JP2018109055A

JP2018109055A - 網膜変性の処置のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2018109055A
Application number: JP2018039411A
Authority: JP
Inventors: マリオン，ヴァンサン; Marion Vincent; メッケル，アナイス; Mockel Anais; ドルフス，エレーヌ; Dollfus Helene
Original assignee: Universite de Strasbourg
Current assignee: Universite de Strasbourg
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2018-07-12
Also published as: JP6371225B2; JP2015513539A; AU2013223965B2; AU2013223965C1; US20170231930A1; AU2013223965A1; WO2013124484A1; US9636377B2; EP2817020A1; US20150038432A1; CA2865034A1

Abstract

【課題】繊毛機能障害に関連する網膜変性を処置するための医薬組成物の提供。【解決手段】ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。ｅＩＦ２αの阻害剤が、グアナベンズ、トートマイシン、トートマイセチン、カリクリンＡ、サルブリナル、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成を阻害する化合物、及びＰＰ１又はＧＡＤＤ３４発現に特異的に干渉する核酸分子からなる群より選択される。【選択図】なし

Description

発明の属する技術分野
本発明は、医学の分野、特に網膜変性、特に繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置に関する。

発明の背景
網膜変性は、繊毛病、一次繊毛（ヒトの体において偏在的に発現されるオルガネラ）における欠損から生じる稀な遺伝的障害の群における非常に一般的な臨床的特徴である。光受容体細胞は、修飾された繊毛（効率的な光検出及び形質導入のために要求される２つの節間でのタンパク質輸送を許すタンパク質ハイウェイとして作用する、いわゆる結合繊毛）により結合された２つの節を伴い構築される。繊毛病は、従って、内節から外節へまた逆方向のタンパク質輸送に影響を及ぼし、網膜色素変性症を誘導する。発症は、通常、早期の幼児期の間であり、毎日の生活及び社会的統合に対する主要な影響を伴う、主要な視覚障害の早期発症に導く。

この網膜変性機構は、孤立性の網膜色素変性症（例えばレーバー先天性黒内障及びＸ連鎖網膜色素変性症など）あるいは、また、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）又はアルストレーム症候群（ＡＬＭＳ）などの症候性状態のいずれかにおいて観察され、両方の象徴的な繊毛病が網膜色素変性症により中核的に特徴付けられる。暗示されうる全ての生物学的プロセスの間で、結合繊毛の機能における欠損が、網膜色素変性症の全ての症例の２０%超を占め、それは、一般的な病態機構について全般的に非常に高い率である。

遺伝性網膜ジストロフィーのための処置は、過去１０年間において定期的なスピードで前進してきた。しかし、現在、利用可能な治癒的アプローチ及び、実際に視力を保持するために役立つ又は少なくとも網膜欠損を遅らせる満足な姑息的アプローチはない。処置では、主に、症状（着色眼鏡、低視力補助・・・）を低下させ、合併症（白内障手術、嚢胞様黄斑浮腫・・・）を防止することに焦点を合わせる。

今日まで、たくさんの試験又は治験が宣言されており、現在、種々のアプローチ（薬理学的、組織工学、遺伝子治療、又は補綴装置）を使用して進行中である。遺伝子治療は、今日まで、最も先端的な分野の１つである。なぜなら、治験が、現在、特に、最も象徴的なＲＰＥ６５遺伝子治療プロジェクトについて、種々の国においてヒトで実施されているからである。高い遺伝的異質性及び網膜色素変性症に含まれる複数の生物学的経路のため、処置を見出すための戦略の多様性が、妥当なままである。繊毛病に関連する網膜変性についてのいくつかの遺伝子治療プロジェクトが、現在、着手されている：イヌにおけるＲＰＧＲ（Beltran et al., 2011）及びマウスにおけるＢＢＳ４（Simons et al., 2011）。

しかし、網膜変性は、大半の場合において、小児期において非常に早期に生じ、早期遺伝子治療の注射は、非常に若い子供において急性であることが公知である炎症反応の観点で危険でありうる。したがって、種々の繊毛病において光受容体細胞を保存し、遺伝子治療の使用を延期するために、網膜変性を遅らせることができうる薬理学的処置についての有意な必要性がある。

発明の概要
網膜繊毛病は、遺伝性疾患のクラスを表し、それにおいて、光受容体の結合繊毛は欠損している。遺伝的由来のこの欠損は、生合成的に活性な内節と光感受性の外節の間での効率的なタンパク質輸送を妨げる。この繊毛渋滞は、光受容体の内節におけるタンパク質蓄積に起因する小胞体（ＥＲ）ストレスを誘導することが報告されている（Lin et al., 2007; Yang et al., 2007）。ＥＲストレスが協調応答経路を誘導する：アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）（Griciuc et al., 2011; Walter and Ron, 2011）。ＵＰＲは、２つのバランスの取れた応答（保護応答及びアポトーシス応答）の活性化により、タンパク質フォールディングストレスを検出及び管理する。

網膜において、光受容体細胞は、光伝達の最初の工程に関与している。それは、結合繊毛として公知である修飾された一次繊毛により連結された、生合成的に活性な内節及び光感受性の外節で構成されている。繊毛機能障害に関連する網膜変性は、孤立した特徴又は症候群、例えばバルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）などの部分でありうる。

本発明者らは、本明細書において、ＢＢＳモデルにおける繊毛欠損が、内節におけるタンパク質蓄積に起因する小胞体ストレスを介した光受容体アポトーシスを誘導したことを示している。一度、誘発された経路が明確に同定され、本発明者らは、アンフォールドタンパク質応答の調節の治療戦略を開発した。本発明者らは、アポトーシスに対する光受容体の保護を達成しており、Ｂｂｓ１２-/-マウスにおいて網膜の機能を維持している。本発明者らは、本明細書において、ＥＲストレス調節薬物を使用して、ＢＢＳのマウスモデルにおいて網膜変性の減速についての原理の証明を報告している。これらの薬物、即ち、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびにカスパーゼ１２の阻害剤は、別々にテストした場合、多少の効果を示しているが、２つ又は３つの分子の組み合わせが、アポトーシスを防止する際にはるかにより効果的であることが証明されている。顕著には、これらの薬物の組み合わせは、また、本発明者らがインビボモデルに投与される用量を低下させることを許しており、最大限にまで、任意の可能性のある副作用を限定する。

したがって、第１の局面において、本発明は、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。

ｅＩＦ２−αの阻害剤は、グアナベンズ、トートマイシン、トートマイセチン、カリクリンＡ、サルブリナル、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成を阻害する化合物、及びＰＰ１又はＧＡＤＤ３４発現に特異的に干渉する核酸分子からなる群より選択してもよい。

好ましくは、ｅＩＦ２−αの阻害剤は、ＧＡＤＤ３４の阻害剤であり、より好ましくは、ｅＩＦ２−αの阻害剤は、グアナベンズである。

タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、バルプロ酸又はその誘導体、トリコスタチンＡ、リチウム、１−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−２−チオシアネート−エタノン、及びエキセンディン４からなる群より選択されうる。

好ましくは、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、バルプロ酸又はその誘導体（例えば２−エン−バルプロ酸など）であり、より好ましくは、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、バルプロ酸である。

本発明に従った医薬組成物は、好ましくは、カスパーゼ１２の触媒部位を標的とするペプチド、プロカスパーゼ１２の切断を防止するペプチド、及びカスパーゼ１２発現に特異的に干渉する核酸分子からなる群より選択される、カスパーゼ１２の阻害剤をさらに含みうる。特に、カスパーゼ１２の阻害剤は、カスパーゼ１２の触媒部位を標的とするペプチドでありうる、好ましくは、式Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンのペプチドである。

本発明に従った医薬組成物は、好ましくは、化学療法薬剤、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、アルファ−アドレナリン遮断薬、アルファ−アドレナリン作動薬、ベータ−アドレナリン作動薬、抗コリン作用薬、５アルファ還元酵素の阻害剤、アンドロゲン、免疫調節剤、免疫抑制剤、抗血管新生剤（例えば抗ＶＥＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ＨＧＦ、及び抗ＥＦＧなど）、ロイコトリエン修飾剤、アミノサリチル酸、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症剤、抗寄生虫、可溶化インターロイキン受容体の治療、細胞傷害剤、酸化防止剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの追加の治療的薬剤をさらに含みうる。

本発明は、また、薬物としての使用のための、特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における使用のための、本発明に従った医薬組成物に関する。

繊毛機能障害に関連する網膜変性は、バルデ・ビードル症候群、シニア−ローケン症候群、ジュベール症候群、サルディーノマインツァー症候群、センセンブレナー症候群、ジュンヌ症候群、メッケル−グルーバー症候群、アルストレーム症候群、ＭＯＲＭ症候群、繊毛遺伝子中の変異により起こされるレーバー先天性黒内障、及びＲＰＧＲ遺伝子中の変異により起こされるＸ連鎖網膜色素変性症からなる群より選択される繊毛病により誘導されうる。

本発明は、また、カスパーゼ１２の阻害剤との組み合わせにおいて使用される、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。

本発明は、さらに、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせた製剤として、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤を含む生成物に関する。

特に、生成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびにカスパーゼ１２の阻害剤を含みうる。

好ましくは、ｅＩＦ２αの阻害剤はグアナベンズであり、ならびに／あるいはタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物はバルプロ酸であり、ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤はペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである。

好ましくは、本発明に従った医薬組成物又は生成物は、局所、経口、皮内、非経口、及び／又は眼内投与のために適する。より好ましくは、本発明に従った医薬組成物又は生成物は、眼投与のために、好ましくは局所眼又は眼周囲投与のために適する。

