JP2018189449A - 分離方法および分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】分離性に優れる超臨界流体クロマトグラフィーによる分離方法および分析方法を提供する。【解決手段】背圧制御弁（１４０）よりも上流側に配置された分離カラム（１２０）に、試料、超臨界状態の二酸化炭素およびモディファイアを導入して、試料に含まれる成分を分離する。分離カラム内には、充填剤としてポリマービーズが装填されている。分離された試料は、さらにクロマトグラフィーおよび／または質量分析による分析に供してもよい。【選択図】図１

Description

本発明は、超臨界流体クロマトグラフィーによる試料の分離方法および分析方法に関する。

臨界点を超える温度および圧力を有する流体（超臨界流体）は、気体と比較して物質を溶解する能力が高く、液体と比較して粘性が低く拡散性が高いとの特徴を有している。超臨界流体を主な移動相とする超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）は、液体クロマトグラフィーに比べて高流量での送液による高速分析やカラム延長による高分離分析を実現可能である。超臨界流体としては、一般に二酸化炭素（臨界温度：３１℃、臨界圧力：７．４ＭＰａ）が用いられる。

超臨界流体二酸化炭素は非極性であり、ｎ−ヘキサンに類似した溶解性を示す。そのため、超臨界流体二酸化炭素のみを移動相とするＳＦＣは、非極性化合物の分離・分析に適している。一方、超臨界流体二酸化炭素は、メタノール、エタノール、アセトニトリル等の極性有機溶媒に対して相溶性を有するため、これらの極性有機溶媒をモディファイアとして添加して移動相に極性をもたせることにより、非極性物質から極性物質まで幅広い極性を有する多数の物質のＳＦＣによる分離・分析が可能となる（例えば特許文献１参照）。

ＳＦＣの分離カラムの充填剤には、耐圧性が高く、二酸化炭素とモディファイアとの混合比を変化させた場合でも膨潤や収縮が生じ難いことから、シリカゲルや、シリカ担体の表面を化学修飾したものが用いられている。

特開２０１５−２１５３２０号公報

本発明者らは、ＳＦＣにおいて、分離カラムに試料を導入した後、モディファイア濃度を変化させながら溶出を行った場合に、保持時間の長い成分（主に極性物質）のピークがテーリングして、分離性能が低下する場合があることを見出した。かかる課題に鑑み、本発明は、幅広い物質に対して高い分離性を実現可能な分離方法および分析方法の提供を目的とする。

本発明者らが検討の結果、ＳＦＣの分離カラムの充填剤としてポリマービーズを用いることにより、シリカゲルを用いた場合に比べてシャープなピークが得られ分離性能を向上できることを見出し、本発明に至った。

本発明は、クロマトグラフの背圧制御弁よりも上流側に配置された分離カラムに、試料、超臨界状態の二酸化炭素およびモディファイアを導入して、試料に含まれる成分を分離する方法（超臨界クロマトグラフィー：ＳＦＣ）に関する。分離カラム内には、充填剤としてポリマービーズが装填されている。

ポリマービーズの平均粒子径は、例えば１〜１０μｍである。ポリマービーズとしては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を吸収したときの膨潤度、およびメタノールを吸収したときの膨潤度が、いずれも１．４以下であるものが好ましく用いられる。ポリマービーズは、架橋ポリマーを含むことが好ましい。架橋ポリマーとしては、ジビニルベンゼンやジ（メタ）アクリル酸エステル等の多官能モノマー由来の構造単位を有するものが挙げられる。架橋ポリマーの架橋度は５０％以上が好ましい。

