JP2018032009A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】簡易かつ安価な構成で、液浸媒質の量および補給頻度を低減しつつ液浸媒質の液切れを防止し、信頼性の高い観察を実現する。【解決手段】サンプルＳと共に溶液Ｗ１を収容するキュベット３が浸漬される、溶液Ｗ１と同等の屈折率を有する溶液Ｗ２を貯留するチャンバ５と、チャンバ５の外部に配され、サンプルＳから発せられる光を集光する液浸対物レンズ１１と、液浸対物レンズ１１により集光された光を撮影するカメラ３１と、液浸対物レンズ１１をその検出光軸Ｐに沿う方向に移動させる照準部１２と、チャンバ５内でキュベット３を少なくとも検出光軸Ｐに沿う方向に移動可能に支持する可動ステージ７とを備え、キュベット３およびチャンバ５が、サンプルＳからの光を透過可能な透明部３ｂおよび透明部５ｂを有し、液浸対物レンズ１１が、チャンバ５の透明部５ｂを介してキュベット３の透明部３ｂに対向して配置される顕微鏡１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

従来、検出光学系の検出光軸に交差する方向から励起光を標本に入射させて、検出光学系により検出される標本からの蛍光に基づいて標本の３次元立体像を取得する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。これら特許文献１および特許文献２に記載の顕微鏡では、撮像平面以外に励起光が照射されないので、蛍光の褪色を抑えて良好な３次元立体像を得ることができる。

近年、この技術は、蛍光タンパク質をターゲット分子に標識したゼブラフィッシュのような生物の立体像を得ることを目的としたものとしてだけでなく、スフェロイドやオルガノイド（人工臓器またはその一部）のような３次元培養細胞の３次元立体像を得て、画像解析技術の利用により薬効の評価を行う、いわゆる創薬スクリーニングへの適用を目的としたものとしても注目されており、幅広いアプリケーションに応用されることが期待されている。また、この観察手法には、個々の細胞を認識可能なレベルの解像度で観察を行いたいという研究者からの強いニーズにより、より微細かつ高解像な観察が求められている。

この観察手法において、特許文献１，２に記載の顕微鏡では、液浸対物レンズが使用されている。しかしながら。特許文献１に記載の顕微鏡は、対物レンズに対して容器を移動させて観察位置を変更すると、対物レンズと容器との間に保有されている液浸媒質の量が減少するため、液浸媒質を補給する必要がある。特に、容器が複数のアレイで構成される等、対物レンズと容器との相対移動距離が長くなれば長くなるほど、高い頻度で液浸媒質を補給する必要があり、大量の液浸媒質を用意しておかなければならないという不都合がある。また、液浸媒質の補給には時間がかかるため、補給頻度が多くなるほど総観察時間が長くなるという不都合もある。

これに対し、特許文献２に記載の顕微鏡では、透明化溶液等の液浸媒質が充填されたキュベットにサンプルが収容されるとともに、このキュベットがさらに液浸媒質が充填されたチャンバに収容されてＸＹＺステージ上に載置されている。また、観察のための対物レンズは、その先端部が液漏れを防止するシーリング部材を介してチャンバ内の液浸媒質に浸漬されている。特許文献２の顕微鏡の構成によれば、ＸＹＺステージを移動させても液浸媒質が減少しないので、特許文献１に記載の顕微鏡の上述した問題を解消することができる。

特許第４４４３８３２号公報 国際公開第２０１５／１８４１２４号

しかしながら、対物レンズを動かすことができない特許文献２に記載の顕微鏡では、観察位置の変更に伴いサンプル内の屈折率分布に応じて対物レンズの焦点位置にずれが生じた場合に、スキャナにより励起光の照射位置を対物レンズの焦点位置に合わせることで焦点位置のずれを補正しており、このような補正を行うための複雑で高価な調整機構が必要になるという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易かつ安価な構成で、液浸媒質の量およびその補給頻度を低減しつつ液浸媒質の液切れを防止して、信頼性の高い観察を実現することができる顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本と共に第１液浸媒質を収容する標本容器が浸漬される、前記第１液浸媒質と同等の屈折率を有する第２液浸媒質を貯留する媒質容器と、該媒質容器の外部に配され、前記標本から発せられる光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記光を撮影する撮像部と、前記対物レンズをその検出光軸に沿う方向に移動させる照準部と、前記媒質容器内で前記標本容器を少なくとも前記検出光軸に沿う方向に移動可能に支持する可動ステージとを備え、前記標本容器および前記媒質容器が、前記標本からの前記光を透過可能な光透過部をそれぞれ有し、前記対物レンズが、前記媒質容器の前記光透過部を介して前記標本容器の前記光透過部に対向して配置される顕微鏡である。

本態様によれば、標本が第１液浸媒質と共に標本容器に収容されて、媒質容器内の第２液浸媒質に標本容器ごと浸漬される。そして、標本から発せられる光が、第１液浸媒質、標本容器の光透過部、第１液浸媒質と同等の屈折率を有する第２液浸媒質および媒質容器の光透過部を透過して対物レンズにより集光され、撮像部により撮影される。したがって、可動ステージにより、媒質容器内で標本容器を対物レンズの検出光軸に沿う方向に移動させることで、対物レンズの検出光軸に交差する標本の断層像を取得することができる。

この場合において、可動ステージにより媒質容器内で標本容器を移動させて観察位置を変更しても、対物レンズと媒質容器との相対位置が変化しないので、対物レンズの先端と媒質容器の光透過部との間に液浸媒質を保持させたとしても、標本容器の移動によってこの液浸媒質の量は変化しない。したがって、対物レンズの先端と媒質容器の光透過部との間に液浸媒質を大量に用意したり頻繁に補給したりしなくてすみ、またこの液浸媒質が液切れすることもない。

また、標本の観察位置を変更した場合に、標本内の屈折率分布に応じて対物レンズの焦点位置にずれが生じたとしても、照準部により、対物レンズの検出光軸に沿う方向の位置を微調整することにより、焦点位置のずれを解消することができる。
したがって、簡易かつ安価な構成で、液浸媒質の量およびその補給頻度を低減しつつ液浸媒質の液切れを防止して、信頼性の高い観察を実現する顕微鏡を構成することができる。

上記態様においては、前記対物レンズが、前記媒質容器の前記光透過部との間に間隔を空けて配置されることとしてもよい。
このように構成することで、対物レンズを倍率が異なるものに切り替えることが可能となる。

上記態様においては、前記対物レンズが液浸対物レンズであり、該液浸対物レンズが前記媒質容器の前記光透過部との間に第３液浸媒質を介して配置されることとしてもよい。
このように構成することで、第３液浸媒質として空気よりも屈折率が大きいものを採用することにより、液浸対物レンズの開口数を大きくして、より高い分解能を得ることができる。また、標本容器の移動によって第３液浸媒質の量は変化しないので、第３液浸媒質を大量に用意したり頻繁に補給したりしなくてすみ、また第３液浸媒質が液切れすることもない。

上記態様においては、前記液浸対物レンズが、鉛直方向に交差する方向に前記検出光軸を向けて配置され、前記第３液浸媒質が、前記液浸対物レンズと前記媒質容器の前記光透過部との間に表面張力により保持されることとしてもよい。
このように構成することで、液浸対物レンズの先端と媒質容器の光透過部との間に第３液浸媒質を保持するための機構が必要なく、簡易な構成にすることができる。

