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JP2018021081A - 新規のグルカゴン類似体 - Google Patents

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Abstract

【課題】１つには、治療法における前記ペプチドの使用と、患者に前記ペプチドを投与することを含む治療方法と、糖尿病、肥満ならびに関連疾患および状態を治療する際に使用するための医薬品を製造する際の前記ペプチドの使用とを提供すること。【解決手段】本発明は、新規なグルカゴンペプチド、療法における前記グルカゴンペプチドの使用、それを必要とする患者に前記グルカゴンペプチドを投与することを含む治療法および医薬品を製造する際の前記グルカゴンペプチドの使用に関する。本発明のグルカゴンペプチドは、高血糖、糖尿病および肥満、さらに高血糖、糖尿病および肥満に関連する様々な疾患または状態の治療に関して特に重要である。【選択図】なし

Description

本発明は、新規なグルカゴンペプチド類似体、療法における前記ペプチドの使用、患者に前記ペプチドを投与することを含む治療方法ならびに医薬品の製造における前記ペプチドの使用に関する。
血糖値の正確な管理は、ヒトはもちろん他の哺乳動物にとっても非常に重要である。2種のホルモン、即ちインスリンおよびグルカゴンが正しい血糖値を維持するために重要であることが十分に確立されている。インスリンが肝臓および末梢組織において、グルコースの末梢取り込みの増大および肝臓からのグルコース放出の低下を介して血糖値を下げることによって作用する一方で、グルカゴンは、主に膵臓および肝臓で、グルコース新生およびグリコーゲン分解のアップレギュレーションを介して血糖値を上げることによって作用する。グルカゴンはまた、脂肪分解を増大させ、ケトーシスを誘発し、血漿中の血漿トリグリセリド値を低下させることが報告されている[SchadeおよびEaton、Acta Diabetologica、1977、14、62頁]。
グルカゴンは、低血糖に対する防御機構の重要な部分であり、低用量のグルカゴンの投与によって、インスリン誘発低血糖を予防することができるか、または低血糖からの回復能力を改善することができる。グルカゴンアゴニズムはまた、脂質代謝、エネルギー消費および食物摂取において作用を発揮することが示されている[Habeggerら、Nature Reviews Endocrinology 2010、6、689〜697頁]。
糖尿病、特に2型糖尿病に罹患している人のうちの多数は、過体重または肥満である。肥満は、重症で、致死的でさえある一般病における高危険因子であり、多くの糖尿病患者にとって、その治療が体重増加をもたらさないことが極めて望ましい。
例えば特許WO2008/086086、WO2008/101017、WO2007/056362、WO2008/152403およびW096/29342など、種々のグルカゴンをベースとする類似体およびGLP-1/グルカゴン受容体共アゴニスト(co-agonists)を開示しているいくつかの特許出願が当分野で公知である。開示されている他のグルカゴン類似体は、ペグ化されているか(例えばWO2007/056362)、または天然ヒトグルカゴンの特異的な位置でアシル化されている(例えばW096/29342)。低血糖を予防するためのグルカゴンペプチドは、例えば特許出願の米国特許第7314859号に開示されている。
約5分の半減期で循環から迅速に排除されることによって、医薬品におけるグルカゴンの潜在的使用可能性は限られる。治療薬の高い血中濃度を長期間にわたって維持することが望ましい場合に、繰り返し投与が必要となるため、治療薬の高いクリアランスは不都合である。場合によっては、適切な医薬組成物を適用することによって、ペプチドの放出プロファイルに影響を及ぼすことが可能であるが、この手法は様々な欠点を有し、一般には適用不可能である。
グルカゴンは現在、内因性グルカゴンレベルよりもかなり高いレベルにピークを有するグルカゴンレベルにもかかわらず、1時間未満に限られる短い作用持続時間を有する凍結乾燥製剤として利用可能である。したがって、より長い生物学的半減期が達成されるような連続的なレベルで送達されるためには、化学的に修飾されたグルカゴン化合物、すなわち、遷延性作用プロファイルを有する修飾グルカゴンペプチドが必要とされている。
水溶液中に溶けている場合、グルカゴンの物理的安定性、さらには化学的安定性は不十分である。グルカゴンの溶液は、ペプチドの純度、塩濃度、pHおよび温度に応じて、数時間または数日のうちにゲルおよび原線維を形成する(Beavenら、European J. Biochem. 1969、11、37〜42頁)。グルカゴンは、脱アミド、開裂、アスパルチミド形成および異性化をもたらし得るいくつかの不安定なアミノ酸またはアミノ酸配列を含有する。加えて、ヒトグルカゴンの溶解性は、3.5〜9.5のpH範囲において非常に不十分である。
WO2008/086086 WO2008/101017 WO2007/056362 WO2008/152403 W096/29342 米国特許第7314859号 WO 98/08871 米国特許第5424286号 WO 2007/009894
SchadeおよびEaton、Acta Diabetologica、1977、14、62頁 Habeggerら、Nature Reviews Endocrinology 2010、6、689〜697頁 Beavenら、European J. Biochem. 1969、11、37〜42頁 J. Pharm. Sci.(1977) 66、2頁 Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年 Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177、244〜249頁 LeVine(1999) Methods. Enzymol. 309、274〜284頁 Nielsenら(2001) Biochemistry 40、6036〜6046頁 Johan GabrielssonおよびDaniel Weiner: Pharmacokinetics and Pharmacodynamic Data Analysis. Concepts & Applications、第3版、Swedish Pharmaceutical Press、Stockholm (2000) Rowland, MおよびTozer TN: Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications、第3版、1995年、Williams Wilkins
本発明は、療法における前記ペプチドの使用と、患者に前記ペプチドを投与することを含む治療方法と、糖尿病、肥満ならびに関連疾患および状態を治療する際に使用するための医薬品を製造する際の前記ペプチドの使用とに関する。
本発明者らは意外にも、グルカゴンペプチドのアミノ酸位置3、15および/または16における1つまたは複数の置換と、3個以上の負に荷電している部分を含み、前記負に荷電している部分のうちの1個は親油性部分の遠位にある置換基の、前記グルカゴンペプチドの位置24での結合とが、改善された安定性を有するグルカゴンアゴニストをもたらすことを発見した。
本発明は、中性pHで改善された溶解性、ゲルおよび原線維形成に対して改善された物理的安定性、改善された化学的安定性を有し、改善された薬物動態特性も有しながら長い半減期を有する新規な修飾グルカゴンペプチドを提供する。
第1の実施形態(実施形態1)において、本発明は、
X24がLysを表し、以下の置換:X3がHisである置換か、X15がGluである置換か、またはX16がAla、Ile、Phe、Arg、Thr、Val、Leu、Glu、TrpまたはTyrである置換のうちの少なくとも1つおよび前記グルカゴンペプチド中に6つまでの追加のアミノ酸置換が存在する配列番号1ならびに
親油性部分および3個以上の負に荷電している部分を含む置換基であって、前記負に荷電している部分のうちの1個は、前記親油性部分の遠位にあり、その置換基が、位置24のLysの側鎖窒素に結合している置換基を含む、
グルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、酸もしくはプロドラッグに関する。
別の実施形態では、本発明は、グルカゴンペプチドのエステル形態も提供する。
本発明はさらに、療法における本発明の化合物の使用、本発明の化合物を含む医薬組成物および医薬品の製造における本発明の化合物の使用に関する。
DIOラットにおける体重に対するグルカゴン類似体の作用を示すグラフである。DIOラットに、グルカゴン類似体1日皮下用量(4nmol/kg)を3週間投与し、体重を毎日測定した。4種のグルカゴン類似体は全て、体重を経時的に低下させた。
本発明のペプチドは、遷延性作用プロファイルを有する新規な修飾グルカゴンペプチドを提供することに加えて、生理学的pHで安定な医薬組成物中におけるそのような修飾グルカゴンペプチドを提供する。本発明は、改善された溶解性、ゲルおよび原線維形成に対して改善された物理的安定性、改善された化学的安定性を有し、長い半減期を有する新規なグルカゴン類似体に関する。
本発明者らは意外にも、本発明の化合物がゲルおよび原線維形成に対して改善された物理的安定性、改善された化学的安定性および長い半減期を有しながら、他にも、中性pHまたはやや塩基性のpHで改善された水溶性を有することを発見した。
一実施形態では、本発明は、X16がIle、Phe、Arg、Val、Leu、Glu、TrpまたはTyrであるグルカゴンペプチドに関する。
特にさらなる本発明の実施形態は下記である:
2. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に0、1、2、3、4、5または6個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
3. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に0個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
4. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に1個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
5. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に2個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
6. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に3個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
7. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に4個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
8. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に5個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
9. 前記グルカゴンペプチドが、前記グルカゴンペプチド中に6個の追加のアミノ酸残基置換を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
10. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下のアミノ酸位置:X9、X10、X12、X17、X20、X21、X27、X28、X29および/またはX30にあってよい、実施形態1〜2および4〜9のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
11. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下のアミノ酸位置:X10、X12、X17、X20、X21、X27、X28および/またはX29にあってよい、実施形態10によるグルカゴンペプチド。
12. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下のアミノ酸位置: X12、X17、X20、X21、X27、および/またはX28にあってよい、実施形態11によるグルカゴンペプチド。
13. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドのX10、X12、X27および/またはX28位にあってよい、実施形態12によるグルカゴンペプチド。
14. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドのX12、X27および/またはX28位にあってよい、実施形態13によるグルカゴンペプチド。
15. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドのX10、X12、X27および/またはX29位にあってよい、実施形態11によるグルカゴンペプチド。
16. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドのX12、X27および/またはX29位にあってよい、実施形態15によるグルカゴンペプチド。
17. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下の位置から選択され得る、実施形態10〜16のいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
X9がGluを表し;
X10がValを表し;
X12がArgを表し;
X17がLysを表し;
X20がLysを表し;
X21がGluを表し;
X27がMet(O)、Val、Leu、Ile、AlaまたはGluを表し;
X28がSer、Thr、Ala、Gln、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、His、Asp、GlyまたはGluを表し;
X29がSer、Gln、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Arg、Lys、His、AspまたはGluを表し;
X30が存在しないか、またはProを表す。
18. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下の位置:X12がArgである置換、X17がLysである置換、X20がLysである置換、X21がGluである置換、X27がLeuである置換、X28がSer、IleまたはThrである置換、から選択され得る、実施形態17によるグルカゴンペプチド。
19. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下の位置:X10がValである置換、X21がGluである置換、X27がLeuである置換、X28がSerである置換、から選択され得る、実施形態17によるグルカゴンペプチド。
20. X9がGluを表す、実施形態17によるグルカゴンペプチド。
21. X10がValを表す、実施形態19によるグルカゴンペプチド。
22. X12がArgを表す、実施形態18によるグルカゴンペプチド。
23. X16がAlaを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
24. X16がIleを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
25. X16がPheを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
26. X16がArgを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
27. X16がThrを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
28. X16がValを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
29. X16がLeuを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
30. X16がGluを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
31. X16がTrpを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
32. X16がTyrを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
33. X17がLysを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
34. X20がLysを表す、実施形態33によるグルカゴンペプチド。
35. X21がGluを表す、実施形態34によるグルカゴンペプチド。
36. X27がMet(O)、Met(O2)、Val、Leu、Ile、AlaまたはGluを表す、実施形態35によるグルカゴンペプチド。
37. X27がLeuまたはGluを表す、実施形態36によるグルカゴンペプチド。
38. X27がLeuを表す、実施形態36によるグルカゴンペプチド。
39. X27がGluを表す、実施形態36によるグルカゴンペプチド。
40. X28がSer、Thr、Ala、Gln、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、His、Asp、GlyまたはGluを表す、実施形態33〜39のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
41. X28がSer、Thr、GlyまたはIleを表す、実施形態40によるグルカゴンペプチド。
42. X28がSer、ThrまたはIleを表す、実施形態40によるグルカゴンペプチド。
43. X28がSerを表す、実施形態40によるグルカゴンペプチド。
44. X28がThrを表す、実施形態40によるグルカゴンペプチド。
45. X28がGlyを表す、実施形態40によるグルカゴンペプチド。
46. X28がIleを表す、実施形態40によるグルカゴンペプチド。
47. X29がSer、Gln、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Arg、Lys、His、AspまたはGluを表す、実施形態40から46のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
48. X29がVal、LeuまたはIleを表す、実施形態47によるグルカゴンペプチド。
49. X29がValを表す、実施形態47から48のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
50. X29がLeuを表す、実施形態47から48のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
51. X29がIleを表す、実施形態47から48のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
52. X30が存在しないか、Proを表す、実施形態47〜51のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
53. X30が存在しない、実施形態52によるグルカゴンペプチド。
54. 前記置換基が式IIを有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]
[式中、
Z1は、式IIaまたはIIbの1つによる構造を表し;
(ここで、式IIa中のnは6〜20であり、
式IIaおよびIIb中の記号*は、Z2中の窒素への結合点を表し;Z2が存在しない場合、Z1は記号*でZ3上の窒素に結合し;Z2およびZ3が存在しない場合、Z1は記号*でZ4上の窒素に結合している)
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表す;
(ここで、各アミノ酸部分は立体化学LまたはDを独立に有し、
Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ3の窒素に接続しており;Z3が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ4の窒素に接続しており、Z3およびZ4が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、グルカゴンペプチドの位置24のLysのイプシロン窒素に接続している);
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
Z3は、記号*を有するZ3の炭素を介して、記号*を有するZ4の窒素に接続しており、Z4が存在しない場合、Z3は、記号*を有する炭素を介して、グルカゴンペプチドの位置24のLysのイプシロン窒素に接続しており;
Z4は存在しないか、または各アミノ酸部分が独立にLまたはDのいずれかであり、Z4が記号*を有する炭素を介して、グルカゴンペプチドの位置24のLysのイプシロン窒素に接続している式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjまたはIIkのいずれか1つによる構造を表すが;
但し、Z2もしくはZ4のいずれか、またはZ2およびZ4の両方が、前記置換基中に存在することを条件とする]。
55. 前記置換基が式IIを有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
Z1-Z2-Z3-Z4- [II]
[式中、
Z1は、式IIaまたはIIbのいずれか1つによる構造を表し;
(ここで、式IIa中のnは6〜20である)
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;
(ここで、各アミノ酸部分は独立に立体化学LまたはDを有する)
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoもしくはIIpの1つによる構造を表し;
Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表す;
(ここで、各アミノ酸部分は独立に立体化学LまたはDを有する)]。
56. 式IId〜IIkの構造が立体化学Lを有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
57. 式IId〜IIkの構造が立体化学Dを有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
58. Z4が存在する場合に、式IIの前記置換基のZ2が存在しない、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