ＳＦＣにより分離された試料は、さらにクロマトグラフィーや質量分析による分析に供してもよい。

ＳＦＣの分離カラムの充填剤として、ポリマービーズを用いることにより、分離成分のピークのテーリングが抑制され、分離性能を向上できる。

超臨界流体クロマトグラフの概略構成図である。 実験例および比較例のナプタラムおよびピメトロジンのクロマトグラムである。

本発明においては、超臨界流体を移動相とする超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により、試料の分離および分析が行われる。図１は、超臨界流体クロマトグラフの構成例を示す概略構成図である。図１に示すクロマトグラフ１０では、ボンベ１０１に収容された二酸化炭素を加圧ポンプ１１１により送液する超臨界流体流路１１と、溶媒容器１０２に収容されたモディファイアを溶媒ポンプ１１２により送液するモディファイア流路１２とが、ミキサ１４に接続されている。モディファイアとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル等の極性有機溶媒が用いられる。

ミキサ１４から移動相を送液する分析流路１６には、上流側から、試料注入部１８、分離カラム１２０、検出器１３０、背圧制御弁１４０が設けられており、背圧制御弁１４０の下流側に、複数の回収容器１５５を収容する回収ユニット１５０が配置されている。分離カラム１２０はカラムオーブン２０内に収容されており、一定温度に保たれる。背圧制御弁１４０は分析流路１６内を所定の圧力に保つ作用を有する。

分離カラム１２０の温度が設定値に達すると、ボンベ１０１から、流路１１に設けられた加圧ポンプ１１１を介して二酸化炭素を分析流路１６内に導入する。加圧ポンプ１１１および背圧制御弁１４０により、分析流路１６の圧力を、二酸化炭素の臨界圧力（７．４ＭＰａ）を超える圧力とし、かつ分離カラム１２０の温度を二酸化炭素の臨界温度（３１℃）を超える温度に設定することにより、分離カラム１２０内では、二酸化炭素が超臨界状態となる。

試料注入部１８から、分析流路１６内に導入された試料は、移動相とともに分離カラム１２０内に送られる。分離カラム１２０内には充填剤が装填されている。後に詳述するように、本発明においては分離カラム１２０に装填される充填剤として、ポリマービーズが用いられる。

クロマトグラフ１０では、背圧制御弁１４０の圧力、移動相における超臨界二酸化炭素とモディファイアの割合（グラジエントプログラム）、分離カラム１２０の温度、試料注入部１８からの試料注入、および回収ユニット１５０による分離試料の回収（分取）は、不図示の制御部により管理されている。試料注入後の分析動作では、二酸化炭素およびモディファイアが、それぞれ加圧ポンプ１１１および溶媒ポンプ１１２により流路１１，１２に送られ、ミキサ１４で混合され、移動相として分析流路１６に導入される。その後、二酸化炭素とモディファイアの割合が経時的に変化するように、ポンプ１１１，１１２の流量が調節される。分離カラム１２０内に導入された試料は、成分ごとに分離されて分離カラム１２０から溶出し、検出器１３０で検出される。検出器１３０としては、例えば可視‐紫外分光計が用いられる。成分ごとに分離された試料は、排圧制御弁１４０を経て、移動相と共に、回収ユニット１５０内の回収容器１５５に分取される。

本発明においては、分離カラム１２０の充填剤としてポリマービーズが用いられる。分離カラムの充填剤としてシリカゲルや化学修飾シリカを用いた場合は、特に溶出時間の長い成分のピークがテーリングして分離性能が低下する傾向がある。これに対して所定のポリマービーズを用いることにより、シャープなピークが得られ、分離性能を向上できる。

本発明者らの検討によると、分離カラムの充填剤としてシリカゲルを用いた場合、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）では正常に分離されシャープなピークを与える成分でも、ＳＦＣではピークのテーリングが生じる場合があり、特に、アンモニウムイオン、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミド、カルボニル、ピリジル基、チオシアナト基等の官能基を有する化合物のピークがテーリングする傾向がみられた。

シリカ充填剤を用いた場合のテーリングは、シリカゲルに残存する金属や、シリカ表面への分離対象成分の配位およびイオン性吸着等の相互作用に起因すると推定される。ＳＦＣでは、超臨界流体二酸化炭素との相溶性等の観点から、モディファイアに添加可能な塩（例えばアンモニウム塩）の種類や濃度が限定されているため、カラム充填剤と分離対象成分との相互作用が溶出に影響を与えやすいと考えられる。

