JP2018515098A - メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法 - Google Patents

Abstract

メチロトローフ酵母を遺伝子操作するための方法および材料が提供される。

Description

技術分野
本開示は、メチロトローフ酵母（methylotrophic yeast）を遺伝子操作するための、ＤＮＡ構築物およびそのようなＤＮＡ構築物を使用する方法に一般的に関する。

背景
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのメチロトローフ酵母は、組換えタンパク質を発現するために一般的に使用される。メチロトローフ酵母中で１種または複数のポリペプチドを効率的に発現するために使用することができる構築物が、本明細書で提供される。

要旨
本開示は、１種または複数のタンパク質の組換え産生を有意に改善するＡＯＸ１プロモーターからやはり発現される導入遺伝子の発現を増大させるために、ＡＯＸ１プロモーターから転写活性化因子Ｍｘｒ１を過発現するＰ．パストリス（P. pastoris）株の使用を記載する。それに加えて、ＡＯＸ１プロモーターからのＭｘｒ１の発現は、抑制炭素源が消費し尽くされたときに、常態では真正の誘導物質であるメタノールの不在下で、ＡＯＸ１プロモーターから他の導入遺伝子を発現することを可能にする正のフィードバックループを創り出す。Ｍｘｒ１の発現は、産生されるタンパク質の量における有意の増大をもたらす。

一態様において、組換え核酸分子を含むメチロトローフ酵母細胞が提供される。組換え核酸分子は、典型的には、少なくとも１つのメタノール誘導性プロモーター要素（エレメント）と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む。代表的メチロトローフ酵母は、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ピキア属（Pichia）またはトルロプシス属（Toruplosis）であり得る。代表的メチロトローフ酵母はピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。

幾つかの実施形態において、組換え核酸分子は、メチロトローフ酵母細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。幾つかの実施形態において、組換え核酸分子は、複製コンピテントプラスミド（replication-competent plasmid）から染色体外で発現される（extrachromosomally expressed）。

幾つかの実施形態において、転写活性化因子をコードする外因性核酸は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＡｄｒ１配列、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ１配列、およびカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ２配列を含む。転写活性化因子をコードする代表的核酸はＤＱ３９５１２４に示される。代表的転写活性化因子はＡＢＤ５７３６５に示されるアミノ酸配列を有する。

幾つかの実施形態において、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＡＯＤ１プロモーター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＭＯＸプロモーター要素、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１プロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＦＬＤ１プロモーター要素、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター要素である。

幾つかの実施形態において、メチロトローフ酵母細胞は、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の異種核酸が、ヘムなどの鉄共同因子（iron-cofactor）（例えば、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（porphogilinogen）、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、および／またはフェロキラターゼ）の生合成に関与する１種または複数のポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、鉄共同因子の生合成に関与する１種または複数のポリペプチドは、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と連結している。

別の態様において、異種ポリペプチドを細胞で発現する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、本明細書に記載されたメチロトローフ酵母細胞を提供すること；少なくとも１種のピキア・パストリス（Pichia pastoris）アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること；および該細胞を該組換え核酸分子の発現に適当な条件下で培養して、それにより該異種ポリペプチドを発現することを含む。

幾つかの実施形態において、細胞が培養される条件は、鉄または薬学的にまたは代謝的に許容されるそれらの塩の添加を含む。幾つかの実施形態において、該導入ステップは、形質導入、電気穿孔法、微粒子銃送達（biolistic particle delivery）、または化学的形質転換などの技法を含む。幾つかの実施形態において、培養ステップは、メタノールの存在下で細胞を培養することを含む。

別の態様において、それが活性化するプロモーターと作動的に連結している転写活性化因子を含む組換え生物体が提供される。幾つかの実施形態において、プロモーターと作動的に連結しているポリペプチドを発現する組換え生物体が提供される。さらに別の態様において、誘導物質を添加せずに誘導性プロモーターからポリペプチドを発現する方法が、本明細書に記載されたように提供される。

特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、方法および組成物が属する技術の当業者により共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と同様なまたは等価の方法および材料が、方法および組成物の実行または試験で使用され得るが、適当な方法および材料は下に記載される。それに加えて、材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定するものであることは意図されない。本明細書で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は、それらの全体で参照により本明細書に組み込まれる。

図１は、ヘムの生合成経路に関与するステップを模式的に描く図である。 図２は、産生株ＭＸＹ０１８３の構築で使用されるプラスミドの概略図である。 図３は、親株Ｂｇ１１からの産生株、ＭＸＹ０１８３およびＭＸＹ０２０７の発生を模式的に示す図である。 図４は、プラスミドｐＧＡＢおよびｐＭｘ３５４を示す概略図である。 図５は、親株Ｂｇ１１からの抗生物質選択なしの産生株、ＭＸＹ０２９１およびＭＸＹ０３３８の発生を模式的に示す図である。 図６は、共形質転換により産生株ＭＸＹ０２９１を作製するために導入されたＭｘｒ１およびＬｅｇＨ変形体３を含有するＤＮＡの線状部分の概略図である。 図７は、天然のピキア(Pichia）非ｐＡＯＸ１構成的プロモーターの制御下でＬｅｇＨを発現する線状構築物を示す概略図である。 図８は、株ＭＸＹ０１８３と関連する表現型の変化を示す写真である。導入開始時（０時間）および導入後７２時間における振盪フラスコを示す。１、ＭＸＹ００５１；２、ＭＸＹ０１１８；３、ＭＸＹ０１８３。 図９は、改変されたＰ．パストリス（P. pastoris）株からのＬｅｇＨの産生を示す図である。パネルＡは、振盪フラスコで成長したＰ．パストリス（P. pastoris）株からの溶解物を示すＳＤＳゲルである：５１、ＭＸＹ００５１；１１８、ＭＸＹ０１１８；１８３、ＭＸＹ０１８３。パネルＢは、株ＭＸＹ０１１８、ＭＸＹ０１８３、およびＭＸＹ０２０７からのＬｅｇＨ産生を比較する表である。 図１０は、株ＭＸＹ０２０６を用いる実験からのデータを示す図である。パネルＡは、抑制炭素源における成長の４８時間後の株ＭＸＹ０１８３（左）およびＭＸＹ０２０６（右）の振盪フラスコ培養の写真である。パネルＢは、ＢＭＹ培地中における成長の４８時間後の株ＭＸＹ０１８３（左）およびＭＸＹ０２０６（右）の振盪フラスコ培養からの細胞ペレットの写真である。パネルＣは、ヘム搭載ＬｅｇＨの相対収率（いかなる誘導剤も不在で）を示すグラフである。 図１１は、２Ｌの発酵槽中でメタノールおよびグリセロール、またはメタノールおよびグルコースの存在下で成長したときの本明細書に記載された株の相対収率を示す総括表である。

詳細な説明
ポリペプチドの組換え発現を増大させるために細胞を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、誘導する分子の不在下で誘導性プロモーターからのポリペプチドの組換え発現を増大させるために、細胞を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。いかなる特定の機構にも束縛されずに、本明細書に記載される方法は、転写活性化因子の低レベルの天然の発現が、転写活性化因子と作動的に連結しているプロモーターを誘導する正のフィードバックループを創り出す。このことは転写活性化因子ならびに同じ誘導性プロモーターと作動的に連結している１種または複数の目標ポリペプチドの増大した発現をもたらす。

メチロトローフ酵母細胞を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。該方法は、本明細書ではピキア（Pichia）種（即ち、Ｐ．パストリス（P. pastoris））を使用して例示されるが、ピキア属（Pichia genus）の他の種も、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）, ピキア属（Pichia）およびトルロプシス属（Torulopsis）のいずれかからの種も使用することができる。

メチロトローフ酵母細胞の遺伝子操作は、典型的には、組換え核酸分子を細胞中に導入することを含む。本明細書に記載されるように、組換え核酸分子は、典型的には少なくとも１種の誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む。

本明細書に記載される方法で使用される組換え核酸分子は、典型的にはＤＮＡであるが、ＲＮＡ分子も適当な状況下で使用することができる。本明細書において使用する「外因性」とは、外部供給源から細胞のゲノム中に導入される任意の核酸配列を指し、ここで、外部供給源は、同じかもしくは異なる生物体または合成で生成した核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、１種の微生物（例えば、メチロトローフ酵母の１つの属または種）からの核酸で、メチロトローフ酵母の異なった属または種に導入された核酸であり得るが、しかしながら、外因性核酸は、メチロトローフ酵母からの核酸で、対応する天然の核酸配列の存在にもかかわらず追加のコピーとしてメチロトローフ酵母中に組換えで導入された核酸でもあり得る。例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）は、Ｍｘｒ１転写活性化因子をコードする内因性の核酸を含有する。Ｐ．パストリス（P. pastoris）の追加のＭｘｒ１核酸（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）中に組換えで導入された）または内因性のＰ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１核酸の改変は外因性と考えられる。

転写活性化因子、および転写活性化因子をコードする核酸（例えば、転写活性化因子をコードする外因性核酸）が、当技術分野において知られている。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からの転写活性化因子は、Ｍｘｒ１配列であるが、適当な転写活性化因子は、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（Ａｄｒ１配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＯＩ０２０００００５、塩基８５８８７３から８６２３５２まで、およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＳＸ０１２５３を参照されたい）およびカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）（Ｔｒｍ１配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ３６５３５５、およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＦ９９７００を参照されたい；Ｔｒｍ２配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ５４８７６０およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＪ０７６０８を参照されたい）にも見出すことができる。代表的Ｐ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３９５１２４に見出され得るが、代表的Ｐ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ５７３６５に見出すことができる。

Ｍｘｒ１などの転写活性化因子は、常態では低レベルで発現され得る。それ故、外因性核酸（即ち、転写活性化因子）を誘導性のプロモーターの制御下に置くことが望ましい。本明細書において使用する「作動的に連結している」とは、プロモーターまたは他の発現要素が、核酸の発現を指示または調節するように、配列をコードする核酸に対して位置（例えば、インフレーム）することを意味する。

