JP2018161097A - 培養細胞供試体の作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】各種計測等の支障になる物理的構造を有さず且つ所望のパターンで配列・配向された成熟細胞や組織が培養されている供試体を作製することができるようにする。【解決手段】培養容器１内に細胞非接着基質の領域２が形成され（Ｓ１）、細胞培養スポット３ａが形成されている鋳型３が細胞非接着基質の領域２に設置される（Ｓ２）と共に鋳型３の細胞培養スポット３ａ内に細胞接着基質の領域４が形成され（Ｓ３）、その上で培養容器１へと培地５並びに細胞６と組織６とのうちの少なくとも一方が投入され（Ｓ４）、細胞６や組織６の培養が行われた（Ｓ６）後に鋳型３が取り外される（Ｓ７）ようにした。【選択図】図１

Description

本発明は、培養細胞供試体の作製方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、例えば平坦な培養基質の表面において任意の平面的なパターンで生体細胞や組織が培養されている供試体の作製に用いて好適な技術に関する。

細胞を培養する技術の進歩に伴い、例えば動物の組織や臓器などの細胞が生体外で培養され（例えば、特許文献１）、培養された細胞が種々の試験，研究，検査，計測などに用いられている。

特開２００３−０９３０５１号公報

培養された細胞が用いられて行われる試験や計測などの種類・内容によっては、平坦な培養基質の表面に所定のパターン（言い換えると、形状は配列・配向の態様）に従って細胞が培養されていることが望ましかったり必要とされたりする場合がある。

生体細胞や組織の培養では、機能的に分化・成熟するために必要となる長期培養（具体的には、数週間乃至数ヶ月程度）において生体細胞や組織を培養環境下に制御することが必要されるものの、細胞増殖や形態変化、細胞分化などを原因として、特に長期培養においては特定の空間に配列された細胞や組織の形状を維持することができないという問題がある。

例えば生物検定において、図１３に示すように、一つに纏まった細胞集団を用いて実験を行うと、化学物質等の環境因子の閾値が、細胞同士の接合に起因する細胞間の相互作用によって本来の閾値よりも低く見積もられてしまうことがあるという問題がある。

また、培養された細胞や組織が用いられて各種計測等が行われる際には、培養基質上に物理的構造があると、計測等の邪魔になったり計測におけるノイズになって計測等の結果に影響を及ぼしたりしてしまうという問題がある。

そこで、本発明は、各種計測等の支障になる物理的構造を有さず且つ所望のパターンで配列・配向された成熟細胞や組織が培養されている供試体を作製することができる培養細胞供試体の作製方法を提供することを目的とする。具体的には例えば、図１４に示すように、細胞を所定のパターンに配列・配向することにより、細胞間の相互作用を排除して化学物質等の環境因子の閾値が本来の閾値通りに正しく把握されるようにすることができる培養細胞供試体の作製方法を提供することを目的とする。

かかる目的を達成するため、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、培養容器内に細胞非接着基質の領域が形成され、細胞培養スポットが形成されている鋳型が細胞非接着基質の領域に設置されると共に鋳型の細胞培養スポット内に細胞接着基質の領域が形成され、その上で培養容器へと培地並びに細胞と組織とのうちの少なくとも一方が投入され、細胞や組織の培養が行われた後に鋳型が取り外されるようにしている。

したがって、この培養細胞供試体の作製方法によると、生体細胞や組織の培養の初期段階においては物理的構造（即ち、鋳型）が利用されて細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染とを防止した状態で長期培養が行われ、その後、物理的構造（鋳型）が取り外された後においても細胞非接着基質の効果により、物理的構造（鋳型）に従う細胞・組織の集団の形状が維持されると共に各集団の配列・配向の態様が維持される。

また、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、磁性を有する材料が添加された鋳型が用いられるようにしても良い。この場合には、鋳型が、外部力である磁力を利用して引き上げられるので、傾動したり揺動したりすること無く真っ直ぐ上に引き上げられて取り外される。この場合には、また、細胞非接着基質と鋳型との密着性が十分には期待できない場合であっても、磁性を有する鋳型を培養容器下方から磁力を利用して吸引することにより、細胞非接着基質と鋳型とを良好に密着させて固定して鋳型の配置を長期にわたって維持することができる。

また、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、細胞非接着基質の領域を形成する物質として温度応答性高分子が添加された物質が用いられ、加熱されることによって細胞接着基質の領域が細胞非接着基質から剥離するようにしても良い。この場合には、細胞非接着基質のうちの細胞接着基質の領域（言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲）が加熱されることによって各細胞接着基質の領域が個別に細胞非接着基質から剥離する。

