JP2018508194A - 非侵襲的出生前検査のためのマイクロ流体力学ベースの胎児細胞検出および単離 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示する実施形態は、非侵襲的出生前診断のために胎児細胞を単離する方法であって、母体血試料を用意すること；前記母体血試料をマイクロ流体デバイス上に集積されているフィルターに適用して、それによって前記母体血試料から有核血液細胞を濃縮すること；前記マイクロ流体デバイス内の濃縮された有核血液細胞を、胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する蛍光結合部分または親和性分子で標識すること；および前記胎児細胞を単離することを含む方法を提供する。本明細書に開示する実施形態は、胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスであって、フィルター；胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；および顕微鏡で可視化可能なチャンバを含む、集積マイクロ流体デバイスを提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月２３日に出願した「ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣＳ ＢＡＳＥＤ ＦＥＴＡＬ ＣＥＬＬ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＦＯＲ ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ ＰＲＥＮＡＴＡＬ ＴＥＳＴＩＮＧ」と題する米国特許仮出願第６２／１０７，２６１号の優先権を主張するものであり、前記仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書に開示する実施形態は、非侵襲的出生前診断のために母体血からマイクロ流体力学に基づいて胎児細胞を検出および単離するための方法、デバイスおよびキットに関する。

非侵襲的出生前診断のための母体血からの胎児細胞単離は、そのような細胞の希少性のため、様々な課題をもたらす。下流の遺伝子分析および診断アッセイのためにそのような細胞を抽出および分析するための様々アプローチが試みられてきたが、そのような抽出の成功および純度は非常に不十分なものであった。加えて、ＦＡＣＳベースの分析以外のそのような検出および抽出のスループットは依然として低く、このことが非侵襲的出生前検査の分野に別の課題をもたらす。それ故、今日までの非侵襲的出生前診断は、主として、母体血からの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の分析に頼ってきた。しかし、高度に断片化されたｃｆＤＮＡは、そのＤＮＡを分析する上で、また存在する場合には胎児ゲノム異常の完全な出生前分析を提示する上で、多くの課題をもたらす。

本明細書に開示する実施形態は、非侵襲的出生前診断のために胎児細胞を単離する方法であって、母体血試料を用意すること；前記母体血試料をマイクロ流体デバイス上に集積されているフィルターに適用して、それによって前記母体血試料から有核血液細胞を濃縮すること；前記マイクロ流体デバイス内の前記濃縮された有核血液細胞を、胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する蛍光結合部分または親和性分子で標識すること；および前記胎児細胞を単離することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、フィルターは、透明である。一部の実施形態において、有核血液細胞は、該細胞の形態および／または他の物理的特性によって濃縮される。一部の実施形態において、前記方法は、マイクロ流体デバイス内の、顕微鏡で可視化可能なチャンバの中の標識された有核血液細胞を可視化することをさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、可視化および／または顕微鏡分析のために、標識された有核血液細胞をフィルター装着マイクロ流体デバイス内に選択的に固定化することをさらに含む。一部の実施形態において、可視化および／または顕微鏡分析は手動である。一部の実施形態において、可視化および／または顕微鏡分析は、マシンビジョンによって自動化される。一部の実施形態において、胎児細胞は、有核赤血球（ｎＲＢＣ）である。一部の実施形態において、胎児細胞特異的抗原は、ＣＤ４５、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、ベータ−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−バイオホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテイナーゼ１４）、および胎児ヘモグロビンからなる群から選択される。一部の実施形態において、フィルターは、有核血液細胞を濃縮するように、かつ／または成熟赤血球（ＲＢＣ）を除去するように構成される。一部の実施形態において、前記方法は、非胎児細胞を除去することをさらに含む。一部の実施形態において、非胎児細胞を除去することは、非胎児細胞を固定化することを含む。一部の実施形態において、前記方法は、胎児細胞を固定化することをさらに含む。一部の実施形態において、胎児細胞を固定化することは、胎児細胞と、胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子とを接触させることを含む。一部の実施形態において、胎児細胞特異的抗原は、ＣＤ４５、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、ベータ−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−バイオホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテイナーゼ１４）、および胎児ヘモグロビンからなる群から選択される。一部の実施形態において、前記方法は、単離された胎児細胞をシークエンシングによって核酸配列について分析すること、または単離された胎児細胞の遺伝子異常を、ＦＩＳＨもしくはＤＮＡマイクロアレイなどの他の一般に使用されている方法を使用して検出することをさらに含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析することは、１つ以上の単離された胎児細胞のゲノムＤＮＡに検出可能なプローブをハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析することは、１つ以上の単離された胎児細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む。一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡをシークエンシングすることは、単細胞のＤＮＡのシークエンシングを含み、単細胞のＤＮＡのシークエンシングが１つ以上の単離された胎児細胞について行われる。一部の実施形態において、遺伝子の発現の分析は、１つ以上の単離された胎児細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態において、単離された胎児細胞は、遺伝子欠陥について分析される。

本明細書に開示する実施形態は、胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスであって、フィルター；胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；および顕微鏡で可視化可能なチャンバを含む、集積マイクロ流体デバイスを提供する。一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチド配列を検出するように構成されている試薬をさらに含む。

本明細書に開示する実施形態は、フィルター；胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；および顕微鏡で可視化可能なチャンバを含む、胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスと、単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチド配列を検出するように構成されている試薬とを含む、キットをさらに提供する。

図１は、一実施形態における母体血試料から胎児細胞を単離するための例示的プロセスを示す図である。

図２は、単離された胎児細胞の下流での分析について例示的プロセスを示す図である。

発明の詳細な説明

胎児細胞単離のための本明細書に開示する方法およびデバイスは、親和性および／またはバイオマーカーベースの単離と形態ベースの単離とを組み合わせる。本明細書に開示する方法およびデバイスは、これらのプロセスを集積マイクロ流体デバイスで組み合わせることによって、母体血試料からの胎児細胞単離のスループットに関する長年の課題を解決する。ＦＡＣＳとは異なり、顕微鏡プラットフォームで行われる細胞画像解析に類似した可視化ベースの方法を本明細書において開示する。ここで開示する方法を部分的にまたは完全に自動化することができ、これは、本開示に別の利点をもたらす。

好ましくは、本明細書に開示する方法およびデバイスは、マイクロ流体チップ上に集積されているフィルターを活用する。これは、母体血試料からの有核血液細胞の濃縮を可能にする単離プロセスの初期ステップで使用される。たとえば、形態ベースの選択フィルターにより、成熟赤血球（ＲＢＣ）の大部分またはすべてが該フィルターの開口部を通過することができ、有核血液細胞の大部分が捕捉される。その後、有核血液細胞は、対象となる有核血液細胞の小集団の陽性または陰性選択のために、核染色剤および／または特異的バイオマーカーで染色および／または標識される。出生前診断について特に対象となるのは、胎児有核赤血球（ｆｎＲＢＣ）である。

したがって、本明細書に開示する方法およびデバイスは、１）手作業および介入を最小限にする１つの集積プラットフォームでの、細胞濾過、染色、濃縮（必要な場合）；２）母体血の処理を能率的にするための自動化の使用；３）試薬の使用およびコストの削減をもたらす、試薬送達のためのマイクロ流体力学の使用；４）汚染および試料の混合を減少させる密封マイクロ流体チャンバの使用；ならびに５）細胞溶解などの他の機能に使用することができる柔軟なプラットフォームを可能にする。

定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において言及するすべての特許、特許出願、特許公開出願および他の出版物は、その全体が参照により組み込まれている。このセクションで述べる定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、特許出願、特許公開出願および他の出版物で述べられている定義と反対か、または矛盾する場合、このセクションで述べる定義が、参照により本明細書に組み込まれている定義より優先する。