上記態様においては、前記標本容器および前記媒質容器が前記光透過部を側壁部に有し、前記液浸対物レンズが、鉛直方向に略直交する方向に前記検出光軸を向けて配置されることとしてもよい。
このように構成することで、液浸対物レンズを媒質容器の側方に側壁部の光透過部に近接させて第３液浸媒質を介して配置することができる。

上記態様においては、前記第３液浸媒質が、前記第２液浸媒質と同等の屈折率を有することとしてもよい。
このように構成することで、標本の観察位置を変更した場合に、標本内の屈折率分布に応じて液浸対物レンズの焦点位置にずれが生じ、照準部により液浸対物レンズの検出光軸に沿う方向に焦点の微調整を行ったとしても、球面収差の発生を抑制することができる。

上記態様においては、前記標本容器の前記光透過部が、前記第２液浸媒質と同等の屈折率を有することとしてもよい。
このように構成することで、製造誤差により標本容器の光透過部の厚さにばらつきがある場合であっても、球面収差の発生を抑制することができる。

上記態様においては、前記媒質容器の前記光透過部が、前記第２液浸媒質と同等の屈折率を有することとしてもよい。
このように構成することで、製造誤差により媒質容器の光透過部の厚さにばらつきがある場合であっても球面収差の発生を抑制することができる。

上記態様においては、前記可動ステージが、前記標本容器を前記検出光軸に交差する方向に移動可能に支持することとしてもよい。
このように構成することで、標本の観察位置を対物レンズの検出光軸に交差する方向に変更することができる。

上記態様においては、前記撮像部が、前記標本が自己発光した前記光を撮影することとしてもよい。
このように構成することで、発光顕微鏡を構成することができ、光源や照明光学系が不要となる分だけシンプルかつ安価な構成にすることができる。

上記態様においては、前記検出光軸に交差する方向から前記標本に励起光を照射する照明光学系を備え、前記標本容器および前記媒質容器が、前記照明光学系からの前記励起光を前記標本に向けて透過させる励起光透過部をそれぞれ有することとしてもよい。
このように構成することで、照明光学系を媒質容器の側方に配置して、照明光学系から発せられた励起光を媒質容器および標本容器の側方から各励起光透過部を介して標本に照射することができる。

上記態様においては、前記媒質容器が、前記励起光透過部を底部に有し、前記照明光学系が、前記媒質容器内に配置された反射ミラーを備え、前記励起光を前記底部の前記励起光透過部から前記媒質容器内に入射させて前記反射ミラーにより前記標本に向けて反射することとしてもよい。

このように構成することで、反射ミラーを除く照明光学系を媒質容器の下方に配置することができる。これにより、可動ステージおよび標本容器と照明光学系との機械的な干渉を回避することができ、１方向からだけでなく、対物レンズの検出光軸に交差する複数の方向から励起光を標本に入射可能な照明光学系を構成し易くすることができる。

上記態様においては、前記媒質容器が、前記励起光透過部を側壁部に有し、前記照明光学系が、前記側壁部の前記励起光透過部から前記媒質容器内に前記励起光を入射させることとしてもよい。
このように構成することで、照明光学系を媒質容器の側方に配置することができる。これにより、対物レンズ、照準部および撮像部が備えられている通常の倒立型顕微鏡に、媒質容器、可動ステージおよび照明光学系を加えるだけで構成することができる。

上記態様においては、前記照明光学系が、前記媒質容器内に配置された正のパワーを有するレンズを備えることとしてもよい。
シート照明の厚さを薄くして解像度を上げるにはレンズの射出ＮＡを大きく設定する必要がある。このように構成することで、媒質容器の外にレンズを配置する場合と比較してレンズから標本までの距離を短くすることができ、レンズの射出ＮＡを大きく設定することができる。これにより、正のパワーを有するレンズを媒質容器内に配置するだけの簡易な構成で解像度を向上することができる。

上記態様においては、前記正のパワーを有するレンズが、前記照明光学系の照明光軸に交差する一方向に正のパワーを有するシリンドリカルレンズであることとしてもよい。
このように構成することで、シリンドリカルレンズにより、検出光学系の検出光軸に交差する平面に沿って平面状に励起光を集光させて標本に入射させることができる。これにより、励起光の入射平面に対物レンズの焦点面を一致させることで、焦点面に沿う広い範囲において発生した光を対物レンズによって１度に集光して、より高解像の画像を取得することができる。

上記態様においては、前記撮像部の撮影光軸に交差する方向に複数のマイクロレンズを２次元的に配列してなるマイクロレンズアレイを備え、前記照明光学系が、略平行光束の前記励起光を前記標本に入射させることとしてもよい。

このように構成することで、励起光の入射範囲に対物レンズの焦点面を一致させることで、焦点面に沿う広い範囲において発生した光を対物レンズによって１度に集光することができる。そして、撮像部により、マイクロレンズアレイによって投影される像を撮影することで、視差が異なる複数の画像情報を１度に取得することができる。

上記態様においては、前記可動ステージが、複数の前記標本容器を前記媒質容器内で前記検出光軸に平行な軸線回りに移動可能に支持することとしてもよい。
このように構成することで、可動ステージにより複数の標本容器を検出光軸に平行な軸線回りに移動させるだけで、検出光軸上に配置する標本容器を切り替えることができる。したがって、照明光学系により各標本容器の標本に励起光を順に入射させるとともに、対物レンズにより各標本容器の標本からの光を順に集光して撮像部により連続して撮影することができる。これにより、大量の標本の画像を効率よく高速で取得することができる。

上記態様においては、前記標本容器が、前記照明光学系の照明光軸に交差する１方向に配列された複数の標本収容部を有し、前記可動ステージが、前記検出光軸上に配置する前記標本収容部を切り替え可能に支持することとしてもよい。
このように構成することで、可動ステージにより対物レンズの検出光軸上に配置する標本収容部を切り替えるだけで、複数の標本を順に観察することができる。

上記態様においては、前記可動ステージが、前記標本容器を前記媒質容器内で前記検出光軸回りに回転可能に支持することとしてもよい。
このように構成することで、可動ステージにより標本容器を検出光軸回りに回転させるだけで、標本における同一の観察位置に異なる方向から励起光を入射させることができる。これにより、各方向からの励起光の標本への入射深度を浅くして標本における散乱の影響を抑制し、鮮明な画像を取得することができる。

上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズの検出光軸に交差する平面に沿って平面状の前記励起光を前記標本に入射させることとしてもよい。
このように構成することで、励起光の入射平面に対物レンズの焦点面を一致させることにより、対物レンズの焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を対物レンズによって１度に集光して、より高解像の画像を取得することができるライトシート顕微鏡を構成することができる。