また、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、細胞接着基質の領域を形成する物質として温度が変化することによって細胞や組織の接着性を有する性質（言い換えると、細胞接着基質として機能する材質）から細胞や組織の接着性を有しない性質（言い換えると、細胞非接着基質として機能する材質）へと変質する物質が用いられ、加熱若しくは冷却されることによって細胞接着基質の領域から細胞や組織が分離して回収されるようにしても良い。この場合には、細胞接着基質の領域（言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲）が加熱若しくは冷却されることによって各細胞群や各組織群が個別に細胞接着基質から分離して回収される。

本発明の培養細胞供試体の作製方法によれば、生体細胞や組織の培養の初期段階においては物理的構造（即ち、鋳型）が利用されて細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染とを防止した状態で長期培養を行うことができると共に、物理的構造（鋳型）が取り外された後においても細胞非接着基質の効果により、物理的構造（鋳型）に従う細胞・組織の集団の形状を維持することができると共に各集団の配列・配向の態様を維持することができるので、任意の形状や配列・配向の態様（言い換えると、平面的パターン）で成熟した生体細胞や組織が培養されている供試体を作製することが可能になる。

本発明の培養細胞供試体の作製方法は、磁性を有する材料が添加された鋳型が用いられるようにした場合には、傾動させたり揺動させたりすること無く真っ直ぐ上に引き上げて鋳型を取り外すことができるので、鋳型の取り外し操作における細胞や組織への影響・ダメージを回避することが可能になる。この場合には、また、鋳型を培養容器下方から磁力を利用して吸引することによって細胞非接着基質と鋳型とを良好に密着させて固定して鋳型の配置を長期にわたって維持することができるので、細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染とを一層確実に防止することが可能になる。

本発明の培養細胞供試体の作製方法は、温度応答性高分子が添加された細胞非接着基質が用いられようにした場合には、細胞非接着基質のうちの細胞接着基質の領域（言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲）を加熱することによって各細胞接着基質の領域を個別に細胞非接着基質から剥離させることができるので、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。

本発明の培養細胞供試体の作製方法は、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変質する細胞接着基質が用いられるようにした場合には、細胞接着基質の領域（言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲）を加熱若しくは冷却することによって各細胞群や各組織群を個別に細胞接着基質から分離させることができるので、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。

本発明の培養細胞供試体の作製方法の実施形態の一例を説明するフローチャートである。 実施形態の培養細胞供試体の作製方法における細胞非接着基質の上面に鋳型が設置された状態を模式的に示す縦断面図である。 鋳型における細胞培養スポットとしての穴の配列の一例を示す平面図である。 図３に示す鋳型が用いられて細胞が培養された供試体による環境因子（時間変動する一様磁界）ばく露試験の概略を説明する概念図である。 実施形態の培養細胞供試体の作製方法における鋳型の穴内に細胞接着基質の領域が形成された状態を模式的に示す縦断面図である。 実施形態の培養細胞供試体の作製方法における培地及び細胞や組織が投入された状態を模式的に示す縦断面図である。 実施形態の培養細胞供試体の作製方法における培養時の状態を模式的に示す縦断面図である。 実施形態の培養細胞供試体の作製方法における培養後に鋳型が取り外された状態を模式的に示す縦断面図である。 実施例１において作製された供試体における鋳型を取り外した直後の細胞集団の境界の状態を示す図である。（Ａ）は培養条件<１>の供試体の状態を示す図である。（Ｂ）は培養条件<２>の供試体の状態を示す図である。 実施例１において作製された培養条件<１>の供試体における鋳型を取り外してから７日目の細胞集団の境界の状態を示す図である。 実施例１において作製された培養条件<２>の供試体における鋳型を取り外してから７日目の細胞集団の境界の状態を示す図である。 実施例１において作製された供試体における培養開始から４６日目の細胞集団の境界を示す図である。（Ａ）は培養条件<１>の供試体の状態を示す図である。（Ｂ）は培養条件<２>の供試体の状態を示す図である。 従来の生物検定における問題点を説明する概念図である。 従来の生物検定における問題点を解決する方法の考え方を説明する概念図である。

