JP2018029505A - 細胞構造体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することを目的とする。【解決手段】培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行い、ここで、被覆領域の表面ゼータ電位を０〜５０ｍＶとすることを特徴とする、細胞構造体の製造方法。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞構造体の製造方法に関する。

生物学の分野における重要な実験技術として、１９００年頃に開発された細胞培養技術がある。開発当初は、培地成分の最適化等細胞を馴化することに注力されるに留まり、単層培養や浮遊培養の技術が中心に検討されてきた。

近年、単層培養系の細胞と生体内組織の細胞との間で、種々の性質、刺激応答性、細胞機能等が異なることが明らかになり、単層構造を形成させる単層培養よりも、生体内の組織構造に近い３Ｄ構造を形成させる３Ｄ培養、特に、スフェロイド培養の需要が拡大している（非特許文献１参照）。

古典的には、タンパク質系のゾル中に細胞を浮遊させ、この細胞浮遊液を何らかのトリッガー（熱、光、化学架橋剤等）でゲル化させることによって形成させた３Ｄゲル中に細胞を包埋させる技術、多孔質のスキャホールド中に細胞を生着させる技術、ＮＩＰＡＭを固定化した培養皿を用いて細胞シートの積層体を調製する技術等が盛んに開発されてきた。

近年では、住友ベークライト社のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ等の、非接着性の丸底面へ細胞を沈降させる手法；ＪＳＲ社のＮａｎｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ、日立製作所のＮａｎｏ Ｐｉｌｌａｒ Ｐｌａｔｅ等の、レーザー加工により平滑面を規則正しい凹凸面にすることによって培養面に接着した細胞の遊走性を高め、これにより、培養面において細胞の自己組織化を誘導する手法；クラレ社のＥｌｐｌａｓｉａ、イワキ社のＥＺＳＰＨＥＲＥ等の、直径１００〜５００μｍ、深さ５００μｍ程度の無数の穴が配設された培養皿を用いて、各穴の底面へ各穴に播種した細胞を沈降させる手法等が開発されている。

また、近年では、管状部材の先端に細胞懸濁液の液滴を調製し、液滴の表面張力を利用して液滴の形状を球状に保ちながら液滴を所定期間（例えば、２週間程度）保持することによって、液滴中でスフェロイド状の細胞構造体を製造する、ハンギングドロップ法も知られている。

Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４２４，Ｐ８７０−８７２，２１ Ａｕｇｕｓｔ，２００３．

しかしながら、上記従来の方法を用いてスフェロイド状の細胞構造体を製造した場合、細胞構造体のバイアビリティが低い、所望のサイズとすることが容易ではない、形状を整えることが困難である等という問題があった。特に、細胞構造体のサイズや形状が揃わない場合には、製造した細胞構造体の分級作業が必要になり、製造工程が煩雑になりコストも増大することとなる。

そこで、本発明は、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することを目的とする。

本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の細胞構造体の製造方法は、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行い、ここで、前記被覆領域の表面ゼータ電位を０〜５０ｍＶとする
ことを特徴とする。
ここで、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記被覆領域に対する水の接触角を５０〜９０°とすることが好ましい。
また、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記培養面に複数の前記被覆領域を調製することが好ましい。
更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記被覆領域に複数の前記液滴を形成することが好ましい。
更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、各前記被覆領域において、前記液滴の底面積を前記被覆領域の面積よりも小さくすることが好ましい。
更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記液滴に含まれる細胞の数を３．０×１０^５個／ｍＬ以下とすることが好ましい。
更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記液滴の径を１μｍ〜８ｍｍとすることが好ましい。
更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記液滴の量を０．５〜５０μＬとすることが好ましい。

本発明によれば、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することができる。

本発明の実施形態の細胞培養体の製造方法の一例の概略を示す図である。 （ｉ）〜（ｉｉｉ）本発明の実施形態の細胞培養体の製造方法の変形例を示す図である。 （Ａ）〜（Ｃ）は、実施例において培養面における液滴の量と液滴の径との相関を調査した結果を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明の細胞構造体の製造方法の実施形態について詳細に例示説明する。

図１に、本発明の実施形態の細胞培養体の製造方法の一例の概略を示す。

（細胞構造体の製造方法）
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」ともいう。）は、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行うものである。

より具体的には、本実施形態の製造方法の一例では、図１に示すように、まず、培養面を準備し（図１（ｉ）参照）、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置し（図１（ｉｉ）参照）、培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆して被覆領域を調製し（図１（ｉｉｉ）参照）、被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し（図１（ｉｖ）参照）、液滴中で細胞培養を行い（図１（ｖ）参照）、細胞構造体を形成させる（図１（ｖｉ）参照）。

