JP2018161152A - 血小板標的化治療 - Google Patents

Abstract

【課題】外来遺伝子の発現を血小板に標的化するための組成物および方法を提供する。【解決手段】本発明は、外来遺伝子の発現を血小板に標的化するための組成物および方法に関する。特に、外来性作用物質（例えば、凝固因子）の発現を血小板に標的化することによる、血友病および他の疾患および症状の治療に関する。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本願は、２０１２年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／７１７，９５１号の優先権を主張するものであり、上述出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、外来遺伝子の発現を血小板に標的化するための組成物および方法に関する。本開示は特に、外来性作用物質（例えば、凝固因子）の発現を血小板に標的化することによる、血友病および他の疾患ならびに症状の治療に関する。

〔背景技術〕
血友病は一般的な出血性障害（男性の約１０，０００人に１人にみられる）であり、患者の血液が正常に凝固しないため重度の内出血を来たし、死に至る場合が多い。血友病は通常、遺伝性であり、患者は出生時に始まり生涯を通じて再発する制御不可能な重度の出血事象を示す。血小板とともに作用して血液凝固を助ける凝固因子にはいくつかあるが、血友病患者では通常、凝固第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）または第ＩＸ因子（血友病Ｂ）をコードするタンパク質の量または性質に欠陥がみられ、これが正常な止血を妨げる。

造血幹細胞が骨髄内で分化し巨核球となって成熟し、血小板として知られる数千個の小断片に分かれ、正常な状態ではこれが血流中を約１０日間、静かに（他の血液細胞または血管壁と相互作用せずに）循環する。血小板の主な役割は、活性化され、変形し、損傷を受けた血管に張り付いてその傷を修復することである。血管が損傷されると、凝固因子の助けにより血小板が互いにくっつき合い、切れ目を塞いで血管の破れた部分を閉じ、出血を止める。

血友病Ａの患者には凝固第ＶＩＩＩ因子の欠損またはレベル低下がみられる。血友病患者の１０人中約９人がＡ型である。血友病Ｂの患者には凝固第ＩＸ因子の欠損またはレベル低下がみられる。両凝固因子とも通常、肝臓で合成されるが、他の細胞型では、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦＩＸタンパク質の完全な機能的形態を合成することを誘導させることが可能であるという報告がある。

血友病は、正常に機能する凝固因子が血液中にどれだけ存在するかに応じて、軽症、中等症または重症となり得る。血友病Ａの患者では１０人に約７人が重症型の疾患である。

第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子はＸ染色体上にあるため、血友病は通常、男性（まれな例外として、罹患している父親と血友病の保因者の母親からそれぞれ欠陥のあるＸ染色体を遺伝的に受け継いだ女性）に発症する。世界では毎年、約１０，０００人に１人が血友病を持って生まれる。

血友病の主な治療法はタンパク質補充療法である。ドナー血液またはＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸをコードする正常遺伝子で形質転換した組織培養細胞系から調製した組換えタンパク質のプールから単離した凝固因子ＶＩＩＩ（血友病Ａの場合）または凝固因子ＩＸ（血友病Ｂの場合）の濃縮物を、重篤な出血の発生時に、静脈内に少しずつ点滴または注入することができる。このような注入により、欠損している、または低値を示す凝固因子が補充される。

補充療法の厄介な問題点としては、最終的に患者の約３０％に凝固因子の不活性化または破壊および制御不可能な出血をもたらす、患者の免疫系にとって外来性の正常な治療用タンパク質に対する抗体応答が発現すること（インヒビター形成として知られる）、ヒト凝固因子に起因するウイルス感染症が発現すること（特に第三世界諸国における感染した血液ドナーに由来するＨＩＶまたは肝炎に汚染された血液による）、補充タンパク質の半減期（日数）が極めて短く、治療の遅れを招く、重症の血管損傷および関節、筋肉および他のダメージを軽減するために頻繁に再投与する必要があり、コストが極めて高くなることが挙げられる。

したがって、これらの厄介な問題点を克服する新規な血友病の治療法が必要である。

〔発明の概要〕
本開示は、外来遺伝子の発現を血小板に標的化するための組成物および方法に関する。本開示は特に、外来性作用物質（例えば、凝固因子）の発現を血小板に標的化することによる、血友病および他の疾患ならびに症状の治療に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、造血幹細胞遺伝子治療のための組成物および臨床的に意義のある方法に関し、骨髄巨核球内での外来遺伝子の発現を標的化とすることにより、ヒト血小板内での組換え治療用タンパク質の発現および／または貯蔵をもたらす。

例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンαＩＩｂ遺伝子（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーターのフラグメントを含む発現カセットと、この発現カセットと作動可能に連結された目的外来遺伝子とを含む発現ベクターを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、例えば、配列番号２１、２２もしくは２３または配列番号２１、２２、２３もしくは２５よりも大きいもしくは小さい（例えば、配列番号２１、２２、２３もしくは２５よりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチドもしくはそれ以上大きいもしくは小さいヌクレオチド）配列またはそのフラグメントから選択される核酸配列を含む、これを実質的に有する、またはこれで構成される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、標的化因子（例えば、Ｄ２ドメインと作動可能に連結されたヒトフォン・ヴィルブランド因子プロペプチド（ＶＷＦｐｐ）のフラグメント）（例えば、配列番号２４または配列番号２４よりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチドもしくはそれ以上大きいもしくは小さいヌクレオチドの配列または配列番号２４のフラグメントによって記載されるもの）をさらに含む。本発明は特定の外来遺伝子に限定されない。例としては、特に限定されないが、ヒトＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは自己不活性化ベクター、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。

さらなる実施形態は、本明細書に記載される発現ベクターを含む造血幹細胞（例えば、生体外幹細胞）を提供する。

また別の実施形態では、本発明は、動物（例えば、ヒト）の疾患および症状（例えば、血友病）の治療にこのような幹細胞を使用することを提供する。

本発明はほかにも、改変幹細胞内で遺伝子（例えば、第ＶＩＩＩ因子遺伝子）が発現する条件下で、造血幹細胞と本明細書に記載されるベクターとを接触させて改変幹細胞を作製することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、前記改変幹細胞を動物（例えば、ヒト）に移植する段階をさらに含む。いくつかの実施形態では、動物は血友病があると診断されており、移植により動物の大量出血を治療または予防する。いくつかの実施形態では、接触を生体外で実施する。いくつかの実施形態では、動物から幹細胞を動員する（例えば、サイトカインを投与して末梢血中に動員し、アフェレーシス採取を実施し、免疫磁気ビーズで単離することによって動員する）。いくつかの実施形態では、動物は、血小板内で前記第ＶＩＩＩ因子を発現する。いくつかの実施形態では、この方法を繰り返す（例えば、定期的に、または必要に応じて）。

さらなる実施形態を本明細書に記載する。

〔図面の簡単な説明〕
図１は、血小板標的化レンチウイルスベクターの設計を示す図である。（Ａ）ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターフラグメントが巨核球の特異的な発現をルシフェラーゼに導く。（Ｂ）−８８９ＩＴＧＡ２Ｂ−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクターの略図。（Ｃ）−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ−ＶＷＦＳＰＤ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクターの略図。

図２は、ＢＤＤＦＶＩＩＩの合成およびイヌ血小板α顆粒内への輸送を示す図である。（Ａ）血小板内でのＢＤＤＦＶＩＩＩとＦｇの共局在を示す共焦点顕微鏡観察。（Ｂ）よりヒトＢＤＤＦＶＩＩＩがα顆粒内に局在することを直接示す電子顕微鏡観察。

図３は、血小板ＦＶＩＩＩの定量分析を示す図である。

図４は、ＦＶＩＩＩ:Ｃの分泌が誘導された活性化血小板を示す図である。

図５は、イヌゲノム内のレンチウイルスベクターを検出し位置を特定するＰＣＲ分析を示す図である。（Ａ）白血球ゲノムＤＮＡ内におけるＢＤＤＦＶＩＩＩ−レンチウイルスベクターの長期間にわたる検出。（Ｂ）レンチウイルスベクターのイヌゲノム内での位置を特定する線形増幅媒介（ＬＡＭ）−ＰＣＲ。

図６は、血小板ＢＤＤＦＶＩＩＩによるイヌ血友病Ａ表現型の是正を示す図である。

図７は、ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターおよびＶＷＦｓｐＤ２の構造領域を示す図である。矢印は血小板標的化治療の前および後の重篤な出血事象を示す。イヌＩ４２およびＭ６４は完全な止血の修正を示している。

図８は、本開示の実施形態の例示的なレンチウイルス遺伝子治療ベクターを示す図である。

図９は、図８のベクターの配列（配列番号２５）を示す図である。

図１０は、組換えレンチウイルス遺伝子導入構築物に用いたインテグリンαＩＩｂプロモーターフラグメントの略図およびヌクレオチド配列を示す図である。（Ａ）巨核球に特異的なルシフェラーゼレポーター試験に用いたヒトαＩＩｂ−遺伝子プロモーターＮｃｏ Ｉの−ＳａｌＩ ＢｇｌＩＩ−１２１８〜＋３０のヌクレオチド配列（配列番号２１）。（Ｂ）巨核球特異的ルシフェラーゼレポーター試験に用いたヒトαＩＩｂ−遺伝子プロモーターＮｃｏ Ｉの−ＳａｌＩ ＢｇｌＩＩ−８８９〜＋３０のヌクレオチド配列（配列番号２２）。（Ｃ）巨核球に特異的なルシフェラーゼレポーター試験に用いたヒトαＩＩｂ−遺伝子プロモーターＮｃｏ Ｉの−ＳａｌＩ ＢｇｌＩＩ−６７３〜＋３０のヌクレオチド配列（配列番号２３）。番号付けはＰｒａｎｄｉｎｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５６（１）５９５−６０１，１９８８）に基づくものである。

〔発明を実施するための形態〕
定義
本発明の理解を容易にするため、多数の用語および語句を以下に定義する。

本明細書で使用される「遺伝子導入システム」という用語は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入システムとしては、特に限定されないが、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヒト人工染色体、および他の核酸ベースの送達システム）、ネイキッド核酸のマイクロインジェクション、ポリマーベースの送達システム（例えば、リポソームベースのシステムおよび金属粒子ベースのシステム）、遺伝子銃による注入などが挙げられる。本明細書で使用される「ウイルス遺伝子導入システム」という用語は、所望の細胞または組織への試料の送達を容易にするウイルス要素（例えば、未処理のウイルス、改変ウイルスおよび核酸またはタンパク質などのウイルス成分）を含む遺伝子導入システムを指す。本明細書で使用される「アデノウイルス遺伝子導入システム」という用語は、アデノウイルス科に属する未処理のウイルスまたは改変ウイルスを含む遺伝子導入システムを指す。

本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、特に限定されないがＤＮＡまたはＲＮＡを含めた分子を含む、任意の核酸を指す。この用語は、特に限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５‐フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含めた既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長のコード配列によってコードされていても、完全長またはフラグメントの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、コード配列の任意の一部分によってコードされていてもよい。この用語はほかにも、構造遺伝子のコード領域ならびに遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するようにコード領域の５’末端側および３’末端側の約１ｋｂ以上の距離にわたって両端に隣接して位置する配列を包含する。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列を５’非翻訳配列と呼ぶ。コード領域の３’または下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列を３’非翻訳配列と呼ぶ。「遺伝子」という用語はｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム形態をともに包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。「イントロン」とは核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントのことであり、イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含んでいてもよい。イントロンは核転写産物または一時転写産物から除去される、すなわち「スプライシングで切り出される」ため、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳時に新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を指定するために機能する。

本明細書で使用される「異種遺伝子」という用語は、その自然環境には存在しない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子としては、ある種から別の種に導入された遺伝子が挙げられる。異種遺伝子としてはほかにも、何らかの方法（例えば、変異、複数コピーの付加、非天然の制御配列との連結など）で改変された生物由来の遺伝子が挙げられる。異種遺伝子は通常、天然の状態では染色体中の遺伝子配列と関連してみられないＤＮＡ配列と連結されているか、天然にみられない染色体の部分と関連している（例えば、通常なら遺伝子が発現しない遺伝子座に遺伝子が発現する）という点で内在遺伝子と区別される。

本明細書で使用される「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方（すなわち、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントによってもたらされる機能、これらの機能に関する考察については上を参照されたい）をもたらすことができる配列を含むＤＮＡのセグメントを意味する。例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーター機能とエンハンサー機能をともに含む。エンハンサー／プロモーターは「内在性」であっても、「外来性」であっても、「異種性」であってもよい。「内在性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に連結しているエンハンサー／プロモーターである。「外来性」または「異種性」のエンハンサー／プロモーターは、連結したエンハンサー／プロモーターによって遺伝子の転写が指揮されるように、遺伝子操作（例えば、クローン化および組換えなどの分子生物学的技術）によって遺伝子と並列に配置されたエンハンサー／プロモーターである。調節エレメントは組織特異的なものであっても、細胞特異的であってもよい。「組織特異的」という用語は、調節エレメントに適用される場合、特定のタイプの組織（例えば、乳腺）に対して目的ヌクレオチド配列の選択的発現を指令することができるが、これと異なるタイプの組織（例えば、肝臓）に目的ヌクレオチド配列（１つまたは複数）が相対的に発現されない調節エレメントを指す。調節エレメントの組織特異性は、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列（非組織特異的である）および調節エレメントと作動可能に連結してレポーター構築物を作製し、レポーター構築物が結果として生じたトランスジェニック動物のあらゆる組織に組み込まれるように、レポーター構築物を動物のゲノム内に導入し、トランスジェニック動物の異なる組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出する（例えば、レポーター遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質の活性を検出する）ことによって評価することができる。他の組織におけるレポーター遺伝子の発現のレベルに対して、より高いレベルの１つ以上の組織におけるレポーター遺伝子の発現の検出は、より高いレベルの発現が検出された組織において調節エレメントが「特異的である」ことを示している。したがって、本明細書で使用される「組織特異的」（例えば、肝臓特異的）という用語は、発現の絶対的な特異性を必要としない相対的な用語である。言い換えれば、「組織特異的」という用語は、ある組織には極めて高レベルの発現がみられ、別の組織には発現がみられないという必要はない。ある組織の方が別の組織よりも発現レベルが高ければ十分である。これとは対照的に、「厳密な」または「絶対的な」組織特異的発現は、単一のタイプの組織（例えば、肝臓）に発現を示すが、他の組織には検出可能な発現がないことを表すものとする。