本発明に係る顕微鏡によれば、簡易かつ安価な構成で、液浸媒質の量およびその補給頻度を低減しつつ液浸媒質の液切れを防止して、信頼性の高い観察を実現することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 図１のキュベットおよびプリズムを検出光軸に沿う方向に見た平面図である。 本発明の第１実施形態の変形例に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第２実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第３実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第４実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 図６のチャンバおよびキュベットを示す斜視図である。 図６のキュベットを示す斜視図である。 図６のチャンバを示す斜視図である。 本発明の第５実施形態に係る顕微鏡を鉛直方向に見た概略構成図である。 図１０の顕微鏡を液浸対物レンズの検出光軸に沿う方向に見た概略構成図である。 本発明の第６実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、サンプル（標本）Ｓを収容するキュベット（標本容器）３と、キュベット３を収容可能なチャンバ（媒質容器）５と、キュベット３を支持する可動ステージ７と、サンプルＳにレーザ光（励起光）を照射する照明光学系９と、サンプルＳから発せられる蛍光を集光する液浸対物レンズ（対物レンズ）１１と、液浸対物レンズ１１をその検出光軸Ｐに沿う方向に移動可能な照準部１２と、液浸対物レンズ１１により集光された蛍光に基づいてサンプルＳの画像を取得する撮像光学系１３とを備えている。

キュベット３は、図２に示すように、サンプルＳが収容される３つの収容部（標本収容部）３ａが１方向に配列されてなるアレイ構造を有している。各収容部３ａには、それぞれ透明化溶液等のキュベット溶液（第１液浸媒質）Ｗ１が充填され、そのキュベット溶液Ｗ１にそれぞれサンプルＳが浸漬されている。各サンプルＳは、キュベット溶液Ｗ１に浸漬されることで透明化されている。また、図１に示すように、キュベット３は、側壁部および底部にそれぞれレーザ光および蛍光を透過可能な透明部（励起光透過部、光透過部）３ｂを有している。

チャンバ５は、開口部５ａを上部に有し、レーザ光および蛍光を透過可能な透明部（励起光透過部、光透過部）５ｂを底部に有している。透明部５ｂは、照明光学系９の照明光軸Ｑ上および液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐ上を含む底部の広範囲に形成されている。このチャンバ５には、キュベット溶液Ｗ１と屈折率が略等しいチャンバ溶液（第２液浸媒質）Ｗ２が貯留され、そのチャンバ溶液Ｗ２内にキュベット３が浸漬されるようになっている。

可動ステージ７は、キュベット３を保持するアーム部７ａと、アーム部７ａを支持する支持部７ｂとを備えている。この可動ステージ７は、アーム部７ａおよび支持部７ｂにより、キュベット３をチャンバ５の開口部５ａを介してチャンバ溶液Ｗ２内に浸漬させて照明光軸Ｑ上に側壁部の透明部３ｂが位置するように、キュベット３を支持するようになっている。

また、可動ステージ７は、保持しているキュベット３を鉛直方向（以下、Ｚ方向という。）および鉛直方向に交差し互いに直交する２次元的な方向（以下、Ｘ，Ｙ方向という。）に移動させることができるようになっている。これにより、可動ステージ７は、検出光軸Ｐ上に配置するキュベット３の収容部３ａを切り替えたり、同一の収容部３ａ内でサンプルＳの観察位置を変更したりすることができるようになっている。

液浸対物レンズ１１は、図示しない多数のレンズを組み合わせて構成されている。この液浸対物レンズ１１は、チャンバ５の下方に底部の透明部５ｂに近接して設けられ、透明部５ｂに対向して鉛直上向きに配置されている。液浸対物レンズ１１の最先端のレンズの上面１１ａとチャンバ５の底部の透明部５ｂとの隙間には、純水等の液浸溶液（第３液浸媒質）Ｗ３が注入され、液浸溶液Ｗ３が表面張力によってその隙間内に保持されるようになっている。

照準部１２は、液浸対物レンズ１１の最先端のレンズの上面１１ａとチャンバ５の底部の透明部５ｂとの隙間で液浸溶液Ｗ３の表面張力が働く範囲内で、液浸対物レンズ１１をＺ方向に微動させることにより、液浸対物レンズ１１の焦点位置を検出光軸Ｐに沿う方向に微調整することができる。

照明光学系９は、レーザ光を発生するレーザ光源１５と、レーザ光源１５から発せられたレーザ光を導光する光ファイバ１７と、光ファイバ１７により導光されてきたレーザ光を平行光束に変換する凸レンズ１９Ａ，１９Ｂと、凸レンズ１９Ａ，１９Ｂにより平行光束にされたレーザ光を集光するシリンドリカルレンズ（レンズ）２１Ａ，２１Ｂと、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂにより集光されたレーザ光をサンプルＳに向けて反射するミラーコーティングされた反射面（反射ミラー）２４Ａ，２４Ｂを有するプリズム２３Ａ，２３Ｂとを備えている。

光ファイバ１７は、長手方向の途中位置から分岐された２つの先端部１８Ａ，１８Ｂを有している。これら先端部１８Ａ，１８Ｂは、液浸対物レンズ１１を挟んで検出光軸Ｐに交差する方向に間隔をあけて設けられ、チャンバ５の底部の透明部５ｂに対向して鉛直上向きに配置されている。

光ファイバ１７の一方の先端部１８Ａから射出されたレーザ光は、凸レンズ１９Ａ、シリンドリカルレンズ２１Ａを介してプリズム２３Ａの反射面２４ＡによりサンプルＳに向けて反射され、他方の先端部１８Ｂから射出されたレーザ光は、凸レンズ１９Ｂ、シリンドリカルレンズ２１Ｂを介してプリズム２３Ｂの反射面２４ＢによりサンプルＳに向けて反射されるようになっている。

凸レンズ１９Ａ，１９Ｂおよびシリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂは、チャンバ５の外部において検出光軸Ｐを挟んでこれに交差する方向に間隔をあけて配置され、プリズム２３Ａ，２３Ｂは、チャンバ５の内部において検出光軸Ｐを挟んでこれに交差する方向に間隔をあけて配置され、内側底部に固定されている。

シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂは、照明光軸Ｑに直交する一方向にパワーを有している。このシリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂは、略平行光束からなるレーザ光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有する平面状に集光して、液浸対物レンズ１１の略検出光軸Ｐ上で焦点を結ばせるようになっている。

プリズム２３Ａ，２３Ｂは、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂにより平面状に集光された各レーザ光を反射面２４Ａ，２４Ｂにより反射し、検出光軸Ｐに垂直な方向に広がる同一の入射平面に沿ってキュベット３の側壁部の透明部３ｂを介してサンプルＳにレーザ光を入射させるようになっている。

これら凸レンズ１９Ａ，１９Ｂ、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂおよびプリズム２３Ａ，２３Ｂの反射面２４Ａ，２４Ｂは、それぞれのレーザ光の焦点位置が一致するように予め調整されている。

撮像光学系１３は、液浸対物レンズ１１により集光された蛍光を反射するミラー２５と、ミラー２５により反射された蛍光からレーザ光等を除去するエミッションフィルタ２７と、エミッションフィルタ２７を通過した蛍光を結像させる結像レンズ２９と、結像レンズ２９により結像された蛍光を撮影するカメラ（撮像部）３１とを備えている。

キュベット３内のキュベット溶液Ｗ１、チャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２、液浸対物レンズ１１とチャンバ５との間の液浸溶液Ｗ３、キュベット３の透明部３ｂおよびチャンバ５の透明部５ｂは互いに略同等の屈折率を有している。