分離カラムの充填剤として表面が化学修飾されたシリカを用いた場合も、被修飾シリカの場合同様に、ＳＦＣクロマトグラムにおけるピークのテーリングが生じる。これは、シリカゲルに残存する金属やシリカの化学修飾後に残存したシラノール基等と分離対象成分との相互作用等に起因すると推定される。

充填剤としてポリマービーズを用いた場合は、分離対象成分と充填剤との間に、金属との配位等の強い相互作用を生じ難いため、シリカゲルや化学修飾シリカを用いた場合に比べて、シャープなピークが得られると考えられる。

カラム充填剤に用いられるポリマービーズの材料としては、アクリル系ポリマー、スチレン系ポリマー、ポリアクリルアミド系ポリマー、セルロース系ポリマー等が挙げられる。超臨界流体二酸化炭素を移動相とするＳＦＣでは、分析流路１６に配置される分離カラム１２０に、二酸化炭素の臨界圧力（７．４ＭＰａ）を超える圧力がかかるため、充填剤としてのポリマービーズには耐圧性が要求される。また、二酸化炭素とモディファイアとの混合比を変化させた場合でも膨潤や収縮を生じないように、ポリマービーズには高い耐溶剤性が要求される。そのため、ポリマービーズとしては、溶媒に対する膨潤度の小さいものが好ましく用いられる。

カラム充填剤として用いられるポリマービーズは、架橋ポリマーを含有することが好ましい。ポリマービーズは、テトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度およびメタノールを吸収したときの膨潤度が、いずれも１．４以下であるものが好ましい。このような低膨潤度のポリマービーズを用いることにより、良好なピーク形状が得られるとともに、ポリマービーズの耐久性が高いため、繰り返し分析を行った場合でも良好な分析結果が得られる傾向がある。また、低膨潤度のポリマービーズは、カラムへの充填時の充填圧を充分に高めることができるため、ＳＦＣによる分析性能の低下を抑制できる。

ポリマービーズの膨潤度は、ポリマービーズを溶媒に分散させる前後の体積変化に基づいて決定される。ポリマービーズのテトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度およびメタノールを吸収したときの膨潤度は、１．３以下がより好ましく、１．２以下がさらに好ましい。膨潤度は一般には１．０以上である。

ポリマービーズの平均粒子径は、高い理論段数のカラムを得られ易いという観点から、１０μｍ以下、５μｍ以下または４μｍ以下であってよい。分析時のカラム圧の過度な上昇を抑制する観点から、ポリマービーズの平均粒子径は、例えば、１μｍ以上または２μｍ以上であってよい。

カラムの理論段数を高める観点からは、ポリマービーズの粒子径（直径）の分散性を示す指標であるＣＶ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）値は、小さいことが好ましく、例えば、２５％以下、２０％以下、１５％以下または１０％以下であってよい。ＣＶ値の下限は特に制限されないが、一般には１％以上である。平均粒子径およびＣＶ値の調整等を目的として、任意の篩等を用いてポリマービーズを分級してもよい。

ポリマーの架橋度が高いほど、ポリマービーズの膨潤度が小さくなる傾向がある。ポリマービーズに含まれる架橋ポリマーの架橋度は、例えば、５０％以上、８０％以上または９０％以上である。架橋度が上記範囲内であれば、超臨界流体の影響を受け難く、分析性能を向上できる。架橋ポリマーの架橋度は、重合に用いられるモノマー中の架橋性モノマーの配合割合であり、重合性モノマー全質量を基準とした架橋性モノマーの質量割合として定義される。

架橋性モノマーは、２以上の重合性官能基を有する化合物であり、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン等のジビニル化合物；ジアリルフタレートおよびその異性体；トリアリルイソシアヌレートおよびその誘導体；多官能性（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。架橋性モノマーは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。多官能性（メタ）アクリル酸エステルとしては、ジ（メタ）アクリル酸エステル、３官能以上の（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。