本明細書でヌクレオチド配列に関して使用される「部分」または「フラグメント」（「所与のヌクレオチド配列の一部分またはフラグメント」のように）という用語は、その配列のフラグメントを指す。フラグメントは、大きさが４ヌクレオチドからヌクレオチド配列全体から１ヌクレオチドを除いたもの（１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドなど）の範囲であればよい。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ヌクレオチド配列よりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチド少ないヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）またはそのサブセット（例えば、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド短い配列など）を含む。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さの短い一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは通常、長さが２００残基未満（例えば、１５〜１００残基）であるが、本明細書で使用される場合、この用語はほかにも、より長いポリヌクレオチド鎖を包含する。オリゴヌクレオチドはその長さで称されることも多い。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドであれば「２４量体」と呼ぶ。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリッド形成または他のポリヌクレオチドとのハイブリッド形成によって二次構造または三次構造を形成することができる。このような構造は、特に限定されないが、二本鎖、ヘアピン、十字型、折れ曲がりおよび三本鎖を含んでいてもよい。

本明細書で使用される「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則に関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、一連のヌクレオチド）に関して使用される。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って対応する「部分的な」ものであってもよい。あるいは、核酸間で「完全な」または「全面的な」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度はハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは増幅反応においても、核酸間の結合に依存する検出方法においても、特に重要である。

「相同性」という用語は相補性の程度を指す。部分的な相同性であっても、完全な相同性（すなわち、同一性）であってもよい。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が標的核酸にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する核酸分子であることは、「実質的に」相同である。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。低ストリンジェントなの条件下では、実質的に相同な配列またはプローブは、完全に相同な核酸分子と標的との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合するか、これを阻害する。低ストリンジェントな条件が非特異的結合を容認するのではなく、低ストリンジェントな条件が、２つの配列が特異的（すなわち、選択的）相互作用でお互いに結合することを要求する。非特異的結合が存在しないことは、実質的に非相補的な（例えば、同一性が約３０％未満である）第二の標的を使用することによって試験することができる。非特異的結合が存在していなければ、プローブは第二の非相補的な標的とハイブリダイズしない。

ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用する場合、「実質的に相同な」という用語は、上述の低ストリンジェントな条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖とハイブリダイズすることができる任意のプローブを指す。

１つの遺伝子は、一次ＲＮＡ転写産物の差次的スプライシングによって生じる複数のＲＮＡ種を生成する。同じ遺伝子のスプライスバリアントであるｃＤＮＡは、配列が同一であるか完全に相同である領域（両ｃＤＮＡ上に同じエキソンまたは同じエキソンの一部分が存在することを意味する）および完全に非同一である領域（例えば、ｃＤＮＡ １にはエキソン「Ａ」が存在するのに対して、ｃＤＮＡ ２には代わりにエキソン「Ｂ」を含むことを意味する）を含む。この２つのｃＤＮＡは配列が同一である領域を含むため、両ｃＤＮＡに見いだされる配列を含む遺伝子全体または遺伝子の一部分に由来するプローブとハイブリダイズする。したがって、この２つのスプライスバリアントは、このようなプローブと実質的に相同であり、かつ互いに実質的に相同である。

一本鎖核酸配列に関して使用する場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェントな条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズすることができる（すなわち、その相補体である）任意のプローブを指す。

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対形成に用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は核酸間の相補性の程度、用いられるストリジェントの条件、形成されるハイブリッドのＴ_ｍおよび核酸内のＧ：Ｃの比などの因子によって影響を受ける。その構造内に相補的な核酸の対形成を含む単一分子を「自己ハイブリッド形成した」と言う。

核酸に関して用いる場合、「単離」という用語は、「単離オリゴヌクレオチド」または「単離ポリヌクレオチド」のように、その天然物中では本来結合している少なくとも１つの成分または夾雑物から同定し分離された核酸配列を指す。単離核酸とは、天然に見いだされるものとは異なる形態または状況で存在する。これに対して、非単離核酸とは、天然で存在する状態のＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞の染色体上で、近傍遺伝子に近接して見いだされ、特異的なタンパク質をコードする特異的なｍＲＮＡのようなＲＮＡ配列は、細胞内で、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として見いだされる。しかし、所与のタンパク質をコードする単離核酸は、例を挙げると、本来その所与のタンパク質を発現する細胞内の核酸を含み、その核酸は、自然細胞の染色体位置とは、異なる染色体位置にあるか、天然に見いだされる核酸配列とは異なる核酸配列に隣接している。単離核酸、単離オリゴヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖の形態で存在することができる。単離核酸、単離オリゴヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドを、タンパク質を発現させるために用いる場合、そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは少なくともセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってよい）が、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。

本明細書で使用される「精製される」または「精製する」という用語は、試料から成分（例えば、夾雑物）を除去することを指す。例えば、抗体は、夾雑する非免疫グロブリンタンパクを除去することによって精製され、るほか、標的分子に結合しない免疫グロブリンを除去することによっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去により、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合が増大する。また別の例では、組換えポリペプチドを細菌宿主細胞内で発現させ、宿主細胞タンパク質の除去によってそのポリペプチドを精製する。これにより試料中の組換えポリペプチドの割合が増大する。

本明細書で使用される「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。１つの意味では、生物学的試料および環境試料のほか、任意の入手源から得られる標本または培養物を含む。生物試料は動物（ヒトを含む）から得られ、液体、固体、組織および気体を含む。生物試料は、血漿、血清などの血液製剤を含む。環境試料は、表面物質、土壌、水および産業試料などの環境物質を含む。しかし、これらの例は、本発明に適用できる試料のタイプを限定するものとして解釈してはならない。

本明細書で使用される「対象」という用語は、本発明の方法により処理の対象となる生物体を指す。このような生物体として好ましくは、特に限定されないが、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含み、最も好ましくはヒトを含む。本発明において、「対象」という用語は一般に、細菌感染を特徴とする状態の治療（例えば、本発明の化合物および任意に１以上の他の薬剤の投与）を受ける予定または既に治療を受けている個体を指す。

〔発明の詳細な説明〕
本開示は、外来遺伝子の発現を血小板に標的化するための組成物および方法に関する。本開示は特に、外来性作用物質（例えば、凝固因子）の発現を血小板に標的化することによる、血友病および他の病気ならび症状の治療に関する。

本発明の実施形態は、細胞特異的プロモーターを用いて異種遺伝子の発現を特定の細胞型に指揮するための組成物および方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、異種遺伝子または外来遺伝子の発現を幹細胞（例えば、癌幹細胞または造血幹細胞）に標的化し、次いで、前駆細胞（例えば、血小板）内で目的遺伝子を発現する。この組成物および方法は様々な疾患（例えば、血友病などの血小板が仲介する疾患）の治療に用いられる。本発明の特定の実施形態を、外来性凝固因子または異種性の凝固因子を用いる血友病の治療に基づいて説明するが、本発明は血友病または血小板障害の治療に限定されない。

いくつかの実施形態では、本開示は、血友病および希少なまたは典型的遺伝性出血性障害ならびに血小板に関係のある他の疾患状態（例えば、静脈および動脈の血栓症、免疫応答ならびに癌）および症状を治療することに関し、血小板系列内でのみタンパク質の発現を駆動するための血小板特異的遺伝子プロモーターのフラグメントおよび場合によっては、シグナルペプチドと組換えタンパク質を血小板α顆粒に特異的に輸送する治療分子との融合体を使用して、損傷部位における活性化血小板からの外来性作用物質の調節された放出を誘発するために、造血幹細胞遺伝子治療を採用する。まとめると、この方法は、血小板を、治療剤を送達する媒体として用いることで、外来性作用物質（例えば、遺伝性血小板異常の修正によって止血を回復させる正常な補充タンパク質、血友病のための凝固因子、深部静脈血栓症および動脈閉塞のための抗血栓剤ならびに固形腫瘍を収縮させ癌の血管新生を阻害する抗腫瘍剤）の発現を血小板に標的化して創傷の修復を可能にするものである。

血小板の機能の様々な側面（活性化、接着、凝集、シグナル伝達、顆粒貯蔵）に影響を及ぼす、十分に特徴付けられた遺伝性の遺伝子異常がいくつかあり、これらは通常、出血が制御できない状態として臨床的に示されている（Ｌｅｓｌｉｅ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，５６２−５６４（２０１０））。本発明の実施形態は、ヒトの血友病Ａを処置するための、血小板での凝固因子ＦＶＩＩＩの合成を駆動する正常なインテグリン遺伝子プロモーターをコードする遺伝子により形質導入した造血幹細胞の自家移植を提供する。これまで、巨核球での生物学的に正常な分子のデノボ合成により、全タンパク質を輸送して血小板を創傷修復に関与させることが可能になっている。このことは、最近、イヌグランツマン血小板無力症（ＧＴ）に罹患しインテグリンαＩＩｂに異常のあるイヌにおいて、インテグリンαＩＩｂの発現を駆動するインテグリンαＩＩｂ遺伝子プロモーターの造血幹細胞遺伝子導入を用いて血小板でインテグリンαＩＩｂβ３受容体複合体のデノボ合成を起こし、血小板機能を改善し、出血回数および血液損失を減少させることに成功したことによって裏付けられる（Ｆａｎｇ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８，９５８３−９５８８（２０１１））。

インテグリンβ３をコードするオンコレトロウイルスベクターで動員したＧ−ＣＳＦを末梢血幹細胞（Ｇ−ＰＢＣ）に形質導入することにより、ヒトＧＴ患者に由来する巨核球に使用可能なインテグリンαＩＩｂβ３複合体のｄｅ ｎｏｖｏ合成が生じた（Ｗｉｌｃｏｘ，Ｄ．Ａら，Ｂｌｏｏｄ．９５：３６４５−５２，２０００；Ｌｅｓｌｉｅ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，５６２−５６４（２０１０））。ほかにも、β３をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した骨髄の移植によりＧＴモデルのマウスの血小板機能を修正すること（Ｆａｎｇ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ １０６，２６７１−２６７９（２００５））およびインテグリンαＩＩｂの造血幹細胞遺伝子導入を用いて血小板でαＩＩｂβ３を生成させることによりイヌのグランツマン血小板無力症（ＧＴ）を修正すること（Ｆａｎｇ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８，９５８３−９５８８（２０１１））が示された。

本発明の実施形態の開発の過程で実施した実験は、Ｇ−ＰＢＣへ遺伝子を導入することが、オンコレトロウイルスで形質導入したヒト巨核球および血小板がヒト凝固第ＶＩＩＩ因子を合成し、貯蔵し、血小板活性化の生理学的アゴニストによりインビトロで活性化されるＦＶＩＩＩを放出し得ることを示すことを証明する（Ｗｉｌｃｏｘ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１：２４７７−８９，２００３）。このほか、ヒトＦＶＩＩＩの発現を駆動するインテグリンαＩＩｂ遺伝子プロモーターの−８８９フラグメントの転写制御下でレンチウイルスベクターにより形質導入した骨髄の移植によって、（ＦＶＩＩＩの阻害抗体の存在下でも）血友病Ａのマウスモデルの止血が改善したこと（Ｓｈｉ，Ｑ．ａｎｄ Ｗｉｌｃｏｘ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．,Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ５：３５２−３６１，２００７）および（Ｓｈｉ，Ｑ．ら，Ｂｌｏｏｄ １１２：２７１３−２１，２００８）ならびにヒトＦＶＩＩＩと融合したＶＷＦＳＰＤ２を有する、またはヒトＦＶＩＩＩと融合したＶＷＦＳＰＤ２を有さないインテグリンαＩＩｂ遺伝子プロモーターフラグメントのレンチウイルス仲介による造血幹細胞遺伝子導入のためにＰＢＣが動員されたＧ−ＣＳＦを使用すると、血小板および血小板α顆粒に完全に機能するＦＶＩＩＩの発現を誘導し、血小板機能を修正し、止血ならびに重篤な出血事象の減少および／または消失を改善したため、血友病Ａの大型動物「イヌ」モデルでは、動物は、移植後少なくとも２．５年間、ＦＶＩＩＩタンパク質補充療法による注射を必要とせず、さらにイヌ血小板内に貯蔵される組換えヒトＦＶＩＩＩに対して阻害抗体が生成しないことを示す。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、幹細胞（例えば、造血幹細胞）を標的とする遺伝子療法のための組成物および方法を提供する。本明細書に記載される組成物および方法は様々な疾患および症状（例えば、血小板が仲介する障害）の治療に用いられる。

本発明のいくつかの実施形態は血友病および他の血小板疾患の治療を用いて説明するが、本発明は血友病の治療に限定されない。いくつかの実施形態では、組成物および方法はインビボまたはエクスビボでの遺伝子療法を含む。例えば、いくつかの実施形態では、造血幹細胞を動員し、外来遺伝子（例えば、凝固因子、血小板機能に関連する血小板タンパク質、血栓性障害のための抗血栓剤ならびに発癌性障害のための抗血管新生剤および抗腫瘍剤）の発現を血小板に特異的に標的化するエクスビボでベクターを標的化し、改変造血幹細胞を再導入する。