ここで、本実施形態の製造方法では、後述のとおり細胞構造体を自発的に形成する効果を得る観点から、培養面に調製しした被覆領域の表面ゼータ電位を、０〜５０ｍＶとすることが肝要である。

以下、本実施形態の製造方法における作用効果について記載する。

細胞構造体の製造方法として公知のハンギングドロップ法では、管状部材の先端に細胞懸濁液の液滴を調製し、液滴の表面張力を利用して液滴の形状を球状に保ちながら液滴を所定期間（例えば、２週間程度）保持することによって、液滴中でスフェロイド状の細胞構造体を製造している。しかしながら、液滴を保持するために操作が煩雑なものとなり、スフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することが困難である。
一方、本実施形態の製造方法によれば、液滴を培養面に載せた状態で保持することができるため、スフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することが可能となる。

また、例えば、培養面と壁面とで区画される１つ又は複数のウェルを備える細胞培養器を用いて、ウェルの培養面に被覆領域と被覆領域でない領域である非被覆領域とを調製し、ウェルに細胞懸濁液を加える方法も考えられるが、かかる方法に対しては本実施形態の製造方法は下記のような効果を有している。

上述の方法では、被覆領域も非被覆領域も細胞懸濁液で浸るように、細胞培養液を細胞培養器に対して加えるため、非被覆領域に播種した細胞が接着するおそれがある。このとき、非被覆領域の細胞が、被覆領域における形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体の形成を阻害することがある。そのため、壁面を有する細胞培養器を用いる場合には、培養面の全部又は一部に細胞非接着性を与える処理を施すことが必要となることもある。そして、ときに、かかる処理に起因して細胞に毒性のある物質が培地に溶出することもある。
一方、本実施形態の製造方法によれば、被覆領域における細胞懸濁液の液滴は非被覆領域から隔離されているため、上記の細胞非接着性を与えるような処理が必要とならず、そして、細胞の生育に悪い影響を与える可能性が低くなる。

また、上述の方法では、ウェルに細胞懸濁液を加えた後、被覆領域には細胞が接着し、細胞非接着性を与えるような処理を施した非被覆領域には細胞が接着しないこととなる。非被覆領域における接着しなかった細胞は、アポトーシスを生じさせたりヒートショックプロテインを産生させたりして、被覆領域において接着した細胞の生育に対して悪い影響を与えるおそれがある。そのため、この方法では、非被覆領域の細胞を培地交換等の操作によりウェルから除去することが必要となる場合がある。
一方、本実施形態の製造方法によれば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆されることで細胞接着性を備えることとなった被覆領域に、非被覆領域から隔離された状態で、細胞懸濁液の液滴を形成するため、非被覆領域の細胞を除去する必要性が小さいため、使用する細胞の量を低減することができ、また、培地交換ンどの操作の必要性が小さいため、使用する培地の量を低減することができる。総じて、本実施形態の製造方法によれば、製造コストを低減することが可能になる。

本実施形態の製造方法では、３８４ウェル細胞培養プレート等に使用されている自動培養装置をそのまま利用することが可能（例えば、１６連ノズルで細胞浮遊液をマルチプレートに注入するプログラムで、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を塗布した培養面に細胞懸濁液の液滴を吐出することが可能）であり、また、細胞培養プレートの分析機器も当該技術分野において通常用いられているものを利用することが可能である。そのため、本実施形態の製造方法によれば、細胞構造体の製造コストを抑制することができると共に、上記装置や機器の用途を広げるという意味で経済効果を生み出すことができる。

本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、前述のとおり、被覆領域の表面ゼータ電位を０〜５０ｍＶとすることが肝要である。表面ゼータ電位を０ｍＶ以上とすれば、負に帯電する細胞を接着させることができ、また、５０ｍＶ以下とすれば、細胞毒性を軽減することができる。
上記と同様の理由から、表面ゼータ電位は、好適には０〜３５ｍＶであり、更に好適には１０〜２５ｍＶである。

表面ゼータ電位は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物における、Ｃ／Ａ比（後述）を調整することによって、調整することができる。

上記特定の範囲の表面ゼータ電位を有する培養面によれば、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体（スフェロイド）を簡便に形成させることができる。
これは、上記特定の範囲の表面ゼータ電位とすることによって、培養面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができるものと推測される。

上記特定の範囲の表面ゼータ電位を有する培養面における細胞構造体を形成する現象の再現性は極めて高く、均質な細胞構造体を作製することが可能となる。

従来の細胞培養器を用いて作製された細胞の塊は、細胞非接着性の培養面に接着できない細胞が寄せ集められたものに過ぎないため、細胞の塊を構成する細胞のバイアビリティが低いという問題があった。
一方、本実施形態の製造方法で製造された細胞構造体（スフェロイド）は、培養面上に速やかに接着し、増殖しながら伸展するという経過を経たうえで形成されるものであるため、細胞間に産生された細胞外マトリックスが豊富に存在する。そのため、細胞構造体自体のバイアビリティ（活性）が極めて高い。

