JP2018173334A - 免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キット - Google Patents

Abstract

【課題】免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キットを提供する。【解決手段】検体を第１試薬と混合する第１工程と、該第１工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第２工程とを含む、前記検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法であって、前記第１試薬は、前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する第１粒子を含み、前記第２試薬は、第２粒子を含み、該第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉する粒子であるか又は前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子は、前記抗原の異なるエピトープを捕捉する粒子であることを特徴とする測定方法。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キットに関するものであり、詳細には、担体凝集免疫測定法において、抗原に対する高い反応性を有し、それにより、高感度の測定を可能とする免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キットに関する。

担体凝集免疫測定法の中でも、ラテックス凝集免疫測定法は生化学自動分析装置を適用することで汎用化され、広く多くの臨床検査項目の測定に利用されている。
ここで、標準的なラテックス凝集免疫測定法は、緩衝液を主成分とする第１試薬（Ｒ１）を反応用セルに加え、これに被験検体（Ｓ）を加えて混合し一定時間静置し、次いでこの混液に、標的とする抗原分子を認識する抗体を担持したラテックス粒子を主成分とする、第２試薬（Ｒ２）を加えて混合し、一定時間静置する過程での吸光度（濁度）変化量を光学的に測定するものである。

上記のような生化学自動分析装置を適用するラテックス凝集免疫測定法は、短時間に多量の検体を測定できることから、大学病院などの大規模病院の中央検査室や受託臨床検査機関における利用頻度が高い。
しかしながら、ラテックス凝集免疫測定法の検出感度は、一般的な蛋白質抗原にあっては、１．０ｎｇ／ｍＬ程度であるため、より希薄な抗原の濃度の検体の測定には限界があり、該測定法によりカバーしきれない項目の測定には化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＩＡ）などの専用の機器・試薬を利用する必要がある。

ここで、生化学自動分析装置用のラテックス凝集免疫測定法用の免疫測定法試薬キットの構成は、通常、第１試薬（Ｒ１）と第２試薬（Ｒ２）とからなっており、第１試薬の主成分は緩衝液であり、第２試薬の主成分は、測定対象物（抗原分子）を認識する抗体を担持したラテックス粒子である。第１試薬の主な役割は検体間の違いを補正して（非特異反応の中和も含む）反応を均質化することと、増感剤による検出感度の増強である。一方、第２試薬の役割は、ラテックス粒子に固定された抗体を、測定対象（抗原分子）と反応させることで、被検検体中に存在する抗原分子数（濃度）に応じたラテックス粒子の凝集塊を形成させ、濃度依存的な吸光度（濁度）変化を惹起させることである。

これまで、生化学自動分析装置を適用するラテックス凝集免疫測定法を高感度化するための提案が幾つかなされている。例えば、特開２００１−０９１５１６号公報（特許文献１）は、ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の高感度で迅速な定量法として、ヒトα−フェトプロテイン抗体のＦｃ部分を取り除き、Ｆ（ａｂ´）₂のみとした抗体を担持したラテックス粒子を用いるＡＦＰの定量法を提案しており、また、特開２００３−２９４７５３号公報（特許文献２）は、特にラテックス凝集法において高い測定感度及び定量性を実現することができる免疫測定法として、少なくとも１種のアルギン酸を含有する凝集反応増感剤を用いる免疫測定法を提案している。

特開２００１−０９１５１６号公報 特開２００３−２９４７５３号公報

しかし、特許文献１、２に記載の方法は、残念ながら、生化学自動分析装置を適用するラテックス凝集免疫測定法を高感度化するという目的を十分に達成しているとは言えない。
従って、本発明の課題は、担体凝集免疫測定法において、抗原に対する高い反応性を有し、それにより高感度の測定を可能とする免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キットを提供することである。