Ｉ．ベクター
本発明は特定の標的化ベクターまたは発現カセットに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、発現カセットは、細胞（例えば、血小板）特異性のプロモーターと作動可能に連結した目的外来遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝子発現標的化分子または遺伝子発現シグナル分子および発現エンハンサーをさらに含む。図７、８および１０に本発明の実施形態に有用な発現カセットおよびベクターを例示する。例示的なベクター構成要素を以下に記載する。

Ａ．プロモーター
いくつかの実施形態では、ベクターは、特定の細胞型に遺伝子発現を指示するプロモーターを含む。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは血小板特異的プロモーターである。本発明は、特定の血小板特異的プロモーターに限定されない。いくつかの実施形態では、短縮されたインテグリンαＩＩｂ遺伝子（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーターを用いる。例示的なプロモーターとしては、特に限定されないが、巨核球において高レベルの遺伝子転写のための「ＥＴＳ」および「ＧＡＴＡ」エレメントをコードする−１２１８、−８８９および−６７３ＩＴＧＡ２Ｂプロモーターならびに他の造血細胞系列において遺伝子転写を抑制するリプレッサー領域を含む（配列番号２１、２２、２３および２５；図８および１０）。

ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列は、１９８８年に、Ｇｅｒａｒｄ
Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ博士を筆頭とするフランスのグループによって初めて明らかにされた（Ｐｒａｎｄｉｎｉ ＭＨ，Ｄｅｎａｒｉｅｒ Ｅ，Ｆｒａｃｈｅｔ Ｐ，Ｕｚａｎ Ｇ，Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ Ｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５’ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９８８，１５６（１）：５９５−６０１）。図７は、ＩＴＧＡ２Ｂプロモーターの構造領域を示す。いくつかの実施形態では、このプロモーターのフラグメント（例えば、１２１８，−８８９および−６７３）を用いる。いくつかの実施形態では、−６７３は血小板に特異的な導入遺伝子の発現を駆動するために不可欠な全ての調節エレメントを含む。１９９３年に、研究者らは遺伝子プロモーターに関する研究を行い、転写因子ＧＡＴＡ−１が、ＩＴＧＡ２Ｂに確認されるＧＡＴＡ−１結合部位として機能する少なくとも３つの領域、おそらくは第四の領域を有する巨核球における高レベルの遺伝子発現に重要であることを明らかにした（Ｍａｒｔｉｎ Ｆ，Ｐｒａｎｄｉｎｉ ＭＨ，Ｔｈｅｖｅｎｏｎ Ｄ，Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ Ｇ，Ｕｚａｎ Ｇ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＧＡＴＡ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９３，２６８（２９）：２１６０６−２１６１２）。次いで、高レベルの導入遺伝子発現を生じさせるために協働すると信じられるＩＴＧＡ２Ｂに結合する別の転写因子Ｅｔｓの３個のコンセンサス配列が発見された（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄｅｌ Ｖ，Ｇｈｙｓｄａｅｌ Ｊ，Ｍｉｇｎｏｔｔｅ Ｖ，Ｒａｈｕｅｌ Ｃ，Ｒｏｍｅｏ ＰＨ．ＧＡＴＡ ａｎｄ Ｅｔｓ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
１９９３，１３（１）：６６８−６７６）。マウスＩＴＧＡ２Ｂプロモーターがクローン化され、ヒトＩＴＧＡ２Ｂプロモーター、特に転写因子コンセンサス結合配列が同定された領域において、ヌクレオチド配列相同性が極めて高いことが明らかにされた（Ｄｅｎａｒｉｅｒ Ｅ，Ｍａｒｔｉｎ Ｆ，Ｍａｒｔｉｎｅａｕ Ｓ，Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ Ｇ．ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＧＰＩＩｂ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９３，１９５（３）：１３６０−１３６４）。さらに、遺伝子プロモーターを解析することにより、遺伝子プロ−モーターが他の造血系列で導入遺伝子転写を駆動することを妨げるために、ＩＴＧＡ２Ｂの−１３９〜−６３の領域が保持されていなければならず、この領域がリプレッサーを標識することが明らかになった（Ｐｒａｎｄｉｎｉ ＭＨ，Ｍａｒｔｉｎ Ｆ，Ｔｈｅｖｅｎｏｎ Ｄ，Ｕｚａｎ Ｇ．Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ ｇｅｎｅ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８（６）：２０６２−２０７０）。最後に、プロモーターが最適な血小板特異的遺伝子の転写に不可欠な三次元構造を形成する際に他のエレメントとともにＥｔｓと協働するのに重要であると考えられている、Ｓｐ１の結合部位がＩＴＧＡ２Ｂにおいて同定された（Ｂｌｏｃｋ ＫＬ，Ｓｈｏｕ Ｙ，Ｐｏｎｃｚ Ｍ．Ａｎ Ｅｔｓ／Ｓｐ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｌｐｈａ ＩＩｂ ｇｅｎｅ ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ Ｓｐ１
ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｉｓ ＴＡＴＡ−ｌｅｓｓ ｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８（６）：２０７１−２０８０）。

本発明は配列番号２１〜２３に記載されるＩＴＧＡ２Ｂプロモーターに限定されない。本発明の実施形態では、本明細書に記載されるフラグメント、部分およびフラグメントの組合せを予定する。いくつかの実施形態では、フラグメントは完全長ＩＴＧＡ２Ｂプロモーターよりも短く（例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ以上短く）、かつ所望の活性（例えば、細胞特異的発現を駆動して所望の効果、例えば疾患または症状の徴候または症状の軽減を誘発する能力）を保持する。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号２１、２２および２３に記載されるＩＴＧＡ２Ｂフラグメントまたは配列番号２１、２２および２３よりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチドもしくはそれ以上大きいもしくは小さい配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号２１よりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ以上小さいフラグメントを用いる。いくつかの実施形態では、配列番号２３よりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチドまたはそれ以上大きいフラグメントを用いる。

いくつかの実施形態では、プロモーター活性を保持する配列番号２１、２２また２３の不連続なフラグメントを用いる。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号２１、２２または２３の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチドを用いる。

いくつかの実施形態では、プロモーターフラグメントは、プロモーター活性に有用な１つ以上のエレメントを含む。例としては、特に限定されないが、ＧＡＴＡエレメント（例えば、ＧＡＴＡ５４またはＧＡＴＡ４５４）、ｓＰ１エレメント、Ｅｔｓ３５エレメントなどが挙げられる（例えば、それぞれその全体が参照による本明細書に組み込まれる、Ｂｌｏｃｋら，Ｂｌｏｏｄ １９９４ ８４：３３８５−３３９３；Ｐｒａｎｄｉｎｉら，Ｂｌｏｏｄ １９９６ ８８：２０６２−２０７０；Ｂｌｏｃｋら，Ｂｌｏｏｄ １９９６ ８８：２０７１−２０８０；およびＤｏｕｂｅｉｋｏｖｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４３００−２４３０７，１９９７を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、発現ベクターのクローン化および構築を支援するために、プロモーターの５’末端に制限酵素部位を付加して改変する。例えば、いくつかの実施形態では、５’末端の１，２，３または４ヌクレオチドは、制限酵素部位を付加するために野生型配列または本明細書に開示されるフラグメントから改変する。

いくつかの実施形態では、フラグメントは、配列番号２１、２２または２３にみられるプロモーター配列を含むか、実質的にこれよりなるか、これよりなるものである。

Ｂ．異種遺伝子
本発明は特定の外来遺伝子に限定されない。血友病を治療する実施形態では、外来遺伝子は一般に凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および／または第ＩＸ因子）である。ヒト第ＶＩＩＩ因子はアクセッション番号ＮＭ＿０００１３２．３であり、ヒト第ＩＸ因子はアクセッション番号ＮＭ＿０００１３３．３である。

他の血小板に関連する症状の治療には他の外来遺伝子を用いてもよい。いくつかの実施形態では、血小板関連障害以外の疾患の治療（例えば、血小板を用いて、抗腫瘍物質、すなわち固形腫瘍を縮小させる「ＩＬ−２４」および深部静脈血栓症の場合などの血餅部位で放出させる抗血栓物質を標的放出するために、血小板を用いる癌治療）に有用な外来遺伝子を用いる。

Ｃ．標的化因子およびエンハンサー
いくつかの実施形態では、発現カセットは、血小板の特定の部分構造内の発現を標的化する標的化因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＶＷＦに加えて、細胞顆粒区画、特に、ともに細胞が活性化されると分泌される内皮細胞の天然の貯蔵部分構造「バイベル・パラーデ小体」および血小板α顆粒にタンパク質を貯蔵する証明された能力を有するペプチドと融合した組換えタンパク質を輸送することができることが見いだされているシグナル配列ペプチドの最小限のアミノ酸配列をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＪＢら，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ＦＶＩＩＩ ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ｓｔｏｒａｇｅ Ｇｒａｎｕｌｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，６１３−６２４（１９９８）；Ｈａｂｅｒｉｃｈｔｅｒ ＳＬ，Ｊａｃｏｂｉ Ｐ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＲＲ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ
ｉｎ ｔｈｅ ＶＷＦ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ＶＷＦ ｔｈａｔ ｅｎａｂｌｅ ｎｏｒｍａｌ ＶＷＦ ｓｔｏｒａｇｅ．Ｂｌｏｏｄ ２００３，１０１（４）：１３８４−１３９１およびＨａｂｅｒｉｃｈｔｅｒら，Ｔｈｅ Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＷＦｐｐ）Ｔｒａｆｆｉｃｓ ａｎ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ Ｓｔｏｒａｇｅ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓ Ｂｉｏｌ．２２，９２１ ９２６（２００２）に記載されるように、発現構築物は、α顆粒区画への分子の直接輸送を促進するフォン・ヴィルブランド因子プロペプチドシグナルペプチドおよびＤ２ドメイン（ＳＰＤ２）をコードする核酸を含む。

ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターの６７３ｂｐフラグメントとＶＷＦ／ＳＰＤ２遺伝子とを含む発現カセットの例を図７に示す（配列番号２４）。本発明の実施形態の組成物および方法で使用するためには、所望の活性を保持するこれらの配列の変異体が特異的に考慮される。

いくつかの実施形態では、構築物はプロモーター／シグナル伝達カセットと目的外来遺伝子との間に発現エンハンサー（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））を含む。このエレメントは、その構造が細胞内での転写物の分解を阻害することにより、ＷＰＲＥが存在しない遺伝子導入ベクターよりも多く治療用タンパク質を合成することが可能であるため、いくつかの遺伝子導入戦略に用いられている。

Ｄ．ベクター骨格
本発明は特定の発現ベクターに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは自己不活性化である。いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。表２に例示的な適切なベクターをまとめて記載する。

レトロウイルス（レトロウイルス科）はスプーマウイルス（例えば、ヒト泡沫状ウイルス）、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒツジビスナウイルス）およびオンコウイルス（例えば、ＭＬＶ、ラウス肉腫ウイルス）の３つのグループに分けられる。

レトロウイルスは、外被に包まれた（例えば、宿主細胞由来の脂質二重膜に囲まれた）一本鎖ＲＮＡウイルスであり、動物細胞に感染する。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのＲＮＡゲノムが二本鎖の直鎖状ＤＮＡ形態に変換される（例えば、逆転写される）。次いで、このＤＮＡ形態のウイルスがプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに組み込まれる。プロウイルスは付加的にウイルスゲノムおよびウイルスｍＲＮＡ産生の鋳型となる。感染細胞の表面から２つのゲノムＲＮＡのコピーを含む成熟ウイルス粒子が出芽する。このウイルス粒子はゲノムＲＮＡ、逆転写酵素およびｐｏｌ遺伝子産物をウイルスキャプシド（ウイルスｇａｇ遺伝子産物が含まれている）内に含み、このキャプシドはウイルス外被糖タンパク質（膜結合タンパク質とも呼ばれる）を含む宿主細胞に由来する脂質二重膜で囲まれている。

多数のレトロウイルスのゲノムの組織化は、レトロウイルスベクターを作製するために、レトロウイルスゲノムを適応させる目的遺伝子を運ぶ組換えレトロウイルスベクターの作製は通常、２段階で実施される。最初に、目的遺伝子の効率的な発現に必要な配列（ウイルスの長い末端反復配列［ＬＴＲ］または内部プロモーター／エンハンサーおよび関連するスプライシングシグナルによってもたらされ得るプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントを含む）を含み、ウイルスＲＮＡを効率的に感染性ビリオンにパッケージングするのに必要な配列（例えば、パッケージングシグナル［Ｐｓｉ］、ｔＲＮＡプライマー結合部位［−ＰＢＳ］、逆転写に必要な３’制御配列［＋ＰＢＳ］およびウイルスＬＴＲ）を含むレトロウイルスベクターに目的遺伝子を挿入する。ＬＴＲには、ウイルスゲノムＲＮＡ、逆転写酵素およびインテグラーゼの機能を連動させるのに必要な配列と、ウイルス粒子にパッケージングされたゲノムＲＮＡの発現の指令に関与する配列とを含む。安全上の理由から、多くの組換えレトロウイルスベクターにはウイルス複製に不可欠な遺伝子の機能的コピーが欠損しており（これらの不可欠な遺伝子は削除されているか、その機能が停止している）、得られたウイルスを複製欠損性であると言う。