このように構成された顕微鏡１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１によりサンプルＳを観察するには、まず、可動ステージ７により、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３を支持し、チャンバ５内に浸漬して目的の観察位置に移動させる。図２に示す例では、キュベット３の真ん中の収容部３ａが液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐ上に配置されている。

続いて、レーザ光源１５からレーザ光を発生させる。レーザ光源１５から発せられたレーザ光は、光ファイバ１７により導光されて途中で分岐され、２つの先端部１８Ａ，１８Ｂから射出される。そして、レーザ光は、それぞれ凸レンズ１９Ａ，１９Ｂにより平行光束にされ、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂにより平面状に集光されてチャンバ５の底部の透明部５ｂに入射される。

底部の透明部５ｂからチャンバ５内に入射されたレーザ光は、それぞれプリズム２３Ａ，２３Ｂに入射して反射面２４Ａ，２４Ｂにより反射される。そして、レーザ光は、チャンバ溶液Ｗ２、キュベット３の透明部３ｂ、キュベット溶液Ｗ１を介して、検出光軸Ｐに交差する互いに対向する２方向からサンプルＳに入射される。

チャンバ５の透明部５ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、キュベット３の透明部３ｂおよびキュベット溶液Ｗ１が略同等の屈折率を有することで、照明光学系９により照射するレーザ光を屈折させることなくサンプルＳに入射させることができる。

サンプルＳに平面状のレーザ光が入射することにより、レーザ光の入射平面に沿ってサンプルＳ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。サンプルＳにおいて発生した蛍光の内、検出光軸Ｐに沿う方向に放射された蛍光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の底部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の底部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３を介して液浸対物レンズ１１により集光される。

この場合も、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の底部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の底部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３が略同等の屈折率を有することで、サンプルＳからの蛍光を屈折させることなく液浸対物レンズ１１により集光することができる。

液浸対物レンズ１１により集光された蛍光は、ミラー２５により反射されてエミッションフィルタ２７を通過し、結像レンズ２９によりカメラ３１の撮像面上に結像される。これにより、カメラ３１において、サンプルＳの断層像が得られる。

液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐと垂直な方向に広がる入射平面に沿う平面状のレーザ光をサンプルＳに入射させることで、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂの焦点位置と液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐとを一致させるとともに、レーザ光の入射平面に液浸対物レンズ１１の焦点面を一致させることにより、液浸対物レンズ１１の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を液浸対物レンズ１１により１度に集光してカメラ３１により撮影することができる。これにより、サンプルＳにおける観察領域の鮮明な蛍光画像を取得することができる。また、カメラ３１の撮像平面以外にレーザ光が照射されないので、蛍光の褪色を抑えて良好な３次元立体像を得ることができる。

この場合において、可動ステージ７によりチャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更しても、液浸対物レンズ１１とチャンバ５との隙間に配置される液浸溶液Ｗ３の量は変化しないので、液浸溶液Ｗ３を大量に用意したりこれを高い頻度で補給したりしなくてすみ、また液浸溶液Ｗ３の液切れも防ぐことができる。

また、サンプルＳの観察位置を変更した場合に、サンプルＳ内の屈折率分布に応じて液浸対物レンズ１１の焦点位置にずれが生じたとしても、照準部１２により液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の位置を微調整することで、焦点位置のずれを解消することができる。これにより、サンプルＳにおける所望の観察位置を精度よく観察することができる。

なお、液浸溶液Ｗ３がチャンバ溶液Ｗ２と略同等の屈折率を有することで、照準部１２により液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向に焦点の微調整を行った場合に、球面収差の発生を抑制することができる。また、キュベット３の透明部３ｂやチャンバ５の透明部５ｂがチャンバ溶液Ｗ２と略同等の屈折率を有することで、製造誤差によりキュベット３の透明部３ｂの厚さやチャンバ５の透明部５ｂの厚さにばらつきがある場合であっても、球面収差の発生を抑制することができる。

以上説明したように本実施形態に係る顕微鏡１によれば、サンプルＳの観察位置を変更した場合に液浸対物レンズ１１の焦点位置にずれが生じても、照準部１２により液浸対物レンズ１１を検出光軸Ｐに沿う方向に微調整するだけで焦点位置のずれを解消することができる。したがって、従来の顕微鏡のように、液浸対物レンズの焦点位置のずれをスキャナによって補正するような複雑で高価な調整機構を用いる必要がなく、簡易かつ安価な構成で、液浸溶液Ｗ３の量およびその補給頻度を低減しつつ液浸溶液Ｗ３の液切れを防止して、信頼性の高い観察を実現することができる。

また、照明光学系９が、レーザ光をチャンバ５の底部の透明部５ｂからチャンバ５内に入射させることで、プリズム２３Ａ，２３Ｂを除く照明光学系９をチャンバ５の下方に配置することができる。これにより、可動ステージ７およびキュベット３と照明光学系９との機械的な干渉を回避することができ、液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに交差する２方向からレーザ光をサンプルＳに入射させる照明光学系９を構成し易くすることができる。

本実施形態では、照明光学系９により、レーザ光を異なる２方向から同時にサンプルＳに入射させることとしたが、これに代えて、レーザ光を一方向からのみサンプルＳに入射させる単一照明であってもよい。多くの場合、サンプルＳで光の吸収や散乱が生じるので、複数の照明光束により照明する方が照明の均一性において有利に働く。

また、可動ステージ７が、キュベット３をチャンバ５内で検出光軸Ｐ回りに回転可能に支持することとしてもよい。このようにすることで、可動ステージ７によりキュベット３を検出光軸Ｐ回りに回転させるだけで、サンプルＳにおける同一の観察位置に異なる方向からレーザ光を入射させることができる。これにより、各方向からのレーザ光のサンプルＳへの入射深度を浅くしてサンプルＳにおける散乱の影響を抑制し、鮮明な蛍光画像を取得することができる。単一照明の場合に、より有効である。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂをチャンバ５の外側に配置したが、これに代えて、例えば、図３に示すように、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂをチャンバ５の内側に配置することとしてもよい。この場合、例えば、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂをプリズム２３Ａ，２３Ｂの射出端に取り付けることとすればよい。

解像度を上げるには、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂの射出ＮＡを大きく設定して、平面状のレーザ光の厚さを薄くする必要がある。本変形例によれば、チャンバ５の外にシリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂを配置する場合と比較して、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１ＢからサンプルＳまでの距離を短くすることができる。したがって、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂの射出ＮＡを大きく設定して、平面状のレーザ光の厚さを薄くすることができる。これにより、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂをチャンバ５内に配置するだけの簡易な構成で解像度を向上することができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡４１は、図４に示すように、照明光学系９が、さらに、負のパワーを有するシリンドリカルレンズ４３と、シャッタ４５Ａ，４５Ｂとを備え、シャッタ４５Ａ，４５Ｂの切り替えにより、ライトフィールド顕微鏡としての機能とライトシート顕微鏡としての機能を切り替え可能な点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

負のパワーを有するシリンドリカルレンズ４３は、例えば、光ファイバ１７の先端部１８Ａから射出されるレーザ光の光路上に設けられ、プリズム２３Ａの射出端に取り付けられている。このシリンドリカルレンズ４３により、液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の観察深さに対応した厚さを有する断面が矩形状のレーザ光を構成することができるようになっている。