本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、検体に第１試薬及び抗体担持粒子を含む第２試薬を順次添加混合する担体凝集免疫測定方法において、第１試薬に抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子を添加すると、第２試薬を加えて混合した際に、該第２試薬に含まれる抗体担持粒子は、抗原との高い反応性を示し、検体中の抗原の濃度が希薄であっても凝集し、結果として、高感度で抗原が測定できることを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、
［１］検体を第１試薬と混合する第１工程と、該第１工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第２工程とを含む、前記検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法であって、
前記第１試薬は、前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する第１粒子を含み、前記第２試薬は、第２粒子を含み、該第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉する粒子であるか又は前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子は、前記抗原の異なるエピトープを捕捉する粒子であることを特徴とする測定方法、
［２］前記第１粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するポリクローナル抗体を担持した粒子である前記［１］記載の測定方法、
［３］前記第１粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子である前記［１］記載の測定方法、
［４］前記第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの２つ以上に親和性を有するポリクローナル抗体を担持した粒子である前記［１］乃至前記［３］の何れか１つに記載の測定方法、
［５］前記第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体の２種以上を担持した粒子であって、各種のモノクローナル抗体は、前記抗原の異なるエピトープに親和性を有する抗体である前記［１］乃至前記［３］の何れか１つに記載の測定方法、
［６］前記第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子は、前記抗原の異なるエピトープに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子である前記［１］乃至前記［３］の何れか１つに記載の測定方法、
［７］検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法に用いるための、第１試薬と第２試薬とを含む免疫測定用試薬キットであって、
前記第１試薬は、前記［２］又は前記［３］に記載の第１粒子を含み、前記第２試薬は、前記［４］乃至前記［６］の何れか１つに記載の第２粒子を含むことを特徴とする免疫測定用試薬キット、
［８］更に、抗体を担持した粒子を含まない第３試薬を含む、前記［７］記載の免疫測定用試薬キット
に関するものである。

本発明により、担体凝集免疫測定法において、抗原に対する高い反応性を有し、それに
より高感度の測定を可能とする免疫学的測定方法が提供される。
また、本発明は、上記の高感度の免疫学的測定方法に用いる試薬キットも提供する。
尚、第１試薬に抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子を添加することにより、第２試薬に含まれる抗体担持粒子が抗原と高い反応性を示して、検体中の抗原の濃度が希薄であっても凝集する理由に関しては必ずしも明らかではないが、第１試薬に含まれる粒子が抗原のエピトープの１つを捕捉することにより、抗原の他のエピトープが第１試薬に含まれる粒子の表面方向に提示され、それにより、第２試薬に含まれる抗体担持粒子が、提示されたエピトープを効率よく捕捉できるようになり、結果として、検体中の抗原の濃度が希薄であっても抗原と高い反応性を示したことが考えられる。

更に詳細に本発明を説明する。
本発明は、検体を第１試薬と混合する第１工程と、該第１工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第２工程とを含む、前記検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法であって、
前記第１試薬は、前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する第１粒子を含み、前記第２試薬は、第２粒子を含み、該第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉する粒子であるか又は前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子は、前記抗原の異なるエピトープを捕捉する粒子であることを特徴とする測定方法に関する。
尚、本発明におけるエピトープは、抗原（抗原分子）の抗原決定基を意図するが、抗原決定基が明確でない小さな分子に関しては、該分子が有するアミノ酸配列の１部分のアミノ酸配列を意図する。

検体に含まれ得る抗原（抗原分子）としては、特に限定されず、一般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質及び病原体（ウイルス、細菌等）の抗原の全てが挙げられる。具体的には、生理活性物質としては生体内に存在する各種生体内レセプター、酵素、血中タンパクなどが挙げられる。具体的な生理活性物質としては、例えば、ミオグロビン、Ｄ−ダイマー、α−フェトプロテイン等が挙げられる。具体的な病原体の抗原としては、例えば、フィラリア抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、梅毒菌体由来抗原、ＨＢＳ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、ＡＴＬＡ抗原、クラミジア抗原、ヘルペス抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原等が挙げられる。

本発明に使用し得る第１試薬は、上記の抗原が有するエピトープの１つを捕捉する第１粒子を含む。
第１粒子は、抗原が有するエピトープの１つしか捕捉しないため、抗原との混合によりエピトープを捕捉した際にも、粒子の凝集は惹起されない。

第１粒子は、抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するポリクローナル抗体を担持した粒子であり得る。
上記の様なポリクローナル抗体は、例えば、エピトープマッピング分析の結果から特定のエピトープに対応するペプチド抗原を設計・合成し、該ペプチド抗原を免疫源としてポリクローナル抗体を作成することにより得ることができる。
また、第１粒子は、抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子であり得る。