本明細書において用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指示がない限り、複数の言及対象を含む。たとえば、「１つの（ａ）」二量体は、１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）二量体を含む。

本明細書において用いる場合、用語「マイクロ流体デバイス」は、物質、特に、液体などの流体によって運ばれる物質を輸送することができるデバイスであって、一部の実施形態においてはマイクロスケール、また一部の実施形態においてはナノスケールのデバイスを一般に指す。したがって、本開示主題によって記述されるマイクロ流体デバイスは、マイクロスケールの特徴、ナノスケールの特徴、およびそれらの組合せを含む。そのようなデバイスで送達される試料は、流体のみであってよく、または細胞および粒子などの懸濁成分を有する流体であってよい。

したがって、例示的マイクロ流体デバイスは、約５ｍＬ／分以下の流量で流体を操作することができる、大体ミリメートルスケールの寸法またはそれより小さい寸法の構造的または機能的特徴部を概して含む。概して、そのような特徴部としては、チャネル、流体リザーバ、反応チャンバ、混合チャンバ、および分離領域があげられるが、これらに限定されない。一部の例において、チャネルは、約０．１μｍ〜約１０ミリメートルの範囲である、少なくとも１つの断面寸法を備えている。この程度の寸法を使用することによって、より小さい区域へのより多数のチャネルの組み込みが可能になり、用いる流体の体積がより小さくなる。

マイクロ流体デバイスは、単独で存在することができるか、またはマイクロ流体システムの一部として存在することができ、前記マイクロ流体システムは、たとえば、限定ではないが、流体、たとえば、試料、試薬、緩衝液などを前記システムに、かつ／または前記システム経由で導入するためのポンプおよび弁と；検出装置またはシステムと；データ保存システムと；前記デバイス内の流体輸送および／または方向を制御し、該当する場合にはセンサーを使用して前記デバイス内の流体が供される環境条件、たとえば、温度、電流などをモニターおよび制御する制御システムとを備えることができる。そのようなシステムにおける弁は、圧力駆動式であってよく、または真空駆動式であってよい。

本明細書において用いる場合、用語「チャネル」、「マイクロチャネル」および「マイクロ流体チャネル」は、互換的に用いられ、パターン基板から物質にパターン形状を付与することによって、もしくは任意の好適な物質除去技術によって、物質内に形成された溝もしくはキャビティーを意味することができるか、または溝もしくはキャビティーであって、該溝もしくはキャビティー内に載置されているチューブ、毛管などの流体を導く任意の好適な構造物と組み合わせた溝もしくはキャビティーを意味することができる。

本明細書において用いる場合、用語「フローチャネル」および「制御チャネル」は、互換的に用いられ、物質、たとえば、流体、たとえば、気体または液体が通って流れることができるマイクロ流体デバイス内のチャネルを意味することができる。より詳細には、用語「フローチャネル」は、対象となる物質、たとえば、任意の流体（懸濁物質を伴うかもしくは伴わない）または化学的試薬が通って流れることができるチャネルを指す。さらに、用語「制御チャネル」は、物質、たとえば、流体、たとえば、気体または液体が弁またはポンプを起動させるような方法で通って流れることができるフローチャネルを指す。そのようなチャネルでの流体の流れは、能動的に流れるように圧力駆動もしくは真空駆動され得るか、または表面張力によって受動的に駆動され得る。

本明細書において用いる場合、「チップ」は、ある特定のプロセス、たとえば、物理的、化学的、生物学的、生物物理学的もしくは生化学的プロセスなどを行うことができる、複数の一次元、二次元もしくは三次元マイクロ構造またはマイクロスケール構造を有する固体基板を指す。前記マイクロ構造またはマイクロスケール構造、たとえば、チャネルおよび壁、電極素子、電磁素子は、前記チップ上での物理的、生物物理的、生物学的、生化学的、化学的反応またはプロセスを助長するために、前記基板に組み込まれているか、前記基板上に作製されているか、またはそうでなければ前記基板に取り付けられている。チップは、一次元で薄くてよく、他の次元の様々な形状、たとえば、長方形、円形、楕円形または他の不規則形状を有してよい。本発明のチップの主面のサイズは、たとえば、約１ｍｍ^２〜約０．２５ｍ^２とかなり変化し得る。好ましくは、チップのサイズは、特性寸法約１ｍｍ〜約５ｃｍで、約４ｍｍ^２〜約２５ｃｍ^２である。チップ表面は平坦であってよく、または平坦でなくてよい。平坦でない表面を有するチップは、その表面に作製されたチャネルまたは壁を含み得る。

マイクロ流体チップは、任意の好適な材料、たとえば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ガラス、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）など、またはそれらの組合せから製造することができる。チップ内に集積されているフィルターは、同様の材料から製造されてよく、または異なる材料から製造されてよい。

「抗体」は、免疫グロブリンであって、該免疫グロブリンの様々な領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる、免疫グロブリンであり、任意のクラス、たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンであり得る。ニワトリなどの鳥類種における主要抗体型であるＩｇＹも、この定義に含まれる。本明細書において用いる場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、その断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、天然に存在するバリアント、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗原部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾形態も包含する。

本明細書において用いる場合、用語「特異的に結合する」は、特異的結合ペアの結合特異性を指す。他の潜在的標的の存在下での特定の標的の抗体による認識は、そのような結合の１つの特徴である。特異的結合には２つの異なる分子が関与し、前記分子の一方はそのもう一方の分子と化学的または物理的手段によって特異的に結合する。２つの分子は、その結合が、その結合パートナーを同様の特性を有する他のアッセイ構成要素と区別することができるような意味で、関連している。結合成分ペアのメンバーは、リガンドと受容体（抗リガンド）、特異的結合ペア（ＳＢＰ）メンバーとＳＢＰパートナー、抗体−抗原などと呼ばれる。分子はまた、分子集合体についてのＳＢＰメンバーであってもよく、たとえば、第二の抗体とその対応する抗原との免疫複合体に対して産生された抗体は、免疫複合体についてのＳＢＰメンバーであると考えることができる。

本明細書に記載する本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなること」および／または「から本質的になること」を理解されたい。

本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面と併せて以下の明細書から明らかになる。

胎児細胞を単離する方法
本明細書に開示する実施形態は、非侵襲的出生前診断のための胎児細胞を単離する方法を提供する。胎児細胞は、生体試料、たとえば、母体血試料から単離される。一部の実施形態において、前記方法は、母体血試料をマイクロ流体デバイス上に集積されているフィルターに適用して、それによって母体血試料から有核血液細胞を濃縮することを含み得る。一部の実施形態において、前記方法は、たとえば、マイクロ流体デバイス内の濃縮された有核血液細胞を、陽性選択または陰性選択のために、胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する蛍光結合部分または親和性分子で標識することを含み得る。

開示する実施形態に従って胎児細胞を単離する方法１００の非限定的な例を、図１に示されているフロー図で説明する。図１で説明するように、方法１００は、１つ以上の操作１１０〜１５０によって説明されるような１つ以上の機能、操作または行為を含むことができる。

方法１００は、操作１１０「母体試料を用意する」で開始することができる。操作１１０に続いて操作１２０「マイクロ流体デバイス上に集積されているフィルターに母体試料を適用する」を行うことができる。操作１２０に続いて操作１３０「濃縮された有核血液細胞を標識する」を行うことができる。操作１３０に続いて操作１４０「非胎児細胞を除去する」を行うことができる。操作１３０または操作１４０に続いて操作１５０「胎児細胞を単離する」を行うことができる。

