JP2018155768A - 信号に基づく試料の調製 - Google Patents

Abstract

【課題】光学顕微鏡で観察された試料を、電子顕微鏡用に自動的に、再現性良く、かつ簡便に処理する包括的でかつ一貫した方法を提供する。【解決手段】試料調製システム４００は、光学顕微鏡で観察された細胞試料の情報を複数の画像として得る画像取得モジュール４３５、得られた画像を解析する画像解析モジュール４４０、フルイディクス始動モジュール４６０、を有する。画像解析モジュール４４０によって観察中に検出可能な細胞の事象が起こったと判断された場合、フルイディクス始動モジュール４６０を始動させ、細胞試料を電子顕微鏡用に調整するために、細胞試料に流体（固定剤）を放出する。【選択図】図４

Description

本実施例は、生体試料の調製を前記生体試料によって生成される信号に基づいて行う装置及び方法に関する。より詳細には本実施例は、前記生体試料の調製のプロセスを制御するために画像解析を用いる装置に関する。

光・電子相関顕微鏡（CLEM）は、試料の光学顕微鏡観察から得られる情報と、前記試料の電子顕微鏡観察から得られる情報とを相関させる一組の処理を含む周知の方法である。しかし既に光学顕微鏡で解析された試料を電子顕微鏡用に調製するには、多くの異なる処理を行うことが必要となる。光学顕微鏡は、動的な生きている細胞にも使えるが、電子顕微鏡は、固定された処理済みの試料に依拠する。たとえば生体試料−たとえば細胞又は組織−は、電子顕微鏡によって適切に解析するため、安定させ、薄くし、かつ、電子光学コントラストを増大させる（染色する）様々な方法で適切に調製される必要がある。

多くの場合において、CLEMは、特定の細胞又は組織内部で起こる生物学的事象を調べるのに用いられる。たとえば、細胞に導入される蛍光タンパク質の動特性が決定され、かつ、前記細胞は、試料を取り出して、その試料を固定及び処理する一連の実験を行うことによって電子顕微鏡用に固定されうる。これにより、生体試料を電子顕微鏡で観察することが可能となる。

しかし現時点では、光学顕微鏡で観察された試料を、電子顕微鏡用に自動的に、再現性良く、かつ簡便に処理する包括的でかつ一貫した方法は存在しない。

一の実施例は、生体試料の画像を提供するように構成される顕微鏡を有する、試料の調製を制御する装置である。また前記の提供された画像を解析して検出可能な事象が前記生体試料内で起こったか否かを判断するように構成された画像解析モジュールも含まれる。フルイディクス始動モジュールはまた、検出可能な事象が発見された場合には始動するように構成される。前記始動の結果、前記生体試料は処理される。

他の実施例は、生体試料の調製を制御する方法である。当該方法は、顕微鏡で生体試料の画像を取得する段階、前記画像を解析して検出可能な事象が起こったか否かを判断する段階、及び、前記検出可能な事象が起こった場合には、前記生体試料を電子顕微鏡用に調製するように、フルイディクスサブシステムを始動させる段階を有する。

試料調製システムの一の実施例の斜視図である。 図1の試料調製システム内に設置される試料ホルダの画像を取り込む顕微鏡の斜視図である。 一の実施例によるマイクロ流体チャネルを備える試料ホルダの上面図である。 試料を調製するシステムの一の実施例のブロック図である。 試料を調製する方法の一の実施例のフローチャートである。 事象の誘因を検出する方法の一の実施例のフローチャートである。

本発明の実施例は、電子顕微鏡用又は他の種類の解析用に生体試料を調製する試料処理システム及び方法に関する。一の実施例では、当該システムは、光学顕微鏡による画像化、取り込まれた画像の解析、及び、フルイディクスシステムのリアルタイムフィードバック制御を組み合わせて利用することで、特定の細胞で事象が起こったか否かを判断して、それと同時に前記生体試料を固定する。たとえば試料処理システムは、検出可能な事象−たとえば分子結合、共焦点変化、蛍光、又は他の事象−のために前記生体試料を走査する高解像度カメラを用い、かつ、他の処理を前記生体試料上で自動的に初期化し得る。たとえば前記他の処理は、電子顕微鏡用に前記生体試料を調製する第1段階としての前記生体試料の急速冷凍であって良い。

よって当該試料処理システムは、たとえば所定の生物学的事象が起こるときは必ず特定の試料を固定するように調節されることによって、電子顕微鏡用の試料調製を再現可能に行うことができる。よって一連の細胞試料は、後述するように、抗体に取り付けられた蛍光色素又は金の微粒子がいつ細胞表面に結合するのかを解析し、それに続いて固定反応を引き起こすことによって一貫して処理されうる。前記光学顕微鏡での観察時に起こる特定の細胞の事象を決定する際に前記固定反応を自動かつリアルタイムで引き起こす結果、当該試料調製システムは、特定の事象を観察する際に手動で引き起こされていた従来システムと比較して、非常に再現性の良い結果を与える。