以下、本発明の構成を図面に示す実施の形態の一例に基づいて詳細に説明する。

図１乃至図８に、本発明の培養細胞供試体の作製方法の実施形態の一例を示す。

本実施形態の培養細胞供試体の作製方法は、培養容器１内に細胞非接着基質の領域２が形成され（Ｓ１）、細胞培養スポット３ａが形成されている鋳型３が細胞非接着基質の領域２に設置される（Ｓ２）と共に鋳型３の細胞培養スポット３ａ内に細胞接着基質の領域４が形成され（Ｓ３）、その上で培養容器１へと培地５並びに細胞６と組織６とのうちの少なくとも一方が投入され（Ｓ４）、細胞６や組織６の培養が行われた（Ｓ６）後に鋳型３が取り外される（Ｓ７）ようにしている（図１参照）。

培養容器１（シャーレとも呼ばれる）の大きさは、当該培養容器１と組み合わされて用いられる鋳型３の大きさや当該培養容器１内に投入されて培養される細胞・組織６の量が考慮されるなどした上で、長期培養を可能にする量の培地５（言い換えると、長期培養の間において培地５の交換が不要な量の培地５）が収容可能な容積が少なくとも確保され得るように設定される。なお、培養容器１の深さは、当該培養容器１内に鋳型３が設置されると共に培地５が投入された細胞・組織培養状態において鋳型３が培地５中に没入する寸法以上に設定される。

培養細胞供試体の作製方法の実施にあたっては、まず、培養容器１内に細胞非接着基質の領域２が形成される（Ｓ１；図２）。

細胞非接着基質の領域２は、生体細胞や組織の接着性を有しない基質によって形成される領域であり、したがって生体細胞の増殖や分化などが誘導されない基質の領域である。

細胞非接着基質として用いられる物質は、特定の物質に限定されるものではなく、細胞や組織の接着が抑制される物質や所定の物質に所定の処理が施されたものが適宜選択される。細胞非接着基質としては、具体的には例えば、あくまで一例として挙げると、アガロースゲル，ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー，ポリエチレングリコール，有機フッ素化合物，及びこれらを末端とするシランカップリング剤などが用いられ得る。

細胞非接着基質の領域２は、具体的には例えば、当該領域２の形成にアガロースゲルが用いられる場合には、例えば１〜２％程度に調製されたアガロース溶液を培養容器１に滴下した後に例えば１時間程度風乾することによって形成される。なお、アガロースのタイプは、特定のものに限定されるものではないものの、Ｌ（低融点タイプ）やＳ（スタンダードタイプ）が好ましい。

細胞非接着基質の領域２は、或いは、具体的には例えば、当該領域２の形成にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が用いられる場合には、例えば０．１〜１％程度に調製されたＢＳＡ溶液を培養容器１に滴下し培養容器１をパラフィンフィルムで密封した後に室温で１２時間以上インキュベートすることによって形成される。

細胞非接着基質の領域２は、少なくとも鋳型３が設置される部分（言い換えると、範囲）に平坦な皮膜（言い換えると、層）として形成され、培養容器１の底部の全面に亙って平坦な皮膜（層）として形成されることが好ましい。

なお、培養容器１の底部に当該培養容器１とは別体のガラス板（図示していない）が載置され、当該ガラス板の上面に細胞非接着基質の領域２が例えば膜や層として形成されるようにしても良い。

次に、細胞非接着基質の領域２の表面に鋳型３が設置される（Ｓ２；図２）。

鋳型３は、基質上における細胞・組織６の接着パターンを形成する（言い換えると、特定する、或いは、誘導する）ための部材であり、培養容器１の底部に形成された細胞非接着基質の領域２の上面に接触する下面と上面とがそれぞれ開口している穴３ａ（即ち、貫通孔）が細胞培養スポットとして板状の部材に形成されたものとして構成される。

鋳型３の材質は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば培養容器１に投入される培地５によっては変質し得ないことが考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。鋳型３の材質としては、具体的には例えば、あくまで一例として挙げると、シリコン樹脂，ポリジメチルシロキサン（Ｐolydimethylsiloxane：「ＰＤＭＳ」とも表記される），アクリル樹脂，ガラス，パリレン，アガロース等のハイドロゲルなどが用いられ得る。

鋳型３を形成する材料に磁性を有する材料が添加されるようにしても良い。この場合には、後述するＳ７の処理において、外部力である磁力を利用して鋳型３が取り外されるようになり、鋳型３を傾動させたり揺動させたりすること無く真っ直ぐ上に引き上げて取り外すことができるので、鋳型３の取り外し操作における細胞・組織６への影響・ダメージを回避することが可能になる。この場合には、また、細胞非接着基質と鋳型３との密着性が十分には期待できない場合であっても、磁性を有する鋳型３を培養容器１の下方から磁力を利用して吸引することにより、細胞非接着基質への鋳型３の吸着力を増強して細胞非接着基質と鋳型３とを良好に密着させて固定して鋳型３の配置を長期にわたって維持することができるので、細胞非接着基質の領域２への細胞侵入と接着分子等の汚染とを一層確実に防止することが可能になる。