ジ（メタ）アクリル酸エステルとしては、アルキレン基に２つの（メタ）アクリレートが結合したアルカンジオールジ（メタ）アクリレートが挙げられる。アルキレン基の炭素数は、例えば、１〜２０または１〜５であってもよくい。アルキレン基は、直鎖状、分枝状および環状のいずれでもよい。アルキレン基は、水酸基等の置換基を有していてもよい。

アルカンジオールジ（メタ）アクリレートとしては、例えば、１，３−ブタンジオールジアクリラート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，７−ヘプタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，８−オクタンジオールジ（メタ）アクリレート、３−メチル−１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０−デカンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレートおよびグリセロールジメタクリレートが挙げられる。

ジ（メタ）アクリル酸エステルのその他の例は、エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；および（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレートを含む。

３官能以上の（メタ）アクリレートとしては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等が挙げられる。

これらの架橋性モノマーのうち、架橋密度の高いポリマー（多官能モノマー由来構造の比率の高いポリマー）が得られやすく、ポリマービーズの膨潤度を小さくできることから、例えば、ジビニルベンゼンおよびジ（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選択される１種以上を用いてもよい。すなわち、架橋ポリマーは、ジビニルベンゼン由来の構造単位および／またはジ（メタ）アクリル酸エステル由来の構造単位を含んでいてもよい。

架橋性モノマーとともに単官能性モノマーを用いてもよい。単官能性モノマーとしては、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の単官能の（メタ）アクリル酸エステル；スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレンおよびその誘導体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。

ポリマービーズは、全体が架橋ポリマーからなるものでもよく、一部に架橋ポリマーを有していてもよい。膨潤度を低くする観点から、ポリマービーズの少なくとも外層に架橋ポリマーが含まれていることが好ましい。外層に架橋ポリマーを有するポリマービーズは、例えばシード重合法により得られる。

一般に、ビーズの粒径が小さいほどカラムの理論段数は大きくなる傾向がある。一般に、ポリマービーズはシリカゲル等と比較して粒径の小さい粒子の形成が困難な場合があるが、シード重合法は粒径の小さい粒子を形成し易い。

シード重合法は、重合性モノマーを含む乳化液中でシード粒子を膨潤させ、シード粒子に重合性モノマーを吸収させた後、重合性モノマーを重合する方法である。シード粒子としては、例えば、（メタ）アクリレート系粒子、スチレン系粒子等が挙げられる。

（メタ）アクリレート系粒子は、（メタ）アクリル酸エステルの重合により得られる。（メタ）アクリル酸エステルとしては、先に例示した直鎖状または分岐状のアルキル基を有する（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。スチレン系粒子は、例えば、スチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン等のスチレン系モノマーの重合により得ることができる。シード粒子を得るためのモノマーとして、上記（メタ）アクリル酸エステルおよびスチレン系モノマーの他に、アリルアルコール、フタル酸アリル、アリルエーテル等を組み合わせてもよい。これらのモノマーは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。

シード粒子は、上記モノマーを用いて、例えば、乳化重合法、ソープフリー乳化重合法、分散重合法等の公知の方法で合成することができる。シード粒子の平均粒子径は、得られるポリマービーズの設計粒子径に応じて調整すればよい。シード粒子の平均粒子径は、重合性モノマーの吸収時間を短縮する観点から、例えば、２．０μｍ以下または１．５μｍ以下であってよい。シード粒子の平均粒子径は、均一且つ真球に近いシード粒子を効率的に得られる観点から、例えば、０．１μｍ以上または０．５μｍ以上であってよい。これらの観点から、シード粒子の平均粒子径は、０．１〜２．０μｍであることが好ましく、０．５〜２．０μｍであることがより好ましく、０．５〜１．５μｍであることがさらに好ましい。

シード粒子のＣＶ値は、例えば、得られるポリマービーズの均一性を充分に確保する観点から、１０％以下または７％以下であってよい。シード粒子のＣＶ値は一般に１％以上である。