一の実施例は、前記検出可能な事象が起こったのか否かを判断する画像解析システム、及び、前記画像解析システムによって得られた情報に従って前記試料を処理するフルイディクス始動システムを利用するシステム並びに方法を含む。前記画像解析システムは、任意の種類の顕微鏡から画像を受け取り、その後前記試料を処理する処理命令の組を生成するため、前記画像のデータを解析するように構成されて良い。前記フルイディクス始動システムは、所定の命令の組に従って前記生体試料へ固定流体を放出させるように1つ以上の処理サブシステムを始動させる前記処理命令によって制御されうる。当該試料調製システムは、前記生体試料の処理前、処理中、及び/又は処理後に前記顕微鏡から取り込まれた画像を解析することによって前記生体試料の観察を継続し得る。

たとえば前記画像解析システムは、前記顕微鏡によって取り込まれた一連の空間的及び/又は時間的な画像を解析することで、特定の事象が起こったのか否かを判断しうる。同様に前記画像解析システムは、前記生体試料の処理中の一連の空間的及び/又は時間的な画像を解析することで、たとえば前記生体試料の処理を継続するのか変更するのかを判断して良い。それに加えて、前記画像解析システムは、前記生体試料の処理後の一連の空間的及び/又は時間的な画像を解析することで、エラーが前記生体試料の調整中に起こったのか否かを判断して良い。

試料の調製が自動化されることで、具体的に定義された生物学的事象によって引き起こされる完全に自動化されたシステムが、前記具体的に定義された生物学的事象が起こった時点で前記生体試料の取り込みと解析を行うことが可能となる。これは有利となるように、前記試料ホルダの使い勝手を向上させながらも試料調製の処理効率と再現性を向上させうる。さらに当該試料調製システムは、電子顕微鏡用の試料調製の全段階を制御するのに用いられるリアルタイム制御システムに統合されて良い。

一部の実施例は、生物学的事象によって生成される信号に基づいて試料を処理するように構成されるシステムを供する。関心対象となる生物学的事象は生きている試料内での動的な事象であって良い。本願明細書において詳述したように、試料調製をリアルタイムでフィードバックするので、他の利点としては、前記事象の検出の際、試料が略瞬時に処理できることで、特定の状態又は特定の時点の前記生体試料が保持されうることがある。

[生体試料処理の概要]
後述するように、多くの異なる処理が生体試料に適用されうる。本発明の実施例は、当該システムが検出する事象に応じて、当該システムによって始動される任意の種類の処理を含む。たとえば検出された事象に応じて、化学固定が開始されて良い。このシステムでは、前記フルイディクスシステムは、試料の可動性巨視的細胞構造を安定化させ得る固定剤を放出する。たとえば前記フルイディクスシステムは、アルデヒドを有する化合物−たとえばホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒド−を放出して、タンパク質を化学的に架橋する。あるいはその代わりに、前記フルイディクスシステムは、化合物−たとえば四酸化オスミウム−を放出して、脂質試料を固定して良い。

他の実施例では、前記フルイディクスシステムは、前記生体試料を急速冷凍することによって前記生体試料を低温固定するように組成物を放出して良い。液化窒素、液化エタン、又は液体ヘリウムのような物質が、電子顕微鏡観察を行える状態を保持するように、前記生体試料内部でガラス化された（非晶質の）氷を生成するのに用いられて良い。この方法は、前記の検出された事象が起こった時点で前記試料の溶液状態の瞬間状態を保持する。この実施例では、前記生体試料が低温固定された後、前記生体試料は、ミクロトームを用いることによって破壊又は分割され、その後電子顕微鏡によって観察されうる。

本願明細書で用いられているように、「生体試料」という語句は、生物から得られる任意の種類の試料を含んで良いが、典型的には、細胞組織、細胞、ウイルス、細胞構造、又は関心対象となる他の任意の生体試料を含む。

[生物学的事象の検出]
本明細書で用いられているように、「生物学的事象」又は「関心対象である生物学的事象」とは、分子結合（たとえば抗体結合）、蛍光分子、受容体インターナリゼーション、受容体結合、又は膜によるイオン交換の検出を含むが、これらに限定される訳ではない。

生物学的事象は、任意の数の方法によって検出されて良い。たとえば前記生物学的事象は、前記生体試料内での蛍光、反射、干渉反射、透過光、及び/又は定量的位相コントラストによって検出されうる。一部の実施例では、前記生物学的事象はラベル型の事象−たとえば蛍光−である。他の実施例では、前記生物学的事象はラベルのない型の事象である。たとえばラベルのない型の事象は、分子の存在を示唆するスペクトルを含んで良い。

生物学的事象は、検出するのにミクロン秒、秒、分、又はさらには数時間を要することがある。よって当該システムは、数ミリ秒〜数時間の範囲の期間で検出された事象について前記生体試料を観察して良い。

本発明の実施例は、取り込まれた画像から収集されたデータに基づいて生物学的事象を検出する段階を有して良い。たとえば一部の実施例では、前記生体試料は、一般的な蛍光色素−たとえばシアニン、フルオレセイン、ローダミン、Alexa蛍光標識（登録商標）、Dylight蛍光標識（登録商標）、ATTO色素、及びBODIPY色素を用いた蛍光体の固定後に生体内で画像化されて良い。それに加えて生物学的巨視的分子−たとえば抗体−は、色素によってラベルが付され、かつ、所定の事象の発生を検出するのに用いられて良い。

他の実施例では、前記生物学的事象を検出する段階は、前記生物学的事象が分光学的方法から検出されうるようなラベルを含まない。たとえば試料のスペクトルは前記試料の存在を示しうる。非ラベル型の方法は、コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)顕微分光法及び/又は2次和周波発生(SHG)法を含んで良い。