シャッタ４５Ａ，４５Ｂは、照明光学系９の両方の照明光軸Ｑ上に挿脱可能に設けられ、光ファイバ１７の各先端部１８Ａ，１８Ｂと各凸レンズ１９Ａ，１９Ｂとの間に配置されている。

撮像光学系１３は、カメラ３１の手前に配置された複数のマイクロレンズ４８からなるマイクロレンズアレイ４７を備えている。各マイクロレンズ４８は、カメラ３１の撮影光軸に交差する方向に２次元的に配列されている。

また、撮像光学系１３は、マイクロレンズアレイ４７上に結像させる結像レンズ２９Ａと、カメラ３１の撮像面上に結像させる結像レンズ２９Ｂと、これら結像レンズ２９Ａおよび結像レンズ２９Ｂを保持する結像レンズターレット４９とを備えている。

マイクロレンズアレイ４７は、カメラ３１の撮像面に像を投影させるようになっている。これにより、カメラ３１によって、視差が異なる複数の画像情報を１度に取得することができるようになっている。

結像レンズターレット４９は、回転軸４９ａ回りに回転可能に設けられ、結像レンズ２９Ａおよび結像レンズ２９Ｂを蛍光の光路上に択一的に配置することができるようになっている。

これら照明光学系９のレーザ光源１５、光ファイバ１７、凸レンズ１９Ａ、シリンドリカルレンズ２１Ａ、プリズム２３Ａおよびシリンドリカルレンズ４３と、液浸対物レンズ１１と、撮像光学系１３のミラー２５、エミッションフィルタ２７、結像レンズ２９Ａ、マイクロレンズアレイ４７およびカメラ３１とにより、ライトフィールド顕微鏡として機能するようになっている。また、照明光学系９のレーザ光源１５、光ファイバ１７、凸レンズ１９Ｂ、シリンドリカルレンズ２１Ｂおよびプリズム２３Ｂと、液浸対物レンズ１１と、撮像光学系１３のミラー２５、エミッションフィルタ２７、結像レンズ２９Ｂおよびカメラ３１とにより、ライトシート顕微鏡として機能するようになっている。

このように構成された顕微鏡４１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡４１によりサンプルＳを観察する場合、シャッタ４５Ａ，４５Ｂにより、ライトフィールド顕微鏡としての機能とライトシート顕微鏡としての機能とを切り替えて行う。

ライトフィールド顕微鏡としてサンプルＳを観察する場合は、光ファイバ１７の先端部１８Ａから射出されるレーザ光の光路上からシャッタ４５Ａを脱離させ、先端部１８Ｂから射出されるレーザ光の光路上にシャッタ４５Ｂを挿入する。また、結像レンズターレット４９により、カメラ３１の撮影光軸上に結像レンズ２９Ａを挿入する。

この状態で、光ファイバ１７の先端部１８Ａから射出されたレーザ光は、凸レンズ１９Ａおよび正のパワーを有するシリンドリカルレンズ２１Ａを透過してプリズム２３Ａの反射面２４Ａにより反射された後、負のパワーを有するシリンドリカルレンズ４３により、液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の観察深さに対応した厚さを有する平行光束に変換されてサンプルＳに入射される。レーザ光の入射範囲に液浸対物レンズ１１の焦点面を一致させることで、焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を液浸対物レンズ１１によって１度に集光することができる。

液浸対物レンズ１１により集光されたサンプルＳからの蛍光は、ミラー２５、エミッションフィルタ２７を介して結像レンズ２９Ａによりマイクロレンズアレイ４７上に結像され、各マイクロレンズ４８によりカメラ３１の撮像面に投影される。これにより、視差が異なる複数の画像情報を１度に取得し、１枚の画像から３次元画像データを構築することができる。

一方、ライトシート顕微鏡としてサンプルＳを観察する場合は、光ファイバ１７の先端部１８Ａから射出されるレーザ光の光路上にシャッタ４５Ａを挿入し、先端部１８Ｂから射出されるレーザ光の光路上からシャッタ４５Ｂを脱離させる。また、結像レンズターレット４９により、カメラ３１の撮影光軸上に結像レンズ２９Ｂを挿入する。以下、ライトシート顕微鏡として観察する場合は第１実施形態と同様なので、説明を省略する。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡４１によれば、１台の倒立型顕微鏡で異なる観察方法を選択することができる。この場合において、可動ステージ７を移動することによりチャンバ５内でサンプルＳの観察位置を変更しても、照準部１２により液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の位置を微調整することで、焦点位置のずれを解消することができ、サンプルＳにおける所望の観察位置を精度よく観察することができる。

本実施形態においては、以下のように変形することができる。
第１変形例としては、光ファイバ１７の先端部１８Ａから射出されるレーザ光の光路上に可変絞りを設けることとしてもよい。可変絞りにより、レーザ光の照明光束の太さを変更することで、ライトフィールド顕微鏡としての機能で得られる深度に対し、無駄なレーザ光を照射することを回避することができる。

第２変形例としては、ライトフィールド顕微鏡としての機能およびライトシート顕微鏡としての機能において、可動ステージ７によりサンプルＳをＺ方向に移動する代わりに、スキャナを採用して、レーザ光をＺ方向に振れるようにしてもよい。この場合、サンプルＳをＺ方向に移動させないので、生態を観察する場合に移動による刺激をサンプルＳに与えないですむ。特に、生体内のカルシウムの変化を撮像するような場合において、サンプルＳに刺激を与えず、より正確な計測を行うことができる。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡５１は、図５に示すように、照明光学系９が、チャンバ５の側壁部を透過させてレーザ光をサンプルＳに入射させる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡５１は、倒立型顕微鏡構成部５３と、ライトシート照明モジュール５５と、レーザ光源１５と、光ファイバ１７とを備えている。
倒立型顕微鏡構成部５３は、液浸対物レンズ１１と、ミラー２５と、エミッションフィルタ２７と、結像レンズ２９と、カメラ３１とを備えている。

ライトシート照明モジュール５５は、キュベット３と、チャンバ５と、可動ステージ７と、照準部１２と、凸レンズ１９Ａと、シリンドリカルレンズ２１Ａとを備えている。
キュベット３およびチャンバ５は、いずれも底面部の検出光軸Ｐ上と側壁部の照明光軸Ｑ上に透明部３ｂ，５ｂを有している。通常の倒立型顕微鏡である倒立型顕微鏡構成部５３にライトシート照明モジュール５５を載置するだけで、付加的（アドオン）に構成できるという利点がある。

光ファイバ１７の射出端は、ＦＰＣ（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ）のようなファイバーコネクタ５７により、ライトシート照明モジュール５５に着脱可能に接続されている。

このように構成された顕微鏡５１によりサンプルＳを観察する場合、レーザ光源１５から発せられたレーザ光は、光ファイバ１７により導光されてファイバーコネクタ５７を介してライトシート照明モジュール５５に入射される。ライトシート照明モジュール５５に入射したレーザ光は、凸レンズ１９Ａにより平行光束にされてチャンバ５の側壁部の透明部５ｂを透過し、シリンドリカルレンズ２１Ａにより集光される。シリンドリカルレンズ２１Ａにより集光されたレーザ光は、キュベット３の側壁部の透明部３ｂを透過してサンプルＳに入射される。