網膜外植片におけるＢｂｓ１２枯渇は、光受容体の異形を誘導する。（ａ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片におけるＢｂｓ１２の発現分析（ｎ＝３）。ｓｈＣｔｌ、対照ｓｈＲＮＡ；ｓｈＢｂｓ１２Ｂｂｓ１２-/-ｓｈＲＮＡ。＊，ｐ＜０．０１（ｂ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片におけるＢＢＳ１２タンパク質レベル。ＢＢＳ１２及び負荷対照としてのβチューブリンの免疫検出。（ｃ）処置された外植片のトルイジンブルー染色切片。スケールバー５０μm。ＩＮＬ、内顆粒層（ｄ）ｓｈＣｔｌ処置された（上パネル）及びｓｈＢｂｓ１２処置された（下パネル）外植片の光受容体ＯＳ及び結合繊毛（ＣＣ）を示す透過電子顕微鏡写真。スケールバー、５００nm。（ｅ）処置された外植片におけるアグルチニンを使用したＤＡＰＩ及びＯＳ対比染色を伴うロドプシンの免疫染色。スケールバー、１５μm。（ｅ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片における暗（左パネル）及び明（右パネル）条件におけるアレスチンの免疫染色；漫画は、両方の条件におけるアレスチンの予測される局在化を表す。スケールバー１５μm。Ｂｂｓ１２枯渇した外植片は、ＥＲストレスを提示する。（ａ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片のＴＵＮＥＬアッセイ。感染後７２時間；緑色及びＤＡＰＩ対比染色において標識されたアポトーシス核。スケールバー、２５μm対応するアポトーシスレベルについては、図８を参照のこと。（ｂ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片におけるカスパーゼ３、６、７、９、１２、Ｂｉｐ、及びＣｈｏｐ１０の発現分析（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０１。（ｃ）Ｘｂｐ１の長い（非ストレス）及び短い（アンフォールドタンパク質応答関連）アイソフォームの両方のＲＴ−ＰＣＲ。（ｄ）リン酸化及び全ｅＩＦ２α含量のウエスタンブロット分析、示したｓｈＲＮＡ処置された外植片におけるＣＨＯＰ１０及びＢｉＰ。負荷対照及び定量化については、図８を参照のこと。（ｅ）ｓｈＣｔｌ、ｓｈＢｂｓ１２、ｓｈＰｅｒｋ、又はｓｈＢｂｓ１２＋ｓｈＰｅｒｋ処置された外植片におけるＴＵＮＥＬアッセイ。スケールバー、２５μm。対応するアポトーシスレベル及びＰｅｒｋノックダウン検証については、図８を参照のこと。（ｆ）ｓｈＢｂｓ１２及びｓｈＰｅｒｋ処置された外植片におけるカスパーゼ１２、Ｂｉｐ、及びＣｈｏｐ１０の発現分析。スケールバー２５μm。＊＊Ｐ＜０．０５。薬理学的処置は、Ｂｂｓ１２枯渇した外植片においてＥＲストレスを低下させる。（ａ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２外植片でのＶＰＡ又はＧＢＺ又はＩＮＨ又はＧＩＶ処置のアポトーシスレベルに対する効果（ＯＮＬにおけるＴＵＮＥＬ陽性核／ＤＡＰＩとしてカウント）。＊，ｐ＜０．０１。（ｂ）示したｓｈＲＮＡ処置された外植片におけるｐｅＩＦ２α、ｅＩＦ２αｔｏｔ、ＣＨＯＰ１０、及びＢｉＰの免疫検出。（ｃ−ｅ）示したｓｈＲＮＡ処置された外植片におけるｐｅＩＦ２α／ｔｏｔ、ＣＨＯＰ１０、及びＢｉＰレベルの定量化。＊＊，ｐ＜０．０５。（ｆ）標的とタンパク質及びアポトーシスレベルに対する異なる処置の効果を要約した表（%＿Ｓ．Ｅ．）。ＶＰＡ０．２mM＿ＧＢＺ２．５μM処置された外植片については、図１６を参照のこと。Ｂｂｓ１２-/-マウスは、網膜変性を有する。（ａ）Ｂｂｓ１２^＋／＋（左パネル）及びＢｂｓ１２-/-（右パネル）網膜のトルイジンブルー染色切片ならびにＯＳのＭＥＴ写真；グラフは、４週齢でのＢｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-マウスのＯＮＬ厚の測定値を表す（ｎ＝６）。＊Ｐ＜０．００２（ｂ）１０週齢のＢｂｓ１２^＋／＋（左パネル）ならびに４週齢（中央パネル）及び１０週齢（右パネル）でのＢｂｓ１２-/-マウスの代表的な暗順応ＥＲＧ記録。（ｃ）Ｂｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-網膜におけるＤＡＰＩ共染色を伴う及び伴わないロドプシンの免疫染色、赤色で囲ったＥＲ嚢を伴う両方の遺伝子型におけるＩＳのＭＥＴ分析（右パネル）。（ｄ）Ｂｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-網膜におけるカスパーゼ３、６、７、１２、Ｂｉｐ、及びＣｈｏｐ１０の発現分析（ｎ＝３）。スケールバー２０μm。ＥＲストレス処置は、Ｂｂｓ１２-/-視覚機能を回復する。未処置ならびにＧＩＶ又はＶＰＡ又はＧＢＺ処置Ｂｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-動物の比較：（ａ）暗順応ＥＲＧ記録。（ｂ）１cd.s/m²暗順応ＥＲＧでのａ波振幅（ｎ＝１２）。＊Ｐ＜０．００１（ｃ）１cd.s/m²暗順応ＥＲＧでのｂ波振幅（ｎ＝１２）。＊＊Ｐ＜０．０５（ｄ）ＤＡＰＩ共染色を伴うアセチル化αチューブリンの免疫染色（ｅ）測定したＯＮＬ長（ｎ＝６）。＊Ｐ＜０．０１（ｆ）リン酸化及び全ｅＩＦ２α含量ならびにＢｉＰのウエスタンブロット分析。スケールバー１０μm。提案された機構。Ｂｂｓ１２-/-網膜において、ＩＣＴは十分に効率的ではなく、ＩＳにおけるタンパク質蓄積に導く。タンパク質の過負荷は、ＵＰＲを誘導する：分子シャペロニンＢｉＰは凝集タンパク質を感知し、ｅＩＦ２αキナーゼＰＥＲＫを活性化する。ｅＩＦ２αリン酸化は、ＥＲストレス応答カスケードを誘導する。恒常性が再構築されない場合、プロアポトーシス応答が促され、カスパーゼ１２活性化を介してアポトーシスに導く。本発明者らは、ＢｉＰ含量を増加させるためのＶＰＡ、ｅＩＦ２αホスファターゼＧＡＤＤ３４を阻害するためのＧＢＺ、及びカスパーゼ１２活性を阻害するためのＩＮＨを使用して、成功裏にＥＲストレスを調節した。これらの相乗的な処置は、Ｂｂｓ１２-/-マウスにおいて光受容体アポトーシスを低下させる。網膜外植片培養における光受容体の完全性。（ａ）トルイジンブルー染色（左パネル）、ＤＡＰＩ共染色を伴うロドプシンの免疫染色（中央パネル）。４日間にわたり培養した網膜外植片切片におけるＤＡＰＩ共染色を伴うアセチル化αチューブリンの免疫染色（右パネル）。（ｂ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片における負荷対照タンパク質レベルとしてのＢＢＳ１２及びβチューブリン。スケールバー５μm。Ｂｂｓ１２枯渇した外植片は、ＰＥＲＫにより媒介されるＥＲストレスを提示する。（ａ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片におけるアポトーシス率（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．００１（ｂ−ｃ）網膜外植片におけるＢｂｓ１２及びＰｅｒｋの相乗的な枯渇：（ｂ）アポトーシス率（ｎ＝３）。＊＊Ｐ＜０．０２（ｃ）ＰｅｒｋｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。＊＊Ｐ＜０．０５（ｄ）ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片のウエスタンブロットのための負荷対照としてのポンソー染色。（ｅ）対応するタンパク質定量化（免疫ブロッティングシグナルの強度／ポンソー染色の強度として算出、ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ＜０．０５。ＨＲＩは、Ｂｂｓ１２枯渇により誘導されない。網膜外植片におけるＢｂｓ１２及びＨｒｉの相乗的な枯渇：（ａ）ＨｒｉｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０３（ｂ）アポトーシス率（ｎ＝３）、（ｃ）ＴＵＮＥＬアッセイ、（ｄ）カスパーゼ１２、Ｂｉｐ、及びＣｈｏｐ１０の発現分析（ｎ＝３）。スケールバー２５μm。網膜外植片におけるＥＲストレス処置についてのＴＵＮＥＬアッセイ。処置を伴わない（ａ）、ＶＰＡ処置を伴う（ｂ）、ＧＢＺ処置を伴う、（ｃ）ＩＮＨ処置を伴う、ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片におけるＴＵＮＥＬアッセイ。スケールバー２５μm。網膜外植片におけるＥＲストレス処置についてのウエスタンブロット分析。（ａ）ＶＰＡを添加した、ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片のウエスタンブロットのための負荷対照としてのポンソー染色。（ｂ）対応するタンパク質の定量化（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．１（ｃ）ＧＢＺを添加した、ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２処置された外植片のウエスタンブロットのための負荷対照としてのポンソー染色。（ｄ）対応するタンパク質の定量化（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０５。Ｂｂｓ１２-/-網膜におけるアレスチン局在化。Ｂｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-光受容体におけるＤＡＰＩ共染色を伴うアレスチンの免疫染色。スケールバー２０μm。動物におけるＥＲストレス処置の分析。（ａ）ＶＰＡ、ＧＢＺ、ＧＩＶ、又は無処置を受けたマウスからのＢｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-網膜でのウエスタンブロットのための負荷対照としてのポンソー染色。（ｂ）対応するタンパク質の定量化（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５（ｃ）ＶＰＡ、ＧＢＺ、ＧＩＶ、又は無処置を受けたマウスからのＢｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-網膜のヘマトキシリン・エオシン染色。Ｂｂｓ１２-/-網膜におけるアポトーシス動態。出生後１０、１２、１４日目でのＢｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-網膜におけるＴＵＮＥＬアッセイ、スケールバー２５μm。肝機能に対する全身薬物処置の影響。ＤＭＳＯ０．００３%（ＣＴＬ）又はＶＰＡ又はＧＢＺのいずれかを用いて１０週間にわたり処置したｗｔ動物の血漿含量の分析：（ａ）アミノ酸濃度（グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、スレオニン、システイン、アルギニン、アラニン、チロシン、バリン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、オルニチン、ロイシン、トリプトファン、リジン、及び分岐鎖アミノ酸）（ｂ）全アミノ酸濃度（ｃ）尿素クリアランス速度に比例した、標識尿素の２時間の灌流後での非標識尿素濃度。＊Ｐ＜０．０５。網膜外植片におけるＧＶ処置。（Ａ）ＧＶ処置を受けたｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２外植片におけるＴＵＮＥＬアッセイ（スケールバー：２０mm）。（Ｂ）示された処置された外植片のアポトーシスレベル。（Ｃ）ＧＶを用いて添加された又はされていない、示したｓｈＲＮＡ処置された外植片におけるＢｉＰ、ｐｅＩＦ２α、ｅＩＦ２αｔｏｔ、及びＣＨＯＰ１０の免疫検出。（Ｄ）タンパク質定量化、同じゲル上に負荷した未処置網膜を、標準として使用した。（Ｅ）処置された外植片のウエスタンブロッティングのための負荷対照としてのポンソー染色。ＧＶ：ＧＢＺ２，５μM ＋ＶＰＡ０．２mM。ＵＰＲの薬理学的調節は、Ｂｂｓ１２-/-網膜における光受容体喪失を防止した。（Ａ）４週齢での示された処置及び遺伝子型を伴う動物の暗順応ａ波振幅対刺激強度（対数）関数（ｎ＝１２）。＊，ｐ＜０．０５。（Ｂ）示された動物の暗順応ｂ波振幅対刺激強度（対数）関数（ｎ＝１２）。＊＊，ｐ＜０．０５。動物を、２週間にわたり、ＧＩＶｉｎ（局所ＧＢＺ７，５μM ＋局所ＩＮＨ５００μM ＋全身ＶＰＡ５mg/ml）を用いて処置した。未処置動物と比較した、ｓＶＰＡ、ｓＧＢＺ、又はＧＩＶｉｎを受けた動物からのＢｂｓ１２-/-網膜におけるＵＰＲ関連標的レベル、ＯＮＬ長（mm±ＳＥＭ）及び厚さ、ならびに「ａ及びｂ波」振幅（１cd*s/m²でのμV±ＳＥＭ）の比較。ｓＶＰＡ：全身バルプロ酸５mg/ml；ｓＧＢＺ：全身グアナベンズ５０μM；ＧＩＶｉｎ：局所ＧＢＺ７，５μM ＋局所ＩＮＨ５００μM ＋全身ＶＰＡ５mg/ml。

発明の詳細な説明
世界中で網膜色素変性症（ＲＰ）は、遺伝的に決定された失明の最もよく見られる原因である。バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ、ＯＭＩＭ２９０９００）は、光受容細胞喪失に起因する症候性ＲＰを含む遺伝性疾患である。ＢＢＳは、ＲＰの早期発症、多指症、肥満、腎機能障害、性機能低下、及び認知障害により特徴付けられる（Mockel et al., 2011）。ＢＢＳは、現在までに同定された少なくとも１７の遺伝子を伴う異種状態である：ＢＢＳ１からＢＢＳ１７。全てのＢＢＳ遺伝子は、繊毛生合成及び／又は機能に関連している（Fliegauf et al., 2007）。機能的には、７つのＢＢＳタンパク質（ＢＢＳ１、２、４、５、７、８、及び９）が、繊毛膜への小胞輸送において含まれるＢＢＳｏｍｅと名付けられた安定な複合体を形成している（Nachry et al., 2007）。ＢＢＳ６、１０、及び１２（シャペロニン様ＢＢＳタンパク質）を含むシャペロニン複合体は、ＢＢＳｏｍｅ組み立てを媒介する（Seo et al., 2010）。光受容体の結合繊毛（ＣＣ）は、修飾された一次繊毛である。それは、生合成的に活性な内節（ＩＳ）を、光感受性の外節（ＯＳ）へ連結する。結合繊毛は外節の成長及び維持のために必須である。なぜなら、ＯＳにおいて必要とされる機能及び構造タンパク質のための唯一の輸送通路であるからである。