事象の検出後、前記試料が電子顕微鏡用に調製されて良い。電子顕微鏡は、生物学及び生命科学において、たとえば診断用電子顕微鏡、低温生物学、タンパク質の特定、電子断層診断、細胞断層診断、低温電子顕微鏡、毒物学、生物学的生産及びウイルス負荷の観察、粒子解析、製薬の品質制御、構造生物学、3D細胞組織の画像化、ウイルス学、及びガラス化といった用途に用いられて良い。これらの各独立する用途は、様々な種類の電子顕微鏡によって実行されて良い。そのような電子顕微鏡にはたとえば、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査電子顕微鏡(SEM)、反射電子顕微鏡、走査型透過電子顕微鏡、及び低電圧電子顕微鏡が含まれる。

[試料調製システムの概略]
図1は試料調製システム100の一の実施例を表す図である。試料調製システム100は、統合された相関顕微鏡システムの一部としての電子顕微鏡へ搬送されうるように生体試料を調製するのに用いられる。図示されているように、試料調製システム100は、上側部分108と表示パネル109を支持する底部105を有する。

上側部分108の内部には、処理中での生体試料の画像を取り込むのに用いられる顕微鏡ステーション110が存在する。顕微鏡ステーション110は高解像度カメラ115を有する。高解像度カメラ115は、生体試料から取り込まれた画像を増幅及び伝送するレンズ系120を有する。カメラ115は、以降で詳述するように、試料ホルダ130内部に設けられた試料を映し出す。

解析システム150もまた試料調製システム100の一部である。解析システム150は、試料ホルダ130内に供された生体試料の画像を解析して、試料の固定に必要な誘因となる事象が起こったのか否かを判断するように構成される。フルイディクス始動システム160もまた試料調製システム100と電気的に接続する。フルイディクス始動システム160は、解析システム150からの誘因となる信号を解析して、固定剤又は他の種類の試薬若しくは流体を、試料ホルダ130内の試料上に放出するように構成される。

画像解析システム150とフルイディクス始動システム160が、外部で試料調製システム100と接続するように図示されているが、試料調製システム100の一部として内蔵されても良いことに留意して欲しい。たとえば本発明の一の実施例では、画像解析システムとフルイディクス始動システムは、試料調製システムの上側部分108内に内蔵されて良い。

それに加えて、本実施例は、顕微鏡の特定の構成に限定されないことに留意して欲しい。たとえば試料の画像を取り込むのに用いられる任意の型の顕微鏡は、本実施例の技術的範囲内に属する。そのような顕微鏡にはたとえば、可視光を利用した光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、赤外及び近赤外顕微鏡、及び、生体試料内で起こる事象を検出できる他の型の顕微鏡が含まれる。当業者は、可視光を利用する顕微鏡を例示した実施例が、他の種類の顕微鏡にも適用されうることをすぐに理解する。

顕微鏡は、取得したい一連の画像を取り込むように構成されて良い。一部の実施例では、顕微鏡は、所定の事象の解析中、試料の画像を連続的に取り込むように構成されて良い。たとえば顕微鏡は、毎秒1000回、100回、50回、10回、又は1回画像を取り込んで良い。あるいはその代わりに又はそれに加えて、顕微鏡は、試料調製システムのユーザーが選択して事前に決定した期間で（複数の）画像を取り込むように構成されて良い。

それに加えてフルイディクス始動システムは、流体を供給するのに適した接続システムを介して試料ホルダと接続して良い。たとえば接続システムは、任意の数のプロセッサにより制御されるマイクロバルブ、マイクロポンプ、マイクロ流体チャネル、マイクロ流体ミキサ、及び/又は液滴システムを含んで良い。しかもフルイディク始動スシステムの接続システムは、所望のパラメータの組の範囲内で、1つ以上の流体を試料ホルダへ供給するように構成されて良い。たとえば、流量、体積、圧力、温度、又は他のパラメータが、フ

ルイディクス始動システムによって制御されて良い。当業者は、試料ホルダへ供給される体積が処理される試料に依存しうることを理解する。たとえば、供給される流体の体積は、試料の種類、試料のサイズすなわち厚さ、又は、試料ホルダのサイズと配置に依存しうる。

任意の適した流体は、試料を処理するように試料ホルダへ供給されて良い。たとえば一部の実施例では、供給された流体は、試料凍結用の流体であって良い。適切な凍結用の流体には、液化窒素、エタン、又はプロパンが含まれて良い。流体は、任意の所望の状態−たとえば液体、気体、又はプラズマ状態−で供給されて良い。当業者は、供給される（複数の）流体の選択が、処理される試料及び/又は実施したい処理に依存しうることを理解する。

しかもフルイディクス始動システムは、試料処理手順の一部として様々な種類の試薬を放出して良い。たとえばフルイディクス始動システムは、当該システムに、脱水処理における次の段階へ進めさせ、染色段階を中止させ、又は、脱水処理の一部として試料のサイズを制御させて良い。それに加えて、流体始動モジュールは、始動サイクルの一部であって良い。複数の種類の生物学的に活性な化合物又は分子が、所定の手順で生体試料へ向けて放出されて良い。よって一例では、流体始動モジュールは、処理手順の一部として、薬、栄養因子、又は他の生物学的に活性な化合物若しくは分子の生体試料への放出を引き起こして良い。処理手順の最終段階は、生体試料への固定剤の放出であって良い。