次に、組換えベクターの構築後、ベクターＤＮＡをパッケージング細胞系に導入する。パッケージング細胞系により、所望の宿主範囲を有するウイルス粒子にウイルスゲノムＲＮＡをパッケージングするためにトランスで必要なウイルスタンパク質（例えば、ウイルスがコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質）が供給される。宿主範囲は、ウイルス粒子表面に発現する外被遺伝子産物のタイプによって部分的にコントロールされる。パッケージング細胞系に同種指向性、両種指向性または異種指向性の外被遺伝子産物が発現させ得る。あるいは、パッケージング細胞系にウイルス外被（ｅｎｖ）タンパク質をコードする配列を欠損させてもよい。この場合、パッケージング細胞は、膜結合タンパク質（例えば、ｅｎｖタンパク質）が欠如した粒子にウイルスゲノムをパッケージングする。ウイルスの細胞内への侵入を許す膜結合タンパク質を含むウイルス粒子を作製するには、レトロウイルス配列を含むパッケージング細胞に膜結合タンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ］のＧタンパク質）をコードする配列をトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトしたパッケージング細胞により、トランスフェクトしたパッケージング細胞系が発現する膜結合タンパク質を含んだウイルス粒子が産生される。別のウイルスの外被タンパク質によってキャプシド形成したウイルスに由来するウイルスゲノムＲＮＡを含むこのようなウイルス粒子を偽型ウイルス粒子と言う。

組換えレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿またはＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、核酸のエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの他の技術よりも、細胞に遺伝子を導入するために効率的な手段を提供する。ウイルス導入の効率は部分的には、核酸の導入が受容体介在性の過程である（すなわち、ウイルスが、感染する細胞の表面の特異的な受容体タンパク質と結合する）ことによるものであると考えられている。さらに、細胞内のウイルスによって導入された核酸は、ウイルスを用いて導入されなかった核酸の組込みとは対照的に制御された方法で組み込まれる；すなわち、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿などの他の手段によって導入された核酸は再編成および分解を受ける。

よく用いられる組換えレトロウイルスベクターは両種指向性のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するものである（ＭｉｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２８９５［１９８６］）。ＭｏＭＬＶ系には利点がいくつかある：１）この特異的レトロウイルスは多数の様々な細胞型に感染することができ、 ２）組換えＭｏＭＬＶウイルス粒子を作製するために、確立されたパッケージング細胞系を用いることができ、３）導入された遺伝子は標的細胞の染色体に恒久的に組み込まれる。この確立されたＭｏＭＬＶベクター系は、レトロウイルス配列のごく一部分（ウイルスの長い末端反復配列すなわち「ＬＴＲ」およびパッケージングすなわち「ｐｓｉ」シグナル）を含むＤＮＡベクターと、パッケージング細胞系とを含むものである。導入する遺伝子はＤＮＡベクターに挿入される。ＤＮＡベクター上に存在するウイルス配列は、ベクターＲＮＡのウイルス粒子内への挿入またはパッケージングおよび挿入した遺伝子の発現に必要なシグナルを供給する。パッケージング細胞系は、粒子の組立てに必要なウイルスタンパク質を供給する（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０［１９８８］）。

このような利点があるにもかかわらず、ＭｏＭＬＶをベースとする既存のレトロウイルスベクターにはいくつかの固有の問題点によって制限を受ける：１）同レトロウイルスベクターは非分裂細胞には感染せず（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：４２３９［１９９２］）、２）低力価の組換えウイルスを産生し（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎ．，７：９８０［１９８９］；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５［１９９２］）、３）ある特定の細胞型（例えば、ヒトリンパ球）には低効率で感染する（Ａｄａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８９８１［１９９２］）。ＭｏＭＬＶベースのベクターに伴う低力価は、少なくとも部分的にはウイルスがコードするタンパク質の不安定さに起因する。物理的手段（例えば、超遠心分離および限外ろ過）によりレトロウイルスストックを濃縮すると、感染性ウイルスが大幅に失われる。

よく用いられるその他のレトロベクターは、特に限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を含むレンチウイルスに由来する。レンチウイルスベクターには非複製細胞に感染することができる利点がある。

レトロベクターによる低力価とある特定の細胞型に対する非効率的な感染は、膜結合タンパク質としてＶＳＶのＧタンパク質を含む偽型レトロウイルスベクターを使用することによって克服される。細胞内に侵入するために特異的な細胞表面タンパク質受容体と結合するレトロウイルス外被タンパク質とは異なり、ＶＳＶ Ｇタンパク質は細胞膜のリン脂質成分と相互作用する（Ｍａｓｔｒｏｍａｒｉｎｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：２３５９［１９７７］）。ＶＳＶの細胞内への侵入が特異的タンパク質受容体の存在に依存しないため、ＶＳＶは宿主範囲が極めて広い。ＶＳＶ Ｇタンパク質を有する偽型レトロウイルスベクターは、ＶＳＶに特徴的な宿主範囲が変化している（すなわち、偽型レトロウイルスベクターはほとんどあらゆる脊椎動物種、無脊椎動物種および昆虫種の細胞に感染することができる）。重要なことは、ＶＳＶ Ｇ−偽型レトロウイルスベクターは、感染力をあまり失うことなく、超遠心分離によって２０００倍以上に濃縮することができる点である（Ｂｕｒｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８０３３［１９９３］）。

ＶＳＶ Ｇタンパク質はほかにも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとする偽型レトロウイルスベクターにも用いられる（Ｎａｌｄｉｎｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３［１９９６］）。このように、ＶＳＶ Ｇタンパク質は様々な偽型レトロウイルスベクターの作製に使用することができ、ＭｏＭＬＶをベースとするベクターに限定されない。

本発明は、ウイルスＧタンパク質をウイルス粒子内の異種膜結合タンパク質として使用する場合には、ＶＳＶ Ｇタンパク質の使用に限定されない。ラブドウイルス科の他のメンバーに由来する他のＧタンパク質をコードする配列を使用してもよく；多数のラブドウイルスＧタンパク質をコードする配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。

感染時にレシピエント細胞が反復している（すなわち、分裂している）場合にのみ、レトロウイルスの大部分は、二本鎖の直鎖状形態のウイルス（プロウイルス）をレシピエント細胞のゲノムに導入する、または組み込むことができる。分裂細胞のみにもっぱら、またはより効率的に感染するレトロウイルスとしては、ＭＬＶ、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびその他のレンチウイルスベクターが挙げられる。

ＭＬＶウイルスＤＮＡの組込みは宿主細胞の有糸分裂の進行に依存することが示されており、この有糸分裂への依存はウイルス組込み複合体が核内に侵入するには核膜の破壊が必要であることを反映していると仮定されている（Ｒｏｅら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２０９９［１９９３］）。しかし、分裂中期で停止している細胞には組込みが起こらないことから、核膜の破壊のみではウイルス組込みを許容するのに十分ではない可能性があり、ゲノムＤＮＡの凝縮状態など追加要件の可能性がある（Ｒｏｅら，上記）。

本発明はレトロウイルスベクターに限定されない。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。このようなベクターとしては、特に限定されないが、以下のようなベクターが挙げられる：１）細菌−−ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３ ３、ｐＫＫ２３３ ３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；および２）真核生物−−ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。宿主内で複製し生存できる限り、他のどのようなプラスミドまたはベクターを使用してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、本明細書に記載される発現カセットとともに、複製起点、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列ならびに５’隣接非転写配列を含む。他の実施形態では、ＳＶ４０のスプライスに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を、非転写遺伝子エレメントを供給するために使用してもよい。

ＩＩ．治療方法
いくつかの実施形態では、本発明は幹細胞（例えば、造血幹細胞または癌幹細胞）の遺伝子操作ためのシステムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を血小板機能に関連する様々な障害（例えば、血友病および下の表３に記載される障害）の治療への使用を見いだす。

通常、持続的な出血事象をもたらす、血小板の膜、細胞質および顆粒タンパク質の分子遺伝学的欠損により特徴付けられるいくつかの出血性障害がある。それぞれの障害はまれである、１，０００，０００人に１人にみられるもの（例えば、グランツマン血小板無力症）もあるが、Ｗｉｌｃｏｘ，Ｄ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ ＩＩ，Ｇ．Ｃ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ ｔｈｒｏｍｂａｓｔｈｅｎｉａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１：２３００−２３１１，（２００３）ならびにＰｌａｔｅｌｅｔｓ，第２版，Ａ．Ｄ．Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７１：１３１３−１３２５（２００７）および第３版，Ｃｈａｐｔｅｒ ６４：近刊（２０１２）のＷｉｌｃｏｘ，Ｄ．Ａ．，Ｗｈｉｔｅ ＩＩ，Ｇ．Ｃ：Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓに記載されているように、遺伝性血小板異常全体でみると世界で２０，０００人に１人にみられ、集団的に起こる。遺伝性血小板異常に加え、治療剤を血小板の表面、細胞質または顆粒に標的化することを目的とした造血幹細胞遺伝子治療は、他の止血、血栓症、免疫応答および癌の障害を修正する戦略として用いることを見いだす。

いくつかの実施形態では、治療方法はエクスビボの方法であり、治療を必要とする動物（例えば、ヒト）から自家造血幹細胞を採取し、本明細書に記載されるベクターの１つを用いて改変し、元のドナーに再導入する。このような自家法により、ドナー凝固因子の注入によって起こり得る自己免疫または拒絶反応のリスクを低減し、またエクスビボでの形質導入を造血幹細胞に限定することを許容する。

造血幹細胞のエクスビボ改変の例示的な方法がＡｉｕｔｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８６５（２０１３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に記載されている。例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、末梢血中に末梢血幹細胞を動員するためにサイトカインを投与する段階；ＣＤ３４＋細胞に対してアフェレーシスおよび磁気ビーズによる選別を実施する段階；例えばブルスルファンおよび／またはフルダラビンなどのその他の薬剤を用いて前処置を実施する段階；ならびにこれを患者に再導入する前に幹細胞を改変するためにウイルス（例えば、レンチウイルス）遺伝子導入ベクターを用いる段階を含む。

いくつかの実施形態では、サイトカインまたはその他の動員剤を投与して造血幹細胞を動員する（例えば、Ｆｕら，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．２０００ Ｄｅｃ；１４（４）：２０５−１８および米国特許第７４１７０２６号を参照されたい；両文献はそれぞれ、動員プロトコルの考察に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が、その他の適切なプロトコルを用いてもよい。

例えば、いくつかの実施形態では、動員に用いるサイトカインとしては、特に限定されないが、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、Ａｍｇｅｎ社のＦＤＡ承認剤Ｎｅｕｐｏｇｅｎとしても知られる顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数の薬剤の逐次投与または同時投与を含む。

動員に用いる薬剤の適切な用量範囲は多様であるが、一般に、化合物を約０．１μｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲；好ましくは約１μｇ／ｋｇ体重〜３００μｇ／ｋｇ体重の範囲；より好ましくは約１０μｇ／ｋｇ体重〜１００μｇ／ｋｇ体重の範囲で投与する。したがって、典型的な７０ｋｇのヒトの対象では、用量範囲は約０．７μｇ〜３５０ｍｇ；好ましくは約７００μｇ〜２１ｍｇ；最も好ましくは約７００μｇ〜７ｍｇである。化合物を経口的にまたは経皮的に投与する場合、用量が、例えば静脈内投与よりも高いものとなり得る。化合物は、単回ボーラス投与、静脈内もしくは経皮投与などでの緩徐投与または複数回投与で投与することができる。

投与する活性化合物の量は当業者の裁量に応じて変更することができる。レシピエントに投与する活性化合物の量は、幹細胞の動員に関して上記の範囲内にある。しかし、このような量の投与は、幹細胞増強療法の分野の臨床医が定める基準に応じて変更される。

動員したのち、最近ＦＤＡから臨床使用の承認を受けたＭｉｌｔｅｎｙｉ社のａｕｔｏｍａｃｓシステム（２５〜４５ｋｇの大型動物、イヌ用）およびＭｉｌｔｅｎｙｉ社のＣｌｉｎｉｍａｃｓシステム（ヒト用）を用いて、免疫磁気ビーズにより低分子量の単核細胞からＣＤ３４＋末梢血幹細胞（ＰＢＣ）を単離する。本明細書に記載されるベクターを用いて、このＣＤ３４＋ＰＢＣを遺伝子改変し、自家幹細胞移植によって必要とされる対象に再導入する。いくつかの実施形態では、出血の発症を長期間予防するために、単回治療を用いる。血友病を治療するいくつかの実施形態では、出血エピソードを予防するために治療を定期的に（例えば、週１回、月１回、年１回、２年、３年、４年、５年またはそれ以上に１回など）実施する。いくつかの実施形態では、異常な出血エピソードが認められる場合（例えば、事故後、術前または術後など）に限り治療を実施する。いくつかの実施形態では、異常な出血エピソードが認められる場合、維持療法を別の治療法と組み合わせて実施する。

〔実施例〕
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を詳細に説明するために記載するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。

〔実施例１〕
材料および方法
細胞系
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からヒト形質転換細胞系を入手し、前巨核球（ＨＥＬ巨核球形質転換細胞系）（Ｂｒａｙ，Ｐ．Ｆ．ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８０，１８１２−１８１７．（１９８７）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｔ細胞リンパ腫（ＫＴ１）（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１，４６１５−４６１９（１９８６））、Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）（Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８，８５２−８５８，２００８．０１．０３７（２００８））、赤白血病（Ｋ５６２）（Ｇａｕｗｅｒｋｙ，Ｃ．およびＧｏｌｄｅ，Ｄ．Ｗ．Ｂｌｏｏｄ ５６，８８６−８９１（１９８０））および上皮（ＨｅＬａ）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｎ．ら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８９，４７４−４８３（１９６０））の細胞系に関して記載されている条件下で増殖させた。