ＢＢＳノックアウトマウスモデルが、いくつかのＢＢＳ遺伝子について生成されている（Ｂｂｓ１Ｍ３８０Ｒ／Ｍ３８０Ｒ、Ｂｂｓ２-/-、Ｂｂｓ３Ｌ-/-、Ｂｂｓ４-/-、及びＢｂｓ６-/-）（Fath et al., 2005; Nishimura et al., 2004; Mykytyn et al., 2004; Davis et al., 2007; Pretorius et al., 2010）。出生時、全ての変異マウスが、正確な網膜積層及び正確な光受容体発生（結合繊毛及び外節形成を含む）を提示する。その正確な発生にもかかわらず、外節は持続することができない。なぜなら、これらのマウスが、ＯＳ分解及び光受容体細胞死を提示するからである。興味深いことに、Ｂｂｓ１Ｍ３８０Ｒ／Ｍ３８０Ｒ、Ｂｂｓ２-/-、Ｂｂｓ４-/-、及びＢｂｓ６-/-マウスは、外核層（ＯＮＬ）中及び内節中でのロドプシン蓄積を有する。Ｂｂｓ４-/-マウスは、アレスチン及びトランスデューシンの両方の光依存的輸送における欠損を有する（Abd-El-Barr et al., 2007）。これは、ＢＢＳタンパク質を、小胞輸送だけでなく、少なくとも光受容体中の繊毛内輸送（ＩＣＴ）にも直接的に連結する。結合繊毛に沿って輸送される最も重要なタンパク質の１つは、ロドプシンである。内節中でのそのミスフォールディング及び蓄積を誘導するロドプシン遺伝子における一部の変異は、光受容体アポトーシスに導く。ミスフォールドされたロドプシンの蓄積は、最近、小胞体（ＥＲ）ストレスを介して細胞死を誘導することが示された（Tam et al., 2006）。後者は、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）と呼ばれる協調応答経路を誘導する（Griciuc et al., 2011）。ＵＰＲは、２つのバランスのとれた応答（保護応答及びアポトーシス応答）を活性化することにより、タンパク質フォールディングストレスを検出及び管理する。ＥＲ中でのアンフォールドタンパク質の蓄積は、その嚢拡張及び分子シャペロンによる凝集タンパク質の検出に導く。結合免疫グロブリン重鎖タンパク質（ＢｉＰ）は、ＥＲ常在性シャペロンであり、ＥＲストレスのセンサーである（Kosmaoglou et al., 2008）。それが働き、タンパク質のフォールディングを回復する。ＢｉＰは、また、真核生物の開始因子２アルファ（ｅＩＦ２α）キナーゼ：ＰＲＫＲ様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）を活性化する。この工程は、ＵＰＲの適応応答の一部を形成し、それは、ＥＲ中のタンパク質負荷を軽減するために、キャップ依存性タンパク質合成の低下をもたらす。実際に、それは、適応応答を媒介するための代替の転写及び翻訳経路の活性化を許す。１つの重要な転写因子はＸｂｐ１である。ＥＲストレスは、転写因子Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質（Ｃｈｏｐ１０）を含むＵＰＲ応答に含まれる遺伝子のセットの転写に関与している、その短いアイソフォームの発現に導くＸＢＰ１の選択的スプライシングを誘導する。Ｃｈｏｐ１０は、アポトーシス経路と保護経路の間でのバランスのために重要である。恒常性が再確立されていない場合、プロアポトーシス応答が促され、カスパーゼ１２を介してアポトーシスに導く。それは、ＥＲに位置付けられ、カスパーゼカスケードが要求される場合に特異的に活性化される（Yang et al., 2007）。長期のＥＲストレス時でのその活性化は、エフェクターカスパーゼの活性化を誘導する：カスパーゼ３、６、及び７。

ＥＲストレス調節は、誘発された経路が明確に同定されることを条件として、網膜変性において出現する治療的選択肢でありうる。本発明者らは、本明細書において、Ｂｂｓ１２枯渇網膜外植片及びＢｂｓ１２-/-マウスモデルを使用して、最終的に光受容体の死に導く、ＵＰＲにおけるシグナル伝達カスケードを検討した。次に、本発明者らは、ＵＰＲ調節の治療戦略を開発した。本発明者らは、アポトーシスに対する光受容体細胞の保護を達成し、ＢＢＳ誘導性の網膜変性において網膜の機能を維持した。

本発明者らは、このように、本明細書において、これらの光受容体のアポトーシスを防止するために、光受容体においてＵＰＲを薬理学的に調節することが可能であることを実証している。本発明者らは、アンフォールドタンパク質応答に関与するシグナル伝達カスケードを検討し、網膜繊毛病を処置するための治療戦略を開発するための３つの主な標的、即ち、ＧＡＤＤ３４、ＢｉＰ、及びカスパーゼ１２を強調してきた。

タンパク質ホスファターゼ１調節サブユニット１５Ａ又はＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（遺伝子ＩＤ：２３６４５）とも名付けられるＧＡＤＤ３４は、真核生物の開始因子２α（ｅＩＦ２α）ホスファターゼである。この酵素は、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）と相互作用し、ｅＩＦ２αを脱リン酸化し、そして活性化し、このように、ＣＡＰ依存性タンパク質翻訳を調節する。

ＢｉＰ（結合免疫グロブリン重鎖タンパク質）は、また、熱ショック７０kDaタンパク質５、ＨＳＰＡ５、ＭＩＦ２、又はＧＲＰ７８（遺伝子ＩＤ：３３０９）と名付けられ、ＥＲの内腔において局在化する分子シャペロンである。その機能は、新生タンパク質を隔離し、タンパク質のフォールディングを回復し、ｅＩＦ２αキナーゼを活性化することである。

カスパーゼ１２は、また、ＣＡＳＰ−１２（遺伝子ＩＤ：１００５０６７４２）と名付けられ、ＥＲストレスにより特異的に活性化されるシステインプロテアーゼであり、アポトーシスの最終工程を開始するエフェクターカスパーゼのための誘因として作用している。

本発明は、このように、モジュレーター、又は、細胞の恒常性を維持し、細胞死を防止し、網膜の光検出能力を保持するための、上に記載する通りの特定のＵＰＲアクターについての２つ又は３つのモジュレーターの組み合わせを使用することにある。

したがって、第１の局面において、本発明は、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびに／あるいはタンパク質ＢＩＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤を含む医薬組成物に関する。

好ましくは、医薬組成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびに／あるいはタンパク質ＢＩＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤からなる群より選択される少なくとも２つの化合物を含む。

好ましい実施態様において、医薬組成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびにタンパク質ＢＩＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物を含む。

本明細書において使用する通り、用語「阻害剤」は、タンパク質の活性又は発現を阻害又は低下する化合物、あるいは、前記タンパク質の活性化を防止する化合物を指す。

用語「ｅＩＦ２α阻害剤」は、本明細書において使用する通り、翻訳開始因子ｅＩＦ２αの活性又はその発現を阻害又は低下する化合物、あるいは、ｅＩＦ２αの活性化を防止する（例えば、その脱リン酸化を低下又は遮断することによる）化合物を指す。ｅＩＦ２α阻害剤の活性は、当技術分野において公知の任意の方法により簡単にアッセイすることができる。例えば、阻害活性は、ｅＩＦ２αの活性及び不活性形態の量の測定を通じてアッセイすることができる。ｅＩＦ２αの活性及び不活性形態の量を、免疫学的方法を使用して、特に、実験セクションにおいて詳述する通り、ｅＩＦ２α及びｅＩＦ２αのリン酸化形態に特異的な商業的な抗体を使用して、決定しうる。

実施態様において、ｅＩＦ２α阻害剤は、ｅＩＦ２αの活性化を防止する化合物である。ｅＩＦ２αの活性化は、その脱リン酸化を、低下又は遮断することにより防止されうる。特に、化合物は、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤、又はＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤でありうる。

ＰＰ１の触媒サブユニットの阻害剤の例は、しかし、限定しないが、トートマイシン、トートマイセチン（Mitsuhashi et al., 2003）、カリクリンＡ、及びＰＰ１発現に特異的に干渉する核酸分子を含む。

ＧＡＤＤ３４の阻害剤の例は、しかし、限定しないが、グアナベンズ（Tsaytler et al., 2011）及びＧＡＤＤ３４発現に特異的に干渉する核酸分子を含む。特に、ＧＡＤＤ３４の活性は、グアナベンズ（ＧＢＺ）により抑制又は阻害することができる。

ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤の例は、しかし、限定しないが、サルブリナル及び化合物、例えば、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成を阻害するペプチド、即ち、ＧＡＤＤ３４と競合し、ＰＰ１と複合体を形成し、それにより、前記複合体を非機能的にすることができる化合物を含む。そのような化合物は、例えば、国際特許出願ＷＯ２００８／０２８９６５に記載されている。

このように、特定の実施態様において、ｅＩＦ２α阻害剤は、ｅＩＦ２αの活性化を防止し、グアナベンズ、トートマイシン、トートマイセチン、カリクリンＡ、サルブリナル、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成を阻害する化合物、及びＰＰ１又はＧＡＤＤ３４発現に特異的に干渉する核酸分子からなる群より選択される化合物である。

好ましい実施態様において、ｅＩＦ２α阻害剤は、ＧＡＤＤ３４の阻害剤である。より好ましくは、ｅＩＦ２α阻害剤はグアナベンズである。グアナベンズ（ＣＡＳ番号５０５１−６２−７）は、現在、抗高血圧薬物として使用されているアルファ２選択的アドレナリン作動薬である。

本発明において使用する通り、「ＰＰ１又はＧＡＤＤ３４発現に特異的に干渉する核酸分子」は、ＰＰ１又はＧＡＤＤ３４についてコードする遺伝子の発現を、特異的な方法で、低下又は抑制することができる核酸分子である。干渉核酸は、好ましくは、ＲＮＡｉ、アンチセンス、及びリボザイム分子からなる群より選択される。

特に、用語「ＲＮＡｉ分子」は、標的とするタンパク質の発現を下方制御することが可能である任意のＲＮＡを指す。それは、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を包含する。

アンチセンス核酸分子は、標的とするポリペプチドをコードするセンス核酸の全て又は一部に相補的でありうる、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的又はｍＲＮＡ配列と相補的でありうるが、それは、標的ｍＲＮＡの翻訳に干渉すると考えられる。ＲＮＡｉ及びアンチセンス分子を設計、産生、及び投与するための方法が、当業者に周知である。

リボザイムはリボヌクレアーゼ活性を伴う触媒的ＲＮＡ分子であり、それらは相補的領域を有する一本鎖核酸（例えばｍＲＮＡなど）を切断することが可能である。このように、リボザイムを使用して、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。標的について特異的なリボザイム分子が、当技術分野に一般に公知の方法により、設計、産生、及び投与することができる。

タンパク質ＢＩＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、バルプロ酸又はその誘導体、例えば２−エン−バルプロ酸、トリコスタチンＡ（Shi et al., 2007）、リチウム（Hiroi et al., 2005）、１−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−２−チオシアネート−エタノン（Kudo et al., 2008）、及びエキセンディン４（Cunha et al., 2009）からなる群より選択されうる。

好ましくは、前記化合物は、タンパク質ＢＩＰの発現及び活性を増加させる。ＢｉＰの発現及び活性を、例えば、実験セクションにおいて実証する通りに、バルプロ酸（ＶＰＡ）により増加させることができる。このように、好ましい実施態様において、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、バルプロ酸又はその誘導体である。特に、誘導体は、２−エン−バルプロ酸でありうる。好ましくは、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、バルプロ酸である。バルプロ酸（ＣＡＳ番号９９−６６−１）は、現在、てんかんの処置において使用される抗痙攣特性を伴う脂肪酸である。バルプロ酸は、典型的には、ナトリウム塩の形態で供給される。

ＧＡＤＤ３４及びカスパーゼ１２の酵素活性の抑制の効果を、ＢｉＰ遺伝子発現及びそのタンパク質活性の上方調節と組み合わせることにより、本発明者らは、光受容体アポトーシスの細胞死における有意な低下を達成し、それにより、症候性の網膜繊毛病、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）のモデルにおいて網膜の光検出能力を維持している。

このように、実施態様において、本発明の医薬組成物は、好ましくは、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびに／あるいはタンパク質ＢＩＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物との組み合わせにおいて、カスパーゼ１２の阻害剤を含む。

特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢＩＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびにカスパーゼ１２の阻害剤を含む。

カスパーゼ１２の阻害剤は、酵素の触媒部位を標的とするペプチド、プロカスパーゼ１２の切断を防止するペプチド、又はカスパーゼ１２発現と特異的に干渉する核酸分子でありうる。

カスパーゼ１２発現と特異的に干渉する核酸分子は、カスパーゼ１２についてコードする遺伝子の発現を特異的な方法において低下又は抑制することができる核酸分子である。ＰＰ１及びＧＡＤＤ３４について上に定義する通り、干渉核酸は、好ましくは、ＲＮＡｉ、アンチセンス、及びリボザイム分子からなる群より選択される。特に、核酸分子は、Jiang et al., 2008に記載される通りのリボザイムでありうる。

好ましい実施態様において、カスパーゼ１２の活性は、カスパーゼ１２酵素の触媒部位を標的とし、式：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを有する小さなペプチドにより抑制される。特に、前記ペプチドは、式ベンジルオキシカルボニル−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを有しうる。このペプチドは、いくつかの供給業者から商業的に入手可能である。

インビトロでの適用のために、細胞を、ｅＩＦ２αの活性化を防止する化合物ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤ならびに／あるいはタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物を含む適した培養培地中でインキュベートする。

本発明の医薬組成物を、当業者により公知である標準的な医薬的慣行に従い製剤化する（例、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）。特に、医薬組成物は、１つ又はいくつかの医薬的に許容可能な賦形剤及び／又は担体を含みうる。

可能な医薬組成物は、眼（眼内、局所眼、又は眼周囲を含む）、経口、直腸、膀胱内、局所（経皮的、バッカル、及び舌下を含む）、又は非経口（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内、及び皮内を含む）投与のために適するものを含む。これらの製剤のために、従来の賦形剤を、当業者により周知の技術に従って使用することができる。

非経口又は眼投与のための組成物は、一般的に、場合により使用直前に固形又は凍結乾燥形態から調製することができる生理学的に適合する無菌溶液あるいは懸濁剤である。アジュバント（例えば局所麻酔剤、保存剤、及び緩衝剤など）を溶媒中に溶解することができ、界面活性剤又は湿潤剤を組成物中に含め、活性成分の均一な分布を促進することができる。