図2は、一の実施例による試料調製システム100の上側部分108の拡大斜視図である。図示されているように、顕微鏡115は、レンズ120を介して試料ホルダ130の画像を取り込む。試料ホルダ130は、試料調製システム100内で解析されている生体試料を保持するように構成される一連の試料ウエル320a,320b,320cを有する。試料ウエルは、試料調製システム100と接続する流体管330a,330b,330cと接続するように構成される。係る校正では、流体が任意の試料ウエルへ各独立して供給されうる。たとえば試料ウエル320a,320b,320cはそれぞれ、流体チャネル340a,340b,340cとコネクタ350a,350b,350cを介して流体ライン330a,330b,330cと接続して良い。これにより、流体ライン330a,330b,330cのうちの任意のラインへ導入される流体を特定の試料ウエルへ導くことが可能となる。

図3に図示されているように、様々な種類の生体試料が、試料ウエル320a,320b,320cの各々の内部に設けられて良い。たとえば、ウエル内の媒質内で成長する各独立する複数の細胞で構成される組375を有する試料ウエル320aが図示されている。試料ウエル320bが、その試料ウエル320b内に成長する細胞組織の一部380を有した状態で図示されている。最後に、試料ウエル320cが、その試料ウエル320c内で成長する一層の細胞385を有した状態で図示されている。

本実施例は、試料ホルダ300又はプレートホルダ130の具体的構成に限定されないことに留意して欲しい。たとえば、試料を保持して流体の処理−たとえば固定−を可能にする任意の種類の試料ホルダは、本実施例の技術的範囲内である。係る試料ホルダにはたとえば、3個以外の個数の試料ウエルを有する試料ホルダが含まれる。それに加えて、各異なる構成−たとえば各試料ウエルに接続する2本以上の流体ラインを備える構成−の試料ホルダもまた、本実施例の技術的範囲内であると考えられる。

図4は、統合された画像解析システムとフルイディクス始動システムとを有する試料調製システム400の典型的な実施を表すブロック図である。図示されているように、調製システム400は、動作メモリ405と不揮発ストレージ410と接続するプロセッサ420を有する。また、様々な処理モジュールを記憶するメモリ430と1つ以上の入出力(I/O)ポート427もまたプロセッサ420と接続する。

メモリ430は、試料調製システム100がとる動作を制御するのに用いられるソフトウエア又はファームウエア命令を有する複数のモジュールを記憶する。これらの命令は、以降でより詳しく説明するように、選ばれたシステム作業を実行するようにプロセッサ420を構成するのに用いられて良い。

画像取得モジュール435、画像解析モジュール440、フルイディクス管理モジュール455、及びフルイディクス始動モジュール460を有する作業手順制御ユニット432がメモリ430内に存在する。また、試料処理モジュール470及びエラー処理モジュール480もメモリ430内に存在する。作業メモリ405は、メモリ430のモジュール内に含まれるプロセッサの動作命令の組を記憶するプロセッサ420によって利用されて良い。作業メモリ405はまた、システム100の動作中に生成される動的データを記憶するプロセッサ420によって利用されても良い。

作業手順制御ユニット432は、システム400内部での試料の処理の作業手順を制御するように共に機能する複数のモジュールからなる組である。画像解析システムの全体的な動作を制御するようにプロセッサ420を構成する命令を有する画像取得モジュール435が、作業手順制御ユニット432内に存在する。画像取得モジュール435は、所定の回数で又は事前にプログラムされた画像化プロトコルに従ってカメラ115から画像を取り込むようにプロセッサ420を構成する命令を有する。画像取得モジュール435はまた、カメラから記憶装置410へ送られる取り込まれた画像データを受信及び/又は記憶するようにプロセッサ420を構成する命令をも有して良い。

画像解析モジュール440は、画像解析システムから受け取られた画像データを解析して、特定の所定事象が起こったのか否かを判断するようにプロセッサ420を構成する命令を有して良い。たとえばユーザーは、画像解析モジュールが、試料ホルダ内部の試料を解析して、インターナリゼーション事象が細胞内部で起こったのか否かを判断することを事前に決定して良い。よって、試料は、インターナリゼーションを起こす分子によって処理され、かつ、システムは、いつインターナリゼーション事象が起こったのかを判断するようにプログラムされる。一の実施例では、試料はラベリングされた分子によって処理される。よってシステムは、試料内部での細胞の位置を取得及び決定するようにプログラムされる。試料内部での細胞壁の位置と外形を決定することによって、システムはリアルタイムで、特定の細胞内部及び外部の取り込まれた画像の領域を連続的にプロットすることができる。よって画像解析モジュールは、いつ特定のラベルが、細胞の外部からその細胞の内部へ移行したのかを判断することができる。たとえば、特定の色を有する蛍光色素が経時的にプロットされ、かつ、蛍光色素が細胞膜の境界を交差して細胞に入り込んだと、システムが判断するときに、そのシステムは、所定の事象が起こったことを表す印を与えて良い。