本実施形態に係る顕微鏡５１によりサンプルＳを観察する場合も、可動ステージ７を移動することによりチャンバ５内でサンプルＳの観察位置を変更しても、照準部１２により液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の位置を微調整することで、焦点位置のずれを解消することができる。したがって、サンプルＳにおける所望の観察位置を精度よく観察することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡５１によれば、照明光学系９をチャンバ５の側方に配置することができる。また、液浸対物レンズ１１、照準部１２およびカメラ３１が備えられている通常の倒立型顕微鏡である倒立型顕微鏡構成部５３に、チャンバ５、可動ステージ７、照準部１２および照明光学系９を備えるライトシート照明モジュール５５を加えるだけで構成することができる。
本実施形態においては、ライトシート顕微鏡で構成しているが、ライトフィールド顕微鏡用の照明モジュールを構成してもよい。

〔第４実施形態〕
次に、本発明の第４実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡６１は、図６および図７に示すように、キュベット３およびチャンバ５が円環形状を有し、可動ステージ７が、キュベット３を検出光軸Ｐに平行な軸線回りに回転可能に支持する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

キュベット３は、例えば、図８に示すように、サンプルＳが収容される複数の収容部３ａが周方向に配列されてなるマイクロプレートである。このキュベット３は、側壁部と底部に収容部３ａごとに透明部３ｂを有している。図８に示す例では、キュベット３は、側壁部および底部が周方向の全域に亘り透明部３ｂにより形成されている。

チャンバ５は、内径がキュベット３の内径よりも小さく外径がキュベット３の外径よりも大きい開口部５ａを有している。このチャンバ５は、図６および図９に示すように、側壁部における照明光学系９の照明光軸Ｑ上と底部における液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐ上にそれぞれ透明部５ｂを有している。このチャンバ５も、側壁部および底部が周方向の全域に亘り透明部５ｂにより形成されていることとしてもよい。
照明光学系９は、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂを介してレーザ光を入射させるようになっている。

このように構成された顕微鏡６１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡６１によりサンプルＳを観察する場合、可動ステージ７によりキュベット３を検出光軸Ｐに平行な軸線回りに回転させ、いずれかの収容部３ａを検出光軸Ｐ上に配置する。

この状態でレーザ光源１５から発せられたレーザ光は、光ファイバ１７により導光されて凸レンズ１９Ａにより平行光束にされた後、シリンドリカルレンズ２１Ａにより平面状に集光されてチャンバ５の側壁部の透明部５ｂを透過する。チャンバ５に入射したレーザ光は、キュベット３の側壁部の透明部３ｂを透過してサンプルＳに入射される。これにより、検出光軸Ｐ上に配置されている収容部３ａのサンプルＳの蛍光画像を取得することができる。

続いて、可動ステージ７によりキュベット３を検出光軸Ｐに平行な軸線回りに回転させ、隣接する次の収容部３ａを検出光軸Ｐ上に配置する。そして、検出光軸Ｐ上に配置された次の収容部３ａのサンプルＳについても同様にしてレーザ光を入射させ蛍光画像を取得する。このようにして検出光軸Ｐ上に配置するキュベット３の収容部３ａを切り替え、各収容部３ａに収容されているサンプルＳの蛍光画像を順次取得する。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡６１によれば、可動ステージ７によりキュベット３を検出光軸Ｐに平行な軸線回りに移動させるだけで、検出光軸Ｐ上に配置するサンプルＳを切り替えることができる。したがって、照明光学系９により各収容部３ａのサンプルＳにレーザ光を順に入射させるとともに、液浸対物レンズ１１により各収容部３ａのサンプルＳからの蛍光を順に集光してカメラ３１により連続して撮影することができる。これにより、大量のサンプルＳの画像を効率よく高速で取得することができる。

本実施形態においては、キュベット３としてマイクロプレートを例示して説明したが、これに代えて、例えば、複数のキュベット３をアレイ状に周方向に配列してもよい。この場合は、可動ステージ７により、各キュベット３を検出光軸Ｐに平行な軸線回りに移動可能に支持し、検出光軸Ｐ上に配置するキュベット３を切り替えることとすればよい。
また、本実施形態においては、ライトシート顕微鏡を例示して説明したが、ライトフィールド顕微鏡に適用してもよい。

〔第５実施形態〕
次に、本発明の第５実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡７１は、図１０および図１１に示すように、照明光学系９が、単一照明で、チャンバ５の側壁部を透過させてレーザ光をサンプルＳに入射させ、液浸対物レンズ１１が、サンプルＳからチャンバ５の側壁部を透過してくる蛍光を集光し、可動ステージ７が、チャンバ５内でキュベット３をＸ，Ｙ，Ｚ方向にそれぞれ移動可能、かつ、照明光軸Ｑおよび検出光軸Ｐに直交する所定の回転軸回りに回転可能に支持する点で第１から第４実施形態と異なる。
以下、第１から第４実施形態に係る顕微鏡１，４１，５１，６１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

顕微鏡７１は、キュベット３と、チャンバ５と、可動ステージ７と、照明光学系９と、倍率が異なる複数の液浸対物レンズ１１と、これら複数の液浸対物レンズ１１を支持するレボルバ７３と、レボルバ７３により支持されている液浸対物レンズ１１を検出光軸Ｐに沿う方向に移動させる照準部１２と、撮像光学系１３と、液浸溶液Ｗ３を補給する水補給器７５と、可動ステージ７等を制御する制御装置７７とを備えている。図１１において、符号７９はドレインタンクを示している。

本実施形態においては、キュベット３は、キュベット溶液Ｗ１が充填された１つの収容容器であり、キュベット溶液Ｗ１にサンプルＳが浸漬されている。また、図１０に示すように、キュベット３は、周方向の全ての側壁部にそれぞれ透明部（励起光透過部、光透過部）３ｂを有している。
チャンバ５は、互いに隣接する２つの側壁部に透明部（励起光透過部、光透過部）５ｂを有している。

照明光学系９は、レーザ光源１５と、光ファイバ１７と、光ファイバ１７により導光されてきたレーザ光を平行光束にする凸レンズ１９と、シリンドリカルレンズ２１Ａ，２１Ｂと同じ構成のシリンドリカルレンズ２１と、可変絞り８１とを備えている。

可変絞り８１は、シリンドリカルレンズ２１とチャンバ５の側壁部の透明部５ｂとの間に配置されている。可変絞り８１によりレーザ光の光束径を変更することで、シリンドリカルレンズ２１により平面状に集光されたレーザ光の厚さを変更できる。この変更は光路に挿入する液浸対物レンズ１１に応じて行われる。

光ファイバ１７の先端部１８、凸レンズ１９、シリンドリカルレンズ２１および可変絞り８１は、チャンバ５の一方の側壁部の透明部５ｂに対向して配置されており、レーザ光源１５から発せられたレーザ光をチャンバ５の一方の側壁部の透明部５ｂおよびキュベット３のいずれかの側壁部の透明部３ｂを介してサンプルＳに入射させるようになっている。

液浸対物レンズ１１は、図１０に示すように、その検出光軸Ｐを照明光軸Ｑに直交させて、チャンバ５の外部に他方の側壁部の透明部５ｂに対向して配置されている。液浸対物レンズ１１の最先端のレンズの上面１１ａとチャンバ５の他方の側壁部の透明部５ｂとの隙間には、純水等の液浸溶液Ｗ３が注入され、液浸溶液Ｗ３が表面張力によってその隙間内に保持されるようになっている。