経口投与のために、組成物を、従来の経口投与形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、及び液体製剤（例えばシロップ、エリキシル、及び濃縮滴剤など）などに製剤化することができる。非毒性固形担体又は希釈剤を使用してもよく、それらは、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、マグネシウム、炭酸塩などを含む。圧縮錠剤のために、結合剤（粉末材料に粘着質を与える薬剤である）も必要である。例えば、デンプン、ゼラチン、糖（例えばラクトース又はデキストロースなど）、及び天然又は合成ゴムを結合剤として使用することができる。崩壊剤も、錠剤の分解を促進するために錠剤中に必要である。崩壊剤は、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、ゴム、及び架橋ポリマーを含む。さらに、潤滑剤及び滑剤も錠剤中に含められ、製造プロセスにおける表面への錠剤材料の付着を防止し、製造の間での粉末材料の流動特性を改善する。コロイド状二酸化ケイ素が、滑剤として最も一般的に使用される。化合物（例えばタルク又はステアリン酸など）が、潤滑剤として最も一般的に使用される。

特に、投与の適した経路は、局所、経口、皮内、非経口、又は眼内である。特に、グアナベンズ及びバルプロ酸は、経口又は眼内投与してもよく、カスパーゼ１２を阻害するペプチドは、眼内投与してもよい。

好ましくは、本発明の医薬組成物は、眼投与のために、特に、眼内、局所、眼、又は眼周囲投与のために、より好ましくは、局所眼又は眼周囲投与のために適している。

本発明の医薬組成物を製剤化し、活性薬物を、実質的に投与直後に又は投与後の任意の所定時間に又は期間に放出させてもよい。

医薬組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤及び／又は担体と関連付けられる、ｅＩＦ２αの１つ又はいくつかの阻害剤ならびに／あるいはタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる１つ又はいくつかの化合物、ならびに／あるいはカスパーゼ１２の１つ又はいくつかの阻害剤を含みうる。これらの賦形剤及び／又は担体は、上に記載する通り、投与の形態に従って選ばれる。

医薬組成物は、また、少なくとも１つの別の治療的薬剤を含みうる。特に、前記の治療的薬剤は、化学療法薬剤、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、アルファ−アドレナリン遮断薬、アルファ−アドレナリン作動薬、ベータ−アドレナリン作動薬、抗コリン作用薬、５アルファ還元酵素の阻害剤、アンドロゲン、免疫調節剤、免疫抑制剤、抗血管新生剤（例えば抗ＶＥＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ＨＧＦ、及び抗ＥＦＧなど）、ロイコトリエン修飾剤、アミノサリチル酸、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症剤、抗寄生虫、可溶化インターロイキン受容体の治療、細胞傷害剤、酸化防止剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されうる。

本発明の医薬組成物は、継続的に注入により、ボーラス注射により（それにおいて、組成物は、持続放出される製剤である）、又は特定の製剤のために適切な方法により投与することができる。

投与される、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤の量は、当業者により周知である標準的な手順により決定しなければならない。患者の生理学的データ（例えば、年齢、サイズ、及び体重）及び投与の経路を考慮に入れて、適切な投与量を決定しなければならない。各々の化合物の適切な投与量は、また、医薬品が、１つだけの化合物あるいはｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、及びカスパーゼ１２の阻害剤からなる群より選択される２又は３つの化合物の組み合わせ、特に、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物の組み合わせを含む場合、変動しうる。

本発明の医薬組成物を、単一の用量として又は複数の用量において投与してもよい。各々の単位投与量は、例えば、１０ng〜２０mg、好ましくは１０ng〜１mg/kg体重のｅＩＦ２αの阻害剤、１０ng〜５０mg、好ましくは１０ng〜１mg/kg体重のタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに／あるいは１ng〜１mg、好ましくは１ng〜１００μg/kg体重のカスパーゼ１２の阻害剤を含みうる。特に、各々の単位投与量は、例えば、５０ng〜１．６g、好ましくは５０ng〜８０mgのｅＩＦ２αの阻害剤、５０ng〜４g、好ましくは５０ng〜８０mgのタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに／あるいは５ng〜８０mg、好ましくは５ng〜８mgのカスパーゼ１２の阻害剤を含みうる。単位投与量は、特に、意図した使用が小児での使用である場合、患者の年齢に従って適応されうる。

好ましい実施態様において、医薬組成物は、グアナベンズ及びバルプロ酸、ならびに、場合により、ペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む。

好ましくは、各々の単位投与量は、１０ng〜５００μg/kg体重のグアナベンズ、１０ng〜５００μg/kg体重のバルプロ酸、及び、場合により、１ｎｇ〜５０μg/kg体重のペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む。特に、各々の単位投与量は、５０ng〜４０mgのグアナベンズ、５０ng〜４０mgのバルプロ酸、及び、場合により、５ng〜４mgのペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含みうる。単位投与量は、特に、意図した使用が小児での使用である場合、患者の年齢に従って適応されうる。

本発明は、また、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンとの組み合わせにおける使用のための、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸を含む医薬組成物に関する。本発明は、また、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンとの組み合わせにおける使用のための、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズを含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸との組み合わせにおける使用のための、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、及び／又はカスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む医薬組成物に関する。特に、これらの組み合わせは、薬物としての使用のため、好ましくは、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における使用のためである。

本発明は、また、以下に関する：
− 繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における使用のための本発明の医薬組成物；好ましくは、医薬組成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む；
− 繊毛病により誘導された小胞体ストレスを防止又は低下させるための使用のための本発明の医薬組成物；
− 繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置のための薬物の製造のための、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、及び、場合により、医薬的に許容可能な担体の使用；
− 繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置のための薬物の製造のための、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体の使用；
− 繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置のための薬物の製造のための、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン、及び、場合により、医薬的に許容可能な担体の使用；
− 繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置のための薬物の製造のための、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、及び、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体の使用；
− 繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置のための薬物の製造のための、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体の使用；
− 繊毛病により誘導された小胞体ストレスを防止又は低下させるための薬物の製造のための上に記載する通りの使用；
− 特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせた製剤として、（ａ）ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、（ｂ）タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに（ｃ）カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンからなる群より選択される少なくとも２つの化合物を含む生成物又はキット；
− 特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせた製剤として、（ａ）ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに（ｂ）タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、（ｃ）カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む生成物又はキット；
− 特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせた製剤として、（ａ）ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、（ｂ）タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに（ｃ）カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む生成物又はキット；
− 特に、繊毛病により誘導された小胞体ストレスを防止又は低下させるための、同時、別々、又は連続使用のため組み合わせた製剤としての、上に記載する通りの生成物又はキット；
− それを必要とする被験者において、治療的に効率的な量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、繊毛機能障害に関連する網膜変性を処置するための方法；好ましくは、医薬組成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む；
− それを必要とする被験者において、治療的に効率的な量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、繊毛病により誘導された小胞体ストレスを防止又は低下させるための方法；好ましくは、医薬組成物は、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む。
− それを必要とする被験者において、治療的に効率的な量の上に記載する通りの本発明の生成物又はキットを投与することを含む、繊毛機能障害に関連する網膜変性を処置するための方法；好ましくは、生成物又はキットは、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む；
− それを必要とする被験者において、治療的に効率的な量の上に記載する通りの本発明の生成物又はキットを投与することを含む、繊毛病により誘導された小胞体ストレスを防止又は低下させるための方法；好ましくは、生成物又はキットは、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンを含む。

本発明に従った医薬的使用は、獣医学的使用を含む。

用語「被験者」は、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒト（成人、小児、及び出生前段階のヒトを含む）を指す。

本明細書において使用する通り、用語「繊毛機能障害に関連する網膜変性」は、繊毛病により誘導される網膜変性、即ち、一次繊毛の機能障害及び、特に、光受容体結合繊毛機能障害を指す。繊毛病は、単一の器官（又は組織）に影響を及ぼしうる、又は、同時に含まれる種々の標的器官を伴う、繊毛病関連の徴候の末期症候スペクトルに導きうる。繊毛機能障害に関連する網膜変性、特に、網膜色素変性症は、特定の網膜繊毛遺伝子中の変異に起因する孤立性の非症候性網膜変性でありうる、又は症候性繊毛病の特徴でありうる。

特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性は、バルデ・ビードル症候群、シニア−ローケン症候群、サルディーノ−マインツァー症候群、ジュベール症候群、ジュンヌ症候群、センセンブレナー症候群、メッケル−グルーバー症候群、アルストレーム症候群、ＭＯＲＭ症候群、繊毛遺伝子中の変異により起こされるレーバー先天性黒内障のサブグループ、及びＲＰＧＲ遺伝子中の変異により起こされるＸ連鎖網膜色素変性症からなる群より選択される繊毛病により誘導されうる。

これら繊毛病は、繊毛機能において含まれる１つ又はいくつかの遺伝子における変異により起こされる。変異は、コードされるタンパク質の機能の完全な喪失又は機能の部分的な喪失だけを誘導しうる。変異は、ストップコドンの作製、フレームシフト変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシング、プロセシング又は翻訳効率、生成物不安定性、切断ポリペプチド産生などをもたらしうる。変異は、変化した機能、安定性、標的化、又は構造を伴うポリペプチドの産生をもたらしうる。それは、また、例えば、免疫組織化学、半定量的ウエスタンブロットにより、又はタンパク質もしくは抗体アレイにより評価されうるタンパク質発現における低下を起こしうる。

バルデ・ビードル症候群（ＯＭＩＭ：＃２０９９００）は、ＢＢＳ１、ＢＢＳ２、ＢＢＳ３／ＡＲＬ６、ＢＢＳ４、ＢＢＳ５、ＢＢＳ６／ＭＫＫＳ、ＢＢＳ７、ＢＢＳ８、ＢＢＳ９、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１１、ＢＢＳ１２、ＢＢＳ１３／ＭＫＳ１、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０、ＢＢＳ１５／ＷＤＰＣＰ、ＢＢＳ１６／ＳＤＣＣＡＧ８、又はＢＢＳ１７／ＬＺＴＦＬ遺伝子における変異により起こされうる。

シニア・ローケン症候群（ＯＭＩＭ：＃２６６９００）は、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０、ＢＢＳ１６／ＳＤＣＣＡＧ８、ＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ２、ＮＰＨＰ３、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ５、又はＮＰＨＰ９／ＮＥＫ８遺伝子における変異により起こされうる。

ジュベール症候群（ＯＭＩＭ：＃２１３３００）は、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０、ＲＰＧＲＩＰ１Ｌ、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＭＫＳ３、ＩＮＰＰ５Ｅ、ＡＨＩ１、ＡＲＬ１３Ｂ、ＮＰＨＰ１ＴＭＥＭ２１６、ＴＭＥＭ６７、ＯＦＤ１、ＴＴＣ２１Ｂ＊、ＫＩＦ７、ＴＣＴＮ１、ＴＭＥＭ２３７、ＣＥＰ４１、ＴＭＥＭ１３８、Ｃ５ｏｒｆ４２、ＴＣＴＮ３、ＺＮＦ４２３、ＴＣＴＮ２、又はＴＭＥＭ２３１遺伝子における変異により起こされうる。

サルディーノマインツァー症候群（ＯＭＩＭ＃２６６６９２０）は、ＩＦＴ１４０遺伝子における変異により起こされうる。

ジュンヌ症候群は、また、ジュンヌ窒息性胸郭ジストロフィーと名付けられ（ＯＭＩＭ：＃２０８５００）、ＩＦＴ８０、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＴＴＣ２１Ｂ、又はＷＤＲ１９遺伝子における変異により起こされうる。

メッケル・グルーバー症候群（ＯＭＩＭ：＃２４９０００）は、ＢＢＳ１３／ＭＫＳ１、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０、ＢＢＳ１５／ＷＤＰＣＰ、ＲＰＧＲＩＰ１Ｌ、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＮＰＨＰ３、ＭＫＳ２、又はＭＫＳ３遺伝子における変異により起こされうる。

アルストレーム症候群（ＯＭＩＭ：＃２０３８００）は、遺伝子ＡＬＭＳ１における変異により起こされる。

ＭＯＲＭ症候群（精神遅滞、体幹肥満、網膜ジストロフィー、及び小陰茎）（ＯＭＩＭ：＃６１０１５６）は、遺伝子ＩＮＰＰ５Ｅにおける変異により起こされうる。

レーバー先天性黒内障（ＯＭＩＭ：＃２０４０００）は、異種の非常に早期発症の網膜変性である。今日までに同定された遺伝子のサブセットは、繊毛である。特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性は、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０、ＬＣＡ５／Ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎｅ、又はＲＰＧＲＩＰ１遺伝子における変異により起こされるレーバー先天性黒内障のサブグループに属する繊毛病でありうる。

