JP2018139603A - Ｄｎａミニサークルおよびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】無細胞系において環状核酸を生成するための、方法およびキットの提供。【解決手段】組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程；核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程；及び、タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程；を含む環状核酸を生成する方法。【選択図】図１

Description

発明の分野
[0001] 本発明は、一般に、環状核酸産物を形成するための、核酸の等温増幅のための、方法およびキットに関連する。本発明中に記述される核酸の無細胞増幅方法は、コンタミネーションを回避することを助け、そしてDNAに基づく治療において望ましい、高品質
の核酸を生成する。

背景
[0002] 高品質環状核酸の生成は、核酸に基づく治療への適用、細胞株の形質転換または形質導入に関与する研究などにおいて、望ましい。例えば、遺伝子療法におけるデオキシリボ核酸（DNA）に基づく治療法、遺伝子導入、およびDNAワクチン接種は、高純度、効能、有効性、および安全性に関して厳密な品質基準を有する、DNAの大量生成を必要とす
る。

[0003] ヌクレアーゼによって、線状DNA分子は迅速に分解され、それがワクチン接種
などのDNAに基づく治療への適用のためのその使用を制限する。そのため、現時点で使用
可能なDNA治療への適用のほとんどは、環状核酸またはプラスミドを使用する。スーパー
コイル状DNAプラスミドは、それがヌクレアーゼによっては容易に分解されないため、前
記適用において特に有益である。これらの環状核酸またはプラスミドは、通常、細菌細胞培養によって増やされ、そして細菌細胞からのその精製は、しばしば、有害または毒性のある試薬を使用する。そのため、前記プラスミド調製手段は、毒性試薬、トランスポゾンおよびその他のエピソームDNA、残留した宿主細胞核酸、残留した宿主細胞タンパク質、
エンドトキシンなどに関して、コンタミネーションの潜在的なリスクを伴う。核酸に基づく治療のために必要な品質基準を満たすためには、労力を要し、時間を要し、かつ高価である、広範囲の精製技術がしばしば必要とされる。

[0004] 無細胞系核酸増幅技術は、あらゆる細菌コンタミネーションのない、高品質の核酸を生成する、実行可能な代替手段を提供する。前記のin vitro核酸増幅技術は、費用節減、合理化された生産、および単純化された精製に関しても、大きな利点を有する。しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの、いくつかのin vitro核酸増幅方法は
、迅速な温度サイクリングを必要とし、そしてそのために、高品質核酸の大量生成にはあまり適していない。さらに、線状DNA配列である、PCR産物は、ヌクレアーゼの作用によって、宿主内において迅速に分解される。対照的に、ローリングサークル増幅（RCA）また
は鎖置換反応（SDA）などの、等温核酸増幅技術は、より少ない労力および費用で高品質
核酸を生成するために用いられることができる。RCAは典型的に、インプットされた環状
核酸鋳型配列の線状タンデムリピートユニットを含む、コンカテマーを産生する。これらのタンデムリピート配列は、クローニングおよびシークエンシングといった日常的な分子生物学実験において、有用である。しかしながら、これらのコンカテマーの形質転換効率またはトランスフェクション効率は、しばしば、より低いため、それらは、核酸に基づく治療においてはめったに使用されない。コンカテマーを環状核酸（ミニサークル）に変換するために使用される現在知られている方法は、複数の酵素反応が関与する、複数の段階を必要とする。例えば、コンカテマーをまず制限酵素を使用して小さいフラグメントに切断することができ、そして次に、リガーゼを使用して再びライゲーションして、環状核酸を生成することができる。好ましくはあらゆる細菌配列およびコンタミナントのない、高品質の環状核酸を大量生産する効率的な方法が必要である。

簡単な説明
本明細書の記載は以下の発明の開示を包含する。

［１］以下の工程：
組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程；
核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程；および、
タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程；
を含む環状核酸を生成する方法。

［２］組換え部位が、部位特異的組換え部位を含む、［１］に記載の方法。

［３］組換え部位がloxP部位を含む、［１］または［２］に記載の方法。

［４］組換えタンパク質が、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグ
ラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼより選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。

［５］組換えタンパク質が、バクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼを含む、
［４］に記載の方法。

［６］さらに、エキソヌクレアーゼとインキュベーションする工程を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。

［７］エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、またはその組み合わせより選択される、［６］に記載の方法。

［８］さらに、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とインキュベーションする工程を含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。

［９］さらに、環状核酸を原核細胞へ形質転換する工程を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。

［１０］さらに、環状核酸を真核細胞へトランスフェクションする工程を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。

［１１］［１］に記載の方法によって調製される環状核酸、またはその誘導体を含む、組成物。

［１２］環状核酸が発現カセットを含む、［１１］に記載の組成物。

［１３］発現カセットが、ＲＮＡに転写することができる核酸配列を含む、［１２］に記載の組成物。

［１４］発現カセットがポリペプチドをコードする遺伝子を含み、そしてポリペプチドが宿主において免疫応答を生み出すことができる、［１２］に記載の組成物。

［１５］発現カセットが、真核生物発現カセットを含む、［１２］に記載の組成物。

［１６］ヒト、動物、または植物の、疾患または遺伝子疾患の、予防または治療における、［１１］に記載の組成物の使用。

［１７］以下の工程：
組換え部位を含むように設計される環状核酸鋳型を、インキュベーションする工程；
ローリングサークル増幅によって環状核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含む環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含むコンカテマーを形成する工程；および、
コンカテマーを組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程；
を含む、無細胞系において、環状核酸を生成する方法。

［１８］ローリングサークル増幅が、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下、環状核酸鋳型を、プライマーおよびPhi29 DNAポリメラーゼとインキュベーションする工程
を含む、［１７］に記載の方法。

［１９］組換え部位がSEQ ID NO: 1を含む、［１７］または［１８］に記載の方法。

［２０］組換えタンパク質がCreリコンビナーゼを含む、［１７］〜［１９］のいずれ
かに記載の方法。

［２１］環状核酸を処理（processing）して、核酸ワクチンを生成する工程をさらに含む、［１７］〜［２０］のいずれかに記載の方法。

［２２］以下の工程：
組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程；
核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程；および、
タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして、核酸ワクチンを生成する工程；
を含む、核酸ワクチンを生成するための方法。

［２３］核酸鋳型がさらに発現カセットを含む、［２２］に記載の方法。

［２４］以下の構成：
Phi29 DNAポリメラーゼ；および、
組換えタンパク質；
を含む、無細胞系において環状核酸を生成するためのキット。

［２５］組換えタンパク質が、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテ
グラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼより選択される、請求項24に記載のキット。

［２６］さらに、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼII、またはその組み合わ
せより選択されるエキソヌクレアーゼを含む、［２４］または［２５］に記載のキット。

[0005] 本発明の1つまたはそれ以上の態様は、無細胞系において環状核酸を生成する
方法およびキットを提供する。いくつかの態様において、環状核酸を生成する方法は、核酸増幅の方法を含む。いくつかの態様において、核酸増幅の方法は、組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程；核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配
列を形成する工程；および、タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程；を含む。一態様において、核酸鋳型内の組換え部位は、部位特異的な組換え部位を含む。1つの例示的な態様において、核酸鋳型内の部
位特異的な組換え部位は、loxP部位を含む。一態様において、組換えタンパク質は、Cre
リコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、
または細菌性XerCDリコンビナーゼから選択される。

[0006] いくつかの態様において、無細胞系において環状核酸を生成する方法が提供される。一態様において、この方法は、組換え部位を含むように設計される、環状核酸鋳型をインキュベーションする工程を含む。この方法は、ローリングサークル増幅によって環状核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含む環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含むコンカテマーを形成する工程を含む。この方法はさらに、コンカテマーと組換えタンパク質をインキュベーションして、環状核酸を生成する工程を含む。

[0007] いくつかの態様において、核酸ワクチンを生成する方法が提供される。一態様において、この方法は、組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程、核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程、およびタンデムリピート核酸配列と組換えタンパク質とをインキュベーションして、核酸ワクチンを生成する工程；を含む。

[0008] いくつかの態様において、無細胞系において環状核酸を生成するキットが提供される。一態様において、このキットは、Phi29 DNAポリメラーゼおよび組換えタンパク
質を含む。1つの例示的な態様において、このキットは、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼから選択される組換えタンパク質を含む。1つの例示的な態様において、キットはさ
らに、エキソヌクレアーゼを含む。

[0009] 本発明のこれらおよびその他の特徴、観点、および利点は、添付の図を参照して、以下の詳細な説明が読まれる場合、よりよく理解されるようになるであろう。
[0010] 図1は、発明の一態様に従って、環状核酸を生成する方法の概略図である。 [0011] 図2は、NM522細胞において、発明の一態様に従って生成される核酸の、形質転換効率を示す。 [0012] 図3は、FB5α細胞において、発明の一態様に従って生成される核酸の、形質転換効率を示す。

詳細な説明
[0013] 請求される発明の主題を、より明らかにかつ簡潔に記述および指摘するために、以下の説明および添付の請求項において使用される特定の用語について、以下の定義が提供される。明細書を通して、特定の用語の例示は、限定されない例として、見なされるべきである。正確な使用、試薬の選択、濃度、容量、インキュベーション時間、インキュベーション温度などの変数の選択は、大部分は、意図されるものへの特有の適用に依存する可能性がある。当業者は、本開示に基づく適切な変数を同定することができるであろうことが理解される。しかしながら、本開示の利点を与えられれば、これらおよびその他の適用の型に適切である、本発明の原理に従った方法を使用するための適切な条件を、選択および最適化することは、当業者の能力の範囲内であろう。

[0014] 以下の明細書、および続く請求項において、以下の意味を有する多数の用語に
ついて、参照が作成されるであろう。単数形の“a”、“an”および“the”は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数形の指示対象を含む。明細書および請求項を通して、本明細書中で使用される場合、近似の言語は、それに関する基本的機能における変化を結果としてもたらさずに、許容範囲で変化することが可能である、あらゆる定量的表現を修飾するために、適用することができる。従って、“約”などの用語によって修飾される値は、特定の正確な値に限定されない。いくつかの例において、近似の言語は、値を測定する機器の精度に対応する可能性がある。同様に、“〜がない（free）”は、あるものと結びついて使用することができ、そしてその修飾されたものがまだないと見なされる、ごくわずかな数または微量を、含むことができる。

[0015] 本明細書中で使用される場合、“インキュベーションする”という用語は、溶液または反応混合物を、あらかじめ決められた温度および圧力においてあらかじめ決められた期間維持して、特定の反応に達するプロセスを言う。インキュベーションの温度および期間は、インキュベーションの目的（例えば、環状核酸の生成）が、インキュベーションの終わりに達成されるように、適切に選択される。インキュベーション時間および温度は、反応に関与する試薬／酵素の速度論的特性に応じて変化し得る。

