JP2018033413A - 核酸増幅反応容器、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応方法 - Google Patents

Abstract

【課題】異物が混入する可能性を低くすることができる核酸増幅反応容器を提供する。【解決手段】第２領域は、屈曲した形状を有し、第３領域は、第１領域および前記第２領域と異なる領域であって、前記第１領域と前記第２領域との間の反応液が流動する領域以外の領域に位置し、前記流路は、前記第２領域と前記第３領域との間の前記流路において第１屈曲部および第２屈曲部を有し、前記流路を前記第３領域から前記第２領域に向かう場合、前記第１屈曲部は、１番目の屈曲部であり、前記第２屈曲部は、２番目の屈曲部であり、前記第１屈曲部および前記第２屈曲部は、同じ方向側に屈曲し、前記第３領域と前記第１屈曲部との間の前記流路の方向は、前記第１屈曲部と前記第２屈曲部との間の前記流路の方向に対して、９０°以下で屈曲し、前記第３領域には、試薬が配置されている、核酸増幅反応容器。【選択図】図１

Description

本発明は、核酸増幅反応容器、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応方法に関する。

近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。

ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。核酸の増幅は、例えば、プローブを用いることにより定量することができる。

ＰＣＲの高速化は、遺伝子検査の検査時間短縮化のために必要な技術であり、遺伝子検査の業界において非常に期待されている。

例えば特許文献１には、ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭ、プライマーが少なくとも２μＭの濃度で提供され、１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する方法が記載されている。

特表２０１５−５２０６１４号公報

発明者らは、鋭意研究の結果、プローブが核酸増幅反応を阻害して、ＰＣＲの高速化が不十分になることを見出した。そのため、核酸増幅反応を行った後に、反応液にプローブを混合させることが考えられる。

しかしながら、核酸増幅反応を行った後に、核酸増幅反応容器の蓋を開けてプローブを反応液に混合させると、核酸増幅反応容器に異物が混入することが懸念される。

本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、異物が混入する可能性を低くすることができる核酸増幅反応容器を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を装着可能な核酸増幅反応装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法を提供することにある。

本発明に係る核酸増幅反応容器は、
第１領域、第２領域、および第３領域を有し、試薬を含む反応液が流動可能な流路を含み、前記反応液を前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う核酸増幅反応容器であって、
前記第２領域は、屈曲した形状を有し、
前記第３領域は、前記第１領域および前記第２領域と異なる領域であって、前記第１領域と前記第２領域との間の前記反応液が流動する領域以外の領域に位置し、
前記流路は、前記第２領域と前記第３領域との間の前記流路において第１屈曲部および第２屈曲部を有し、
前記流路を前記第３領域から前記第２領域に向かう場合、
前記第１屈曲部は、１番目の屈曲部であり、
前記第２屈曲部は、２番目の屈曲部であり、
前記第１屈曲部および前記第２屈曲部は、同じ方向側に屈曲し、
前記第３領域と前記第１屈曲部との間の前記流路の方向は、前記第１屈曲部と前記第２屈曲部との間の前記流路の方向に対して、９０°以下で屈曲し、
前記第３領域には、試薬が配置されている。

このような核酸増幅反応容器では、核酸増幅反応を行った後に、核酸増幅反応容器の蓋を開けて試薬を核酸増幅反応容器に導入する必要がない。そのため、このような核酸増幅反応容器では、異物が混入する可能性を低くすることができる。さらに、このような核酸増幅反応容器では、反応液を、第１領域と第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行っている最中に、反応液と第３領域に配置された試薬とが接触する可能性を低くすることができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記試薬は、プローブを含んでもよい。

このような核酸増幅反応容器では、プローブが核酸増幅反応を阻害することを抑制することができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記流路は、前記第２屈曲部と前記第２領域との間の前記流路において第３屈曲部を有し、
前記流路を前記第３領域から前記第２領域に向かう場合、
前記第１屈曲部、前記第２屈曲部、および前記第３屈曲部は、同じ方向側に屈曲していてもよい。

このような核酸増幅反応容器では、反応液を、第１領域と第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行っている最中に、反応液とプローブとが接触する可能性を、より低くすることができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域は、標的核酸を導入する導入口と連通してもよい。

このような核酸増幅反応容器では、標的核酸を導入口から第１領域へ導入することができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域には、前記試薬が配置され、
前記第１領域に配置された前記試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、を含んでもよい。

このような核酸増幅反応容器では、第１領域に配置された試薬を用いて核酸増幅反応を行うことができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域に配置された前記試薬は、凍結乾燥状態で配置されていてもよい。

このような核酸増幅反応容器では、第１領域に配置された試薬を、第１領域を規定する容器本体の内壁に貼り付けておくことができ、第１領域に配置された試薬と第３領域に配置された試薬とを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第３領域に配置された試薬は、凍結乾燥状態で配置されていてもよい。

このような核酸増幅反応容器では、第３領域に配置された試薬を、第３領域を規定する容器本体の内壁に貼り付けておくことができ、第１領域に配置された試薬と第３領域に配置された試薬とを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第３領域に配置された試薬は、ポリメラーゼを含んでもよい。

このような核酸増幅反応容器では、第１領域に配置された試薬に含まれるポリメラーゼによってのみプローブを分解させる場合に比べて、例えば、より確実にプローブを分解させることができる。