図１では、操作１１０〜１５０は、最初が操作１１０そして最後が操作１５０で逐次的に行われるように説明されている。しかし、これらの操作を必要に応じて特定の実施形態に合うように組み合わせることができること、および／またはさらなるもしくは異なる操作に分割することができることは、理解される。たとえば、１つ以上の操作１１０〜１５０の前、そのような操作中、またはそのような操作の後に、さらなる操作を加えることができる。一部の実施形態において、１つ以上の操作をほぼ同時に行うことができる。一部の実施形態において、前記方法は、操作１１０、１２０、１３０および１５０のみからなり、いずれの他の操作からもならない。一部の実施形態において、前記方法は、操作１１０、１２０、１３０および１５０から本質的になる。一部の実施形態において、前記方法は、操作１１０、１２０、１３０および１５０ならびに操作１４０からのみなり、いずれの他の操作からもならない。

操作１１０「母体試料を用意する」では、１つ以上の有核胎児細胞を含有する母体試料を、標準的採血を用いてヒト妊婦から採取することができる。母体試料は、第１三半期（妊娠の最初の約３ヶ月）、第２三半期（妊娠約４〜６ヶ月）、または第３三半期（妊娠約７〜９ヶ月）中に採取することができる。通常は、得られる試料は血液試料である。

ヒトから母体試料（たとえば、血液試料）を得る場合、試料の量は、サイズ、妊娠期間、およびスクリーニングされる条件に依存して様々であり得る。一実施形態において、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｍＬまでの試料が得られる。一実施形態において、５〜２００、１０〜１００、または３０〜５０ｍＬの試料が得られる。一実施形態において、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０ｍＬより多い試料が得られる。一実施形態において、約１０〜１００ｍＬまたは３０〜５０ｍＬの末梢血試料が妊婦から得られる。一部の実施形態において、血液試料は、受胎から３６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８週以内、または上記値のいずれかの間の範囲のヒト妊婦から得られる。たとえば、血液試料は、受胎から８週の早期にヒト妊婦から得られる。一部の実施形態において、血液試料は、ヒト妊婦から妊娠終了後にも得られる。

試料は、試料の全成分に対して有核胎児細胞を濃縮し、かつ／または試料中の全細胞に対して有核胎児細胞を濃縮する１以上のステップに付される。母体試料を、そのまま使用することができ、所望の緩衝液で事前に希釈することができ、またはフィルターに適用する前に必要に応じてチップ上で希釈することができる。

一部の実施形態において、有核胎児細胞の濃縮は、１つ以上のサイズベースの分離方法を使用して行われる。サイズベースの分離モジュールの例としては、濾過膜、モレキュラーシーブ、およびマトリックスがあげられる。本発明によって企図されるサイズベースの分離モジュールの例としては、国際公開第２００４／１１３８７７号に開示されているものがあげられ、この特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。他のサイズベースの分離方法は、国際公開第２００４／０１４４６５１号ならびに米国特許出願公開第２００８／０１３８８０９号Ａ１および同第２００８／０２２０４２２号Ａ１明細書に開示されており、これら特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

操作１２０「マイクロ流体デバイス上に集積されているフィルターに母体試料を適用する」では、有核血液細胞および／または成熟赤血球（ＲＢＣ）を選択するのに好適である任意のフィルターを使用してよい。一部の実施形態において、フィルターは、ＲＢＣを通過させるが有核血液細胞を保持するサイズおよび／形状を有する開口部を含み得る。たとえば、前記開口部は、４．０μｍ、４．１μｍ、４．２μｍ、４．３μｍ、４．４μｍ、４．５μｍ、４．６μｍ、４．７μｍ、４．８μｍ、４．９μｍ、５．０μｍ、６．０μｍ、７．０μｍ、８．０μｍ、９．０μｍ、１０．０μｍ、１１．０μｍ、１２．０μｍ、１３．０μｍ、１４．０μｍ、１５．０μｍ、１６．０μｍ、１７．０μｍ、１８．０μｍ、１９．０μｍ、２０．０μｍ、２１．０μｍ、２２．０μｍ、２３．０μｍ、２４．０μｍ、２５．０μｍ、２６．０μｍ、２７．０μｍ、２８．０μｍ、２９．０μｍ、３０．０μｍであるか、もしくは約４．０μｍ、約４．１μｍ、約４．２μｍ、約４．３μｍ、約４．４μｍ、約４．５μｍ、約４．６μｍ、約４．７μｍ、約４．８μｍ、約４．９μｍ、約５．０μｍ、約６．０μｍ、約７．０μｍ、約８．０μｍ、約９．０μｍ、約１０．０μｍ、約１１．０μｍ、約１２．０μｍ、約１３．０μｍ、約１４．０μｍ、約１５．０μｍ、約１６．０μｍ、約１７．０μｍ、約１８．０μｍ、約１９．０μｍ、約２０．０μｍ、約２１．０μｍ、約２２．０μｍ、約２３．０μｍ、約２４．０μｍ、約２５．０μｍ、約２６．０μｍ、約２７．０μｍ、約２８．０μｍ、約２９．０μｍ、約３０．０μｍであるか、もしくは４．０μｍ未満、４．１μｍ未満、４．２μｍ未満、４．３μｍ未満、４．４μｍ未満、４．５μｍ未満、４．６μｍ未満、４．７μｍ未満、４．８μｍ未満、４．９μｍ未満、５．０μｍ未満、６．０μｍ未満、７．０μｍ未満、８．０μｍ未満、９．０μｍ未満、１０．０μｍ未満、１１．０μｍ未満、１２．０μｍ未満、１３．０μｍ未満、１４．０μｍ未満、１５．０μｍ未満、１６．０μｍ未満、１７．０μｍ未満、１８．０μｍ未満、１９．０μｍ未満、２０．０μｍ未満、２１．０μｍ未満、２２．０μｍ未満、２３．０μｍ未満、２４．０μｍ未満、２５．０μｍ未満、２６．０μｍ未満、２７．０μｍ未満、２８．０μｍ未満、２９．０μｍ未満、３０．０μｍ未満であるか、もしくは上記値のうちのいずれか２つの間の範囲、たとえば、２．０μｍ〜２．５μｍ、１．８μｍ〜３．０μｍなどであるサイズであり得る。一部の実施形態において、前記開口部の形状は、長方形、円形、卵形、三角形など、または不規則形状であってよい。本明細書において用いる場合、開口部の「サイズ」は、フィルターの最小有効開口を指す。したがって、一部の実施形態において、ＲＢＣを通過させるが有核血液細胞を通過させないサイズおよび／または形状を有するフィルター上の開口部をＲＢＣが通過すると、有核血液細胞は濃縮され得る。

一部の実施形態において、フィルターは、有核血液細胞またはＲＢＣに選択的に結合する結合部分または親和性分子でコーティングされてよい。たとえば、有核血液細胞に特異的に結合する抗体を使用してフィルターをコーティングしてよく、その結果有核血液細胞は保持されるがＲＢＣはフィルターを通過する。

一部の実施形態において、濃縮された生成物であっても、対象となるもの（たとえば、有核母体赤血球）でない細胞が優位を占める（＞５０％）ことがある。場合によっては、濃縮された試料の有核胎児細胞は、その濃縮された試料中の全細胞の少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％を構成する。たとえば、本明細書に記載する方法およびシステムを使用して、妊娠しているヒトからの１０〜２０ｍＬの母体血試料を１種以上の有核胎児細胞、たとえば、有核赤血球について濃縮することができ、その結果、濃縮された試料は合計約１，０００〜約１０，０００，０００個の細胞を有し、前記細胞の２％は有核胎児細胞であり、前記細胞の残部は母体細胞である。一部の実施形態において、行った濃縮ステップによって、試料からすべての望ましくない分析物（たとえば、母体細胞、たとえば、血小板および白血球、成熟ＲＢＣ）の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％が除去されている。