レボルバ７３は、複数の液浸対物レンズ１１を検出する蛍光の光路上に択一的に配置することができるようになっている。これにより、例えば、観察の目的に応じて使用する液浸対物レンズ１１を切り替えることができる。

水補給器７５は、先端部にノズル７５ａを有しており、液浸対物レンズ１１を切り替える際に、液浸対物レンズ１１の最先端のレンズの上面１１ａとチャンバ５の側壁部の透明部５ｂとの隙間にノズル７５ａから液浸溶液Ｗ３を補給することができるようになっている。

撮像光学系１３は、ミラー２５と、ミラー２５により反射された蛍光を結像させる結像レンズ２９と、カメラ３１とを備えている。

制御装置７７は、可動ステージ７によるキュベット３のＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動および所定の回転軸回りの回転を制御するようになっている。また、制御装置７７は、レーザ光源１５およびカメラ３１を制御したり、可変絞り８１によるレーザ光の光束径の調整、レボルバ７３による液浸対物レンズ１１の切り替え、照準部１２による液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の位置の微調整および水補給器７５による液浸溶液Ｗ３の補給を制御したりするようになっている。

このように構成された顕微鏡７１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡７１によりサンプルＳを観察するには、まず、制御装置７７により、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３を可動ステージ７によって支持してチャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２に浸漬し、レーザ光源１５からレーザ光を発生させる。

レーザ光源１５から発せられたレーザ光は、光ファイバ１７により導光されて凸レンズ１９により平行光束にされた後、シリンドリカルレンズ２１により平面状に集光されて可変絞り８１を通過し、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂを透過してチャンバ５内に入射される。

チャンバ５内に入射されたレーザ光は、チャンバ溶液Ｗ２、キュベット３の側壁部の透明部３ｂ、キュベット溶液Ｗ１を介して、検出光軸Ｐに直交する方向からサンプルＳに入射される。サンプルＳに平面状のレーザ光が入射することにより、レーザ光の入射平面に沿ってサンプルＳ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

サンプルＳにおいて発生した蛍光の内、検出光軸Ｐに沿う方向に放射された蛍光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の側壁部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３を介して液浸対物レンズ１１により集光される。

液浸対物レンズ１１により集光された蛍光は、ミラー２５により反射されて結像レンズ２９によりカメラ３１の撮像面上に結像される。これにより、カメラ３１において、サンプルＳの検出光軸Ｐに直交する断層像が得られる。制御装置７７により可動ステージ７を駆動して、チャンバ５内でキュベット３をＸ、Ｙ、Ｚ方向にそれぞれ移動させることで、サンプルＳの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。

シリンドリカルレンズ２１の焦点位置と液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐとを一致させるとともに、レーザ光の入射平面に液浸対物レンズ１１の焦点面を一致させることにより、液浸対物レンズ１１の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を液浸対物レンズ１１により１度に集光してカメラ３１により撮影し、サンプルＳにおける観察領域の鮮明な蛍光画像を取得することができる。また、カメラ３１の撮像平面以外にレーザ光が照射されないので、蛍光の褪色を抑えて良好な３次元立体像を得ることができる。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡７１によれば、制御装置７７により可動ステージ７を駆動して、キュベット３を照明光軸Ｑおよび検出光軸Ｐに直交する所定の回転軸回りに回転させて液浸対物レンズ１１に対するサンプルＳの向きを反転させ、サンプルＳの液浸対物レンズ１１から遠かった部位を液浸対物レンズ１１に近接させることで、サンプルＳの略全域に亘り良好な画像を取得することができる。

また、可動ステージ７によりチャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更しても、液浸対物レンズ１１とチャンバ５との隙間に配置される液浸溶液Ｗ３の量は（焦点の微調整があっても表面張力によりそのまま保持されて）変化しないので、液浸溶液Ｗ３を大量に用意したりこれを高い頻度で補給したりしなくてすみ、また液浸溶液Ｗ３の液切れも防ぐことができる。

また、サンプルＳの観察位置を変更した場合に、サンプルＳ内の屈折率分布に応じて液浸対物レンズ１１の焦点位置にずれが生じたり、キュベット溶液Ｗ１の屈折率とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率との僅かな相違によって液浸対物レンズ１１の焦点位置にずれが生じたりしても、照準部１２により、液浸対物レンズ１１の検出光軸Ｐに沿う方向の位置を微調整するだけで焦点位置のずれを解消することができる。

本実施形態においては、ライトシート顕微鏡を例示して説明したが、ライトフィールド顕微鏡に適用してもよい。この場合、第２実施形態と同様に、照明光学系９が、さらに、負のパワーを有するシリンドリカルレンズ４３（図４参照。）を備え、シリンドリカルレンズ２１とチャンバ５との間にシリンドリカルレンズ４３を配置して、カメラ３１の撮影光軸に沿う方向に厚さを有するレーザ光をサンプルＳに入射させることとすればよい。また、撮像光学系１３が、カメラ３１の撮像面に像を投影させる複数のマイクロレンズ４８からなるマイクロレンズアレイ４７と、マイクロレンズアレイ４７上に結像させる結像レンズ２９Ａ（同じく図４参照。）とを備えることとすればよい。このようにすることで、視差が異なる複数の画像情報を１度に取得することができる。

〔第６実施形態〕
次に、本発明の第６実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡９１は、図１２に示すように、発光顕微鏡を構成する点で第１から第５実施形態と異なる。
以下、第１から第５実施形態に係る顕微鏡１，４１，５１，６１，７１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

顕微鏡９１は、キュベット３と、チャンバ５と、可動ステージ７と、サンプルＳから発せられる蛍光を集光するドライ対物レンズ（対物レンズ）９３と、ドライ対物レンズ９３をその検出光軸Ｐに沿う方向に移動可能な照準部１２と、ドライ対物レンズ９３により集光された蛍光に基づいてサンプルＳの画像を取得する撮像光学系１３と、可動ステージ７等を制御する制御装置７７とを備えている。

本実施形態においては、キュベット３は、底部に蛍光を透過可能な透明部（光透過部）３ｂを有している。
チャンバ５は、底部に蛍光を透過可能な透明部（光透過部）５ｂを有している。

ドライ対物レンズ９３は、チャンバ５の外部に底部の透明部５ｂに近接して設けられ、透明部５ｂに対向して鉛直上向きに配置されている。また、ドライ対物レンズ９３は、チャンバ５の底部の透明部５ｂとの間に、液浸溶液Ｗ３を介在させずに間隔を空けて配置されている。
撮像光学系１３は、ドライ対物レンズ９３により集光された蛍光を結像させる結像レンズ２９と、カメラ３１とを備えている。

このように構成された顕微鏡９１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡９１によりサンプルＳを観察するには、まず、可動ステージ７により、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３を支持してチャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２に浸漬し、目的の観察位置に移動させる。