ポリマービーズの平均粒子径は、シード粒子の平均粒子径に対して、例えば、２〜１０倍、または２．５〜７倍となるように調整してもよい。ポリマービーズの平均粒子径を上記の範囲で調整することにより、ポリマービーズの粒子径が単分散性となり、粒子径のＣＶ値を小さくできる。

重合性モノマーおよび水性媒体を含む乳化液に、シード粒子を添加してシード粒子に重合性モノマーを吸収させた後、重合性モノマーを重合することによりポリマービーズが得られる。乳化液は、公知の方法により調製できる。例えば、重合性モノマーを水性媒体に添加して、ホモジナイザー、超音波処理機、ナノマイザー等の微細乳化機により水性媒体に分散させることにより、乳化液が得られる。水性媒体としては、水、または水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系および両性イオン系のいずれを用いてもよい。

乳化液は、必要に応じて、有機過酸化物、アゾ系化合物等の重合開始剤を含んでいてもよい。重合開始剤は、例えば、重合性モノマー１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

乳化液は、シード粒子の分散安定性を向上させるために、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の高分子分散安定剤を含んでいてもよい。高分子分散安定剤は、例えば、重合性モノマー１００質量部に対して、１〜１０質量部の範囲で使用することができる。

乳化液は、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を含んでいてもよい。重合禁止剤を含むことにより、乳化液中でのモノマーの乳化重合を抑制できる。

シード粒子は、乳化液に直接添加してもよく、シード粒子を水性分散体に分散させた状態で添加してもよい。例えば、シード粒子を添加した後の乳化液を、室温で１〜２４時間撹拌することにより、シード粒子に重合性モノマーを吸収させることができる。乳化液を３０〜５０℃程度に加温することにより、重合性モノマーの吸収が促進する傾向がある。

シード粒子に対する重合性モノマーの混合割合は、特に制限されないが、例えば、所望の平均粒子径を有するポリマービーズを効率的に作製する観点から、シード粒子１００質量部に対して８００質量部以上または１５００質量部以上であってよい。一方、例えば、水性媒体中で重合性モノマーが独自に懸濁重合することを抑制し、目的とする平均粒子径を有するポリマービーズを効率的に作製する観点から、重合性モノマーの混合割合は、シード粒子１００質量部に対して１０００００質量部以下または３５０００質量部以下であってよい。シード粒子は、重合性モノマーを吸収することにより膨潤するため、光学顕微鏡を用いてシード粒子の粒径の拡大を確認することにより、重合性モノマーのシード粒子への吸収が終了したか否かを判定できる。

シード粒子に吸収させた重合性モノマーを重合させることにより、ポリマービーズが得られる。重合条件は特に限定されず、モノマーの種類等に応じて適宜選択すればよい。重合終了後、必要に応じて重合液から遠心分離またはろ過により、水性媒体を除去し、水および溶剤で洗浄した後、乾燥することにより、ポリマービーズが単離される。

ポリマービーズは、多孔質構造を有していてもよい。例えば、シード重合時に、水性媒体に対して不溶性または難溶性の有機溶媒を用い、相分離を促すことにより、多孔質ビーズが得られる。

本発明では、分離カラムの充填剤として所定のポリマービーズを用いること以外は、従来のＳＦＣと同様に試料の分離・分析を実施可能であり、クロマトグラムの構成は図１に示すものに限定されない。

ポリマービーズをカラムに充填する際に用いる溶媒は、ポリマービーズが分散可能な溶媒であれば特に限定されず、例えば、水、メタノール、ＴＨＦ、アセトニトリル、クロロホルム、エチレングリコールおよび流動パラフィンが挙げられる。ポリマービーズをカラムに充填する際の充填圧は、例えば、１０ＭＰａ以上または１５ＭＰａ以上となるようにしてもよい。充填圧を高めることにより、ＳＦＣクロマトグラムにおけるピークのテーリングが抑制され、良好なピーク形状が得られやすい。ポリマービーズの変改やカラムの破損を抑制する観点から、充填圧は、例えば、６０ＭＰａ以下または５０ＭＰａ以下となるようにしてもよい。