繊毛機能障害に関連する網膜変性は、また、ＲＰＧＲ遺伝子における変異により起こされるＸ連鎖網膜色素変性症（ＯＭＩＭ：＃３０００２９）でありうる。

センセンブレナー症候群（ＯＭＩＭ＃２１８３３０）は、ＷＤＲ１９、ＷＤＲ３５、ＩＦＴ１２２、又はＩＦＴ４３遺伝子における変異により起こされうる。

このように、繊毛機能障害に関連する網膜変性は、ＢＢＳ１、ＢＢＳ２、ＢＢＳ３／ＡＲＬ６、ＢＢＳ４、ＢＢＳ５、ＢＢＳ６／ＭＫＫＳ、ＢＢＳ７、ＢＢＳ８、ＢＢＳ９、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１１、ＢＢＳ１２、ＢＢＳ１３／ＭＫＳ１、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０、ＢＢＳ１５／ＷＤＰＣＰ、ＢＢＳ１６／ＳＤＣＣＡＧ８、ＢＢＳ１７／ＬＺＴＦＬ１、ＲＰＧＲＩＰ１Ｌ、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＮＰＨＰ３、ＭＫＳ２、ＭＫＳ３、ＩＮＰＰ５Ｅ、ＡＨＩ１、ＡＲＬ１３Ｂ、ＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ２、ＮＰＨＰ３、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ５、ＮＰＨＰ９／ＮＥＫ８、ＴＭＥＭ２１６、ＴＭＥＭ６７、ＯＦＤ１、ＴＴＣ２１Ｂ＊、ＫＩＦ７、ＴＣＴＮ１、ＴＭＥＭ２３７、ＣＥＰ４１、ＴＭＥＭ１３８、Ｃ５ｏｒｆ４２、ＴＣＴＮ３、ＺＮＦ４２３、ＴＣＴＮ２、ＴＭＥＭ２３１、ＩＦＴ１４０、ＩＦＴ８０、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＴＴＣ２１Ｂ、ＷＤＲ１９、ＷＤＲ３５、ＩＦＴ１２２、ＩＦＴ４３、ＡＬＭＳ１、ＬＣＡ５、及びＲＰＧＲからなる群より選択される遺伝子における変異により起こされる繊毛病により誘導されうる。

特定の実施態様において、網膜変性は、バルデ・ビードル症候群により誘導される。

本明細書において使用する通り、用語「処置」、「処置する」、又は「処置している」は、患者の健康状態を改善することが意図された任意の行為、例えば疾患の治療、防止、予防、及び遅延などを指す。特定の実施態様において、そのような用語は、疾患又は疾患と関連付けられる症状の寛解又は根絶を指す。他の実施態様において、この用語は、そのような疾患を伴う被験者への、１つ又は複数の治療用薬剤の投与に起因する疾患の伝播又は悪化を最小限にすることを指す。

特に、用語「繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置」は、特に、網膜電図記録上のａ波の増加した振幅を伴う、光受容体の光検出能力の保存又は改善を指しうる。この用語は、また、網膜中の光受容体のアポトーシスの低下及び／又は外顆粒層の厚みの増加を指す。

「治療的に効率的な量」により、繊毛機能障害に関連する網膜変性の、上に定義する通りの処置を構成するために十分である、被験者に投与される、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤の量を意図する。

本発明の繊毛機能障害に関連する網膜変性を処置するための方法において、医薬組成物又は生成物又はキットを、任意の適した経路を使用して投与してもよく、特に、局所、経口、皮内、非経口、及び／又は眼内、好ましくは眼内に投与してもよい。

本発明の方法は、また、少なくとも１つの追加の治療的薬剤を被験者に投与することをさらに含みうる。特に、前記の治療的薬剤は、化学療法薬剤、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、アルファ−アドレナリン遮断薬、アルファ−アドレナリン作動薬、ベータ−アドレナリン作動薬、抗コリン作用薬、５アルファ還元酵素の阻害剤、アンドロゲン、免疫調節剤、免疫抑制剤、抗血管新生剤（例えば抗ＶＥＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ＨＧＦ、及び抗ＥＦＧなど）、ロイコトリエン修飾剤、アミノサリチル酸、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症剤、抗寄生虫、可溶化インターロイキン受容体の治療、細胞傷害剤、酸化防止剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されうる。

これらの薬物、即ち、ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびにカスパーゼ１２の阻害剤は、別々にテストした場合、一部の効果を示しているが、２つ又は３つの分子の組み合わせが、アポトーシスを防止する際にはるかにより効果的であることが証明されている。顕著には、これらの薬物の組み合わせは、また、本発明者らが、インビボモデルに投与される用量を低下させることを許しており、最大限にまで、任意の可能性のある副作用を限定する。

この増強効果は、減少量のｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤を使用することを許す。このように、本発明の医薬組成物、組み合わせ、生成物、キット、又は組み合わせ処置を用いて、有害又は毒性効果を低下させながら、処置の効力を保存、又はさらには改善することが可能である。

このように、実施態様において、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンからなる群より選択される少なくとも２つの化合物が、医薬組成物、生成物、もしくはキット中に存在しており、又は、それを必要とする被験者に、治療量以下の用量で投与される。

特定の実施態様において、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンが、医薬組成物、生成物、もしくはキット中に存在しており、又は、それを必要とする被験者に、治療量以下の用量で投与される。

特に、医薬組成物、生成物、又はキットは、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはグアナベンズ、ならびに、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはバルプロ酸を含み、相対量のｅＩＦ２αの阻害剤ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物は、それらが、被験者への投与時に相乗的な治療効果を示すようにし、好ましくは、１つ又は両方が、治療量以下の用量で使用される。

本明細書において使用する通り、用語「治療量以下の用量」は、それが単独で使用される場合、同じ適応症及び同じ投与経路について、被験者に投与される従来の用量よりも低い治療的薬剤の量又は用量を指す。特に、それは、単独で使用した場合に無の又はわずかだけの効果を有する治療用薬剤の量又は用量を指す。特に、治療量以下の用量は、従来の用量の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０%でありうる。

あるいは、化合物の量又は投与量を下げる代わりに、投与頻度又は処置期間を低下させてもよい。

本発明の例示的な態様
１．ｅＩＦ２αの阻害剤ならびに／あるいはカスパーゼ１２の阻害剤ならびに／あるいはタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物を含む医薬組成物。

２．ｅＩＦ２αの阻害剤、カスパーゼ１２の阻害剤、ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物からなる群より選択される少なくとも２つの化合物を含む、局面１の医薬組成物。

３．ｅＩＦ２αの阻害剤、カスパーゼ１２の阻害剤、ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物を含む、局面１又は２の医薬組成物。

４．ｅＩｆ２−αの阻害剤がＧＢＺである、局面１〜３のいずれか１つに従った組成物。

５．カスパーゼ１２の阻害剤が、カスパーゼ１２酵素の触媒部位を標的とするペプチド、好ましくは、式Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンのペプチドである、局面１〜４のいずれか１つに従った組成物。

６．タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物がＶＰＡである、局面１〜５のいずれか１つに従った組成物。

７．ＧＢＺ、式Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンのペプチド、及びＶＰＡの組み合わせを含む、局面１〜６のいずれか１つに従った組成物。

８．繊毛病により誘導された小胞体ストレスを防止又は低下させるための局面１〜６のいずれか１つに従った組成物。

９．網膜変性、特に、繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における使用のための、局面１〜６のいずれか１つに従った組成物。

１０．網膜変性がバルデ・ビードル症候群により誘導される、局面８の組成物。

１１．タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物との組み合わせにおいて使用される、ｅＩＦ２αの阻害剤及び／又はカスパーゼ１２の阻害剤を含む医薬組成物。

１２．網膜繊毛病又は網膜変性の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせた製剤として、ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはＧＢＺ、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン、ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはＶＰＡからなる群より選択される少なくとも２つの化合物を含む生成物。

１３．ｅＩＦ２αの阻害剤、好ましくはＧＢＺ、カスパーゼ１２の阻害剤、好ましくはペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン、ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、好ましくはＶＰＡを含む局面１２の生成物。

１４．被験者において網膜変性を処置又は防止するための方法であって、前記方法が、局面１〜１１のいずれか１つにおいて定義される通りの医薬組成物あるいは局面１２又は１３の生成物の治療的に効果的な量を、それを必要とする被験者に投与することからなる工程を含む。

１５．医薬組成物又は生成物が、局所、経口、皮内、非経口、及び／又は眼内に投与される、局面１４に従った方法。

１６．少なくとも１つの追加の治療的薬剤を被験者に投与することをさらに含む、局面１４又は１５に従った方法。

１７．局面１６に従った方法であって、それにおいて、前記の少なくとも１つの追加の治療的薬剤が、化学療法薬剤、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、アルファ−アドレナリン遮断薬、アルファ−アドレナリン作動薬、ベータ−アドレナリン作動薬、抗コリン作用薬、５アルファ還元酵素の阻害剤、アンドロゲン、免疫調節剤、免疫抑制剤、抗血管新生剤（例えば抗ＶＥＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ＨＧＦ、及び抗ＥＦＧなど）、ロイコトリエン修飾剤、アミノサリチル酸、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症剤、抗寄生虫、可溶化インターロイキン受容体の治療、細胞傷害剤、酸化防止剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。

本明細書において言及又は引用する、全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物が、参照により、それらの全体において（全ての図及び表を含む）、それらが本明細書の明かな教示と一致しない範囲まで、組み入れられる。

以下の実施例を、例示の目的のために、限定の方法によらず、与える。

実施例
材料及び方法
網膜外植片
野生型動物は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上であった。網膜外植片培養手順を、以前に記載された通りに行った（Reidel et al., 2006）。簡単には、１５日齢のマウスを、断頭により屠殺し、眼を除去し、トリプシン（カタログ＃２５２００−０７２、Gibco、Invitrogen、Paris、France）中で１０分間にわたり３７℃でインキュベートした。消化を、眼をＤＭＥＭ＋１０%ウシ胎仔血清（カタログ＃３１８８５−０２３及び１０５００−０６４、Gibco）中に移し、１０分間にわたる４℃でのインキュベーションにより停止させた。眼を、６．５ｇ／Ｌグルコースを添加したＡｍｅ培地（カタログ＃１５２３０−０９７、Gibco）中で解剖した。最初に、強膜を慎重に除去し、眼球に付着した網膜色素上皮（ＲＰＥ）を残した。角膜の縁を切開し、角膜、レンズ、及び硝子体を除去した。次に、４つの放射状切開を、網膜中に作り、十字形状を得た。網膜を、ＲＰＥ側を下にしたニトロセルロース培養膜（カタログ＃ＰＩＣＭＯＲＧ５０、Millipore、Molsheim、France）上に移し、Ｂ２７添加剤（カタログ＃１７５０４−０４４、Gibco）、Ｌ−グルタミン（カタログ＃３５０５０−０６１、Gibco）、及び／又はペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ＃１５２４０；Gibco）を添加したNeurobasal A培地（カタログ＃１０８８８８−０２２， Gibco）中で培養した。外植片を、３７℃の加湿５% ＣＯ_２で維持した。Ｂｂｓ１２、Ｐｅｒｋ、Ｈｒｉ、又はロドプシンについてのｓｈＲＮＡ配列を保有するレンチウイルスを使用した特異的な遺伝子サイレンシング（SantaCruz Biotechnology、Tebu Bio、Yvelines、France）を、全培地交換前に、培養培地中の２０μｌのウイルス懸濁液（１×１０^５感染単位）を加えることにより、一晩実施した。感染した外植片を、次に、３日間にわたり、毎日の半培地交換を伴い、培養した。外植片を、より長く培養中で維持せず、異なる網膜層における非特異的なアポトーシスを回避した。薬理学的処置のために、２mMバルプロ酸（エタノール１００%中に溶解したＶＰＡ；カタログ番号４５４３；Sigma-Aldrich）、２５μMグアナベンズ（Ｍｅ_２ＳＯ中に溶解したＧＢＺ；カタログ番号０８８９；Tocris Bioscience、Ellisville、MO）、１０μMカスパーゼ１２阻害剤（Ｍｅ_２ＳＯ中に溶解したＩＮＨと名付けた。合成ペプチドＺ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）−フルオロメチル−ケトン；カタログ番号ＰＫ−ＣＡ５７７−１０７９−１００；Promokine、Heidelberg、Germany）を、単一処置のために、組み合わせ処置：ＧＩＶ（ＧＢＺ２．５μM ＋１μM ＩＮＨ＋０．２mM ＶＰＡ）又はＧＶ（２．５μM ＧＢＺ＋０．２mM ＶＰＡ）のために１０倍希釈で加えた。薬物を、培養培地へのウイルス感染と同時に加えた。