第１粒子に使用し得る、抗体を担持するための粒子としては、抗体を担持し得る粒子であれば特に限定されないが、有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球および細胞膜片などが挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好ましくはラテックス懸濁液が用いられる。ラテックス懸
濁液に使用するラテックス粒子としては、例えばポリスチレン、スレチン−スチレンスルホン酸塩重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどがある。用いるラテックス粒子の平均粒径は、０．０５〜１．０μｍの範囲で適宜選択される。無機物質担体としては、シリカ、アルミナ、炭素末、あるいは金、チタン、鉄、ニッケルなどの金属片などが例示される。
第１粒子に使用し得る、抗体を担持するための粒子としては、好ましくは、ラテックス粒子が挙げられ、特に、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。

第１粒子に使用し得るモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、当該分野で公知の方法により行うことができ、また、市販されている抗体を用いることもできる。
また、抗体を粒子に担持する方法も、当該分野で公知の方法により行うことができ、例えば、物理吸着法、化学結合法等が挙げられる。
第１試薬に含まれる第１粒子の量は、該第１試薬の総体積に対する質量として、通常、０．００１乃至０．１％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは、０．００３乃至０．０７％（ｗ／ｖ）である。
尚、第１試薬は、原則として、第１粒子以外の抗体を担持した粒子を含まない。

第１試薬は、第１粒子に加えて、水性媒体を含み得る。
該水性媒体としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、５．５〜８．５が好ましい。

第１試薬は、更に、牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。
また、第１試薬は、測定感度の向上及び抗原抗体反応の促進のために、増感剤を添加し得る。具体的な増感剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、プルラン、ポリビニルピロリドン、アルギン酸等が挙げられる。

第２試薬は、第２粒子を含む。
本発明に使用し得る第２粒子は、抗原との混合により粒子の凝集を惹起する粒子であれば特に限定されるものではなく、同一の抗体を担持した粒子であってもよく、また、異なる抗体を担持した２種以上の粒子の混合物であってもよい。
つまり、第２粒子は、粒子全体として抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉すればよく、そして、抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉することにより、抗原との混合によりエピトープを捕捉した際に、粒子の凝集を惹起するものである。
そして、第２試薬は、第２粒子として、抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉する粒子であるか又は前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子は、抗原の異なるエピトープを捕捉する粒子を含む。
ここで、第２粒子が捕捉する抗原の２つ以上のエピトープのうちの少なくとも１つは、第１粒子が捕捉する抗原のエピトープとは異なるエピトープである。
つまり、第２粒子が捕捉する抗原の２つ以上のエピトープのうちの１つは、第１粒子が捕捉する抗原のエピトープと同一であってもよい。また、第２粒子が捕捉する抗原の２つ以上のエピトープの全てが、第１粒子が捕捉する抗原のエピトープと異なっていてもよい。

第２粒子は、抗原が有するエピトープの２つ以上に親和性を有するポリクローナル抗体を担持した粒子であり得る。
該ポリクローナル抗体を担持した粒子は、同一のポリクローナル抗体を担持した粒子であり得るが、異なるポリクローナル抗体を担持した粒子の混合物でもあり得る。
また、第２粒子は、抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体の２種以上を担持した粒子であり得、この場合、各種のモノクローナル抗体は、抗原の異なるエピトープに親和性を有する抗体となる。
該モノクローナル抗体の２種以上を担持した粒子は、同一の２種以上のモノクローナル抗体を担持した粒子であり得るが、異なる２種以上のモノクローナル抗体を担持した粒子の混合物でもあり得る。
また、第２粒子は、抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子の２種以上の混合物であり得、この場合、各種の粒子は、抗原の異なるエピトープに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子となる。
また、第２試薬に含まれる粒子は、抗原との混合により粒子の凝集を惹起すればよいものであり、そのため、第２試薬は、第２粒子に加えて他の抗体を担持した粒子も含み得る。
例えば、第２試薬は、
・上述のポリクローナル抗体を担持した粒子に、上述の２種以上のモノクローナル抗体を担持した粒子を混合したもの、
・上述のポリクローナル抗体を担持した粒子に、上述の１種のモノクローナル抗体を担持した粒子を混合したもの、
・上述の２種以上のモノクローナル抗体を担持した粒子に、上述の１種のモノクローナル抗体を担持した粒子を混合したもの、
・上述のポリクローナル抗体を担持した粒子に、上述の２種以上のモノクローナル抗体を担持した粒子及び上述の１種のモノクローナル抗体を担持した粒子を混合したもの、
を含み得る。