図１では、分離カラム１２０と背圧制御弁１４０との間の分析流路１６に検出器１３０が設けられているが、検出器は必須の構成ではない。背圧制御弁よりも下流側に検出器が設けられていてもよい。

図１では、背圧制御弁１４０の下流側に、ＳＦＣにより分離した試料を回収するための回収ユニット１５０が設けられているが、試料を回収する必要がない場合は、回収ユニットは不要である。例えば、分離カラムの下流側に設けられた検出器により、分離成分の同定や定量等の分析を行う場合は、試料の回収は不要である。

一方、食品中の残留農薬の一斉分析のように、多数の成分の同時分析を行う場合は、ＳＦＣにより分離した試料を、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、質量分析等により分析してもよい。これらの分析は、ＳＦＣとオンラインで実施することもできる。

例えば、背圧制御弁の下流側にタンデム四重極質量分析計を接続することにより、ＳＦＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施できる。ＳＦＣ−ＭＳを実施する場合は、質量分析計での試料成分のイオン化を促進するために、移動相にギ酸やアンモニア等のイオン化促進剤を添加しておいてもよい。また、分離カラム１２０と背圧制御弁１４０の間の分析流路１６に、イオン化補助剤となるメイクアップ溶液をポンプにより供給するようにしてもよい。メイクアップ溶液としては、例えばメタノール等の有機溶媒または水に、ギ酸やアンモニア等のイオン化促進剤を含む溶液を使用することができる。質量分析により検出された成分は、例えば、データベースと照合することにより同定が行われる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

［分析対象試料］
林純薬工業製の農薬混合標準液（PL2005 Pesticide GC/MS Mix I, II, III, IV, V, VI,および7、PL2005 Pesticide LC/MS Mix I, II, III, 4, 5, 6, 7, 8, 9 および10、ならびに53 Polar pesticides Mix (for STQ method)）を混合することにより、約２５０種の農薬をそれぞれ０．５μｇ／ｍＬ含む農薬混合標準溶液を調製した。

［カラム充填剤］
比較例１では、オクタデシル基および極性官能基で化学修飾したシリカ充填剤が装填された市販のＳＦＣ用カラム（Shim-pack UC-RP）を用いた。実施例１および実施例２では、それぞれ、下記の作製例１および作製例２で得られたポリマービーズを充填剤として装填したカラムを用いた。

＜シード粒子の合成例＞
５００ｍＬのセパラブルフラスコに、メタクリル酸メチル７０ｇ、オクタンチオール２．１ｇ、およびイオン交換水３７０ｇを入れ、窒素でバブリングするとともに撹拌羽根で攪拌しながら３０℃で１時間保温した。その後、ペルオキソ二硫酸カリウム０．８７５ｇおよびイオン交換水３０ｇを加え、７０℃で６時間反応させ、シード粒子を形成した。反応液を冷却後、反応液中の塊状物および微粒子を除去して、シード粒子のスラリー（固形分濃度：３．５質量％）を得た。塊状物は、目開き７５μｍの篩を用いて取り除いた。微粒子は、塊状物を取り除いた後の反応液（篩を通過したスラリー）を遠心脱水機で処理し、デカンテーションで上澄み液を廃棄することにより取り除いた。

粒度分布測定機（マイクロトラック・ベル株式会社製、商品名：ＭＴ−３３００ＥＸ ＩＩ）を用いて測定した粒度分布から算出したシード粒子の平均粒子径は７５０ｎｍであり、ＣＶ値は６．４％であった。