ルシフェラーゼレポーター遺伝子プロモーターベクター
ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーター構築物：ヒト全巨核球細胞系Ｄａｍｉ，４９からゲノムＤＮＡを単離し、ＩＴＧＡ２Ｂのセンスプライマー「−１２１８」

「−１１９８」（配列番号１）（太字）、ＩＴＧＡ２Ｂの「−８８９」

「−８７２」（配列番号２）（太字）またはＩＴＧＡ２Ｂの「−６７３」

「−６５４」（配列番号３）（太字）と、ルシフェラーゼｐＧＬ３−ＢＡＳＩＣのヌクレオチド＋９９〜＋８６およびＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターのヌクレオチド＋３０〜＋１５（太字）をコードするアンチセンスプライマー

（配列番号４）とを用いて、ＰＣＲによりヒトＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターフラグメントを増幅した。ヌクレオチド配列分析により構築物の正確な同一性を確認した。

ｐＣＭＶＬｕｃ：ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のサイトメガロウイルス組織非特異的遺伝子プロモーター（８７８ｂｐ）のＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化物をｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に連結した。この構築物を全細胞型での高レベルの遺伝子発現の陽性対照とし、各細胞系に任意のレベルで１００％ルシフェラーゼ活性を割り当てた（図１）。

ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃＬｕｃ：ルシフェラーゼ遺伝子転写を駆動する遺伝子プロモーターを欠くため、０％ルシフェラーゼ活性の陰性対照構築物とした（Ｐｒｏｍｅｇａ）（図１）。

ｐＣＭＶｎｌａｃ：細胞系を、ｐＩＴＧＡ２ＢＬｕｃ＋構築物のうちの１つおよび導入遺伝子発現を正規化するためのβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子をコードするｐＣＭＶｎｌａｃと共トランスフェクトした（Ｗｉｌｃｏｘら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９９，９６（１７）：９６５４−９６５９）。

ルシフェラーゼ遺伝子プロモーターレポーターアッセイ
細胞系（２×１０^７個）にＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーター構築物（−１２１８、−８８９、−６７３）（図１Ａ）またはホタルルシフェラーゼをコードする陽性（ＣＭＶ）もしくは陰性（Ｂａｓｉｃ）対照のいずれか（２０μｇ）と、β−ガラクトシダーゼ．４９をコードするｐＣＭＶｎｌａｃ（２０μｇ）とを共トランスフェクトした。簡単にいうと、共トランスフェクションの４８時間後、細胞を洗浄して回収し、溶解液を調製し、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、−８０℃で凍結した。Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｍｏｄｅｌ２０ルミノメーターによりルシフェラーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼの基質である、クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトフラノシド（ｇａｌａｃｔｏｐｈｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＣＰＲＧ）による発色変化を測定する高感度ＥＬＩＳＡ酵素アッセイにより各細胞系の一過性の導入遺伝子発現を正規化するために、β−ガラクトシダーゼ活性を検出した（Ｅｕｓｔｉｃｅ ＤＣら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１１（６）：７３９−７４０，７４２−７３３）。各々の細胞系のトランスフェクション効率を明らかにするために、各構築物についてルシフェラーゼ／ＣＰＲＧ Ｖｍａｘ値の相対光量単位（ＲＬＵ）の平均値を比較してルシフェラーゼ活性の百分率を求めた。図１Ａに示されるように、ｐＣＭＶＬｕｃのＲＬＵに１００％の値を任意に割り当て、その値に基づいて各ベクターについて全ての他の結果を計算した。

ＩＴＧＡ２Ｂプロモーターによって駆動されるヒトＢＤＤＦＶＩＩＩのレンチウイルスベクター
ＩＴＧＡ２Ｂ−（Ｍ）ＷＰＴＳ遺伝子導入ベクターはＨＩＶ１型レンチウイルスベクター（Ｄ．Ｔｒｏｎｏ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に由来する。５１ ｐ−８８９ＩＴＧＡ２Ｂ−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクター（図１Ｂ）はヒトＩＴＧＡ２Ｂプロモーターの−８８９〜＋３０ヌクレオチドフラグメントおよびヒトＢＤＤＦＶＩＩＩ分子をコードする。１６ ｐ−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ−ＶＷＦＳＰＤ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクター（図１Ｃ）はヒトＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターのヌクレオチド−６７３〜＋３０のフラグメントと、これに続くヒトフォン・ヴィルブランド因子プロペプチドのフラグメント（Ｄ２ドメイン（１，１９９ｂｐ）と連結した５４０アミノ酸のＶＷＦシグナルペプチド（ＳＰ；６６ｂｐ）をコードするＶＷＦｐｐ）と、ＳＰＤ２ペプチドを用いてヒトＢＤＤＦＶＩＩＩを血小板α顆粒まで輸送するハイブリッド分子の巨核球特異的転写を可能にするヒトＢＤＤＦＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡとをコードする。ＳＰをコードする２２個のｃＤＮＡは、順方向プライマー（Ｐ）１（５’ＧＴＴＡＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＡ３’）（配列番号５）および逆方向Ｐ２（５’ＡＡＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴ３’）（配列番号６）を用いてＰＣＲにより増幅され、順方向Ｐ３（５’ＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣ３’）（配列番号７）および逆方向Ｐ４（５’ＣＧＴＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＧ３’）（配列番号８）を用いてＰＣＲにより増幅したＤ２と連結した。ネステッドＰＣＲにより、ＩＴＧＡ２ＢプロモーターおよびＶＷＦＳＰＤ２を、Ｐ５（５’ＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡ３’）（配列番号９）およびＰ４と連結した。ｐ−８８９ＩＴＧＡ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳは、ＶＷＦＤ２に直接連結するｃＤＮＡを合成するために、順方向Ｐ７（５’ＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴ３’）（配列番号１０）および逆方向Ｐ８（５’ＡＣＧＣＧＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＴＡ３’）（配列番号１１）を用いて、ＢＤＤＦＶＩＩＩのフラグメントをコードするｃＤＮＡのＰＣＲの鋳型として機能した。５’ｈＢＤＤＦＶＩＩＩ（ＢｓｍＢ１およびＭｌｕＩ）と連結した固有の制限部位−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ−ＳＰＤ２（ＣｌａＩおよびＢｓｍＢＩ）を３’ＢＤＤＦＶＩＩＩ（ＭｌｕＩおよびＳｐｅｌ）とともに用いて、全ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中でクローン化した。全フラグメントをｐＷＰＴＳレンチウイルスベクター中でクローン化し、ヌクレオチド配列分析により正確な同一性を確認した。３プラスミド一過性共トランスフェクションにより組換えビリオンが生じた後、上清を収集し、遠心分離により５００倍に濃縮し、使用するまで−８０ｏＣで保管した（Ｆａｎｇ Ｊら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１１，１０８（２３）：９５８３−９５８８）。ＲＴ−ＰＣＲによりビリオンの力価を決定した（Ｌｉｚｅｅ Ｇら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３，１４（６）：４９７−５０７）。ストック内に複製能のあるビリオンが存在しないことをマーカーレスキューアッセイで確認した（Ｗｉｌｃｏｘら，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５（１２）：３６４５−３６５２）。

イヌ
ともに米国実験動物飼育公認協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）の公認施設であるノースカロライナ大学およびウィスコンシン医科大学の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された、血友病Ａに罹患したＦＶＩＩＩ欠損イヌを用いたサイトカイン動員ＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣの遺伝子導入および自家移植に関する研究（ノースカロライナ大学、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ、ＮＣ）（Ｌｏｚｉｅｒ ＪＮら，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９（２０）：１２９９１−１２９９６）を実施した。

イヌＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣの単離、形質導入、移植
１９匹のＦＶＩＩＩ欠損成体雄イヌ（１．２５歳、４．２５歳および６．５歳）にイヌ組換え顆粒球コロニー刺激因子（ｃｒＧ−ＣＳＦ；１０μｇ／（ｋｇ・日）および幹細胞因子（ｃｒＳＣＦ；５μｇ／（ｋｇ・日））（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）を連日注射した。３日目に、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ
Ｓｅｐａｒａｔｏｒを用いてＧ−ＰＢＣを収集した。Ｆｉｃｏ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により単核Ｇ−ＰＢＣを単離した。Ａｕｔｏｍａｃｓ磁気細胞分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によりビオチンコンジュゲート１Ｈ６Ａｂ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｎａｓｈ、フレッド・ハッチンソン研究所、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）および抗ビオチン免疫磁気ビーズ（１：５希釈）を用いてＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣを選別した。ＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣを−８８９ＩＴＧＡ２Ｂ−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳまたは−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ−ＶＷＦＳＰＤ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクターで形質導入した。簡単に言うと、２０μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）でコートした６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に１ウェル当たり４×１０６個の細胞を播き、１０％ＦＣＳ、ｒｈＩＬ−３、ｒｃａＩＬ−６、ｒｃａＳＣＦ、ｒｈＴＰＯおよびｒｈｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンドを含有するＸ−Ｖｉｖｏ １０中、１細胞当たり１．０×１０^４個のＩＴＧＡ２Ｂ−ＦＶＩＩＩレンチビリオンとインキュベートした。骨髄非破壊的用量５〜１０ｍｇ／ｋｇのＢｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）で前処置した各自家移植レシピエントの橈側皮静脈内に１ｋｇ当たり約３×１０６個のＦＶＩＩＩ形質導入ＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣと、２×１０８個のＣＤ３４（−）Ｇ−ＰＢＣとを注入した。移植後約９０日間、シクロスポリン（Ｇｅｎｇｒａｆ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）１０ｍｇ／（ｋｇ・日）およびＭＭＦ ８ｍｇ／（ｋｇ・日）により一時的に免疫を抑制した（表１）（Ｆａｎｇら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１１，１０８（２３）：９５８３−９５８８）。

血液採取
事前に選択した時間に血液を、７．５％ＥＤＴＡ抗凝固剤を含むバキュチューブ（ｖａｃｕｔｕｂｅ）内に採取した（Ｆａｎｇら，上記）。Ｖｅｔ ＡＢＣ血液分析器（ｓｃｉｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇｕｒｎｅｅ、ＩＬ）で血液細胞を計数した。Ｆｉｃｏ／Ｌｉｔｅ（商標）（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）により血小板を単離してＰＢＳで洗浄し、免疫蛍光フローサイトメトリーまたはＦＶＩＩＩ：Ｃ活性分析に直接使用した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により製造業者の仕様書に従って白血球を単離した。

抗体
イヌＣＤ３４「１Ｈ６」（１ｍｇ／ｍｌ）に対するマウスモノクローナル一次抗体をフレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から入手した。イヌフィブリノーゲンを認識する２７ Ａ ヒツジ抗ウサギフィブリノーゲンポリクローナル一次抗体（５μｇ／ｍｌ）をＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。モノクローナル一次抗体（５〜１０μｇ／ｍｌ）、ヒトＢＤＤＦＶＩＩＩ ５３二次抗体上のエピトープを認識するＭＢＣ１０３．３および３０１．３（Ｒ．Ｒ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ ｏｆ ＷＩ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を用い、ロバ抗ヒツジＩｇＧのフラグメント（Ｈ＋Ｌ）とコンジュゲートしたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｆ（ａｂ’）２（１：１，０００希釈）とヤギ抗マウスＩｇＧのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｈ＋Ｌ）（１：５００希釈）とをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から入手した。

免疫蛍光共焦点顕微鏡法
イヌ血小板を３．７％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）緩衝ホルマリンで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍｍｏｌ／Ｌスクロース、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび３ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０中）で透過処理し、ＨＢＳＳ中２．５％の正常ヤギ血清でブロッキングした。血小板をイヌフィブリノーゲンに対するヒツジポリクローナル一次抗体およびヒトＦＶＩＩＩに対するモノクローナル一次抗体（ＭＢＣ１０３．３および３０１．３）（５μｇ／ｍｌ）と４℃で一晩インキュベートした。ロバ抗ヒツジＩｇＧの５３ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｈ＋Ｌ）を、フィブリノーゲンを検出する二次抗体（１：１，０００希釈）として使用し、２５℃で３０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８コンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｈ＋Ｌ）とコンジュゲートした二次抗体（１：５００希釈）を用いてＦＶＩＩＩの存在を検出した。血小板をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でマウントした。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０多光子共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で免疫蛍光を検出した（Ｗｉｌｃｏｘ ＤＡら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ＪＴＨ ２００３，１（１１）：２３００−２３１１）。ＦＶＩＩＩ欠損イヌから単離血小板を陰性対照として用いた。非特異的アイソタイプ対照抗体を陰性対照とした。血小板を各視野で撮影したＺ切片により画像化し、全Ｚシリーズ（１２〜２５枚の画像）を１つの積み重なった投影像にまとめた。Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ａｓｓｉｓｔａｎｔソフトウェアプログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてこの投影像を統合した。コンピュータが割り当てる色はビットマップの重なりの強度に基づくものであり、Ａｌｅｘａ４８８−蛍光色素は緑色の画素で表され、Ａｌｅｘａ５６８−蛍光色素は赤色の画素で表され、２つの蛍光色素コンジュゲート抗体の共局在は黄色の画素で表された。