[0016] 本明細書中で使用される場合、“反応混合物”という用語は、1つまたはそれ
以上の化学的分析または生物学的アッセイの実行に使用される、試薬または試薬溶液の組み合わせを言う。いくつかの態様においいて、反応混合物はDNA合成／増幅反応を実行す
るために必要であるすべての構成要素を含む。いくつかの態様において、反応混合物は、タンデムリピート核酸配列を環状化するために必要であるすべての構成要素を含む。

[0017] 本明細書中で使用される場合、“増幅”という用語、または“増幅する”という用語は、核酸鋳型の複数のコピーを産生すること、または核酸鋳型に相補的である、複数の核酸配列のコピーを産生することを言う。

[0018] 本明細書中で使用される場合、“ヌクレオチド”という用語は、天然のヌクレオシドリン酸、および修飾されたヌクレオシドリン酸の両方を言う。“ヌクレオシド”という用語は、糖または糖代替物（例えば炭素環式部分または非環式部分）に、1'位または同等の位置で結合した、プリン、デアザプリン、ピリミジン、または修飾塩基を有する化合物を言う。ヌクレオシドは、糖または糖代替物の2'-デオキシ体、2'-ヒドロキシル体、または2',3'-ジデオキシ体、並びにその他の置換体を含むことができる。ヌクレオシドリン酸中の糖部分は、リボースなどの五炭糖であってよく、そしてリン酸エステル化部位は、ヌクレオシドの五炭糖のC-5位に結合したヒドロキシル基に相当することができる。ヌ
クレオチドは、限定するものではないが、デオキリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）であってよい。デオキリボヌクレオシド三リン酸は、限定するものではないが、デオキリボアデノシン三リン酸（2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸、またはdATP）、デオキシリボシトシン三リン酸（2'-デオキシシチジン5'-三リン酸、またはdCTP）、デオキシリボグアノシン三リン酸（2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸、またはdGTP）、またはデオキリボチミジン三リン酸（2'-デオキチジミジン5'-三リン酸、またはdTTP）であってよい。

[0019] 本明細書中で使用される場合、“オリゴヌクレオチド”という用語は、ヌクレオチドのオリゴマーまたはその誘導体を言う。明細書を通して、オリゴヌクレオチドが文字の配列によって示される際はいつでも、ヌクレオチドは左から右へ、5'→3'の順である。文字配列において、文字Aはアデノシンを表し、Cはシトシンを表し、Gはグアノシンを
表し、Tはチミジンを表し、WはAまたはTを表し、そしてSは、GまたはCを表す。Nは、ランダムな核酸塩基を示す（例えば、NはA、C、G、U、またはTのいずれでもよい）。合成の、ロックされた（locked）、ランダムヌクレオチドは、+Nによって示され、そしてホスホロチオエート修飾されたランダムヌクレオチドは、^*Nによって示される。

[0020] 本明細書中で使用される場合、“核酸”または“オリゴヌクレオチド”は、DNA、またはRNA、またはその類似体（たとえばホスホロチオエート類似体）であってよい。核酸またはオリゴヌクレオチドには、修飾塩基、バックボーン、および／または末端が含まれていてもよい。限定的ではない、合成バックボーンの例には、核酸に対して安定性および／またはその他の利点を与える、ホスホロチオエート、ペプチド核酸、ロックされた核酸、キシロール核酸、またはそれらの類似体が含まれる。

[0021] 本明細書中で使用される場合、“プラスミド”または“プラスミドDNA”とい
う用語は、染色体の核酸から分離される、染色体外核酸を言う。プラスミドDNAは、細胞
内において、染色体の核酸（染色体DNA）とは独立して複製することができる。プラスミ
ドは、しばしば、環状かつ二本鎖である。

[0022] 本明細書中で使用される場合、“発現カセット”は、特に着目される核酸配列を含む、核酸配列を言う。例えば、発現カセットは、1つまたはそれ以上の遺伝子、およ
びそれらの発現を制御するための核酸配列を含むことができる。発現カセットは、しばしば、プロモーター配列およびオープンリーディングフレームを含むことができる。それには、真核細胞において通常ポリアデニレーション部位を含む、3'非翻訳領域が、含まれていてもよい。異なる発現カセットは、的確な制御配列が使用される限りは、細菌、酵母、植物、または哺乳動物細胞を含む異なる生物中に、形質転換、トランスフェクション、または形質導入することができる。それぞれの成功した形質転換において、発現カセットは、細胞の機構に、RNAおよび／またはタンパク質を作製するように、指示することができ
る。

[0023] 本明細書で使用される場合、“プライマー”という用語は、核酸鋳型（例えば、増幅されるDNA鋳型）にハイブリダーゼーションする、短い線状オリゴヌクレオチドを
言う。プライマーは、特異的なプライマーまたはランダムプライマーであってよい。特異的なプライマーは、それがアニーリングする核酸鋳型のあらかじめ決められた領域の、逆向きの相補鎖である配列を有するように、設計される。プライマーの長さの上限および下限は両方とも、経験的に決定される。プライマー長の下限は、核酸鋳型とハイブリダイゼーションする際に、安定な二本鎖を形成するために必要である、最小限の長さである。非常に短いプライマー（通常、3ヌクレオチド長より短い）は、ハイブリダイゼーション条
件下、核酸鋳型と、熱力学的に安定な二本鎖を形成しない。上限は、核酸鋳型中のあらかじめ決められた核酸配列以外の領域において、二本鎖形成を有する可能性によって決定される。適切なプライマーの長さは、約3〜約100ヌクレオチド長の範囲内であってよい。適切なプライマーの長さは、約3〜約40ヌクレオチド長であるか、または約3〜約25ヌクレオチド長であってよい。いくつかの態様において、適切なプライマーは長さが6ヌクレオチ
ドであるヘキサマーである。

[0024] 本明細書中で使用される場合、“DNAポリメラーゼ”という用語は、新たなDNAの産生または合成を触媒するあらゆる酵素を言う。DNAポリメラーゼは、DNA合成の鋳型として、存在しているDNAまたはRNAを使用し、そしてそれが読む鋳型鎖に沿って、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。新たに合成されるDNA鎖は、鋳型鎖に相補的である
。DNAポリメラーゼは、新たに形成される鎖の3'-ヒドロキシル基末端にのみ遊離ヌクレオチドを加えることができる。それは、ヌクレオシド三リン酸（NTP）またはデオキリボヌ
クレオシド三リン酸（dNTP）から、伸長しているオリゴヌクレオチド鎖の3'-ヒドロキシ
ル基への、ヌクレオシド一リン酸の移動を介して、オリゴヌクレオチドを合成する。これは、新たな鎖の5'→3'方向への伸長という結果をもたらす。DNAポリメラーゼは、前もっ
て存在する3'-OH基上にヌクレオチドを加えることしかできない。そのため、DNA合成反応を始めるために、DNAポリメラーゼは、一番目のヌクレオチドをそこに加えることができ
る、プライマーを必要とする。適切なプライマーは、RNAおよびDNAを含む。

[0025] 本明細書中で使用される場合、“プルーフリーディングDNAポリメラーゼ”と
いう用語は、DNA合成を実行する間に、そのエラーを訂正することができる、あらゆるDNAポリメラーゼを言う。プルーフリーディングDNAポリメラーゼは、そのポリメラーゼ活性
とは別に3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、そしてこのエキソヌクレアーゼ活性は、ここではプルーフリーディング活性と言われる。前記ポリメラーゼのプルーフリーディング活性は、新たに合成されたDNAにおける間違いを訂正する。DNA合成の間に、正しくない塩基対が認識されると、プルーフリーディングDNAポリメラーゼが、DNAの1塩基対ごとに
その方向を逆に戻す。酵素の3'→5'エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）は、正しくない塩基対を削除することができる。塩基の削除に続いて、ポリメラーゼは正しい塩基を再び挿入し、その後、DNA合成を続ける。遊離dNTPがDNA合成に適する溶液または反応混合物中に存在する場合、プルーフリーディングDNAポリメラーゼの主要な活性
は、DNA合成である。しかしながら、DNA合成反応用のdNTPが入手できない場合、プルーフリーディングDNAポリメラーゼの主要な活性は、その3'→5'エキソヌクレアーゼ活性であ
ることができる。いくつかのプルーフリーディングDNAポリメラーゼは、それらのプルー
フリーディング活性において、およびそれらのポリメラーゼ活性において、二価陽イオンの存在を必要とする可能性がある。プルーフリーディングポリメラーゼのプルーフリーディング活性のスイッチを入れることができる、適切な二価陽イオンは、限定するものではないが、マグネシウムまたはマンガンを含む。

[0026] 本明細書中で使用される場合、“試薬溶液”または“DNA合成反応を実行する
ために適切な溶液”という用語は、増幅反応またはDNA合成を実行するために典型的に使
用される、あらゆる溶液を言う。それには、限定するものではないが、等温DNA増幅方法
において使用される溶液、PCR増幅反応において使用される溶液などが含まれてもよい。DNA合成反応に適切な溶液は、バッファー、塩、および／またはヌクレオチドを含むことができる。それはさらに、プライマーおよび／または増幅されるDNA鋳型を含むことができ
る。

[0027] 本明細書中で使用される場合、“組換えタンパク質”という用語は、組換えを媒介することができるタンパク質、例えば、リコンビナーゼを言う。組換えタンパク質は、相同組換えまたは非相同組換えのどちらか、または両方を媒介することができる。限定しない組換えタンパク質の例には、バクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼ、バ
クテリオファージラムダインテグラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、細菌性XerCDリコンビナーゼなどの、DNAリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーが含まれる。

[0028] 本明細書中で使用される場合、“loxP部位”（locus of X-over Pl）または“loxP組換え部位”という用語は、Cre組換えタンパク質またはCreリコンビナーゼによって特異的に認識される配列を言う。loxP部位は野生型loxP部位または修飾loxP部位であってよい。野生型loxP部位は、8 bpの非対称コア配列（スペーサー）領域に隣接する2つの13 bpの逆向きリピート（パリンドローム）を含む、34塩基対（bp）の配列を含み、それが方向性を与える（SEQ ID NO: 1）。組換え交換は、非対称コア配列において行われる。1つ
のCreリコンビナーゼ分子が、それぞれのパリンドローム配列に結合する。野生型loxP部
位において、鎖開裂位置は、8-bp非対称コアの、最初の塩基より後ろ、そして最後の塩基より前の塩基である。