第２粒子に使用し得る、抗体を担持するための粒子としては、第１粒子で使用したものと同様の粒子が使用できる。
尚、第１粒子に使用する抗体を担持するための粒子と、第２粒子に使用する抗体を担持するための粒子とは、同一であり得るが、異なるものもでもあり得る。
第２粒子に使用し得る、抗体を担持するための粒子としては、好ましくは、ラテックス粒子が挙げられ、特に、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。

第２粒子に使用し得るモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、当該分野で公知の方法により行うことができ、また、市販されている抗体を用いることもできる。
また、抗体を粒子に担持する方法も、当該分野で公知の方法により行うことができ、例えば、物理吸着法、化学結合法等が挙げられる。
第２試薬に含まれる第２粒子の量は、該第２試薬の総体積に対する質量として、通常、０．０１乃至０．１５％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは、０．０５乃至０．１％（ｗ／ｖ）である。

第２試薬は、第２粒子に加えて、水性媒体を含み得る。
該水性媒体としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、５．５〜８．５が好ましい。

第２試薬は、更に、牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。

本発明の担体凝集免疫測定方法は、検体を第１試薬と混合する第１工程と、該第１工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第２工程とを含む。
検体を第１試薬と混合する第１工程は、検体に第１試薬を添加して混合することにより行われるが、恒温で行うのが好ましく、２５〜４０℃で行うのが好ましく、３０〜３８℃
で行うのがより好ましい。また、上記混合は、５秒〜３０分間、より好ましくは、５秒〜１５分間行う。これに続く第１工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第２工程は、得られた混合液に第２試薬を添加して混合することにより行われるが、恒温で行うのが好ましく、２５〜４０℃で行うのが好ましく、３０〜３８℃で行うのがより好ましい。また、上記混合は、５秒〜３０分間、より好ましくは、５秒〜１５分間行う。

上記第１工程及び第２工程をおこなうことにより得られた混合液の吸光度変化量を測定することにより、検体中の抗原を測定する。上記吸光度変化量は、粒子の凝集の進行に伴う吸光度の増加量である。
上記吸光度変化量の測定の際の測定波長は、通常、３４０〜１０００ｎｍ、好ましくは、５００〜８００ｎｍの範囲から適切な波長が選択される。上記吸光度変化量の測定に用いられる測定装置としては、経時的に上記溶液の吸光度を測定することができるものであれば特に限定されず、例えば、汎用の生化学自動分析装置等が挙げられる。上記測定波長、試料量、試薬量等は、上記測定装置に合わせて適宜選択することができる。

本発明はまた、検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法に用いるための、第１試薬と第２試薬とを含む免疫測定用試薬キットにも関する。
免疫測定用試薬キットに使用し得る第１試薬としては、上記した第１試薬を用いることができ、また、上記した第１粒子を含み、第２試薬としては、上記した第２試薬を用いることができ、また、上記した第２粒子を含む。

本発明はまた、更に、抗体を担持した粒子を含まない第３試薬を含む、免疫測定用試薬キットにも関する。
上記の３種の試薬を含む免疫測定用試薬キットを使用する場合、例えば、検体を第３試薬と混合する第１工程、該第１工程で得られた混合液を第１試薬と混合する第２工程及び該第２工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第３工程とを含み得る。
第３試薬は、緩衝液を主成分とする試薬であり、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、牛血清アルブミン、ショ糖、塩化ナトリウム、増感剤等を含み得る。
上記増感剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、プルラン、ポリビニルピロリドン、アルギン酸等が挙げられる。
上記の３種の試薬を含む免疫測定用試薬キットを採用する場合、第１試薬は、その保存安定性の観点から増感剤を含まないものとするのが好ましい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
調製例１：抗ヒトミオグロビン・モノクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ａ１）の調製
平均粒径２２０ｎｍのポリスチレン粒子を、０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２で希釈して、５％（ｗ／ｖ）の懸濁液１ｍＬを調製し、該１ｍＬの懸濁液に、市販の抗ヒトミオグロビン・モノクローナル抗体（ミクリ免疫研究所：Ｌｏｔ８）（０．７ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、混合した。
３７℃で２時間混和した後、遠心分離して上清を捨て、沈殿した粒子を、０．０５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２の２ｍＬに浮遊せしめて、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ１）を調製した。