免疫蛍光実験及びＴＵＮＥＬアッセイのために、網膜外植片を、ホルマリン１０%を用いて、４℃で１時間にわたり、直接的に、膜上に固定した。スクロース含浸を、次に、１０%、２０%、及び３０%スクロース槽を使用して実施した（各々２０分間）。外植片を、モールド中のＯＣＴ（カタログ＃４５８３、Tissue-Tek、Sakura、Villeneuve d'Ascq、France）に移し、液体窒素中で凍結した。８μmの薄凍結切片をStarFrostスライド（カタログ＃ＶＳ１１１７、Waldemar Knittel Glasbearbeitungs、Braunschweig、Germany）上に載せた。

光適応実験
光適応実験を、３７℃で、外植片上で、遺伝子ノックダウンを許すための３日間の培養後に実施した。明暗実験のために、外植片を、４時間にわたり暗適応し、次に、発光ダイオードにより、３０分間にわたり２００ルクスに曝露した。明暗条件のために、外植片を、４５分間にわたる暗適応前に、１５分間にわたり２００ルクスに曝露した。処置後、外植片を、使用した照明条件において、４%ホルムアルデヒドを用いて固定した。

Ｂｂｓ１２-/-マウスの繁殖及び薬理学的処置
Ｂｂｓ１２-/-マウスを、以前に記載された通りに生成した。Ｂｂｓ１２-/-マウスを、ヘテロ接合体動物を交配することにより得た。マウスを、１２時間明／１２時間暗サイクルの湿度及び温度が制御された部屋に収容し、適宜、餌及び水を用いた。抗アポトーシス処置のために、動物を、点眼を用いて、２〜４週齢で１日１回処置し、点眼は、ＧＢＺ７．５μm及びカスパーゼ阻害剤５００μmを左眼について含み、５%ＤＭＳＯを右眼について含む。３〜４週齢に、離乳後、ＶＰＡ又はＧＢＺを、それぞれ５mg/mL及び５０μmの濃度で飲料水中に加えた。点眼処置は２〜４週齢で達成され、全身処置は３〜４週齢で達成された。４週齢で、電気生理学的分析を実施し、網膜を分子分析のために回収した。

網膜電図分析
マウスを、記録前の１２時間にわたり暗適応させた。それらの実験は、暗い赤色ライト下で実施した。マウスを、上のセクションにおいて記載する同じ麻酔混合物を用いて麻酔した。瞳孔を、アトロピン０．３%の点眼（カタログ＃ Atropine Alcon ０．３%、Alcon、Rueil-Malmaison、France）を用いて拡張させた。動物を、制御された加熱パッド上に置き、手順の間に３７℃で維持した。参照電極を、頭部皮膚下に置き、バックグラウンド電極を、動物の尾中に挿入した。測定電極を角膜上に置き、角膜と金電極の間での接触を最適化した。１滴のメチルセルロースゲル（カタログ＃Ocry-gel、TVM laboratories、Lempdes、France）を加えた。フラッシュを、最大出力３１８cd/m²を伴う発光ダイオード（Siem Biomedicale、Nimes、France）を備えた全体野を通じて送達した。暗順応ＥＲＧのために、フラッシュ時間が３〜５msまで変動し、最終的なフラッシュ出力は０．００１〜１cd*s/m²であった。応答が、増幅、ろ過（１−３００Hzバンドパス）、及びデジタル化した（Visiosystem；Siem Biomedicale）。ａ及びｂ波を、１−７５Hzバンドパスを使用することにより測定し、振動電位をフィルタリングした。

ＲＮＡ抽出及び定量的ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Trizol（カタログ＃１５５９６−０１８、Invitrogen）を用いて抽出した。１μgの全ＲＮＡを、TURBO DNA-free Kit（カタログ＃ＡＭ１９０７、Applied Biosystems、Villebon-sur-Yvette、France）を使用してＤＮＡｓｅ処理し、次に、iScript cDNA合成キット（カタログ＃１７０−８８９１、BioRad、Marne-la-coquette、France）を使用して逆転写した。プライマー（補足方法においてリストする）を、Qiagen（Courtaboeuf、France）から購入した。定量的ＰＣＲを、SYBR Green PCR Mix（カタログ＃４３６７６５９、Applied Biosystems）を使用して、BioRad CFX96システム上で実施した。ｍＲＮＡ発現を、ＧａｐｄｈＲＮＡ含量と比べて、BioRad CFXマネージャーソフトウェアを使用して表した。小胞体ストレスアレイのために、Custom TaqMand Array 96を、Applied Biosystemsから購入し、全てのテストされた遺伝子を、補足方法においてリストする。

Ｘｂｐ１スプライシングのＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡを、上に記載する通りに抽出し、逆転写した。ｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＸｂｐ１の非スプライス及びスプライス変異体の両方のＰＣＲ増幅のために使用した：５’−ＴＴＡＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＧＧＧＴＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２）（Lin et al., 2007）。ＰＣＲを、RedTaq DNAポリメラーゼ（カタログ＃Ｄ４３０９−５０ＵＮ、Sigma-Aldrich）を使用し、以下のサイクリングを使用して行った：５分間にわたる９５℃−［１分間にわたる９５℃−３０秒間にわたる５８℃−３０秒間にわたる７２℃］３５サイクル−５分間にわたる７２℃。

ウエスタンブロット、免疫蛍光顕微鏡、及びＴＵＮＥＬアッセイ
タンパク質を、Protease Inhibitors Complete Mini EDTA free（カタログ＃１１８３６１７０００１、Roche、Boullogne-Billancourt、France）、１mM ＮａＶＯ_４、及び２５mM ＮａＦ（カタログ＃Ｓ６５０８及びＳ７９２０、Sigma-Aldrich）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（１５０mM ＮａＣｌ、５０mM ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８、０．１% Tween20、カタログ＃Ｐ７６５３、Ｔ３２５３、９３７７３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中での溶解により得た。ダウンスホモジナイザーを使用した網膜解離後、サンプルを超音波処理し、タンパク質濃度を、Bradford試薬（カタログ＃５００−０００６、ＢｉｏＲａｄ）を使用して決定した。ウエスタンブロッティングのために、８０μｇの全タンパク質抽出物を、１レーン当たりに負荷し、ポンソーＳ染色を、シグナル定量化のための負荷対照として使用した。抗体結合を、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（カタログ＃３４０９５、ThermoFisher）を使用して、Versadoc装置（BioRad）上で可視化した。シグナル定量化は、BioRadからのQuantityOneソフトウェアを使用して評価した。

切片又は細胞を、ＰＢＳ１×を用いて洗浄し、ホルマリン１０%溶液を用いて５分間にわたり短く固定し、ＰＢＳ１×を用いて３回洗浄した。切片を、次に、Teng-T（１０mM ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ＝７．６）、５mM ＥＤＴＡ（カタログ＃Ｅ５７６８、Sigma-Aldrich）、１５０mM ＮａＣｌ、０．２５%ゼラチン（カタログ＃Ｇ９３９１、Sigma-Aldrich）、０．０５% Tween-20）／１０%正常ヤギ血清（カタログ＃ＰＣＮ５０００、Gibco）を用いて３０分間にわたりプレインキュベートし、Ｔｅｎｇ−Ｔ／１０% ＮＧＳ中に希釈した一次抗体を用いた４℃での一晩インキュベーションが続く。スライドを、次に、ＰＢＳ１×を用いて洗浄し、Teng-T／１０% ＮＧＳ中に希釈した、示した二次抗体を用いて、１時間にわたり室温でインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ１×を用いて洗浄し、核染色を、ＤＡＰＩ（カタログ＃Ｄ１３０６、Invitrogen）を用いて実施した。スライドをImmumount（カタログ＃９９９０４０２、ThermoFisher）上に乗せた。ＴＵＮＥＬアッセイを、In situ Cell Death Detection Kit（カタログ＃１１６８４７９５９１０、Roche）を使用して、供給業者のプロトコールに従って実施した。アポトーシス核の保有率は、１実験当たりのＯＮＬの３つの異なる領域におけるＴＵＮＥＬ陽性核及びＤＡＰＩ染色核の比率として表した。示した全ての結果は、少なくとも３つの別々の実験の代表である。

透過型電子顕微鏡
サンプルを、カルノフスキー固定液中で固定し、１重量%容積の四酸化オスミウムを含む０．１Mカコジル酸緩衝液内で１時間にわたり４℃で後固定した。サンプルを、次に、等級アルコールを通して脱水し、Epon812樹脂中に包埋した。７０nmの超薄切片を切り、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて対比した。切片の写真を、Philips Morgagni 268D透過型電子顕微鏡を使用して作った。

抗体
使用した一次抗体：ウサギポリクローナル抗ＢＢＳ１０（カタログ＃１２４２１、ProteinTech）、マウスポリクローナル抗ＢＢＳ１２（カタログ＃Ｈ００１６６３６９−Ｂｏ１Ｐ、Abnova、Colmar、France）、マウスモノクローナル抗ロドプシンＲｈｏ−４Ｄ２（Hicks et al., 1986）、ウサギモノクローナル抗切断ＰＡＲＰ、マウスモノクローナル抗ｅＩＦ２アルファ、ウサギモノクローナル抗ホスホｅＩＦ２アルファ、ウサギモノクローナル抗ＢＩＰ、マウスモノクローナル抗ＣＨＯＰ１０（それぞれ、カタログ＃９５４４、＃２１０３、＃３５９７、＃３１７７、＃２８９５、全てを、Cell Signaling、Ozyme、Saint-Quentin-Yveline、Franceから購入）、マウスモノクローナル抗βチューブリン（カタログ＃ＴＵＢ−２Ａ２、Euromedex、Souffeliweyersheim、France）、マウスモノクローナル抗γチューブリン（カタログ＃ａｂ１１３１６−１００、Abcam、Paris、France）、マウスモノクローナル抗アセチル化αチューブリン（カタログ＃３２−２７００ Zymed laboratories、Invitrogen）。異なる二次抗体を、免疫蛍光実験のために使用した：ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（カタログ＃８１−６５１１、Zymed laboratories）、ロバ抗ウサギTexas Red（カタログ＃ａｂ６８００、Abcam）、抗マウスAlexa 594、抗ウサギＦＩＴＣ、ロバ抗ヤギＩＧ−ＴＲ（カタログ＃ｓｃ−２７８３、Santa Cruz）、ロバ抗ウサギＩｇ−ＦＩＴＣ（カタログ＃ｓｃ−２０９０、Santa Cruz）、ウサギ抗マウスAlexa 488、ヤギ抗マウスFluor 594（カタログ＃Ａ−１１０５９及びＡ−１００３２、Molecular Probes、Invitrogen）。

毒物学的分析
処置のために、マウスに、１０週間にわたり、ＶＰＡ５mg/ml又はＧＢＺ５０μＭ又は対照としてのＤＭＳＯ０．００３%のいずれかを添加した水を用いて自由摂取で与えた。１０週間の処置後、Hallemeesch et al., 2001において発表された通り、尿素合成の速度を測定した。簡単には、動物を、２５μl/１０グラム体重の麻酔混合物（１００ml Domitor（カタログ＃ Domitor １mg/ml、Janssen-Cilag、Issy-les-Moulineaux、France）＋３１４mlケタミン（カタログ＃ Ketamine 1000、Virbac、Carros、France）＋４ml ０．９% ＮａＣｌ溶液）を用いて麻酔した。マウスを、制御された加熱パッド上に置き、手順の間、３７℃で維持した。頸静脈内カテーテルを固定し、標識した尿素溶液を、初速４ml/時間で７分間にわたり、０．５ml/時間で次の２時間にわたり注入した。溶液は、２４μmol ＮａＨＣＯ_３（カタログ＃Ｓ５７６１、Sigma-Aldrich）及び３．６μmol標識尿素（カタログ＃ＣＯＬＭ−４８６１−０．５、Cambridge Isotope Laboratories、Andover、USA）／１０グラム体重を添加した０．９% ＮａＣｌである。２時間の灌流後、血液を、大静脈（ｃａｖｅａｌｖｅｉｎ）尾側から腎臓まで採取した。血液サンプルを１２０００gで１２分間にわたり遠心し、８０μlの血漿を、尿素濃縮及びアミノ酸濃度のさらなる分析のために、６．４mgのスルホサリチル酸（カタログ＃Ｓ７４２２、Sigma-Aldrich）を用いて沈殿した。血漿アミノ酸濃度を、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈａｔａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）（Pierce）及び３−メルカプトプロピオン酸（Sigma-Aldrich）、Omnisphere3 C18カラム（Varian）、及び蛍光検出（Van Eijk et al., 1993）を用いたプレカラム誘導を伴う勾配逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定した。血漿尿素濃度を、５４０nmでの吸光度測定を用いた製造業者の指示に従って、Sigma完全試薬キット血液尿素窒素テストを使用した比色法を使用して決定した。トレーサーを、タンデム液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して、２５μl血漿を分析することにより測定した。濃縮は、安定同位体の天然存在度について補正した、トレーサー−トレーシー比率として与える。検出は親断片化に基づいていた−質量及び電荷に関するイオン化及び娘検出。