[0029] 本明細書中で使用される場合、“組換え部位”という用語は、組換え事象の可能性が通常よりも高い、核酸配列における位置を言う。組換え部位は、組換えのために好ましい核酸配列を含む。本明細書中で使用される場合、“部位特異的組換え部位”という用語は、特異的な配列を含む組換え部位を言い、これが特異的な組換えタンパク質によっ
て認識される。例えば、部位特異的組換え部位は、loxP部位を含むことができる。Cre組
換えタンパク質は、核酸配列中の2つの別個のloxP部位を特異的に認識し、そしてそれら
の部位の間で組換えをもたらす。

[0030] 本明細書中で使用される場合、“Cre組換えタンパク質”または“Creリコンビナーゼ”または“Cre”（環化組換え、cyclization recombination）という用語は、loxP部位を認識し、そして核酸の部位特異的組換えを触媒する、部位特異的組換えタンパク質を言う。CreリコンビナーゼはDNAリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーの構成員である。それは、4つのサブユニットと2つのドメイン（より大きいカルボキシル（C-末端）ドメイン、およびより小さいアミノ（N-末端）ドメイン）を含む、34kDaのタンパク質で
ある。Cドメインは酵素の触媒部位を含む。Creリコンビナーゼは、補因子のいずれの必要もなく、DNAの特異的な配列を組換える。loxP部位は、8 bpのコア配列領域（スペーサー
）に隣接する、2つの13 bpの逆向きリピート（パリンドローム）を含む、34塩基対（bp）のDNA配列を含み、これが方向性を与える。組換え産物は、loxP部位の数、位置、および
相対的方向に応じて変化することができる。互いのloxP部位の方向に応じて、Creリコン
ビナーゼは、DNA配列を、切り出し、交換し、組み込み、または反転することができる。2つのCreリコンビナーゼが、各loxP部位に対して、パリンドロームの半分上に1つずつ結合する。従って、DNAに結合したCreリコンビナーゼは、4量体の複合体を形成し、2つのloxP部位を近接させる。Creを介する、loxP部位間の鎖開裂および交換は、8 bpコア領域の最
初の塩基の後、そして最後の塩基の前で生じる。Creリコンビナーゼは、分子間DNA交換、および分子内切除または反転の、両方を触媒する。例えば、1つのloxP部位を含む2つのDNA分子が融合することができる。反対に、二つのloxP部位が同じDNA分子内に、同じ方向で位置する場合（同方向に並んだ（co-aligned））、Creを介する組換えは、loxP部位間でDNA配列を選択的に切除し、そして切除されたDNA配列を環状化する。Creはまた、逆反応、すなわち1つのloxP部位へのDNAの組み込み、を触媒するが、挿入されたDNAは2つのloxP部位によって直接に隣接され、再切除が可能になるため、組み込みは大抵の場合効率的でない。このことにより、Creを介する切除は、事実上不可逆性となる。2つのloxP部位が逆向きである場合、Creを介する組換えは、残りのDNAに関してloxP部位間のDNA配列の反転を
導く。

[0031] 1つまたはそれ以上の態様は、環状核酸を生成する方法に関する。環状核酸は
、無細胞増幅系を使用して生成される。これらの無細胞増幅方法は、あらゆる細菌コンタミネーションのない、高品質の環状核酸を生じる。前記高品質環状核酸の生成は、研究、分析、診断、予後診断、または法医学への適用などの適用などにおいて、望ましい可能性がある。結果的に得られる核酸が、医療への適用、例えばDNAワクチンの生成に使用され
る場合、環状核酸の無細胞生成は、特に望ましい可能性がある。

[0032] 核酸の増幅、およびそれに続く環状核酸の生成の方法の、1つまたはそれ以上
の態様は、一般に、核酸鋳型を増幅して増幅された核酸を生成する工程、および増幅された核酸の環状核酸への変換の工程を含む。いくつかの態様において、増幅された核酸は、組換え部位を含むように設計される。次に、組換え部位を含む増幅された核酸は、組換えタンパク質を介する核酸組換えによって、環状核酸に変換される。いくつかの態様において、組換え部位を含む増幅された核酸は、組換え部位を含む核酸鋳型を選択し、そして選択された核酸鋳型を増幅することによって、生成することができる。その他の態様において、核酸鋳型は、組換え部位を含むように設計することができ、そして設計された核酸鋳型を増幅することにより、組換え部位を含む増幅された核酸を生成する。核酸鋳型の設計は、限定するものではないが、クローニングなどの当技術分野において既知である遺伝子工学的技術または分子生物学的技術のいずれかの技術によって、達せられることができる。いくつかの態様において、組換え部位は、部位特異的な組換え部位であってもよく、そして増幅された核酸から環状核酸を生成するために使用される組換えタンパク質は、部位
特異的なリコンビナーゼであってもよい。

[0033] 核酸鋳型は、一本鎖核酸鋳型であってもよく、または二本鎖核酸鋳型であってもよい。核酸鋳型は、デオキリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）を含むことができる。核酸鋳型は、合成核酸または天然の核酸であってよい。核酸鋳型はまた、修飾されたヌクレオチドを含むこともできる。核酸鋳型は、環状核酸鋳型であってもよく、または線状核酸鋳型であってもよい。いくつかの態様において、核酸鋳型は、環状核酸鋳型である。いくつかの例示的な態様において、線状核酸鋳型を環状化させて、環状核酸鋳型を生成する。1つの例示的な態様において、線状核酸鋳型の環状化は、酵素反応によって、例えばDNAリガーゼなどのライゲーション酵素とのインキュベーションによって、達成される。

[0034] いくつかの例示的な態様において、核酸鋳型はloxP組換え部位を含むように設計される。1つの例示的な態様において、核酸鋳型は、野生型loxP組換え部位を含むよう
に設計される。その他の態様において、核酸鋳型は、Creリコンビナーゼによって認識す
ることができる、変異型loxP組換え部位を含むように設計される。loxP組換え部位を含む核酸鋳型を、続いて増幅して、loxP組換え部位を含む増幅された核酸を生成する。増幅された核酸内のloxP組換え部位は、同方向性の様式において（同方向に並んで（co-aligned）または同じ方向において）、配列することができる。loxP組換え部位を含む増幅された核酸は、次にCreリコンビナーゼとともにインキュベーションされる。Creリコンビナーゼは、loxP組換え部位間の核酸配列が切除される、分子内切除反応を媒介する。続いて、Creリコンビナーゼは、切除された核酸配列を環状化して、環状核酸を生成する。1つの例示的な態様において、環状核酸の生成に使用されるCreリコンビナーゼは、バクテリオファ
ージP1 cre遺伝子の38 kDa産物である。

[0035] 核酸鋳型を、様々な核酸増幅方法のいずれかを使用して、増幅することができる。いくつかの態様において、核酸鋳型の増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの
、温度サイクリング方法を使用して行うことができる。いくつかの態様において、核酸鋳型は、等温核酸増幅方法を使用して増幅することができる。本発明中で使用され得る核酸増幅方法の限定的ではない例には、リガーゼ連鎖反応（LCR）、自己持続性（self-sustained）配列複製（SSR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ループを介する等温増幅（LAMP）、Qb-レプリカーゼを伴う増幅などが、含まれる。いくつかの例示的な態様において、核酸鋳型は、鎖置換増幅反応（SDA）を使用して増幅される。その他の例示的な態様にお
いて、核酸鋳型は、多置換増幅（MDA）を使用して増幅される。いくつかの特定の態様に
おいて、核酸鋳型は、ローリングサークル増幅（RCA）方法を使用して増幅される。本発
明において使用され得るローリングサークル増幅は、線形RCA（LRCA）であってもよく、
あるいは指数関数的RCA（ERCA）であってもよい。いくつかの例示的な態様において、多
重プライミング（multiply primed）ローリングサークル増幅（MPRCA）が、核酸鋳型の増幅において使用される。

[0036] いくつかの態様において、核酸鋳型は、増幅された核酸を生成するために、核酸増幅反応が行われるのに適する溶液中において増幅される。増幅反応は、しばしば、プライマー、核酸ポリメラーゼ、および遊離ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP））などの試薬を使用する。増幅反応において使用される核酸ポリメラーゼは、プルーフリーディング核酸ポリメラーゼであってもよい。いくつかの態様において、核酸増幅反応に使用されるそれぞれの試薬は、前処理して、あらゆるコンタミネーションする核酸配列を取り除くことができる。いくつかの態様において、試薬の前処理には、紫外線照射の存在下における、試薬のインキュベーションが含まれる。いくつかの態様において、試薬は、ヌクレアーゼおよびその補因子（例えば、金属イオン）の存在下、試薬をインキュベーションすることによって、脱コンタミネーションされる。適切なヌクレアーゼには、限定するものではないが、エキソヌクレアーゼIまたはエキソヌクレアー
ゼIIIなどのエキソヌクレアーゼが含まれる。DNA増幅反応に使用することができるプルーフリーディングDNAポリメラーゼは、二価金属イオン（例えば、マグネシウムまたはマン
ガン）とインキュベーションすることにより、脱コンタミネーションすることができる。核酸鋳型増幅において使用される遊離ヌクレオチドには、天然のヌクレオチド（例えば、dATP、dGTP、dCTP、またはdTTP）、またはそれらの修飾類似体が含まれてよい。核酸増幅を効率的に生じさせるために、バッファー、塩などのその他の構成要素もまた、添加することができる。

[0037] いくつかの態様において、環状核酸を生成するため、核酸鋳型の増幅および増幅された核酸鋳型の環状化（例えば組換え反応における）は、単一の容器内で行われる。増幅反応および組換え反応は、連続して行われるか、または同時に行うことができる。例えば、核酸増幅のための反応混合物は、増幅された核酸の環状化に必要とされる試薬も、含むことができる。核酸増幅および環状核酸の生成の方法は、手動で行われるか、あるいは、自動化されるかのどちらであってもよい。いくつかの態様において、この方法のいくつかの工程は、手動で行うことができ、一方その他の工程は、自動化することができる。

[0038] 核酸増幅の方法の一態様において、この方法は、核酸鋳型を提供する工程、核酸鋳型を増幅してタンデムリピート核酸配列を形成する工程、およびタンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして環状核酸を生成する工程、を含む。一態様において、核酸鋳型は、組換え部位を含む。

[0039] 核酸鋳型は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）を含むことができる。核酸鋳型は、一本鎖核酸鋳型であってもよく、または二本鎖核酸鋳型であってもよい。核酸鋳型は、合成核酸または天然の核酸であってよい。核酸鋳型はまた、修飾ヌクレオチドを含むこともできる。