59. Z2が存在する場合に、式IIの前記置換基のZ4が存在しない、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
60. 前記置換基が式IIIa、IIIb、IIIc、IIId、IIIe、IIIf、IIIg、IIIh、IIIi、IIIj、IIIk、IIIl、IIIm、IIIn、IIIo、IIIp、IIIq、IIIr、IIIs、IIIt、IIIu、IIIv、IIIw、IIIxまたはIIIyのいずれか1つによる構造を表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
61. 前記置換基が式IIIa、IIIb、IIIi、IIIn、IIIp、IIIr、IIIs、IIIt、IIIu、IIIv、IIIw、IIIxまたはIIIyのいずれか1つによる構造を表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
62. 前記置換基が式IIIa、IIIpまたはIIItのいずれか1つによる構造を表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
63. 前記置換基のZ4が存在しない、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
64. 前記置換基のZ3およびZ4が存在しない、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
65. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、γGlu、Gluおよび/またはAspなどの負に荷電している部分によって表される、実施形態1から62のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
66. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、10個までの前記負に荷電している部分によって表される、実施形態65によるグルカゴンペプチド。
67. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、3個の前記負に荷電している部分によって表される、実施形態66によるグルカゴンペプチド。
68. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、4個の前記負に荷電している部分によって表される、実施形態66によるグルカゴンペプチド。
69. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、5個の前記負に荷電している部分によって表される、実施形態66によるグルカゴンペプチド。
70. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、Gluおよび/またはγGlu部分によって表される、実施形態1〜62および65〜69のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
71. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、γGlu、γGlu-Glu、γGlu-Glu-Glu、γGlu-Glu-Glu-Glu、γGlu-Glu-Glu-Glu-Gluによって表される、実施形態70によるグルカゴンペプチド。
72. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、Gluおよび/またはAsp部分によって表される、実施形態1〜62および65〜69のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
73. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、γGluおよび/またはAsp部分によって表される、実施形態72によるグルカゴンペプチド。
74. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、Asp部分によって表される、実施形態72〜73のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
75. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、Asp、Asp-Asp、Asp-Asp-AspまたはAsp-Asp-Asp-Aspによって表される、実施形態74によるグルカゴンペプチド。
76. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、Glu部分によって表される、実施形態70または72のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
77. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、Glu、Glu-Glu、Glu-Glu-Glu、Glu-Glu-Glu-Glu、Glu-Glu-Glu-Glu-Gluによって表される、実施形態76によるグルカゴンペプチド。
78. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、γGlu部分によって表される、実施形態70または73のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
79. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、γGlu、γGlu-γGlu、γGlu-γGlu-γGlu、γGlu-γGlu-γGlu-γGlu、γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-γGluによって表される、実施形態78によるグルカゴンペプチド。
80. 前記置換基が直鎖アルキル基または分枝アルキル基を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
81. Z1が式IIaによる構造を表し、式IIa中のnが12から18である、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
82. Z1が19-カルボキシノナデカノイル、17-カルボキシヘプタデカノイル、15-カルボキシペンタデカノイル、13-カルボキシトリデカノイルまたは4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
83. Z1が19-カルボキシノナデカノイル、17-カルボキシヘプタデカノイル、15-カルボキシペンタデカノイルまたは13-カルボキシトリデカノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
84. Z1が4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
85. Z1が19-カルボキシノナデカノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
86. Z1が17-カルボキシヘプタデカノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
87. Z1が15-カルボキシペンタデカノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
88. Z1が13-カルボキシトリデカノイルを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
89. 前記置換基がアルブミンに非共有結合している、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
90. 前記置換基が、生理学的pHで負に荷電している、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
発明者らは、本発明の化合物が中性pHまたはやや塩基性のpHで改善された水溶性を有することを意外にも発見した。さらに、本発明者らはまた、本発明のグルカゴン類似体が、水溶液中でのゲルおよび原線維の形成に対して改善された安定性を有することを意外にも発見した。本発明のグルカゴン類似体はまた意外にも、改善された化学的安定性を有する、すなわち類似体の化学的分解が低減されている。発明者らは、本発明の化合物が改善された薬物動態特性を有する、すなわち、in vivoで長時間の半減期を有することを発見した。さらに、本発明の化合物は、皮下投与で体重の有意な減少を示す。
種々のpH値の溶解性は、アッセイIXに記載されているとおりに測定することができる。
本発明の化合物の物理的安定性は、アッセイIIに記載されているとおりの方法によって測定することができる。
類似体の化学的安定性は、アッセイXに記載されているとおりに測定することができる。
半減期は、ラット(アッセイVIII)またはブタ(アッセイXI)などの種での薬物動態研究において決定することができる。体重の減少は、アッセイXIIにおいて記載されているとおりにDIOマウスで測定することができる。
本発明の化合物の遷延性作用は、本発明の化合物が生物学的活性を発揮する期間が長時間にわたることを意味する。
グルカゴンをインスリン、GLP-1アゴニストおよびGIPアゴニストなどの公知の抗糖尿病薬と共に同時投与することによって、1型および2型糖尿病において血糖値をより良好に制御することができる。
一実施形態では、本発明のグルカゴン類似体をGLP-1類似体またはインスリン類似体と一緒に製剤化して、安定な医薬組成物を形成することができる。
インスリンおよびグルカゴン療法の組合せは、インスリンのみの療法と比較して有利であり得る。通常、血糖値が低くなる食後の状況では、初めのホルモン応答はインスリン産生の低下である。血糖が低下するとさらに、第2のライン応答はグルカゴンの生成であり、肝臓からのグルコース放出の増大が生じる。糖尿病患者が多すぎるインスリン外来用量を受けると、上昇したグルカゴンの天然応答は、外来インスリンの存在によって妨げられる。それというのも、インスリンは、グルカゴン産生に対して阻害作用を有するためである。その結果、インスリンの僅かな過量も低血糖の原因となり得る。現在、多くの糖尿病患者が、生命を脅かすこともある低血糖事象をおそれて最適よりも僅かに少ないインスリンを使用することを好む傾向がある。
本発明の化合物が中性pHで溶解性であり、したがってインスリンとの同時製剤(co-formulation)が可能となり、より安定な血糖値および低血糖事象の回数の低減、さらに、糖尿病関連合併症のリスクの低下が可能となり得る。
さらなる本発明の実施形態は、以下の実施形態である:
91. 前記グルカゴンペプチドが1個のアミノ酸残基からなるC末端伸長を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
92. グルカゴンペプチドがC末端アミドまたはC末端カルボン酸である、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
93. 前記グルカゴンペプチドがC末端アミドである、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
94. 前記グルカゴンペプチドがC末端カルボン酸である、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
95. グルカゴン(1〜29)、グルカゴン(1〜29)-アミドまたはそれらの類似体から選択される、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
96. 化学式1;化学式2;化学式3;化学式4;化学式5;化学式6;化学式7;化学式8;化学式9;化学式10;化学式11;化学式12;化学式13;化学式14;化学式15;化学式16;化学式17;化学式18;化学式19;化学式20;化学式21;化学式22;化学式23;化学式24;化学式25;化学式26;化学式27;化学式28;化学式29;化学式30;化学式31;化学式32;化学式33;化学式34;化学式35;化学式36;化学式37;化学式38;化学式39;化学式40;化学式41;化学式42;化学式43;化学式44;化学式45;化学式46;化学式47;化学式48;化学式49;化学式50;化学式51;化学式52;化学式53;化学式54;化学式55;化学式56;化学式57;化学式58;化学式59;化学式60;化学式61;化学式62;化学式63;化学式64;化学式65;化学式66;化学式67;化学式68;化学式69;化学式70;化学式71;化学式72;化学式73;化学式74;化学式75;化学式76;化学式77;化学式78;化学式79;化学式80;化学式81;化学式82;化学式83;化学式84;化学式85;化学式86;化学式87;化学式88;化学式89;化学式90; 化学式91;化学式92;化学式93;化学式94;化学式95;化学式96および化学式97からなる群から選択される、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
さらなる本発明の実施形態は、本発明の化合物を抗糖尿病薬または抗肥満薬と共に投与することに関する:
97. グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)化合物と組み合わされた先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
98. インスリン化合物と組み合わされた先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
99. エキセンジン-4と組み合わされた先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
100. デュアルチャンバー(dual chamber)、デポジトリー(depository)および/またはマイクロカプセル封入製剤である、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
101. 糖尿病および/または肥満を治療するための医薬品を調製するための、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)化合物と組み合わされた先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
102. 糖尿病および/または肥満を治療するための医薬品を調製するための、インスリン化合物と組み合わされた先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
103. 糖尿病および/または肥満を治療するための医薬品を調製するための、エキセンジン-4と組み合わされた先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
104. GLP-1化合物およびインスリン化合物が個々に式G1〜G4およびG5によって表される、実施形態97〜103のいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
N-ε26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G1);
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({trans-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G2);
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G3);
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G4)および
NεB29-ヘキサデカンジイオール(hexadecandiyol)-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
(化合物G5)。
105. GLP-1化合物が式G1によって表される、実施形態104によるグルカゴンペプチド:
N-イプシロン26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G1)
106. GLP-1化合物が式G2によって表される、実施形態104によるグルカゴンペプチド:
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({trans-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G2)
107. GLP-1化合物が式G3によって表される、実施形態104によるグルカゴンペプチド:
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8, Arg34,]GLP-1-(7-37):
(化合物G3)
108. GLP-1化合物が式G4によって表される、実施形態104によるグルカゴンペプチド:
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G4)
109. インスリン化合物が式G5によって表される、実施形態104によるグルカゴンペプチド:
NεB29-ヘキサデカンジイオール-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
(化合物G5)。
110. 化学式1〜化学式97からなる群から選択され、群:G1〜G4から選択されるGLP-1化合物と組み合わされている、実施形態97〜104のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
111. 化学式1〜化学式97からなる群から選択され、G5などのインスリン化合物と組み合わされている、実施形態97〜104のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
112. 化学式1〜化学式97からなる群から選択され、エキセンジン-4と組み合わされている、実施形態97〜104のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
GLP-1は、食物を摂取した後に小腸の内分泌細胞によって産生されるインクレチンホルモンである。GLP-1は、グルコース代謝および膵臓のランゲルハンス島のβ細胞からのインスリン分泌の制御因子である。GLP-1はまた、糖尿病状態においてインスリン分泌ももたらす。しかしながら、GLP-1自体のin vivoでの半減期は非常に短いので、in vivoでのGLP-1の半減期を延長する方法に、大いに注目が集まっている。
WO 98/08871は、2型糖尿病を治療するために販売されているNovo Nordisk A/Sによって開発された1日1回投与のためのGLP-1誘導体であるリラグルチドを包含する、長い半減期を有し、ヒトGLP-1(7-37)をベースとする遷延性GLP-1類似体および誘導体を開示している。
エクセナチドは、Amylin PharmaceuticalsおよびEli Lilly & Co.によって製造および販売されている2型糖尿病を治療するための市販のインクレチン模倣物質である。エクセナチドは、アメリカドクトカゲの唾液中に発見されたホルモンであるエキセンジン-4をベースとしている。これは、ヒトGLP-1に類似した生物学的特性を示す。米国特許第5424286号はとりわけ、エキセンジン-4(配列番号3)を投与することによって哺乳動物においてインスリン放出を刺激する方法に関する。
用語「GLP-1化合物」は本明細書で使用される場合、ヒトGLP-1(7-37)、エキセンジン-4、さらにはGLP-1活性を維持しているその類似体、融合ペプチド、および誘導体を指す。
GLP-1化合物中の位置ナンバリングに関して:本目的では、何らかのアミノ酸置換、欠失および/または付加は、GLP-1(7-37)(配列番号2)および/またはエキセンジン-4の配列に対して示されている。しかしながら、配列リスト中のアミノ酸残基のナンバリングが常に、1番から始まっているのに対して、本目的では、本発明者らは、当技術分野で確立された実施に従って、アミノ酸残基番号7から始めることを望み、GLP-1(7-37)の場合に、番号7をそれに割り当てている。したがって一般に、GLP-1(7-37)配列の位置番号に対する本明細書における言及はいずれも、位置7のHisから始まり、位置37のGlyで終わる配列に対する言及である。
GLP-1化合物は、当技術分野で公知のとおりに調製することができる。
当技術分野で公知の任意の方法、例えば、本明細書に記載のアッセイ(II)(ヒトGLP-1受容体を発現する細胞系でのcAMP形成の刺激)を使用して、GLP-1活性を決定することができる。
さらに、GLP-1化合物は:
i) デスアミノHis7、Aib8、Aib22、Arg26、Aib35、および/またはLys37のうちの少なくとも1個を含んでいてよく;
ii) 少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、より好ましくは2個の遊離カルボン酸基を含むアルブミン結合部分を含むGLP-1誘導体;または薬学的に許容されるその塩であってよく;
iii) 好ましくはC12、C14、C16、C18、C20、C22またはC24、最も好ましくはC16、C18またはC20などの合計12〜24個の炭素原子を含むジカルボン酸のアシルラジカルを含むアルブミン結合部分を含むGLP-1誘導体であってよく;ここで好ましくは、a)アシルラジカルは、GLP-1ペプチドのリシン残基のイプシロンアミノ基に、リンカーを介して結合しており;b)リンカーは、少なくとも1個のOEGラジカルおよび/または少なくとも1個の4-アミノメチル-シクロヘキサンカルボン酸ラジカルおよび場合によって加えて、少なくとも1個のGluを含み;および/または
iv) 化合物N-イプシロン26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G1);
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({trans-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G2);
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G3);
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G4);
およびそれらの薬学的に許容される塩、アミド、アルキルまたはエステルからなる群から選択され得る化合物である。
本発明による「インスリン」は本明細書において、ヒトインスリン、インスリン類似体またはインスリン誘導体と理解されるべきである。
インスリン化合物は例えば:
NεB29-ヘキサデカンジイオール-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
(化合物G5)
によって表され得る化合物である。