鋳型３を形成する材料へと添加される磁性を有する材料は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば細胞・組織６の増殖・分化に与える影響が考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。添加される磁性を有する材料としては、例えば、種々の磁性粒子が選択され得る。

鋳型３は、特定の大きさや形状に限定されるものではないものの、鋳型３を配置することになる細胞培養容器として一般には円形のものが普及していることを考慮すると、例えば、直径が５〜１０ ｃｍ 程度の円盤状のものが適合し易いと考えられる。

細胞培養スポットとして鋳型３に形成される穴３ａ（貫通孔）は、特定の大きさや形状に限定されるものではなく、例えば、各種計測等の内容に応じて供試体毎に要求される培養細胞・組織の集団としての所望の形状に合わせた大きさや形状に形成される。

細胞培養スポットとしての穴３ａは、具体的には例えば、最小寸法(内側差渡し)が０．０１〜２ ｍｍ 程度且つ最大寸法(内側差渡し)が２〜３ ｍｍ 程度の貫通する空隙／穴隙として形成されることが考えられる。なお、一つの鋳型３に、細胞培養スポットとして、穴３ａが一つのみ形成されるようにしても良く、また、複数の穴３ａが形成されるようにしても良い。

細胞培養スポットとして鋳型３に形成される穴３ａ（貫通孔）の配列・配向の態様は、特定のパターンに限定されるものではなく、例えば、各種計測等の内容に応じて供試体毎に要求される培養細胞や組織の集団についての所望の配列・配向に合わせた態様に設定される。

細胞培養スポットとしての穴３ａ（貫通孔）の配列・配向の態様は、具体的には例えば、環境因子ばく露試験の一例としての、時間変動する一様磁界の印加試験に使用される供試体を作製するために図３に示すように同心円状に設定されることが考えられる。

図３に示す鋳型３が設置されて培養されることによって鋳型３の細胞培養スポットとしての穴３ａのパターンに従って同心円状の複数の細胞・組織６の集団が配列・配向された供試体が作製され、当該供試体に対して図４に示すように時間変動する一様磁界を印加して試験を行うことが考えられる。

図４に示すように培養容器１（供試体）の上面から垂直方向に一様な時間変動する磁界を入射する方法では、培地５内に誘導される電流密度が以下の数式１に従うため、培養容器１の中心部（即ち、ｒ＝０）から径方向距離に比例する、同心円状の誘導電流強度分布が形成される。なお、図３において、破線（符号９）は誘導電流強度分布を表し、誘導電流強度は外側ほど強くなる。
（数式１） Ｊ＝σπｆＢｒ
ここに、Ｊ：誘導電流密度［Ａ／ｍ²］，σ：培地導電率［Ｓ／ｍ］，π：円周率，ｆ：周波数［Ｈｚ］，Ｂ：磁束密度［Ｔ］，ｒ：半径［ｍ］をそれぞれ表す。

図３に示す鋳型３を用いた細胞培養によって作製された、同心円状の複数の細胞・組織６の集団が配列・配向された供試体への図４に示すような時間変動する一様磁界の印加により、細胞・組織６の集団に印加される誘導電流強度のばらつきを低減する（尚、穴３ａの大きさが小さいほど誘導電流強度のばらつきが小さくなる）と共に異なる誘導電界強度に対する細胞応答を同時に評価することができ、刺激方向や強度の差違と細胞への影響の差違との間の関係の分析が効率的に容易に且つ適切に行われるようになる。また、鋳型３に形成された細胞培養スポットとしての穴３ａのそれぞれに単一種の細胞を播種するか或いは複数種の細胞を播種するかにより、単一種の細胞での評価を行うことと複数種の細胞のネットワークでの評価を行うこととの両方ができるようになる。

鋳型３の下面が細胞非接着基質の領域２の上面へと吸着した状態とされることが好ましい。具体的には例えば、鋳型３がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）によって形成される場合には、鋳型３を細胞非接着基質の領域２へと接触させると、ＰＤＭＳと細胞非接着基質とに作用する分子間力により、ＰＤＭＳが吸着固定される。