メチロトローフ酵母を遺伝子操作するときに使用され得る多くの誘導性プロモーターがある。例えば、メタノール誘導性プロモーター、またはそれらからのプロモーター要素を使用することができる。メタノール誘導性プロモーターは当技術分野で知られている。例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの一般的に使用されるメタノール誘導性プロモーターは、メタノールに応答して強く転写されるアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子からのプロモーター、またはそれらの一部である。しかしながら、他のメタノール誘導性プロモーターまたはそれらからのプロモーター要素は、限定されないが、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＳＡＡＯＤ１Ａを参照されたい）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのアルコールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２４２５を参照されたい）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１またはＭＯＤ２プロモーター（例えば、Raymond et al., 1998, Yeast, 14:11-23;およびNakagawa et al., 1999, Yeast, 15: 1223-30を参照されたい）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ７５２５５１を参照されたい）またはそれらからのプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６６０５４を参照されたい）、またはＰ．パストリス（P. pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター（例えば、Kranthi et al., 2010, Yeast, 27: 705-11を参照されたい）を含めて使用することができる。幾つかの実施形態において、転写活性化因子は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｉｔ１配列である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＹ７０８８７を参照されたい）。全てのこれらのプロモーターは、メタノールにより誘導されることが知られている。

当業者は、本明細書に記載された組換え核酸分子がメチロトローフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれ得ること、または複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現され得ることを理解するであろう。両方を達成する方法は、当技術分野で周知であり、日常的に使用されている。

本明細書で示したように、ピキア（Pichia）中のメタノールに調節される転写活性化因子は、ＡＯＸ１プロモーターに結合して、Ｍｘｒ１と協調してＡＯＸ１プロモーターからの転写を活性化することができる。幾つかの実施形態では、メタノールに調節される２種類の転写活性化因子（例えば、Ｍｘｒ１およびＭｉｔ１）が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結することができる。

本明細書に記載される組換え核酸分子を含む株は、メチロトローフ酵母細胞中の第２の組換え核酸分子を調節する（例えば、過発現する）ことに使用することができる。第２の組換え核酸分子は、例えば、関心のある１種または複数のポリペプチドをコードする１種または複数の異種核酸を含むことができる。転写活性化因子をコードする外因性核酸と同様に、異種核酸は、生物体のゲノムにまたはゲノム中で生得（native）でない任意の核酸配列を指す（例えば、異種核酸は、１種類の微生物（例えば、メチロトローフ酵母の１属または種）からの核酸で、メチロトローフ酵母の異なる属または種中に導入された核酸であり得る）。

単に例として、関心のある１種または複数のポリペプチドをコードする異種核酸は、ヘム共同因子の生合成に関与する核酸であり得る。ここで例にするのは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ゲノムの配列から決定されて注記されるようなヘム生合成に関与する８種の異なる酵素をコードする核酸である。例えば、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼをコードする異種核酸は、本明細書に記載されたメチロトローフ酵母株中で発現させることができる。２種以上の異種核酸（例えば、導入遺伝子）を含有するようにメチロトローフ酵母を遺伝子操作するために、メタノール誘導性プロモーターと構成的プロモーターの組合せまたはそれらからの要素を、そのような核酸の発現をさらに増大させるために組み合わせることができる。

サッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）における以前の研究で、ＡＬＡデヒドラターゼおよびポルフォビリノーゲンデアミナーゼがヘム生合成における律速酵素として同定された（例えば、Hoffman et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 310 (4): 1247-53を参照されたい）。しかしながら、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ギャップ）プロモーターからのＰ．パストリス（P. pastoris）における個々のヘム酵素の異種発現は、ヘム共同因子を含有する組換えタンパク質の発現と関連する制限を克服することに成功しなかった（Krainer et al., 2015, Microb. Cell Fact., 13; 14: 4を参照されたい）。本明細書に記載されるように、Ｐ．パストリス（P. pastoris）中の組換えヘム含有タンパク質の高度に効率的な発現は、メタノール誘導性プロモーターからの全ヘム生合成経路を共発現することにより達成されたが、ヘム生合成経路に関与する１種または複数の遺伝子を、１種または複数の構成的プロモーターから発現することができることが認識されるであろう。

鉄共同因子生合成に関与する酵素に加えて、植物ヘモグロビンを含むタンパク質のグロビンファミリー（ＰｆａｍデータベースにおいてＰＦ０００４２）のメンバーをコードする核酸が存在し得ることが理解されるであろう。本明細書における例では、ダイズレグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）をコードする核酸が存在する。ＬｅｇＨは鉄共同因子のヘムに結合するタンパク質であり、それは４１５ｎｍに特徴的な吸収および明瞭な赤色を生じる。ＬｅｇＨタンパク質（ＬＧＢ２としても知られる）は、天然でダイズの根粒に見出され（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２２３６を参照されたい）、そこで使用される核酸配列は、Ｐ．パストリス（P. pastoris）における発現のために最適化されたコドンであった。例えば、国際公開第２０１４／１１０５３９号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１１０５３２号パンフレットを参照されたい。

あるいは、関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸は、例えば、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、または任意のそのようなポリペプチドに対する抗体であり得るが、これらに限定されない。他の実施形態では、異種核酸は、エタノール、乳酸、ブタノール、アジピン酸、またはコハク酸などの低分子の産生経路に関与する１種または複数の酵素をコードすることができる。

転写活性化因子をコードする外因性核酸と同様に、関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーター要素（例えば、メタノール誘導性プロモーター要素）と作動的に連結することができ、または関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターまたは構成的プロモーター要素と作動的に連結することができる。誘導性プロモーターおよびそれらからの要素は上で論じてある。構成的プロモーターおよび構成的プロモーター要素は当技術分野において知られている。例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの一般的に使用される構成的プロモーターは、構成的な様式で強く転写される転写伸長因子ＥＦ−１α遺伝子（ＴＥＦ１）からのプロモーター、またはそれらの一部である。しかしながら、他の構成的プロモーターまたは、それらからのプロモーター要素も使用することができて、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６２６４８．１を参照されたい）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの可能性のあるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）が固定されたタンパク質からのプロモーターＧＣＷ１４ｐ（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１〜４＿０５８６）、（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００２４９０６７８を参照されたい）、またはＰ．パストリス（P. pastoris）からの３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）からのプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８８２９６を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に記載された組換え核酸分子と同様に、第２の組換え核酸分子は、メチロトローフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、または複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現され得る。

誘導性プロモーター（例えば、メタノール誘導性）と構成的プロモーター（またはそれらからのプロモーター要素）の組合せが、組み合わされて、任意のそれらと作動的に連結している核酸の発現をさらに増大させることができることは、当業者により理解されるであろう。

プロモーター要素と作動的に連結している関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸が、本明細書に記載された組換え核酸分子から分離され得ること、または本明細書に記載された組換え核酸分子内に含有されるプロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸と近接することができることは、当業者により認識されるであろう。第２の核酸分子が本明細書に記載された組換え核酸分子と近接していれば、単一のプロモーター、またはそれらからのプロモーター要素を、両方のまたは全ての遺伝子（例えば、転写活性化因子をコードする外因性核酸ならびに関心のあるポリペプチドをコードする１種または複数の異種核酸）の転写を推進するために使用することができることも当業者により認識されるであろう。

核酸をメチロトローフ酵母細胞に導入する方法は、当技術分野において知られており、形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換を含むが、これらに限定されない。

それに加えて、メチロトローフ酵母細胞を培養する方法も、当技術分野において知られている。例えば、Pichia Protocols, Methods In Molecular Biology, 389, Cregg, Ed., 2007, 2ndEd., Humana Press, Inc.を参照されたい。幾つかの状況下で、メタノールを培養培地に導入または添加することが望ましいこともあるが、本明細書で示したように、メタノールは、１種または複数の関心のあるポリペプチドの高レベルにおける効率的な発現を得るために必要とされない。幾つかの状況下で（例えば、鉄共同因子の生合成に関与する酵素をコードする１種または複数の核酸が発現される場合）、培養培地に鉄または薬学的にまたは代謝的に許容される（またはＧＲＡＳ）それらの塩を補完することが望ましいこともある。

ピキア（Pichia）株は、メタノールを唯一の炭素源として成長することができる。メタノールの利用は、アルコールオキシダーゼの作用によるメタノールのホルムアルデヒドへの変換により開始される。メチロトローフ酵母のピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、アルコールオキシダーゼのための２つの遺伝子、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２を含有する。アルコールオキシダーゼ活性が低下した株（「メタノール利用が遅い」、またはＭｕｔＳ株）は、しばしば、ＡＯＸ１プロモーターから発現される組換えタンパク質を、アルコールオキシダーゼ活性が低下していない株よりも多く産生する。両方のＡＯＸ遺伝子が変異した株およびアルコールオキシダーゼ活性を完全に欠く株は、メタノールを代謝することができないが、それでもＡＯＸ１プロモーターからの発現のためにメタノールにより誘導され得る。これらの株は、成長のために他の炭素源を使用する能力を保持しているが、それでもまだ、メタノールの添加でＡＯＸ１プロモーターから異種タンパク質を発現する。これらの株は、メタノールを代謝しない（「メタノール利用のない」またはＭｕｔ株）ので、はるかに少ないメタノールしかタンパク質発現の誘導のために必要とせず、これらの変異を有する株は、大規模発酵におけるメタノール供給に関する問題を回避する。例えば、Chiruvolu et al., 1997, Enzyme Microb. Technol., 21: 277-83を参照されたい。Ｍｕｔ株におけるＡＯＸ１プロモーターからのＬｅｇＨの発現がＬｅｇＨ収率を大きく改善したことが本明細書で判定された。したがって、ＡＯＸ１遺伝子およびＡＯＸ２遺伝子の両方で変異を有するメチロトローフ酵母は、本明細書に記載される方法で使用することができる。

関心のあるタンパク質、または１種または複数の関心のあるタンパク質を含む複合体（例えば、ヘムが結合したＬｅｇＨ、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、または抗体）は、酵母細胞から精製することができる。ポリペプチドを精製する方法は当技術分野において知られている。本明細書において使用する「精製された」ポリペプチドは、天然でそれに伴った細胞の成分から分離または精製されたポリペプチドである。典型的には、ポリペプチドは、それが、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、それが天然で結合しているポリペプチドおよび天然に生じる分子を含まない場合に、「精製された」とみなされる。化学的に合成されたポリペプチドは、本来、天然でそれに伴う成分から分離されているので、合成ポリペプチドは「精製されている」。