以下は、本発明を実行するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は、限定的として解釈すべきではない。全てのパーセンテージは重量によるものであり、全て溶媒混合割合は容積によるものである（他に記述しない限り）。

結果
網膜外植片におけるＢｂｓ１２枯渇は、光受容体の異形に導く。

ＢＢＳにおける光受容体細胞死の機構におけるＥＲストレスの関与を検討するために、網膜組織化及び光受容体区画化を維持している網膜外植片の培養物を使用して、エクスビボモデルを確立した（図７）。ｓｈＲＮＡ媒介性のＢｂｓ１２枯渇時、Ｂｂｓ１２ＲＮＡの発現レベルは４０%だけ低下し（図１ａ）、ＢＢＳ１２タンパク質レベルにおける有意な減少をもたらした（図１ｂ）。この枯渇は、光受容体のＯＮＬ及びＯＳの一般的な組織崩壊を誘導し、それは、ＣＣの劇的な低下及びＯＳにおけるディスク拡張と関連付けられた（図１ｃ及び１ｄ）。ＢＢＳ１２枯渇光受容体におけるＩＣＴは、ＯＮＬにおけるロドプシンの蓄積により例示される通り、欠損していた（図１ｅ）。ＩＣＴのこの喪失は、ロドプシン特異的ではなかった。なぜなら、アレスチンのＩＣＴを評価するための暗光実験では、フォトニック刺激時にＯＳに向かう再局在化の非存在が明らかになったからである（図１ｆ）。

網膜外植片におけるＰＥＲＫ−ｉｎＢｂｓ１２ノックダウンは、ＥＲストレス媒介光受容体細胞死を誘導する。

Ｂｂｓ１２不活性化後での光受容体細胞死の程度を評価するために、本発明者らは、ＴＵＮＥＬアッセイを実施し、３倍多いアポトーシス細胞を、ｓｈＢｂｓ１２処置した網膜外植片において見出した（図２ａ及び図８）。カスパーゼが、プログラム細胞死の実行において中心的な役割を有するため、それらの発現を評価した（図２ｂ）。エフェクターカスパーゼ３、６、及び７のＲＮＡが、全て、上方調節された。カスパーゼ９のｍＲＮＡレベル（ミトコンドリア欠損に連結される）は、未変化のままであったのに対し、カスパーゼ１２のｍＲＮＡレベル（ＥＲストレスに関連付けられる）は、Ｂｂｓ１２枯渇外植片において２倍増加した。特定のＥＲストレス遺伝子（Ｂｉｐ及びＣｈｏｐ１０など）のその後の分析では、ＢＢＳ１２の非存在において同時上方調節が示された（図２ｂ）。本発明者らは、Ｘｂｐ１の長い及び短いアイソフォームの両方のＲＴ−ＰＣＲを実施し、短いアイソフォームが、ｓｈＢｂｓ１２処置された外植片においてより豊富であった（図２ｃ）。タンパク質レベルで、ＢｉＰ及びＣＨＯＰ１０は、両方とも、５０%増加した。ｅＩＦ２αのリン酸化状態が、Ｂｂｓ１２枯渇後に増加した（図２ｄ及び図８）。ＥＲストレスに含まれるｅＩＦ２αキナーゼをテストするために、本発明者らは、Ｐｅｒｋノックダウンを実施した。ＰｅｒｋｍＲＮＡ枯渇単独では（４０%のｍＲＮＡ減少、図８ｃ）、カスパーゼ１２、Ｃｈｏｐ１０、及びＢｉｐ発現レベルに影響を及ぼさなかった（図２ｆ）。他方で、Ｐｅｒｋ及びＢｂｓ１２の相乗的な枯渇は、光受容体におけるアポトーシス核の明らかな低下に翻訳された、ｓｈＢｂｓ１２単独と比較して、カスパーゼ１２、Ｃｈｏｐ１０、及びＢｉｐｍＲＮＡレベル発現を低下した（図２ｅ、定量化については図９ｂを参照のこと）。

光受容体のＥＲストレス誘導性アポトーシスは、標的化した薬理学的処置により軽減される。

本発明者らは、ＥＲストレスを低下するための薬理学的処置をテストした。本発明者らの知見に基づき、ｅＩＦ２α及びカスパーゼ１２のＢｉＰ、ＰＥＲＫ媒介性リン酸化は、Ｂｂｓ１２欠乏光受容体の表現型における重要なＵＰＲアクターである。最初に、本発明者らは、ＢｉＰ転写及び活性を調節することが公知であるバルプロ酸（ＶＰＡ）をテストした。ｓｈＣｔｌ＋ＶＰＡ処置された網膜は、未変化のアポトーシス率（１３%）を提示したのに対し、ｓｈＢｂｓ１２＋ＶＰＡ処置された外植片は、非ＶＰＡ処置外植片と比較して、有意により低いアポトーシス率（１７%）を有した（図３ａ及び図１０ａ）。本発明者らは、ＥＲストレス関連遺伝子のｍＲＮＡ発現を分析した（図４ｂ）。対照条件において、ＶＰＡ処置は、Ｂｉｐ発現の２倍増加を誘導したのに対し、Ｃｈｏｐ１０及びカスパーゼ１２ｍＲＮＡは両方とも有意に変化しなかった。Ｂｂｓ１２枯渇後、ＶＰＡ処置は、より低いＢｉｐ、Ｃｈｏｐ１０、及びカスパーゼ１２ｍＲＮＡ発現を誘導した。タンパク質レベルでは、ＶＰＡ処置は、ｅＩＦ２αリン酸化及びＣＨＯＰ１０タンパク質含量を減少させ、ＢｉＰを増加させた（図４ｃならびに図１１ａ及び１１ｂ）。

本発明者らは、また、グアナベンズ（ＧＢＺ）、増殖停止及びＤＮＡ損傷誘導性タンパク質（ＧＡＤＤ３４）、ｅＩＦ２αホスファターゼの阻害剤をテストした（Tsaytler et al., 2011）。それは、Ｂｂｓ１２枯渇後でのアポトーシスの光受容体核の割合を、処置を伴わない３３%からＧＢＺを伴う１２%に有意に低下させる（図３ａ）。テストしたストレス遺伝子発現（カスパーゼ１２、Ｃｈｏｐ１０、及びＢｉｐ）が、また、処置を用いて減少された（図３）。さらに、ＧＢＺ処置は、リン酸化状態においてｅＩＦ２αを維持することを許し、ＣＨＯＰ１０（しかし、ＢｉＰではない）の増加を誘導した（図３ならびに図１１ｃ及び１１ｄ）。

本発明者らは、また、カスパーゼ１２活性を特異的に不活化させるように設計された合成ペプチド（ＩＮＨと名付けられた）をテストすることを選んだ。ＩＮＨは、アポトーシス率を、ｓｈＢｂｓ１２＋ＩＮＨ外植片において２３%まで減少させた（図３ａ）。カスパーゼ１２の不活化は、ペプチドとのその不可逆的な連結により達成されるため、本発明者らは、遺伝子又はタンパク質発現分析を、これらの条件において評価しなかった。

ＧＢＺ、ＶＰＡ、及びＩＮＨは、それらの作用において相補的であったため、本発明者らはそれらを組み合わせ（ＧＩＶと呼ばれる単一の薬理学的処置において、それぞれの濃度２，５μＭ、０．２μＭ、及び１μＭを用いる）、外植片を処置した。３つの薬物の組み合わせは、ＴＵＮＥＬアッセイにより評価した通り、対照レベルまでのアポトーシス光受容体率の低下を許すように明らかに見えた（図３）。

ＧＩＶ処置におけるＶＰＡ、ＧＢＺ、及びＩＮＨの組み合わせは、１０倍より高い濃度での、この組み合わせの個々の成分のいずれかよりも効率的にアポトーシスを減少させた。実際に、Ｂｂｓ１２不活化の影響は、全ての３つの標的での同時の薬理学的調節により完全にバランスを取った。アポトーシスに対するＩＮＨの影響は、ｐｅＩＦ２α及びＣＨＯＰ１０における減少と相関した。他方で、ＧＩＶ処置は、成功裏に、ＢｉＰ、ｐｅＩＦ２ α、及びＣＨＯＰ１０濃度を同時に増加させる処置だけであった。

Ｂｂｓ１２-/-マウス網膜表現型
組織学的試験では、Ｂｂｓ１２-/-マウスが光受容体変性を提示することが明らかになった（図４ａ）。１０週齢では、変異マウスにおいて、ＯＮＬはより薄く、重度に破壊されたＯＳが、ＴＥＭを使用して観察された。残存外節片が、正常な９＋０構造を伴うディスク拡張及び稀な残留結合繊毛を有するように見えた。暗順応網膜電図（ＥＲＧ）記録は、ａ及びｂ波の両方の振幅における有意な減少を４週齢という早期に証明した。１０週齢での同じ記録は、フォトニック刺激への応答の全くの非存在をもたらした（図４ｂ）。ロドプシン（図４ｃ）及びアレスチン（図１２）の両方が、ＯＮＬ及びＩＳにおいて誤って局在化され、Ｂｂｓ１２-/-網膜におけるＩＣＴ欠損を描写している。本発明者らは、ヌル網膜においてＥＲストレス遺伝子発現を測定した。カスパーゼ３及びカスパーゼ１２ならびにＣｈｏｐ１０がＢｂｓ１２-/-網膜において上方調節された（図４ｄ）。これは、光受容体細胞におけるＥＲ嚢拡大（図４ｃ）により伴われた。

Ｂｂｓ１２-/-網膜におけるアポトーシスの動態
網膜変性は、出生後４週まで順調に進んでいた。Ｂｂｓ１２^＋／＋及びＢｂｓ１２-/-マウスにおけるアポトーシス核の存在量における発生上の変化を試験することにより、本発明者らは、最初に、生後１２〜１４日目の間での細胞死におけるＢＢＳ１２依存的な増加を観察した。さらに、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ１２、Ｂｉｐ、及びＣｈｏｐ１０ｍＲＮＡの発現は、生後１４日目のＢｂｓ１２-/-網膜において上方調節され、それは、Ｂｂｓ１２-/-網膜におけるＢｉＰ及びＣＨＯＰ１０タンパク質含量の増加と相関した。これらのデータでは、ＥＲストレスが、ＢＢＳ１２枯渇網膜において活性化されるとのエクスビボでの知見を検証する。

ＧＩＶ処置は、光受容体をアポトーシスから保護し、それらのインビボでの機能を回復する。

本発明者らは、ＰＮ１４で開始した３つの異なる種類の処置をテストした：ＶＰＡ又はＧＢＺの全身投与（ＶＰＡ及びＧＢＺと名付けられる）ならびにＶＰＡの全身投与に加えた点眼中のＧＢＺ及びＩＮＨの組み合わせ処置（ＧＩＶと名付けられる）。ＧＩＶ、ＶＰＡ、又はＧＢＺのいずれかの処置を受けたＢｂｓ１２-/-マウスは、暗順応ＥＲＧ記録における明かな寛解を提示した（図５ａ）。ａ及びｂ波の両方の振幅が、有意に増加した（図５ｂ及び５ｃならびに図１７及び１８）。ｂ波振幅が、また、ＶＰＡ及びＧＩＶ処置されたＢｂｓ１２-/-動物においてより高かった（図５ｃ）。アセチル化αチューブリン免疫染色は、繊毛維持における改善を明らかにしなかったが（図５ｄ）、しかし、処置動物について、ＯＮＬ厚における有意な増加を示した（図５ｄ）。ＯＮＬ層の厚さを測定した：Ｂｂｓ１２-/-未処置網膜について３７μm、ＧＩＶについて５２μm、ＶＰＡについて４４μm、及びＧＢＺ処置動物について４５μm（図５ｅ及び図１３）。さらに、ＧＩＶ及びＧＢＺの両方の処置が、ｅＩＦ２αのリン酸化状態を増加させたが、ＧＩＶ及びＶＰＡ処置がＢｉＰタンパク質レベルを増加させた（図５ｆならびに図１３ａ及び１３ｂ）。