本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記流路は、第１内壁と、前記第１内壁に対向する第２内壁と、に挟まれ、
前記第１内壁と前記第２内壁との間の距離は、前記流路に前記反応液が導入された場合に、前記反応液が前記第１内壁および前記第２内壁に接触する長さであってもよい。

このような核酸増幅反応容器では、加熱部の熱を反応液に十分に伝えることができる。

本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、
前記第１領域を第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、および前記第３領域に移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。

このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を装着可能なため、異物が混入する可能性を低くすることができる。

本発明に係る核酸増幅反応装置において、
前記第３領域を前記第１温度よりも低い第３温度に加熱する第３加熱部を含んでもよい。

このような核酸増幅反応装置では、第３加熱部によって第３領域を第３温度に加熱することができる。

本発明に係る核酸増幅反応装置は、
前記第３領域に配置された前記試薬が混合した前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含んでもよい。

このような核酸増幅反応装置では、第３領域に配置された試薬が混合した反応液からの蛍光を検出することができる。

本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度の前記第１領域と、前記第１温度よりも低い第２温度の前記第２領域と、の間で往復させて、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応工程と、
前記核酸増幅反応工程の後に、前記反応液を前記第１温度よりも低い第３温度の第３領域に移動させて、前記反応液に、前記第３領域に配置された前記試薬を混合する混合工程と、
前記混合工程の後に、前記反応液を前記第１領域に移動させる第１移動工程と、
前記第１移動工程の後に、前記反応液を前記第２領域または前記第３領域に移動させる第２移動工程と、
前記第２移動工程の後に、前記反応液からの蛍光を検出する検出工程と、
を含む。

このような核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応容器を用いるため、異物が混入する可能性を低くすることができる。

本実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。 本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。

以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

１． 核酸増幅反応容器
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す断面図である。図２は、本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。なお、図１および図２では、互いに直交する３軸として、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸を図示している。

核酸増幅反応容器１００は、図１および図２に示すように、容器本体１０を含む。容器本体１０の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。核酸増幅反応容器１００は、容器本体１０によって形成された流路２０を含む。流路２０には、第１試薬２および第２試薬４が設けられている。

１．１． 流路
流路２０は、反応液６が流動可能な流路である。流路２０は、密封されている。なお、図１では、流路２０に反応液６が配置される前の状態を示し、図２では、流路２０に反応液６が配置された状態を示している。

反応液６は、標的核酸（鋳型核酸）を含む鋳型核酸溶液と、容器本体１０内に配置された第１試薬２と、が接触することによって調整（生成）される。したがって、反応液６は、鋳型核酸および第１試薬２を（鋳型核酸の成分および第１試薬２の成分を）含むこととなり、核酸増幅反応を進行させる場となる。鋳型核酸は、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）であってもよいし、ＲＮＡ（Ｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）であってもよい。

流路２０には、液体（図示せず）が収容されている。液体は、反応液６とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体は、反応液６と異なる比重を有している。具体的には、液体の比重は、反応液６の比重よりも小さい。液体は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。液体は、容器本体１０の内壁を覆っており、流路２０に反応液６が配置された際に反応液６の表面を覆う。液体は、流路２０に充填されていない。これにより、核酸増幅反応容器１００では、液体が流路２０を充填する場合に比べて、反応液６を速く移動させることができる。

流路２０は、図１に示すように、第１領域３０と、第２領域３２と、第３領域３４と、を有している。流路２０の第１領域３０は、第１温度に加熱される領域である。第１領域３０に位置する反応液６は、例えば、第１温度に加熱される。第１温度は、二本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。第１領域３０は、例えば、流路２０の、第１加熱部５０（図３参照）に設けられた開口部５０ａ内に位置する部分である。

流路２０の第１領域３０は、図２に示すように、標的核酸（鋳型核酸）を含む鋳型核酸溶液を導入する導入口３１と連通する。図示の例では、導入口３１は、蓋１２によって塞がれている。核酸増幅反応容器１００では、蓋１２を開けて鋳型核酸溶液を流路２０に導入することができる。容器本体１０および蓋１２によって、流路２０は、密封されている。

流路２０の第２領域３２は、第１領域３０と異なる領域である。第２領域３２は、第１温度よりも低い第２温度に加熱される領域である。第２領域３２に位置する反応液６は、例えば、第２温度に加熱される。第２温度は、プライマーのアニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。第２領域３２は、例えば、流路２０の、第２加熱部５２（図３参照）に設けられた開口部５２ａ内に位置する部分である。

流路２０の第３領域３４は、第１領域３０および第２領域３２と異なる領域であって、第１領域３０と第２領域３２との間の反応液６が流動する領域以外の領域に位置する。図１に示す例では、第３領域３４は、第１領域３０および第２領域３２と異なる領域であって、第１領域３０と第２領域３２との間以外に位置する領域である。第３領域３４は、第１温度よりも低い第３温度に加熱される領域である。第３領域３４に位置する反応液６は、例えば、第３温度に加熱される。第３温度は、第２温度よりも高くてもよいし、第２温度と同じでもよいし、第２温度よりも低くてもよい。第３温度は、プローブが混合された反応液６からの蛍光を検出するのに適した温度である。第３領域３４は、例えば、流路２０の、第３加熱部５４（図３参照）に設けられた開口部５４ａ内に位置する部分である。

例えばプローブのＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値がプライマーのＴｍ値よりも低い場合、第３温度は、第２温度よりも低いことが好ましい。第３温度が第２温度よりも低いと、第３温度が第２温度以上の場合に比べて、反応液６を第１領域３０から第３領域３４へ移動させる際に、反応液６に対する降温速度を速くすることできる。これにより、プライマーのアニーリングの確率を低くして、プローブのハイブリダイゼーションの確率を高くすることができる。したがって、反応液６からの蛍光強度を高くすることができる。第３温度は、例えば、４０℃以上１０５℃以下である。

流路２０は、図１に示すように、第１流路２１と、第２流路２２と、第３流路２３と、第４流路２４と、第５流路２５と、第６流路２６と、を有する。流路２１，２２，２３，２４，２５，２６は、例えば、直線状の流路である。流路２１，２２，２３，２４，２５，２６の形状は、例えば、直方体である。

第１流路２１は、第１領域３０を有する。第１領域３０は、第１流路２１の一方側の端部である。図示の例では、第１流路２１は、一方側の端部から他方側の端部へ、＋Ｘ軸方向側に延出している。

第２流路２２は、第１流路２１に屈曲して接続されている。流路２０は、第１流路２１と第２流路２２との接続部において、屈曲部４０を有する。図示の例では、屈曲部４０は、角部である。第２流路２２は、第２領域３２を有する。第２流路２２の一方の端部は、第１流路２１の他方の端部に接続され、第２領域３２は、第２流路２２の他方の端部である。図示の例では、第２流路２２は、一方側の端部から他方側の端部へ、＋Ｙ軸方向側に延出している。すなわち、第２流路２２の方向（延出方向）は、第１流路２１の方向と直交している。

なお、第２流路２２の方向は、第１流路２１の方向と直交していなくてもよい。例えば、第２流路２２の方向の第１流路２１の方向に対する角度（図示の例では第１流路２１と第２流路２２との交わり角）αは、例えば、７０°以上１１０°以下であってもよい。このことは、後述する屈曲部４２，４４，４６についても同様である。

また、図示はしないが、屈曲部４０は、角部ではなく、曲線を有する形状（例えば円弧状）であってもよい。このことは、後述する屈曲部４２，４４，４６についても同様である。

第３流路２３は、第２流路２２に屈曲して接続されている。流路２０は、第２流路２２と第３流路２３との接続部において、屈曲部４２を有する。図示の例では、屈曲部４２は、角部である。第３流路２３は、屈曲部４２において第２領域３２を有する。すなわち、第２領域３２は、屈曲した形状を有している。第２領域３２は、第３流路２３の一方側の端部である。図示の例では、第３流路２３は、一方側の端部から他方側の端部へ、−Ｘ軸方向側に延出している。すなわち、第３流路２３の方向は、第１流路２１の方向と平行であり、第２流路２２の方向と直交している。

第４流路２４は、第３流路２３に屈曲して接続されている。流路２０は、第３流路２３と第４流路２４との接続部において、屈曲部４４を有する。図示の例では、屈曲部４４は、角部である。第４流路２４の一方の端部は、第３流路２３の他方の端部に接続されている。図示の例では、第４流路２４は、一方側の端部から他方側の端部へ、−Ｙ軸方向側に延出している。すなわち、第４流路２４の方向は、第２流路２２の方向と平行であり、第３流路２３の方向と直交している。

第５流路２５は、第４流路２４に屈曲して接続されている。流路２０は、第４流路２４と第５流路２５との接続部において、屈曲部４６を有する。図示の例では、屈曲部４６は、角部である。第５流路２５の一方の端部は、第４流路２４の他方の端部に接続されている。図示の例では、第５流路２５は、一方側の端部から他方側の端部へ、＋Ｘ軸方向側に延出している。すなわち、第５流路２５の方向は、第１流路２１の方向および第３流路２３の方向と平行であり、第４流路２４の方向と直交している。

第６流路２６は、第５流路２５に屈曲して接続されている。流路２０は、第５流路２５と第６流路２６との接続部において、屈曲部４８を有する。図示の例では、屈曲部４８は、角部である。第６流路２６は、第３領域３４を有する。第６流路２６の一方の端部は、第５流路２５の他方の端部に接続され、第３領域３４は、第６流路２６の他方の端部である。図示の例では、第６流路２６は、一方側の端部から他方側の端部へ、＋Ｙ軸方向側に延出している。すなわち、第６流路２６の方向は、第２流路２２の方向および第４流路２４の方向と平行であり、第５流路２５の方向と直交している。なお、図示はしないが、屈曲部４８は、角部ではなく、曲線を有する形状（例えば円弧状）であってもよい。

流路２０は、上記のように、第１領域３０と第２領域３２との間の流路２０において、屈曲部４０を有する。流路２０は、第２領域３２と第３領域３４との間の流路２０において、屈曲部４４，４６，４８を有する。流路２０は、第１領域３０と第３領域３４との間の流路において、屈曲部４０，４２，４４，４６，４８を有する。

流路２０に沿って、流路２０を第３領域３４から第２領域３２に向かう場合、屈曲部４８は、１番目の（１番目に到達する）第１屈曲部であり、屈曲部４６は、２番目の（２番目に到達する）第２屈曲部であり、屈曲部４４は、３番目の（３番目に到達する）第３屈曲部である。すなわち、流路２０を第３領域３４から第２領域３２に向かう場合、屈曲部４８、屈曲部４６、屈曲部４４の順で配置されている。流路２０は、屈曲部４６と第２領域３２との間の流路２０において、屈曲部４４を有する。