操作１３０「濃縮された有核血液細胞を標識する」では、濃縮された有核血液細胞を色素で直接標識してよく、または間接的に標識してよい。一部の実施形態において、ＤＮＡを染色する色素、たとえば、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、臭化エチジウム、ヘマトキシリン、ナイルブルー、ヘキスト、サフラニン、またはＤＡＰＩを使用してよい。一部の実施形態において、細胞型特異的色素、たとえば、胎児細胞または非胎児細胞を特異的に標識する色素を使用してよい。細胞型特異的色素を使用して、細胞を直接標識してよく、または間接的に、たとえば、細胞型特異的抗体によって標識してよい。関係する標識戦略を逐次的に行ってよく、または同時に行ってよい。

一部の実施形態において、胎児細胞を濃縮するために、任意選択の操作１４０「非胎児細胞を除去する」を行ってよい。この任意選択の操作では、非胎児細胞が、濃縮された有核血液細胞から様々な技術によって除去され得る。たとえば、一部の実施形態において、成熟ＲＢＣを溶解するための別溶解もしくは有核画分を濃縮するための密度勾配遠心分離によって、または胎児細胞が位置するマイクロチャネルもしくはチャンバとは異なるマイクロ流体デバイス上のマイクロチャネルもしくはチャンバ内に非胎児細胞を固定化することによって、非胎児細胞の大部分が除去され得る。これらの濃縮ステップは、上述の技術の１つまたは組合せを使用することができる。また、チップ外で部分的濃縮ステップを行った後に、濃縮された試料を胎児細胞単離のためにチップに負荷することができる。たとえば、非胎児細胞は、非胎児細胞に特異的に結合する結合部分または親和性分子でコーティングされたマイクロチャネルまたはチャンバ内に固定化してよい。一部の実施形態において、非胎児細胞は、蛍光活性化プロセスによって除去されてよい。

親和性ベースの濃縮
一部の実施形態において、有核胎児細胞を、結合部分または親和性分子に対するその親和性に基づいて、濃縮することができる。そのような実施形態において、結合部分を適切に標識して、母体試料の望ましくない成分からの有核胎児細胞の分離を助長する。たとえば、有核胎児細胞に対して親和性を有する結合部分は、有核胎児細胞に結合することができ、その結合部分を使用して、有核胎児細胞を、固体支持体、たとえば、磁性ビーズ、もしくはクロマトグラフィー材料の非磁性固相に結合させることによって分離することができ、または、可視化ベースもしくは別の方法での有核胎児細胞の検出支援濃縮によって有核胎児細胞を他の試料成分と区別することができるように、前記結合部分を検出可能に標識することができる。

一部の実施形態において、親和性方法は、胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する、直接または間接的に標識された結合部分または親和性分子の使用を含む。たとえば、結合部分または親和性分子を固定相、フルオロフォア、放射性核種、または他の検出可能な部分に結合させることができ、試料と標識された結合部分または親和性分子とを、胎児有核細胞を前記結合部分または親和性分子に特異的に結合させるが、前記試料の他の成分が前記結合部分または親和性分子に特異的に結合しない条件下で、接触させることができる。その後、たとえば、フローサイトメトリー、細胞画像解析、マイクロマニピュレーター、光ピンセット、ＤＥＰ、磁性捕捉、密度遠心分離機、およびサイズベース液体クロマトグラフィーを使用して、標識された結合部分または親和性分子を処理して、前記標識された結合部分または親和性分子に結合している母体試料の成分を、前記標識された結合部分または親和性分子に結合していない母体試料の成分から分離させることができる。場合により、母体試料の結合成分を洗浄して、非特異的結合成分を除去することができる。胎児有核細胞を含む、標識された結合部分または親和性分子に結合している試料の成分を、その後さらなる濃縮のためにまたは分析のために保持または回収することができる。

結合部分は、たとえば、有核胎児細胞に特異的に結合するタンパク質、核酸および炭水化物を含むことができる。一実施形態において、結合部分は、１種以上の炭水化物、たとえば、ガラクトースに対して親和性を有する。たとえば、結合部分はレクチンであり得る。他の実施形態において、結合部分は抗体である。そのような結合部分抗体の例としては、抗マトリックスメタロプロテイナーゼ１４（抗ＭＭＰ１４）、抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１）、抗グリコホリンＡ（抗ＧＰＡ）、抗トロンボスポンジン受容体（抗ＣＤ３６）、抗ＣＤ３４、抗ＨｂＦ、抗ＨＡＥ９、抗ＦＢ３−２、抗Ｈ３−３、抗エリスロポエチン受容体、抗ＣＤ２３５ａ、抗炭水化物、抗セレクチン、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗・抗原−ｉ、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅ−カドヘリン、抗Ｍｕｃ−１、抗ｈＰＬ、抗ＣＨＳ２、抗ＫＩＳＳ１、抗ＧＤＦ１５、抗ＣＲＨ、抗ＴＦＰ１２、抗ＣＧＢ、抗ＬＯＣ９０６２５、抗ＦＮ１、抗ＣＯＬ１Ａ２、抗ＰＳＧ９、抗ＰＳＧ１、抗ＨＢＥ、抗ＡＦＰ、抗ＡＰＯＣ３、抗ＳＥＲＰＩＮＣ１、抗ＡＭＢＰ、抗ＣＰＢ２、抗ＩＴＩＨ１、抗ＡＰＯＨ、抗ＨＰＸ、抗ベータ−ｈＣＧ、抗ＡＨＳＧ、抗ＡＰＯＢ、抗Ｊ４２−４−ｄ、抗２，３−バイオホスホグリセリン酸（抗ＢＰＧ）、抗炭酸脱水酵素（抗ＣＡ）、または抗チミジンキナーゼ（抗ＴＫ）があげられる。

一実施形態において、抗ＭＭＰ１４、抗ＣＤ７１および／または抗ＧＰＡ選択を使用して、有核胎児細胞を濃縮する。別の実施形態において、遺伝子ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、ベータ−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡ、またはＴＫから発現されるタンパク質に結合することができる１つ以上の抗体または抗体断片を使用して、有核胎児細胞を濃縮する。

固定相ベースの濃縮
一部の実施形態において、アフィニティークロマトグラフ法を使用することができる。たとえば、結合部分または親和性分子を固定相、たとえば、ビーズ、カラムまたは粒子に結合させることができ、試料と親和性分子結合固定相とを、胎児有核細胞を前記結合部分または親和性分子に特異的に結合させるが、前記試料の他の成分が前記結合部分または親和性分子に特異的に結合しない条件下で、接触させることができる。その後、その接触させた固定相を、たとえば、移動相を使用して処理して、その親和性分子結合固定相に結合している母体試料の成分を、その親和性分子結合固定相に結合していない母体試料の成分から分離させることができる。胎児有核細胞を含む、親和性分子結合固定相に結合している試料の成分を、その後さらなる濃縮のためにまたは分析のために保持または回収することができる。

一実施形態において、磁性粒子を使用して有核胎児細胞を濃縮する。一実施形態において、抗体などの結合部分を磁性粒子（たとえば、磁性ビーズ）に結合させることができる。一実施形態において、抗ＭＭＰ１４、抗ＣＤ７１、抗ＧＰＡ、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ３４、抗ＨｂＦ、抗ＨＡＥ９、抗ＦＢ３−２、抗Ｈ３−３、抗エリスロポエチン受容体、抗ＣＤ２３５ａ、抗炭水化物、抗セレクチン、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗・抗原−ｉ、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅ−カドヘリン、抗Ｍｕｃ−１、抗ｈＰＬ、抗ＣＨＳ２、抗ＫＩＳＳ１、抗ＧＤＦ１５、抗ＣＲＨ、抗ＴＦＰ１２、抗ＣＧＢ、抗ＬＯＣ９０６２５、抗ＦＮ１、抗ＣＯＬ１Ａ２、抗ＰＳＧ９、抗ＰＳＧ１、抗ＨＢＥ、抗ＡＦＰ、抗ＡＰＯＣ３、抗ＳＥＲＰＩＮＣ１、抗ＡＭＢＰ、抗ＣＰＢ２、抗ＩＴＩＨ１、抗ＡＰＯＨ、抗ＨＰＸ、抗ベータ−ｈＣＧ、抗ＡＨＳＧ、抗ＡＰＯＢ、抗Ｊ４２−４−ｄ、抗ＢＰＧ、抗ＣＡまたは抗ＴＫの抗体またはそれらの抗体の断片に、ビーズを結合させる。