調製例２：抗ヒトミオグロビン・モノクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ａ２）の調製
モノクローナル抗体を、市販の抗ヒトミオグロビン・モノクローナル抗体（ミクリ免疫研究所：Ｌｏｔ４４）（０．７ｍｇ／ｍＬ）に代えた以外は、調製例１と同様の操作を行
って、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ２）を調製した。

調製例３：抗ヒトミオグロビン・家兎ポリクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ａ３）の調製
ヒトミオグロビンを、フロインドの完全アジュバントと共に家兎の皮内に投与して免疫し、該家兎から得た抗血清をプロテイン−Ｇカラム法に付して、ＩｇＧ抗体（抗ヒトミオグロビン・家兎ポリクローナル抗体）を分取した。
平均粒径２２０ｎｍのポリスチレン粒子を、０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２で希釈して、５％（ｗ／ｖ）の懸濁液１ｍＬを調製し、該１ｍＬの懸濁液に、上記で得たＩｇＧ抗体の溶液（０．７ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、混合した。
３７℃で２時間混和した後、遠心分離して上清を捨て、沈殿した粒子を、０．０５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２の２ｍＬに浮遊せしめて、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ３）を調製した。

実施例１
標準ミオグロビン希釈列溶液（０、２５、５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）を作成した。
反応用緩衝液試薬に、調製例１で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ１）を添加して、粒子（ラテックス粒子）を０．０７％（ｗ／ｖ）含む浮遊液（第１試薬）を調製し、該浮遊液の１５０μＬを、上記で作製した標準ミオグロビン希釈列溶液の５μＬに加え、攪拌混和し、約５分後に、該混合液に、調製例３で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ３）を、粒子（ラテックス粒子）の含有量が０．０７５％（ｗ／ｖ）になるよう希釈調整された浮遊液（第２試薬）１００μＬを添加し、攪拌混和後、約５分間の吸光度変化量を、日立７１８０型自動分析装置（（株）日立ハイテクノロジーズ製）を用い、６６０ｎｍの波長にて測定した。

比較例１
第１試薬として、反応用緩衝液試薬（粒子（ラテックス粒子）を含まない）を使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。

比較例２
第１試薬として、反応用緩衝液試薬（粒子（ラテックス粒子）を含まない）を使用し、第２試薬として、調製例１で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ１）と調製例２で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ａ２）を等量で混合した浮遊液を、粒子（ラテックス粒子）の含有量が０．０７５％（ｗ／ｖ）になるよう希釈調整された浮遊液を使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。

実施例１、比較例１及び比較例２における、標準ミオグロビン希釈列溶液（０、２５、５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）における吸光度変化量を表１に纏めた。

結果：第１試薬にＡ１の粒子（ラテックス粒子）を添加した実施例１は、第１試薬に粒子（ラテックス粒子）を添加しなかった比較例１及び比較例２に比して、大きな吸光度変化量（高感度）を示した。

調製例４：抗フィラリアモノクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ｂ１）の調製
フィラリア成虫より生理食塩水にて抽出した抗原成分をマウスに免疫し、常法により抗フィラリアモノクローナル抗体を得た。
平均粒径２００ｎｍのポリスチレン粒子を、０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２で希釈して、５％（ｗ／ｖ）の懸濁液１ｍＬを調製し、該１ｍＬの懸濁液に、上記で得た抗フィラリアモノクローナル抗体（０．７ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、混合した。
３７℃で２時間混和した後、遠心分離して上清を捨て、沈殿した粒子を、０．０５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２の２ｍＬに浮遊せしめて、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｂ１）を調製した。

調製例５：家兎抗フィラリア抗原ＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体）担持粒子の浮遊液（Ｂ２）の調製
フィラリア成虫より生理食塩水にて抽出した抗原成分を常法により家兎に免疫し、家兎抗フィラリア抗原ＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体）を得た。
平均粒径３１７ｎｍのポリスチレン粒子を、０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２で希釈して、５％（ｗ／ｖ）の懸濁液１ｍＬを調製し、該１ｍＬの懸濁液に、上記で得た家兎抗フィラリア抗原ＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体）（０．７ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、混合した。
３７℃で２時間混和した後、遠心分離して上清を捨て、沈殿した粒子を、０．０５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２の２ｍＬに浮遊せしめて、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｂ２）を調製した。