そして、本実施形態の製造方法では、細胞構造体のサイズは、実験者が目的に応じて適宜定めることができ、サイズに分布を持たせることも、サイズを均一にすることも可能となる。
細胞構造体のサイズは、微小サイズ（例えば、数百μｍ以下のサイズ）とすることができ、５０〜１，５００μｍ径としてよく、５０〜２００μｍ径であることが好ましい。

また、本実施形態の製造方法では、平板な培養面において細胞構造体を作製することが可能であるため、細胞培養器を用いて作製した細胞構造体に対してアッセイを行う場合に、この培養器を直接的に顕微鏡により観察することも可能となる。

更に、本実施形態の製造方法によれば、細胞が細胞培養器の培養面と壁との境界である培養面の外縁に接着させないことも可能となり、サイズの均質性を長時間維持することができる。

以下、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法における各工程について詳細に記載する。

本実施形態の製造方法の一例では、まず、培養面を準備する（図１（ｉ）参照）。

ここで、培養面としては、細胞培養器の培養面であってもよく、細胞培養器以外の部材の培養面であってもよく、例えば、市販のプレート、ディッシュ、フラスコ、ガラス板、シリコンシート等が挙げられる。

培養面は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよい。
なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。

培養面の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ポリカーボネート等が挙げられ、精密な成形加工が容易であり、種々の滅菌法を適用することが可能であり、透明性があるため顕微鏡観察に向いているという観点から、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。

なお、一般的な細胞培養用のプレートは、ポリスチレン等のプラスチックでできているが、表面処理（例えば、プラズマ処理）が施されており、培養面に細胞が接着しやすくなっている。

なお、本発明の細胞構造体の製造方法では、培養面を準備すればよく、細胞培養器を用いなくてもよい。

次いで、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置する（図１（ｉｉ）参照）。

以下、本発明の実施形態の製造方法において培養面に配置される温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物について詳述する。

本発明の実施形態の細胞培養器に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。
ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含む温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本発明の実施形態において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。

２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。

重合禁止剤の混合物に対する重量割合は、０．０１％〜１．５％であることが好ましく、０．１％〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の混合物に対する重量割合は、１．０％〜５０％であることが好ましく、９．０％〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。

次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０ｎｍ〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０ｎｍ〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

反応条件に関して、温度条件としては、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７時間〜２４時間であることが好ましく、１７時間〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。

なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。

混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）

、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）

を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。

なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。

（温度応答性ポリマー）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。

ここで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）及び塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル数）は、０．００１〜１とすることが好ましく、０．０１〜０．５とすることが更に好ましい。

溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基からなる群から選択される少なくとも１種の基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜５とすることが更に好ましい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。

数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００であり、更に好適には２０，０００であり、特に好適には１００，０００である。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。

この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。

この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。

（温度応答性ポリマー）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。

ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。

Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。

カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。

ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。

ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水、等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。

この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。

更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

（温度応答性ポリマー）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。

例えば、特許文献１に記載の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡはポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記特許文献１の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。

一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、前述の（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマー組成物の製造方法）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する（（２）トリスは任意選択的に含む。）。

（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。

この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。

ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。

また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。

上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。

上記（３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピン等の人工核酸等が挙げられる。
特に、ＤＮＡとしては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞を分化細胞、特に、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、血管内皮細胞、に分化誘導できるＤＮＡが好ましい。

また、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。

（３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸等のジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。

なお、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。

ここで、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。

上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。

また、上記割合（（２）／（１））は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。

上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。

ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。

Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、管状細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。

上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。

ここで、本実施形態の製造方法の一例では、培養面全面に被覆領域を調製してもよく（図２（ｉ）、（ｉｉ）参照）、培養面に複数の被覆領域を調製してよい（図２（ｉｉｉ）参照）。

培養面全面に被覆領域を調製する場合、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物溶液を培養面に流延させてよい。
培養面に複数の被覆領域を調製する場合、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置（スポット）手法としては、例えば、８連マイクロピペッターによる手技、溶液を定量吐出するスポッター印刷法、回転スクリーンドラム印刷法等が挙げられる。

特に、培養面に複数の被覆領域を調製する場合、
被覆領域の面積は、０．１〜３０ｍｍ^２であることが好ましい。上記範囲とすれば、目的の微小サイズのスフェロイドが得られやすい。
被覆領域間の距離が、０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。なお、「被覆領域間の距離」とは、被覆領域間の培養面上における最短距離をいう。０．１ｍｍ以上とすれば、隣接する被覆領域間で、それぞれの領域に播種された細胞どうしが接着してしまうことを抑制することができる。１０ｍｍ以下とすれば、大量の細胞構造体（スフェロイド等）を効率良い作製することができる。