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、ＡＭＣＡ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、フルオレセインチオイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＳＥ、ＣＦＤＡ−ＳＥ、ＤｙＬｉｇｈｔ ２８８、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、ローダミン、ローダミン６Ｇ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ｃｙ３色素、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、リサミンローダミンＢ色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ｃｙ５色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ｃｙ５．５色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ペリジニン・クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、Ｄｒａｑ−５、パシフィックオレンジ、アミンアクア、パシフィックブルー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ−５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０、またはＤｙＬｉｇｈｔ ８００を含むがこれらに限定されない、本明細書において提供する核酸プローブ、抗体プローブ、または抗体に基づく断片プローブと併用することができる、任意の様々な蛍光分子または色素。

胎児バイオマーカー
一部の実施形態において、胎児バイオマーカーを使用して、１つ以上の胎児細胞を検出および／または単離することができる。たとえば、これは、胎児発育中に差次的に発現される遺伝子（たとえば、ＤＹＳ１、ＤＹＺ、ＣＤ−７１、ＭＭＰ１４）の相対発現に基づいて胎児有核細胞と母体有核細胞とを区別することによって行うことができる。提供する発明の一実施形態において、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、ベータ−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−バイオホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）またはチミジンキナーゼ（ＴＫ）を含む１つ以上の遺伝子の転写産物またはタンパク質発現の検出を使用して、胎児細胞を濃縮、精製、計数、同定検出または区別する。前記発現は、これらの遺伝子またはタンパク質から発現された転写産物を含むことができる。提供する発明の一実施形態において、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＨＳＧ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫを含む１つ以上の遺伝子の発現を使用して、有核胎児赤血球などの有核胎児細胞を同定、精製、濃縮または計数する。

ベータ−ｈＣＧ（ｂ−ｈＣＧ、ＨＣＧ、ＣＧＢ、ＣＧＢ３およびｈＣＧＢとしても公知）は、糖タンパク質ホルモンベータ鎖ファミリーのメンバーであり、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のベータ３サブユニットをコードする。糖タンパク質ホルモンは、共通のアルファサブユニットと生物学的特異性を付与する固有のベータサブユニットとからなるヘテロ二量体である。ＣＧは、胎盤の絨毛細胞によって産生され、妊娠の維持に不可欠であるステロイドを合成するように卵巣を刺激する。ＣＧのベータサブユニットは、６つの遺伝子によってコードされ、これらの遺伝子は、染色体１９ｑ１３．３上に直列と逆列のペアで、かつ黄体形成ホルモンベータサブユニット遺伝子と連続して配置されている。

ＡＰＯＢ（アポリポタンパク質Ｂ（Ａｇ（ｘ）抗原を含む）およびＦＬＤＢとしても公知）は、カイロミクロンおよび低密度リポタンパク質の主要アポリポタンパク質である。ＡＰＯＢは、２つの主要アイソフォーム、アポＢ−４８およびアポＢ−１００として血漿中に存在し、前者アポＢ−４８は腸内でのみ合成され、後者アポＢ−１００は肝臓でのみ合成される。腸型のアポＢおよび肝臓型のアポＢは、単一の非常に長いｍＲＮＡからの単一遺伝子によってコードされる。２つのアイソフォームは、共通のＮ末端配列を共有する。より短いアポＢ−４８タンパク質は、残基２１８０でのアポＢ−１００転写産物のＲＮＡ編集（ＣＡＡ−＞ＵＡＡ）後に産生され、その結果、終止コドンの生成、そして早期翻訳終結が生ずる。この遺伝子またはその調節領域の変異は、血漿コレステロールおよびアポＢレベルに影響を与える疾患である、リガンド欠損アポＢに起因する低βリポタンパク血症、正トリグリセリド血症性低βリポタンパク血症および高コレステロール血症を引き起こす。

ＡＨＳＧ（アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質；ＡＨＳ；Ａ２ＨＳ；ＨＳＧＡ；およびＦＥＴＵＡとしても公知）は、血清中に存在する糖タンパク質であり、肝細胞によって合成され得る。ＡＨＳＧ分子は、２本のポリペプチド鎖からなり、これらの鎖は両方とも、単一のｍＲＮＡからコードされたプロタンパク質から切断される。ＡＨＳＧは、細胞内取り込み、脳の発達および骨組織の形成などのいくつかの機能に関与する。このタンパク質は、通例、未熟大脳皮質の皮質板および骨髄造血マトリックスに存在し、したがって、組織の発達に関与するとみなされている。

ＨＰＸ（ヘモペキシンとしても公知）は、ヘムに結合することができる。ＨＰＸは、ヘモグロビンなどのヘムタンパク質の代謝回転によって放出または失われたヘムを捕捉することによって、遊離ヘムに起因しうる酸化ダメージから身体を保護することができる。身体の鉄を保存するために、ヘモペキシンは、肝臓細胞の表面に位置する特異的受容体と相互作用することによって、その結合リガンドを内在化のために放出することができる。

ＣＰＢ２（カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿）；ＣＰＵ；ＰＣＰＢ；およびＴＡＦＩとしても公知）は、Ｃ末端ペプチド結合を加水分解することができる酵素である。カルボキシペプチダーゼファミリーは、メタロカルボキシペプチダーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼおよびシステインカルボキシペプチダーゼを含む。それらの基質特異性に従って、これらの酵素は、カルボキシペプチダーゼＡ（脂肪族残基を切断）またはカルボキシペプチダーゼＢ（塩基性アミノ残基を切断）と呼ばれる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、トリプシンによって活性化され、カルボキシペプチダーゼＢ基質に対して作用する。トロンビン活性化後、成熟タンパク質は、線維素溶解をダウンレギュレートする。この遺伝子およびそのプロモーター領域について多型が記載されている。入手可能な配列データ解析は、異なるアイソフォームをコードするスプライスバリアントを示す。

ＩＴＩＨ１（インターアルファ（グロブリン）インヒビターＨ１；Ｈ１Ｐ；ＩＴＩＨ；ＬＡＴＩＨ；およびＭＧＣ１２６４１５としても公知）は、セリンプロテアーゼインヒビターファミリーのメンバーである。ＩＴＩＨ１は、２つの前駆タンパク質：軽鎖と１本または２本どちらかの重鎖から構築される。ＩＴＩＨ１は、インビトロで細胞付着を増加させることができる。

ＡＰＯＨ（アポリポタンパク質Ｈ（ベータ−２−糖タンパク質Ｉ）；ＢＧ；およびＢ２Ｇ１としても公知）は、リポタンパク質代謝、凝固、および抗リン脂質自己抗体の産生を含む、様々な生理的経路に関係づけられている。ＡＰＯＨは、狼瘡および原発性抗リン脂質抗体症候群を有する多くの患者の血清中で見いだされる抗リン脂質自己抗体によるアニオン性リン脂質結合の必要補因子であり得る。

ＡＭＢＰ（アルファ−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体；ＨＣＰ；ＩＴＩ；ＵＴＩ；ＥＤＣ１；ＨＩ３０；ＩＴＩＬ；ＩＡＴＩＬ；およびＩＴＩＬＣとしても公知）は、血漿に分泌される複合糖タンパク質をコードする。この前駆体は、タンパク質分解的に処理されて、異なる機能性タンパク質：リポカリン輸送タンパク質のスーパーファミリーに属して炎症プロセスの調節の役割を果たす、アルファ−１−ミクログロブリン；およびクニッツ型プロテアーゼインヒビターのスーパーファミリーに属する尿トリプシンインヒビターであり、多くの生理プロセスおよび病理プロセスにおいて重要な役割を果たす、ビクニンになる。この遺伝子は、リポカリン遺伝子のクラスターにおける９番染色体上に位置する。