＜ポリマービーズ作製例１＞
２Ｌのセパラブルフラスコに、架橋性モノマーとしてジビニルベンゼン（純度９４％）１００ｇ、ならびに有機溶媒としてトルエン３６ｇおよびジエチルベンゼン３６ｇを仕込んで得られた混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル７．０ｇを溶解させた。次いで、イオン交換水１２４０ｇ、エタノール９６ｇおよび界面活性剤としてラウリル硫酸トリエタノールアミンを４０質量％含む水溶液３２ｇ、ならびに重合禁止剤としてアスコルビン酸０．１２ｇをさらに加えた後、超音波ホーンで１０分間超音波分散させて乳化液を得た。得られた乳化液を撹拌羽根で攪拌しながら、上記の合成例で得られたシード粒子スラリー７７ｇ、およびイオン交換水２７ｇを加え、３０℃で２４時間保温した。次いで、分散安定剤としてポリビニルアルコールを６質量％含む水溶液１２０ｇを加え、窒素でバブリングしながら８０℃で８時間重合させた後、冷却した。得られた粒子を、イオン交換水／メタノール混合液、およびアセトンで順次洗浄した後、目開き５μｍの篩で湿式分級して凝集物を除去した。凝集物を除去後のスラリーから粒子をろ別し乾燥することにより、ポリマービーズを得た。

＜ポリマービーズ作製例２＞
３Ｌのセパラブルフラスコに、架橋性モノマーとしてグリセロールジメタクリレート（純度９３％）８１ｇ、ならびに有機溶媒として酢酸ブチル７３ｇおよびイソアミルアルコール４８ｇを仕込んで得られた混合物に、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．４ｇを溶解させた。次いで、イオン交換水１５３０ｇ、および界面活性剤としてラウリル硫酸トリエタノールアミンを４０質量％含む水溶液１２ｇをさらに加えた後、超音波ホーンで１０分間超音波分散させて乳化液を得た。得られた乳化液を撹拌羽根で攪拌しながら、上記の合成例で得られたシード粒子のスラリー１４ｇ、およびイオン交換水１２２ｇを加え、３０℃で１時間保温した。次いで、分散安定剤としてポリビニルアルコールを６質量％含む水溶液１２１ｇを加え、窒素でバブリングしながら７８℃で５時間重合させた後、冷却した。上記作製例１と同様にして、得られた粒子の洗浄、分級、ろ別および乾燥を行い、ポリマービーズを得た。

＜ポリマービーズの特性＞
（ポリマーの架橋度）
重合性モノマー全質量を基準とした多官能モノマー（作製例１：ジビニルベンゼン、作製例２：グリセロールジメタクリレート）の質量割合から算出した。

（粒子径）
粒度分布測定機（ベックマンコールター社製、商品名：マルチサイザー４e）を用いて、ポリマービーズの粒度分布を測定し、平均粒子径および粒子径のＣＶ値を算出した。

（膨潤度）
真空乾燥機で６０℃、３時間以上乾燥させたポリマービーズ１ｇを、１０ｍｌメスシリンダに投入し、２０回以上タッピングして静置した後、メスシリンダの目盛を読み取り、ポリマービーズの見かけ上の体積Ｖｄ（ｍｌ）とした。ポリマービーズと溶媒とを合わせた総量が１０ｍｌとなるように、溶媒（ＴＨＦまたはメタノール）を添加し、室温（２０℃）で２４時間以上静置した後、メスシリンダの底部に堆積したポリマービーズの見かけ上の体積Ｖｗ（ｍｌ）を、メスシリンダの目盛から読み取り、次式により膨潤度Ｓを算出した。
Ｓ＝Ｖｗ／Ｖｄ

作製例１および作製例２のポリマービーズの特性を表１に示す。

＜ＳＦＣ用カラムの作製＞
１００ｍＬビーカに、上記作製例１で得られたポリマービーズ２．４ｇ、および超純水１３．６ｇを仕込み、超音波処理をしながら粒子を分散混合し、充填用スラリーを調製した。次いで、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍのステンレスカラムを取り付けたステンレスパッカーに充填用スラリーを流し込み、密閉した後、プランジャー式充填ポンプ（ジーエルサイエンス ＰＵ７１３ポンプ）で１８ＭＰａに加圧することにより、カラム内にポリマービーズを充填し、実施例１のＳＦＣ用カラムを作製した。１００ｍＬビーカに作製例２で得られたポリマービーズ１．３ｇおよびＴＨＦ１２．７ｇを仕込み、上記と同様にして、カラム内にポリマービーズを充填し、実施例２のＳＦＣ用カラムを作製した。