特に、培養面に複数の被覆領域を調製する場合、
被覆領域の数は、実験者の目的に応じて適宜定められてよく、２以上としてよく、１０以上としてよく、１，０００以上としてよい。

特に、培養面に複数の被覆領域を調製する場合、
被覆領域の平面視形状は、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状であることが好ましい。
曲率半径としては、０．１〜５０ｍｍであることが好ましく、１〜１０ｍｍであることが更に好ましい。
円形の被覆領域の直径としては、１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましく、３０μｍ〜１５００μｍであることが更に好ましい。
これらの形状は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本実施形態の製造方法の一例では、培養面の被覆領域が、単位面積当たりに有する、温度応答性ポリマーの量が、５．０〜５０ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、１５〜４０ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。

本実施形態の製造方法の一例では、温度応答性ポリマーは、水溶液の状態からの沈殿、溶液の塗布及び溶媒の乾燥、放射線照射、低温プラズマ照射、コロナ放電、グロー放電、紫外線、ラジカル発生剤を使用したグラフト重合等の手法により細胞培養器の培養面に被覆されていてよい。

培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆する方法、及び被覆領域となる複数の培養面上における位置に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置する方法については後述する。

本実施形態の製造方法における培養面は、細胞培養用プレート（例えば、３５ｍｍディッシュ等）をベースとして作製されてよく、例えば、再生医療の分野において好適に用いることができる。
一方、培養面は、マイクロプレート（例えば、９６穴プレート等）をベースとして作製されてよく、例えば、創薬の分野（特に、薬剤スクリーニング）において好適に用いることができる。

上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物は、加熱乾燥、凍結乾燥、減圧蒸留等により水分を除去して、メタノール、エタノール等のアルコール、ケトン、エステル等の有機溶媒に溶解してもよい。これらの中でも、表面張力と沸点が低く速やかな乾燥が可能であり、温度応答性ポリマーをより均一に被覆できる観点から、メタノールに溶解させることが好ましい。また、有機溶媒に溶解する場合には、更に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等の非イオン性でかつ親水性である親水性分子を加えてもよい。

こうして、この製造方法の一例では、培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆して被覆領域を調製する（図１（ｉｉｉ）参照）。

本実施形態の製造方法では、前述のとおり、被覆領域の表面ゼータ電位が、０〜５０ｍＶとすることが肝要であり、０〜３５ｍＶであることが好ましく、１０〜２５ｍＶであることが更に好ましい。

また、本実施形態の製造方法では、本発明の効果を高める観点から、培養面の被覆領域に対する水の接触角が、５０〜９０°であることが好ましく、６０〜８０°であることが更に好ましく、６２〜７８°であることが特に好ましい。
なお、被覆領域に対する水の接触角とは、被覆領域内の任意の数点において、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠して、測定される接触角の平均値を指す。

上記の通り、被覆領域は、細胞表面との間の相互作用を高めて、細胞の被覆領域に対する接着性を高める観点から、所定程度以上の疎水性を有する領域であることが好ましい。

培養面の被覆領域に対する水の接触角は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物における疎水性基の構造や量を調整することによって、調整することができる。

本実施形態の製造方法の一例では、各被覆領域において、液滴の底面積を被覆領域の面積よりも小さくすることが好ましい。
培養面を被覆する工程においては、被覆領域の端縁では被覆領域の中央部分と比較して、単位面積当たりに対する温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の量が多くなり、ときに被覆領域の端縁が中央部分に対して盛り上がることがある。この場合、被覆領域に接着した細胞がなす細胞構造体の形状が整いにくい傾向がある。液滴の底面積を被覆領域の面積よりも小さくすれば、被覆領域において温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の量が不均一になるおそれのある領域には細胞を接着させないようにすることができるようになるため、形状の整った細胞構造体を調製しやすくなる。
上記と同様の理由から、具体的には、各被覆領域において、被覆領域の面積に対する液滴の底面積の割合の上限を９９％以下としてよく、上限は、９７％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％することも好ましい。
また、上記割合の下限を１０％以上としてよく、下限は、２０％、３０％とすることも好ましい。上記割合を１０％以上とすれば、十分なサイズの細胞構造体を効率良く調製することが可能となる。

本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例では、被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成する（図１（ｉｖ）参照）。

本実施形態の製造方法は、製造した細胞構造体の直径に極めて高い均質性が要求される細胞（例えば、創薬試験に利用される細胞や多分化能幹細胞等）や、分化状態の精密制御のために培養コストが高額になる細胞（具体的には、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞、並びに、それらの分化誘導細胞；血管内皮細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞、心筋細胞、筋芽細胞等の間葉系細胞；ＨｅｐａＲＡ、ＨｅｐａＲＧ、ＨｅｐＧ２、ＢｘＰＣ−３等の上皮系の細胞；等）に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。