本明細書において使用する核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができ、１種または複数のヌクレオチドアナログまたは骨格改変を含有する核酸を含むことができる。核酸は単鎖であることもまたは二重鎖であることもできて、それは通常その意図される使用に依存する。所与の配列と異なる核酸およびポリペプチドも提供される。核酸およびポリペプチドは、所与の核酸またはポリペプチド配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有することができる。

配列同一性のパーセントの計算では、２つの配列が整列されて、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一の一致数が決定される。同一の一致数を整列された領域の長さ（即ち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）により除して１００倍するとパーセントで配列同一性値になる。整列された領域の長さは、最短配列の全長サイズまでの一方または両方の配列の一部であり得ることは認識されるであろう。単一の配列が２種以上の他の配列と整列することができて、それゆえ、各整列された領域全体にわたって異なるパーセントの配列同一性値を有することができることも認識されるであろう。

配列同一性のパーセントを決定するための２つ以上の配列の整列は、コンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌＷおよび既定のパラメーターを使用して実施することができて、それが、核酸またはポリペプチド配列の整列がそれらの全長（グローバルアライメント）にわたって実施されることを可能にする。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31 (13): 3497-500。ＣｌｕｓｔａｌＷは、検索配列と１種または複数の対象の配列間の最良の一致を計算して、同一性、類似性および相違を決定できるように、それらを整列させる。１個または複数の残基のギャップが、検索配列、対象配列、または両方中に挿入されて、配列の整列を最大にすることができる。核酸配列を迅速にペアをなす整列にするために、既定のパラメーターを使用することができる（即ち、ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコア付けの方法：パーセンテージ；頂点の対角線数（number of top diagonals）：４；およびギャップペナルティー：５）；複数の核酸配列を整列させるために、以下のパラメーターを使用することができる：ギャップオープニングペナルティー：１０．０；ギャップエクステンションペナルティー：５．０；およびウェイトの変更（weight transition）：あり。ポリペプチド配列を迅速にペアをなす整列にするために、以下のパラメーターを使用することができる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコア付け方法：パーセンテージ；頂点の対角線数（number of top diagonals）：５；およびギャップペナルティー：３。複数のポリペプチド配列を整列させるために、以下のパラメーターを使用することができる：ウェイトマトリックス：ブロスム（blosum）；ギャップオープニングペナルティー：１０．０；ギャップエクステンションペナルティー：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；および残基特異的ギャップペナルティー：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、Baylor College of Medicine Search Launcher websiteでまたはWorld Wide WebのEuropean Bioinformatics Institute websiteで実行することができる。

変化を核酸分子に導入して、それによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じさせることができる。例えば、変化は、配列をコードする核酸に、突然変異生成（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲに媒介される突然変異生成）を使用して、またはそのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することにより、導入することができる。そのような核酸変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的および／または非保存的アミノ酸置換を生じさせ得る。「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基が同様な側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えられたものであり（例えば、アミノ酸置換のための頻度表を提供するDayhoff et al.（1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 (Suppl. 3): 345-352）を参照されたい）、および非保存的置換は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有しないアミノ酸残基で置き換えられたものである。核酸および／またはポリペプチド配列は、本明細書に記載されるように、改変されて、増大した発現（例えば、転写および／または翻訳）、より厳格な調節、脱制御、異化代謝産物抑制の消失、改変された特異性、分泌、熱安定性、溶媒安定性、酸化的安定性、プロテアーゼ耐性、触媒活性、および／または色を含むが、これらに限定されない１種または複数の性質が改善され得る。

本明細書において使用する「単離された」核酸分子とは、単離された核酸がそこから誘導された生物体のゲノム中の核酸の一端または両端に天然で側面に位置する配列（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されたｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡフラグメント）を含まない核酸分子である。そのような単離された核酸分子は、操作の便宜のために、または下でさらに詳細に論ずる融合核酸分子を発生させるために、ベクター（例えば、クローニングベクター、または発現ベクター）中に一般的に導入される。それに加えて、単離された核酸分子は、組換えまたは合成核酸分子などの操作された核酸分子を含むことができる。

核酸は、当技術分野における日常的技法を使用して単離することができる。例えば、核酸は、限定されないが、組換え核酸技法、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ技法は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.に記載されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消化および連結を含み、それらは核酸を単離するために使用することができる。単離された核酸は、単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。

ポリペプチドは、天然資源（例えば、生物学的試料）からＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの知られた方法により精製することができる。ポリペプチドは、例えば、発現ベクターで核酸を発現させることにより精製することもできる。それに加えて、精製されたポリペプチドは、化学的合成により得ることもできる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定することができる。

核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）を含有する構築物またはベクターも提供される。発現構築物またはベクターを含む構築物またはベクターは、市販されているか、または当技術分野における日常的組換えＤＮＡ技法により産生することができる。核酸を含有する構築物またはベクターは、そのような核酸と作動的に連結している発現要素を有することができて、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードするものなどの配列をさらに含むことができる。核酸を含有する構築物またはベクターは、キメラまたは融合ポリペプチド（即ち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにあり得る異種ポリペプチドと作動的に連結しているポリペプチド）をコードすることができる。代表的異種ポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製で使用することができるものである（例えば、６×Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））。

発現要素は、核酸をコードする配列の発現を指示および調節する核酸配列を含む。発現要素の１例は、プロモーター配列である。発現要素は、イントロン、エンハンサー配列、応答要素、または核酸の発現をモジュレートする誘導性要素も含むことができる。発現要素は細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、またはウイルスが起源であってもよく、ベクターは異なる起源由来の要素の組合せを含有することができる。

本明細書に記載されるベクターは、宿主細胞に導入することができる。本明細書において使用する「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を指し、ベクターを担持するそのような細胞の子孫も含む。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞の細胞であり得る。例えば、核酸は、大腸菌（E. coli）などの細菌の細胞中、または昆虫細胞中、酵母または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など）で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に知られている。インビボおよびインビトロの両方で核酸を宿主細胞に導入する多くの方法が、当業者に周知であり、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、ヒートショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸移入を含むが、これらに限定されない。

核酸は、任意の数の増幅技法（例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；および米国特許第４，６８３，１９５号明細書；第４，６８３，２０２号明細書；第４，８００，１５９号明細書；および第４，９６５，１８８号明細書を参照されたい）をオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の適当な対と共に使用して検出することができる。最初のＰＣＲへの多くの改変が開発されて、核酸を検出するために使用することができる。

核酸は、ハイブリッド形成を使用して検出することもできる。核酸間のハイブリッド形成は、Sambrook et al. （1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sections 7.37-7.57, 9.47-9.57, 11.7-11.8, and 11.45-11.57）に詳細に論じられている。Ｓａｍｂｒｏｏｋらは、約１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブのために適当なサザンブロット条件を開示している（Sections 11.45-11.46）。長さが１００ヌクレオチド未満の配列と第２の配列との間のＴｍは、Section 11.46で提供された式を使用して計算することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋらは、それに加えて、約１００ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドプローブのためのサザンブロット条件も開示している（Sections 9.47-9.54を参照されたい）。長さが１００ヌクレオチドを超える配列と第２の配列との間のＴｍは、ＳａｍｂｒｏｏｋらのSections 9.50-9.51で提供された式を使用して計算することができる。

核酸を含有する膜が、予備ハイブリッドおよびハイブリッドされる条件、ならびに核酸を含有する膜が過剰のおよび非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄される条件は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーにおいて有意義な役割を演じ得る。そのようなハイブリッド形成および洗浄は、中程度のまたは高いストリンジェンシー条件下で、必要に応じて実施することができる。例えば、洗浄条件を、洗浄溶液中の塩濃度を下げることによりおよび／または洗浄が実施される温度を上げることにより、さらに厳格にすることができる。単に例として、高いストリンジェンシー条件は、典型的には、６５℃における０．２×ＳＳＣ中の膜の洗浄を含む。

それに加えて、ハイブリッド形成量の読み取りは、例えば、標識されたオリゴヌクレオチドプローブの特異的活性、プローブがハイブリッドしたテンプレート核酸上のプローブ−結合部位の数により、およびオートラジオグラフの露出または他の検出媒体の量により影響され得る。任意の数のハイブリッド形成および洗浄条件を、プローブの核酸分子の固定化された目標核酸に対するハイブリッド形成を検査するために使用することができるが、同一のハイブリッド形成、洗浄、および露出条件下でプローブの目標核酸に対するハイブリッド形成を検査することがより重要であることは、当業者により容易に認識されるであろう。目標核酸は同じ膜上にあることが好ましい。

核酸分子は、核酸に対するハイブリッド形成が、別の核酸に対するハイブリッド形成の少なくとも５倍（例えば、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍）を超えれば、ある核酸とハイブリッドを形成しているのであって別の核酸とはハイブリッドを形成していないと考えられる。ハイブリッドの形成量は、膜上で直接または、例えば、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒまたはＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用するオートラジオグラフから定量することができる。

ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出する技法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈殿法および免疫蛍光法が含まれる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して生成させることができる。抗体は、当技術分野において知られた方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体の支持体に付着させることができる。ポリペプチドの存在下で、抗体−ポリペプチド複合体が形成される。

検出（例えば、増幅生成物、ハイブリッド形成複合体、またはポリペプチドの検出）は、通常、検出可能な標識を使用して達成される。用語「標識」は、直接標識ならびに間接標識の使用を包含することが意図される。検出可能な標識には、酵素、補欠分子族、蛍光性材料、発光性材料、生物発光材料、および放射性材料が含まれる。

選択のための配列を欠く（即ち、選択可能なマーカーを欠く）株を発生させるために使用することができる方法が、本明細書に記載される。これらの方法は、環状のプラスミドＤＮＡベクターおよび線状ＤＮＡ配列の使用を含み；環状のプラスミドＤＮＡベクターは、選択マーカーおよびＤＮＡの複製起点（自律的に複製する配列（ＡＲＳ）としても知られる）を含有し、線状ＤＮＡ配列は、相同性組換えによりピキア（Pichia）のゲノム中に組み込むための配列を含有する。それに加えて、線状ＤＮＡ分子は、１種または複数の関心のあるタンパク質、例えば、限定されないが、ヘムが結合したＬｅｇＨ、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、低分子、例えば、エタノール、乳酸、ブタノール、アジピン酸またはコハク酸などの産生経路に関与する１種または複数の酵素、または任意のそのようなタンパク質に対する抗体をコードする核酸配列を含むことができる。