本発明の化合物および本明細書において定義されているとおりの抗肥満薬または抗糖尿病薬は、同時に、または連続して投与することができる。要素を、両方の化合物を含有する単一剤形で、または第1の単位剤形として本発明の化合物の製剤と、第2の単位剤形として抗肥満薬もしくは抗糖尿病薬の製剤とを含むパーツキットの形態で供給することができる。本明細書を通じて第1または第2または第3などの単位用量が述べられている場合にはいつでも、これは、好ましい投与順序を示しているのではなく、むしろ、単に便宜的な目的のために示されている。
本発明の化合物の薬剤および抗肥満薬または抗糖尿病薬の薬剤の「同時」投与とは、単一剤形での化合物の投与または第1薬の投与、その後15分、好ましくは10分、より好ましくは5分、より好ましくは2分以下の時間を空けての第2薬の投与を意味する。いずれの要素が初めに投与されてもよい。
「連続」投与とは、第1薬の投与に、15分超の時間を空けて第2薬の投与を続けることを意味する。2種の単位剤形のうちのいずれを最初に投与してもよい。好ましくは、両方の製品を同じ静脈内アクセスを介して注射する。
既に示されているとおり、上記で開示されている治療方法または適応症の全てにおいて、本発明の化合物を単独で投与することができる。しかしながら、1種または複数の追加の治療活性な薬剤、物質または化合物と組み合わせて順次か、または一緒に投与することもできる。
本発明による方法で使用する場合、本発明の化合物の典型的な投薬量は、1回から3回用量などの1回または複数回用量で投与される1日当たり約0.0001から約100mg/体重kg、好ましくは約0.001から約10mg/体重kg、より好ましくは1日当たり約0.001から約5mg/体重kg、例えば1日当たり約0.001から約10mg/体重kgまたは1日当たり約0.001から約5mg/体重kgの範囲である。正確な投薬量は、投与頻度および投与方法、治療される対象の性別、年齢、体重および全身状態、治療される状態の性質および重症度、治療される任意の随伴疾患ならびに当業者には明らかな他の因子に左右される。
本発明の化合物は、例えば週に1回よりも長い間隔での投与によく適していると考えられる化合物を含み、したがって、適切に製剤化された本発明の化合物は、本明細書に開示されている経路の1つなど、適切な投与経路によって、週に2回または週に1回の投与に適していることがある。
上記のとおり、本発明の化合物は、1種または複数の追加の治療活性化合物または物質と組み合わせて投与または施与することができ、適切な追加の化合物または物質は、例えば抗糖尿病薬、抗高脂血症薬、抗肥満薬、抗高血圧症薬および糖尿病から生じているか、またはそれに随伴する合併症を治療するための薬から選択することができる。
適切な抗糖尿病薬には、インスリン、インスリン誘導体もしくは類似体、GLP-1(グルカゴン様ペプチド-1)誘導体もしくは類似体またはリラグルチド(Victoza、Novo Nordisk A/S)、エクセナチド(Byetta、Eli Lilly/Amylin)、タスポグルチド(Roche)、アルビグルチド(Syncria、GlaxoSmithKline)などの他のGLP-1類似体、アミリン、アミリン類似体(例えばSymlin(商標)/プラムリンチド)、さらに経口活性血糖降下薬などの他のGLP-1類似体が包含される。
本発明の化合物は、当分野で既に開示されているペプチドよりも高いグルカゴン受容体選択性を有する。本発明のペプチドはまた、長期のin vivo半減期を有する。本発明の化合物は、例えば少なくとも0.1mmol/l、0.2mmol/l、少なくとも0.5mmol/l、少なくとも2mmol/l、少なくとも4mmol/l、少なくとも8mmol/l、少なくとも10mmol/lまたは少なくとも15mmol/lの溶解性を有する溶解性グルカゴン受容体アゴニストであり得る。
本内容では、別段に述べられていなければ、「溶解性の」、「溶解性」、「水溶液に溶解性の」、「水性溶解性」、「水溶性」、「水-溶性」、「水溶解性」および「水-溶解性」という用語は、水への、または水性塩もしくは水性緩衝液、例えば10mMのリン酸塩溶液への、または他の化合物を含有するが、有機溶媒は含有しない水溶液への化合物の溶解性を指す。
「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって接続されている少なくとも5個の構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸の群からであってよく、それらは、遺伝コードによってコードされない天然アミノ酸、さらに合成アミノ酸であってよい。遺伝コードによってコードされない天然アミノ酸は例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成によって製造されるアミノ酸、即ちD-アラニンおよびD-ロイシンなどの遺伝コードによってコードされるアミノ酸のD-異性体、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Tie(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
「類似体」という用語は、ポリペプチドに関連して本明細書で使用される場合、ペプチドの1個または複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、および/または1個または複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失しており、および/または1個または複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失しており、および/または1個または複数のアミノ酸残基がペプチドに加えられている修飾されたペプチドを意味する。アミノ酸残基のそのような付加または欠失は、ペプチドのN末端および/またはペプチドのC末端で行っていてよい。簡単な系を使用して、類似体を記載する。ペプチド類似体およびその誘導体の式は、標準の単一文字またはlUPAC-IUB命名法に従って使用されるアミノ酸のための3文字略語を使用して描写される。
「誘導体」という用語は、ペプチドに関連して本明細書で使用される場合、少なくとも1個の置換基が非修飾ペプチドまたはその類似体には存在しない化学的に修飾されたペプチドまたはその類似体、即ち共有で修飾されたペプチドを意味する。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルなどである。
光学異性体が述べられていない全てのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解されたい。
「グルカゴンペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、グルカゴンペプチド、グルカゴン化合物、本発明による化合物、本発明の化合物、式Iの化合物、グルカゴン類似体、グルカゴン誘導体またはグルカゴン類似体ヒトグルカゴンの誘導体、ヒトグルカゴン(1-29)、グルカゴン(1-30)、グルカゴン(1-31)、グルカゴン(1-32)、さらにグルカゴン活性を維持しているそれらの類似体、融合ペプチドおよび誘導体を意味する。
グルカゴン化合物中の位置ナンバリングに関して:本目的では、何らかのアミノ酸置換、欠失および/または付加は、天然ヒトグルカゴン(1-29)(配列番号1)の配列に対して示されている。ヒトグルカゴンアミノ酸位置1-29は本明細書において、アミノ酸位置X1からX29と同じであることとする。ヒトグルカゴン(1-29)配列は、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(配列番号1)である。
グルカゴン(1-30)は、C-末端に1個のアミノ酸の伸長を伴うヒトグルカゴンを意味し、グルカゴン(1-31)は、C-末端に2個のアミノ酸の伸長を伴うヒトグルカゴンを意味し、グルカゴン(1-32)は、C-末端に3個のアミノ酸の伸長を伴うヒトグルカゴンを意味する。
「遠位」という用語は、本明細書で使用される場合、結合点から最も離れている(末端にある)ことを意味する。
「負に荷電している部分」という用語は、本明細書で使用される場合、これらに限られないが、カルボン酸、スルホン酸またはテトラゾール部分などの負に荷電している化学部分を意味する。
「親油性部分」という用語は、本明細書で使用される場合、6個超から30個未満の炭素原子を有する脂肪族または環式炭化水素部分を意味し、その際、前記炭化水素部分は、追加の置換基を含有してよい。
「置換基」という用語は、本明細書で使用される場合、水素から置き換わった化学部分または基を意味する。
「1H-テトラゾール-5-イル」という用語は、本明細書で化学名の一部として使用される場合、1H-テトラゾール-5-イルおよび2H-テトラゾール-5-イルの両方を示すことが意図されている。
さらなる本発明の実施形態は、以下に関する:
113. 前記グルカゴンペプチドがDPPIV保護されている化合物である、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
114. 前記グルカゴンペプチドがDPPIV安定化されている、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
115. 前記グルカゴンペプチドがグルカゴン受容体のアゴニストである、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
116. 前記グルカゴンペプチドがEC50<1nMを有するグルカゴン受容体のアゴニストである、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
「DPP-IV保護」という用語は、ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、前記化合物を血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ-4(DPP-IV)に対して耐性にするために化学的に修飾されているポリペプチドを意味する。血漿中のDPP-IV酵素は、数種のペプチドホルモン、例えばグルカゴン、GLP-1、GLP-2、オキシントモジュリンなどの分解に関与していることが知られている。したがって、DPP-IVによる分解速度を低下させるために、DPP-IV媒介加水分解を受けやすいポリペプチドの類似体および誘導体を開発するかなりの努力が成されている。
さらに、本発明の化合物は、アッセイVIIにおいて記載されているとおりのアルブミン遊離アッセイで、DPP-IV開裂に対して安定化されていてよい。
本内容において、「アゴニスト」という用語は、該当する受容体タイプを活性化させる物質(リガンド)を示すことが意図されている。
本内容において、「アンタゴニスト」という用語は、アゴニストの作用を遮断、中和または防止する物質(リガンド)を示すことが意図されている。
「グルカゴンアゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴン受容体を完全に、または部分的に活性化する任意のグルカゴンペプチドを指す。好ましい実施形態では、「グルカゴンアゴニスト」は、アッセイIによって測定した場合にグルカゴン受容体を好ましくは1μM未満、例えば、100nM未満または1nM未満の効力(EC50)で活性化する任意のグルカゴンペプチドである。
本内容では、「薬学的に許容される塩」という用語は、患者に有害でない塩を示すことが意図されている。そのような塩には、薬学的に許容される酸付加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が包含される。酸付加塩には、無機酸、さらに有機酸の塩が包含される。適切な無機酸の代表的な例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸および硝酸などが包含される。適切な有機酸の代表的な例には、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などが包含される。薬学的に許容される無機または有機酸付加塩のさらなる例には、参照によって本明細書に組み込まれるJ. Pharm. Sci.(1977) 66、2頁に列挙されている薬学的に許容される塩が包含される。該当する金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびマグネシウム塩などが包含される。アルキル化アンモニウム塩の例には、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウムおよびテトラメチルアンモニウムなどが包含される。
本明細書で使用される場合、化合物の「治療的有効量」という用語は、所定の疾患および/またはその合併症の臨床的症状発現を治癒、緩和または部分的に停止させるのに十分な量を指す。このことを達成するために適した量を「治療的有効量」と定義する。各目的での有効量は、疾患または損傷の重症度、さらに、対象の体重および全身状態に左右されるであろう。適切な投薬量の決定は、常套的な実験を使用して、値のマトリックスを構築し、マトリックスの異なるポイントで試験することによって達成することができることは理解されるであろうが、これらは全て、経験を積んだ医師または獣医師の通常の技能レベルの範囲内である。
「治療」、「治療する」という用語およびその他のその変化形は、本明細書で使用される場合、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした患者の管理およびケアを指す。それらの用語は、症状もしくはその合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは除くため、および/または状態を予防するための該当する活性化合物の投与など、患者が罹患している所定の状態について治療の全範囲を包含することが意図されており、ここで予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした患者の管理およびケアであると理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防ぐための該当する活性化合物の投与が包含される。治療される患者は好ましくは、哺乳動物、特定するとヒトであるが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはブタなどの他の動物の治療は本発明の範囲内である。
「アルブミン結合残基」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト血清アルブミンに非共有結合する残基を意味する。治療用ポリペプチドに結合しているアルブミン結合残基は典型的には、ヒト血清アルブミンに対して10μM未満、好ましくは1μM未満の親和性を有する。4〜40個の炭素原子を含有する直鎖および分枝親油性部分のうち、一連のアルブミン結合残基が公知である。
本発明の他の実施形態は、医薬組成物に関する:
117. 実施形態1〜116のいずれか1つによるグルカゴンペプチドを含む医薬組成物。
118. 1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、実施形態117による医薬組成物。
119. GLP-1化合物をさらに含む、実施形態117〜118のいずれか1つによる医薬組成物。
120. GLP-1化合物が:
N-ε26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G1);
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({trans-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G2);
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
(化合物G3);
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
(化合物G4);
およびそれらの薬学的に許容される塩、アミド、アルキルまたはエステルからなる群から選択される、実施形態119による医薬組成物。
121. インスリン化合物をさらに含む、実施形態117〜118のいずれか1つによる医薬組成物。
122. インスリン化合物が:
NεB29-ヘキサデカンジイオール-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
(化合物G5)
である、実施形態121による医薬組成物。
123. 単位剤形中に、実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド約0.01mgから約1000mg、約0.1mgから約500mg、約0.5mgから約5mg、例えば約0.5mgから約200mgなどを含む、実施形態105〜110のいずれか1つによる医薬組成物。
124. 非経口投与に適した、実施形態117〜123のいずれか1つによる医薬組成物。
125. 療法で使用するための、実施形態1〜116のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
さらに本発明の実施形態は、下記に関する:
126. 高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
127. 2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
128. 肥満を治療するための、または過体重を予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
129. 食物摂取量を低下させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
130. エネルギー消費を増大させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
131. 体重を減少させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
132. 耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
133. 2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
134. 食欲を抑制する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
135. 満腹を誘発する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
136. 体重減少の成功後に体重再増加を予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
137. 過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
138. 大食症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
139. 暴食を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
140. アテローム硬化症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
141. 高血圧を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
142. 2型糖尿病を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
143. 耐糖能障害を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
144. 脂質異常症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
145. 冠状動脈性心疾患を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
146. 肝脂肪症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
147. 肝脂肪症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
148. ベータ遮断薬中毒を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
149. X線、CT-およびNMR-走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害で使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
150. 低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
151. インスリン誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
152. 反応性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
153. 糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
154. 非糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
155. 空腹時低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
156. 薬物誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
157. 胃バイパス誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
158. 妊娠時低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
159 アルコール誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
160. インスリノーマを治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
161. フォンギールケ病を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチド。
さらに本発明の実施形態は、下記の方法に関する:
162. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、低血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防する方法。
163. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための方法。
164. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、肥満を治療するための、または過体重を予防するための方法。
165. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、食物摂取量を低下させるための方法。
166. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、エネルギー消費を増大させる際に使用するための方法。
167. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、体重を減少させる際に使用するための方法。
168. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための方法。
169. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための方法。
170. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、食欲を抑制する際に使用するための方法。
171. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、満腹を誘発する際に使用するための方法。
172. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、体重減少の成功後に体重再増加を予防する際に使用するための方法。
173. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療する際に使用するための方法。
174. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、大食症を治療する際に使用するための方法。
175. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、暴食を治療する際に使用するための方法。
176. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、アテローム硬化症を治療する際に使用するための方法。
177. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、高血圧を治療する際に使用するための方法。
178. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、2型糖尿病を治療する際に使用するための方法。
179. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、耐糖能障害を治療する際に使用するための方法。
180. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、脂質異常症を治療する際に使用するための方法。
181. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、冠状動脈性心疾患を治療する際に使用するための方法。
182. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、肝脂肪症を治療する際に使用するための方法。
183. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、ベータ遮断薬中毒を治療する際に使用するための方法。
184. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、X線、CT-およびNMR-走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害で使用するための方法。
185. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
186. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、インスリン誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
187. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、反応性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
188. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
189. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、非糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
190. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、空腹時低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
191. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、薬物誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
192. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、胃バイパス誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
193. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、妊娠時低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
194. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、アルコール誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
195. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、インスリノーマを治療または予防する際に使用するための方法。
196. それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜116のいずれかによるグルカゴンペプチドを、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、フォンギールケ病を治療または予防する際に使用するための方法。
さらに本発明の実施形態は、下記に関する:
197. 医薬品を調製するための、実施形態1〜116のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
198. 高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態1〜116のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
199. 2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための、肥満を治療するための、または過体重を予防するための、食物摂取量を低下させるための、エネルギー消費を増大させるための、体重を減少させるための、耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させるための;2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるための;食欲を抑制するための;満腹を誘発するための;体重減少の成功後に体重再増加を予防するための;過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療するための;大食症を治療するための;暴食を治療するための;アテローム硬化症、高血圧、2型糖尿病、IGT、脂質異常症、冠状動脈性心疾患、肝脂肪症を治療するための、ベータ遮断薬中毒を治療するための、X線、CT-およびNMR走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害のために使用するための医薬品を調製するための、実施形態1〜116のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
200. 低血糖、インスリン誘発性低血糖、反応性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹時低血糖、薬物誘発性低血糖、胃バイパス誘発性低血糖、妊娠時低血糖、アルコール誘発性低血糖、インスリノーマおよびフォンギールケ病を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態1〜116のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
さらに本発明の実施形態は、以下に関する:
201. ThT原線維形成アッセイにおいて70%を超える回収率を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
202. ThT原線維形成アッセイにおいて90%を超える回収率を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
203. ThT原線維形成アッセイにおいて約100%の回収率を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
204. ThT原線維形成アッセイにおいて7時間を超えるラグタイムを有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
205. ThT原線維形成アッセイにおいて20時間を超えるラグタイムを有する、先行する実施形態のうち4のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
206. ThT原線維形成アッセイにおいて45時間以上のラグタイムを有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
207. 化学的安定性アッセイにおいて14%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
208. 化学的安定性アッセイにおいて13%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
209. 化学的安定性アッセイにおいて12%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
210. 化学的安定性アッセイにおいて10%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
211. 化学的安定性アッセイにおいて9%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
212. 化学的安定性アッセイにおいて7%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
213. 化学的安定性アッセイにおいて5%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
214. 化学的安定性アッセイにおいて3%未満の分解を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
215. GLP-1受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して30倍高い選択性を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
216. GLP-1受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して50倍高い選択性を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
217. GLP-1受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して100倍高い選択性を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
218. GLP-1受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して250倍高い選択性を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
219. GLP-1受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して500倍高い選択性を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
220. GLP-1受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して1000倍高い選択性を有する、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
GLP-1受容体とグルカゴン受容体との間の選択性は、2種の受容体でのEC50値またはIC50値の比として測定することができる。アッセイ(I)および(III)を使用して、グルカゴン受容体およびGLP-1受容体での活性を個々に測定することができる。
肥満または過体重の治療または予防に関連した目的で、即ち過剰な脂肪蓄積の減少または予防に関連した目的で、本発明のグルカゴンペプチドを、場合によって上記で開示されたとおりの1種または複数の追加の治療活性化合物または物質と組み合わせて投与する場合、そのような投与を、体重減少を達成するか、または体重増加を予防することを目的とする外科的介入と組み合わせて、例えば肥満学的外科的介入と組み合わせて使用することが適当であることがある。多くの場合に使用される肥満学的外科的技術の例には、これらに限られないが、下記が包含される:胃の一部をステープル処置して、新たな胃として機能するより小さな胃前パウチを作成する垂直バンド固定胃形成(vertical banded gastroplasty)(「胃ステープリング」としても公知);患者がサイズを調節することができる弾性(例えばシリコーン)バンドを使用して、新たな胃として機能する小さな胃前パウチを作成する、例えば調節可能な胃バンドシステム(Swedish Adjustable Gastric Band(SAGB)、LAP-BAND(商標)またはMIDband(商標)など)を使用する胃バンディング;およびステープラーデバイスを使用して小さな胃パウチを作成し、遠位小腸と接続させるが、その際、小腸の上部をY型配置で再付着させる胃バイパス手術、例えば「ルーワイ」バイパス。
本発明のグルカゴンペプチド(場合によって、上記で開示されたとおりの1種または複数の追加の治療活性化合物または物質と組み合わせて)の投与は、該当する肥満学的外科的介入を実施している期間に、および/またはその後の期間に実施することができる。多くの場合に、肥満学的外科的介入が行われた後に、本発明の化合物の投与を開始することが好ましい場合がある。
「肥満」という用語は、過剰な脂肪組織を意味する。エネルギー摂取が、エネルギー消費を超えると、過剰なカロリーが脂肪組織に蓄積され、この正味でプラスの平衡が持続すると、肥満が生じる。即ち、体重のバランスには2つの成分が存在し、いずれかの側(摂取または消費)の異常が肥満をもたらし得る。この内容において、肥満は、健康リスクをもたらすある程度過剰な脂肪組織とみなされるのが最適である。正常な個体と肥満個体との相違は、概算しかできないが、肥満によってもたらされる健康リスクはおそらく、脂肪組織の増加と連続している。しかしながら、本発明の内容では、25を超える肥満指数(BMI=体重(キログラム)を身長(メートル)の二乗で割った値)を有する個体を肥満とみなすこととする。
本内容において使用されるアミノ酸の略語は、次の意味を有する:
D-Ser、D-HisなどのD-から始まって、3文字コードが続くアミノ酸の略語は、対応するアミノ酸のD-鏡像異性体、例えばD-セリン、D-ヒスチジンなどを指す。
医薬組成物
本発明による医薬組成物の投与は、そのような治療を必要とする患者へのいくつかの投与経路、例えば、舌、舌下、頬側、口腔内、経口、胃および小腸内、経鼻、肺、例えば、細気管支および肺胞またはその組合せを介して、表皮、皮膚、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜を介して、尿管、ならびに非経口での投与であってよい。
医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者に、いくつかの部位で、例えば、局所部位、例えば、皮膚および粘膜部位で、吸収をバイパスする部位で、例えば、動脈、静脈、心臓への投与で、および吸収を伴う部位で、例えば、皮膚、皮膚下、筋肉内、または腹部への投与で投与することができる。
医薬製剤は、[0.01]mg/mLから[50]mg/mLの濃度のグルカゴンペプチドを含んでよい。製剤は、緩衝剤系、防腐剤、等張化剤、キレート化剤、安定剤および界面活性剤をさらに含んでよい。本発明の一実施形態では、医薬製剤は、水性製剤、即ち、水を含む製剤である。そのような製剤は典型的には、液剤または懸濁剤である。本発明のさらなる実施形態では、医薬製剤は水性液剤である。「水性製剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む製剤と定義される。同様に、「水性液剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む液剤と定義され、「水性懸濁剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む懸濁剤と定義される。
他の実施形態では、医薬製剤は、事前の溶解を何ら要しないすぐに使用することができる乾燥製剤(例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥)である。
緩衝剤は、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リン酸塩、リン酸水素塩およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン(TRIS)、ビシン、トリシン、コハク酸塩、アスパラギン酸、アスパラギンまたはそれらの混合物からなる群から選択することができる。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、薬学的に許容される防腐剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、フェノール、m-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、クロロクレゾール、塩化ベンゼトニウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される。医薬組成物中での防腐剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、等張化剤をさらに含む。等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、単糖、二糖もしくは多糖などの糖または例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストランもしくは糖アルコールを包含する水溶性グルカン、アミノ酸(例えばL-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばPEG400)あるいはそれらの混合物からなる群から選択することができる。糖アルコールは、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラシチトール(galacititol)、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールが包含される。
医薬組成物中での等張化剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、キレート化剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、キレート化剤は、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、クエン酸およびアスパラギン酸の塩、EGTAならびにそれらの混合物から選択される。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、安定剤をさらに含む。医薬組成物中での安定剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
本発明の医薬組成物は、組成物を貯蔵している間のポリペプチドまたはタンパク質による凝集体形成を減少させるために十分な量のアミノ酸塩基をさらに含んでよい。「アミノ酸塩基」では、アミノ酸またはアミノ酸の組合せが意図されており、その際、任意の所定のアミノ酸が、その遊離塩基の形態で、またはその塩の形態のいずれかで存在する。アミノ酸には、アルギニン、リシン、アルパラギン酸およびグルタミン酸、アミノグアニジン、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニン、エチオニンおよびブチオニンおよびS-メチル-Lシステインが包含される。