サンプルＳが自己発光する蛍光の内、検出光軸Ｐに沿う方向に放射された蛍光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の底部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２およびチャンバ５の底部の透明部５ｂを介してドライ対物レンズ９３により集光され、結像レンズ２９によりカメラ３１の撮像面上に結像される。これにより、カメラ３１において、サンプルＳの検出光軸Ｐに直交する断層像が得られる。制御装置７７により可動ステージ７を駆動して、チャンバ５内でキュベット３をＸ、Ｙ、Ｚ方向にそれぞれ移動させることで、サンプルＳの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡９１によれば、チャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更した場合に、サンプルＳ内の屈折率分布に応じてドライ対物レンズ９３の焦点位置にずれが生じたり、キュベット溶液Ｗ１の屈折率とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率との僅かな相違によってドライ対物レンズ９３の焦点位置にずれが生じたりしても、照準部１２によりドライ対物レンズ９３を検出光軸Ｐに沿う方向に微調整するだけで焦点位置のずれを解消することができる。

したがって、サンプルＳ内に屈折率分布や、キュベット溶液Ｗ１の屈折率とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率とに僅かな相違があっても、可動ステージ７を駆動して等間隔でＺ方向に撮像する、スタック画像を取得する際に、僅かな焦点の微調整を行うことにより等間隔な画像を得ることができ、歪のない３次元画像を構築することができる。また、光源や照明光学系が不要となる分だけシンプルかつ安価な構成にすることができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。例えば、上記実施形態においては、１方向または２方向からレーザ光をサンプルＳに入射させる例を示したが、例えば、３方向以上からレーザ光をサンプルＳに入射させることとしてもよい。

また、上記各実施形態においては、キュベット溶液Ｗ１、チャンバ溶液Ｗ２、液浸溶液Ｗ３、キュベット３の透明部３ｂおよびチャンバ５の透明部５ｂが全て略同等の屈折率を有することとしたが、キュベット３の透明部３ｂの厚さおよびチャンバ５の透明部５ｂの厚さがそれぞれ一定であれば、チャンバ５内でキュベット３を移動させても、励起光および蛍光が透過するキュベット３の透明部３ｂおよびチャンバ５の透明部５ｂの屈折率は変化しないので、少なくともキュベット溶液Ｗ１とチャンバ溶液Ｗ２とが互いに略同等の屈折率を有するものであればよい。

１，４１，５１，６１，７１，９１ 顕微鏡
３ キュベット（標本容器）
３ａ 収容部（標本収容部）
３ｂ，５ｂ 透明部（励起光透過部、光透過部）
５ チャンバ（媒質容器）
５ａ 開口部
７ 可動ステージ
９ 照明光学系
１１ 液浸対物レンズ（対物レンズ）
１２ 照準部
３１ カメラ（撮像部）
２１ シリンドリカルレンズ（レンズ）
２１Ａ，２１Ｂ シリンドリカルレンズ（レンズ）
２４Ａ，２４Ｂ 反射面（反射ミラー）
４７ マイクロレンズアレイ
９３ ドライ対物レンズ（対物レンズ）
Ｐ 検出光軸
Ｑ 照明光軸
Ｓ サンプル（標本）
Ｗ１ キュベット溶液（第１液浸媒質）
Ｗ２ チャンバ溶液（第２液浸媒質）
Ｗ３ 液浸溶液（第３液浸媒質）

Claims (20)

1. 標本と共に第１液浸媒質を収容する標本容器が浸漬される、前記第１液浸媒質と同等の屈折率を有する第２液浸媒質を貯留する媒質容器と、
   該媒質容器の外部に配され、前記標本から発せられる光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された前記光を撮影する撮像部と、
   前記対物レンズをその検出光軸に沿う方向に移動させる照準部と、
   前記媒質容器内で前記標本容器を少なくとも前記検出光軸に沿う方向に移動可能に支持する可動ステージとを備え、
   前記標本容器および前記媒質容器が、前記標本からの前記光を透過可能な光透過部をそれぞれ有し、
   前記対物レンズが、前記媒質容器の前記光透過部を介して前記標本容器の前記光透過部に対向して配置される顕微鏡。
2. 前記対物レンズが、前記媒質容器の前記光透過部との間に間隔を空けて配置される請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記対物レンズが液浸対物レンズであり、該液浸対物レンズが前記媒質容器の前記光透過部との間に第３液浸媒質を介して配置される請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記液浸対物レンズが、鉛直方向に交差する方向に前記検出光軸を向けて配置され、
   前記第３液浸媒質が、前記液浸対物レンズと前記媒質容器の前記光透過部との間に表面張力により保持される請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記標本容器および前記媒質容器が前記光透過部を側壁部に有し、
   前記液浸対物レンズが、鉛直方向に略直交する方向に前記検出光軸を向けて配置される請求項４に記載の顕微鏡。
6. 前記第３液浸媒質が、前記第２液浸媒質と同等の屈折率を有する請求項３から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡。
7. 前記標本容器の前記光透過部が、前記第２液浸媒質と同等の屈折率を有する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
8. 前記媒質容器の前記光透過部が、前記第２液浸媒質と同等の屈折率を有する請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡。
9. 前記可動ステージが、前記標本容器を前記検出光軸に交差する方向に移動可能に支持する請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
10. 前記撮像部が、前記標本が自己発光した前記光を撮影する請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡。
11. 前記検出光軸に交差する方向から前記標本に励起光を照射する照明光学系を備え、
    前記標本容器および前記媒質容器が、前記照明光学系からの前記励起光を前記標本に向けて透過させる励起光透過部をそれぞれ有する請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡。
12. 前記媒質容器が、前記励起光透過部を底部に有し、
    前記照明光学系が、前記媒質容器内に配置された反射ミラーを備え、前記励起光を前記底部の前記励起光透過部から前記媒質容器内に入射させて前記反射ミラーにより前記標本に向けて反射する請求項１１に記載の顕微鏡。
13. 前記媒質容器が、前記励起光透過部を側壁部に有し、
    前記照明光学系が、前記側壁部の前記励起光透過部から前記媒質容器内に前記励起光を入射させる請求項１１に記載の顕微鏡。
14. 前記照明光学系が、前記媒質容器内に配置された正のパワーを有するレンズを備える請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の顕微鏡。
15. 前記正のパワーを有するレンズが、前記照明光学系の照明光軸に交差する一方向に正のパワーを有するシリンドリカルレンズである請求項１４に記載の顕微鏡。
16. 前記撮像部の撮影光軸に交差する方向に複数のマイクロレンズを２次元的に配列してなるマイクロレンズアレイを備え、
    前記照明光学系が、略平行光束の前記励起光を前記標本に入射させる請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の顕微鏡。
17. 前記可動ステージが、複数の前記標本容器を前記媒質容器内で前記検出光軸に平行な軸線回りに移動可能に支持する請求項１１から請求項１６のいずれかに記載の顕微鏡。
18. 前記標本容器が、前記照明光学系の照明光軸に交差する１方向に配列された複数の標本収容部を有し、
    前記可動ステージが、前記検出光軸上に配置する前記標本収容部を切り替え可能に支持する請求項１１から請求項１６のいずれかに記載の顕微鏡。
19. 前記可動ステージが、前記標本容器を前記媒質容器内で前記検出光軸回りに回転可能に支持する請求項１１から請求項１８のいずれかに記載の顕微鏡。
20. 前記照明光学系が、前記対物レンズの前記検出光軸に交差する平面に沿って平面状の前記励起光を前記標本に入射させる請求項１１に記載の顕微鏡。

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