他の実施例は、特定の結合事象が起こったのか否かを判断するようにプログラムされた画像解析モジュールを有して良い。たとえばシステムは、細胞膜の表面に結合する特定のラベリングされた分子の存在を解析するようにプログラムされて良い。他の実施例は、画像解析モジュールが、互いにある距離の範囲内にある2つのラベリングされた分子−2つの分子は互いに結合していることを示唆する−を探すようにプログラムされて良い。他の実施例では、ある領域での特定の分子濃度が事象を引き起こしても良い。たとえば画像解析モジュールは、いつ、ある数よりも多くのラベリングされた分子が細胞に入り込むか又は細胞膜と結合するのかを判断するようにプログラムされて良い。当然のこととして、他の実施例は、事象が起こったことを表す印を与える所定の基準を設定するための様々な方法を含む。本発明の態様は、事象の発生を引き起こす特定の方法に限定されない。

画像解析モジュール440は、画像取得モジュール435へのフィードバックが、特定の試料の取り込み方法を更新する命令を有して良い。たとえば解析に依存して、画像解析モジュール440は、事象が起こったのか否かをより明確に判断するため、画像取得モジュール435に、様々な倍率の画像を取り込ませる命令を送信して良い。

フルイディクスシステムの全体の動作を制御するようにプロセッサ420を構成させる命令を有するフルイディクス管理モジュール455が、メモリ430内に存在し、かつ、画像解析モジュール440と接続する。たとえばフルイディクス管理モジュールは、システム400に現在付着する各流体の状態を判断する命令を有して良い。係る情報は、各ステーション内での流体の種類、各流体の温度、並びに、特定の流体を試料ホルダ内部の適切な試料ウエルへ供給するために始動する適切なフルイディクス制御システム、バルブ、及び制御装置の特定を含んで良い。それに加えて、フルイディクス管理モジュール460は、使用される流体の種類に基づいて試料を適切に処理するすべての方法を有して良い。係る方法は、事象が起こったとシステムが判断したとき、特定の期間にわたって、かつ、特定の温度である特定量の流体を供給するためにユーザーが事前に記憶したパラメータを含んで良い。

流体を適切な試料ウエルへ導入させるようにフルイディクス始動システム120へ命令を送るようにプロセッサ420を構成する命令を有する流体始動モジュール460が、流体管理モジュール455と通信する。フルイディクス始動システム460は、フルイディクス管理モジュール455によって生成される所定の処理方法に基づく試料ウエル処理を始動させて良い。一部の実施例では、試料調製の始動は、フルイディクス始動システムの初期化−たとえばフルイディクスラインを使用可能にする、流体圧力を調節する、温度を調節する等−を含んで良い。しかし大抵の場合、事象が画像解析モジュール440によって検出されて、その事象に印が与えられるとすぐに、適切な流体が適切な試料ウエルへ供給されるように、流体始動モジュールは、装置400内の適切なバルブとシステムを始動させるように構成される。

試料処理モジュール470は、試料ウエル内に存在する試料の種類に依存して特別に調節された繰り返し処理を実行するようにプロセッサを構成する命令を有する。たとえば試料が個々の細胞であるときとは対照的に、試料が細胞組織であるときには、フルイディクス方法が実行される必要がある。

エラー処理モジュール480は、試料の処理の際にエラーが発生したか否かを判断して、エラーからの回復を実現するエラー処理の組を実行するようにプロセッサ420を構成する命令を有する。

上述のシステムが様々なモジュールを有するとはいえ、当業者には明らかなように、各モジュールは、1つ以上のサブルーチン、処理、定義された宣言又はマクロを有して良い。各モジュールは一般的には、各独立にコンパイルされ、かつ、単体で実行可能なプログラムにリンクされて良い。従って各モジュールの記載は、好適システムの機能を説明するために便宜上用いられている。よって各モジュールによって行われる処理は、別なモジュールに再配布され、単一のモジュールに結合され、かつ、たとえば共有可能なダイナミックリンクライブラリ内で利用可能であって良い。

本明細書で用いられているように、「命令」とは、システム内で情報を処理するためのコンピュータにより実施可能な段階を指称する。命令は、ソフトウエア、ファームウエア、又はハードウエアにおいて実装可能で、かつ、当該システムの構成要素によって行われる任意の種類のプログラムされた段階を含んで良い。

「マイクロプロセッサ」又は「プロセッサ」は、インテル、AMD、IBM他によって製造されるような従来の汎用、単一コア、又はマルチコアマイクロプロセッサであって良い。それに加えて、マイクロプロセッサは、任意の特殊用途向けマイクロプロセッサ−たとえばデジタル信号プロセッサ、ASIC、フィールドプログラマブルゲートアレイ、又はグラフィックスプロセッサ等−を有して良い。

図示された実施例では、本明細書に記載された任意の動作、処理等は、コンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータ可読命令として実装されてよい。コンピュータ可読命令は、携帯ユニット、ネットワーク素子、及び/又は他の計算装置のプロセッサにより実行されて良い。

本願において開示された発明は、ソフトウエア、ファームウエア、又はハードウエアを生成する標準的な方法を用いることによって、方法、装置、又はコンピュータプログラムとして実施されて良い。本明細書で用いられているように、コンピュータプログラムとは、ハードウエア又はコンピュータ可読媒体−たとえば−光学記憶媒体、揮発性又は不揮発性メモリ−において実装されたコード又は論理を指称する。係るハードウエアには、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)、用途特定型集積回路(ASIC)、複合プログラマブル論理素子(CPLD)、プログラマブル論理アレイ(PLA)、マイクロプロセッサが含まれるが、これらに限定される訳ではない。