なお、鋳型３の表面に、細胞や組織の接着性を有しない物質によって皮膜が形成されるようにしても良い。

また、一つの培養容器１内に複数の鋳型３が設置されるようにしても良い。

次に、鋳型３の細胞培養スポットとしての穴３ａ内に細胞接着基質の領域４が形成される（Ｓ３；図５）。

細胞接着基質の領域４は、生体細胞や組織の接着性を有する基質の領域であり、したがって生体細胞の増殖や分化などが誘導される基質の領域である。

細胞接着基質として用いられる物質は、特定の物質に限定されるものではなく、例えば培養対象の細胞・組織６の種類やタイプが考慮されるなどした上で、細胞や組織の接着が誘導される物質や所定の物質に所定の処理が施されたものが適宜選択される。細胞接着基質としては、具体的には例えば、あくまで一例として挙げると、ラミニン，コラーゲン，フィブロネクチン，ポリエチレンイミン（ＰＥＩ），ポリリジン，Ｐuramatrix，抗体などが用いられ得る。

細胞接着基質の領域４は、具体的には例えば、当該領域４の形成にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が用いられる場合には、例えば０．１％程度に調製されたＰＥＩ溶液を滴下して冷蔵（例えば４℃程度）にて一晩保存した後に滅菌水で洗浄（尚、毒性が強いため、４回以上洗浄することが好ましい）することによって形成される。

細胞接着基質の領域４は、或いは、具体的には例えば、当該領域４の形成にポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）が用いられる場合には、例えば０．１％程度に調製されたＰＬＬ溶液を滴下して冷蔵（例えば４℃程度）にて一晩保存した後に滅菌水で洗浄（例えば１回程度）することによって形成される。

細胞接着基質の領域４は、鋳型３が細胞非接着基質の領域２の上面に設置（言い換えると、吸着）された状態において当該鋳型３に細胞培養スポットとして形成されている穴３ａそれぞれの底部に該当する細胞非接着基質の領域２の上面に平坦な皮膜（言い換えると、層）として形成される。

細胞接着基質の領域４は、穴３ａの底部に該当する部分に於いて、細胞非接着基質の領域２の上面に積層するものとして形成されるようにしても良く、また、細胞非接着基質の領域２の少なくとも上面側部分（言い換えると、少なくとも表層部分）が改質されたり細胞非接着基質の領域２の少なくとも上面側部分と交換されたりすることによって形成されるようにしても良い。

ここで、細胞培養スポットとしての穴３ａ内に形成される細胞接着基質の領域４について、穴３ａ毎に種類が異なる細胞接着基質の領域４を形成した上で同一種類の細胞・組織６を播種して培養した後に環境因子にばく露することにより、異なる接着環境を有する細胞・組織６に対して同一条件の環境因子を印加することができる。これにより、細胞・組織６と細胞接着基質との間の接着様式（例えば、共有結合，抗原抗体反応，その他の結合反応など）や接着強度の差異に依存した応答の違いを観察することが可能になり、その上、評価実験の効率化を図ることができると共にサンプル間の誤差を低減させることが可能になる。

次に、培養容器１へと培地５及び細胞・組織６が投入される（Ｓ４；図６）。

培地５（尚、液体培地や培養液とも呼ばれる）は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば培養対象の細胞・組織６の種類・性質や流動性を有して鋳型３の穴３ａへと進入し得ることが考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。

培地５は、細胞・組織６を機能的に成熟させるために必要とされる培養期間が考慮されるなどした上で、当該培養期間に亙る培養を可能にするだけの量が少なくとも投入される。なお、培養容器１の底部に設置された鋳型３が培地５中に没入するように調整される。

ここで、培地５へと環境因子や薬剤が添加されるようにしても良い。これにより、同一培養条件下での異なる細胞・組織６の集団の応答を一度に評価することが可能になる。

細胞・組織６は、各々が分離した単体の状態で若しくは凝集塊の状態で、例えばピペット７が用いられて投入される。

細胞・組織６は、特定の種類に限定されるものではなく、各種計測等の内容に応じて供試体毎に指定・特定されるものが適宜選択される。

細胞・組織６は、例えば各種計測等の内容に応じ、鋳型３に形成されている細胞培養スポットとしての穴３ａのそれぞれに初期状態として接着させる所望の量（個数）が考慮されるなどした上で、例えば前記所望の量の接着を可能にするだけの量が投入される。

なお、培地５と細胞・組織６との投入について、培養容器１へと培地５が投入されてから当該培地５へと細胞・組織６が投入されるようにしても良く、或いは、細胞培養スポットとしての穴３ａへと細胞・組織６が（個別に）投入されてから培養容器１へと培地５が投入されるようにしても良い。