流路２０に沿って、流路２０を第３領域３４から第２領域３２に向かう場合、屈曲部４４，４６，４８は、同じ方向側に屈曲している。図示の例では、流路２０に沿って、流路２０を第３領域３４から第１領域３０に向かう場合、屈曲部４０，４２，４４，４６，４８は、同じ方向側に屈曲している。例えば、流路２０に沿って、流路２０を第３領域３４から第１領域３０に向かう場合、第３領域３４から第６流路２６を通り屈曲部４８において右側に屈曲し、第５流路２５を通り屈曲部４６において右側に屈曲し、第４流路２４を通り屈曲部４４において右側に屈曲し、第３流路２３を通り屈曲部４２において右側に屈曲し、第２流路２２を通り屈曲部４０において右側に屈曲し、第１流路２１を通り第１領域３０に至る。流路２０は、例えば、略螺旋状の形状（略渦巻き状の形状）を有している。

流路２０に沿って、流路２０を第３領域３４から第２領域３２に向かう場合、第３領域３４と屈曲部４８との間の第６流路２６の方向は、屈曲部４８と屈曲部４６との間の第５流路２５の方向に対して、９０°以下で屈曲している。すなわち、第６流路２６の方向の第５流路２５の方向に対する角度（図示の例では第５流路２５と第６流路２６との交わり角）βは、９０°以下であり、例えば５°以上９０°以下であり、図示の例では９０°である。

なお、図１に示すように、角度βは、第５流路２５および第６流路２６の外側を（流路２０の外側を）規定する容器本体１０の内壁の交わり角度である。また、角度αは、第１流路２１および第２流路２２の外側を（流路２０の外側を）規定する容器本体１０の内壁の交わり角度である。

流路２０は、図２に示すように、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれている。第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂは、容器本体１０の内壁である。内壁１０ａ，１０ｂによって、流路２０は形成されている。第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。具体的には、距離Ｄは、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下である。距離Ｄを０．５ｍｍ以上とすることにより、核酸増幅反応容器１００の製造が困難になることを抑制することができる。距離Ｄを３ｍｍ以下とすることにより、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。

核酸増幅反応容器１００は、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行うため容器である。さらに、核酸増幅反応容器１００は、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させた後に、反応液６を第３領域３４に移動させ、反応液６からの蛍光を検出するための容器である。

なお、流路２０は、屈曲部４６，４８を有していれば、屈曲部の数は、特に限定されない。上記の例では、流路２０は、５つの屈曲部を有していたが、流路２０は、６つ以上の屈曲部を有していてもよいし、２つ以上４つ以下の屈曲部を有していてもよい。

１．２． 第１試薬
第１試薬２は、図１に示すように、第１領域３０に配置されている。第１試薬２は、第２試薬４と離間した状態で配置されている。第１試薬２は、導入口３１から第１領域３０に導入されてもよい。第１試薬２は、例えば、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第１試薬２は、第１領域３０を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。なお、第１試薬２は、液体の状態で配置されていてもよい。第１試薬２は、核酸を増幅させるための試薬である。第１試薬２は、例えば、プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。

プライマーは、鋳型核酸にアニーリングするよう設計されている。アニーリングとは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。第１試薬２は、プライマーとして、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。第２試薬４が混合された反応液６に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。

ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。第２試薬４が混合された反応液６に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。

ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。第２試薬４が混合された反応液６に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。

バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、バッファーのＰＨを調整することができる。バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。第２試薬４が混合された反応液６に含まれる２価の陽イオンの濃度は、例えば、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。

鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、第１試薬２は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。

第１試薬２が凍結乾燥されている場合、第１試薬２は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、特にトレハロースは、凍結保護剤としての機能が高く、強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、第１試薬２の各成分を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。なお、第２試薬４が凍結乾燥されている場合、第２試薬４も糖を含んでもよい。

１．３． 第２試薬
第２試薬４は、第３領域３４に配置されている。第２試薬４は、第３領域３４と連通する導入口（図示せず）から第３領域３４に導入されてもよい。該導入口は、第２試薬４が導入された後、蓋（図示せず）によって塞がれてもよい。第２試薬４は、例えば、凍結乾燥状態で配置されている。これにより、第２試薬４は、第３領域３４を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。なお、第２試薬４は、液体の状態で配置されていてもよい。第２試薬４は、核酸の増幅量を定量するための試薬である。第２試薬４は、例えば、プローブ、ポリメラーゼと、を含む。

プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。容器本体１０の、少なくとも第３領域３４を規定する部分は、プローブが混合された反応液６からの蛍光、および蛍光を得るための励起光を透過することができる材料で構成されている。反応液６に第２試薬４が混合された場合、反応液６に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上７．２μＭ以下であり、好ましくは０．９μＭ以上３．６μＭ以下である。

プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであってもよい。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有しているポリメラーゼを用いる。

プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼを用いる。５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤポリメラーゼがあるが、この酵素は、一般的に用いられるＴａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。

第２試薬４に含まれるポリメラーゼは、第２試薬４に含まれるプローブとして加水分解プローブを用いる場合は、例えばＴａｑポリメラーゼを用いる。第２試薬４に含まれるプローブとしてＱプローブを用いる場合は、例えばＫＯＤポリメラーゼを用いる。なお、第２試薬４は、ポリメラーゼを含まず、プローブのみによって構成されていてもよい。