実施例２
フィラリア標準抗原希釈列溶液（０、８、３２、１３０ｎｇ／ｍＬ）を作成した。
反応用緩衝液試薬に、調製例４で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｂ１）を添加して、粒子（ラテックス粒子）を０．０１２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液（第１試薬
）を調製し、該浮遊液の６０μＬを、上記で作製したフィラリア標準抗原希釈列溶液の３０μＬを生理食塩水１２０μＬで希釈した希釈液の１０μＬに加え、攪拌混和し、約５分後に、該混合液に、調製例５で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｂ２）を、粒子（ラテックス粒子）の含有量が０．０７５％（ｗ／ｖ）になるよう希釈調整された浮遊液（第２試薬）５５μＬを添加し、攪拌混和後、約５分間の吸光度変化量を、ＢＭ２２５０（日本電子（株）社製）を用い、５７１ｎｍの波長にて測定した。

実施例３
第１試薬として、調製例４で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｂ１）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．００６２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例２と同様の操作を行った。

比較例３
第１試薬として、反応用緩衝液試薬（粒子（ラテックス粒子）を含まない）を使用した以外は実施例２と同様の操作を行った。

実施例２、実施例３及び比較例３における、フィラリア標準抗原希釈列溶液（０、８、３２、１３０ｎｇ／ｍＬ）における吸光度変化量を表２に纏めた。

結果：第１試薬にＢ１の粒子（ラテックス粒子）を添加した実施例２及び実施例３は、第１試薬に粒子（ラテックス粒子）を添加しなかった比較例３に比して、大きな吸光度変化量（高感度）を示した。

調製例６：抗ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）・モノクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ｃ１）の調製
平均粒径２２０ｎｍのポリスチレン粒子を、０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２で希釈して、０．４５％（ｗ／ｖ）の懸濁液１ｍＬを調製し、該１ｍＬの懸濁液に、市販の抗ヒトα−フェトプロテイン・モノクローナル抗体（ミクリ免疫研究所：ｃｌｏｎｅ６Ｇ２）（０．２３５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、混合した。
３７℃で２時間混和した後、遠心分離して上清を捨て、沈殿した粒子を、０．０５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２の２ｍＬに浮遊せしめて、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ１）を調製した。

調製例７：抗ヒトα−フェトプロテイン・モノクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ｃ２）の調製
モノクローナル抗体を、市販の抗ヒトα−フェトプロテイン・モノクローナル抗体（ミクリ免疫研究所：ｃｌｏｎｅ３Ｃ５）（０．２３５ｍｇ／ｍＬ）に代えた以外は、調製例
６と同様の操作を行って、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ２）を調製した。

調製例８：抗ヒトα−フェトプロテイン・家兎ポリクローナル抗体担持粒子の浮遊液（Ｃ３）の調製
ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を、フロインドの完全アジュバントと共に家兎の皮内に投与して免疫し、該家兎から得た抗血清をプロテイン−Ｇカラム法に付して、ＩｇＧ抗体（抗ヒトα−フェトプロテイン・家兎ポリクローナル抗体）を分取した。
平均粒径２２０ｎｍのポリスチレン粒子を、０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２で希釈して、０．４５％（ｗ／ｖ）の懸濁液１ｍＬを調製し、該１ｍＬの懸濁液に、上記で得たＩｇＧ抗体の溶液（０．２３５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、混合した。
３７℃で２時間混和した後、遠心分離して上清を捨て、沈殿した粒子を、０．０５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１モル濃度のグリシン食塩緩衝液（ＧＳＢ）ｐＨ８．２の２ｍＬに浮遊せしめて、粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ３）を調製した。

実施例４
標準ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）希釈列溶液（０、３５、１４４、６１９、２５５７ｎｇ／ｍＬ）を作成した。
反応用緩衝液試薬に、調製例６で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ１）を添加して、粒子（ラテックス粒子）を０．０２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液（第１試薬）を調製し、該浮遊液の１８０μＬを、上記で作製した標準ミオグロビン希釈列溶液の１５μＬに加え、攪拌混和し、約５分後に、該混合液に、調製例８で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ３）を、粒子（ラテックス粒子）の含有量が０．０７５％（ｗ／ｖ）になるよう希釈調整された浮遊液（第２試薬）９０μＬを添加し、攪拌混和後、約５分間の吸光度変化量を、日立７１７０型自動分析装置（（株）日立ハイテクノロジーズ製）を用い、７００ｎｍの波長にて測定した。

