバー供給口のうちの少なくともいくつかと複数の流体チャンバードレイン口のうちの少なくともいくつかの中間ならびに少なくとも１つの中間のモジュール第２側面と第２キャップの中間に配置した第２流体チャンバーを含む、流体回路を提供し；
    装置の入口と出口にわたって液圧差を提供する際に、分配チャネルに沿って配置される複数の流体チャンバー供給口、及び中間モジュールの収集チャネルに沿って配置される複数の流体チャンバードレイン口は、流体チャンバー内に均一の局所的流体速度を提供する；前記装置。
25. 前記第１キャップ内に埋め込まれた複数の希土類磁石；及び
    前記第２キャップ内に埋め込まれた対応する複数の希土類磁石；を更に含み、
    前記第２キャップの前記希土類磁石はパターンに配置されて、前記第１キャップ内に埋め込まれた前記希土類磁石と符号し、それによって前記第２キャップが前記第１キャップと整列し、及び前記第２キャップの前記複数の希土類磁石の対応する１つに対する前記第１キャップの前記複数の希土類磁石のそれぞれの間の磁力を促進し、及びそれによって前記１つ以上の中間モジュールの前記第１封止側面を有する前記第１キャップの前記封止面の間の境界面、及び更に前記１つ以上の中間モジュールの前記第２封止側面を有する前記第２キャップの前記封止面の間の境界面に、封止力を適用する、請求項２４に記載の装置
26. 前記流体チャンバーの数は、前記１つ以上の中間モジュールの数プラス１に等しい、請求項２４に記載の装置。
27. 少なくとも前記第１キャップ及び前記第２キャップはポリスチレンを含む、請求項２４に記載の装置
28. 前記１つ以上の中間モジュールの前記第１封止側面を有する前記第１キャップの前記封止面の間の境界面、及び更に前記１つ以上の中間モジュールの前記第２封止側面を有する前記第２キャップの前記封止面の間の境界面に、封止力を適用するために、前記第１端を前記第２端に押しつけるためのクランプを更に含む、請求項２４に記載の装置。
29. 前記クランプが弾性バンドである、請求項２８に記載の装置。
30. 前記クランプは、引張部材、及びクランプ圧力を調整するためのねじ付き部材を備えた機械的締結具を含む、請求項２８に記載の装置。
31. 前記第１キャップは、前記封止面周囲に延在する隆起縁及び陥凹溝のうちの少なくとも１つを更に含み、
    前記１つ以上の中間モジュールの前記第１封止側面は、前記第１キャップの前記隆起縁及び前記陥凹溝のうちの１つと係合するために前記隆起縁及び前記陥凹溝のうちの他方を更に含む、請求項２４に記載の装置。
32. 前記第２キャップは、前記封止面周囲に延在する隆起縁及び陥凹溝のうちの少なくとも１つを更に含み、
    前記１つ以上の中間モジュールの前記第２封止側面は、前記第２キャップの前記隆起縁及び前記陥凹溝のうちの１つと係合するために前記隆起縁及び前記陥凹溝のうちの他方を更に含む、請求項３１に記載の装置。
33. 前記第１キャップ、前記第２キャップ及び前記１つ以上の中間モジュールは、それぞれ長方形状である、請求項２４に記載の装置
34. 調整組成物の製造方法であって、
    （ａ）幹細胞の出発集団を得ること、
    （ｂ）細胞接着を可能にするように基質上に前記幹細胞を培養すること、及び
    （ｃ）調整組成物を生成するのに十分な力で、制御された剪断応力を前記幹細胞に適用すること、を含む、前記方法。
35. 前記調整組成物は調整した幹細胞の集団である、請求項３４に記載の方法。
36. （ｄ）調整した幹細胞の集団を単離することを更に含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記調整組成物は調整培地組成物である、請求項３４に記載の方法。
38. （ｄ）調整培地を単離することを更に含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記調整培地が細胞を実質的に含まない、請求項３７に記載の方法。
40. 前記方法が自動化されている、請求項３４に記載の方法。
41. ステップ（ｃ）が前記幹細胞上に流体を通過させることを含む、請求項３４に記載の方法。
42. 前記流体が増殖培地である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記基質が、単層での幹細胞の増殖を支持する表面である、請求項３４に記載の方法。
44. 前記増殖培地が、少なくとも第１の外因性サイトカインまたは増殖因子を含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記増殖培地がＩＬ１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ及び／またはプロスタグランジンを含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記プロスタグランジンが１６，１６’−ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記増殖培地が、少なくとも第１のＴＬＲアゴニストまたは炎症の刺激物質を含む、請求項４３に記載の方法。
48. 前記増殖培地がＰｏｌｙＩ：Ｃ、リポ多糖体（ＬＰＳ）またはホルボールミリステート酢酸塩（ＰＭＡ）を含む、請求項４３に記載の方法。
49. 前記剪断応力が層流剪断応力である、請求項３４に記載の方法。
50. 前記剪断応力が少なくとも平方センチメートル当たり５ダインである、請求項３４に記載の方法。