この製造方法の一例では、被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成するに当たって、底面の形状が好適には円形となるように、細胞懸濁液を滴下することが好ましい。かかる手法によれば、形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を得られやすくなる。

本実施形態の製造方法の一例では、液滴に含まれる細胞の数を、３．０×１０^５個／ｍＬ以下とすることが好ましい。
細胞を播種する工程において、細胞密度が高過ぎる場合には、細胞が重なり合った状態で沈殿してしまい、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物と接触しない細胞が生じることとなる。この場合、このようなポリマー又はポリマー組成物と非接触の細胞は、例えば、他の細胞との融合によりその性質を変えてしまう等といった有害な影響をもたらす可能性がある。液滴に含まれる細胞の数を３．０×１０^５個／ｍＬ以下とすれば、被覆領域にほぼ単層で細胞を沈殿させることができ、細胞を好適な条件下で培養することが可能となる。

また、液滴に含まれる細胞の数は、十分なサイズの細胞構造体を調製する観点から、１．０×１０^４個／ｍＬ以上とすることが好ましい。

上記と同様の理由から、液滴に含まれる細胞の数は、更に好適には１．０×１０^５個〜３．０×１０^５個／ｍＬであり、特に好適には２．０×１０^５個〜３．０×１０^５個／ｍＬであり、播種した細胞の形態やサイズ等を考慮して当業者によって適宜調整可能である。なお、上記の細胞の数とは、生細胞の数を意味する。

この製造方法の一例では、液滴の径を１μｍ〜８ｍｍとすることが好ましい。
液滴の径が１μｍより少ないと、培地量が少なくなりすぎるため、乾燥が引き起こされる等細胞培養において適当でない環境となる可能性がある。
液滴の径が８ｍｍを超えると、細胞が液滴内でポリマー又はポリマー組成物上に沈殿する際に、ポリマー上に配置される細胞の細胞密度にばらつきが生じ、スフェロイド形成が複数箇所で生じ（細胞の凝集の核となる応力発生点が複数箇所となり）、スフェロイドが真球状となりにくいおそれがある。
上記と同様の理由から、液滴の径は、更に好適には１００μｍ〜４ｍｍであり、特に好適には３００μｍ〜３ｍｍである。

本実施形態の製造方法の一例では、形状の整った細胞構造体を調製しやすくする観点から、液滴の量を０．５〜５０μＬとすることが好ましく、１．０〜４０μＬとすることが更に好ましく、５．０〜２５μＬとすることが特に好ましい。

また、この製造方法の一例では、１つの被覆領域に、１つの液滴を形成してもよく、複数の液滴を形成してもよい。

特に、１つの被覆領域に複数の液滴を形成する場合には、液滴間の間隔（液滴間の最近接距離）としては、１〜５００μｍであることが好ましい。
１μｍより少ないと、液滴同士が結合してしまう可能性がある。５００μｍを超えると、効率的にスフェロイドを大量生産するという目的を達成できない可能性がある。
上記と同様の理由から、液滴間の間隔は、２〜２５０μｍであることが更に好ましく、５〜１００μｍであることが特に好ましい。

この製造方法の一例では、液滴中で細胞培養を行う（図１（ｖ）参照）。

培養条件は、使用する細胞に応じて適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等としてよい。

細胞培養の際には、水ミストの噴霧等により培養器内を積極的に加湿する方法、リン脂質、高級カルボン酸、流動パラフィン等の低比重で不活性な油性成分の被膜で細胞懸濁液の液滴表面を覆うことによって、液滴中の水分の揮発を抑制する方法を用いてよい。かかる方法は、特に、細胞懸濁液の液滴の量が１０μＬ未満である場合に、液滴を維持するために特に有効である。

その後、この製造方法の一例では、更に培養を続けることによって、細胞構造体を形成させる（図１（ｖｉ）参照）。

培養条件は、使用する細胞に応じて適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等としてよい。

このとき、特定の特性を有する被覆領域において、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。

以下、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法において用いられる好適な培養面について記載する。

好適な培養面は、ガラス製の培養面と、培養面から始端する前述の本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法において用いられる温度応答性ポリマーと、を含むものである。

好適な培養面によれば、ガラス自体が有機溶媒に対する耐性を備えるため、培養面を有機溶媒で洗浄することが可能となり、より細胞毒性物質を低減することが可能となる。
また、この培養面は、従来的に用いられてきた放射線照射を伴うグラフト重合の方法を用いることなく製造することが可能であること（後述）、また、ため、放射線照射により生じる重合体の分解物の量を低減することができ、細胞の生育に良好な環境を提供することができる。