実施例５
第１試薬として、調製例６で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ１）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．０１２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例４と同様の操作を行った。

実施例６
第１試薬として、調製例６で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ１）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．００６２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例４と同様の操作を行った。

実施例７
第１試薬として、調製例６で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ１）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．００３１２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例４と同様の操作を行った。

実施例８
第１試薬として、調製例６で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ１）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．０２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液に代えて、調製例７で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ２）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．０２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例４と同様の操作を行った。
実施例９
第１試薬として、調製例７で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ２）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．０１２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例８と同様の操作を行った。

実施例１０
第１試薬として、調製例７で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ２）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．００６２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例８と同様の操作を行った。

実施例１１
第１試薬として、調製例７で調製した粒子の浮遊液（ラテックス浮遊液）（Ｃ２）を添加した、粒子（ラテックス粒子）を０．００３１２５％（ｗ／ｖ）含む浮遊液を用いた以外は、実施例８と同様の操作を行った。

比較例４
第１試薬として、反応用緩衝液試薬（粒子（ラテックス粒子）を含まない）を使用した以外は実施例４と同様の操作を行った。

実施例４乃至実施例７及び比較例４における、標準ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）希釈列溶液（０、３５、１４４、６１９、２５５７ｎｇ／ｍＬ）における吸光度変化量を表３に纏め、実施例８乃至実施例１１及び比較例４における、標準ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）希釈列溶液（０、３５、１４４、６１９、２５５７ｎｇ／ｍＬ）における吸光度変化量を表４に纏めた。

結果：第１試薬にＣ１の粒子（ラテックス粒子）を添加した実施例４乃至実施例７並びに第１試薬にＣ２の粒子（ラテックス粒子）を添加した実施例８乃至実施例１１は、第１試薬に粒子（ラテックス粒子）を添加しなかった比較例４に比して、大きな吸光度変化量（
高感度）を示した。
また、第１試薬にＣ１の粒子（ラテックス粒子）を添加した実施例４乃至実施例７では、ＡＦＰの低濃度領域での感度向上の程度が大きかったのに対して、第１試薬にＣ２の粒子（ラテックス粒子）を添加した実施例８乃至実施例１１では、ＡＦＰの高濃度領域での感度向上の程度が大きく、使用する抗体の種類により反応性が異なっていた。
また、何れの抗体を用いた場合においても、粒子（ラテックス粒子）の非常に低い濃度において、感度の向上が観られており、抗原に対する高い反応性を示したことが分る。

Claims (8)

1. 検体を第１試薬と混合する第１工程と、該第１工程で得られた混合液を第２試薬と混合する第２工程とを含む、前記検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法であって、
   前記第１試薬は、前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する第１粒子を含み、前記第２試薬は、第２粒子を含み、該第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの２つ以上を捕捉する粒子であるか又は前記抗原が有するエピトープの１つを捕捉する粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子が、前記抗原の異なるエピトープを捕捉する粒子であることを特徴とする測定方法。
2. 前記第１粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するポリクローナル抗体を担持した粒子である請求項１記載の測定方法。
3. 前記第１粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子である請求項１記載の測定方法。
4. 前記第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの２つ以上に親和性を有するポリクローナル抗体を担持した粒子である請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の測定方法。
5. 前記第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体の２種以上を担持した粒子であって、各種のモノクローナル抗体は、前記抗原の異なるエピトープに親和性を有する抗体である請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の測定方法。
6. 前記第２粒子は、前記抗原が有するエピトープの１つに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子の２種以上の混合物であって、各種の粒子は、前記抗原の異なるエピトープに親和性を有するモノクローナル抗体を担持した粒子である請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の測定方法。
7. 検体中の抗原を測定するための担体凝集免疫測定方法に用いるための、第１試薬と第２試薬とを含む免疫測定用試薬キットであって、
   前記第１試薬は、請求項２又は請求項３に記載の第１粒子を含み、前記第２試薬は、請求項４乃至請求項６の何れか１項に記載の第２粒子を含むことを特徴とする免疫測定用試薬キット。
8. 更に、抗体を担持した粒子を含まない第３試薬を含む、請求項７記載の免疫測定用試薬キット。