本発明のさらなる実施形態では、メチオニン残基からメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために、治療薬として作用するポリペプチドが、そのような酸化を受けやすい少なくとも1個のメチオニン残基を含むポリペプチドである場合には、メチオニン(または他の含硫アミノ酸またはアミノ酸類似体)を加えることができる。「阻害する」では、時間の経過に伴うメチオニン酸化種の蓄積を最小限にすることが意図されている。メチオニン酸化を阻害することで、ポリペプチドのより多くが、その適正な分子形態に維持される。メチオニンの任意の立体異性体(LまたはD)またはそれらの組合せを使用することができる。加えられる量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に許容されるように、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量であるべきである。典型的にはこれは、組成物が約10%から約30%以下のメチオニンスルホキシドを含有することを意味する。一般にこれは、加えられるメチオニンとメチオニン残基との比が10:1から約100:1など、約1:1から約1000:1であるようにメチオニンを加えることによって達成することができる。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、安定剤を、ポリエチレングリコール(例えばPEG 3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールなどの硫黄含有物質ならびに種々の塩(例えば塩化ナトリウム)から選択する。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、界面活性剤をさらに含む。典型的な界面活性剤(括弧[]内に示されている商品名が例である)は、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートween 20]、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート[Tween 40]またはポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート[Tween 80]などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマー[Pluronic F68/ポロキサマー 188]、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル[Triton X-100]またはポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル[Brij 35]などのポロキサマーである。医薬組成物中での界面活性剤の使用は当業者によく知られている。便宜的に、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)およびベンズアミジンHClなどのプロテアーゼ阻害薬をさらに含むが、他の市販のプロテアーゼ阻害薬も使用することができる。プロテアーゼ阻害薬の使用は、プロテアーゼの酵素原またはFVIIaなどの活性化酵素を含む医薬組成物において、自己触媒作用を阻害するために、特に有用である。
他の成分が、本発明のペプチド医薬製剤中に存在することも可能である。そのような追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張性調節剤、キレート化剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質)および双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン、ヒスチジンなどのアミノ酸)が包含され得る。
化合物の安定性をさらに増大させ、生物学的利用能を高め、溶解性を高め、有害作用を減らし、当業者によく知られている時間治療を達成し、患者の服薬遵守を高めるか、またはそれらの任意の組合せのために、例えば共有結合、疎水的および静電的相互作用を介して、本発明の組成物を薬物担体、薬物送達系および高度薬物送達系にさらに混合または結合させることができる。担体、薬物送達系および高度薬物送達系の例には、これらに限られないが、ポリマー、例えばセルロースおよび誘導体、多糖、例えばデキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレートおよびメタクリレートポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、微粒子、ナノ微粒子、液晶およびそれらの分散液、脂質-水系の相動態の当業者によく知られているL2相およびそれらの分散液、ポリマーミセル、多層乳剤、自己乳化、自己マイクロエマルション化、シクロデキストリンおよびその誘導体ならびにデンドリマーが包含される。
非経口投与は、シリンジ、場合によってペン型シリンジを用いて、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うことができる。別法では、非経口投与は、点滴ポンプを用いて行うことができる。さらなる選択肢は、経鼻または肺用噴霧剤の形態でグルカゴンペプチドを投与するための液剤または懸濁剤であってよい組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のグルカゴンペプチドを含有する医薬組成物はまた、例えば無針注射によるか、またはパッチ、場合によってイオン泳動パッチからか、または経粘膜、例えば頬側投与を介しての経皮投与のために適応することができる。
治療用タンパク質およびポリペプチドを経口適用するための医薬製剤は、活性化合物のナノ粒子、マイクロ粒子または他の種類の多粒子剤形へのカプセル封入を包含し得る。さらなるオプションは、界面活性化合物、細胞浸透性ペプチド、粘膜粘着薬物送達システム、キレート化剤などの浸透促進剤の使用である。なおさらなるオプションは、プロテアーゼ阻害薬の添加であり得る。別のオプションは、SEDDS、SMEDDS SNEDDS(自己乳化(Self Emulsifying)、自己マイクロ乳化(Self Micro-Emulsifying)または自己ナノ乳化(Self Nano-Emulsifying)薬物送達システム)などの脂質をベースとする薬物送達システムの使用である。上述の薬物送達システムは、錠剤に製剤化するか、または制御手法で、もしくは好ましい腸管セグメントで活性化合物を放出するようにコーティングされていてよい適切な硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤に充填することができる。
本発明はまた、以下の実施形態を企図している:
221. グルカゴンペプチドであって、
X24はLysを表し、以下の置換:X3はHisである置換、X15はGluである置換、および/またはX16はAla、Ile、Phe、Arg、Thr、Val、Leu、Glu、TrpもしくはTyrである置換のうちの少なくとも1つおよび前記グルカゴンペプチド中に6つまでの追加のアミノ酸置換は存在する配列番号1ならびに
3個以上の負に荷電している部分のうちの1個が親油性部分の遠位にあり、24位のLysの側鎖窒素に結合している、3個以上の負に荷電している部分を含む置換基
を含むグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、酸もしくはプロドラッグ。
222. 前記アミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下の位置:
X12がArgである置換、
X17がLysである置換、
X20がLysである置換、
X21がGluである置換、
X27がLeuである置換、
X28がSer、IleまたはThrである置換
から選択されていてよい、実施形態221によるグルカゴンペプチド。
223. 前記置換基が式IIを有する実施形態221〜222のいずれかによるグルカゴンペプチド:
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]
[式中、
Z1は、式IIa、IIbまたはIIcのいずれか1つによる構造を表し;
(ここで、式IIa中のnは、6〜20であり、
式IIc中のmは、5〜11であり、
式IIc中のCOOH基は、フェニル環の2、3または4位に結合していてよく、
式IIa、IIbおよびIIc中の記号*は、Z2中の窒素への結合点を表し;
Z2が存在しない場合、Z1は記号*でZ3上の窒素に結合し;Z2およびZ3が存在しない場合、Z1は記号*でZ4上の窒素に結合している)
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表す;
(ここで、各アミノ酸部分は立体化学LまたはDを独立に有し、
Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ3の窒素に接続しており;Z3が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ4の窒素に接続しており、Z3およびZ4が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に接続している);
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
Z3は、記号*を有するZ3の炭素を介して、記号*を有するZ4の窒素に接続しており、Z4が存在しない場合、Z3は、記号*を有する炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に接続しており;
Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;ここで、各アミノ酸部分は独立に、LまたはDのいずれかであり、Z4は、記号*を有する炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に接続している]。
224. 前記置換基が式IIIa、IIIb、IIIc、IIId、IIIe、IIIf、IIIg、IIIh、IIIi、IIIj、IIIk、IIIl、IIIm、IIIn、IIIo、IIIp、IIIqまたはIIIrのいずれか1つによる構造を表す、請求項221から223のいずれか1つによるグルカゴンペプチド:
225. 化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5、化学式6、化学式7、化学式8、化学式9、化学式10、化学式11、化学式12、化学式13、化学式14、化学式15、化学式16、化学式17、化学式18、化学式19、化学式20、化学式21、化学式22、化学式23、化学式24、化学式25、化学式26、化学式27、化学式28および化学式29からなる群から選択される、実施形態221〜224のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
226. 実施形態221〜225のいずれか1つによるグルカゴンペプチドを含む医薬組成物。
227. 1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、実施形態226による医薬組成物。
228. GLP-1化合物をさらに含む、実施形態226-227のいずれか1つによる医薬組成物。
229. インスリン化合物をさらに含む、実施形態226〜228のいずれか1つによる医薬組成物。
230. 非経口投与に適している、実施形態226〜229のいずれか1つによる医薬組成物。
231. 療法で使用するための、実施形態221〜225のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
232. 医薬品を調製するための、実施形態221〜225のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
233. 高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態221〜225のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
234. 2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための、肥満を治療するための、または過体重を予防するための、食物摂取量を低下させるための、エネルギー消費を増大させるための、体重を減少させるための、耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させるための;2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるための;食欲を抑制するための;満腹を誘発するための;体重減少の成功後に体重再増加を予防するための;過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療するための;大食症を治療するための;暴食を治療するための;アテローム硬化症、高血圧、2型糖尿病、IGT、脂質異常症、冠状動脈性心疾患、肝脂肪症を治療するための、ベータ遮断薬中毒を治療するための、X線、CT-およびNMR走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害のために使用するための医薬品を調製するための、実施形態221〜225のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
235. 低血糖、インスリン誘発性低血糖、反応性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹時低血糖、薬物誘発性低血糖、胃バイパス誘発性低血糖、妊娠時低血糖、アルコール誘発性低血糖、インスリノーマおよびフォンギールケ病を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態221〜225のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
(実施例)
略語のリスト:
BOC: tert-ブチルオキシカルボニル
DCM: ジクロロメタン
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
LCMS: 液体クロマトグラフィー質量分析
MeCN: アセトニトリル
Mmt: 4-メトキシトリチル
Mtt: 4-メチルトリチル
NMP: N-メチル-ピロリドン
Oxyma Pure: シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
RP: 逆相
RP-HPLC: 逆相高速液体クロマトグラフィー
RT: 室温
Rt: 保持時間
SPPS： 固相ペプチド合成
TFA: トリフルオロ酢酸
TIPS: トリイソプロピルシラン
UPLC: 超高速液体クロマトグラフィー
一般的な方法
この項は、樹脂結合ペプチドを合成する方法(アミノ酸を脱保護する方法、樹脂からペプチドを切断し、それを精製する方法を包含するSPPS法)、さらに、生じたペプチドを検出および特性決定する方法(LCMSおよびUPLC法)に関する。
SPPS一般法
使用されるFmoc-保護アミノ酸誘導体は、例えばAnaspec、Bachem、Iris BiotechまたはNovabioChemから供給される標準推奨の:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OHおよびFmoc-Lys(Mtt)-OHであった。
SPPSを、Fmocをベースとする化学を使用して、Protein Technologies(Tucson、AZ 85714、米国)製のPrelude Solid Phase Peptide Synthesizerで行った。C-末端カルボン酸を調製するために適した樹脂は、Novabiochemから入手可能な予め負荷された低負荷Wang樹脂である(例えば、低負荷fmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂、LL、0.27mmol/g)。N末端アルファアミノ基をBocで保護した。
Fmoc脱保護は、NMP中20%のピペリジンを2×3分用いることで達成した。カップリング化学は、DIC/HOAt/コリジンまたはDIC/Oxyma Pure/コリジンであった。アミノ酸/HOAtまたはアミノ酸/Oxyma Pure溶液(3〜10倍のモル過剰でNMP中0.3M/0.3M)を樹脂に加え、続いて、同じモル当量のDIC(NMP中3M)、続いてコリジン(NMP中3M)を加えた。例えば、次の量の0.3Mのアミノ酸/HOAt溶液をカップリング毎に、次のスケールの反応で使用した:スケール/ml、0.05mmol/1.5mL、0.10mmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL。カップリング時間は、2×30分または1×240分のいずれかであった。
樹脂をDCMで洗浄し、樹脂をHFIP/DCM/TIPS(70:28:2)(2×20分)に懸濁させることによって、Mtt基を除去し、続いて、DCM(3×)、DCM中5%のDIPEA(1×)、DCM(4×)およびNMP-DCM(4:1)で順次洗浄した。Prelude Synthesizer;樹脂をHFIP/DCM(75:25)(2×2分)で洗浄し、DCMで洗浄し、樹脂をHFIP/DCM(75:25)(2×20分)中に懸濁させることによって、Mtt基を除去し、続いて、ピペリジン/NMP(20:80)、DCM(1×)、NMP(1×)、DCM(1×)、NMP(1×)で順次洗浄した。
リシンのε-窒素上への置換基の導入は、Mttで保護されたリシン(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)を使用して達成した。同様に、側鎖がオルニチン側鎖上に存在する場合、アシル化されるオルニチンのデルタアミノ基をMttで保護した(例えば、Fmoc-Orn(Mtt)-OH)。別法では、リシンのε-窒素は、ivDde基で保護することができるであろう(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)。オルニチンのデルタアミノ基も同様に、ivDde基で保護することができた(Fmoc-Orn(ivDde)-OH)。側鎖へのγ-Glu部分の組み込みを、アミノ酸とのカップリングリングによって達成したFmoc-Glu-OtBu。
側鎖への各部分の導入は、長時間のカップリング時間(1×6時間)を使用し、続いて無水酢酸または別法では、酢酸/DIC/HOAt/コリジンでキャップすることで達成された。置換基上の末端窒素のアセチル化は、無水酢酸(10当量)およびコリジン(20当量)をNMP中で使用して達成した。
置換基の結合
適切に保護された構成単位を使用する上記のとおりのPrelude Peptide Synthesizerによって、ただし、Fmoc-Ado-OH、Fmoc-Glu-OtBuおよびオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(または類似のC8、C10、C12-、C14- C16-、C20-二酸モノtert-ブチルエステル)を包含するアミノ酸および脂肪酸誘導体が各ステップで6時間でカップリングされるように変更して、アルブミン結合部分を段階的な手順で導入することができる。各カップリングステップの後に、酢酸無水物およびコリジンを過剰(>10当量)に使用して、未反応のペプチド中間体にキャップをした。構成単位4-(N-(16-(テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイル)スルファモイル)酪酸(WO 2007/009894に記載されている合成手順によって入手可能)を使用することによって、4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイル部分を含有する化合物を同様に調製する。
樹脂からの切断
合成の後に、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)で2〜3時間処理することによってペプチドを樹脂から切断し、続いて、ジエチルエーテルで沈殿させた。沈澱物をジエチルエーテルで洗浄した。
精製および定量化
粗製ペプチドを、水/MeCN(4:1)などの水およびMeCNの適切な混合物に溶かし、逆相分取HPLC(Waters Deltaprep 4000またはGilson)によって、C18-シリカゲルを含有するカラムで精製する。溶離を0.1%のTFAを含有する水中で上がっていくMeCNの勾配で行う。該当フラクションを分析用HPLCまたはUPLCによってチェックする。純粋な標的ペプチドを含有するフラクションを混合し、減圧下で濃縮する。生じた溶液を分析し(HPLC、LCMS)、化学発光窒素特異的HPLC検出器(Antek 8060 HPLC-CLND)を使用して、または280nmでのUV吸収を測定することによって、生成物を定量化する。生成物をガラスバイアル中に分散させる。バイアルに、Milliporeガラス線維プレフィルターで封をする。凍結乾燥によって、ペプチドトリフルオロアセテートが白色の固体として得られる。
検出および特性決定のための方法
LCMS方法
方法:LCMS_2
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析計を使用して、Perkin Elmer Series 200 HPLCシステムから溶離した後の試料の質量を同定した。
溶離剤:A:水中0.05%のトリフルオロ酢酸;B:アセトニトリル中0.05%のトリフルオロ酢酸。カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm、内径5μm。勾配:1.5ml/分で7.5分かけて5%〜90%のB。
方法:LCMS_4
LCMS_4を、Waters Acquity UPLCシステムおよびMicromass製のLCT Premier XE質量分析計からなる構成で行った。
溶離剤:
A:水中0.1%のギ酸
B:アセトニトリル中0.1%のギ酸。適切な体積の試料(好ましくは2〜10μl)をカラムに注入し、これを、AおよびBの勾配で溶離することによって、分析を室温で行った。UPLC条件、検出器設定および質量分析計設定は:カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mmであった。勾配:0.4ml/分で4.0分(別法では8.0分)の間に線形で5%〜95%のアセトニトリル。検出:214nm(TUV(可変UV検出器)から類似の出力) MSイオン化モード:API-ES
走査:100〜2000amu(別法では500〜2000amu)、0.1amuステップ。
方法:LCMS_13
方法LCMS_13を、PDA UV検出器を備えたUPLCシステムおよびエレクトロスプレーイオン化を備えた単一四極質量検出器からなるWaters Acquity UPLC SQD 2000システムで行った。溶離剤:A:水中0.1%のトリフルオロ酢酸;B:アセトニトリル中0.1%のトリフルオロ酢酸。カラム:Waters Acquity UPLC BEH C18、100Å、1.7μm、2.1mm×100mm。勾配:流速0.3ml/分で3分かけて線形で10%〜90%のB、全実行時間は4分。MS走査範囲:500〜2000amu。
方法:LCMS_AP
Waters2525バイナリー勾配モジュール、Waters2767サンプルマネージャー、Waters2996 Photodiode Array DetectorおよびWaters 2420 ELS Detectorから構成されるHPLCシステムから溶離した後に、Micromass QuatroマイクロAPI質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。溶離剤:A:水中0.1%のトリフルオロ酢酸;B:アセトニトリル中0.1%のトリフルオロ酢酸。カラム:Phenomenex Synergi MAXRP、4μm、75×4.6mm。勾配:1.0ml/分で7分かけて5%〜95%B。
UPLC法
方法 04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて75%のA、25%のBから45%のA、55%のBへ。
方法 04_A4_1
UPLC(方法04_A4_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて65%のA、35%のBから25%のA、65%のBへ。
方法 04_A2_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて90%のA、10%のBから60%のA、40%のBへ。