[0040] いくつかの態様において、核酸鋳型は組換え部位を含むように設計することができる。核酸鋳型の設計は、様々な遺伝子工学的技術または分子生物学的技術によって、達成することができる。組換え部位は、相同組換え部位であってもよく、または非相同組換え部位であってもよい。いくつかの態様において、組換え部位は、部位特異的組換え部位であってもよい。使用することができる部位特異的組換え部位の限定的ではない例は、loxP部位、attB部位、またはattP部位を含む。いくつかの態様において、核酸鋳型は、複数の部位特異的組換え部位を含む。いくつかの態様において、複数の部位特異的組換え部位は、1つの、同一の組換え部位での複数事象の結果として得ることができる。その他の
態様において、複数の部位特異的組換え部位は、2つまたはそれ以上の異なる部位特異的
組換え部位での1つまたはそれ以上の事象の結果として、得ることができる。例えば、い
くつかの態様において、核酸鋳型は、2つまたはそれ以上のloxP部位を含むことができる
。その他の態様において、核酸鋳型は、attB部位およびattP部位を含むことができる。さらに、その他の態様において、核酸鋳型は、1つまたはそれ以上のloxP部位、および1つまたはそれ以上のattB部位、および／またはattP部位を含むことができる。いくつかの態様において、核酸鋳型内の複数の部位特異的組換え部位は、同方向性の（同じ方向において配列される、または同方向に並んだ（co-aligned））様式において、配列することができる。その他の態様において、核酸鋳型内の複数の部位特異的組換え部位のいくつかは、同方向性の様式において配列することができ、一方、その他は、逆方向において配列することができる。いくつかの態様において、これらの部位特異的組換え部位は、同方向性の、部位特異的組換えタンパク質によって認識される。本発明において使用することができる、適切な部位特異的組換えタンパク質には、限定するものではないが、Creリコンビナー
ゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼが含まれる。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、バクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼを含む。適切な組換えタンパク質の選択は、組
換え部位の配列および／または方向によって、主に決定される。

[0041] 1つの例示的な態様において、核酸鋳型は、デオキシリボ核酸（DNA）鋳型である。DNA鋳型は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むことができる。DNA鋳型は、環状DNA鋳型、線状DNA鋳型、または切れ目の入った（nicked）DNA鋳型であってよい。いくつかの態様において、核酸鋳型は、環状DNA鋳型であり、そしてこの方法を使用して、環状DNA鋳型を増幅し、無細胞系において環状DNA（DNAミニサークル）の複数のコピーを生成することができる。いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、組換え部位を含む。前記態様において、
この方法は、タンデムリピートDNA配列を産生するための組換え部位を含む環状DNA鋳型の、in vitroでの増幅を含むことができる。産生されたタンデムリピート配列は、複数の組換え部位を含む。方法は、さらに、タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とともに処理し、タンデムリピートDNA配列から環状DNAの複数のコピーを生成することを含むことができる。

[0042] いくつかの態様において、核酸鋳型は、環状DNA鋳型である。様々な方法を使
用して、本発明の方法において使用される環状DNA鋳型を調製することができる。いくつ
かの態様において、線状DNA鋳型を環状化して、環状DNA鋳型を生成することができる。1
つの例示的な態様において、線状DNA鋳型の環状化は、酵素反応によって、例えば、DNAリガーゼなどのライゲーション酵素とともにインキュベーションすることによって、達成することができる。いくつかの態様において、線状DNA鋳型の末端を核酸配列にハイブリダ
イゼーションして、末端同士がごく接近するようにする。ライゲーション酵素とのインキュベーションは、次に、ハイブリダイゼーションされた線状DNA鋳型の環状化を達成し、
環状DNA鋳型を生成することができる。いくつかの態様において、プラスミドDNAは、環状DNA鋳型として使用することができる。いくつかの態様において、細菌内でのプラスミドDNAの選択および複製に必要である、典型的な遺伝子配列を欠損した修飾プラスミドDNAは
、環状DNA鋳型として使用することができる。いくつかの態様において、既存のプラスミ
ドDNAを酵素的に修飾して、適切な環状DNAを生成することができる。例えば、既存のプラスミドDNAの制限酵素を介する消化と、それに続く再環状化を使用して、環状DNA鋳型を生成することができる。適切な環状DNA鋳型はまた、適切なPCRプライマーを使用して、より大きいDNA（例えば、ゲノムDNAまたはDNAライブラリー由来のDNA）の一部分をPCR増幅し
、それに続いてPCR産物を環状化することによっても、生成することができる。環状DNA鋳型はまた、適当な線状オリゴヌクレオチドの化学合成とそれに続く合成されたオリゴヌクレオチドの環状化によって、生成することもできる。いくつかの態様において、合成された線状オリゴヌクレオチドは、環状DNA鋳型を生成するために、リコンビナーゼを介するDNA組換えによる環状化を達成するための、適切に配置された組換え部位を含むことができる。

[0043] いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、組換え部位を含むように設計する
ことができる。環状DNA鋳型の設計は、遺伝子工学的技術または分子生物学的技術のあら
ゆるものによって、達成することができる。組換え部位は、相同組換え部位であってもよく、または非相同組換え部位であってもよい。いくつかの態様において、組換え部位は、部位特異的組換え部位であってよい。使用することができる、部位特異的組換え部位の限定的ではない例は、loxP部位、attB部位、またはattP部位を含む。いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、複数の部位特異的組換え部位を含む。いくつかの態様において、複
数の部位特異的組換え部位は、1つの同一の組換え部位での複数の事象の結果として得る
ことができる。その他の態様において、複数の部位特異的組換え部位は、2つまたはそれ
以上の異なる部位特異的組換え部位での1つまたはそれ以上の事象の結果として、得るこ
とができる。例えば、いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、2つまたはそれ以上のloxP部位を含むことができる。その他の態様において、環状DNA鋳型は、attB部位およびattP部位を含むことができる。さらに、その他の態様において、環状DNA鋳型は、1つまたは
それ以上のloxP部位、1つまたはそれ以上のattB部位、および／または1つまたはそれ以上のattP部位を含むことができる。いくつかの態様において、環状DNA鋳型内の複数の部位
特異的組換え部位を、同方向性の（同じ方向において配列される、または同方向に並んだ（co-aligned））様式において、配列することができる。いくつかの態様において、これらの部位特異的組換え部位は、同方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識される。

[0044] いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、送達ユニットを含むように設計さ
れる。いくつかの態様において、組換え部位は、送達ユニットに隣接することができる。いくつかの態様において、送達ユニットは、発現カセットを含むことができる。

[0045] いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、組換え部位が発現カセットに隣接
する、発現カセットを含むように設計される。いくつかの態様において、発現カセットは、真核生物発現カセットであってよい。発現カセットは、特に着目する核酸配列を含むことができる。特に着目する核酸配列は、限定するものではないが、例えば、無傷な遺伝子、または遺伝子フラグメントであってよい。いくつかの態様において、発現カセットは、転写開始および転写終結配列もまた、含むことができる。いくつかの態様において、発現カセットはさらに、宿主において、特に着目する核酸配列（例えば、ある遺伝子）の発現に必要である可能性がある遺伝子エレメントまたは配列（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列）、および発現した産物のプロセッシング（例えば、シグナル配列のプロセッシング）に必要である可能性がある遺伝子エレメントまたは配列を含むことができる。適切な宿主には、限定するものではないが、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、脊椎動物（ニワトリ）、無脊椎動物、霊長類（例えば、サル）、または哺乳動物（例えば、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒト）が含まれる。いくつかの態様において、発現カセットは、着目する遺伝子、およびヒトにおいて、着目する遺伝子の発現および発現した遺伝子産物のプロセッシングに必要である可能性のある、遺伝子エレメントまたは配列を含む。

[0046] いくつかの態様において、発現カセットは、RNAに転写することができる、核
酸配列を含む。発現カセット内の核酸配列は、RNAに基づく治療、またはRNAに基づく細胞修飾（cellular modification）に使用することができるRNA（例えば、miRNA、siRNA）を得るように、選択することができる。例えば、発現カセットは、転写された場合に、低分子干渉RNA（siRNA）またはマイクロRNA（miRNA）を得ることができる、核酸配列を含むことができる。

[0047] いくつかの例示的な態様において、環状DNA鋳型内の部位特異的組換え部位は
、loxP部位を含む。環状DNAはさらに、発現カセットを含むことができる。発現カセット
は、着目する遺伝子を含むことができる。それはまた、宿主、例えばヒトにおいて、着目する遺伝子の発現、および発現された遺伝子産物のプロセッシングに必要である可能性がある、遺伝子エレメントまたは配列も含むことができる。いくつかの態様において、発現カセットは、迅速な取り込みを促進し、および／または細胞内に一度入ったカセットの発現の期間を延長させる、安定化配列を含む。いくつかの態様において、発現カセットは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、真核生物発現カセットである。いくつかの態様において、コードされるポリペプチドは、宿主において免疫応答を生み出すことができる可能性がある。いくつかの態様において、遺伝子は、ヒトにおいて免疫応答を生み出すことができるポリペプチドをコードする。

[0048] いくつかの例示的な態様において、環状DNA鋳型は、loxP部位が同方向に並ん
でいる（co-aligned）、発現カセットに隣接する2つのloxP部位を含む。いくつかの態様
において、loxP部位によって隣接された発現カセットは、着目する遺伝子を含む。いくつ
かの態様において、loxP部位によって隣接された発現カセットは、着目する遺伝子、およびヒトにおいて、着目する遺伝子の発現および発現された遺伝子産物のプロセッシングに必要である可能性がある、遺伝子エレメントまたは配列を含む。いくつかの例示的な態様において、環状DNA鋳型は、真核生物発現カセットが、宿主、例えばヒトにおいて、免疫
応答を生み出すことができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む、真核生物発現カセットに隣接する2つの同方向のloxP部位を含む。前記態様において、この方法は、タンデ
ムリピートDNA配列を産生する、loxP部位を含む環状DNA鋳型のin vitroでの増幅を含む。いくつかの態様において、増幅は、ローリングサークル増幅（RCA）を使用することによ
り、達成される。産生されたタンデムリピート配列は、2つの同方向に並んだloxP部位が
発現カセットに隣接している、複数の同方向に並んだloxP部位を含む。次に、タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とともにインキュベーションすることは、環状DNA（
ミニサークル）の形状において、発現カセットを切除（ループアウト）する。

[0049] DNA鋳型は、あらゆる様々なDNA増幅方法を使用して増幅することができる。いくつかの態様において、DNA鋳型の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの、温度サイクリング方法を使用して実行することができる。いくつかの態様において、DNA鋳型は
、等温DNA増幅方法を使用して、増幅することができる。DNA増幅方法の限定的ではない例には、リガーゼ連鎖反応（LCR）、自己持続性（self-sustained）配列複製（SSR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ループを介する等温増幅（LAMP）、およびQb-レプリカーゼを伴う増幅が、含まれる。いくつかの例示的な態様において、DNA鋳型は、鎖置換増幅反
応（SDA）を使用して増幅される。その他の例示的ないくつかの態様において、DNA鋳型は、多置換増幅（MDA）を使用して増幅される。いくつかの特定の態様において、DNA鋳型は、ローリングサークル増幅（RCA）を使用して増幅される。