それに加えて、モジュール又は命令は、1つ以上のプログラマブル記憶装置−たとえばFLASH装置、CD-ROM、ハードディスク、DVD−に記憶されて良い。

[試料調製の典型的な方法]
図5は、試料調製システム100の一の実施例で動作可能な典型的な方法500を表すフローチャートを示す。方法500は、図4の装置100の一部として表されているメモリ430に含まれている命令によって実施されて良い。

方法500は、ブロック501で開始され、ブロック510へ進む。ブロック510では、試料調製システムが初期化される。たとえば試料調製システムの初期化には、1つ以上のサブシステムの初期化−画像解析システム及び/又はフルイディクス始動システム−が含まれて良い。一旦試料調製システムが初期化されると、方法500はブロック520へ進む。ブロック520では、方法500は、試料の誘因データの受け取りを待つ。試料の誘因データは、試料ウエルへの流体の放出を引き起こす事象を表すデータである。よって上述したように、誘因データは、細胞内部でのラベルの位置、顕微鏡によって検出される結合事象、又は、ユーザーがシステムに事前にプログラムする他の事象を含んで良い。またシステムは、複数の試料ウエルから取り込まれた画像を同時に解析して、誘因事象が試料ホルダ内の試料ウエル内で起こったか否かを判断することに留意して欲しい。従って、誘因事象の組−各試料ウエルにつき1つの誘因事象−が、ブロック520で、定義され、かつ、システムに記憶されて良い。

一旦試料の誘因データがシステムによって受け取られると、方法500はブロック530へ進む。ブロック530では、試料ブロック内での生体試料の画像化が開始される。たとえば一部の実施例では、画像取得モジュール435は、顕微鏡システムに、所定の時点で画像の取得を開始させる命令を送って良い。続いて方法500はブロック535へ進む。ブロック535では、試料の画像がシステムによって受け取られる。受けた取られた試料の画像は、画像解析モジュールによって解析されて良い。

取り込まれた画像がブロック535で受け取られ始めた後、方法500は判定ブロック540へ進む。判定ブロック540では、方法500が、誘因事象が生体試料内で検出されたか否かを評価する。上述したように、この判断は通常、画像解析モジュール440によって実行される。事象の誘因が検出されたのか否かを判断する一の典型的な方法について以降で図6と共に説明する。

図5に戻ると、事象の誘因が検出されなかった場合、方法500はブロック545へ進む。ブロック545では、方法500は試料の画像化を継続する。たとえば方法500は、顕微鏡システムに、所定の画像取り込み方法に従って試料の新しい画像を取り込ませる新しい命令を送って良い。続いて方法500はブロック535へ戻る。ブロック535では、方法500は他の取り込まれた画像を受け取る。判断ブロック540へ戻ると、事象の誘因が検出された場合、方法500はブロック550へ進む。ブロック550では、試料の調製が、所定の流体を所定の試料ウエルへ放出するように始動する。

図5は、一の事象の誘因が検出され、その後試料の調製が始動する単一ループを表しているが、実施例は、より複雑な事象の誘因の処理をも含む。たとえばシステムは、事象を検出し、その後所定の試料処理手順を開始する。第1の始動は、細胞媒質への薬の放出であって良い。続いてシステムは、所定期間待って、第2分子を媒質へ放出して良い。最終的に、全ての処理段階の実行後、システムは、試料を電子顕微鏡用に調製するために固定剤を放出して良い。従って試料の始動は、単一段階処理である必要はなく、その代わりに様々な段階−各段階ではそれぞれの事象の誘因が監視される−を含んで良い。

一旦試料の調製がブロック550で始動されると、方法500はブロック560へ進む。ブロック560では、試料状態が観察される。たとえば別な画像が、試料の調製がプログラムを実行するか否かを判断するために試料状態を観察するのに用いられて良い。たとえば画像解析システムは処理された試料を解析することで、取り込まれた画像が、試料へ放出された処理剤の種類に基づくと予想されるものと整合することを確かめて良い。

続いて方法500は判定ブロック570へ進む。判定ブロック570では、試料の調製が完了したか否かが判断される。試料の調製が完了していないと判断された場合、方法500は、ブロック575へ進んで試料の処理を継続する。ブロック570へ戻る前に、試料の状態は繰り返し観察されて良い（ブロック560）。一旦試料の調製が、判定ブロック570で完了したと判断されると、方法500は判定ブロック580へ進み、エラーが検出されたか否かを評価する。たとえば試料の調製が、画像化された試料が、電子顕微鏡にとって適切であると判断された場合にのみ完了したと判断されて良い。エラーが検出される場合、方法500は、終了ブロック590へ進む前に、エラー処理ブロック585へ進む。しかしエラーが検出されなかった場合、方法500は終了ブロック590へ進む。

図6は、試料調製システム100の一で実施例において実行可能な、事象の誘因が生体試料内で起こったのか否かを判断する典型的方法600のフローチャートである。方法600は、ブロック601で開始され、その後ブロック610へ進む。ブロック610では、取り込まれた画像は、起こりうる誘因事象のために解析される。

取り込まれた画像の解析後、方法600は判定ブロック620へ進む。判定ブロック620では、方法600は、起こりうる誘因事象が検出されたのか否かを評価する。起こりうる誘因事象が検出されなかった場合、方法600は終了ブロック660へ進む。しかし起こりうる誘因事象が検出された場合、方法600はブロック630へ進む。ブロック630では、起こりうる誘因事象が2次誘因地点と比較される。