方法:04_A6_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150 mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。UPLCシステムを:A:10mMのトリス、15mMの硫酸アンモニウム、80%のH2O、20%、pH7.3;B:80%のCH3CN、20%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから10%のA、90%のBへ。
方法:04_A7_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:10mMのトリス、15mMの硫酸アンモニウム、80%のH2O、20%、pH7.3
B:80%のCH3CN、20%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
方法:04_A9_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、C18、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、60℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 200mMのNa2SO4+20mMのNa2HPO4+20ｍMのNaH2PO4を90%のH2O/10％のCH3CNに、pH7.2
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次のステップで勾配を使用した:0.40ml/分の流速で3分かけて90%のA、10%のBから80%のA、20%のBへ、17分かけて90%のA、10%のBから50%のA、50%のBへ。
方法:05_B5_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で8分かけて60%のA、40%のBから30%のA、70%のBへ。
方法:05_B7_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて80%のA、20%のBから40%のA、60%のBへ。
方法:05_B8_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて50%のA、50%のBから20%のA、80%のBへ。
方法:05_B9_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて70%のA、30%のBから20%のA、80%のBへ。
方法:05_B10_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて40%のA、60%のBから20%のA、80%のBへ。
方法:07_B4_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
方法:09_B2_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
方法:09_B4_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
方法:08_B2_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
方法:08_B4_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
方法:10_B4_2
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で12分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
方法:10_B5_2
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:70%のMeCN、30%の水
B: 0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のMeCN、pH2.25を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で1分で40%のA、7分で40%から70%のAへ。
方法:10_B14_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で12分かけて70%のA、30%のBから40%のA、60%のBへ。
方法:AP_B4_1
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、30℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.30ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
(実施例1)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式1:
UPLC法: 04_A9_1: Rt =12.84分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.61分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 3.7分、m/3 = 1427; m/4 = 1071; m/5 = 857
(実施例2)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[His3,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式2:
UPLC法: 05_B9_1: Rt = 8.4
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.8分、m/4 = 1106
(実施例3)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[His3,Lys20,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式3:
UPLC法: 04_A9_1: Rt =13.1分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.0分
LCMS法: LCMS_4: RT = 2.8分、m/3 = 1474; m/4 = 1106; m/5 = 885
(実施例4)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[His3,Glu16,Lys20,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式4:
UPLC法: 04_A9_1: Rt =12.0分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.0分
LCMS法: LSMS_4: RT = 2.8分、m/3 = 1488; m/4 = 1117; m/5 = 893
(実施例5)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[His3,Lys24,Leu27]-グルカゴン
化学式5:
UPLC法: 09_B4 Rt=8.29分
UPLC法: Rt= 7.66分
LCMS:法: LCMS_4 Rt= 2.85; m/Z=4452; M/3: 1483、M/4: 1113
(実施例6)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[His3,Lys17,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式6:
UPLC法: 04_A9_1; Rt = 12.2分
UPLC法: 09_B4_1; Rt = 8.2分
LCMS法: LCMS_4; RT=2.1分; m/3 = 1421; m/4 = 1066; m/5 = 853
(実施例7)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val16,Lys24,Leu27]-グルカゴン
化学式7:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 12.9分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 891
(実施例8)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ile16,Lys24,Leu27]-グルカゴン
化学式8:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.2分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.7分
UPLC法: 04_A9_1: Rt 13.6分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
(実施例9)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[His3,Glu15,Thr16,Lys24,Leu27]-グルカゴン
化学式9:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 12.4分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.2分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 12.7分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1493; m/4 = 1120; m/5 = 896
(実施例10)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Thr16,Lys24,Leu27]-グルカゴン
化学式10:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 12.6分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.3分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 13.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1495、m/4 = 1121; m/5 = 897
(実施例11)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ile16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式11:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1480; m/4 = 1110; m/5 = 889
(実施例12)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式12:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 12.7分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.4分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 12.9分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
(実施例13)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式13:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1480; m/4 = 1110; m/5 = 889
(実施例14)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式14:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.4分
UPLC法: 04_A6_1: Rt = 5.9分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 13.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1486; m/4 = 1115; m/5 = 892
(実施例15)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式15:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.7分
UPLC法: 04_A6_1: Rt = 7.2分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 16.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1490; m/4 = 1117; m/5 = 894
(実施例16)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式16:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 12.7分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.4分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 14.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
(実施例17)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Phe16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式17:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.9分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1501; m/4 = 1126; m/5 = 901
(実施例18)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ile28]-グルカゴン
化学式18:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1499; m/4 = 1124; m/5 = 899
(実施例19)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Thr28]-グルカゴン
化学式19:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.6分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1494; m/4 = 1121; m/5 = 897
(実施例20)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Arg16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式20:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 10.6分;
UPLC法: 04_A6_1: Rt = 5.9分;
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分; m/3 = 1504; m/4 = 1128; m/5 = 903
(実施例21)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式21:
UPLC法: 10_B4_1: Rt = 8.5分;
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 14.5分;
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分; m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 891
(実施例22)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式22:
UPLC法: 04_A9_1; Rt = 13.1分
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.4分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.2; m/3 =1485; m/4 = 1114; m/5 = 892
(実施例23)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ile16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式23:
UPLC法: 10_B4_1: Rt = 8.6分;
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.2分;
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分; m/3 = 1490; m/4 = 1118; m/5 = 894
(実施例24)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式24:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 11.7分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 7.7分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 13.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1471; m/4 = 1103; m/5 = 883
(実施例25)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式25:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 12.4分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.2分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 14.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1481; m/4 = 1110; m/5 = 889
(実施例26)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式26:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 14.0分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 9.2分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 16.6分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1499; m/4 = 1124; m/5 = 900
(実施例27)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式27:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 14.7分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
(実施例28)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式28:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.5分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 14.7分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
(実施例29)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式29:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 13.2分
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.7分
UPLC法: 04_A9_1: Rt = 15.2
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1392; m/4 = 1045; m/5 = 836
(実施例30)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式30:
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.6分
UPLC法: 04_A6_1; Rt= 7.3分
LC-MS法: LCMS_4; Rt = 2.3、m/3 = 1475; m/4 = 1107; m/5 = 886
(実施例31)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式31:
UPLC法: 10_B4_1; Rt = 8.4分
UPLC法: 04_A9_1; Rt = 13.3分
LC-MS法: LCMS_4; RT = 2.2、m/3 = 1481; m/4 = 1111; m/5 = 889
(実施例32)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ile29]-グルカゴン
化学式32:
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.8分
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 13.5分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.4、m/3 =1446; m/4 = 1085; m/5= 868
(実施例33)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Val29]-グルカゴン