ピキア（Pichia）細胞は、ＤＮＡ分子および環状のプラスミド上の選択可能なマーカーの存在により選択された形質転換体の両方により形質転換され得る。次に、線状ＤＮＡ分子をゲノムに組み込むために、形質転換体を、例えばＰＣＲを使用して選別することができる。マーカーを含まない線状ＤＮＡ分子が正しく組み込まれた形質転換体が同定されたら、細胞は、環状のプラスミドのための選択の不在下で成長され得る。マーカーを担持するプラスミドは、選択の不在下では安定に維持されないので、該プラスミドは、選択が緩和された後しばしば非常に速やかに消失する。生じた株は、選択のための異種配列の不在下で組み込まれた線状ＤＮＡを担持する。それ故、この手法は、組換えタンパク質収率に対する影響が殆どないし全くなしで、選択可能なマーカー（例えば、異種選択マーカー）を欠くピキア（Pichia）株を構築するために使用することができる。

本発明により、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、生化学的技法および組換えＤＮＡ技法が使用され得る。そのような技法は、文献で十分に説明されている。本発明を、以下の例でさらに説明することにするが、これらの例は、請求項に記載された方法および組成物の範囲を限定しない。

パートＡ 材料および方法

実施例１ ポリメラーゼ連鎖反応
ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡテンプレートから関心のある遺伝子を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。簡単に説明すると、各々０．６μＭのフォワードおよびリバースプライマーを、１〜２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、１０〜５０ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび４００μＭのヌクレオチドの混合物とインキュベートする。反応条件は以下のようであった。

実施例２ 連結によるプラスミド構築
５０〜１００ｎｇの制限酵素で消化されたプラスミドおよび３×モル過剰のＰＣＲで増幅された挿入物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）の存在下でインキュベートした。連結を１６℃で２時間を超える間実施した。２μｌの連結反応物はＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）細胞に形質転換された。

実施例３ 大腸菌（E. coli）ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性コンピテント細胞への形質転換
１．５〜２μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３−０１５）に、１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用する電気穿孔により、１ｍｍギャップキュベット（ＢｉｏＲａｄ、カタログ＃１６５−２０８９）を使用して形質転換した。パルスの後１ｍｌのＳＯＣを細胞に加えて、細胞を３７℃で１時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬＢ寒天プレート上にプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。

実施例４ Ｐ．パストリス（P. pastoris）への形質転換のためのプラスミドＤＮＡの線状化
プラスミドＤＮＡを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中のＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０５６０Ｌ）で１〜４時間３７℃、または１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中のＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１２３Ｌ）で１〜４時間５０℃のいずれかで消化した。線状化されたプラスミドを、０．８％アガロースゲルからＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。

実施例５ Ｐ．パストリス（P. pastoris）形質転換コンピテント細胞の調製
Ｐ．パストリス（P. pastoris）の選択された株を、２５ｍｌのＹＰＤ培地中で中期指数期の成長相（約２ＯＤ）に成長させた。細胞を９３０×ｇで１５分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを８０％ＹＰＤおよび２００ｍＭ ＨＥＰＥＳの２ｍｌの溶液（ｐＨ６．８）中に再懸濁させた。７５μｌの１Ｍ ＤＴＴを加えた。再懸濁された細胞ペレットを１００ｒｐｍ、３０℃で２５分間混合した。４０ｍｌの体積の氷冷滅菌水を懸濁液に加えて、細胞を１１２５×ｇで１５分間遠心分離することにより収集して氷上に置いた。細胞ペレットを、４０ｍｌの氷冷水中に再懸濁させて収集した後、２回の洗浄ステップを追加した。次に、細胞ペレットを、２０ｍｌの氷冷１Ｍソルビトール中に再懸濁して、前のように遠心分離により収集した。最終の細胞ペレットを、０．３ｍｌの氷冷、滅菌ソルビトール中に懸濁させて等分し、−８０℃で凍結させた。

実施例６ Ｐ．パストリス（P. pastoris）への形質転換
３０〜１００ｎｇの線状化されたプラスミドＤＮＡを、３０μｌのエレクトロコンピテントＰ．パストリス（P. pastoris）細胞に、１ｍｍギャップのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して１．１５ｋＶに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて形質転換した。１ｍｌのＹＰＤ／１Ｍソルビトールを加えて細胞と１：１比で混合した。細胞を３時間３０℃、１００ｒｐｍで振盪しながら回復させた。１００μｌの回復混合物を、適当な抗生物質を含有するＹＰＤプレートにプレートして、細胞の残りを適当な抗生物質を含むＹＰＤプレートにプレートした。プレートを、３０℃で４８時間インキュベートした。最初の形質転換プレートを、適当な抗生物質を含むＹＰＤプレート上に画線して、プレートを４８時間３０℃でインキュベートした。個々のクローンを抗生物質を含むＹＰＤプレート上にパッチ状に付けて、パッチを使用してコロニーＰＣＲまたはゲノムＤＮＡ調製を行い、染色体への組込みを確認して、さらに分析するために該株を振盪フラスコ中で成長させた。

実施例７ ＬｅｇＨの産生のための振盪フラスコ中における培養物の成長
新鮮パッチからの株を、成長培地ＢＭＧＹ（０．７５％グリセロールで補完されたＢＭＹ）に接種して、終夜３０℃、２００ｒｐｍで振盪して成長させた。翌日、ＬｅｇＨの発現を、ＯＮ培養物を０．１ｍＭクエン酸アンモニウムＦｅ（ＩＩＩ）で補完されたＢＭＭＹ培地（ＢＭＹ＋１％メタノール）で希釈することによりメタノールで誘導した。培養物をＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで成長させた。消泡剤を最終の濃度が０．０１％になるまで加えた。培養物を合計で７２時間成長させ；培養物にメタノールを、２４時間毎に振盪フラスコ体積の１／１０の１０×ＢＭＭＹ培地（ＢＭＹ＋１０％メタノール）を加えることにより補完した。細胞を、誘導された成長の７２時間後に遠心分離により収穫した。

実施例８ 振盪フラスコ培地
ＢＭＹ培地は、１０ｇの酵母抽出物および２０ｇのソイトンを７９０ｍｌの水に溶解することにより調製した。該混合物をオートクレーブにより滅菌して、室温に冷却した。１００ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および１００ｍｌのアミノ酸を含まない１０×酵母窒素ベース（１００ｍＬ当たり１３．４ｇのＹＮＢ粉末；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を濾過滅菌して（０．２μｍ孔径のＰＥＳ）該培地に加えた。ｐＨ調節の必要はない

以下の成分を水に溶解して、オートクレーブで滅菌した。

実施例９ 発酵培地および仕込み
下に示した成分を溶解して体積を水で調節した。成分はＦＣＣ食品規格であるかまたは同等であった。培地をオートクレーブにより、その場でスチーム処理することにより、または同等の手段により滅菌した。

滅菌後、培地は室温に冷えるに任せて、以下の成分を追加した。

微量金属ＰＴＭ１溶液は、Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから粉末化された混合物（カタログ番号４０５２−Ａ−Ｂ−１Ｌ）として入手できる。ポーチＡおよびポーチＢを９５０ｍＬの水中で混合して、５ｍＬの硫酸を添加した。若干の沈殿が混合で予想され；混合物を濾過滅菌して（０．２μｍ孔径のＰＥＳ）、４℃で暗所に貯蔵した。

あるいは、微量金属ＰＴＭ１は、以下のように作製することもできる。

成分を一緒に混合して濾過滅菌し、室温で貯蔵する。１７．５ｇのＡｍｂｅｒＦｅｒｍ４０００を３２０ｍＬの水と混合して攪拌し溶解させることにより、グリセロール供給混合物を調製した。水とＡｍｂｅｒｆｅｒｍの混合物を８５０ｇのグリセロールに加えて激しく攪拌することにより十分に混合した。該供給混合物をオートクレーブにより滅菌した。

メタノールの供給は、１２ｍＬ／ＬのＰＴＭ１溶液で補完された９９〜１００％メタノールを使用して行なった。

実施例１０ 実験室規模の高酸素移動発酵のためのプロトコル
播種振盪フラスコのプロトコル
無菌バイオセーフティフード中で、低浸透圧モル濃度培地とＢＭＹを、９：１の低オスモ：ＢＭＹ比で混合した。グリセロールを、１２．５ｇ／Ｌの濃度で培地に加えた。ＵＳＰ食品規格のグリセロール／グリセリン（５０％ｖ／ｖ（６３％ｗ／ｗ）グリセロール／水溶液中９９．７％の純度）を使用して、オートクレーブ滅菌した。Ｓｉｇｍａ２０４または同等の消泡剤を培地に０．２５ｍＬ／Ｌの濃度で加えた。グリセロール播種バイアルを取り出して、７０％ＩＰＡまたはエタノールで外側に噴霧し、バイオセーフティフード内で約５分間室温で解凍した。遮壁板付き振盪フラスコにグリセロール播種バイアルで接種した；１ｍＬの接種原バイアルを１Ｌの振盪フラスコ培地毎に使用した。培養物を３０℃で２４時間振盪（１インチの振り（１”throw）で２００ＲＰＭ）しながら成長させた。実際の培地体積：名目上の振盪フラスコ体積の比は１：１０と１：５の間を使用した。名目上２．８Ｌの体積のフラスコに２５０から５００ｍＬの培地を入れて、定型的手順で首尾よく使用した。２４時間成長させた後６００ｎｍにおけるＯＤを測定した。ＯＤが１５以上であった場合に、培養物を発酵槽に接種するために使用した。ＯＤが１５未満であった場合には、培養物をさらに１〜２時間成長させてからＯＤを再び決定した。１５のＯＤが１５から３０時間後に到達されなかった場合には、その播種フラスコは不成功であったとみなした。