培養容器１内へと投入された細胞・組織６は、鋳型３に細胞培養スポットとして形成されている穴３ａ内の細胞接着基質の領域４へと接着する。

続いて、培地５が交換される（Ｓ５）。

細胞・組織６が投入された後、これら細胞・組織６が細胞培養スポットとしての穴３ａ内の細胞接着基質の領域４へと接着する時機を待って培地５が交換される。

培地５の交換は、例えば培養対象の細胞・組織６の種類が考慮されるなどした上で、細胞・組織６が投入されてから適当な時間が経過した時に行われる。

なお、培養容器１へと培地５が投入される前に細胞培養スポットとしての穴３ａへと細胞・組織６が直接投入・播種されてから培養容器１へと培地５が投入されるようにした場合には、培地５が交換されないようにしても良い。

そして、所定の培養期間に亙って細胞・組織６の培養が行われる（Ｓ６；図７）。

培養期間は、例えば培養対象の細胞・組織６の種類や各種計測等の内容に応じて供試体毎に要求される条件が考慮されるなどした上で、適当な長さに適宜設定される。

ここで、本発明では、細胞・組織６を機能的に成熟させ得る程度の長期間に亙る培養も可能であることを特徴の一つとする。

細胞・組織６の培養期間は、具体的には例えば、３週間から３ヶ月程度の範囲で設定されることが考えられる。本発明では、概ね３週間程度以上の期間に及ぶ培養のことを「長期培養」と呼ぶ。

培養期間中、鋳型３の周囲の細胞非接着基質の領域２の上面や鋳型３の下面が接着している細胞非接着基質の領域２の上面に対しては、細胞・組織６の侵入が防止されたり培地５を介した細胞接着分子が除去されたりするため、細胞・組織６が接着することが無い。

一方で、鋳型３に細胞培養スポットとして形成されている穴３ａ内の細胞接着基質の領域４には細胞・組織６が接着して増殖・分化が行われる。

ここで、鋳型３に細胞培養スポットとして形成されている穴３ａの上面は開口して培地５に対して開放されているので、穴３ａ内の細胞接着基質の領域４に接着している細胞・組織６には培地５から栄養が継続的且つ十分に供給される。

所定の培養期間が経過した後に、鋳型３が取り外される（Ｓ７；図８）。

鋳型３が取り外される（言い換えると、剥離される）ことにより、基質上に所望の態様でパターニングされた細胞・組織６の集団が形成されている供試体が得られる。

上述の工程によれば、培養容器１内の細胞非接着基質が剥き出しになっている部分や細胞非接着基質の上面と鋳型３の下面とが接触している部分には細胞・組織６が接着せず、鋳型３の穴３ａ内の細胞接着基質の領域４のみに細胞・組織６が接着するので、細胞・組織６の集団のそれぞれは独立して隣接部での結合が無く、且つ、各細胞・組織６の集団は長期培養された結果として機能的に十分に成熟している。

また、鋳型３を取り外した後においても、細胞非接着基質の働きにより、機能的に成熟している細胞・組織６の集団それぞれの形状及び配列が維持される。

そして、鋳型３を取り外した状態で各種計測等を行うことにより、細胞・組織６（具体的には、培養された細胞・組織６が付着している供試体）へとばく露などされる環境因子の空間分布を阻害することが無い状態で、即ち環境因子に関して意図した所望の空間分布のままで正確な計測等を行うことが可能になる。

培養された細胞・組織６が用いられて種々の実験や計測等が行われる際には、細胞・組織６を収容している培養容器１全体が供試体として使用されるようにしても良く、また、細胞・組織６が接着している細胞非接着基質の領域２が培養容器１の底部から剥がされて供試体として使用されるようにしても良く、或いは、培養容器１の底部に載置されたガラス板の上面に細胞非接着基質の領域２が形成されるようにした場合には細胞非接着基質の領域２が貼り付いているガラス板ごと供試体として使用されるようにしても良い。

ここで、温度応答性高分子が細胞非接着基質の領域２の形成に用いられる物質に添加され、加熱されることによって分子構造が変化して（具体的には例えば、細胞非接着基質が融解して）細胞接着基質の領域４が細胞非接着基質から剥離するようにしても良い。この場合には、細胞接着基質の領域４（言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲）のそれぞれが局所的に加熱されることによって各細胞接着基質の領域４が個別に細胞非接着基質から剥離するようになり、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織６の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織６の集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。