ガラス製の培養面としては、ガラス製の細胞培養器の培養面やガラス板の表面等としてよい。
温度応答性ポリマーとしては、前述の（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー等が挙げられる。

より具体的には、かかる好適な細胞培養器の製造方法としては、例えば、
（ａ）ガラス製の培養面をビニル基を有するシランカップリング剤で処理し、処理された培養面上において２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を水存在下で紫外線を照射しながら重合させる方法、
（ｂ）ガラス製の培養面をハロゲン化アルキル基を有するシランカップリング剤で処理し、また、ハロゲン化アルキル基とＮ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカバミル酸との置換反応で、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカルバモイル基を培養面に導入し、かかる培養面上において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカルバモイル基をラジカル重合開始点として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を水存在下で紫外線を照射しながらイニファーター重合させる方法、
が挙げられる。

上記（ａ）の方法に関して、ビニル基を有するシランカップリング剤としては、有機物との反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｙ）として、ビニル基、スチリル基、メタクリル基、アクリル基からなる群から選択される少なくとも１つを有し、ガラスとの反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｘ）として、アルコキシ基、ハロゲンからなる群から選択される少なくとも１つを有するものが挙げられる。
具体的には、ビニルトリメトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロイルオキシプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。
シランカップリング剤での処理の条件は、常法の通りとしてよい。

処理された培養面上におけるＤＭＡＥＭＡの重合の方法としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマーについて記載した通りとしてよい。
特に、上記（ａ）の方法では下記の条件とすることが好ましい。
・紫外線照射における紫外線の波長としては、重合体の分解物の量を低減する観点から、近紫外線の波長であることが好ましく、３３０〜４００ｎｍであることが更に好ましく、３５０〜３９０ｎｍであることが特に好ましい。
・処理された培養面の裏側から光を照射する（ガラスを透過させるように光を照射する）と、光源に含まれる短波長の紫外線をカットし、近紫外線領域の波長の光線を選択的に照射することも可能となり、かつ、ビニル基を有するシランカップリング剤側からＤＭＡＥＭＡ側に向かって光照射して、モノマーの分解等よりも重合反応を優先させることも可能となるため、好ましい。

上記（ｂ）の方法に関して、ハロゲン化アルキル基を有するシランカップリング剤としては、有機物との反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｙ）として、ハロゲン化アルキル基、より具体的には、ｐ−クロロメチルベンジル基、３−クロロプロピル基、ｐ−ブロモメチルベンジル基、３−ブロモプロピル基からなる群から選択される少なくとも１つを有し、ガラスとの反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｘ）として、アルコキシ基、ハロゲンからなる群から選択される少なくとも１つを有するものが挙げられる。
具体的には、３−クロロプロピルトリメトキシシラン、ｐ−クロロメチルベンジルトリクロロシラン、３−クロロプロピルトリクロロシラン等が挙げられる。
シランカップリング剤での処理の条件は、常法の通りとしてよい。

ガラス表面（培養面）へ導入されたＮ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカルバモイル基をラジカル重合開始点とする２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）のイニファーター重合の反応条件は、常法の通りとしてよい。
特に、上記（ｂ）の方法では下記の条件とすることが好ましい。
・紫外線照射における紫外線の波長としては、重合体の分解物の量を低減する観点から、近紫外線の波長であることが好ましく、３３０〜４００ｎｍであることが更に好ましく、３５０〜３９０ｎｍであることが特に好ましい。
・処理された培養面の裏側から光を照射する（ガラスを透過させるように光を照射する）と、光源に含まれる短波長の紫外線をカットし、近紫外線領域の波長の光線を選択的に照射することも可能となり、かつ、シランカップリング剤側からＤＭＡＥＭＡ側に向かって光照射して、モノマーの分解等よりも重合反応を優先させることも可能となるため、好ましい

以上、図面を参照して、本発明の細胞構造体の製造方法の実施形態について例示説明したが、本発明の細胞構造体の製造方法は、上記の例に限定されることはなく、上記実施形態には、適宜変更を加えることができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（実施例Ａ１）
（試験Ａ１）ポリマーの製造
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０^５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した（実施例ポリマー１）。

上述の温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、代表的なピークを示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）δ ０．８−１．２（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，−Ｏ−ＣＨ_２−）．
ここで、主鎖のメチル基（δ ０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ ２．２−２．４）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
その結果、上述の温度応答性ポリマーの場合は９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

実施例ポリマー１の３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜４０℃の間で測定した。
その結果、２０℃〜３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
なお、実施例ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。

（試験Ａ２）細胞構造体の製造
実施例Ａ１では、塗布・乾燥により調製した培養面を用いて、細胞構造体の製造を行った。
細胞培養器として、ポリスチレン製の３５ｍｍ細胞培養プレート（イワキ社製、型番：３０００−０３５−ＭＹＰ、１ウェル当たりの底面積：９ｃｍ^２）を用いた。
次いで、培養面上に、曇点以下に冷却した温度応答性ポリマーの水溶液（濃度：１５μｇ／ｍＬ）４０μＬを、全面に亘って、塗布した。
そして、クリーンベンチ内にて放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させた。
こうして、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した被覆領域を設けた。