[0050] DNA鋳型が組換え部位を含む態様において、DNA鋳型の増幅は、DNA鋳型配列の
タンデムリピートユニットを含む、コンカテマーを得ることができる。コンカテマーは、さらに、複数の組換え部位を含む。いくつかの態様において、組換え部位は、コンカテマーを組換えタンパク質ととともにインキュベーションすることが、組換え部位によって隣接されたDNA配列を、環状DNA（ミニサークル）の形態において切除（ループアウト）するように、適切に配列することができる。使用することができる、組換えタンパク質には、限定するものではないが、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラー
ゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼが含まれる。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、バクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼを
含む。適切な組換えタンパク質の選択は、組換え部位の配列および／または方向によって、主に決定される。

[0051] DNA鋳型が環状DNA鋳型である、いくつかの態様において、環状核酸鋳型は、ローリングサークル増幅方法を使用して増幅することができる。本発明において使用するのに適する可能性のあるローリングサークル増幅には、線形RCA（LRCA）、または指数関数
的RCA（ERCA）が含まれる。いくつかの例示的な態様において、多重プライミング（multiply primed）ローリングサークル増幅（MPRCA）が、環状DNA鋳型を増幅するために使用される。いくつかの態様において、ライゲーションローリングサークル増幅は、環状DNA鋳
型を増幅するために使用される。いくつかの態様において、環状DNA鋳型は、組換え部位
を含む。次に、環状DNA鋳型のローリングサークル増幅は、DNA鋳型配列のタンデムリピートユニットを含む、コンカテマーを得る。コンカテマーは、さらに、複数の組換え部位を含む。いくつかの態様において、組換え部位は、コンカテマーを組換えタンパク質ととともにインキュベーションすることが、組換え部位によって隣接されたDNA配列を、環状DNA（ミニサークル）の形態において切除（ループアウト）するように、適切に配列することができる。

[0052] この方法はさらに、反応混合物をヌクレアーゼとともにインキュベーションすることを含むことができる。反応混合物のヌクレアーゼとのインキュベーションは、組換えタンパク質とのインキュベーションの後に行うことができる。反応混合物のヌクレアーゼとのインキュベーションを使用して、あらゆる残った線状核酸配列、または組換えタンパク質の作用によって環状化されなかった可能性のある、タンデムリピート配列を消化することができる。使用することができる適切なヌクレアーゼには、限定するものではないが、エキソヌクレアーゼが含まれる。エキソヌクレアーゼは、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼであってもよく、または二本鎖特異的エキソヌクレアーゼであってもよい。単一のエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して、残った線状核酸配列を消化することができる。使用することができる適切なエキソヌクレアーゼには、限定するものではないが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、T7遺伝子-6エキソヌクレアーゼ、脾臓エキソヌクレアーゼ、T5 D15エキソヌク
レアーゼ、またはラムダエキソヌクレアーゼが含まれる。1つの例示的な態様において、
エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼIIIといった、エキソヌクレアーゼの組み合わせを、使用することができる。

[0053] いくつかの態様において、方法はさらに、反応混合物を一本鎖DNA結合タンパ
ク質（SSBタンパク質）とともにインキュベーションすることを含むことができる。使用
することができる適切なSSBタンパク質には、限定するものではないが、超熱安定性一本
鎖DNA結合タンパク質（マサチューセッツ州、New England Biolabs由来のET SSB）、E. coli RecA、Thermus thermophilus より単離されるRecA類似体（マサチューセッツ州、New
England Biolabs由来のTth RecA）、ファージT4遺伝子-32タンパク質、またはE.coli SSBタンパク質が含まれる。エキソヌクレアーゼおよびSSBタンパク質の反応混合物への添加は、連続して、あるいは同時に、行うことができる。連続的な添加が行われる態様において、添加はいずれかの順番で実行することができる。例えば、いくつかの態様において、エキソヌクレアーゼが最初に反応混合物に添加され、続いて、SSBタンパク質が添加する
ことができる。いくつかのその他の態様において、SSBタンパク質を反応混合物と最初に
接触させ、続いて、エキソヌクレアーゼを添加することができる。さらにその他の態様において、エキソヌクレアーゼおよびSSBタンパク質を、反応混合物にインキュベーション
された混合物に加える前に、あらかじめ一緒にインキュベーションすることができる。

[0054] この方法はさらに、核酸重合におけるエラーから生じるミスマッチヌクレオチドを除去することにより、生成された環状核酸の均質性を改善することを含むことができる。例えば、変異検出酵素（例えば、レゾルバーゼ、T4エンドヌクレアーゼVII、またはT7エンドヌクレアーゼI）、または遺伝子変異または多型を検出するために使用されるその他の酵素とともにインキュベーションすることによって、均質性を改善することができる。

[0055] 1つの例示的な態様において、無細胞系において環状核酸を生成する方法は、
（a）組換え部位を含むように設計される環状核酸鋳型をインキュベーションする工程；
（b）環状核酸鋳型をローリングサークル増幅によって増幅して、組換え部位を含む環状
核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含む、コンカテマーを形成する工程；および、（c）コンカテマーを組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成す
る工程；を含む。

[0056] 環状核酸鋳型のローリングサークル増幅は、環状核酸鋳型をプライマーとインキュベーションして、鋳型-プライマー複合体を形成する工程を含むことができる。次に
、鋳型-プライマー複合体を、遊離ヌクレオチドの存在下、核酸ポリメラーゼとインキュ
ベーションして、環状核酸鋳型の増幅をもたらすことができる。

[0057] 環状核酸鋳型は、一本鎖環状核酸鋳型であってもよく、または二本鎖環状核酸鋳型であってもよい。環状核酸鋳型は、環状DNA鋳型、環状RNA鋳型、または環状DNA-RNA
ハイブリッド鋳型であってよい。環状核酸鋳型は、合成核酸または天然の核酸であってもよい。環状核酸鋳型はまた、修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むことができる。環状DNA鋳型は、ゲノムDNA、RNA鋳型（逆転写酵素を使用する）、またはcDNA由来で
あってもよい。1つの例示的な態様において、環状核酸鋳型はデオキリボ核酸（DNA）鋳型である。環状核酸鋳型は、限定するものではないが、例えば、loxP部位、attB部位、attP部位、またはそれらの組み合わせなどの、組換え部位を含むように、設計することができる。いくつかの例示的な態様において、環状核酸は、野生型loxP組換え部位を含むように設計される。

[0058] 増幅反応において使用されるプライマーは、典型的に、増幅される環状核酸鋳型の配列、および選択される増幅方法に依存する。単一のプライマーまたは複数のプライマーのどちらかを、増幅に使用することができる。プライマーは特異的プライマーまたはランダムプライマーのどちらかであってもよい。特異的なプライマーは、環状核酸鋳型内に存在する配列に、ワトソン-クリックの意味において、相補的なヌクレオチド配列を有
する、または有するように設計される。ランダムプライマーの使用は、ランダムな位置における、環状核酸鋳型とプライマーとのハイブリダイゼーションをもたらす。ランダムプライマーは、鎖置換産物（例えば、RCA反応において）とも、ランダムな位置でハイブリ
ダイゼーションすることができる。いくつかの態様において、プライマーは、ヌクレアーゼ耐性プライマー、例えば、エキソヌクレアーゼ（例えば、3'→5'エキソヌクレアーゼ）に耐性のあるプライマーを含む。エキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、それにエキソヌクレアーゼ消化への耐性をもたせる、修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、プライマーは、プライマー配列の3'端でヌクレオチド間に、1、2、3、または4つのホスホロチオエート結合をもつことができる。修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドであってもよい。修飾ヌクレオチドは、3'-末端部位に位置してもよく、あるいは、3'末端部位以外の場所に位置してもよい。いくつかの態様において、3'→5'エキソヌクレ
アーゼ活性に耐性のある、ランダムヘキサマープライマーが使用される。いくつかの態様において、WWNN^*N^*SまたはNNNN^*N^*Nといった配列を含むプライマーが、適切なプライマーとして使用される。これらの場合、プライマー配列は、3'末端に2つのホスホロチオエー
トヌクレオチドを有することができる（^*はヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を
表す）。いくつかの態様において、核酸鋳型増幅のために複数のプライマーが使用される。いくつかの態様において、複数のプライマーは、エキソヌクレアーゼ活性に対して感受性があるプライマー、エキソヌクレアーゼ活性に耐性のあるプライマー、またはエキソヌクレアーゼ活性に対して感受性があるプライマーとエキソヌクレアーゼ活性に耐性のあるプライマーの混合物である。

[0059] 環状DNA鋳型のローリングサークル増幅は、DNA合成反応を行うために適切な溶液中において、鋳型-プライマー複合体を、適切なDNAポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチド(例えば、デオキリボヌクレオシド三リン酸）とともにインキュベーションすることに
よって、実行することができる。DNAポリメラーゼは、原核生物、真菌、ウイルス、バク
テリオファージ、植物または真核生物の、既知のいずれかのDNAポリメラーゼであってよ
い。適切なDNAポリメラーゼはまた、ホロ酵素、ホロ酵素の機能部分、キメラポリメラー
ゼ、またはDNA分子の合成をもたらすことができる、いずれかの修飾ポリメラーゼを、含
むこともできる。使用することができる、適切なDNAポリメラーゼの限定的ではない例に
は、バクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼ、Phi29-様ポリメラーゼ（例えば、ファ
ージM2 DNAポリメラーゼ、ファージB103 DNAポリメラーゼ、またはファージGA-1 DNAポリメラーゼ）、ファージPhi-PRD1ポリメラーゼ、VENT DNAポリメラーゼ、DEEP VENT DNAポ
リメラーゼ、KlenTaq（登録商標）DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、T7 DNAポリメラーゼ配列で修飾されたDNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、DN
AポリメラーゼIII、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素、T5 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼホロ酵素、T7 DNAポリメラーゼ、減少したかまたはわずかな3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するように遺伝子操作されたT7 DNAポリメラーゼ（例えば、Sequenase DNAポ
リメラーゼ）、Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus由来のDNAポリメラーゼ（Tts
DNAポリメラーゼ）、またはそれらのフラグメント、修飾Tts DNAポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、rBST DNAポリメラーゼ、N29 DNAポリメラーゼ、またはTopoTaq DNAポリメラーゼが、含まれる。