核酸増幅反応容器１００は、例えば、以下の特徴を有する。

核酸増幅反応容器１００では、流路２０を第３領域３４から第２領域３２に向かう場合、屈曲部４８は、１番目の屈曲部であり、屈曲部４６は、２番目の屈曲部であり、屈曲部４６，４８は、同じ方向側に屈曲し、第３領域３４と屈曲部４８との間の流路２０の方向は、屈曲部４８と屈曲部４６との間の流路２０の方向に対して、９０°以下で屈曲し、第３領域３４には、第２試薬４が配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、例えば第２試薬４が液体の状態で配置されていたとしても、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行っている最中に、反応液６と第２試薬４とが接触する可能性を低くすることができる。したがって、核酸増幅反応容器１００では、核酸増幅反応を行った後に、核酸増幅反応容器１００の蓋を開けて第２試薬４を核酸増幅反応容器１００に導入する必要がない。そのため、核酸増幅反応容器１００では、異物が混入する可能性を低くすることができる。さらに、核酸増幅反応を行った後に蓋を開けて第２試薬４を容器に導入する場合に比べて、作業を簡便にすることができる。

核酸増幅反応容器１００では、第２試薬４は、プローブを含む。そのため、核酸増幅反応容器１００では、プローブが核酸増幅反応を阻害することを抑制することができる。

核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、屈曲部４６と第２領域３２との間の流路２０において屈曲部４４を有し、流路２０を第３領域３４から第２領域３２に向かう場合、屈曲部４４，４６，４８は、同じ方向側に屈曲している。そのため、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行っている最中に、反応液６と第２試薬４とが接触する可能性を、より低くすることができる。

核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０は、標的核酸を導入する導入口３１と連通する。そのため、核酸増幅反応容器１００では、標的核酸を導入口３１から第１領域３０へ導入することができる。

核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０には、第１試薬２が配置され、第１試薬２は、プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、を含む。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１試薬２を用いて、核酸増幅反応を行うことができる。

核酸増幅反応容器１００では、第１試薬２は、凍結乾燥状態で配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１試薬２を、第１領域３０を規定する容器本体１０の内壁に貼り付けておくことができ、第１試薬２が液体の状態で配置されている場合に比べて、第１試薬２と第２試薬４とを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、第１試薬２の保存安定性を高めることができる。

核酸増幅反応容器１００では、第２試薬４は、凍結乾燥状態で配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第２試薬４を、第３領域３４を規定する容器本体１０の内壁に貼り付けておくことができ、第２試薬４が液体の状態で配置されている場合に比べて、第１試薬２と第２試薬４とを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、第２試薬４の保存安定性を高めることができる。

核酸増幅反応容器１００では、第２試薬４は、ポリメラーゼを含む。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１試薬２に含まれるポリメラーゼによってのみプローブを分解させる場合に比べて、例えば、より確実にプローブを分解させることができる。

核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれ、第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。そのため、核酸増幅反応容器１００では、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。

なお、第１試薬２および第２試薬４が含む成分は、上記の例に限定されない。例えば、第１試薬２は、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法における１回目のＰＣＲを行うための試薬であってもよいし、第２試薬４は、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法における２回目のＰＣＲを行うための試薬であってもよい。第２試薬４は、プローブを含んでいなくてもよい。

２． 核酸増幅反応装置
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図３は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００を模式的に示す断面図である。図４は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００を模式的に示す図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。図５は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００の機能ブロック図である。なお、図３および図４では、互いに直交する３軸として、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸を図示している。

本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を装着可能である。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器１００を装着可能な核酸増幅反応装置２００について説明する。

核酸増幅反応装置２００は、図３〜図５に示すように、第１加熱部５０と、第２加熱部５２と、第３加熱部５４と、駆動機構６０と、検出機構７０と、処理部８０と、操作部８２と、表示部８４と、記憶部８６と、を含む。核酸増幅反応装置２００は、核酸増幅反応容器１００を含んでもよい。

なお、便宜上、図３および図４では、駆動機構６０、検出機構７０、処理部８０、操作部８２、表示部８４、および記憶部８６の図示を省略している。また、図４では、第２試薬４の図示を省略している。また、図５では、核酸増幅反応容器１００および加熱部５０，５２，５４の図示を省略している。

第１加熱部５０、第２加熱部５２、および第３加熱部５４は、核酸増幅反応容器１００に接して設けられている。加熱部５０，５２，５４は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器１００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部５０，５２，５４の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部８０によって制御されていてもよい。

第１加熱部５０は、流路２０の第１領域３０を第１温度に加熱する。具体的には、第１加熱部５０は、例えば、第１領域３０に位置する反応液６を第１温度に加熱する。第１加熱部５０には、開口部５０ａが設けられている。図示の例では、開口部５０ａは、有底の穴である。第１領域３０は、開口部５０ａに挿入された領域である。開口部５０ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。

第２加熱部５２は、流路２０の第２領域３２を第２温度に加熱する。具体的には、第２加熱部５２は、例えば、第２領域３２に位置する反応液６を第２温度に加熱する。第２加熱部５２には、開口部５２ａが設けられている。図示の例では、開口部５２ａは、第２加熱部５２を貫通する貫通孔であり、屈曲した形状を有している。第２領域３２は、開口部５２ａに挿入された領域である。開口部５２ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。