化学式33:
UPLC法: 10_B4_1; Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 12.9分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.4、m/3 = 1442; m/4 = 1081; m/5 = 865
(実施例34)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Leu29]-グルカゴン
化学式34:
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.9分
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 13.8分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.5、m/3 = 1446; m/4 = 1085; m/5 = 868
(実施例35)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ile29]-グルカゴン
化学式35:
UPLC法: 09_B4_1; Rt= 8.8分
LC-MS法: LCMS_4; Rt=2.4分、m/3 = 1446; m/4 = 1085; m/5 = 868
(実施例36)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Val29]-グルカゴン
化学式36:
UPLC法: 09_B4_1; Rt= 8.6分
LC-MS法: LCMS_4; Rt=2.3分; m/4 = 1085; m/5 = 868
(実施例37)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Leu29]-グルカゴン
化学式37:
UPLC法: 09_B4_1; Rt= 8.9分
LC-MS法:LCMS_2: Rt=6.2分; m/3 = 1451、m/4 =1088
(実施例38)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式38:
UPLC法: 06_B4_1: Rt= 8.4分
LC-MS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3=1494.1; m/4= 1120.5; m/5=896.8
(実施例39)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴンアミド
化学式39:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.6分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.3分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 15.3分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
(実施例40)
Nε24-[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式40:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.6分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.3分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
(実施例41)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式41:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.6分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.3分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分、m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 892
(実施例42)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式42:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.6分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.3分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1495; m/4 = 1121; m/5 = 897
(実施例43)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式43:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.6分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.4分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 13.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1466; m/4 = 1100; m/5 = 880
(実施例44)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Thr16,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式44:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 11.9分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 7.9分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 9.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.0分、m/3 = 1491; m/4 = 1118; m/5 = 895
(実施例45)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式45:
UPLC法: 09_B2_1: Rt = 14.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1532; m/4 = 1149; m/5 = 920
(実施例46)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式46:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.9分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 9.4分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 15.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1494; m/4 = 1121; m/5 = 897
(実施例47)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式47:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.9分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.8分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 10.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分、m/3 = 1495; m/4 = 1121; m/5 = 897
(実施例48)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Gln28]-グルカゴン
化学式48:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.6分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 9.2分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 14.9分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1503; m/4 = 1127; m/5 = 902
(実施例49)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式49:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.9分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.5分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分、m/3 = 1427; m/4 = 1070; m/5 = 857
(実施例50)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式50:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.2分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 9.0分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1406; m/4 = 1054; m/5 = 844
(実施例51)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式51:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.2分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 9.0分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1436; m/4 = 1077; m/5 = 862
(実施例52)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式52:
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 12.2分
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.3分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.2、m/3 = 1490; m/4 = 1118; m/5 = 894
(実施例53)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ile16,Glu21,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式53:
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 11.0分
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.0分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.2、m/3 = 1499、m/4 = 1125、m/5 = 900
(実施例54)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式54:
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 9.0分
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.1分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.2、m/3 = 1474; m/4 = 1106; m/5 = 885
(実施例55)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式55:
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 8.8分
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 8.1分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.2; m/3 =1495; m/4 = 1121; m/5 = 898
(実施例56)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ala16,Lys24,Leu27,Gln28]-グルカゴン
化学式56:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.3分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 9.0分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 13.5分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1480; m/4 = 1110; m/5 = 888
(実施例57)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ala16,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式57:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.5分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 9.5分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1471; m/4 = 1104; m/5 = 883
(実施例58)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴンアミド
化学式58:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.2分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 9.0分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 14.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
(実施例59)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Glu27,Ser28]-グルカゴン
化学式59:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.5分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.5分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 8.6分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.1分、m/3 = 1481; m/4 = 1111; m/5 = 889
(実施例60)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Gln28]-グルカゴン
化学式60:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.9分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
(実施例61)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴンアミド
化学式61:
UPLC法: 04_A9_1; Rt= 16.1分
UPLC法: 10_B4_1; Rt= 9.6分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.5; m/3 =1459; m/4 = 1094; m/5 = 875
(実施例62)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val10,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式62:
UPLC法: 05_B4_1: Rt=9.6分
LC-MS法: LCMS_4; Rt=2.5分; m/3= 1459; m/4= 1095; m/5= 876
(実施例63)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式63:
UPLC法: 05_B4_1: Rt=8.6分
LC-MS法: LCMS_4; Rt=2.6 m/3=1463; m/4= 1098; m/5= 878
(実施例64)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Arg12,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式64:
UPLC法: 05_B4_1: Rt=9.7分
LC-MS法: LCMS_4; RT=2.5分; m/3= 1468; m/4= 1101; m/5= 881
(実施例65)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式65:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.1分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1481; m/4 = 1111
(実施例66)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式66:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1437
(実施例67)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式67:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.5分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1542; m/4 = 1157
(実施例68)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式68:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.6分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1499; m/4 = 1124
(実施例69)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式69:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1467; m/4 = 1100
(実施例70)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式70:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1476; m/4 = 1107
(実施例71)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式71:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.7分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.2分、m/3 = 1481
(実施例72)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式72:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 7.9分
LCMS法: LCMS_13: Rt = 2.2分、m/3 = 1369; m/4 = 1027
(実施例73)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式73:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 7.9分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1412; m/4 = 1060; m/5 = 848
(実施例74)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式74:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.1分
LCMS法: LCMS_13: Rt = 2.2分、m/3 = 1426; m/4 = 1070
(実施例75)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ile16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴンアミド
化学式75:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 15.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
(実施例76)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴンアミド
化学式76:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.9分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.5分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 14.6分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1421; m/4 = 1066; m/5 = 853