51. 前記剪断応力が少なくとも平方センチメートル当たり１０または１５ダインである、請求項３４に記載の方法。
52. ステップ（ｃ）が前記細胞を高圧力に曝露することを含む、請求項３４に記載の方法。
53. 制御された剪断応力を前記幹細胞に適用することは、約１分と２日の間の期間である、請求項３４に記載の方法。
54. 制御された剪断応力を前記幹細胞に適用することは、約５分〜２４時間、１０分〜２４時間、０．５時間〜２４時間、または１時間〜８時間の間の期間である、請求項５３に記載の方法。
55. 前記幹細胞がヒト細胞である、請求項３４に記載の方法。
56. 前記幹細が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項３４に記載の方法。
57. 前記幹細胞がトランスジェニック細胞である、請求項３４に記載の方法。
58. 前記幹細胞が自家幹細胞である、請求項３４に記載の方法。
59. 前記幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項３４に記載の方法。
60. 前記ＭＳＣを組織から単離することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
61. 前記組織が、組織は、骨髄、臍帯血、末梢血、卵管、胎児の肝臓、肺、歯髄、胎盤、脂肪組織または羊水である、請求項６０に記載の方法。
62. 前記調整した幹細胞が、前記幹細胞の出発集団と比べて少なくとも６倍高い抗炎症性遺伝子の発現を有している、請求項３４に記載の方法。
63. 前記抗炎症性遺伝子が、ＴＳＧ−６、ＰＧＥ−２、ＣＯＸ−２、ＩＬ１Ｒａ、ＨＭＯＸ−１、ＬＩＦまたはＫＬＦ２をコードする、請求項６２に記載の方法。
64. 前記剪断応力がバイオリアクターシステムで適用される、請求項３４に記載の方法。
65. 前記バイオリアクターシステムが、入口流体供給プレート、底部プレート、入口流体供給プレートと底部プレートの間に配置した複数の中間プレートを含む、請求項６４に記載の方法。
66. 前記中間プレートが、第１端、第２端、第１側面及び第２側面、第１端の近位にある分配チャネル、ならびに第２端の近位にある収集チャネルを含む、請求項６５に記載の方法。
67. 前記分配チャネルが、前記中間プレートの前記第１側面と前記第２側面の間に延在する、請求項６６に記載の方法。
68. 前記収集チャネルが、前記中間プレートの前記第１側面と前記第２側面の間に延在する、請求項６６に記載の方法。
69. 前記バイオリアクターシステムが、収容容器、第１導管及び第２導管を更に含む、請求項６４に記載の方法。
70. 前記入口流体供給プレートが、第１流体入口、第１流体出口、第２流体入口及び第２流体出口を含む、請求項６９に記載の方法。
71. 前記収容容器が、前記第１導管を介して前記第１流体入口に連結し、前記第２導管を介して前記第２流体出口に連結する、請求項６９に記載の方法。
72. 前記バイオリアクターシステムが、前記入口流体供給プレートの前記第１流体出口及び前記第２流体入口に連結したポンプを更に含む、請求項６９に記載の方法。
73. 前記ポンプが、第１流体入口と第１流体出口を通って収容容器から流体を出し、及び第２流体入口に流体を配向し、複数の中間プレートをわたって、第２入口を出て収容容器に戻るように構成される、請求項７２に記載の方法。
74. 前記第２流体入口を通る前記流体の速度は、前記ポンプの前記転動体の回転速度によって制御される、請求項７３に記載の方法。
75. 前記バイオリアクターシステムが、高い層流境界層周長対流動断面積の比を提供する、請求項６４に記載の方法。
76. 前記バイオリアクターシステムが大規模な細胞生成が可能である、請求項６４に記載の方法。
77. 請求項３４に記載の方法によって得られた調整した幹細胞の治療に有効な量の組成物。
78. 剪断応力にさらされることで調整された、調整した幹細胞の治療に有効な量を投与することを含む、治療することを、そのような治療を必要とする対象において行う方法。
79. 前記調整した幹細胞が調整した間葉系幹細胞を含む、請求項７８に記載の方法。
80. 前記調整した幹細胞が、請求項３４〜７６のいずれか一項に記載の方法により得られた組成物を含む、請求項７８に記載の方法。
81. 前記対象が、慢性または急性炎症、移植片対宿主病、筋骨格外傷、神経損傷、または自己免疫不全を有する、請求項７８に記載の方法。
82. 前記神経損傷が外傷性脳損傷である、請求項７８に記載の方法。
83. 前記調整した幹細胞が、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与される、請求項７８に記載の方法。
84. 患者に幹細胞（例えば間葉系幹細胞）の有効量を投与することを含む、前記患者の骨髄のＣＤ１０５^＋細胞を増加させる方法。
85. 前記間葉系幹細胞が、剪断応力にさらされることで調整した細胞を含む、請求項８４に記載の方法。
86. 前記間葉系幹細胞が、請求項３４〜７６のいずれか一項に記載の方法によって生成した調整組成物を含む、請求項８４に記載の方法。
87. 前記患者が神経損傷を有する、請求項８４に記載の方法。
88. 前記神経損傷が外傷性脳損傷である、請求項８７に記載の方法。
89. 前記患者が、前記投与前の２４時間未満に、前記神経損傷を受けた、請求項８７に記載の方法。
90. 前記間葉系幹細胞が全身に投与される、請求項８４に記載の方法。
91. 前記間葉系幹細胞が静脈内に投与される、請求項８４に記載の方法。