第３加熱部５４は、流路２０の第３領域３４を第３温度に加熱する。具体的には、第３加熱部５４は、例えば、第３領域３４に位置する反応液６を第３温度に加熱する。第３加熱部５４には、開口部５４ａが設けられている。図示の例では、開口部５４ａは、貫通孔である。第３領域３４は、開口部５４ａに挿入された領域である。開口部５４ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。第３加熱部５４には、開口部５４ｂが設けられている。開口部５４ｂは、開口部５４ａと連通している。開口部５４ｂは、後述する検出機構７０からの励起光を第３領域３４に導き、かつ、プローブが混合された反応液６からの蛍光を検出機構７０に導くための開口部である。

駆動機構６０は、反応液６が、第１領域３０、第２領域３２、および第３領域３４に移動するように、核酸増幅反応容器１００および加熱部５０，５２，５４を動かす機構である。駆動機構６０は、例えば、処理部８０からの入力信号に基づいて、核酸増幅反応容器１００および加熱部５０，５２，５４を動かす。駆動機構６０は、図示はしないが、核酸増幅反応容器１００および加熱部５０，５２，５４を支持する支持部と、該支持部を動かすモーターと、を有していてもよい。

検出機構７０は、プローブが混合された反応液６からの蛍光を検出する機構である。検出機構７０は、例えば、処理部８０からの入力信号に基づいて、プローブが混合された反応液６に励起光を照射し、反応液６からの蛍光を検出する。検出機構７０としては、蛍光を検出することができれば特に限定されず、例えば、公知の蛍光測定器を用いる。

処理部８０は、例えば記憶部８６に記憶されているプログラムに従って、駆動機構６０および検出機構７０を制御するための処理を行う。処理部８０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。

操作部８２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部８０に送る処理を行う。操作部８２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。

表示部８４は、処理部８０によって生成された画像を表示する。表示部８４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ Ｒａｙ Ｔｕｂｅ）等により実現される。

記憶部８６は、処理部８０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部８６は、処理部８０の作業領域として用いられ、処理部８０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部８６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。

核酸増幅反応装置２００では、核酸増幅反応容器１００を装着可能なため、異物が混入する可能性を低くすることができる。

３． 核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図６は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図７〜図１０は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図７〜図１０では、駆動機構６０、検出機構７０、処理部８０、操作部８２、表示部８４、および記憶部８６の図示を省略している。また、図７〜図１０では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器１００が装着された核酸増幅反応装置２００を用いた核酸増幅反応方法について説明する。

まず、核酸増幅反応容器１００の蓋１２を開けて、流路２０の第１領域３０に鋳型核酸溶液を導入し、該鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて、図７に示すように、反応液６を調製する（ステップＳ１）。

次に、核酸増幅反応容器１００を、加熱部５０，５２，５４の開口部５０ａ，５２ａ，５４ａに装着する（ステップＳ２）。本工程では、核酸増幅反応容器１００の配置は、第１配置である。第１配置では、図７に示すように、第１領域３０は、第２領域３２および第３領域３４よりも、重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０に位置する。

次に、処理部８０は、操作部８２から処理を開始する旨の信号を受けると、加熱部５０，５２，５４を制御して、第１領域３０を第１温度とし、第２領域３２を第２温度とし、第３領域３４を第３温度として、流路２０に温度勾配を形成する処理を行う（ステップＳ３）。本工程により、第１領域３０と第２領域３２との間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。さらに、第２領域３２と第３領域３４との間には、第２温度と第３温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。本工程では、反応液６は、第１領域３０に位置しているため、第１温度に加熱される。これにより、反応液６に対して変性反応を行うことができる。

次に、処理部８０は、第１加熱部５０が第１温度に到達して第１の時間（第１の期間）が経過したら、核酸増幅反応容器１００をＲ１の方向に１８０°回転させるように駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ４）。処理部８０は、タイマーを内蔵していてもよい。第１の時間は、変性反応のための加熱時間であり、例えば、１秒以上１０秒以下である。

第２配置では、図８に示すように、第２領域３２は、第１領域３０および第３領域３４よりも、重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。反応液６は、第２領域３２において第２温度に加熱される。これにより、反応液６に対して、プライマーのアニーリング反応および伸長反応を行うことができる。処理部８０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構６０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。これにより、核酸増幅反応容器１００の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第２の時間は、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間であり、１秒以上１０秒以下である。

次に、処理部８０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数）が、予め記憶部８６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ５）。処理部８０は、第１配置から第２配置への切換えを行うたびに、サイクル数を記憶部８６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部８６に記憶されている所定の回数と、を比較する。予め記憶部８６に記憶されている所定の回数は、特に限定されないが、例えば、２０回以上６０回以下である。

処理部８０は、ステップＳ５においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図６において「Ｙｅｓ」の場合）、ステップＳ７へ移行する。

一方、処理部８０は、ステップＳ５においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図６において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ６に移行する。ステップＳ６では、処理部８０は、核酸増幅反応容器１００をＲ２の方向に１８０°回転させるように駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。処理部８０は、例えば、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構６０の動作を、第１の時間停止させる。

そして、処理部８０は、再び、ステップＳ４へ移行し、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う。

以上のように、処理部８０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与することができ、核酸増幅反応を行うことができる（核酸増幅反応工程）。

次に、処理部８０は、核酸増幅反応容器１００をＲ２の方向に１８０°回転させるように駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う（ステップＳ７）。これにより、図７に示すように、反応液６を、屈曲部４０を介して第２領域３２に移動させることができる。