発酵のプロトコル
発酵培地および供給材料は、本明細書に記載したように調製した。初期体積は、最大発酵槽体積の約４０％、例えば、発酵槽の最大実効体積が１０Ｌであれば４Ｌであるべきである。これは、プロセスが発酵の終期までに最大実効体積に近づくであろうからである。発酵槽は、振盪フラスコ播種で発酵槽に対して１０％接種原の比で接種され、例えば、４Ｌの初期培地が発酵槽中に存在すれば、発酵槽は、約０．４Ｌの振盪フラスコ播種により接種される。この時点における発酵槽中の合計体積をＴ０体積と称し、例えばこの代表的例では４．４Ｌである。プロセス制御は以下の条件を含む：３０℃の温度；２０％飽和設定点を維持するために攪拌−給気カスケードにより導かれる溶存酸素制御；および２８％ＮＨ_４ＯＨの添加により導かれるｐＨ制御、設定点は、プロセスの相に依存するであろう。

バッチ相（接種からグリセロールの消耗まで、ＤＯスパイクにより示される）：溶存酸素のＰＩＤ制御の応答性に依存して、攪拌−給気速度における強いＤＯスパイクもしくは急速な低下または両方の組合せは、細胞が培地中に存在するグリセロールを消費し尽くしたときに観察され得る。供給されるバッチ相は、このことが起こるときに開始される。バッチ相の持続時間は、約２０時間であるが、２４時間までが許容されると考えられる。ｐＨ設定点は５．０である。バッチ相の終期における湿潤細胞重量は、約２２０ｇ／Ｌであろう。

供給されるバッチ相：グリセロールの供給が開始されて、Ｔ０体積に基づいて１２〜１４ｇ／Ｌ／時間の無希釈のグリセロールに達する。供給速度（federate）は、約３５０ｇ／Ｌ湿潤細胞重量に達するまで維持されて、それには、約７〜１０時間を要するであろう。ｐＨ設定点は５．０である。

移行相：試料は、移行相を開始する前に採取される。メタノール供給は、開始されて、発酵ブロス中でメタノール濃度が１〜２ｇ／Ｌに達するまで、Ｔ０体積に基づいて無希釈のメタノールの１ｇ／Ｌ／時間を達成した。発酵の残りの間、ブロス中で０．２５〜１ｇ／Ｌのメタノール濃度を維持するように、メタノール供給速度を調節した。グリセロール供給速度（federate）は、２時間の過程を通じて、Ｔ０体積に基づいて１２〜１４ｇ／Ｌ／時間から８〜９ｇ／Ｌ／時間の無希釈グリセロールに直線的に減少した。供給速度における２０分毎の段階的減少も同様に許容されるであろう。ｐＨ設定点は、３．５に変えられて、発酵は新しい設定点に自然に（即ち、酸の添加なしで）調節されることが可能になった。

産生相（グリセロール供給の削減の終わりから発酵の終わりまで）：ｐＨ設定点は３．５であった。発酵ブロス中でメタノール濃度を０．２５〜１ｇ／Ｌに維持した。グリセロールの供給速度を、Ｔ０体積に基づいて８〜９ｇ／Ｌ／時間の無希釈のグリセロールに維持した。試料を約１２時間毎に採取した。試料を４℃で４０００から７０００ＲＣＦでスピンし、上清をデカントした。上清を分離管に取っておいた。各時点におけるペレットおよび５ｍＬの上清の３つの試料を−８０℃で凍結した。容器のための最大給気および攪拌速度でさえ、産生中１５〜２０％ＤＯが維持できないならば、グリセロール供給速度をＴ０体積に基づいて５ｇ／Ｌ／時間の無希釈グリセロールまで低下させることができる。発酵は、接種後６０時間で終了した。１０００Ｌの規模では、収穫プロセスは、原料供給および給気を停止すること、ブロスを８℃に冷却すること、シャープレスまたはディスクスタック遠心分離機を使用してペーストを濃縮することからなった。収穫には、通常約５〜１０時間かかり、検出可能な生成物の品質低下を招かない。実験室規模については、３×５ｍＬの試料に加えて、最後に追加の５０ｍＬ試料を収集すれば十分である。湿潤細胞重量は＞４５０ｇ／Ｌであり、より白色に見えた予備的導入試料からスピンしたペレットに対して、スピンしたペレットはピンクに見えた。白色からより顕著なピンクへのブロスの色変化は、誘導の約６〜１２時間の後で始まった。

パートＢ 産生株の構築
産生株ＭＸＹ０１８３
実施例１１ ヘム生合成経路の各酵素のｐＧＡＮまたはｐＧＡＺ組込み型ベクターへのクローニング
ｐＧＡＮ（天然の選択マーカーを有する）およびｐＧＡＺ（ゼオシン選択マーカーを有する）を、Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。各遺伝子をＡＯＸ１プロモーターの制御下に置いて、ＦＤＨターミネーターを各遺伝子の停止コドンの直後に置いた。ヘム生合成経路中の遺伝子を、野性型Ｐ．パストリス（P. pastoris）株からＰＣＲで増幅させるかまたは前の構築物からサブクローニングした。

ヘムの生合成に関与する酵素を含むヘム生合成経路を図１に示す。ヘムの生合成中に産生される中間体を囲みの中に示し、酵素が触媒する各ステップを右に示す。Ｓ．セレビジアエ（S.cerevisiae）で示される律速の酵素ステップは、下線付きで示す。

ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼおよびＰＰＧオキシダーゼ遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩによる認識のための部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。オリゴヌクレオチドはＥｌｉｍＢｉｏｐｈａｒｍにより合成された。

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を、ゲノムＤＮＡからの遺伝子を増大させるために使用した。ＰＣＲ生成物は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製され、ＤＮＡを２５μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。ベクターＤＮＡ、ｐＧＡＺおよびｐＧＡＮ、およびＰＣＲ生成物を、ＢｓａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０５３５Ｓ）を用いて５０μｌの反応体積中、３７℃で消化した。

線状化されたベクターおよび消化されたＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースゲルからＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ＃Ｄ４００２）を使用して精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して終夜１６℃で１０μｌ中で生じさせた。

ＰＢＤおよびフェロキラターゼ遺伝子を、前に構築されたプラスミドからサブクローニングした。ｐＪＡＺ＿ＰＢＤは、ＢｓｔＢＩ（Ｂｓｐ１１９Ｉ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０１２４）およびＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０５９６）を用いて、１×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液中５分間３７℃で消化した。ｐＪＡＺ＿ Ｆｅｒｒｏｃｈは、ＭｆｅＩ（ＭｕｎＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０７５３）およびＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０５９６）を用いて１×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液中５分間３７℃で消化した。

消化された生成物を、０．８％アガロースゲルからＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ＃Ｄ４００２）を使用して精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。

連結反応を、１６℃で終夜Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、１０μｌの反応で生じさせた。

１．５μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３〜０１５）に１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔により形質転換し、細胞を、１ｍｌのＳＯＣ中で１時間２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。１０μｌの回収された混合物を、アンピシリンを濃度１００μｇ／ｍｌで含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。コロニーを、挿入物の存在についてコロニーＰＣＲによって選別した。遺伝子の配列を確認した。

実施例１２ Ｐ．パストリス（P. pastoris）ｍｕｔＳゲノムに組み込むためのプラスミドにおけるヘム生合成遺伝子の組み立て
全カセット「プロモーター遺伝子ターミネーター」を、ピキア（Pichia）ゲノムに組み込むためのプラスミドを組み立てるために、制限エンドヌクレアーゼのための部位を含有するプライマーでＰＣＲ増幅した。

ｐＧＡＮプラスミド（ｐＭｘ３２７）におけるＰａｏｘ１＿ＵＰＳ＿ＦＤＨｔｅｒｍ−Ｐａｏｘ１＿ＵＰＤ＿ＦＤＨｔｅｒｍ−Ｐａｏｘ１＿ＣＰＯ＿ＦＤＨｔｅｒｍの組み立て
ｐＧＡＮ−ＣＰＧオキシダーゼ（ｐＭｘ３１２）をＵＰＳおよびＵＰＤカセットをクローニングするためのベクターとして使用した。ＵＰＧＩＩＩシンターゼカセットを、ｐＭｘ３１０から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＮｈｅＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。

ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットを、ｐＭｘ３１１から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＳｐｈＩおよびＡｇｅＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を使用してプラスミドからＤＮＡを増幅した。

得られたＰＣＲ生成物を、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製し、ＤＮＡを２５μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。

ベクターとして指定されたｐＧＡＮ−ＣＰＧオキシダーゼ（ｐＭｘ３１２）を、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中でＮｈｅＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）およびＡｇｅＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。

ＵＰＧＩＩＩシンターゼカセットのＰＣＲ生成物を１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中でＮｈｅＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）およびＳｐｈＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１８２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。

ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットＰＣＲ生成物を１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中でＳｐｈＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１８２Ｓ）およびＡｇｅＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。

消化されたベクターおよびＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースからＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。

ＮｈｅＩ−ＳｐｈＩで消化されたＵＰＧＩＩＩシンターゼカセット、ＳｐｈＩ−ＡｇｅＩで消化されたＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットおよびＮｈｅＩ−ＡｇｅＩで消化されたベクターの間の３方連結を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、１０μｌ中に１６℃で終夜生じさせた。

１．５μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３−０１５）に１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔により形質転換し；細胞を３７℃で、１ｍｌのＳＯＣ中で１時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。コロニーを、挿入物の存在を求めてコロニーＰＣＲにより選別した。ベクターと挿入物間の接合部の配列を確認した。

Ｐａｏｘ１＿ＡＬＡシンターゼ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ．−Ｐａｏｘ１＿ＰＰＧオキシダーゼ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ−Ｐａｏｘ１＿Ｆｃ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ．−Ｐａｏｘ１＿ＰＢＤ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍカセット（ｐＭｘ３３０）の組み立て
ａ．遺伝子カセットのＰＣＲ増幅
ＡＬＡシンターゼカセットを、ｐＭｘ３１０から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。

ＰＰＧオキシダーゼカセットを、ｐＭｘ３１３から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＸｈｏＩおよびＡｆｌＩＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。

フェロキラターゼカセットを、ｐＭｘ３２３から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。

Ｇ４１８マーカーを、Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓから購入したｐＪＡＧプラスミドから、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を、プラスミドからのＤＮＡを増幅するために使用した。ＰＣＲ生成物を得て、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製し、ＤＮＡを２５μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。

ｂ．ベクターの調製
ｐＧＡＺ−ＰＢＤ（ｐＭｘ３２１）と称するベクターを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ中でＮｈｅＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）およびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１４６Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。