続いて方法600は判定ブロック640へ進む。判定ブロック640では、方法600は、起こりうる誘因事象が2次誘因地点と一致するか否かを評価する。起こりうる誘因事象が2次誘因地点と一致しない場合、方法600は終了ブロック660へ進む。起こりうる誘因事象が2次誘因地点と一致する場合、方法600はブロック650へ進む。ブロック650では、始動用の1つ以上の適切なサブシステムが特定される。その後方法600は終了ブロック660へ進む。

本実施例は、調製段階の処理制御のために画像解析を利用することによって試料を調製する方法の一実施例を説明する。

蛍光マーカーによってラベルが付された抗体が用意される。細胞への抗体のインターナリゼーションが起こった際に細胞にどのような変化が起こるのかを調べるため、患者からの細胞組織試料と試料とを接触させる。試料調製システムは、細胞の画像を解析して、試料内部での各細胞の細胞膜を決定し、かつ、細胞膜の境界を交差する抗体が検出されるときに固定流体を始動させるようにプログラムされる。

細胞組織の試料とラベリングされた抗体を培養した後、画像解析システムは、抗体が、細胞膜を交差するのを検出して、フルイディクス始動システムを初期化する。この結果、細胞組織試料を格納する試料のウエルへ冷たい液体エタンが放出され、その時点で試料は冷凍される。このとき抗体は細胞膜を交差している。

本実施例は、調製段階の処理制御のために画像解析を利用することによって試料を調製する方法の一実施例を説明する。この例では、カバースリップ上で成長した生きているほ乳類が解析されることで、いつ特定の細胞事象が起こったのかが判断される。たとえばこの例では、ほ乳類の細胞は、いつの蛍光ラベルが付されたポリヌクレオチドが細胞核に到達するのかを判断するように解析される。一旦この所定の誘因値がシステム内に記憶されると、ラベルが付されたポリヌクレオチドによる処理後にほ乳類の細胞の画像を取り込むため、試料調製システムは実行を開始する。

この例は蛍光ラベル検出を用いているが、様々な画像化モード−たとえば蛍光、反射、干渉反射、透過光、（定量的）位相コントラストが、様々な試料特性の情報を収集するのに用いられて良い。特性に関する一の情報又は複数の情報の結合は、追跡された小胞内での強度変化に基づく媒質へのカーゴ小胞のエキソサイトーシスの瞬間を決定するのに用いられる。カーゴ小胞のエキソサイトーシスが光学顕微鏡によって検出される瞬間を検出することで、フルイディクス始動システムは、電子顕微鏡用にその状態で細胞を固定するために固定剤を放出するように始動する。この実施例によると、試料は全くラベリングされる必要はなく、むしろ画像解析システムは、ある細胞事象−たとえばエキソサイトーシス−を検出し、その後フルイディクスシステムを始動させるようにプログラムされる。

本願明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考える。本願明細書は、好適実施例を詳細に説明し、本願発明者等が最善と考える実施形態を記載している。しかし上記説明にかかわらず、本実施例は多くの方法による実施が可能であり、かつ、本実施例は、特許請求の範囲の記載及びその均等物に従って構築されなければならない。

［付記1］
カメラによって生体試料の画像を提供するように構成された顕微鏡と、前記カメラからの画像を解析して検出可能な事象が前記生体試料内で起こったか否かを判断するように構成された画像解析モジュールを有する、試料の調製を制御する装置であって、
検出可能な事象が発見された場合には始動するように構成されるフルイディクス始動モジュールを有し、前記始動の結果、前記生体試料は処理される、
ことを特徴とする装置。
［付記2］
前記顕微鏡が光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡である、装置。
［付記3］
前記画像解析モジュールが、前記生体試料内における蛍光、反射、干渉反射、透過光、コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)顕微分光法、2次和周波発生(SHG)法、3次和周波発生法、又は定量的位相コントラストのうちの少なくとも1つを決定するように構成される、装置。
［付記4］
前記画像解析モジュールが、分子結合若しくは抗体結合の検出、又は、蛍光分子、受容体インターナリゼーション、受容体結合、若しくは膜によるイオン交換の検出に基づいて、検出可能な事象が起こったのか否かを判断する、装置。
［付記5］
前記フルイディクス始動モジュールが、前記生体試料の固定、又は、前記生体試料への薬、栄養因子、若しくは他の生物学的に活性名化合物若しくは分子の放出を引き起こすように構成される、装置。
［付記6］
前記フルイディクス始動モジュールが前記生体試料に一連の処理を実行し、かつ、
最終処理が固定処理である、装置。
［付記7］
生体試料の調製を制御するシステムにおける方法であって、
顕微鏡で生体試料の画像を取得する段階、
前記画像を解析して検出可能な事象が起こったか否かを判断する段階、及び、
前記検出可能な事象が起こった場合には、フルイディクスサブシステムを始動させて、前記生体試料を電子顕微鏡用に調製する段階、
を有することを特徴とする方法。
［付記8］
前記顕微鏡からさらなる画像を取得して、前記試料の調製が完了したか否かを判断する段階をさらに有する、方法。
［付記9］
前記生体試料を電子顕微鏡用に調製する段階が、前記生体試料に所定の一連の処理を実行する段階、その後前記試料を固定剤によって処理する段階を有する、方法。
［付記10］
前記検出可能な事象が起こったか否かを判断する段階が、前記検出可能な事象と、当該システムのメモリ内に記憶された所定の誘因地点とを比較する段階を含む、方法。
［付記11］
前記顕微鏡が光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡である、方法。
［付記12］
前記画像を解析する段階が、前記生体試料内における蛍光、反射、干渉反射、透過光、又は定量的位相コントラストのうちの少なくとも1つを決定する段階をさらに有する、方法。
［付記13］
前記画像を解析して検出可能な事象が起こったか否かを判断する段階が、前記画像を解析して、分子結合若しくは抗体結合の検出、又は、蛍光分子、受容体インターナリゼーション、受容体結合、若しくは膜によるイオン交換を検出する段階を有する、方法。
［付記14］
前記生体試料を電子顕微鏡用に調製する段階が、液化窒素、エタン、又はプロパンを放出する段階を含む、方法。
［付記15］
前記フルイディクスサブシステムを始動させる段階が、脱水方法における次の段階へ進む段階、染色段階を中止する段階、又は、試料のサイズを制御する段階を含む、方法。