免疫蛍光フローサイトメトリー
イヌ血小板を血液から単離し、ＢＤＤＦＶＩＩＩの細胞内検出用にＣｙｔｏｆｉｘ（商標）およびＰＥＲＭ／ＷＡＳＨ（商標）試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。血小板をヒトＦＶＩＩＩに対するモノクローナル一次抗体（ＭＢＣ１０３．３および３０１．３）（５μｇ／ｍｌ）と４℃で３０分間インキュベートした後、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８コンジュゲートＦ（ａｂ’）２ フラグメントとコンジュゲートした二次抗体（１：５００希釈）と４℃で３０分間インキュベートした。ＦＶＩＩＩ欠損イヌから単離した血小板を陰性対照として用いた。非特異的アイソタイプ対照抗体を陰性対照とした。細胞を収集し、Ａｃｃｕｒｉ分析ソフトウェアを用いて、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメータ（Ａｃｃｕｒｉ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ＭＩ）で分析した。

免疫標識
血小板を１．２５％グルタルアルデヒド（Ｆｌｕｋａ ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で固定し、２．３Ｍスクロース（Ｆｌｕｋａ）を注ぎ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ
ＫＦ８０凍結システム（Ｌｅｉｃａ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）で凍結させた。ＦＣ ４Ｅクライオキットアタッチメントを装着したＵｌｔｒａｃｕｔ Ｅウルトラミクロトームで約８０ｎｍの切片を作製し、コロジオンでコートしたニッケルグリッドに載せた。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでグリッドを１０分間インキュベートした後、ＦＶＩＩＩ（３０１．３）に対する一次抗体の小滴（１０μｇ／ｍｌ）上に２５℃で１時間置いた。切片を１０ｎｍ金粒子（１／１００希釈のＡｕｒｏＰｒｏｂｅ ＥＭ Ｇ１０）に吸着させたヤギ抗マウス二次抗体と１時間インキュベートした。対照には同じ種の無関係なＩｇＧを同じ濃度で使用した。

電子顕微鏡法
グリッドを酢酸ウラニルおよびオスミウムで染色し、次いでメチルセルロースに包埋した後、Ｊｅｏｌ ＪＥＭ−１０１０透過型電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ、Ｃｒｏｉｓｓｙ−ｓｕｒ−ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）により８０ＫＶで観察した。

アゴニストによる血小板活性化の誘導
循環末梢血から血小板を単離して洗浄し、血小板活性化の生理学的アゴニストで活性化した。活性化を誘導するため、既に記載されている通り、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２５μＭのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）（Ｓｉｇｍａ）、エピネフリン（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）ならびにイヌトロンビン受容体活性化ペプチド：ＰＡＲ１（ＳＦＦＬＫＮ−ＮＨ２）、ＰＡＲ３（ＴＲＦＧＡＰ−ＮＨ２）およびＰＡＲ４（ＳＦＰＧＱＰ−ＮＨ２）を含有するタイロード緩衝液（２．５×１０６／ｍｌ）に血小板を３７℃で３０分間懸濁させた（Ｆａｎｇら，上記）。陰性対照として、アゴニストを加えないタイロード緩衝液で別々のアリコートをインキュベートした。遠心分離により血小板をペレット化し、アゴニスト処理試料および陰性対照試料から上清を吸引し廃棄した。ｃｏａｔｅｓｔアッセイを用いたＦＶＩＩＩ：Ｃ活性の試験まで血小板ペレットを直ちに−８０℃で凍結した。

血液ゲノムＤＮＡ中のレンチウイルスベクターのＰＣＲ検出
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で精製したイヌ白血球から、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）を用いてＤＮＡを単離した。ｐ−８８９ＩＴＧＡ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳを陽性対照とした。順方向プライマーＰ１（５’−ＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧ−３’）および逆方向プライマーＰ２（５’−ＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’）（配列番号１２）を用いてＰＴＣ２００機器（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）でＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＰＣＲ分析を実施して、ＷＰＲＥをコードする３１８ヌクレオチドの一次産物を合成した（図１Ｂ、Ｃ）。ＷＰＲＥの３０２ｂｐ産物をコードするネスト化した順方向プライマーＰ３（５’−ＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣ−３’）（配列番号１３）および逆方向プライマーＰ４（５’−ＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡＧ−３’）（配列番号１４）により二次ＰＣＲ反応を実施した（図５Ａ）。

レンチウイルスの形質導入効率を検出するためのＲＴ−ｑＰＣＲ
ＢＩＯ−ＲＡＤ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＲＴ−ｑＰＣＲによりレンチウイルス遺伝子標識の百分率を測定した。５２ 簡単に言うと、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１２．５μｌ、濃度９００ｎＭの各プライマーおよび２００ｎＭのプローブを水２０μｌ中で混合した。次いでイヌゲノムＤＮＡ ５μｌを加え、ＰＣＲを５００Ｃで２分間、９５０Ｃで１０分間、次いで９５０Ｃで１５秒間を４０サイクル、６００Ｃで１分間にて用いた。各ＲＴ−ｑＰＣＲには、陰性対照として鋳型を使用しない対照を含めた。Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（バージョン１．０；Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて各試料の遺伝子コピー数を三重反復で分析し、導入遺伝子コピー数／ゲノムの平均値をレンチウイルスベクター陽性の末梢血細胞の百分率（形質導入効率としても知られる）に変換し、表１の表１の８列目に報告した。使用したレンチウイルスＬＴＲのプライマーおよびプローブは：順方向：５’−ＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１５）；逆方向：５’−ＴＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡ−３’（配列番号１６）；プローブ：６ＦＡＭ−ＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号１７）であった。遺伝子コピー数の内在性対照として、イヌＩＴＧＢ３遺伝子を順方向：５’−ＡＴＧＣＡＴＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴ−３’（配列番号１８）；逆方向：５’−ＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号１９）；プローブ：６ＦＡＭ−ＴＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧ−ＭＧＢＮＦＧ（配列番号２０）とともに使用した。コピー数はＴａｑＭａｎの原理に基づくものとした。関連する配列（レンチウイルスベクターＬＴＲおよびイヌＩＴＧＢ３）を含む既知濃度のプラスミド構築物の１０段階希釈を用いて、試料定量化のための標準曲線を作成した。

線形増幅による（ＬＡＭ）−ＰＣＲ
末梢血白血球から単離したゲノムＤＮＡ内のレンチウイルスベクター挿入部位の位置を特定するために、ＬＡＭ−ＰＣＲを実施した。簡単に言うと、ベクター特異的５’−ビオチン化プライマー［５’−／ビオチン／−ＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号２６）］を用いた２回の線形ＰＣＲ［９５℃で５分間；（９５℃で１分間、６０℃で４５秒間、７２℃で９０秒間）×５０；７２℃で１０ｍ］により、組み込まれたプロウイルスＬＴＲと宿主ゲノムとの間の接合点を選別し、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ［Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０］を用いて精製した。クレノウポリメラーゼおよびランダムな６塩基プライマーを用いて産物を二本鎖にし、６５℃で２時間、Ｔｓｐ５０９Ｉで消化した。非ＬＴＲ末端に方向性二本鎖リンカーオリゴを連結し、得られた産物を、ＬＴＲ特異的順方向プライマー［Ｆ１：５’−／ビオチン／−ＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号２７）；Ｆ２：５’−ＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号２８）］およびリンカーカセット特異的逆方向プライマー［Ｒ１：５’−ＧＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２９）；Ｒ２：５’−ＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＧ−３’（配列番号３０）］を用いたネステッドＰＣＲ［９５℃で５分間；（９５℃で１ｍ、６０℃で４５秒間、７２℃で９０秒間）×３５；７２℃で１０ｍ］により増幅した。ネステッドＰＣＲの巡回の間で、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを用いて産物を精製した。２％ＴＡＥアガロースゲル上で産物を可視化した。配列決定には、産物をゲル精製してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローン化し、大腸菌Ｔｏｐ１０内に形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐ−Ｘｇａｌプレート上で選択し、Ｍ１３Ｆ／Ｒを用いたコロニーＰＣＲにより増幅した。

組込み部位の機能評価
プロウイルスＬＴＲ配列を含むことが確認されたＬＡＭ−ＰＣＲの配列産物は、既知のゲノム反復およびプロウイルス的特徴をマスクした。ＵＣＳＣのＢｌａｔ（ＢＬＡＳＴのような配列比較ツール）サーバを用いて、得られた配列をイヌゲノム（ＣａｎＦａｍ ２．０、２００５年５月組立て）と比較した。９５％の類似度のゲノム内の固有の位置への配列マッピングを選択し、プロウイルスＬＴＲ配列と隣接するゲノム配列比較の基準として組込み部位を決定した。各部位について、最も近接するＲｅｆＳｅｑ遺伝子を決定し、ヒト癌オルソログのリストと比較した。

生物学的に活性なヒトＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の検出
Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ４ ＦＶＩＩＩキット（ＤｉａＰｈａｒｍａ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＯＨ）を用いて、１ｍｌ当たり１×１０^８個の血小板を含むライセートをＦＶＩＩＩ：Ｃについて試験した。１２個の上清試料の反復標本を９６ウェルマイクロタイタープレートのコートしていないウェルに入れ（２５μｌ／ウェル）、アッセイ成分（リン脂質、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子および塩化カルシウム）を加え、３７ｏＣで１０分間インキュベートした。発色因子Ｘａ基質のＳ−６７５を加え、予め３７ｏＣに設定したＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２マイクロプレートリーダーにプレートを移した。Ｓ−２６７５のＸａ因子に依存する転換は各ウェル中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量と直接相関する。４０５ｎｍのＶｍａｘを用いて血小板溶出液緩衝液で希釈した既知量の組換えヒトＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ；Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を、プロットすることにより標準曲線を作成した。速度論的ソフトウェアプログラム、ＳＯＦＴｍａｘ、ｖ．２．３４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、各反応のＶｍａｘをＦＶＩＩＩ：Ｃ活性の単位に変換した。４０５ｎｍにおける終点の読取り値によってＦＶＩＩＩ活性を測定し、４９０ｎｍにおけるバックグラウンドの読取り値を４０５ｎｍから減じた。表１および図６に記録されている測定値を用いて、平均ＦＶＩＩＩ：Ｃ Ｕ／（ｍｌ・１×１０８血小板）×９２ｍｌ血液／ｋｇ×イヌの体重（ｋｇ）×（２×１０^８血小板）／１ｍｌ血液の掛け算を実行することより、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／イヌの合計最大値を算出した。

全血凝固時間（ＷＢＣＴ）検査
ＷＢＣＴは、２８℃で２本のシリコン塗布ガラス管（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）を用いる、リー・ホワイト凝固時間の変法である（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＴＣら，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１２，１０（３）：４７４−４７６）。全血１ｍｌを採取し、各管に血液０．５ｍｌずつを分配した。タイマーを作動させた。１分後、一方の管を３０秒毎に傾け、他方の管をそのまま静置した。傾けた管に血餅が形成されたとき、第２の管を血餅が形成されるまで３０秒毎に傾けた。第２の管に完全にゲル化した血餅が形成されるまでの時間をＷＢＣＴとして記録した。Ｇ−ＰＢＣ移植の前と後に、血漿による治療を少なくとも１か月間実施していない、正常な止血性のイヌ（ＷＢＣＴが７．５〜１２．５分）１例および被験イヌ３例（Ｆ２０、Ｉ４２、Ｍ６４）から、血液を採取した。

ヒトＦＶＩＩＩに対する免疫応答を検出するためのインヒビターアッセイ
既に記載されている通りに、凝固因子ＶＩＩＩまたはＩＸのいずれかに対する阻害抗体を検出する活性部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）混合アッセイにより、インヒビターについてイヌ血漿（Ｆ２０、Ｉ４２およびＭ６４）をスクリーニングした（Ｌａｎｇｄｅｌｌ ＲＤら，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １９５３，４１（４）：６３７−６４７；Ｓａｈｕｄ ＭＡ．Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２０００，２６（２）：１９５−２０３；Ｍａｔｒａｉ Ｊら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１，５３（５）：１６９６−１７０７）。簡単に言うと、被験血漿を正常血漿と１：１で混合し３７℃で２時間インキュベートした後、標準的なａＰＴＴ試薬を用いて、このインキュベートした混合物を分析する。ヒトＦＶＩＩＩと交差反応してヒトＦＶＩＩＩを阻害する既知のベセスダインヒビター（ＢＩＵ）力価を有する血友病Ａイヌの血漿（陽性対照）と、インヒビターがみられないイヌの血漿（陰性対照）とを同時にアッセイし比較した。

結果
血小板標的化レンチウイルスベクターの設計および戦略
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、完全長ヒトＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターのフラグメントにより同程度の血小板特異的な遺伝子転写を許容することを明らかにした（図１Ａ）。３種類の異なるＩＴＧＡ２Ｂプロモーターフラグメント（−１２１８、−８８９および−６７３）は前−巨核球細胞系内でほぼ同じレベルのルシフェラーゼ活性を導いた。これに対して、他の血液細胞系列および上皮細胞系ではＩＴＧＡ２Ｂプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ活性は検出不可能であった。各ＩＴＧＡ２Ｂプロモーターは、高レベルの巨核球遺伝子転写を可能にするＥｔｓおよびＧＡＴＡ因子ならびに他の細胞系列内での発現を抑制するリプレッサー領域をコードする（Ｐｒａｎｄｉｎｉ ＭＨら，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８（６）：２０６２−２０７０）。２０ 結果として、ヒトの遺伝子治療の戦略を開発するために、最適な造血幹細胞形質導入効率および血友病Ａイヌの血小板由来ＢＤＤＦＶＩＩＩによる止血機能を改善する能力について２種類のレンチウイルス遺伝子導入ベクターを試験した。ヒトＩＴＧＡ２Ｂプロモーターの−８８９ヌクレオチドから始まるフラグメントをコードするレンチウイルスベクターで形質導入したＧ−ＰＢＣを注入した２匹のイヌは、ＢＤＤＦＶＩＩＩの巨核球特異的転写を導くことが可能であることが示された（図１Ｂ）。２１ 通常条件下では血小板にはＦＶＩＩＩが存在しないが、この方法により、組織培養したヒトＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣ、１２およびレンチウイルスベクターで形質導入し血友病Ａマウスに、移植した骨髄に由来する血小板の子孫に利用可能なＢＤＤＦＶＩＩＩを貯蔵させることに成功したことがわかった（Ｓｈｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２００７，５（２）：３５２−３６１）。ＢＤＤＦＶＩＩＩのα顆粒区画内への輸送を促進するために、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）プロペプチドシグナルペプチドおよびＤ２ドメイン（ＳＰＤ２）と融合したＢＤＤＦＶＩＩＩのハイブリッド分子の巨核球特異的発現を誘導するようにして設計した最も短いＩＴＧＡ２Ｂプロモーターのフラグメント（−６７３）をコードする新規レンチウイルスベクターで形質導入したＧ−ＰＢＣを１匹のイヌに注入した（図１Ｃ）（Ｈａｂｅｒｉｃｈｔｅｒ ＳＬら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００２，２２（６）：９２１−９２６；Ｈａｂｅｒｉｃｈｔｅｒ ＳＬら，Ｂｌｏｏｄ ２００３，１０１（４）：１３８４−１３９１）。ＶＷＦはヒト血小板の正常なα顆粒の成分であり（ただし、イヌ血小板には存在しない）（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＴＣら，Ｂｌｏｏｄ １９９３，８１（１０）：２６４４−２６５１）、ヒトおよびイヌ血漿中でＦＶＩＩＩのキャリアタンパク質としての役割を果たす（Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８９，９（３）：１２３３−１２４２）。