ｐＧＡＺ−ＡＬＡｓｙｎ．−ＰＢＤ（ｐＭｘ３２８）は、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１中でＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１９８Ｓ）およびＢｂｖＣＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０６０１Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。

ｐＧＡＧ−ＡＬＡｓｙｎ−ＰＢＤ（ｐＭｘ３３２）は、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ中でＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１４６Ｓ）およびＡｇｅＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。

ｃ．中間構築物の作製および最終のカセットの組み立て
消化されたベクターおよびＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースからＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。

ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＧＡＺ−ＰＢＤ（ｐＭｘ３２１）ベクターを、同じ酵素で消化されたＡＬＡシンターゼカセットのＰＣＲ生成物と、１６℃で終夜１０μｌの反応で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して連結し、ｐＧＡＺ−ＡＬＡｓｙｎ．−ＰＢＤプラスミド（ｐＭｘ３２８）を得た。

ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩ−ＨＦ制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＧＡＧ−ＡＬＡｓｙｎ−ＰＢＤ（ｐＭｘ３３２）を、ＸｈｏＩ、ＡｆｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ制限エンドヌクレアーゼで消化されたＰＰＧオキシダーゼカセットおよびフェロキラターゼカセットＰＣＲ生成物と対応して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、３方連結反応で連結して、ｐＧＡＧ−ＡＬＡシンターゼ＿ＰＰＧオキシダーゼ＿Ｆｃ＿ＰＢＤ（ｐＭｘ３３０）を得た。

１．５μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３〜０１５）に、１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔により形質転換して；細胞を、１ｍｌのＳＯＣ中３７℃で１時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。コロニーを、挿入物の存在についてコロニーＰＣＲにより選別した。ベクターと挿入物間の接合部の配列を確認した。

実施例１３ 遺伝子カセットを有する線状化されたプラスミドのＰ．パストリス（P. pastoris）Ｂｇ１１ゲノムへの組込み
産生株ＭＸＹ０１８３を発生させるために使用されたプラスミドを、図２に示す。産生株ＭＸＹ０１８３を導いた改変をするためにとられたステップを図３に描く。

Ｐ．パストリス（P. pastoris）のＢｇ１１ゲノムに導入されるべき第１の酵素はＡＬＡＤであった。ｐＡＯＸ１に推進されるＡＬＡＤを含有するプラスミド（ｐＭＸ２２９、図２ｉおよび図３）を、ＰｍｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）を使用して線状化した。線状化されたプラスミドを、記載されたように０．８％アガロースゲルから精製して、天然のＡＯＸ１遺伝子座位における相同性組換えを使用して、Ｐ．パストリス（P. pastoris）に形質転換し、株ＭＸＹ０９９を発生させた（図３）。

ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下のダイズＬｅｇＨ遺伝子（Ｐ．パストリス（P. pastoris）のために最適化された配列；配列番号：３）の２つのコピーを含有するｐＭＸ２８２と称するプラスミド（図２ｉｉおよび図３）を、ＳｆｉＩ制限酵素を使用して線状化した。線状化されたプラスミドを、記載されたように０．８％アガロースゲルから精製し、ＡＬＡＤを含有するＰ．パストリス（P. pastoris）株に形質転換して、株ＭＸＹ０１１８を発生させた（図３）。ｑＰＣＲを使用して、株ＭＸＹ０１１８は、恐らく組換え時におけるプラスミドｐＭＸ２８２のコンカテマー化（concatamerization）に基づいて、ＬｅｇＨ遺伝子の数個のコピーを含有することを決定した。

ＡＯＸ１プロモーターの制御下のウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ（ＵＰＳ）、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ＵＰＤ）およびコプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯ）（それぞれ、ステップ４、５および６を触媒する酵素）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＸ３２７（図２ｉｉｉおよび図３）を、ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化し、ＭＸＹ０１１８に導入して、株ＭＸＹ０１７０を得た（図３）。

Ｐ．パストリス（P. pastoris）ゲノムからのＡＬＡシンターゼ（ＡＬＡＳ）、プロトポルフィリンＩＩＩオキシダーゼ（ＰＰＯ）、フェロキラターゼ（ＦＣ）およびポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＤ）（それぞれ、ステップ１、７、８および３を触媒する酵素）をコードする遺伝子を、プラスミドｐＭＸ３３０上で組み立てた（図２ｉｖおよび図３）。ｐＭＸ３３０をＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化し、ＭＸＹ０１７０に形質転換させて、株ＭＸＹ０１８３の発生に導いた（図３）。ＭＸＹ０１８３の遺伝子型は、ＰＣＲおよびｑＰＣＲを使用して確認した。
産生株ＭＸＹ０２０７

実施例１４ ｐＧＡＢ発現ベクターの構築
ｐＧＡＢ発現ベクター（図４Ａ）を、ｐＧＡＺベクター（ＢｉｏＧｒａｍｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中のゼオシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを、抗生物質ブラスチシジンＳを有するプラスミドを担持する形質転換体の選択を可能にする、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）からのブラスチシジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子からのオープンリーディングフレームで置き換えることにより構築した。

ＢＳＤオープンリーディングフレームを、商業的に合成されたＤＮＡ分子から、オリゴヌクレオチドプライマーＭｘＯ０４７６およびＭｘＯ０４７７を使用して、本明細書に記載した高い信頼性のあるポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。

ＢＳＤＰＣＲ生成物を、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の１％アガロースゲルでゲル電気泳動によりにより精製し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して可視化した。所望のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取り、ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して回収した。

精製されたＢＳＤＰＣＲ生成物およびｐＧＡＺベクターを、各１０単位のＭｌｕＩおよびＢｂｖＣＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて、１時間３７℃で、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５℃でｐＨ７．９）中で消化した。消化されたＤＮＡ生成物を、上記のようにゲル電気泳動により回収した。

精製された、ＭｌｕＩおよびＢｂｖＣＩで消化されたＢＳＤ生成物およびｐＧＡＺベクターを、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．５）中２０μｌの反応で、１６℃で２時間２０μｌの反応でインキュベートした。エレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）のＤＨ１０Ｂ細胞を２μｌの連結反応で形質転換して、抗生物質耐性の形質転換体を１００μｇ／μｌのアンピシリンで補完されたＬＳＢ寒天プレート上で選択した。

実施例１５ Ｍｘｒ１発現ベクターの構築
Ｍｘｒ１発現ベクターｐＭｘ３５４を、Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームをｐＧＡＢベクターに導入することにより構築した（図４Ｂ）。該Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのメタノール誘導性アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの直ぐ下流で翻訳開始して、Ｐ．パストリス（P. pastoris）ＦＤＨ１遺伝子からの転写ターミネーター配列が直ぐ続く翻訳停止シグナルを有する、ｐＧＡＢに挿入された。

Ｍｘｒ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、ＢｉｏＧｒａｍｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得たピキア・パストリス（Pichia pastoris）株Ｂｇ１１ＭｕｔＳから単離されたゲノムのＤＮＡから増幅した。Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームは、Ｐ．パストリス（P. pastoris）のゲノムのＤＮＡから、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の側面に位置して付け加えられたプライマーＭｘＯ０４９５（ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴＧ（配列番号：４５））およびＭｘＯ０４９６（ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣＧＧＴＴ（配列番号：４６））を用いて増幅した。増幅は本明細書に記載されたポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成した。

増幅されたＭｘｒ１ＰＣＲ生成物およびｐＧＡＢベクターを、１０単位のＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１時間３７℃、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５℃でｐＨ７．９）中で消化した。消化に続いて、ＮｏｔＩで消化されたｐＭｘ３５２ベクターを、５単位のＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により１５分間３７℃で、１×Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液（５０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ_２、２５℃でｐＨ６）中において処理した。

ＮｏｔＩで消化されて増幅されたＭｘｒ１フラグメントおよびｐＭｘ３５２ベクターを、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の１％アガロースゲルで電気泳動により分離して、ＳＹＢＲ ＳＡＦＥ ＤＮＡゲル染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して可視化した。所望のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取って、該ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して回収した。

Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームを含有するＮｏｔＩで消化されたフラグメントを、ｐＧＡＢ中に、ＡＯＸ１プロモーターの直ぐ下流のＮｏｔＩ部位で連結することにより導入した。Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームをコードする１３７ｎｇのＮｏｔＩで消化されたＤＮＡおよび６０ｎｇのＮｏｔＩで消化されてホスファターゼ処理されたｐＭｘ３５２を含有する混合物を、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．５）中２０μｌの反応で、１６℃で２時間２０μｌの反応でインキュベートした。エレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ細胞を２μｌの連結反応で形質転換して、抗生物質耐性形質転換体を１００μｇ／μｌアンピシリンで補完されたＬＳＢ寒天プレート上で選択した。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。コロニーを、挿入物の存在についてプライマーＭｘＯ０４９５およびＭｘＯ０４９６を使用するＰＣＲにより選別した。最終のベクターの配列をＤＮＡ配列により確認した。

クローニング中に、Ｍｘｒ１のＮ末端に６個の追加のアミノ酸を導入した。Ｍｘｒ１のオープンリーディングフレームを「核酸配列」の項で示し、クローニングからの残留アミノ酸は下線付きで示す。追加の６個のアミノ酸をＮ末端に有するＭｘｒ１配列を含有するピキア（Pichia）産生株と野性型Ｍｘｒ１（即ち、追加の６個のアミノ酸をＮ末端に有しない）を含有するピキア（Pichia）株は、発酵槽中で区別がつかなかった。

実施例１６ 天然のＭｘｒ１発現ベクターの構築
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下にＭｘｒ１転写制御因子遺伝子を含有するｐＭＸ３５４と称するプラスミドを、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＡＯＸ１プロモーターの３’端部、ＬｅｇＨのオープンリーディングフレーム、およびＡＯＸ１ターミネーターを、ｐＭＸ３５４から、下に示すプライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６４７を使用して増幅した。ＡＯＸ１ターミネーター、リンカーおよびＡＯＸ１プロモーターの５’端部を、ｐＭＸ３８２からプライマーＭｘＯ０６１８およびＭｘＯ０６４６を使用して増幅した。