[0060] 環状DNA鋳型を増幅するために使用されるDNAポリメラーゼは、限定するものではないが、プルーフリーディングDNAポリメラーゼまたは非プルーフリーディングDNAポリメラーゼであってよい。いくつかの態様において、プルーフリーディングDNAポリメラー
ゼは、温度安定性DNAポリメラーゼを含む。プルーフリーディングDNAポリメラーゼは、好熱性DNAポリメラーゼ、または中温性DNAポリメラーゼであってよい。いくつかの態様において、プルーフリーディングDNAポリメラーゼと非プルーフリーディングDNAポリメラーゼの組み合わせを、DNA鋳型の効率的な増幅に使用することができる。いずれかの適切なプ
ルーフリーディングDNAポリメラーゼを、使用することができる。使用に適切であるプル
ーフリーディングポリメラーゼの例には、限定するものではないが、Phi29 DNAポリメラ
ーゼ、高忠実性融合DNAポリメラーゼ（例えば、マサチューセッツ州、New England Biolabs由来の、プロセッシビティー亢進（processivity-enhancing）ドメインをもつ、Pyrococcus様酵素）、Pyrococcus furiosus由来のPfu DNAポリメラーゼ（カリフォルニア州、Lajolla、Strategene）、E. coliのDNAポリメラーゼI由来のクレノウフラグメント、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Pyrococcus属GB-D由来のDNAポリメラーゼ（マサチ
ューセッツ州、New England Biolabs）、およびThermococcus litoralis由来のDNAポリメラーゼ（マサチューセッツ州、New England Biolabs）が含まれる。使用することができ
る、非プルーフリーディングDNAポリメラーゼの適切な例には、限定するものではないが
、Taq DNAポリメラーゼ、Tts DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼの大きいフラグメ
ント、Pyrococcus 属GB-D由来のexo（-）DNAポリメラーゼ遺伝子（マサチューセッツ州、New England Biolabs）、Thermococcus litoralis由来のexo（-）DNAポリメラーゼ（マサチューセッツ州、New England Biolabs）が含まれる。

[0061] いくつかの態様において、この方法は、高前進性の（highly processive）、
鎖置換ポリメラーゼを使用して、高忠実性の（high fidelity）塩基取り込み条件下、環
状核酸鋳型を増幅する。高忠実性のDNAポリメラーゼとは、適切な条件下において、Vent DNAポリメラーゼまたはT7 DNAポリメラーゼなどの、一般に使用される熱安定性PCRポリメラーゼに付随するものと等しいかあるいはそれより低い、誤取り込み率（約1.5×10^-5〜
約5.7×10^-5）を有するDNAポリメラーゼを言う。誤取り込み事象を最小限にするために、増幅反応混合物中に、さらなる酵素を含むことができる。例えば、MutSなどの、タンパク質を介するエラー訂正酵素を添加して、ポリメラーゼ反応の間またはその後のいずれかにおいて、ポリメラーゼの忠実性を改善することができる。

[0062] いくつかの例示的な態様において、Phi29 DNAポリメラーゼ、またはPhi29様ポリメラーゼが、ローリングサークル増幅方法による環状DNA鋳型の増幅のために使用され
る。いくつかの態様において、Phi29 DNAポリメラーゼとTaq DNAポリメラーゼの組み合わせを、環状DNA増幅のために使用することができる。

[0063] 増幅反応の間、環状核酸鋳型は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）、またはリボヌクレオシド三リン酸（NTP）またはそれらの修飾された対応物の存在下、
ポリメラーゼによって複製され、環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含むコンカテマーを形成する。環状核酸鋳型が組換え部位を含む場合、形成されたコンカテマーは、複数の組換え部位を含むことができる。コンカテマーが適切な組換えタンパク質によ
って処理される場合、組換えタンパク質は、コンカテマーの組換え部位において核酸の組換えを媒介する。例えば、環状DNA鋳型がloxP組換え部位を含む場合、ローリングサーク
ル増幅による環状DNA鋳型の増幅は、複数のloxP部位を一定の間隔で含むコンカテマーを
生成する（コンカテマー内の各リピートユニットが、1つずつloxP部位を有するであろう
）。これらのloxP部位は、コンカテマーのタンデムリピート配列に沿って同方向において（同方向性に配列される、または同方向に並んで（co-aligned））配列される。コンカテマーをCre組換えタンパク質とともにインキュベーションすることは、2つの同方向に並んだloxP組換え部位によって隣接される核酸配列の切り出しおよび環状化をもたらす。これは、複数の環状DNAの生成をもたらす。2つの連続する、同方向に並んだloxP組換え部位において組換えが生じる場合、生成された環状DNAは、1つのloxP組換え部位を含むことができる。しかしながら、連続しない、同方向に配列されたloxP組換え部位において組換えが生じる場合、生成された環状DNAは、複数のloxP組換え部位を含むことができ、例えば、
生成された環状核酸は、内部のloxP部位を含むことができる。1つの例示的な態様におい
て、複数のloxP部位を含むコンカテマーから環状核酸を生成するために使用される、Cre
組換えタンパク質は、バクテリオファージP1 cre遺伝子の38 kDa産物である。

[0064] 使用することができる適切な組換えタンパク質には、限定するものではないが、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼが含まれる。適当な組換えタンパク質の選択は、
組換え部位の配列および／または方向によって、主に決定される。

[0065] RNA鋳型のローリングサークル増幅は、逆転写酵素、逆転写酵素とDNAポリメラーゼの組み合わせ、または逆転写酵素活性およびDNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵
素（例えば、デルタ-Tts酵素）を使用することによって、行うことができる。

[0066] いくつかの態様において、ポリメラーゼおよびその他の酵素は、水溶性の形態の酵素を構成する。しかしながら、固相核酸増幅反応または固相組換え反応もまた使用して、環状核酸の生成を効率化することができる。忠実性、効率性、および最終産物のプロセッシングを改善するように設計される、異なる酵素（例えば、ポリメラーゼ）の最適な領域を含む融合タンパク質を、使用することができる。1つまたはそれ以上の親和性タグ
（例えば、His-タグ、S-タグ、カルモジュリン結合ペプチド、またはプロテインA）を含
む、酵素のリコンビナント型もまた、使用することができる。タグは、タグ部分を介して固体マトリックス上に固定化された酵素を回収することを補助することができ、そしてそれに続く酵素反応に使用することができる。

[0067] 1つまたはそれ以上の方法は、さらに、環状核酸（ミニサークル）の精製、分
析、および／または定量の工程を含むことができる。核酸の精製、分析、または定量に使用される、いずれかの適切な技術を使用することができる。限定的ではない例には、ろ過、親和性捕捉（affinity capture）、ゲル電気泳動、シークエンシング、またはHPLC分析が含まれる。例えば、環状核酸の精製は、親和性回収によって達成することができる。

[0068] いくつかの態様において、方法はさらに、生成された環状核酸の処理を含むことができる。生成された核酸の後処理を、意図される使用によって、変化することができる。1つの例示的な態様において、生成された環状核酸を処理して、スーパーコイル状環
状核酸を産生する。いくつかの態様において、スーパーコイル化は、生成された環状核酸を、核酸ジャイレースまたはジャイレース様酵素（例えば、トポイソメラーゼIIまたはDNAジャイレース）で処理することによって、達することができる。

[0069] いくつかの態様において、この方法はさらに、生成された環状核酸を真核細胞にトランスフェクションまたは形質導入することを含むことができる。いくつかのその他
の態様において、方法はさらに、生成された環状核酸を使用して原核細胞を形質転換することを含むことができる。環状核酸のトランスフェクション、形質導入、または形質転換は、いずれかの適切な技術を使用することによって、行うことができる。限定的ではない例には、ウイルス性トランスフェクション方法、非ウイルス性トランスフェクション方法（例えば、陽イオン脂質に基づく核酸トランスフェクション、ポリマーに基づくトランスフェクション）、エレクトロポレーション、または熱ショックを介する形質転換が含まれる。

[0070] 1つまたはそれ以上の態様の方法によって生成される、環状核酸を含む組成物
は、生成された環状核酸のみ、または環状核酸の後処理によって産生されるそれらの誘導体、または組み合わせを含むことができる。いくつかの態様において、組成物の環状核酸は、発現カセットを含むことができる。いくつかの態様において、発現カセットは、真核生物発現カセットであってよい。発現カセットは、着目する配列、例えば、遺伝子を、含むことができる。いくつかの態様において、発現カセットは、宿主（例えばヒト）において免疫応答を生み出すことができる、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。例えば、いくつかの態様において、遺伝子は、抗原タンパク質または免疫原性タンパク質を、コードすることができる。

[0071] 方法を使用することによって生成される環状核酸、および環状核酸を使用して作成された組成物は、DNA治療などの核酸に基づく治療への適用において、使用すること
ができる。これらの使用には、限定するものではないが、特定の疾患に対するワクチン接種（例えば、DNAワクチン）、または既存の疾患の治療を含むことができる。組成物を、
治療において使用して、例えば、ヒト、動物、または植物などの宿主における、疾患または遺伝子疾患を、予測、診断または治療することができる。

[0072] この方法によって生成される環状核酸、および環状核酸を含む組成物はまた、限定するものではないが、抗体産生または遺伝子サイレンシングなどの用途のためにも使用することができる。インフルエンザウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス（HIV）など
の病原体によって引き起こされる疾患を、予防または治療するように設計される、適切な発現カセットを含む、環状核酸の良好な投与を受けて、抗体をin vivoにおいて産生する
ことができる。例えば、真核生物プロモーターの制御下、インフルエンザヘモアグルチニンタンパク質をコードする配列を使用して、インフルエンザAウイルスによって標的とさ
れる動物において、液性免疫応答および／または細胞性免疫応用を引き起こすことができる。同様に、短縮されたHIVエンベロープタンパク質をコードする配列の発現を使用して
、HIVに対する効果的な免疫応答を誘導することができる。

[0073] いくつかの態様において、環状核酸は、特定の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む、発現カセットを含む。前記環状核酸の細胞への投与を使用して、in vivoにおける、その特定の遺伝子のタンパク質発現を抑制することができる。
例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）のICP4またはICP47のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む環状核酸の投与を使用して、in vivoにおけるタンパク質発現を調節する
ことができる。抗-IPC4転写物または抗-IPC47転写物のin vivoにおける発現は、IPC4遺伝子またはIPC47遺伝子を抑制し、細胞内においてIPC4タンパク質またはIPC47タンパク質の産生を阻害し、そしてそのためHSVウイルスの増殖を最小限にすることができる。適切な
遺伝子サイレンシング標的には、限定するものではないが、コロナウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、またはライノウイルスの遺伝子が含まれてもよい。