細胞非接着基質の領域２の形成に用いられる物質へと添加される温度応答性高分子は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば細胞非接着基質の領域２の形成に用いられる物質の性質への影響や細胞・組織６の増殖・分化に与える影響が考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。添加される温度応答性高分子としては、具体的には例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が選択され得る。

温度応答性高分子が添加された物質が用いられて形成された細胞非接着基質の領域２から細胞接着基質の領域４を剥離させる際の加熱の方法としては、あくまで一例としては、レーザー照射が挙げられる。

また、細胞接着基質の領域４を形成する物質として温度が変化することによって細胞や組織の接着性を有する性質（言い換えると、細胞接着基質として機能する材質）から細胞や組織の接着性を有しない性質（言い換えると、細胞非接着基質として機能する材質）へと変質する物質が用いられ、加熱若しくは冷却されることによって細胞接着基質の領域４から細胞・組織６が分離して回収されるようにしても良い。この場合には、細胞接着基質の領域４（言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲）のそれぞれが局所的に加熱若しくは冷却されることによって各細胞・組織６が個別に細胞接着基質から分離するようになり、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織６の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織６の集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。

細胞接着基質の領域４の形成に用いられる、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変質する物質は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば細胞・組織６の増殖・分化に与える影響が考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。温度変化によって細胞接着性が変化する物質としては、具体的には例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が選択され得る。

温度変化によって細胞接着性が変化する物質が用いられて形成された細胞接着基質の領域４から細胞・組織６を分離させるために温度変化を与える方法としては、あくまで一例としては、加熱する場合にはレーザー照射が挙げられ、冷却する場合にはペルチェ素子を用いることが挙げられる。

以上のように構成された培養細胞供試体の作製方法によれば、生体細胞や組織の培養の初期段階においては物理的構造（即ち、鋳型３）が利用されて細胞非接着基質の領域２への細胞侵入と接着分子等の汚染とを防止した状態で長期培養が行われ、その後、物理的構造（鋳型３）が取り外された後においても細胞非接着基質の効果により、物理的構造（鋳型３）に従う細胞・組織６の集団の形状が維持されると共に各集団の配列・配向の態様が維持される。このため、任意の形状や配列・配向の態様（言い換えると、平面的パターン）で成熟した生体細胞や組織が培養されている供試体を作製することができる。

以上のように構成された培養細胞供試体の作製方法によれば、また、例えば化学物質や放射線，電磁界などの様々な環境因子のばく露強度分布に対応するように細胞・組織６の集団を配列・配向させることができ、このため、用量反応や時間反応を各ばく露強度と対応させて複数サンプルで同時評価することができる。

以上のように構成された培養細胞供試体の作製方法によれば、また、長期培養に対応する培地５（液体培地，培養液）を収容し得る容量を有する培養容器１内で細胞・組織６を培養することによって培地交換の操作を不要とし、これにより、培地交換に伴う細胞・組織６への影響・ダメージを与えない状態での長期培養を行うことが可能になる。なお、発明者らの知見によると、長期培養に対応する量の培地５を培養容器１内に貯留させることにより、細胞・組織６から排出される老廃物によって引き起こされる細胞・組織６の増殖・分化の阻害が十分に低減する程度まで前記老廃物が培地５内に分散するようになり、この点からも培地５の交換は不要になる。

なお、上述の実施形態は本発明を実施する際の好適な形態の一例ではあるものの本発明の実施の形態が上述のものに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において本発明は種々変形実施可能である。

本発明の培養細胞供試体の作製方法の作用効果を検証した実施例を図９乃至図１２を用いて説明する。

本発明の実施例として、培養容器の底部に形成された細胞非接着基質の領域の上面に鋳型を設置すると共に当該鋳型の細胞培養スポットとしての穴内に細胞接着基質の領域を形成し、その上で培養容器へと培地及び細胞を投入して培養した後に鋳型を取り外して供試体（試料）を作製した。

本実施例の条件は以下の通りであった。
細胞非接着基質：アガロースゲル
細胞接着基質 ：ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
鋳型の材質 ：ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）
培地 ：Ｎeurobasal medium（＋２％ Ｂ−２７ supplement，１％ Ｇlutamax supplement，１％ Ｐen−Ｓtrep）（２０ ｍｌ で培養，２乃至３日に一度半量の培地交換を実施）
細胞 ：ラット大脳皮質から採取された神経細胞
培養条件<１> ：鋳型を付けた状態で７日間培養し、
その後に鋳型を取り外した状態で３９日間培養
培養条件<２> ：鋳型を付けた状態で２１日間培養し、
その後に鋳型を取り外した状態で２５日間培養