考察
網膜外植片を使用して、本発明者らは、Ｂｂｓ１２の非存在において光受容体アポトーシスに導く機構を分析した。このモデルは、ＩＳにおけるＯＳ分子蓄積を提示し、光受容体における大量のＩＣＴ欠損を強調する。ＩＳにおけるタンパク質蓄積は、本発明者らが、ＥＲストレスを検討することに導き、それは、ＥＲの内腔におけるタンパク質の病理学的蓄積により誘発されることが公知である。３つの異なるトランスデューサーが、異なる経路を介してＵＰＲを媒介しうる（Walter et al., 2011）：転写調節によるＡＴＦ６（活性化転写因子６）、タンパク質負荷の減少によるＰＥＲＫ、及びｍＲＮＡ分解によるＩＲＥ１（イノシトール要求酵素１）。本発明者らのモデルにおいて、ＵＰＲ応答がＰＥＲＫにより駆動され、本発明者らが、ＰＥＲＫ媒介性ＵＰＲ応答からの特異的な、ｅＩＦ２αリン酸化を強調した通りである。しかし、他の細胞ストレスが、ｅＩＦ２αリン酸化を誘導することができる：４つのキナーゼが公知である（ＥＩＦ２ＡＫ１−４と名付けられ、また、ＰＥＲＫ、ＨＲＩ、ＰＫＲ、及びＧＣＮ２として公知である）。ＰＥＲＫはＵＰＲに関連し（Harding et al., 2000）、ＧＣＮ２はアミノ酸飢餓及びＵＶ損傷条件において活性化され（Harding et al., 2000）、酸化ストレス及びヘム欠乏中のＨＲＩ（Berlanga et al., 1998）及びＰＫＲ活性化がウイルス感染により誘導された（Lu et al., 1999）。ｓｈＣｔｌ及びｓｈＢｂｓ１２外植片は、両方とも、同じウイルス力価を用いて処置したため、本発明者らは、ＰＫＲが含まれるキナーゼではないと仮定した。培養条件はＧＣＮ２の活性化を除外した。なぜなら、培地は、アミノ酸飢餓を回避するために十分に富んでいたからである。本発明者らは、光受容体細胞死の由来である酸化的ストレスを除外することができなかった。本発明者らは、Ｂｂｓ１２及びＨｒｉのダブルノックダウンを実施したが、評価した遺伝子又はアポトーシス率における有意な変化は観察されなかった（図９）。反対では、本発明者らは、ＰＥＲＫ不活化が、ＥＲストレス媒介を抑止することを実証したが、ＵＰＲ誘導性ｅＩＦ２αリン酸化を描写している。

本発明者らは、また、インビボモデルを使用した：網膜ジストロフィーを示すＢｂｓ１２-/-マウス。それは、エクスビボモデルと同じ欠損（ＩＳにおけるタンパク質蓄積、ディスク拡張、及びＯＳ分解を含む）を、４週齢という早期に提示する。それは、また、ＵＰＲ活性化を提示する。他の遺伝性ＲＰ動物モデルが、ＥＲストレスと連鎖すると報告されている。実際に、ＥＲストレス活性化が、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子における変異を保有するｒｄ１マウスについて（Yang et al., 2007）及びそのミスフォールディングを起こすＰ２３Ｈロドプシントランスジェニックラットモデルにおいて（Lin et al., 2007）記載された。さらに、ＲＰモデルが、治療的な目的のために使用されており、治療的標的としてのＥＲストレスの機会を強調する。最初に提案された戦略は、細胞モデルにおいてロドプシンフォールディングを成功裏に回復させる９−シス−レチナール及び１１−シス−レチナールとしての分子シャペロニンの使用によりＥＲストレスを調節することであった（Mendes et al., 2008）。次に、直接的にＵＰＲアクターを調節することが提案された。このように、Ｐ２３ＨロドプシンラットモデルにおけるＢｉＰの過剰発現は、視覚機能を回復させ（Gorbatyuk et al., 2010）、ＲＰ処置のためのＥＲストレス調節の効力を実証している。最近、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）が、Ｂｂｓ１Ｍ３９０Ｒ／Ｍ３９０Ｒマウスを処置するために使用された（Drack et al., 2012）。ＴＵＤＣＡが、本試験において、抗アポトーシス化合物として記載され、処置動物において網膜肥厚を誘導した。実際に、文献において、ＴＵＤＣＡは、ＵＰＲ条件においてＥＲの適応能力を増強することができる化学的シャペロンとして公知である（De Almeida et al., 2007; Ozcan et al., 2006）。

本発明者らは、治療的戦略として、ＥＲを調節することが公知である３つの化合物の組み合わせを使用することを選ぶ。最初はＶＰＡであり、抗痙攣薬及び気分安定剤として使用する。それは、恐らくは、そのＨＤＡＣ阻害剤活性を介して、ＢｉＰ転写を調節すると記載されており（Wang et al., 1999）、それは、また、ＥＲシャペロンとコアクチベーターとの相互作用を調節することが提案されている（Kakuichi et al., 2009; Penas et al., 2011）。ＶＰＡ処置は、網膜疾患のいくつかの試験において、神経保護薬剤として既に使用された：それは、細胞死を遅延させ、カスパーゼ３活性化を減少させることにより、視神経挫傷後の網膜神経節細胞保護のために効率的である（Biermann et al., 2010）。それは、ラットにおける虚血−再灌流傷害により誘導されるアポトーシスに対して網膜細胞を保護することが示されている（Zhang et al., 2011）。実際に、このストレスは、網膜ニューロンのＥＲストレス媒介性アポトーシスを誘導し、全身ＶＰＡ投与は、ＢｉＰ発現を増加させ、ラット網膜においてカスパーゼ１２活性化を低下させた。ＶＰＡを、また、ロドプシンミスフォールディングに関連したＲＰ患者についての臨床治験において使用した。この議論の余地がある試験では、２又は４ヶ月間にわたりＶＰＡを用いて処置された５〜７人の患者における視野の増加が示された（Clemson et al., 2011）。他方で、ＧＢＺ（αアドレナリン受容体アゴニスト）は、高血圧の処置のために使用される（Holmes et al., 1983）。それは、また、抗プリオン活性を有すると報告され（Tribouillard-Tanvier et al., 2008）、最近、ＧＡＤＤ３４の阻害剤、ｅＩＦ２αホスファターゼとして同定された（Tsaytler et al., 2011）。ＧＢＺ処置は、ｅＩＦ２αを、その不活性形態において維持することにより、全体的なタンパク質負荷を低下することができる。ＥＲストレスのこの抑止においてより効率的であるために、本発明者らは、抗アポトーシス分子を加えた：カスパーゼ１２活性を特異的に阻害するように設計されたペプチド。組み合わせ処置は、本発明者らが、細胞応答の異なるレベルでＥＲストレスを誘発することを許し、Ｂｂｓ１２枯渇外植片における光受容体アポトーシスを成功裏に低下させた。

Ｂｂｓ１２-/-マウスの網膜表現型の特徴付けから、変性が４週齢でほとんど達成されることが明らかになった。アポトーシス動態の決定が、インビボでの処置のために必須であったため、細胞死が、結合繊毛が成長し、ＯＳが形成し始める際、出生後１４日目（ＰＮ１４）に開始することを検証した（図１４）。ＰＮ１４を、網膜処置のための開始点として選んだ。ＶＰＡ及びＧＢＺの全身投与が毒性効果を有しうるか否かを評価するために、本発明者らは、ｗｔマウスを、１０週間にわたりＶＰＡ又はＧＢＺを用いて処置し、肝機能を、血漿アミノ酸濃度及び尿素クリアランス測定値を使用して評価した。ＶＰＡ処置が、肝機能において有意な変化を誘導しないのに対し、ＧＢＺが有害な影響を有するように見えた（図１５）。ＧＢＺは、ラットＡＭＤモデルの処置用の点眼中で既に成功裏に使用されていたため（Shen et al., 2011）、本発明者らは、それを、ＩＮＨと、ＧＩＶ処置用の点眼溶液中で組み合わせることを好んだ。インビボでの処置は有望な結果を示している：処置されたＢｂｓ１２-/-動物は、より多くの残留光受容体細胞を提示し、動物はＥＲＧ記録において明かな寛解を有する。総計では、インビボ試験は、ＧＢＺ及びＶＰＡ処置が光受容体アポトーシスを低下させるために効率的であるが、しかし、３つの薬物の組み合わせは、保護効果を強調することを示唆する。なぜなら、ＧＩＶ処置後の電気生理学的分析及び組織学的分析の両方が、わずかにより良い結果を提示するからである。

本試験において、本発明者らは、ＥＲストレス調節薬物を使用して、ＢＢＳのマウスモデルにおける網膜変性の減速についての原則の証拠を報告する。全体では、網膜繊毛病は、遺伝性ＲＰの重要な部分を表す。機構が、変異した異なる遺伝子について密接に関連しているため、ＧＩＶ処置は有望な機会を生じる。さらに、出現する証拠は、ＲＰの異なる種類における光受容体アポトーシスの発生におけるＥＲストレスの決定的な役割を支持する。これらの結果は、ＲＰの分野において遺伝子治療への代替物のために道を開く。

本明細書において記載する実施例及び実施態様は、例示的な目的だけのためであり、それに照らした種々の改変又は変化が、当業者に示唆され、本願の精神及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることを理解すべきである。また、本明細書において開示するその任意の発明又は実施態様の任意の要素又は限定を、本明細書において開示するその任意の及び／又は全ての他の要素あるいは限定（個々に又は任意の組み合わせにおいて）あるいは任意の他の発明又は実施態様と組み合わせることができ、全てのそのような組み合わせが、それへの限定を伴わず、本発明の範囲を伴い、熟慮される。

Claims

ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。
ｅＩＦ２αの阻害剤が、グアナベンズ、トートマイシン、トートマイセチン、カリクリンＡ、サルブリナル、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成を阻害する化合物、及びＰＰ１又はＧＡＤＤ３４発現に特異的に干渉する核酸分子からなる群より選択される、請求項１記載の医薬組成物。
ｅＩＦ２−αの阻害剤がＧＡＤＤ３４の阻害剤である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
ｅＩＦ２−αの阻害剤がグアナベンズである、請求項３記載の医薬組成物。
タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物が、バルプロ酸又はその誘導体、トリコスタチンＡ、リチウム、１−（３，４ジヒドロキシ−フェニル）−２−チオシアネート−エタノン、及びエキセンディン４からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の医薬組成物。
タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物が、バルプロ酸又はその誘導体、例えば２−エン−バルプロ酸である、請求項１〜５のいずれか一項記載の医薬組成物。
タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物が、バルプロ酸である、請求項６記載の医薬組成物。
カスパーゼ１２の阻害剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の医薬組成物。
カスパーゼ１２の阻害剤が、カスパーゼ１２の触媒部位を標的とするペプチド、プロカスパーゼ１２の切断を防止するペプチド、及びカスパーゼ１２発現に特異的に干渉する核酸分子からなる群より選択される、請求項８記載の医薬組成物。
カスパーゼ１２の阻害剤が、カスパーゼ１２の触媒部位を標的とするペプチドである、請求項８又は９記載の医薬組成物。
カスパーゼ１２の阻害剤が、式Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンのペプチドである、請求項１０記載の医薬組成物。
好ましくは、化学療法薬剤、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、アルファ−アドレナリン遮断薬、アルファ−アドレナリン作動薬、ベータ−アドレナリン作動薬、抗コリン作用薬、５アルファ還元酵素の阻害剤、アンドロゲン、免疫調節剤、免疫抑制剤、抗血管新生剤（例えば抗ＶＥＧＦ、抗ＦＧＦ、抗ＨＧＦ、及び抗ＥＦＧなど）、ロイコトリエン修飾剤、アミノサリチル酸、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症剤、抗寄生虫、可溶化インターロイキン受容体の治療、細胞傷害剤、酸化防止剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの追加の治療的薬剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の医薬組成物。
薬物としての使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の医薬組成物。
繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の医薬組成物。
網膜変性が、バルデ・ビードル症候群、シニア−ローケン症候群、ジュベール症候群、サルディーノマインツァー症候群、センセンブレナー症候群、ジュンヌ症候群、メッケル−グルーバー症候群、アルストレーム症候群、ＭＯＲＭ症候群、繊毛遺伝子中の変異により起こされるレーバー先天性黒内障、及びＲＰＧＲ遺伝子中の変異により起こされるＸ連鎖網膜色素変性症からなる群より選択される繊毛病により誘導される、請求項１４記載の医薬組成物。
カスパーゼ１２の阻害剤との組み合わせにおいて使用される、請求項１〜７のいずれか一項記載の医薬組成物。
繊毛機能障害に関連する網膜変性の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせた製剤として、ｅＩＦ２αの阻害剤ならびにタンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、ならびに、場合により、カスパーゼ１２の阻害剤を含む生成物。
ｅＩＦ２αの阻害剤、タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物、及びカスパーゼ１２の阻害剤を含む、請求項１７記載の生成物。
ｅＩＦ２αの阻害剤がグアナベンズである、請求項１７又は１８記載の生成物。
タンパク質ＢｉＰの発現及び／又は活性を増加させる化合物が、バルプロ酸である、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の生成物。
カスパーゼ１２の阻害剤がペプチドＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の生成物。
局所、経口、皮内、非経口、及び／又は眼内投与のために適した、請求項１〜１６のいずれか一項記載の医薬組成物又は請求項１７〜２１のいずれか一項記載の生成物。
眼投与に、好ましくは局所眼又は眼周囲投与に適した、請求項１〜１６のいずれか一項記載の医薬組成物又は請求項１７〜２１のいずれか一項記載の生成物。