［比較例１］
超臨界流体クロマトグラフシステム（島津製作所 Nexera UC）に、ＳＦＣの分離カラムとして、シリカ充填剤を装填したカラム（Shim-pack UC-RP）を装着し、ＳＦＣ−ＭＳ／ＭＳにより、上記の分析対象試料の分析を実施した。分析条件は下記の通りとした。

移動相 Ａ：二酸化炭素（超臨界流体）， Ｂ：１ｍＭギ酸アンモニウム‐メタノール溶液（モディファイア）
流速： ３ ｍＬ／分
グラジエントプログラム
０−１２分 ： ％Ｂ＝ ２−１０ グラジェント
１２−２０分 ： ％Ｂ＝１０−８０ グラジェント
２０−２５分 ： ％Ｂ＝８０
２５−３０分 ： ％Ｂ＝ ２
メイクアップ溶液： メタノール
メイクアップ流速： ０．１ ｍＬ／分

［実施例１］
分離カラムを、上記作製例１のポリマービーズを充填したカラムに変更し、ＳＦＣの移動相の流速およびグラジエントプログラムを下記の通り変更した。それ以外は比較例１と同様にして、上記の分析対象試料の分析を実施した。
流速：１.０ｍＬ／分
グラジエントプログラム
０−２０分 ： ％Ｂ＝ ２−８０ グラジェント
２０−２５分 ： ％Ｂ＝８０
２５−３０分 ： ％Ｂ＝ ２

［実施例２］
分離カラムを、上記作製例のポリマービーズを充填したカラムに変更し、ＳＦＣの移動相の流速を０．３５ｍＬ／分に変更した。それ以外は実施例１と同様にして、上記の分析対象試料の分析を実施した。

［分析結果］
比較例１，実施例１および実施例２のＳＦＣ−ＭＳ分析により得られたナプタラムおよびピメトロジンのＭＲＭクロマトグラムを図２に示す。

図２に示すように、充填剤として化学修飾シリカを用いた比較例１では、ナプタラムおよびピメトロジンのピークのテーリングがみられた。これに対して、ポリマービーズを用いた実施例１および実施例２では、ナプタラムおよびピメトロジンのいずれについても、ピークの対称性が高くテーリングが抑制されており、ＳＦＣによる分離性能が向上していることが分かる。

１０ クロマトグラフ
１１，１２，１６ 流路
１０１ ボンベ
１１１ 加圧ポンプ
１０２ 溶媒容器
１１２ 溶媒ポンプ
１４ ミキサ
１８ 試料注入部
１２０ 分離カラム
２０ カラムオーブン
１３０ 検出器
１４０ 背圧制御弁
１５０ 回収ユニット

Claims (6)

1. クロマトグラフの背圧制御弁よりも上流側に配置された分離カラムに、試料、超臨界状態の二酸化炭素およびモディファイアを導入して、前記試料に含まれる成分を分離する方法であって、
   前記分離カラム内に、充填剤としてポリマービーズが装填されている、分離方法。
2. 前記ポリマービーズは、テトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度、およびメタノールを吸収したときの膨潤度が、いずれも１．４以下であり、
   前記ポリマービーズが架橋ポリマーを含む、請求項１に記載の分離方法。
3. 前記架橋ポリマーが、ジビニルベンゼン由来の構造単位、およびジ（メタ）アクリル酸エステル由来の構造単位からなる群から選択される１種以上を有する、請求項２に記載の分離方法。
4. 前記架橋ポリマーの架橋度が、５０％以上である、請求項２または３に記載の分離方法。
5. 前記ポリマービーズの平均粒子径が、１〜１０μｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分離方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により成分ごとに分離された試料を、クロマトグラフィーおよび／または質量分析により分析する、分析方法。