造血幹細胞遺伝子治療のための戦略
臨床的に意義のあるプロトコルを設計するため、イヌサイトカイン（ｃＧ−ＣＳＦおよびｃＳＣＦ）によりイヌ造血幹細胞を骨髄から末梢血中に動員し、ＧＴイヌを用いたこれまでの研究と同一の有害事象を生じさせずにＧ−ＰＢＣアフェレーシスを実施した（Ｆａｎｇら，上記）。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを用いてアフェレーシス産物から単核リンパ球を単離し、次いで、免疫磁気選択によりイヌＣＤ３４抗原陽性（ＣＤ３４＋）細胞を精製した（ＭｃＳｗｅｅｎｅｙ ＰＡら，Ｂｌｏｏｄ １９９８，９１（６）：１９７７−１９８６）。各標的細胞は、形質導入細胞のためのエクスビトロ選択もインビトロ選択も用いずに、ＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣ１個当たり約１ｘ１０４個の全ウイルス粒子を形質導入し、３匹の血友病ＡイヌにＦＶＩＩＩ形質導入ＣＤ３４＋Ｇ−ＰＢＣを体重１ｋｇ当たり約３×１０^６個注入した自家移植の条件を表１にまとめる（４列目、５列目）。新たに移植された細胞が生着するためのニッチを骨髄内に設けるために、骨髄非破壊的な移植前処置レジメンを用いた（表１、２列目）。前処置レジメンの強度は、用量が臓器に毒性となるレベルによって決定した。正常イヌモデルを用いた以前の研究では、移植前条件で致死量以下のブスルファン（造血幹細胞に対して優先的に毒性を示す薬物）を投与することによって、安定な造血キメラの同種混合ドナー／宿主を安全に確立することができることが示されている。最近の報告では、イヌ白血球接着不全症を修正するために、造血幹細胞遺伝子を導入するために１０ｍｇ／ｋｇのブスルファンを使用し（Ｂａｕｅｒ ＴＲ，Ｊｒ．ら，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００８，１４（１）：９３−９７）、次いで主要組織適合複合体が一致する骨髄移植後にミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）およびシクロスポリン（ＣＳＰ）により一時的に免疫を抑制したこと（Ｅｎｓｓｌｅ Ｊら，Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０，２１（４）：３９７−４０３）に成功したことが示されている。しかし、本研究で移植を実施した１匹目のイヌ（Ｆ２０）は、Ｇ−ＰＢＣ移植から３か月間、イヌ血漿製剤の形態のイヌ（ｃ）ＦＶＩＩＩおよび組換えｃＦＶＩＩＩの連日補給を必要としたことから、このレベルの移植前処置レジメンは血友病Ａの動物には不適切であることがわかった。Ｇ−ＰＢＣ移植後、血小板中のヒトＢＤＤＦＶＩＩＩが有意水準に達するまでイプシロン−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）も注入した。ＥＡＣＡはプラスミン−プラスミノーゲン系に有効な合成阻害剤であり、くも膜下出血、多数の原因による尿生殖器出血および血友病患者の口腔外科手術をコントロールする（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＤら，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ １９７８，５（１）：２７−４０）。比較のため、Ｇ−ＰＢＣ移植の１年前および２．５年後の、ｃＦＶＩＩＩ補給による治療を必要とした重篤な出血の発症の数を各イヌについて記録した（表１、１０列目、１１列目）（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ＧＰら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００３，３１（１２）：１３５７−１３６２）。Ｆ２０に高頻度の出血事象が観察されたことから、次の２例の移植レシピエントには低用量のブスルファンからなるより穏やかな前処置レジメン（Ｉ４２、５ｍｇ／ｋｇ；Ｍ６４、７ｍｇ／ｋｇ）を実施した。結局、３匹のイヌ全ては、血小板に容易に検出可能なヒトＢＤＤＦＶＩＩＩレベルが観察され、ｈｅｍｏｃｕｌｔ検査によりＧＩ出血がないことが示されるまで、Ｇ−ＰＢＣ移植から３か月間、一時的な免疫抑制（Ｆａｎｇら，上記）およびｃＦＶＩＩＩおよびＥＡＣＡの連日補給を標準的な移植レジメンとして実施した（Ｆａｎｇら，上記）。最終的には、Ｉ４２およびＭ６４では、移植後２．５年にわたって重度の出血の発症が認められず、ＦＶＩＩＩ補給をそれ以上必要としないことが観察された（表１、１１列目）。

血小板ＦＶＩＩＩの生物学的研究
Ｇ−ＰＢＣ移植後にＢＤＤＦＶＩＩＩが血小板で合成され貯蔵されるかどうか決定するために、免疫共焦点顕微鏡法を実施した。図２Ａに示されているのは、レンチウイルスベクターで形質導入したＧ−ＰＢＣの自家移植したイヌ１例（Ｉ４２）から単離した血小板の顕微鏡分析の結果の画像であり、図２Ａは全３例のイヌ（Ｆ２０、Ｉ４２、Ｍ６４）の分析結果を表している。血小板α顆粒の特異的マーカー、フィブリノーゲン（Ｆｇ）に点状の染色パターンがみられた（左パネル）。このほか、血小板内にヒトＢＤＤＦＶＩＩＩが点状のパターンで検出された（中央パネル）。左パネル（Ｆｇ）と中央パネル（ＢＤＤＦＶＩＩＩ）とを重ね合わせたときに見られる黄色い染色から明らかなように、Ｆｇ内にＢＤＤＦＶＩＩＩ染色が高頻度で共局在しているのがわかるが、このことは両タンパク質が血小板α顆粒内に一緒に貯蔵されている可能性を示すものである（右パネル）（Ｗｉｌｃｏｘら，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００３，１（１２）：２４７７−２４８９）。

外来性ＢＤＤＦＶＩＩＩが血小板α顆粒へ特異的に輸送されるかどうかを決定するために、免疫電子顕微鏡法を実施した。ＦＶＩＩＩに対する一次抗体および１０ｎｍの金粒子に吸着させた二次抗体を用いて、超薄切片に免疫金分析を実施した（図２Ｂ）。ＦＶＩＩＩ欠損イヌおよびＦＶＩＩＩ移植レシピエントの血小板内に正常な大きさと形状のα顆粒が見られた。ＦＶＩＩＩ欠損陰性対照の血小板α顆粒にはＢＤＤＦＶＩＩＩが存在しなかった（左パネル）。これに対して、３匹のイヌ（Ｆ２０、Ｉ４２、Ｍ６４）から単離された血小板ではいずれも、α顆粒および細胞質内にＢＤＤＦＶＩＩＩが検出された。この結果は、フォン・ヴィルブランド病に罹患したＶＷＦ（−／−）トランスジェニックマウスの血小板内にＢＤＤＦＶＩＩＩの異所性発現について報告している観察結果（Ｙａｒｏｖｏｉ Ｈら，Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０５（１２）：４６７４−４６７６）と一致する。Ｍ６４の−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ−ＶＷＦＳＰＤ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ形質導入血小板は、α顆粒内にＢＤＤＦＶＩＩＩを最も高いレベルで貯蔵していた（右パネル）。さらに、血小板細胞質の膜系にはＢＤＤＦＶＩＩＩがほとんど検出されず、ＶＷＦＳＰＤ２が実際にＢＤＤＦＶＩＩＩをα顆粒区画内に直接輸送する効率を向上させることを示唆する。

血小板の免疫蛍光フローサイトメトリー分析では、ＦＶＩＩＩを検出する平均蛍光強度について、ＦＶＩＩＩ欠損症陰性対照の血小板と比較してＭ６４の血小板が最も高い値を示し、これに次いでＩ４２およびＦ２０が高い値を示したことから、Ｍ６４が血小板当たり最も高いレベルのＦＶＩＩＩを貯蔵していることを確認した（図３）。この結果は、ＶＷＦＳＰＤ２標的化構築物は、血小板内にＢＤＤＦＶＩＩＩを貯蔵する利点が与えることを示唆する。続いて、最も小さい−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターの使用は、最も大きい治療用挿入物（この場合、ＶＷＦＳＰＤ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ）に適応することをレンチウイルスベクターに許容しその結果、−１２１８または−８８９ＩＴＧＡ２Ｂプロモーターよりもむしろ遺伝子導入に有用なものとなり得る。

これまでに組織培養した活性化ヒト巨核球で示されているように、活性化血小板が生物学的に活性な形態のＢＤＤＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を分泌し得るかどうかを決定するために、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ４ ＦＶＩＩＩアッセイを実施した（Ｗｉｌｃｏｘら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００３，１（１２）：２４７７−２４８９。１２ 図４では、ＦＶＩＩＩ欠損症イヌの血小板溶出液は、未処置の血小板（黒、−アゴニスト）および活性化血小板（白、＋アゴニスト）においてＢＤＤＦＶＩＩＩ：Ｃのバックグラウンド活性のレベルが実質上変化しないことを示す。これに対して、Ｆ２０、Ｉ４２およびＭ６４の静止状態にある未処置の血小板の溶出液にはＦＶＩＩＩ：Ｃ活性が容易に検出された。さらに、３匹全ての被験イヌでは、血小板活性化の生理学的アゴニストのＡＤＰ、エピネフリンおよびイヌＰＡＲ１、３、４の混合物によって刺激した血小板の溶出液にＢＤＤＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの低下がみられた。要するに、ＢＤＤＦＶＩＩＩ形質導入Ｇ−ＰＢＣを移植したイヌでは血小板を活性化した後にのみＦＶＩＩＩ：Ｃ活性の大幅な低下がみられ、実験動物の血小板が血管系内でＦＶＩＩＩを分泌するよう誘導されることを示唆する。

レンチウイルスベクターのゲノム解析
移植後少なくとも２．５年間にわたって、Ｆ２０、Ｉ４２およびＭ６４から収集した白血球から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲによりレンチウイルスベクターのＷＰＲＥエレメントを検出した（図５Ａ）。末梢血白血球から単離されたゲノムＤＮＡのリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析により、各レンチウイルスベクターの形質導入効率は１％（Ｆ２０）、４％（Ｉ４２）および２％（Ｍ６４）であることがわかった（表１、８列目）。挿入による発癌が出現していない場合には、ゲノム解析によるレンチウイルスベクターの検出は、末梢血計数および末梢血塗抹による評価を頻繁に実施して循環造血細胞の形態および数が正常であることが確認されたイヌが全例とも、全般的に良好な健康状態にあることと一致する。このほか、被験イヌゲノム内へのレンチウイルスベクターの組込みパターンを決定するために線形増幅による（ＬＡＭ）−ＰＣＲを実施した。図５Ｂは、ＦＶＩＩＩ欠損症対照のゲノム内にはレンチウイルスベクターが存在しなかったのに対して、移植を実施したイヌ（Ｆ２０、Ｉ４２およびＭ６４）のゲノムＤＮＡには複数のバンドが存在するように思われることを示す。明確な挿入部位がＦ２０では第４染色体に、Ｍ６４では第３５染色体に特異的に検出された。この結果は、Ｉ４２のゲノムＤＮＡ内にレンチウイルスベクターの挿入を検出することはできたが、このイヌのゲノム地図の正確な領域に挿入部位の位置を特定することはできなかったことを示す（Ｓｕｔｔｅｒ ＮＢ，Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ ＥＡ．Ｄｏｇ ｓｔａｒ ｒｉｓｉｎｇ：ｔｈｅ ｄｏｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２００４，５（１２）：９００−９１０）。要するに、以上の結果は、この研究を含めても（移植の約２．５年後）、挿入による変異誘発が起こらなかったことを示唆する。このことは、通常動物およびヒトゲノムの良性の領域にレンチウイルスベクターを挿入することを見いだした別の報告と一致する（Ｂｉｆｆｉ Ａら，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１７（２０）：５３３２−５３３９）。