Ｊ４２−４−ｄは、ｔ−複合体１１（マウス）様２；ＭＧＣ４０３６８およびＴＣＰ１１Ｌ２としても公知である。

操作１５０、「胎児細胞を単離する」では、手動の方法または自動化された方法のいずれかを使用して胎児細胞を単離してよい。たとえば、胎児細胞の選択および／または非胎児細胞の除外によって胎児細胞を単離してよい。一部の実施形態において、胎児細胞を単細胞捕捉によって単離する。一部の実施形態において、胎児細胞を顕微鏡プラットフォームで可視化しながら単離してよい。

様々な実施形態において、操作前、操作中または操作後のある特定の時点で、洗浄緩衝液をマイクロチャネルおよび／またはチャンバに流して、過剰な試薬、たとえば、緩衝剤、色素、抗体、核酸、細胞、細胞片などを洗い流してよい。

単離された胎児細胞の評価
本明細書に開示する実施形態は、出生前検査および／または診断のために単離された胎児細胞に対して１種以上の分析を行う柔軟性をさらに提供する。本開示実施形態による単離された胎児細胞についての下流の分析２００の非限定的な例を、図２に示されている図で説明する。図２において、単離された胎児細胞は、下流の遺伝子分析のために細胞溶解およびＤＮＡ抽出ステップに付され得る。一部の実施形態において、細胞溶解および／またはＤＮＡ抽出を、セルソーティングチップに装着する同じマイクロ流体チップで行ってよく、または別のマイクロ流体チップで行ってよい。一部の実施形態において、細胞溶解および／またはＤＮＡ抽出を、標準的アプローチを使用して行ってよく、そのようなアプローチはチップベースでないことがある。

一部の実施形態において、単離された胎児細胞を、核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現について評価することができる。たとえば、単離された胎児細胞を遺伝子欠陥について分析、たとえば、ＳＮＰ検出、ターゲットシークエンス解析、異数性分析のための全ゲノム増幅（ＷＧＡ）および／またはシークエンシング、そのような遺伝子欠陥を有する個体に有害作用を及ぼす遺伝子上のある特定の領域の挿入および欠失分析、染色体異常（たとえば、１８番、２１番または１３番染色体トリソミー）についてのマイクロアレイベースの分析をしてよい。

用語「染色体異常」は、対象染色体の構造と正常な相同染色体との偏差を指す。用語「正常な」は、特定の種の健常個体において見いだされる主な核型または横縞模様を指す。染色体異常は、数的または構造的なものであり得、限定されるものではないが、異数性、倍数性、反転、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部の欠失、付加、染色体の一部の付加、挿入、染色体の断片、染色体の領域、染色体再編成、および転座を含む。染色体異常を病的状態の存在または病的状態を発生する素因と相関させることができる。本明細書において定義する場合、一塩基多型（「ＳＮＰ」）は、染色体異常ではない。

モノソミーＸ（ＸＯ、全Ｘ染色体の非存在）は、最も一般的な種類のターナー症候群であって、出生女児２５００名に１名〜３０００名に１名に起こる（ＳｙｂｅｒｔおよびＭｃＣａｕｌｅｙ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００４）３５１：１２２７〜１２３８）。ＸＸＹ症候群は、ヒト男性が過剰なＸ染色体を有する状態であって、男性１０００名中おおよそ１名の割合で存在する（Ｂｏｃｋ、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＸＸＹ Ｍａｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆａｍｉｌｉｅｓ．ＮＩＨ発行番号９３−３２０２（１９９３））。ＸＹＹ症候群は、ヒト男性が過剰なＹ染色体を受け取って、より通常の４６の代わりに合計４７染色体になる性染色体の異数性であって、男子出生１０００件に１件影響し、しかも男性不妊症につながる可能性がある（Ａｋｓｇｌａｅｄｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（２００８）９３：１６９−１７６）。

ターナー症候群は、いくつかの状態を包含し、そのうちモノソミーＸ（ＸＯ、全性染色体の非存在、バー小体）が最も一般的である。典型的な女性は、２つのＸ染色体を有するが、ターナー症候群の場合、これらの性染色体の一方が欠失している。表現型女性２０００名に１名〜５０００名に１名に起こり、この症候群それ自体が多数の形で顕在化する。クラインフェルター症候群は、ヒト男性が過剰なＸ染色体を有する状態である。ヒトの場合、クラインフェルター症候群は、最も一般的な性染色体障害であり、過剰な染色体の存在によって引き起こされる二番目に最も一般的な状態である。この状態は、男性１，０００名におおよそ１名で存在する。ＸＹＹ症候群は、ヒト男性が過剰なＹ染色体を受け取って、より通常の４６の代わりに合計４７染色体となる性染色体の異数性である。これにより４７のＸＹＹ核型を生じる。この状態は、通常は無症候性であり、男子出生１０００件に１件影響し、しかも男性不妊症につながる可能性がある。

１３番染色体トリソミー（パトー症候群）、１８番染色体トリソミー（エドワード症候群）および２１番染色体トリソミー（ダウン症候群）は、臨床的に最も重要な常染色体トリソミーであり、それらを如何にして検出するかが常に注目の話題となってきた。上記胎児染色体異常の検出は、出生前診断において大きな意義をもつ（Ｏｓｔｌｅｒ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｙｅ ａｎｄ ｓｋｉｎ：ａ ｃｏｌｏｒ ａｔｌａｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｐｐ．７２．ＩＳＢＮ ９７８０７８１７４９９９２（２００４）；Ｄｒｉｓｃｏｌｌ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００９）３６０：２５５６−２５６２；Ｋａｇａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（２００８）２３：１９６８−１９７５）。

一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析することは、１つ以上の単離された胎児細胞のゲノムＤＮＡに検出可能なプローブをハイブリダイズさせることを含む。このアプローチは、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）のものであってよい。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析することは、１つ以上の単離された胎児細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む。一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡのシークエンシングは、単個細胞または少数細胞のＤＮＡのシークエンシングを含み、単個細胞のＤＮＡのシークエンシングが１つ以上の単離された胎児細胞について行われる。

多数の異なるシークエンシング方法および変法を使用することができることは、当業者には明らかであろう。一実施形態において、大規模並行シークエンシングを使用してシークエンシングを行う。「大規模並行シークエンシング」は、核酸の何百万もの断片をシークエンシングする技術、たとえば、平面の光学的に透明な表面へのランダムに断片化されたゲノムＤＮＡの結合および固相増幅を使用して、各々がテンプレートのコピーを１平方センチメートル当り約１，０００個含有する何百万ものクラスターを有する高密度シークエンシングフローセルを生じさせる技術を意味する。これらのテンプレートは、４色ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ技術を使用してシークエンシングされる。４５４プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３７：３７６−３８０）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（すなわちＳｏｌｅｘａ（商標）プラットフォーム）またはＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡシークエンシング技術（Ｈａｒｒｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）３２０：１０６−１０９）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術、およびナノポアシークエンシング（Ｓｏｎｉ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（２００７）５３：１９９６−２００１）で達成可能な大規模並行シークエンシングは、高い多重化次数で検体から単離された多くの核酸分子の並行式でのシークエンシングを可能にする（Ｄｅａｒ，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ（２００３）１：３９７−４１６）。これらのプラットフォームの各々は、核酸断片のクローン増殖された分子またはさらには増幅されていない単一分子をシークエンシングする。ポリヌクレオチド断片の配列情報を得る際に市販のシークエンシング装置を使用してよい。この実施形態で使用するシークエンシングは、予備増幅またはクローニングステップなしで行うことが好ましいが、ＰＣＲと顕微鏡テンプレートベースのシークエンシングの両方のための反応チャンバを有するマイクロ流体チップで増幅ベースの方法と併用してよい。ある配列を特定のヒト染色体に属すると同定するのに要するのは、約３０ｂｐのランダム配列情報に過ぎない。配列が長いほど、より特定の標的を一義的に同定することができる。本件では、多数の３５ｂｐ読み取りデータが得られた。大規模並行シークエンシング法のさらなる説明は、Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ｖｅｎｔｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３７：３２６−３２７において見いだされる。