ＰＣＲ生成物を得て、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５を使用して精製し、ＤＮＡを１２μｌのＨ_２Ｏに溶出させた。次に、精製されたＰＣＲ生成物を組み合わせて、プライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６１８を使用するＰＣＲ増幅の次の回のためのテンプレートとして使用した。生じたＰＣＲ生成物は、ＡＯＸ１プロモーターの３’端部、それに続くＭｘｒ１オープンリーディングフレーム、ＡＯＸ１ターミネーター、短いリンカー配列、およびＡＯＸ１プロモーターの５’端部で構成された。ＰＣＲ生成物は、本明細書に記載されるように得られて精製された。精製されたＰＣＲ生成物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｋ２８００−２０）を使用してｐＣＲ（商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングして、ｐＭＸ４０２ベクターを創り出した。

実施例１７ Ｐ．パストリス（P. pastoris）株ＭＸＹ０２０６およびＭＸＹ０２０７の構築
ｐＭｘ３５４Ｍｘｒ１発現ベクター（図４Ｂ）を、ＤＮＡ形質転換によりＭＸＹ０１８３株に導入した（図３）。

ｐＭｘ３５４ベクター（１．５μｇ）を、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中で２０単位のＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１時間３７℃で消化することにより、ＡＯＸ１プロモーター配列中における固有のＰｍｅＩ部位で線状化した。

ＰｍｅＩで消化されたｐＭＸ３５４ベクターを、ゲル電気泳動により精製し、上記のＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキットを使用して回収した。線状化されたｐＭＸ３５４ベクターを、株ＭＸＹ０１８３に形質転換により導入して、ブラスチシジン含有培地で選択した。２つの独立のクローンが形質転換から得られて、それらをＭＸＹ０２０６およびＭＸＹ０２０７と命名した。これらの株中でＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるＭｘｒ１の追加のコピーの存在をＰＣＲにより確認した。

産生株ＭＸＹ０２９１
実施例１８ 株ＭＸＹ０２１３およびＭＸＹ０２６０の構築
図５は、ヘム生合成経路の７種の酵素を含有し、抗生物質マーカーを含まない株ＭＸＹ０２１３を構築するためにとられるステップを示す。各端部にｐＡＯＸ１プロモーターに相同性を有するｐＡＯＸ１下の変形体Ｍｘｒ１（Ｎ末端に６個の余分のアミノ酸）を含有するＤＮＡの線状部分を、共形質転換を使用して導入した（図５および図６ｉ）。この線状Ｍｘｒ１発現カセットを、ｐＩＬ７５プラスミドを用いて形質転換によりピキア（Pichia）株ＭＸＹ２１３中に同時に導入した。ｐＩＬ７５ベクターは、形質転換された細胞のゲノム中への組込みなしに、該プラスミドベクターを維持することを可能にするｐａｎＡＲＳ自律的複製配列（Liachko & Dunham, 2014, FEMS Yeast Res., 14: 364-7）および抗生物質Ｇ４１８による形質転換体の選択のためのｋａｎＭＸマーカーを担持する。形質転換された細胞は、Ｇ４１８で補完された培地で、ｐＩＬ７５プラスミドにおけるｋａｎＭＸマーカーの存在について選択した。ピキア（Pichia）形質転換体を、ｐＩＬ７５プラスミドも取り込み、Ｍｘｒ１発現カセットも正しく組み込んだ形質転換体を求めてコロニーＰＣＲにより選別した。

実施例１９ ＬｅｇＨ発現カセットをピキア（Pichia）に導入する共形質転換
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下の、ダイズＬｅｇＨ遺伝子の異なるピキア・パストリス（Pichia pastoris）−コドンが最適化された変形体（変形体３；配列番号：５）を含有するｐＭＸ３９９と称するプラスミドを、該遺伝子のＰＣＲ増幅のためのテンプレートの供給源として使用した。ＴＯＰＯクローニングプラスミドｐＭＸ４０１からの骨格をＰＣＲ増幅した。挿入物およびベクターをＧｉｂｓｏｎアセンブリー（ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーキット）を使用して組み立ててプラスミドｐＭＸ４２２を発生させた。このプラスミドを、下で示すプライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６１８を使用するＰＣＲ増幅の次の回のためのテンプレートとして使用した。

生じたＰＣＲ生成物は、５’から３’方向で、ＡＯＸ１プロモーターの３’端部、それに続くＬｅｇＨ変形体３のオープンリーディングフレーム、ＡＯＸ１ターミネーター、短いリンカー配列、およびＡＯＸ１プロモーターの５’端部で構成された（図６ｉｉ）。ＰＣＲ生成物を得て、本明細書に記載されるようにアガロースゲル電気泳動により精製した。

ゲノム中に組み込まれたＬｅｇＨ発現カセットを有する形質転換体を、ＰＣＲによって選別し、ｑＰＣＲを使用してＬｅｇＨ遺伝子コピー数について特徴づけた。

実施例２０ 選択マーカーを担持するプラスミドベクターの形質転換体のキュアリング
ダイズＬｅｇＨ発現カセットが、コロニーＰＣＲにより正しくおよびｑＰＣＲにより高いコピー数で組み込まれたことが示されたクローンでは、Ｇ４１８で選択するために必要なｐＩＬ７５プラスミドを、抗生物質に対する選択を緩和することにより排除した。形質転換体をＧ４１８抗生物質を欠く培地で単一のコロニーを画線培養した。ｐａｎＡＲＳプラスミドは選択の不在下では安定に維持されないので、ｐＩＬ７５は、この条件下では形質転換された細胞から急速に消失した。生じたピキア（Pichia）株ＭＸＹ０２９１は、ＭＸＹ０２０７と同様なコピー数でＬｅｇＨを発現するための配列を含有するが、選択のための異種配列を欠く。

産生株ＭＸＹ０３３０、ＭＸＹ０３３３、およびＭＸＹ０３３８
実施例２１ 株ＭＸＹ０３０６の構築
株ＭＸＹ０２９１の遺伝子型のＰＣＲにより、ＣＰＧオキシダーゼをコードする配列の一部が、この株の構築中に欠失されたことが明らかになった。全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域は、トランケートされたコピーの置き換えにより回復された。簡単に説明すると、下に示すプライマーＭｘＯ０８６６およびＭｘＯ０８６７を使用して、ｐＡＯＸ１プロモーターおよび全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域を含有する線状ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＭＸ３１２からＰＣＲ増幅により発生させた。

線状ｐＡＯＸ１−ＣＰＧオキシダーゼＤＮＡフラグメントは、ｐＩＬ７５プラスミドとの共形質転換により、株ＭＸＹ０２９１中に導入された。形質転換体は、Ｇ４１８を含有する培地で選択して、全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域の存在についてＰＣＲにより選別した。全長ＣＰＧオキシダーゼを含有する単離物を同定して、その後上記のようにＧ４１８に基づく選択のために必要なプラスミドベクターは排除された。この株をＭＸＹ０３０６と命名した（図５を参照されたい）。

実施例２２ ハイブリッドプロモーター株のための線状構築物
ＬｅｇＨ変形体３を、本明細書で示した３種の天然のピキア・パストリス（Pichia pastoris）の構成的プロモーターの各々の指示下で発現させた。線状構築物は図７に示され、プロモーターの３’側半分、それに続くＬｅｇＨ変形体３、それに続くＦＤＨ１転写ターミネーターを含有した。これに直ぐ、アシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossypii）からのｐＴＥＦプロモーター、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）からのアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）およびアシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossypii）からのＴＥＦターミネーターを含有する抗生物質耐性カセットが続く。最終的に、該構築物はプロモーターの５’側半分を含有した。この線状カセットを、下の表にリストを挙げたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅して、５’および３’端部に、天然のピキア（Pichia）ゲノムのそれぞれのプロモーターに相同性の数百塩基対を含有する構築物を発生させた。

コンピテントＭＸＹ０３０６細胞を、線状カセットの各々で形質転換して、ａｍｄＳ選択カセットを含有する形質転換体を、アセトアミドを唯一の窒素供給源として含有する寒天プレート上で成長するそれらの能力に基づいて選択した。これらの株を、精製し単離して、構成的プロモーターの制御下にあるＬｅｇＨの存在をＰＣＲにより検証した（図５）。

実施例２３ 核酸配列
Ｍｘｒ１の核酸配列（下線付きのヌクレオチドは、クローニング中に導入されたＮ末端における６個のアミノ酸をコードする）（配列番号：１）

Ｍｘｒ１タンパク質配列（Ｎ末端における下線付きの６個のアミノ酸はクローニング中に導入された）（配列番号：２）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）−コドンが最適化されたＬｅｇＨ核酸配列（配列番号：３）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）−コドンが最適化されたＬｅｇＨアミノ酸配列（配列番号：４）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）−コドンが最適化されたＬｅｇＨ変形体３の核酸配列（配列番号：５）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）−コドンが最適化されたＬｅｇＨ変形体３のアミノ酸配列（配列番号：６）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）のｐＡＯＸ１プロモーター（配列番号：７）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）のｐＧＡＰプロモーター（配列番号：８）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）のｐＧＣＷ１４プロモーター（配列番号：９）

ピキア・パストリス（Pichia pastoris）のｐＴＥＦ１プロモーター（配列番号：１０）

ヘム生合成酵素１−ＡＬＡシンターゼ（配列番号：１１）

ヘム生合成酵素２−ＡＬＡデヒドラターゼ（配列番号：１２）

ヘム生合成酵素３−ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（配列番号：１３）

ヘム生合成酵素４−ウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ（配列番号：１４）

ヘム生合成酵素５−ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（配列番号：１５）

ヘム生合成酵素６−コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（配列番号：１６）

ヘム生合成酵素７−プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（配列番号：１７）

ヘム生合成酵素８−フェロキラターゼ（配列番号：１８）

パートＣ．結果および考察
実施例２４ 株ＭＸＹ０１８３の特性評価
株ＭＸＹ０１８３のための最適成長条件は、３．０から６．０の目標ｐＨおよび２８〜３５℃の温度を含む。ＬｅｇＨタンパク質を産生するために、株ＭＸＹ０１８３は、生きていて６日間好気的に成長していなければならない。