本実施例では、鋳型の穴の平面視形状及び前記穴内の細胞接着基質の領域の形状によって特定された所望の細胞形状の維持性能を検証するため、培養条件<１>で作製した試料と培養条件<２>で作製した試料とのそれぞれについて、細胞接着基質の領域内の神経細胞から伸張する神経繊維が細胞非接着基質の領域へと侵入する様子を観察した。

観察の結果として、鋳型を取り外した直後（即ち、培養条件<１>の試料については培養開始から７日目，培養条件<２>の試料については培養開始から２１日目）の状態について図９に示す結果が得られ、また、鋳型を取り外してから７日目（即ち、培養条件<１>の試料については培養開始から１４日目，培養条件<２>の試料については培養開始から２８日目）の状態について図１０（培養条件<１>）及び図１１（培養条件<２>）に示す結果が得られ、さらに、培養開始から４６日目の状態について図１２に示す結果が得られた。

図９に示す結果から、鋳型取り外し直後においては、培養条件<１>でも培養条件<２>でも、細胞接着基質の領域と細胞非接着基質の領域との境界が明確であって細胞非接着基質の領域への細胞の接着や侵入は看取されないことが確認された。

図１０に示す結果から、培養条件<１>では、鋳型を取り外してから７日後には細胞接着基質の領域から細胞非接着基質の領域へと神経繊維が侵入している状況が看取されることが確認された。

一方、図１１に示す結果から、培養条件<２>では、鋳型を取り外してから７日経過時においても細胞接着基質の領域と細胞非接着基質の領域との境界が明確であって細胞非接着基質の領域への細胞（神経繊維）の侵入は看取されないことが確認された。

図１２に示す結果から、培養開始から４６日経過時において、培養条件<１>では細胞非接着基質の領域への神経突起の侵入が継続して更に進行している状況が看取される（同図(Ａ)）一方で、培養条件<２>では細胞接着基質の領域と細胞非接着基質の領域との境界が明確であって細胞非接着基質の領域への細胞（神経繊維）の侵入は看取されず細胞群は鋳型の穴形状と同様の形状を保持していることが確認された。

図９乃至図１２に示す結果から、神経細胞が回路網構造を形成する培養初期段階での神経線維の伸長を鋳型によって物理的に遮断することより、細胞非接着基質の領域へと侵入してしまうような活発な神経線維の伸長を抑制すると共に鋳型内部での神経回路網の形成・成熟を促し得ることが確認された。これにより、鋳型内において長期培養（２１日間）を行った試料（培養条件<２>）については、鋳型取り外し後の長期培養（２５日間）においても細胞非接着基質の領域への神経線維の侵入を抑制することができたものと考えられた。

以上の結果から、本発明によると、生体細胞の培養の初期段階においては鋳型が利用されて細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染が防止された状態で長期培養が行われ、その後、鋳型は取り外されるものの細胞非接着基質の効果により、任意の形状で成熟し且つ形状の境界が明確なままで維持された状態の生体細胞の集団を作製可能であることが確認された。

１ 培養容器
２ 細胞非接着基質の領域
３ 鋳型
３ａ 細胞培養スポット，穴
４ 細胞接着基質の領域
５ 培地
６ 細胞，組織
７ ピペット

Claims (4)

1. 培養容器内に細胞非接着基質の領域が形成され、細胞培養スポットが形成されている鋳型が前記細胞非接着基質の領域に設置されると共に前記鋳型の前記細胞培養スポット内に細胞接着基質の領域が形成され、その上で前記培養容器へと培地並びに細胞と組織とのうちの少なくとも一方が投入され、前記細胞や前記組織の培養が行われた後に前記鋳型が取り外されることを特徴とする培養細胞供試体の作製方法。
2. 前記鋳型として磁性を有する材料が添加された鋳型が用いられることを特徴とする請求項１記載の培養細胞供試体の作製方法。
3. 前記細胞非接着基質の領域を形成する物質として温度応答性高分子が添加された物質が用いられ、加熱されることによって前記細胞接着基質の領域が前記細胞非接着基質から剥離することを特徴とする請求項１記載の培養細胞供試体の作製方法。
4. 前記細胞接着基質の領域を形成する物質として温度が変化することによって前記細胞や前記組織の接着性を有する性質から前記細胞や前記組織の接着性を有しない性質へと変質する物質が用いられ、加熱若しくは冷却されることによって前記細胞接着基質の領域から前記細胞や前記組織が分離して回収されることを特徴とする請求項１記載の培養細胞供試体の作製方法。