集積マイクロ流体デバイス
本明細書に開示する実施形態は、胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスであって、フィルター；胎児細胞の陽性選択または望ましくない細胞の陰性選択のための、胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；および顕微鏡ベースの可視化可能チャンバを含む、集積マイクロ流体デバイスを提供する。

一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスを顕微鏡プラットフォームで可視化されるように構成してよい。たとえば、一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、透明であって顕微鏡下で可視化可能であるフィルターを含んでよい。一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、透明であって顕微鏡下で可視化可能であるマイクロチャネルおよび／またはチャンバを含んでよい。

一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、同様のまたは異なる材料から製造され、かつ様々な利用可能な結合技術によって組み立てられた複数の層を含み得る。

一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、血液容器から該集積マイクロ流体デバイス上のマイクロチャネルまたはチャンバへの流体の流れを駆動するように構成されているポンプを含んでよい。一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、チップの別の区域への液体の流れを調節するための弁として作用するような可撓性膜の組合せを使用して、前記マイクロ流体デバイス上のマイクロチャネルおよび／またはチャンバ内の流体の流れを調節するように構成されているポンプを含んでよい。

一部の実施形態において、集積マイクロ流体デバイスは、マイクロチャネルおよび／またはチャンバ間の交わる部分に流体の流れを制御するためのマイクロ弁を備えてよい。一部の実施形態において、マイクロチャネルおよび／またはチャンバ間の複数の交わる部分に１つより多くのマイクロ弁が形成されてよい。一部の実施形態において、マイクロ弁は、制御チャネルによって制御され得る。マイクロ弁を起動させるために、制御チャネルの開放端を圧力源、たとえば、ポンプ、シリンジ、高圧シリンダーに接続してよい。ある特定の実施形態において、液体の流れが真空によって誘導され得る。

一部の実施形態において、１つより多くの制御チャネルをマイクロ流体デバイスに設けてよい。１つより多くの制御チャネルをマイクロ流体デバイスに設ける実施形態において、制御チャネルの各々が一緒に操作されてよく、または別々に操作されてよい。たとえば、加圧され得る制御チャネルもあり、その一方で圧力を放出する制御チャネルもある。ある特定の実施形態において、制御チャネルを別々に操作することによって、試料および／または試薬を一部の反応チャンバには添加させることができるが、他には添加させないこともできる。

任意の好適な材料を可撓性膜に使用してよい。たとえば、弾性膜の材料は、ＰＤＭＳ、シリコンゴム、記憶合金、もしくはＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）など、またはそれらの組合せであり得る。

例示的なマイクロ流体デバイスは、様々なマイクロ流体素子が配置されている中心本体構造を含み得る。この本体構造は、全マイクロ流体デバイスの様々なマイクロスケールチャネルおよび／またはチャンバを規定する内側部分はもちろん、外側部分または外面も含む。たとえば、例示的マイクロ流体デバイスの本体構造は、構造が平面であり得る、すなわち実質的に平坦であるか、または少なくとも１つの平坦面を有する固体または半固体基板を典型的に用いる。好適な基板を様々な材料の任意の１つから作製してよく、または材料の組合せから作製してよい。多くの場合、平面基板は、微細作製の分野で一般的な固体基板、たとえば、シリカ系基板、たとえば、ガラス、石英、シリコンまたはポリシリコン、ならびに他の公知の基板、すなわちヒ化ガリウムを使用して製造される。これらの基板の場合、一般的な微細作製技術、たとえば、フォトリソグラフィー技術、湿式化学エッチング、マイクロ機械加工、すなわちドリル加工、微粉砕などを、マイクロ流体デバイスおよび基板の作製に容易に適用することができる。あるいは、たとえば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネートなどを含む、ポリマー基板材料を使用して、本発明のデバイスを作製してよい。そのようなポリマー材料の場合、射出成形またはエンボス加工方法を使用して、本明細書に記載するようなチャネルおよびリザーバ幾何形状を有する基板を形成してよい。そのような場合、上記材料および方法のいずれかを使用して原型を作製してよい。組み立てられたチップを、組み立て後に所望によりプラズマで処理して表面湿潤能力を改変してよく、または好ましくは、先ず処理してその後に組み立ててよい。

キット
本明細書に開示する実施形態は、フィルター；胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；場合により、確認のための顕微鏡で可視化を可能にする透明チャンバを含む、胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスと、単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列を検出するように構成されている試薬とを含む、キットをさらに提供する。

任意の好適な試薬、たとえば、ゲル電気泳動用試薬、クロマトグラフィー用試薬、分光光度測定用試薬などを、単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列を検出するために使用することができる。一部の実施形態において、単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列を検出するための試薬は、シークエンシングデバイスであってよい。

一部の実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドの特異的増幅を可能にするプライマーおよびプライマーペアと、単離された胎児細胞の核酸分子に選択的または特異的にハイブリダイズするプローブとを含んでよい。プローブは、検出可能なマーカー、たとえば、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などで標識されてよい。そのようはプローブおよびプライマーを使用して、単離された胎児細胞中のポリヌクレオチドの存在を検出することができる。

一部の実施形態において、キットは、ポリペプチドの存在を検出するための試薬を含んでよい。そのような試薬は、ポリペプチドに特異的に結合する抗体または他の結合分子であり得る。一部の実施形態において、そのような抗体または結合分子は、多型の結果としてポリペプチドに対する構造のバリエーションを区別することができ、それ故、遺伝子型判定に使用され得る。抗体または結合分子は、検出可能なマーカー、たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、酵素または粒子などで標識され得る。ＥＬＩＳＡなどの結合アッセイを行うための他の試薬をキットに含むことができる。

一部の実施形態において、キットは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または１５のバイオマーカーの遺伝子型判定用の試薬を含む。一部の実施形態において、キットは、増幅された核酸の検出用の捕捉プローブのための表面または基板（たとえば、マイクロアレイ）をさらに含んでよい。

キットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器手段を密封状態で受け入れるための区画化されているキャリア手段をさらに含んでよく、前記容器手段の各々は、本方法で使用されることになる別個の要素の１つを含む。たとえば、容器手段の１つは、検出可能に標識されているプローブ、または検出可能に標識することができるプローブを含んでよい。そのようなプローブは、バイオマーカーに特異的なポリヌクレオチドであり得る。キットにおいて核酸ハイブリダイゼーションを用いて標的核酸を検出する場合、該キットはまた、標的核酸配列の増幅用ヌクレオチド（単数もしくは複数）を収容する容器、および／または酵素的標識、蛍光標識または放射性同位元素標識などのレポーター分子に結合しているレポーター手段、たとえば、アビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質を含む容器もさらに有してよい。

キットは通常、上に記載した容器と、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を伴う添付文書を含む、商業的観点および使用者観点から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器とを含む。組成物を特定の治療または非治療的適用に使用することを示すために容器上にラベルが存在してよく、該ラベルはまた、上に記載したものなどのインビボまたはインビトロいずれかでの使用についての指示を示してよい。

キットは、組織または細胞試料の調製および前記試料からの核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ）の調製のための１組の説明書および材料をさらに含むことができる。