100 試料調製システム
105 底部
108 上側部分
109 表示装置
110 顕微鏡ステーション
115 高解像度カメラ
120 レンズ系
130 試料ホルダ
150 画像解析システム
160 フルイディクス始動システム
320a,b,c 試料ウエル
330a,b,c 流体用管
340a,b,c 流体チャネル
350a,b,c コネクタ
375 細胞
380 細胞組織
385 一層の組織

Claims (13)

1. カメラによって生体試料の複数の画像を提供するように構成された光学顕微鏡と、前記カメラからの前記複数の画像を解析するように構成された画像解析モジュールとフルイディクス始動モジュールとを有する、電子顕微鏡法のための生体試料の調製を制御する装置であって、
   前記画像解析モジュールは、検出可能な細胞の事象のために前記カメラからの前記複数の画像を観察するように構成されており、
   前記フルイディクス始動モジュールは、前記観察中に前記検出可能な細胞の事象が起こった場合に、前記画像解析モジュールによって始動されるように構成されており、前記始動の結果、前記生体試料を電子顕微鏡用に調製するために流体を前記試料上に放出する、
   ことを特徴とする装置。
2. 前記画像解析モジュールが、前記生体試料内における蛍光、反射、干渉反射、透過光、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微分光法、２次和周波発生（ＳＨＧ）法、３次和周波発生法、又は定量的位相コントラストのうちの少なくとも１つを決定するように構成される、請求項１に記載の装置。
3. 前記画像解析モジュールが、分子結合若しくは抗体結合の検出、又は、蛍光分子、受容体インターナリゼーション、受容体結合、若しくは膜によるイオン交換の検出に基づいて、前記検出可能な細胞の事象が起こったのか否かを判断する、請求項１に記載の装置。
4. 前記フルイディクス始動モジュールが、前記生体試料の固定、又は、前記生体試料への薬、栄養因子、若しくは他の生物学的に活性な化合物若しくは分子の放出を引き起こすように構成される、請求項１乃至３のうちいずれか一項に記載の装置。
5. 前記フルイディクス始動モジュールが前記生体試料に一連の処理を実行し、
   最終処理が固定処理である、
   請求項１乃至３のうちいずれか一項に記載の装置。
6. 電子顕微鏡法のための生体試料の調製を制御するシステムにおける方法であって、
   光学顕微鏡で前記生体試料の複数の画像を取得する段階、
   検出可能な細胞の事象の発生を検出するために画像解析モジュールが前記複数の画像を観察する段階、及び、
   前記観察中に前記細胞の事象が検出された場合には、画像解析モジュールによってフルイディクスサブシステムを始動させる段階であって、前記始動の結果、前記生体試料を電子顕微鏡用に調製するために、前記フルイディクスサブシステムが流体を前記試料上に放出する、段階、
   を有することを特徴とする方法。
7. 前記顕微鏡からさらなる画像を取得して、前記試料の調製が完了したか否かを判断する段階をさらに有する、請求項６に記載の方法。
8. 前記生体試料を電子顕微鏡用に調製する段階が、前記生体試料に所定の一連の処理を実行する段階、その後前記試料を固定剤によって処理する段階を有する、請求項７に記載の方法。
9. 前記検出可能な細胞の事象が起こったか否かを判断する段階が、前記検出可能な細胞の事象を前記システムのメモリ内に記憶された所定事象と比較する段階をさらに含む、請求項６に記載の方法。
10. 前記画像を解析する段階が、前記生体試料内における蛍光、反射、干渉反射、透過光、又は定量的位相コントラストのうちの少なくとも１つを決定する段階をさらに有する、請求項６に記載の方法。
11. 前記画像を解析して検出可能な細胞の事象が起こったか否かを判断する段階が、前記画像を解析して、分子結合若しくは抗体結合の検出、又は、蛍光分子、受容体インターナリゼーション、受容体結合、若しくは膜によるイオン交換を検出する段階を有する、請求項６に記載の方法。
12. 前記生体試料を電子顕微鏡用に調製する段階が、液化窒素、エタン、又はプロパンを放出する段階を含む、請求項６に記載の方法。
13. 前記フルイディクスサブシステムを始動させる段階が、脱水方法における次の段階へ進む段階、染色段階を中止する段階、又は、試料のサイズを制御する段階を含む、請求項６に記載の方法。

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