（試験Ａ３）ゼータ電位の測定
細胞培養プレートの小片に（試験Ａ２）の手順と同様の手順に従って設けた被覆領域の表面ゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。
具体的には、石英セルの下面に小片の試料を密着させ、セル内部にモニター粒子懸濁液を注入した。ここで、標準のモニター粒子として、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ〜＋５ｍＶ）を用いた。また、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。そして、ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式を用いて算出した。
非被覆の細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は−６８ｍＶであり、一般的な熱可塑性樹脂の固体表面のゼータ電位として当業者に周知の値であった。
一方、温度応答性ポリマーにより被覆された細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。
なお、当業者に周知の通り、現在の技術では、固体表面のゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものであり、また、試料の調製工程においても、コーティング操作自体にバラツキが存在するものであるため、上記ゼータ電位の測定値はある程度の誤差を有し得る。

（試験Ａ４）接触角の測定
細胞培養プレートの被覆領域に対する水の接触角を、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠して、接触角計（商品名：ＤＭｓ−４００、協和界面科学社製）を用いて測定したところ、７０°±１０°であった。

（試験Ａ５）細胞培養
ここで、ＧＦＰでタグ付けしたラット皮下脂肪由来の間葉系脂肪幹細胞３．０×１０^５個／ｍＬを、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６）中に浮遊させ、細胞懸濁液を調製した。
細胞懸濁液をピペッターで、０．５μＬ、２μＬ、４μＬ、２０μＬの量を適宜選択しつつ、１００箇所に液滴として滴下した（図１（ｉｖ）参照）。液滴の形状はほぼ真円形であり、液滴の径は、０．５μＬの場合について１ｍｍ、２μＬの場合について２ｍｍ、４μＬの場合について３ｍｍ、２０μＬの場合について５．５ｍｍであった。液滴間の間隔は、どの液滴間についても、２００μｍ以上となるようにした。液滴の底面積の被覆領域の面積に対する割合は約７５％であった。
この播種したラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気の細胞培養インキュベーター中で８時間培養した。
培養開始から０時間後（滴下直後）には、脂肪幹細胞が被覆領域の全面に接着していた（図１（ｖ）参照）。
培養開始から２時間後に、被覆領域の外縁付近に位置する細胞が、自発的に剥離し始めた。
培養開始から３時間後〜６時間後にかけて、細胞の自発的な剥離は、被覆領域の外縁側から被覆領域の中心側に向かって、徐々に進行した。
培養開始から８時間後に、遂には、各被覆領域における培養から、被覆領域の数だけ、スフェロイド状の構造を有する細胞構造体が形成した（図１（ｖｉ）参照）。
形成したスフェロイド状の細胞構造体は、いずれも液滴の量に応じた所望のサイズの、ほぼ球形状の形状の整ったものであった。

（実施例Ａ２〜Ａ５）
実施例Ａ２については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域の表面ゼータ電位を＋２０ｍＶから＋１５ｍＶに変更した以外は上記実施例Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。
実施例Ａ３については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域の表面ゼータ電位を＋２０ｍＶから＋３５ｍＶに変更した以外は上記実施例Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。
実施例Ａ４については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域に対する水の接触角を７０°±１０°から６５°±７°に変更した以外は上記実施例Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。
実施例Ａ５については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域に対する水の接触角を７０°±１０°から７５°±５°に変更した以外は上記実施例Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。

（実施例Ｂ１）
（試験Ｂ１）培養面の調製
松浪硝子製の精密ガラス板：ＭＩＣＲＯ ＣＯＶＥＲ ＧＬＡＳＳ（３０ｍｍ×４０ｍｍ×０．１５ｍｍ厚）をジエチルエーテルで洗浄して乾燥させた。ガラス板同士の貼り付き防止用の油性成分や異物を清浄する目的で行った。

（試験Ｂ１−１）＜ポリマーを培養面の全面に被覆した場合＞
Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅを４％酢酸水溶液へ溶解し、終濃度が０．５％または２．０％となるように調整した。このシラン化合物溶液をガラスの全面へ流延し，溶液厚が約０．１μｍとなるよう液切りし、塩化カリウムの飽和溶液で８４％となるように加湿した２５℃の密閉デシケーター中で７２時間静置した。ＲＯ水で洗浄した後に１００℃で１０分間処理して水分を蒸発させ、更にＲＯ水および２−プロパノールで洗浄した。ＩＲの分析によりシランカプリング剤Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅに由来するビニル基がガラス表面へ固定されていることが確認された。
２−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅを１０ｇ、ＲＯを５ｇ混合した溶液を１０分間窒素ガスでバブリングした。上記（１）で作製したビニル基が導入されたガラス板を１００ｍｍ径シャーレへ配置し、窒素ガスバブリングにより脱酸素したモノマー水溶液１０ｍＬを加えてガラス板を浸漬し、内部が窒素雰囲気となるように密閉した。シャーレの底面から３７５ｎｍのブラックライトを１０時間照射し、ガラス板をＲＯ水、２−プロパロールで洗浄して乾燥し、細胞培養器（１）を得た。