[0074] 組成物はさらに、特定の細胞または組織への標的化を促進し、細胞内取り込みを改良し、治療効率を改良し、または環状核酸の品質保持期限を改良することができる、
構成要素を含むことができる。これらの構成要素は、組成物の特性のいずれか／すべてを、増加させるかまたは減少させることができる。いくつかの態様において、組成物は、制御された環状核酸の放出を媒介する構成要素を含む。例えば、ポリ（D,L-ラクチド-co−
グリコリド）（PGLA）ミクロスフェア、またはポリ（エチレン-co-酢酸ビニル）（EVAc）マトリックスなどの、生体適合性、制御放出性のポリマーは、制御され、調節可能であり、そして予測可能である、環状核酸の放出を達成するために、組成物中に含ませることができる。

[0075] 1つまたはそれ以上の態様において、核酸ワクチンを生成する方法は、組換え
部位を含む核酸鋳型を提供する工程、核酸鋳型を増幅して組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程、そしてタンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして核酸ワクチンを生成する工程、を含む。いくつかの態様において、核酸鋳型はさらに、発現カセットを含むことができる。いくつかの態様において、核酸鋳型は、環状核酸鋳型（例えば、環状DNA鋳型）であってよく、そして環状核酸鋳型の増幅
は、ローリングサークル増幅を使用して行うことができる。いくつかの態様において、Phi29 DNAポリメラーゼは、環状核酸鋳型を増幅するために使用される。いくつかの態様に
おいて、環状核酸内の組換え部位は、loxP組換え部位であり、そしてこの方法において使用される組換えタンパク質は、Creリコンビナーゼである。いくつかの態様において、こ
の方法はさらに、生成された核酸ワクチンの後処理を含むことができる。
[0076] いくつかの態様において、無細胞系において環状核酸を生成するためのキットは、本発明において記述される方法を使用して、環状核酸を生成するために必要とされる試薬を含む。いくつかの態様において、このキットは、核酸ポリメラーゼおよび組換えタンパク質を含む。キット内の核酸ポリメラーゼは、核酸鋳型を増幅して、核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含むコンカテマーを生成することができる。いくつかの態様において、このキットは、鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、および組換えタンパク質を含む。核酸ポリメラーゼは、高前進性（highly processive）、高忠実性の核酸ポリメ
ラーゼであってよい。キット内の組換えタンパク質は、相同性組換え、または非相同性組換え、またはその両方を媒介することができる。

[0077] いくつかの態様において、このキットはDNAポリメラーゼを含む。キット内に
含むことができる適切なDNAポリメラーゼには、限定するものではないが、原核生物、真
菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物または真核生物のDNAポリメラーゼが含まれる
。適切なDNAポリメラーゼにはまた、限定するものではないが、ホロ酵素、ホロ酵素の機
能部分、またはDNA分子の合成を達成することができるあらゆる修飾ポリメラーゼが含ま
れていてもよい。キットが含むことができる、適切なDNAポリメラーゼの限定的ではない
例には、バクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼ、Phi29様ポリメラーゼ（例えば、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージB103 DNAポリメラーゼ、またはファージGA-1 DNAポリメラーゼ）、ファージPhi-PRD1ポリメラーゼ、Thermococcus litoralis由来のDNAポリ
メラーゼ（VENT DNAポリメラーゼ）、Pyrococcus属由来のDNAポリメラーゼ（DEEP VENT DNAポリメラーゼ）、Pyrococcus furiosus由来のPfu DNAポリメラーゼ、Tts DNAポリメラ
ーゼ、Bstポリメラーゼ、rBST DNAポリメラーゼ、KlenTaq（登録商標）DNAポリメラーゼ
、E. Coli DNAポリメラーゼI、T7 DNAポリメラーゼ配列で修飾されたDNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、DNAポリメラーゼIII 、DNAポリメラーゼIII
ホロ酵素、T5 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼホロ酵素、T7 DNAポリメラーゼ、N29 DNAポリメラーゼ、またはTopoTaq DNAポリメラーゼが含まれる。

[0078] キットのいくつかの態様において、組換えタンパク質は、部位特異的組換えタンパク質である。適切な部位特異的組換えタンパク質には、限定するものではないが、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼが含まれる。いくつかの態様において、このキットは
、DNAリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーを含む。いくつかの態様において、組
換えタンパク質は、バクテリオファージP1由来Creリコンビナーゼを含む。

[0079] 1つの例示的な態様において、このキットは、Phi29 DNAポリメラーゼおよびCreリコンビナーゼを含む。

[0080] いくつかの態様において、このキットはさらに、一本鎖DNA結合タンパク質（SSBタンパク質）を含むことができる。キットに含むことができる、適切なSSBタンパク質
には、限定するものではないが、超熱安定性一本鎖DNA結合タンパク質（マサチューセッ
ツ州、New England Biolabs由来のET SSB）、E. coli RecA、Thermus thermophilusから
単離されるRecA類似体（マサチューセッツ州、New England Biolabs由来のTth RecA）、
ファージT4遺伝子-32タンパク質、またはE.coli SSBタンパク質が含まれる。

[0081] いくつかの態様において、このキットはさらに、ヌクレアーゼを含むことができる。いくつかの態様において、このキットは、エキソヌクレアーゼを含む。このキットが含むことができる、適切なエキソヌクレアーゼの限定的ではない例には、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、T7遺伝子-6エキソヌクレア
ーゼ、脾臓エキソヌクレアーゼ、T5 D15エキソヌクレアーゼ、またはラムダエキソヌクレアーゼが含まれる。いくつかの態様において、このキットは、エキソヌクレアーゼIIIを
含む。いくつかの態様において、このキットは、エキソヌクレアーゼの組み合わせを含む。いくつかの例示的な態様において、このキットはエキソヌクレアーゼIおよびエキソヌ
クレアーゼIIIの混合物を含む。エキソヌクレアーゼの組み合わせを、キット内において
、1つの容器中にて提供することができ、あるいは複数の容器中にて提供することができ
る。

[0082] このキットはさらに、核酸ベクターを含むことができる。核酸ベクターは、組換え部位を含むことができる。いくつかの態様において、核酸ベクター内の組換え部位は、部位特異的組換え部位であってよい。核酸ベクター内に存在することができる、部位特異的組換え部位の限定的ではない例には、loxP部位、attB部位、またはattP部位が含まれる。核酸ベクターはさらに、制限酵素によって認識することができる、適切な配列を含むことができる。いくつかの態様において、核酸ベクターは、発現カセットを含むことができる。発現カセットは、着目する遺伝子を含むことができる。発現カセットは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、真核生物発現カセットであってもよい。いくつかの態様において、コードされるポリペプチドは、宿主において、免疫応答を生み出すことができる。着目する遺伝子は、宿主において免疫応答を生み出すことができるポリペプチドをコードすることができる。核酸ベクターはさらに、ヒトなどの宿主において、着目する遺伝子の発現および発現された遺伝子産物のプロセッシングに必要である可能性がある、遺伝子エレメントまたは配列を含むことができる。

[0083] このキットはさらに、核酸増幅反応および／または組換え反応を行うために適切である可能性がある、緩衝溶液を含むことができる。このキットは、あらかじめ作製される緩衝溶液を含むことができるか、または緩衝溶液を生成するために必要である試薬を含むことができる。

[0084] このキットにはさらに、キットに含まれる特定の構成要素を詳述する、取扱説明書が含まれてもよい。このキットはまた、本発明において記述される方法において、キットの構成要素を使用するためのプロトコールを詳述する、取扱説明書が含まれていてもよい。

[0085] この方法は、半自動化、または完全自動化プラットフォーム用に、および／ま
たは環状核酸の大量生成用に、適合することができる。スケールアップは、各反応容量を比較的少なく維持する（例えば、＜1 mL）一方、反応の数を増加させることによって、達することができ、それによって、核酸鋳型は、標準的なプラットフォームまたは特注のプラットフォームでマルチウェルプレートを使用して、同時に増幅される。あるいは、スケールアップは、単一の反応中で、大量の環状核酸を生成する、より大きい容量を伴うことができる。複合した能力をもつ複数のプラットフォームは、並列することができ、そしてより大きいバイオ製造設備の一部分として、協調的な様式で機能するように、配置することができる。

[0086] 実施例
[0087] 他に規定のない限り、実施例中に記載される成分は、一般的な化学物質供給業者より、商業的に入手可能である。実施例部分において使用されるいくつかの略称は、以下のように展開される：“mg”：ミリグラム；“ng”：ナノグラム；“pg”：ピコグラム；“fg”：フェムトグラム；“mL”：ミリリットル；“mg/mL”：ミリリットル当たりミ
リグラム；“mM”：ミリモル（millimolar）；“mmol”：ミリモル（millimole）；“pM
”：ピコモル（picomolar）；“pmol”：ピコモル（picomole）；“μL”：マイクロリットル；“min”：分；および“h”：時間。

[0088] 図1は、本発明の一般的な態様の1つの概略図である。組換え部位を含む環状核酸鋳型（インプット）は、ローリングサークル増幅（RCA）を使用することによって増幅
され、その後に組換え反応が続き、核酸ミニサークルを生成する。増幅反応は、環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含む、コンカテマー産物を生成する。図1は、多
重プライミング（multiply primed）の、指数関数的ローリングサークル増幅由来の分岐RCAコンカテマー産物の形成を説明する。コンカテマー産物は、従って、同方向性の様式において（同方向に並んで（co-aligned））配列することができる、複数の組換え部位を含む。コンカテマー産物は、次に、組換えタンパク質によって処理され、それにより組換え部位によって隣接される核酸配列をループアウトし、インプットされた環状核酸鋳型の複数のコピーを生成する。

[0089] 実施例1
[0090] 組換えタンパク質を用いたRCA産物の処理（processing）の、細菌への形質転
換効率への効果が、以下の実施例において説明される。プラスミドベクター、pUC18、お
よび設計されたプラスミド構築物、pUC/loxP（DNA鋳型）を、バクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼを使用して、RCAによって別々に増幅した。loxP DNA配列（SEQ ID NO: 1
）をプラスミドベクターpUC18中に組み込み、プラスミド構築物、pUC/loxPを生成した。
次に、増幅された核酸をCreリコンビナーゼによって処理した。次に、処理された、増幅
された核酸を、細菌に形質転換し、さらに形質転換効率を定量した。

[0091] 環状核酸鋳型（プラスミド；pUC18またはpUC/loxP）のRCAにより、環状核酸配列のタンデムリピートユニットを含む、高分子の、高分岐コンカテマーを得る（RCA産物
；pUC18-RCAまたはpUC/loxP-RCA）。核酸鋳型が組換え部位を含む場合、生成されたコン
カテマーは、複数の組換え部位を有するであろう。組換えタンパク質を用いた組換え部位を有するコンカテマーの反応により、環状核酸の複数のコピーを得る（ミニサークル；pUC/loxP-RCA/Cre）。