次に、処理部８０は、核酸増幅反応容器１００をＲ１の方向に５４０°回転させるように駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第３配置へ切換える処理を行う（ステップＳ８）。これにより、核酸増幅反応容器１００の配置は、図８に示す第２配置および図９に示す配置（反応液６が屈曲部４４に位置する状態）を経て、第３配置となる。第３配置では、図１０に示すように、反応液６は、第３領域３４に位置する。核酸増幅反応容器１００の第３配置は、核酸増幅反応容器１００の重力方向に対する傾きにおいて、核酸増幅反応容器１００の第２配置と同じであってもよい。本工程により、反応液６を、屈曲部４０，４２，４４，４６，４８を介して第３領域３４に移動させて、反応液６に第２試薬４を混合することができる（混合工程）。反応液６は、第３温度に加熱される。処理部８０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置とした後に駆動機構６０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させてもよい。第３の時間は、例えば、反応液６と第２試薬４とを確実に混合させるための時間である。

次に、処理部８０は、核酸増幅反応容器１００をＲ２の方向に５４０°回転させるように駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置から第１配置へ切換える処理を行う（ステップＳ９）。これにより、図７に示すように、反応液６を第１領域３０に移動させることができる（第１移動工程）。反応液６は、第１領域３０において第１温度で加熱される。これにより、反応液６に対して変性反応を行うことができる。処理部８０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構６０の動作を第１の時間停止させる。

次に、処理部８０は、核酸増幅反応容器１００をＲ１の方向に５４０°回転させるように駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第３配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１０）。これにより、図１０に示すように、反応液６を第３領域３４に移動させることができる（第２移行工程）。反応液６は、第３領域３４において第３温度で加熱される。これにより、反応液６に対して、例えば、プローブのハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼによるプローブの分解を行うことができる。処理部８０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置とした後に駆動機構６０の動作を第４の時間（第４の期間）停止させる。第４の時間は、例えば、プローブのハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼによるプローブの分解を行い、かつ、反応液６からの蛍光を検出するための時間である。

次に、処理部８０は、検出機構７０を制御して、反応液６に、蛍光を検出するための励起光を照射し、検出機構７０の測定結果として検出機構７０から蛍光強度を取得する処理を行う（ステップＳ１１）。これにより、反応液６からの蛍光を検出することができる（検出工程）。処理部８０は、ステップＳ１０の処理を開始すると同時に、励起光を照射するための処理を行ってもよい。処理部８０は、予め記憶部８６に記憶させた増幅曲線を読み出し、該増幅曲線と取得した蛍光強度とにより、核酸の増幅量を算出する処理を行ってもよい。処理部８０は、算出した核酸の増幅量を、表示部８４に表示させる処理を行ってもよい。そして、処理部８０は、処理を終了する。

ここで、図１１は、核酸増幅反応装置２００を模式的に示す図１０のＸＩ−ＸＩ線断面図である。図１１に示すように、第３配置では、第３領域３４は、検出機構７０と対向した位置にある。検出機構７０からの励起光は、開口部５４ｂを通って反応液６に至り、反応液６からの蛍光は、開口部５４ｂを通って検出機構７０に至る。

核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器１００を用いるため、異物が混入する可能性を低くすることができる。

なお、上記の例では、第２移行工程（ステップＳ１０）において、処理部８０は、駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第３配置へ切換える処理を行ったが、処理部８０は、駆動機構６０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行ってもよい。これにより、反応液６を第２領域３２へ移動させることができ、反応液６は、第２領域３２において第２温度で加熱される。そして、反応液６に対して、例えば、プローブのハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼによるプローブの分解を行うことができる。この場合、第２配置では、第２領域３２は、検出機構７０と対向した位置にあり、処理部８０は、検出機構７０を制御して、反応液６に、蛍光を検出するための励起光を照射する処理を行う。また。この場合、第３加熱部５４は、設けられていなくてもよい。

また、上記の例では、第１流路２１の一方側の端部が第１領域３０であり、第２流路２２と第３流路２３との接続部が第２領域３２であったが、第１流路２１の一方側の端部が第２領域３２であり、第２流路２２と第３流路２３との接続部が第１領域３０であってもよい。この場合、処理部８０は、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて、核酸増幅反応を行うように、駆動機構６０を制御する処理を行う。次に、処理部８０は、反応液６を第３領域３４に移動させて、反応液６に第２試薬４を混合するように、駆動機構６０を制御する処理を行う。次に、処理部８０は、反応液６を第２領域３２に移動させるように、駆動機構６０を制御する処理を行う。次に、処理部８０は、反応液６を第３領域３４に移動させるように、駆動機構６０を制御する処理を行う。次に、処理部８０は、反応液６からの蛍光を検出するように、検出機構７０を制御する処理を行う。

４． 核酸増幅反応容器の変形例
次に、本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１２は、本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応容器１１０を模式的に示す断面図である。なお、図１２では、互いに直交する３軸として、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸を図示している。

以下、本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応容器１１０において、上述した本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。

上述した核酸増幅反応容器１００では、図１に示すように、流路２０は、屈曲部４０，４２，４４，４６，４８を有していた。これに対し、核酸増幅反応容器１１０では、図１２に示すように、流路２０は、屈曲部４０，４２，４６，４８を有し、屈曲部４４を有していない。