株ＭＸＹ０１８３と関連する遺伝子の発現は、株に表現型の変化を生じさせた。図８は、誘導開始時（０時間）および誘導７２時間後における振盪フラスコの写真を示す。＃１としたフラスコは宿主株ＭＸＹ００５１を含有する。＃２および＃３としたフラスコは、中間株（即ち、＞１０コピーのＬｅｇＨ遺伝子およびヘム生合成経路からのＡＬＡデヒドラターゼを含有するＭＸＹ０１１８）および産生株（即ち、＞１０コピーのＬｅｇＨ遺伝子およびヘム生合成経路からの８種の酵素を含有するＭＸＹ０１８３）の１つを、それぞれ含有する。７２時間後のフラスコ＃３における特徴的な赤色は、ヘムが結合したＬｅｇＨの産生を示す。

振盪フラスコ中で成長させた後、上で示したＰ．パストリス（P. pastoris）株ＭＸＹ００５１、ＭＸＹ０１１８、およびＭＸＹ０１８３を溶解してタンパク質をＳＤＳゲルに通した（図９Ａ）。矢印は、ＬｅｇＨタンパク質の位置を示す。株ＭＸＹ０１８３と株ＭＸＹ０１１８におけるＬｅｇＨ産生の比較を図９Ｂに示すが、それはＭＸＹ０１８３株によるＬｅｇＨタンパク質のヘム搭載の有効性を示す。

実施例２５ 株ＭＸＹ０２０７の特性評価
次に、ヘムの生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子の存在下に転写活性化因子Ｍｘｒ１を過発現することの利益を決定するために、実験を実施した。＞１０コピーのＬｅｇＨ配列およびヘム生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子を含有する株ＭＸＹ０１８３、および＞１０コピーのＬｅｇＨ配列、ヘム生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子、およびＭｘｒ１転写活性化因子を含有する姉妹株ＭＸＹ０２０６およびＭＸＹ０２０７を、これらの株にとって抑制炭素源であるグリセロールの存在下に振盪フラスコ培養中で成長させた。４８時間後における振盪フラスコ培養の写真を図１０Ａに示し、ＢＭＹ培地で追加の炭素源なしで４８時間成長させた細胞からのペレットの写真を図１０Ｂに示す。これらの実験は、抑制炭素源が、Ｍｘｒ１もその中でＡＯＸ１プロモーターから発現する株の成長培地中で消費し尽くされたときに、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある導入遺伝子の有意の発現（例えばヘム酵素）が、誘導炭素源の不在下で起こることを示す。振盪フラスコ培養物が誘導剤の不在下で成長した場合のヘム搭載ＬｅｇＨの相対収率を、図１０Ｃに示す。これらの実験は、Ｍｘｒ１発現もその中でＡＯＸ１プロモーターによって推進されるピキア（Pichia）株中において、メタノール誘導の不在下で、組換えヘム搭載タンパク質の有意の産生が、ＡＯＸ１プロモーターに推進される導入遺伝子から達成されることを示す。

選択株を２Ｌ発酵槽中で成長させて、ＬｅｇＨおよびヘム搭載ＬｅｇＨの相対収率を決定した（図１１）。株ＭＸＹ０１８３と比較して、ＭＸＹ０２０７株は、いっそう多くのＬｅｇＨを産生し、ＬｅｇＨタンパク質にヘムを搭載させるのに十分なヘムを非常に効果的に産生することができた。

実施例２６ 株ＭＸＹ０２９１の特性評価
実施例１８〜２０で上記したように、株ＭＸＹ０２９１を構築してＭＸＹ０２０７のＬｅｇＨ産生能力を再現したが、抗生物質耐性遺伝子は含まなかった。株ＭＸＹ０２９１は約１６コピーのＬｅｇＨ変形体３、Ｍｘｒ１および８種のヘム生合成酵素のうち７種を含有することが決定された。２Ｌの発酵槽で成長させた場合、この株は、ＭＸＹ０２０７と比較して改善されたＬｅｇＨ収率を示した。この改善は、メタノール／グリセロールおよびメタノール／デキストロ−ス（Ｄ−グルコース）を含有する誘導培地の両方で見られた（図１１）。

実施例２７ ハイブリッドプロモーター株の特性評価
ダイズレグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）の追加のコピーが、すでにＬｅｇＨの数個のコピー、全てのヘム生合成酵素、およびプロモーターｐＡＯＸ１（上でＭＸＹ０２９１と称した）の制御下にある転写因子Ｍｘｒ１を含有する株で、３種の異なる構成的プロモーター、ｐＧＡＰ、ｐＧＣＷ１４およびｐＴＥＦ１の下で発現された。デキストロ−ス（即ち、Ｄ−グルコース）の存在下でメタノールにより誘導される場合、構成的プロモーターおよびｐＡＯＸ１が、ＬｅｇＨの発現を推進するが、ｐＡＯＸ１プロモーターのみがヘム酵素の発現を推進する。これはＬｅｇＨ収率において前の株ＭＸＹ０２９１と比較してさらなる改善をもたらす（図１１）。

本明細書で、方法および組成物を多くの異なる態様に関連して記載してきたが、様々な態様の前述の記載は、例示を意図しており、方法および組成物の範囲を限定することは意図しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。

開示された方法および組成物のために使用することができて、それらと関連して使用することができ、それらの調製に使用することができるかまたはそれらの生成物である方法および組成物が開示される。本明細書ではこれらのおよび他の材料が開示されて、これらの方法および組成物の組合せ、部分集合、相互作用、群その他が開示されることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法の各々の様々な個々のおよび集合的組合せおよび入れ替えへの特定の言及は、明示的に開示されない場合があるが、各々は、特定的に企図されて本明細書で説明されている。例えば、特定の組成物または特定の方法が開示されおよび論じられ、および多くの組成物または方法が論じられていれば、特に反対のことが示されていない限り、組成物および方法の各々および全ての組合せおよび入れ替えが特定的に企図されている。同様に、これらの任意の部分集合または組合せも特定的に企図されて開示されている。

Claims (38)

1. 組換え核酸分子を含むメチロトローフ酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む、酵母細胞。
2. 前記メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ピキア属（Pichia）およびトルロプシス属（Torulopsis）からなる群から選択された酵母である、請求項１に記載の酵母細胞。
3. 前記メチロトローフ酵母細胞がピキア（Pichia）酵母である、請求項１または２に記載の酵母細胞。
4. 前記細胞がピキア（Pichia）細胞である、請求項１または２に記載の酵母細胞。
5. 前記細胞がピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の酵母細胞。
6. 前記組換え核酸分子が、前記メチロトローフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項１から５のいずれかに記載の酵母細胞。
7. 前記組換え核酸分子が、複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現されている、
   請求項１から５のいずれかに記載の酵母細胞。
8. 前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＡｄｒ１配列、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ１配列、またはカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ２配列を含む、請求項１から７のいずれかに記載の酵母細胞。
9. 前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列を含む、請求項１から８のいずれかに記載の酵母細胞。
10. 前記転写活性化因子が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ５７３６５で示される配列を含む、請求項１から９のいずれかに記載の酵母細胞。
11. 前記転写活性化因子が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３９５１２４で示される核酸配列によりコードされる、請求項１０に記載の酵母細胞。
12. 前記少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＡＯＤ１プロモーター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＭＯＸプロモーター要素、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１プロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＦＬＤ１プロモーター要素、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター要素からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の酵母細胞。
13. 前記少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素である、請求項１から１１のいずれかに記載の酵母細胞。
14. 少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む、請求項１から１３のいずれかに記載の酵母細胞。
15. 前記異種核酸が、鉄共同因子の生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、請求項１４に記載の酵母細胞。
16. 前記鉄共同因子がヘムである、請求項１５に記載の酵母細胞。
17. 前記ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドが、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される、請求項１６に記載の酵母細胞。
18. 前記ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドが、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される２種以上のポリペプチドを含む、請求項１６に記載の酵母細胞。
19. 前記酵母細胞が選択のための異種配列を欠く、請求項１から１８のいずれかに記載の酵母細胞。
20. 細胞中で異種ポリペプチドを発現する方法であって、
    先行する請求項のいずれかに記載の酵母細胞を提供すること；
    少なくとも１種のピキア・パストリス（Pichia pastoris）のアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること；および
    前記組換え核酸分子の発現のために適当な条件下で前記細胞を培養して、それにより異種ポリペプチドを発現すること
    を含む、方法。
21. 前記異種ポリペプチドが、グロビンファミリーＰＦ０００４２のメンバーである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記異種ポリペプチドが植物ヘモグロビンである、請求項２０に記載の方法。
23. 前記植物ヘモグロビンがレグヘモグロビンである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記レグヘモグロビンが、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される配列を有する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記導入ステップが、形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換からなる群から選択される技法を含む、請求項２０から２４のいずれかに記載の方法。
26. 前記細胞が培養される前記条件が、鉄または薬学的にもしくは代謝的に許容されるそれらの塩の添加を含む、請求項２０から２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記培養ステップが、メタノールの存在下で前記細胞を培養することを含む、請求項２０から２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記培養ステップが、メタノールの不在下で前記細胞を培養することを含む、請求項２０から２６のいずれかに記載の方法。
29. 前記培養ステップが、選択の不在下で前記細胞を培養することを含む、請求項２０から２８のいずれかに記載の方法。
30. 組換え核酸分子を含むメチロトローフピキア（Pichia）酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、
    Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのＭｘｒ１転写活性化因子配列をコードする核酸；
    グロビンファミリー（ＰＦ０００４２）のメンバーをコードする核酸；および
    ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸
    を含む、メチロトローフピキア（Pichia）酵母細胞。
31. 前記Ｍｘｒ１転写活性化因子配列をコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、請求項３０に記載の酵母細胞。
32. 前記グロビンファミリーのメンバーがレグヘモグロビンである、請求項３０に記載の方法。
33. 前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、請求項３０から３２のいずれかに記載の酵母細胞。
34. 前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、請求項３０から３２のいずれかに記載の酵母細胞。
35. 前記ヘム生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、請求項３０から３４のいずれかに記載の酵母細胞。
36. 前記ヘム生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、請求項３０から３４のいずれかに記載の酵母細胞。
37. 前記メタノール誘導性プロモーター要素が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーター要素である、請求項３０、３１、３３、または３５のいずれかに記載の酵母細胞。
38. 前記構成的プロモーター要素が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの転写伸長因子ＥＦ−１α遺伝子（ＴＥＦ１）プロモーター要素である、請求項３０、３４または３６のいずれかに記載の酵母細胞。