[0092] 典型的な増幅反応において、1 pgのプラスミドDNA（DNA鋳型）を、illustra^TM
TempliPhi^TM DNA増幅キット（アメリカ合衆国、ニュージャージー州、Piscataway、GE Healthcare）を使用して、RCAによって増幅した。このキットは、試料バッファー、反応バッファー、および酵素ミックスを含む。試料バッファーは、DNA合成を非特異的に開始す
るランダムヘキサマーを含み、そしてDNA鋳型を変性させるために使用される。反応バッ
ファーは、塩およびデオキリボヌクレオチドを含み、そしてDNA合成に適切であるpHを維
持する。酵素ミックスは、50％（v/v）グリセロール中に、Phi29 DNAポリメラーゼ、およびランダムヘキサマーを含む。DNA鋳型増幅反応のため、キット内の製造業者の指示に従
った。

[0093] 簡潔には、増幅反応において、1 pgの精製されたプラスミドDNA鋳型（最大1μL中）を、5μLの試料バッファーに添加し、試料混合液を形成した。試料混合液を95℃で3分間加熱して、プラスミドDNA鋳型を変性させた。次に、試料混合液を氷浴において、冷
却した。試料混合液に、5μLの反応バッファー、および0.2μLの酵素ミックスを添加し、反応混合物を形成した。反応混合物を、30℃で約4時間〜約18時間、インキュベーション
した。インキュベーションの終わりに、反応混合物を65℃で10分間加熱することにより、反応混合物中のPhi29 DNAポリメラーゼを不活性化した。不活性化反応の終わりに、反応
混合物に90 mLの水を加え、そしてよく混合した。

[0094] 対照の増幅反応のあいだ、反応混合物に酵素ミックス（0.2μL）を加えなかったことを除いて、上述の通りの同じプロトコールを用いて、プラスミドベクターpUC18を
使用して、対照の増幅反応を行った。

[0095] 増幅されたプラスミドDNA（pUC18-RCA、pUC/loxP-RCA）、またはモックである増幅されたプラスミドDNA（pUC18-環状）を、Picogreen dsDNA定量アッセイ（Molecular Probes Inc.）を使用して、定量した。制限消化されたDNA産物のアガロースゲル電気泳動もまた行い、そして電気泳動のバンドの強度を、既知濃度のDNAを有する標準の強度と、
比較した。

[0096] 増幅された核酸のそれぞれ（1μLのpUC 18-RCAまたはpUC/loxP-RCA）を、全容量5μL中、Creリコンビナーゼ（1×Cre反応バッファー（50 mM Tris-HCl、33 mM NaCl、10 mM MgCl₂、25℃においてpH＝7.5）中、1ユニットのCreリコンビナーゼ）と、37℃で1時間、インキュベーションした。インキュベーションした試料（pUC18-RCA/CreまたはpUC/loxP-RCA/Cre）は、次に使用するまで、氷上で維持した。

[0097] 増幅されたプラスミドDNA（pUC18-RCA、pUC/loxP-RCAまたはpUC18-環状）、Creリコンビナーゼ処理した増幅されたプラスミドDNA（pUC18-RCA/CreまたはpUC/loxP-RCA/Cre）、および精製した、増幅していないpUC-18環状DNAの、細菌への形質転換の効率を、コンピテント細胞FB5α（Fisher Scientific.）またはNM522（アメリカ合衆国、オハイオ州、Cleveland、Protein Express Inc.）を使用して評価した。典型的な形質転換実験に
おいて、形質転換された細胞を産生するため、化学的コンピテント細胞を用いた、細菌の形質転換のため、HETバッファー（10 mM HEPES、0.1 mM EDTA、0.01％ tween-20、25℃においてpH＝8.0）中に希釈されたDNA試料（60 ng/μL）を使用した。形質転換反応のため
、製造業者の推奨に従った。形質転換された細胞を、アンピシリン（amplicillin）選択
下、LBプレート上で37℃にて一晩、増殖させた。形質転換効率は、二回の試料における、DNA 1μg当たりの形質転換体の平均数として、各DNA試料について定量した。

[0098] 図2および図3は、それぞれNM522細胞およびFB5α細胞における、上記DNA試料
の形質転換効率を説明する。図2は、NM522へ直接形質転換された場合、コンカテマー（RCA産物：pUC18-RCAまたはpUC/loxP-RCA）は、スーパーコイル状pUC18対照よりも、約10,000倍低い形質転換効率を得たことを、説明する。pUC18-RCAの形質転換効率は、Creリコン
ビナーゼとのインキュベーションに際して、有意には影響されなかった。対照的に、pUC/loxP-RCAのCreリコンビナーゼによる処理（pUC/loxP-RCA/Cre）は、形質転換効率を有意
に増加させた。増幅産物pUC/loxP-RCAをCreリコンビナーゼととともにインキュベーショ
ンした際には、約10倍〜約20倍の形質転換効率の上昇が観察された。

[0099] 図3は、FB5αへ直接形質転換された場合、コンカテマー（RCA産物：pUC18-RCAまたはpUC/loxP-RCA）が、精製されたpUC18-環状対照よりも、約1,000倍低い形質転換効
率を得たことを、説明する。pUC18-RCAの形質転換効率は、Creリコンビナーゼとのインキュベーションに際して、有意には影響されなかった。対照的に、pUC/loxP-RCAのCreリコ
ンビナーゼによる処理（pUC/loxP-RCA/Cre）は、形質転換効率を有意に増加させた。増幅産物pUC/loxP-RCAをCreリコンビナーゼとともにインキュベーションした際には、約10倍
〜約20倍の形質転換効率の上昇が観察された。

[0100] コンカテマー（RCA産物）は、コンピテントE. coliを十分に形質転換して、十分な数のコロニー（数十〜数百）を得た。しかしながら、これらのコンカテマーの形質転換効率は、適用されたDNA量で標準化された場合、純粋なプラスミドDNAの約10^-3〜約10^-5のみであった。本実施例において、形質転換混合液中に持ち込まれた元のプラスミドDNA
鋳型の量は、細菌細胞への形質転換を成功させるために必要であるものよりも、大幅に低かった。モックである増幅されたpUC18を使用する対照の形質転換において、細菌の形質
転換体は得られなかった。これらの実験において、細菌内に形質転換されたものは、コンカテマー産物に違いなく、インプットされた鋳型DNAそのものではない。リコンビナーゼ
処理されたpUC/loxP-RCA産物は形質転換効率が増加し、そしてリコンビナーゼ処理されたpUC18-RCA産物は形質転換効率が増加しなかったことは、リコンビナーゼ処理の結果とし
て、DNAの環状化が存在したことの証拠であった。

[0101] 前述の実施例は、発明のいくつかの特徴の実例となり、そしてありとあらゆる可能性のある態様から選択された態様である。発明は、その精神または本質的な特性から離れることなく、その他の特定の形態において、具体化することができる。発明の特定の特徴のみが本明細書中で、説明、および記述されているが、本開示により利益を受ける当業者は、パラメーターを最適化する修飾／変化をなすことができるであろう。そのため、前述の態様は、すべての観点において、本明細書中に記述される発明を限定するよりむしろ、実例となるものとして、みなされるべきである。必要に応じて、範囲が供給され、そしてそれらの範囲は、その間のすべての下部範囲を含む。

Claims (26)

1. 以下の工程：
   組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程；
   核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程；および、
   タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程；
   を含む環状核酸を生成する方法。
2. 組換え部位が、部位特異的組換え部位を含む、請求項1に記載の方法。
3. 組換え部位がloxP部位を含む、請求項1または2に記載の方法。
4. 組換えタンパク質が、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ
   、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼより選択される、請求項1
   〜3のいずれか1項に記載の方法。
5. 組換えタンパク質が、バクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼを含む、請求項4に記載の方法。
6. さらに、エキソヌクレアーゼとインキュベーションする工程を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
7. エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、またはその組み合わせより選択される、請求項6に記載の方法。
8. さらに、一本鎖DNA結合タンパク質とインキュベーションする工程を含む、請求項1〜7
   のいずれか1項に記載の方法。
9. さらに、環状核酸を原核細胞へ形質転換する工程を含む、請求項1〜8のいずれか1項に
   記載の方法。
10. さらに、環状核酸を真核細胞へトランスフェクションする工程を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
11. 請求項1に記載の方法によって調製される環状核酸、またはその誘導体を含む、組成物
    。
12. 環状核酸が発現カセットを含む、請求項11に記載の組成物。
13. 発現カセットが、RNAに転写することができる核酸配列を含む、請求項12に記載の組成
    物。
14. 発現カセットがポリペプチドをコードする遺伝子を含み、そしてポリペプチドが宿主において免疫応答を生み出すことができる、請求項12に記載の組成物。
15. 発現カセットが、真核生物発現カセットを含む、請求項12に記載の組成物。
16. ヒト、動物、または植物の、疾患または遺伝子疾患の、予防または治療における、請求
    項11に記載の組成物の使用。
17. 以下の工程：
    組換え部位を含むように設計される環状核酸鋳型を、インキュベーションする工程；
    ローリングサークル増幅によって環状核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含む環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含むコンカテマーを形成する工程；および、
    コンカテマーを組換えタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程；
    を含む、無細胞系において、環状核酸を生成する方法。
18. ローリングサークル増幅が、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下、環状核酸鋳型を、プライマーおよびPhi29 DNAポリメラーゼとインキュベーションする工程を含む、
    請求項17に記載の方法。
19. 組換え部位がSEQ ID NO: 1を含む、請求項17または18に記載の方法。
20. 組換えタンパク質がCreリコンビナーゼを含む、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
21. 環状核酸を処理（processing）して、核酸ワクチンを生成する工程をさらに含む、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
22. 以下の工程：
    組換え部位を含む核酸鋳型を提供する工程；
    核酸鋳型を増幅して、組換え部位を含むタンデムリピート核酸配列を形成する工程；および、
    タンデムリピート核酸配列を組換えタンパク質とインキュベーションして、核酸ワクチンを生成する工程；
    を含む、核酸ワクチンを生成するための方法。
23. 核酸鋳型がさらに発現カセットを含む、請求項22に記載の方法。
24. 以下の構成：
    Phi29 DNAポリメラーゼ；および、
    組換えタンパク質；
    を含む、無細胞系において環状核酸を生成するためのキット。
25. 組換えタンパク質が、Creリコンビナーゼ、バクテリオファージラムダインテグラーゼ
    、酵母Flpリコンビナーゼ、または細菌性XerCDリコンビナーゼより選択される、請求項24に記載のキット。
26. さらに、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼII、またはその組み合わせより選
    択されるエキソヌクレアーゼを含む、請求項24または25に記載のキット。

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