核酸増幅反応容器１１０では、図１２に示すように、第３流路２３の一方の端部は、屈曲部４２であり、第３流路２３の他方の端部は、屈曲部４６である。第４流路２４の一方の端部は、屈曲部４６であり、第４流路２４の他方の端部は、屈曲部４８である。第５流路２５は、第３領域３４を有する。第５流路２５の一方の端部は、屈曲部４８であり、第５流路２５の他方の端部は、第３領域３４である。

核酸増幅反応容器１１０では、第５流路２５の方向の第４流路２４の方向に対する角度βは、９０°未満であり、図示の例では４５°である。

核酸増幅反応容器１１０では、核酸増幅反応容器１００と同様に、異物が混入する可能性を低くすることができ、かつ、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行っている最中に、反応液６と第２試薬４とが接触する可能性を低くすることができる。

本発明は、本願に記載の特徴や効果を有する範囲で一部の構成を省略したり、各実施形態や変形例を組み合わせたりしてもよい。

本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

２…第１試薬、４…第２試薬、６…反応液、１０…容器本体、１０ａ…第１内壁、１０ｂ…第２内壁、１２…蓋、２０…流路、２１…第１流路、２２…第２流路、２３…第３流路、２４…第４流路、２５…第５流路、２６…第６流路、３０…第１領域、３１…導入口、３２…第２領域、３４…第３領域、４０，４２，４４，４６，４８…屈曲部、５０…第１加熱部、５０ａ…開口部、５２…第２加熱部、５２ａ…開口部、５４…第３加熱部、５４ａ，５４ｂ…開口部、６０…駆動機構、７０…検出機構、８０…処理部、８２…操作部、８４…表示部、８６…記憶部、１００，１１０…核酸増幅反応容器、２００…核酸増幅反応装置

Claims (13)

1. 第１領域、第２領域、および第３領域を有し、試薬を含む反応液が流動可能な流路を含み、前記反応液を前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う核酸増幅反応容器であって、
   前記第２領域は、屈曲した形状を有し、
   前記第３領域は、前記第１領域および前記第２領域と異なる領域であって、前記第１領域と前記第２領域との間の前記反応液が流動する領域以外の領域に位置し、
   前記流路は、前記第２領域と前記第３領域との間の前記流路において第１屈曲部および第２屈曲部を有し、
   前記流路を前記第３領域から前記第２領域に向かう場合、
   前記第１屈曲部は、１番目の屈曲部であり、
   前記第２屈曲部は、２番目の屈曲部であり、
   前記第１屈曲部および前記第２屈曲部は、同じ方向側に屈曲し、
   前記第３領域と前記第１屈曲部との間の前記流路の方向は、前記第１屈曲部と前記第２屈曲部との間の前記流路の方向に対して、９０°以下で屈曲し、
   前記第３領域には、試薬が配置されている、核酸増幅反応容器。
2. 請求項１において、
   前記第３領域に配置された前記試薬は、プローブを含む、核酸増幅反応容器。
3. 請求項１または２において、
   前記流路は、前記第２屈曲部と前記第２領域との間の前記流路において第３屈曲部を有し、
   前記流路を前記第３領域から前記第２領域に向かう場合、
   前記第１屈曲部、前記第２屈曲部、および前記第３屈曲部は、同じ方向側に屈曲している、核酸増幅反応容器。
4. 請求項１ないし３のいずれか１項において、
   前記第１領域は、標的核酸を導入する導入口と連通する、核酸増幅反応容器。
5. 請求項１ないし４のいずれか１項において、
   前記第１領域には、前記試薬が配置され、
   前記第１領域に配置された前記試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、を含む、核酸増幅反応容器。
6. 請求項５において、
   前記第１領域に配置された前記試薬は、凍結乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項において、
   前記第３領域に配置された前記試薬は、凍結乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
8. 請求項１ないし７のいずれか１項において、
   前記第３領域に配置された前記試薬は、ポリメラーゼを含む、核酸増幅反応容器。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項において、
   前記流路は、第１内壁と、前記第１内壁に対向する第２内壁と、に挟まれ、
   前記第１内壁と前記第２内壁との間の距離は、前記流路に前記反応液が導入された場合に、前記反応液が前記第１内壁および前記第２内壁に接触する長さである、核酸増幅反応容器。
10. 請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、
    前記第１領域を第１温度に加熱する第１加熱部と、
    前記第２領域を前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
    前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、および前記第３領域に移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
    を含む、核酸増幅反応装置。
11. 請求項１０において、
    前記第３領域を前記第１温度よりも低い第３温度に加熱する第３加熱部を含む、核酸増幅反応装置。
12. 請求項１０または１１において、
    前記第３領域に配置された前記試薬が混合した前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含む、核酸増幅反応装置。
13. 請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
    前記反応液を、第１温度の前記第１領域と、前記第１温度よりも低い第２温度の前記第２領域と、の間で往復させて、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応工程と、
    前記核酸増幅反応工程の後に、前記反応液を前記第１温度よりも低い第３温度の第３領域に移動させて、前記反応液に、前記第３領域に配置された前記試薬を混合する混合工程と、
    前記混合工程の後に、前記反応液を前記第１領域に移動させる第１移動工程と、
    前記第１移動工程の後に、前記反応液を前記第２領域または前記第３領域に移動させる第２移動工程と、
    前記第２移動工程の後に、前記反応液からの蛍光を検出する検出工程と、
    を含む、核酸増幅反応方法。

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