血小板標的化遺伝子治療の血友病Ａに対する効果
これまで、ヒト造血細胞が、組織培養されたヒト巨核球内でヒトＢＤＤＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の機能的な形態を合成させるための主要な組織源として機能することが、ＢＤＤＦＶＩＩＩ形質導入ヒトＧ−ＰＢＣ、１２を異種移植したマウスから単離された末梢血血小板およびＢＤＤＦＶＩＩＩ形質導入骨髄の移植を実施した血友病Ａのマウスモデル（Ｓｈｉ Ｑら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２００７，５（２）：３５２−３６１）で観察されている（Ｓｈｉ Ｑら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２００３，７９（１）：２５−３３．）。本研究（図６）は、各イヌの自家Ｇ−ＰＢＣ移植から少なくとも２．５年間にわたる発色分析により、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性（約５〜１５ｍＵ／（ｍｌ・１０８血小板）は、移植の約１年後に最高値が出現し、通常、約５〜１０ｍＵ／（ｍｌ・１０^８血小板）になることが検出されることを示す￥（Ｆ２０、Ｉ４２、Ｍ６）。ＦＶＩＩＩ欠損症イヌの試料を各時点の陰性対照とした（黒線）。

任意の所与の時間において各個体内に存在するＦＶＩＩＩ：Ｃ活性の合計量レベルを決定するために、イヌには約２×１０^８個／１．０ｍｌ血液の血小板が存在し、約９２ｍｌ／ｋｇの血液が存在することに留意する。表１に記録されている体重および形質導入効率ならびに図６に示すデータ点から算出された各イヌの平均ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの値を用いると、循環血中の血小板全体でＦＶＩＩＩ：Ｃがイヌ１匹当たり約０．２３０Ｕ（Ｆ２０）、１．３２５Ｕ（Ｉ４２）および０．６７６Ｕ（Ｍ６４）存在すると推定される。これらの値を大局的に捉えるため、１ＵのＦＶＩＩＩ：Ｃ／１ｍｌという用語は、正常イヌ（２０ｋｇ）の参照血漿中で１００％のＦＶＩＩＩ活性を規定し、正常イヌ（２０ｋｇ）は、任意の所与の時間において合計約８００単位のＦＶＩＩＩを有する。図６の結果は、Ｇ−ＰＢＣ前の１年間にｃＦＶＩＩＩ補給の輸液を必要とする複数回の重度の出血の発症が各個体に起こったことを示す。遺伝子治療プロトコルにより出血を予防するため、各イヌにＧ−ＰＢＣ移植プロトコルの一つを開始した日からｃＦＶＩＩＩの補給を連日実施したことに留意されたい。このほか、移植を実施したイヌには糞便に血液がみられなくなるまでＥＡＣＡを投与し、これは血小板ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが約５ｍＵ／（ｍｌ・１０^８血小板）に達するまでの期間と顕著に一致する。Ｆ２０（上パネル）は、全体的な血小板ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが５ｍＵ／（ｍｌ・１０^８血小板）以下の最も低い値を示し、移植から２．５年にわたる実験の追跡期間を通じて、正常イヌ血漿またはｃＦＶＩＩＩの追加補給を必要とする重度の間欠的な出血の発症がみられた。この結果は、出血表現型の十分な修正を達成するために、イヌ血友病Ａにおいて、ＦＶＩＩＩ：Ｃ ５ｍＵ／（ｍｌ・１０８血小板）が克服しなければならない導入遺伝子発現の閾値レベルであると思われることを示唆する。移植イヌＩ４２（中央パネル）では、ＦＶＩＩＩ：Ｃが約９ｍＵ／（ｍｌ・１０^８血小板）の最も高い定常状態で維持され、ｃＦＶＩＩＩ補給を必要とする重度の出血がみられず、最終的に移植から少なくとも２．５年間、血友病Ａ表現型の修正を示した。Ｍ６４（下パネル）では、ハイブリッドＳＰＤ２ＦＶＩＩＩ分子の合成によりＦＶＩＩＩ：Ｃが他の移植イヌよりも早く５ｍＵ／（ｍｌ・１０^８血小板）に達し、平均ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性レベルは８ｍＵ／（ｍｌ・１０^８血小板）であった。この結果は、ＶＷＦＳＰＤ２輸送ペプチドと連動させた−８８９ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターまたは−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターのいずれかの使用は、ＢＤＤＦＶＩＩＩを血小板に効率的に標的化しイヌ血友病Ａ表現型の是正をもたらすことを示唆する。

従来型のリー・ホワイト全血凝固時間（ＷＢＣＴ）検査を用いて、試験管内で全血が凝固するのに必要な時間を各イヌで測定した（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＴＣら，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ
Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１２，１０（３）：４７４−４７６）。止血が正常なイヌでは平均ＷＢＣＴが１０．５分±標準偏差１．４分である。Ｇ−ＰＢＣ移植前では、ＦＶＩＩＩ欠損症イヌのベースラインＷＢＣＴは４４．５分（Ｆ２０）、４０．５分（Ｉ４２）および６０分超（Ｍ６４）であった。Ｇ−ＰＢＣ移植後では、平均ＷＢＣＴは３９．５分（Ｆ２０、ｎ＝５）、３８．４分（Ｉ４２、ｎ＝５）および４１．９分（Ｍ６４、ｎ＝４）に減少した。この結果は、ＷＢＣＴが極めて緩やかに減少することを示し、ＦＶＩＩＩ欠損症イヌのＷＢＣＴが正常変動内に十分に収まっていると考えられる。興味深いことに、この結果は、実験イヌの血漿内にＦＶＩＩＩ：Ｃを検出すること（ＷＢＣＴの成功に不可欠な要素である）ができないことを支持する。したがって、この結果は、エクスビボのＷＢＣＴ測定が、インビボの止血を改善するための血小板ＦＶＩＩＩの効果を予測するのに適さない検査法であることを示唆するが、それは（血漿中ＦＶＩＩＩとは異なり）この結果が、血管損傷部位において、図４および図６に示されるように生理学的血小板アゴニストによる刺激後に活性化血小板から血小板由来ＦＶＩＩＩが分泌されて、ＦＶＩＩＩ欠損症イヌの止血が改善しなければならないことを示唆されるからである。

Ｇ−ＰＢＣ移植レシピエントが新たに発現されるヒトＢＤＤＦＶＩＩＩに対して液性抗体応答を発現するかどうかを決定するため、凝固因子ＶＩＩＩまたＩＸに対する阻害抗体を検出する活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）混合アッセイより、（Ｆ２０、Ｉ４２およびＭ６４の）イヌ血漿をインヒビターについてスクリーニングした。ヒトＦＶＩＩＩと交差反応してヒトＦＶＩＩＩを阻害する既知のベセスダインヒビター（ＢＩＵ）力価を有する血友病Ａイヌの血漿を陽性対照として使用し、同時にインヒビターを有さないイヌの血漿を比較分析の陰性対照としてアッセイした。結果は、Ｆ２０、Ｉ４２およびＭ６４がインヒビターを発現しなかったことを示唆する（表Ｔ１：１２列目）。この結果は、本発明者らが血漿中にＦＶＩＩＩ：Ｃの存在を検出することができなかったことと一致している。この結果は、血友病Ａマウスがヒト血小板ＢＤＤＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を生成しなかったこと、および本発明者らがレンチウイルスベクター形質導入マウス骨髄の移植後、血漿中にＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができなかったことと一致する（Ｓｈｉ Ｑら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２００７，５（２）：３５２−３６１）。このことはさらに、ＦＶＩＩＩに対する既存の抗体でヒトの治療として、ＢＤＤＦＶＩＩＩの導入遺伝子合成を血小板に標的化することを支持する（Ｓｈｉ Ｑら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００６，１１６（７）：１９７４−１９８２；Ｋｕｅｔｈｅｒら，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１２）。

上記明細書で言及される刊行物、特許、特許出願およびアクセッション番号はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施形態に関連して記載されているが、請求項に係る発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際、当業者には記載されている本発明の組成物および方法の様々な修正形態および変形形態が明らかであり、これらは以下の特許請求の範囲内にあることを意図する。

血小板標的化レンチウイルスベクターの設計を示す図である。（Ａ）ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターフラグメントが巨核球の特異的な発現をルシフェラーゼに導く。 血小板標的化レンチウイルスベクターの設計を示す図である。（Ｂ）−８８９ＩＴＧＡ２Ｂ−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクターの略図。（Ｃ）−６７３ＩＴＧＡ２Ｂ−ＶＷＦＳＰＤ２−ＢＤＤＦＶＩＩＩ−ＷＰＴＳレンチウイルスベクターの略図。 ＢＤＤＦＶＩＩＩの合成およびイヌ血小板α顆粒内への輸送を示す図である。（Ａ）血小板内でのＢＤＤＦＶＩＩＩとＦｇの共局在を示す共焦点顕微鏡観察。（Ｂ）よりヒトＢＤＤＦＶＩＩＩがα顆粒内に局在することを直接示す電子顕微鏡観察。 血小板ＦＶＩＩＩの定量分析を示す図である。 ＦＶＩＩＩ:Ｃの分泌が誘導された活性化血小板を示す図である。 イヌゲノム内のレンチウイルスベクターを検出し位置を特定するＰＣＲ分析を示す図である。（Ａ）白血球ゲノムＤＮＡ内におけるＢＤＤＦＶＩＩＩ−レンチウイルスベクターの長期間にわたる検出。（Ｂ）レンチウイルスベクターのイヌゲノム内での位置を特定する線形増幅媒介（ＬＡＭ）−ＰＣＲ。 血小板ＢＤＤＦＶＩＩＩによるイヌ血友病Ａ表現型の是正を示す図である。 ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターおよびＶＷＦｓｐＤ２の構造領域を示す図である。矢印は血小板標的化治療の前および後の重篤な出血事象を示す。イヌＩ４２およびＭ６４は完全な止血の修正を示している。 ＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子プロモーターおよびＶＷＦｓｐＤ２の構造領域を示す図である。矢印は血小板標的化治療の前および後の重篤な出血事象を示す。イヌＩ４２およびＭ６４は完全な止血の修正を示している。 本開示の実施形態の例示的なレンチウイルス遺伝子治療ベクターを示す図である。 図８のベクターの配列（配列番号２５）を示す図である。 図８のベクターの配列（配列番号２５）を示す図である。 図８のベクターの配列（配列番号２５）を示す図である。 図８のベクターの配列（配列番号２５）を示す図である。 図８のベクターの配列（配列番号２５）を示す図である。 組換えレンチウイルス遺伝子導入構築物に用いたインテグリンαＩＩｂプロモーターフラグメントの略図およびヌクレオチド配列を示す図である。（Ａ）巨核球に特異的なルシフェラーゼレポーター試験に用いたヒトαＩＩｂ−遺伝子プロモーターＮｃｏ Ｉの−ＳａｌＩ ＢｇｌＩＩ−１２１８〜＋３０のヌクレオチド配列（配列番号２１）。（Ｂ）巨核球特異的ルシフェラーゼレポーター試験に用いたヒトαＩＩｂ−遺伝子プロモーターＮｃｏ Ｉの−ＳａｌＩ ＢｇｌＩＩ−８８９〜＋３０のヌクレオチド配列（配列番号２２）。（Ｃ）巨核球に特異的なルシフェラーゼレポーター試験に用いたヒトαＩＩｂ−遺伝子プロモーターＮｃｏ Ｉの−ＳａｌＩ ＢｇｌＩＩ−６７３〜＋３０のヌクレオチド配列（配列番号２３）。番号付けはＰｒａｎｄｉｎｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５６（１）５９５−６０１，１９８８）に基づくものである。

Claims (27)

1. ａ）インテグリンαＩＩｂ遺伝子（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーターのフラグメントを含む発現カセットと、前記発現カセットと作動可能に連結された外来目的遺伝子とを含む発現ベクターとを含む、組成物。
2. 前記発現ベクターが、さらに前記目的遺伝子の発現を細胞の特定の位置に標的化する標的化因子を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記標的化因子が、前記目的遺伝子の発現を、血小板を産生する特定の造血細胞系列内に標的化する、請求項３に記載の組成物。
4. 前記標的化因子が、Ｄ２ドメインと作動可能に連結されたヒトフォン・ヴィルブランド因子プロペプチド（ＶＷＦｐｐ）のフラグメントである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記発現カセットが、配列番号２４の配列を含む核酸配列を有する、請求項４に記載の組成物。
6. 前記発現カセットが、配列番号２４の核酸配列を有する、請求項５に記載の組成物。
7. 前記発現カセットが、配列番号２１、２２、２３および２５からなる群より選択される配列を含む核酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
8. 前記発現カセットが、配列番号２１、２２、２３および２５からなる群より選択される核酸配列を有する、請求項７に記載の組成物。
9. 前記外来遺伝子がヒトＦＶＩＩＩ遺伝子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記ベクターが自己不活性化ベクターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１１に記載の組成物。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を含む、造血幹細胞。
14. 前記幹細胞がエクスビボである、請求項１３に記載の幹細胞。
15. 動物の血友病を治療するための、請求項１３または１４に記載の幹細胞の使用。
16. 前記動物がヒトである、請求項１５に記載の使用。
17. 前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子が改変幹細胞内で発現する条件下で、前記改変幹細胞を作製するために造血幹細胞と請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物とを接触させることを含む、方法。
18. さらに前記改変幹細胞を動物に移植する段階を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記動物が、血友病があると診断されている、請求項１８に記載の方法。
20. 前記移植により前記動物の大量出血が治療または予防される、請求項１８に記載の方法。
21. 前記動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
22. 前記接触をエクスビボで実施する、請求項１７に記載の方法。
23. 前記動物から前記幹細胞を動員する、請求項１８に記載の方法。
24. 前記動員が、前記動物へのサイトカインの投与を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記動物が、血小板内で前記第ＶＩＩＩ因子を発現する、請求項１８に記載の方法。
26. 前記方法を繰り返す、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記方法を定期的に繰り返す、請求項２６に記載の方法。

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