本明細書に開示する実施形態は、本発明の方法を実施する際の使用に好適な様々な組成物であって、キットに使用され得る組成物を提供する。たとえば、本明細書に開示する実施形態は、そのような方法で使用することができるアレイなどの表面を提供する。一部の実施形態において、本発明のアレイは、本発明のバイオマーカーの検出に有用な個々の核酸分子または核酸分子の集合を含む。たとえば、本発明のアレイは、標的核酸を含有する試料にハイブリダイズ可能であり、それによってそのようなハイブリダイゼーションが本発明のバイオマーカーの遺伝子型を示す、一連の別々に配置されている個々の核酸オリゴヌクレオチドまたは核酸オリゴヌクレオチドの組合せのセットを含み得る。

スライドガラスなどの固体基板に核酸を結合させるいくつかの技術が当該分野で周知である。１つの方法は、アミン基、アミン基の誘導体または正電荷を有する別の基の誘導体など、固体基板に結合することができる部分を含有する修飾塩基または類似体を、合成される核酸分子へ組み込むことである。合成された生成物を、その後、その増幅生成物上に存在する反応性基と共有結合を形成するアルデヒドまたは別の反応性基でコーティングされている固体基板、たとえば、スライドガラスと接触させ、前記アルデヒドまたは別の反応性基が前記スライドガラスと共有結合することになる。

母体血試料を妊婦から彼女の妊娠第１三半期または初期第２三半期に採取する。血液試料を採取後４８時間以内に処理する。血液試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：２〜１：２０希釈して適切な体積にする。希釈された血液試料を、フィルターが集積されているマイクロ流体チップに、シリンジまたは自動化ピペット様システムによって適用する。フィルターは、開口パターンおよび構造の点から、５μｍの最小有効開口および様々な他の実施形態を有する。血液試料がフィルターを通過した後、通常は２ｍＬの洗浄用緩衝液をマイクロ流体チップに室温で３回適用する。濃縮された有核血液細胞を、導管により溶液リザーバに接続されているマイクロチャネルを通して染色溶液を適用することによって、ＤＡＰＩで標識する。ＦｉｔｃもしくはＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ７１抗体およびまたは抗ＧＰＡ抗体で標識することを含む、様々な蛍光標識戦略によって同定される胎児細胞。母体有核血液細胞のかなり部分が、蛍光タグ付きＣＤ４５抗体での染色によって除去されるか、または拒絶される。顕微鏡プラットフォーム上にチップを配置することによって、標識された胎児細胞を可視化する。ビデオカメラを使用して、標識された胎児細胞の蛍光画像を、上からの直接照明または下からの落射照明のいずれかによって捕捉する。（この構成の厳密な性質は、まだ検討中である）。

１０ｍｇのプロテインＡ／Ｇ磁性ビーズ混合物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を懸濁させ、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄する。５０μｇのＣＤ４５抗体を、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で希釈した４００μＬのビーズ混合物に添加し、室温で３０分間インキュベートし、回転させる。ＣＤ４５抗体と結合しているビーズを磁気スタンドで分離し、ＢＰＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄する。ＣＤ４５は、白血球を標的にし、採取した血液試料の非胎児集団のかなりの部分を取り除くので、検出および単離のための細胞負荷量を減少させ、スループットを増加させる。抗体コーティングビーズを濃縮された有核血液細胞に添加し、３０分間インキュベートする。チップに磁力を印加してチップ上の回収チャンバにビーズを移動させることによって、ビーズに結合している非胎児細胞を胎児細胞から除去する。また、陰性除去のためにチップ外でのより早期のステップとしてこのステップを行って、部分的に濃縮された血液試料をチップに負荷することもできる。

チップの上層を下層から分離して、標識された胎児細胞を含有するチャンバを露出させる。自動化ロボットピペットを使用して、胎児細胞を、ビデオカメラによって得た蛍光画像を使用してコンピューターによって制御されるマイクロタイタープレートに単離する。採取した胎児細胞からゲノムＤＮＡを精製し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法、マイクロアレイ分析、ＦＩＳＨまたはＳＮＰベースのゲノム分析によって２１番、１８番もしくは１３番染色体トリソミーまたは他の遺伝子異常について分析する。

Claims (24)

1. 非侵襲的出生前診断のために胎児細胞を単離する方法であって、
   母体血試料を用意すること；
   前記母体血試料をマイクロ流体デバイス上に集積されているフィルターに適用して、それによって前記母体血試料から有核血液細胞を濃縮すること；
   前記マイクロ流体デバイス内の前記濃縮された有核血液細胞を、胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する蛍光結合部分または親和性分子で標識すること；および
   前記胎児細胞を単離すること
   を含む、方法。
2. 前記フィルターが透明である、請求項１に記載の方法。
3. 前記有核血液細胞が、該細胞の形態および／または他の物理的特性によって濃縮される、請求項１に記載の方法。
4. 前記マイクロ流体デバイス内の、顕微鏡で可視化可能なチャンバの中の標識された有核血液細胞を可視化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 可視化および／または顕微鏡分析のために、標識された有核血液細胞をフィルター装着マイクロ流体デバイス内に選択的に固定化することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記可視化および／または顕微鏡分析が手動で行われる、請求項５に記載の方法。
7. 前記可視化および／または顕微鏡分析が、マシンビジョンによって自動化される、請求項５に記載の方法。
8. 前記胎児細胞が、有核赤血球（ｎＲＢＣ）である、請求項１に記載の方法。
9. 前記胎児細胞特異的抗原が、ＣＤ４５、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、ベータ−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−バイオホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテイナーゼ１４）、および胎児ヘモグロビンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記フィルターが、有核血液細胞を濃縮するように、かつ／または成熟赤血球（ＲＢＣ）を除去するように構成される、請求項１に記載の方法。
11. 非胎児細胞を除去することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記非胎児細胞を除去することが、前記非胎児細胞を固定化することを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記胎児細胞を固定化することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記胎児細胞を固定化することが、前記胎児細胞と、胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子とを接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記胎児細胞特異的抗原が、ＣＤ４５、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、ベータ−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−バイオホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテイナーゼ１４）、および胎児ヘモグロビンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記単離された胎児細胞をシークエンシングによって核酸配列について分析すること、または前記単離された胎児細胞の遺伝子異常を、ＦＩＳＨもしくはＤＮＡマイクロアレイなどの他の一般に使用されている方法を使用して検出することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 核酸分子のヌクレオチド配列を分析することが、１つ以上の単離された胎児細胞のゲノムＤＮＡに検出可能なプローブをハイブリダイズさせることを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記核酸分子のヌクレオチド配列を分析することが、１つ以上の単離された胎児細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記ゲノムＤＮＡをシークエンシングすることが、単細胞のＤＮＡのシークエンシングを含み、単細胞のＤＮＡのシークエンシングが、１つ以上の単離された胎児細胞について行われる、請求項１８に記載の方法。
20. 遺伝子の発現の分析が、１つ以上の単離された胎児細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせることを含む、請求項１６に記載の方法。
21. 前記単離された胎児細胞が、遺伝子欠陥について分析される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスであって、
    フィルター；
    胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；および
    顕微鏡で可視化可能なチャンバ
    を含む、集積マイクロ流体デバイス。
23. 単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチド配列を検出するように構成されている試薬を含む、請求項２２に記載の集積マイクロ流体デバイス。
24. フィルター；
    胎児細胞特異的抗原または非胎児細胞特異的抗原に特異的に結合する結合部分または親和性分子；および
    顕微鏡で可視化可能なチャンバ
    を含む、胎児細胞の非侵襲的単離のための集積マイクロ流体デバイスと、
    単離された胎児細胞の１つ以上のヌクレオチド配列を検出するように構成されている試薬と
    を含む、キット。

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