試験Ｂ１−１で調製した細胞培養器（１）について、液滴の量と液滴の径との相関を調査した。
共重合体が固定されたガラス板表面上へラット皮下脂肪由来の間葉系幹細胞浮遊液（細胞密度：３．０×１０^５個／ｍＬ、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６））をピペッターで０．５μＬ〜５０μＬの液滴として滴下し、底面の投影像から液滴の直径を測定した。液滴の量と液滴の径とは、図３（Ａ）の通り、０．５μＬ〜５０μＬの液滴容量の全範囲では一次相関とはならなかった。
一方，図３（Ｂ）、（Ｃ）の通り、０．５μＬ〜５．０μＬの範囲および５．０μＬ〜５０μＬの範囲へ分離すると、それぞれの領域で線形相関が確認され、液滴容量で液滴の直径が制御できることが示唆された。
図３（Ａ）〜（Ｃ）に、実施例において培養面における液滴の量と液滴の径との相関を調査した結果を示す。

（試験Ｂ１−２）＜ポリマーを培養面の複数箇所に被覆した場合＞
Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅを４％酢酸水溶液へ溶解し、終濃度が２．０％となるように調整した。このシランカップリング剤の溶液を松浪硝子製の精密ガラス板上へ，０．５μＬずつ、液滴の中心部から起算して１．２ｍｍ〜１２ｍｍの間隔を空けて４列×５行の２０滴を滴下し、塩化カリウムの飽和溶液で８４％に加湿した２５℃のデシケーター中で７２時間静置した。液滴をキャピラリーで吸引し、水およびメタノールで洗浄後して乾燥し、細胞培養器（２）を得た。
試験Ｂ１−１の場合と同様に、グラフト重合を行なった。ＩＲの分析によりシランカップリン剤Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ溶液を滴下した液滴（ドット）上にのみ共重合体が固定されていることが確認された。

（試験Ｂ２）細胞構造体の製造
実施例Ｂ２では、グラフト重合により調製した培養面を用いて、細胞構造体の製造を行った。

（試験Ｂ２−１）
試験Ｂ１−１で製造した共重合体が固定されたガラス板表面上へラット皮下脂肪由来の間葉系幹細胞浮遊液（細胞密度：３．０×１０^５個／ｍＬ、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６））をピペッターで０．５μＬ〜２．０μＬの範囲で４列×５行の２０滴の液滴として滴下し、細胞培養インキュベーター（三洋電機，ＭＣＯ−５Ｃ）で２４時間培養した（３７℃、５％炭酸ガス）。
個々の液滴中で細胞は単層を形成してガラス表面上へ接着し、細胞の上へ細胞が積載される状態はほとんど確認されなかった。液滴の滴下から１時間後には全数の細胞がガラス板上に接着して伸展していた。さらに培養を継続すると約９時間後から液滴の外周から中心に向かって凝集が始まり、２１時間後には全細胞が一箇所へ集合して塊となって中心部でスフェロイドを形成した。
ガラス板を０．３％メチルセルロースのＰＢＳ溶液へ浸漬すると、すべてのスフェロイドをスフェロイド浮遊液として回収可能であった。
液滴と液滴の間の距離が３０μｍ以下となると液滴同士が引力や空気相に対する表面張力の関係からか、お互いに融合し、結果、ガラス板の全面に浮遊液が流延した状態となり、細胞凝集の現象は随所で同時に起こる結果となった。

本発明によれば、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することができる。

Claims (8)

1. 培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行い、
   ここで、前記被覆領域の表面ゼータ電位を０〜５０ｍＶとする
   ことを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
2. 前記被覆領域に対する水の接触角を５０〜９０°とする、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
3. 前記培養面に複数の前記被覆領域を調製する、請求項１又は２に記載の細胞構造体の製造方法。
4. 前記被覆領域に複数の前記液滴を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
5. 各前記被覆領域において、前記液滴の底面積を前記被覆領域の面積よりも小さくする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
6. 前記液滴に含まれる細胞の数を３．０×１０^５個／ｍＬ以下とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
7. 前記液滴の径を１μｍ〜８ｍｍとする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
8. 前記液滴の量を０．５〜５０μＬとする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。

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