(実施例77)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴンアミド
化学式77:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 15.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
(実施例78)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式78:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.9分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.5分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1422; m/4 = 1066; m/5 = 853
(実施例79)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ile16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式79:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 13.1分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
(実施例80)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式80:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.1分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 13.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.3分、m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
(実施例81)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式81:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1466
(実施例82)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式82:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1476
(実施例83)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式83:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1457; m/4 = 1093
(実施例84)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式84:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 11.8分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1466; m/4 = 1100
(実施例85)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式85:
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 12.2分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.4分、m/3 = 1471; m/4 = 1103
(実施例86)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式86:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 15.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.6分、m/3 = 1436; m/4 = 1077; m/5 = 862
(実施例87)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ala28]-グルカゴン
化学式87:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.9分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.5分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 15.5分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.6分、m/3 = 1484; m/4 = 1113; m/5 = 891
(実施例88)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Gly28]-グルカゴン
化学式88:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 13.0分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.6分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 16.0分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.6分、m/3 = 1479; m/4 = 1110; m/5 = 888
(実施例89)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ala28]-グルカゴン
化学式89:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.2分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.0分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 14.4分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1475; m/4 = 1106; m/5 = 885
(実施例90)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Gly28]-グルカゴン
化学式90:
UPLC法: 08_B2_1: Rt = 12.3分
UPLC法: 08_B4_1: Rt = 8.1分
UPLC法: 04_A3_1: Rt = 14.9分
LCMS法: LCMS_4: Rt = 2.5分、m/3 = 1470; m/4 = 1103; m/5 = 882
(実施例91)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式91:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.2分
LCMS法: LCMS_13: Rt = 2.2分、m/3 = 1383; m/4 = 1038
(実施例92)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式92:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.5分
LCMS法: LCMS_13: Rt = 2.3分、m/3 = 1379; m/4 = 1034
(実施例93)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式93:
UPLC法: AP_B4_1: Rt = 7.8分
LCMS法: LCMS_AP: Rt = 5.1分、m/3 = 1476; m/4 = 1107
(実施例94)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式94:
UPLC法: AP_B4_1: Rt = 7.8分
LCMS法: LCMS_AP: Rt = 5.3分、m/3 = 1485; m/4 = 1116
(実施例95)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式95:
UPLC法: AP_B4_1: Rt = 8.0分
LCMS法: LCMS_AP: Rt = 5.2分、m/3 = 1466; m/4 = 1100
(実施例96)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式96:
UPLC法: 09_B4_1: Rt = 8.4分
LCMS法: LCMS_13: Rt = 2.3分、m/3 = 1422; m/4 = 1067
(実施例97)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式97:
UPLC法: AP_B4_1: Rt = 8.2分
LCMS法: LCMS_AP: Rt = 5.2分、m/3 = 1475; m/4 = 1106
方法
アッセイ(I)
グルカゴン活性
グルカゴン受容体を膜結合cAMPバイオセンサー(ACTOne(商標))を有するHEK-293細胞にクローニングした。細胞(1ウェル当たり14000)を(37℃、5%CO2)で一晩、384ウェルプレート中でインキュベートした。翌日、細胞に細胞質にのみ分布するカルシウム応答性色素を負荷した。有機アニオントランスポーターの阻害薬であるプロベネシドを加えて、色素が細胞を離脱するのを防いだ。PDE阻害薬を加えて、初期化cAMPが分解するのを防いだ。プレートをFLIPRTETRAに入れ、グルカゴン類似体を加えた。終点データを6分後に集めた。細胞内cAMPの上昇は、細胞質中のカルシウム濃度の上昇と比例した。カルシウムが無水で結合すると、蛍光シグナルが生じた。EC50値をPrism5で算出した。
アッセイ(II)
タンパク質製剤の物理的安定性を評価するためのThT原線維形成アッセイ
ペプチドの低い物理的安定性は、アミロイド原線維形成をもたらすことがあり、これは、整列した糸様高分子構造として試料中で観察され、場合によってはゲル形成をもたらす。これは慣例では、試料を視覚的に検査することによって測定されている。しかしながら、その種の測定は非常に主観的で、観察者に依存している。したがって、小分子インジケータープローブを適用することが、より有利である。チオフラビンT(ThT)はそのようなプローブであり、原線維に結合すると、明瞭な蛍光サインを有する[Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177、244〜249頁;LeVine(1999) Methods. Enzymol. 309、274〜284頁]。
原線維形成についての時間経過は、下式の表現でS字状曲線によって表すことができる[Nielsenら(2001) Biochemistry 40、6036〜6046頁]:
式中、Fは、時間tでのThT蛍光である。定数t0は、最大蛍光の50%に達するのに必要な時間である。原線維形成を表す2つの重要なパラメーターは、t0-2τによって算出されるラグタイムおよび見かけ速度定数kapp1/τである。
ペプチドの部分的に折りたたまれた中間体の形成は、原線維形成への一般的な開始機構であると示唆されている。これらの中間体のうちのほとんどは、さらなる中間体が集成することができ、原線維形成が進行するテンプレートをその上に形成するための核となることはない。ラグタイムは、核の臨界質量が構成される時間間隔に対応し、見かけ速度定数は、原線維自体が形成される速度である。
各アッセイの前に、試料を新たに調製した。各試料組成物は、説明文中に記載されている。適切な量の濃NaOHおよびHClを使用して、試料のpHを所望の値に調節した。チオフラビンTを、H2O中のストック溶液から試料に、1μMの最終濃度まで加えた。
試料アリコット200μlを96ウェルマイクロタイタープレート(Packard OptiPlate(商標)96、白色ポリスチレン)に入れた。通常、各試料の4つまたは8つのレプリカ(1つの試験条件に対応する)をウェルの1つのカラムに入れた。プレートをScotch Pad(Qiagen)で密閉した。
所定の温度でのインキュベーション、振盪およびThT蛍光放出の測定を、Fluoroskan Ascent FL蛍光プレートリーダー(Thermo Labsystems)で行った。温度を所望の値、典型的には30℃または37℃に調節した。振盪せずに(外部物理的ストレスなし)、または1mmの振幅で960rpmに調節して軌道振盪しながら、プレートをインキュベートした。444nmフィルターを介しての励起および485nmフィルターを介しての発光の測定を使用して、蛍光測定を行った。
プレートをアッセイ温度で10分間インキュベートすることによって、各操作を開始した。プレートを20分毎に所望の期間測定した。各測定の間、前記のとおりにプレートを振盪および加熱した。
ThTアッセイが完了した後に、各試料の4つまたは8つのレプリカを貯留し、20000rpm、18℃で30分間遠心分離した。上清を0.22μmフィルターで濾過し、アリコットをHPLCバイアルに移した。
当初試料および濾過上清中でのペプチド濃度を逆相HPLCによって、適切な標準を参照として使用して決定した。当初試料の濃度のうち、濾過された試料の濃度が占めるフラクションパーセンテージを回収率として報告した。
測定点を、さらなる処理のためにMicrosoft Excelフォーマットで保存し、曲線の製図およびフィッティングは、GraphPad Prismを使用して行った。原線維の不在下でのThTからの背景発光は無視することができた。データ点は典型的には、4つまたは8つの試料の平均であり、標準偏差誤差棒と共に示されている。同じ実験(即ち、同じプレート上の試料)で得られたデータのみを、同じグラフに示して、実験間での原線維形成の比較測定を確実にした。データセットを式(1)にフィットさせることができる。しかしながら、曲線を視覚的に検査して、ThT蛍光が背景レベルよりも有意に強まった時点を同定することによって、原線維形成前のラグタイムを評価することができる。
アッセイ(III)
GLP-1活性
GLP-1受容体を膜結合cAMPバイオセンサー(ACTOne(商標))を有するHEK-293細胞にクローニングする。細胞(1ウェル当たり14000)を(37℃、5%CO2)で一晩、384ウェルプレート中でインキュベートする。翌日、細胞に細胞質にのみ分布するカルシウム応答性色素を負荷する。有機アニオントランスポーターの阻害薬であるプロベネシドを加えて、色素が細胞を離脱するのを防ぐ。PDE阻害薬を加えて、初期化cAMPが分解するのを防ぐ。プレートをFLIPRTETRAに入れ、グルカゴン類似体を加える。終点データを6分後に集める。細胞内cAMPの上昇は、細胞質中のカルシウム濃度の上昇と比例する。カルシウムが無水で結合すると、蛍光シグナルが生じる。EC50値をPrism5で算出する。
アッセイ(IV)
LOCIアッセイ
ルミネセンス酸素チャネリングイムノアッセイ(Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay:LOCI)を使用して、試料をペプチドについて分析する。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングし、アクセプタービーズは、グルカゴンに特異的なモノクローナル抗体(1F120)と共役させる。他のグルカゴン結合性モノクローナル抗体(2F7)はビオチン化させる。3種の反応物を分析物と合わせ、2サイト(two-sited)免疫複合体を形成する。複合体を照明すると、一重項酸素原子がビーズのドナーから放出される。これらは、アクセプタービーズに導かれて、化学発光をもたらし、この化学発光を、EnVisionプレートリーダーで測定する。放射光の量は、ペプチドの濃度に比例する。
試料/校正物質/対照1μLを384ウェルLOCIプレートのウェルに加え、続いて、抗体でコーティングされたアクセプタービーズ(0.5μg/ウェル)およびビオチン化抗体の混合物15μLを加える。プレートを21〜22℃で1時間インキュベートする。次いで、ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズ30μL(2μg/ウェル)を各ウェルに加え、21〜22℃で30分間インキュベートする。EnVisionプレートリーダーで21から22℃で、520〜645nmの帯域幅を有するフィルターを用いて、680nmレーザーによって励起させた後に、プレートを読み取る。1ウェル当たりの全測定時間は、70msの励起時間を含めて210msである。
アッセイ(V)
食餌誘発性肥満ラットにおける体重減少
Taconic Europeからの64匹の高脂肪(Research Diet D12492)給餌Sprague Dawleyラットおよび8匹の低脂肪(Research Diet D12450B)給餌Sprague Dawleyラットをこの研究では使用する。ラットの体重は、投与前にそれぞれ約970gおよび約730gであるべきである。ラットは水を自由に摂取することができるべきであり、食物摂取を個々に毎日モニタリングすることができるように飼育されているべきである。照明を、午前10時から午後10時まで消灯する。
ラットを8匹からなる群に分け、2種の試験物質を15日間1日1回皮下(sc)投与し、投与体積は0.5ml/kgである。投与を開始する前に、ラットを毎日手で触って、皮下投与の訓練を5日間行う。
投与5日目に、ラットが経験している劇的な体重減少によって、グルカゴン類似体の用量を30nmol/kgから3nmol/kgに、300nmol/kgから30nmol/kgに調節する。
11日目に、ラットを血糖プロファイリングに掛ける。ラットを15日目または16日目に終結させ、インスリンおよびコレステロールを測定するために、血液を試料採取する。
アッセイ(VI)
自由給餌されているラットモデルを使用する、グルカゴン誘導体を用いて食欲に対する有効性を研究するための実験プロトコル
Taconic Europe(Denmark)からのSprague Dawley(SD)ラットを実験のために使用する。ラットは、実験開始の時点で体重200〜250gを有する。実験状況に順応させるために、ラットを実験開始の14日前に到着させる。この期間の間に、動物を2回手で触る。到着後、ラットを個々に1週間、逆転明暗相(日中は消灯し、夜間に点灯することを意味している)で2週間飼育する。ラットは正常に活発であり、その1日分の食物摂取のうちの大部分を夜間に食べるので、消灯直前の朝に、ラットに投与する。このセットアップによって、最も低いデータ変動および最も高い試験感受性が生じる。実験をラットのホームケージ内で行い、ラットは、順応期間および実験期間を通して、食物および水を自由に摂ることができる。誘導体の各用量を、ラット5匹からなる群で試験する。ラット6〜7匹からなるビヒクル群が、各試験セットには包含される。ラットに、体重に従って皮下(sc.)投与溶液0.01〜3mg/kgを1回投与する。投与の後に、ラットを、食物および水を自由に摂れるそのホームケージに戻す。食物消費量を個々にオンライン記録によって連続的に、または7時間にわたって毎時間、次いで24時間後に、再び48時間後に手動で記録する。実験セッションの終了時に、動物を安楽死させる。
個々のデータをMicrosoft excelシートに記録する。異常値についてGrubbs統計評価試験を適用した後に、異常値を除外する。データを累積食物摂取量として、時間を関数として報告する。スチューデントのt検定または一元ANOVAを使用して、ビヒクル群と試験群とを比較する。
アッセイ(VII)
DPP-IV安定性アッセイ
ペプチド10μMを、DPP-IV(2μg/ml)と共に二重に37℃で、0.005%のTween20が加えられているHEPES緩衝液中でインキュベートする。実験では、ヒトGLP-1を陽性対照として使用する。試料アリコットを3、15、30、60、120および240分目に採取し、3体積のエタノールを加えて、反応を停止する。試料を親ペプチドについてLC-MSによって分析する。一次動態にしたがってデータをプロットし、安定性を半減期として報告する。
アッセイ(VIII)
PKプロファイル
15匹の雄のラット(Sprague Dawley、400g、Taconic Europe)を5匹のラットからなる3つの群に分ける。ラットにt=0で、静脈内15nmol/kg、皮下30nmol/kgまたは100nmol/kgを個々に投与する。尾静脈を介して静脈内投与を行うが、その間、ラットは短時間、イソフルラン麻酔下にあった。舌下静脈を介して、血液試料を時間t=-15分、5分(静脈内投与されたラットのみ)、15分、30分、1時間、1・1/2時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間および72時間目に得る。アッセイIVによって分析するまで、血漿試料を凍結貯蔵する。
アッセイ(IX)
pH依存性溶解性
ペプチドおよびタンパク質の溶解性は、溶液のpHに依存する。多くの場合にタンパク質またはペプチドは、その実効電荷が0であるその等電点(pI)で、またはその付近で沈殿する。低いpH(すなわちpI未満)では、タンパク質およびペプチドは典型的には正に荷電していて、pIを超えるpHでは、負に荷電している。
治療用ペプチドが、安定な薬物製品の処方と、例えば皮下注射による患者への薬物製品の投与との両方に適している所与のpHで十分な濃度で可溶性であれば有利である。
溶解性対pH曲線を前記のとおり測定する:製剤またはぺプチド水溶液を調製し、HClおよびNaOHを加えることによって、アリコットを所望の範囲のpH値に調整する。これらの試料を室温で2〜4日間平衡させたままにする。次いで、試料を遠心分離する。溶液中でのタンパク質の濃度を決定するための逆相HPLC分析のために、各試料から少量のアリコットを取り出す。各試料のpHを遠心分離の後に測定し、各タンパク質の濃度を測定されたpHに対して表す。
アッセイ(X)
化学的安定性の評定
グルカゴン類似体の化学的安定性をRP-UPLC分離およびUV検出によって調査した。凍結乾燥試料を緩衝液(詳細な組成については下記を参照されたい)に、333μMの最終濃度および8.15のpHまで溶かし、5℃および37℃で14日間インキュベートし、続いてRP-UPLC分析した。各クロマトグラムにおいて積算されたピーク全ての合計面積に対する、主なピークの面積パーセンテージとして、純度を定義した。37℃での14日後の純度低下は、5℃で14日間インキュベートした後の試料の純度で割った5℃および37℃でインキュベートされた試料の純度差として決定した。
50℃および流速0.4mL/分で操作されるWaters BEH130 2.1mm×150mm、1.7μmカラムを使用して、典型的にはA:50mMのリン酸塩、10w/w%のアセトニトリル(pH3)およびB:80v/v%のアセトニトリルからなる移動相系を使用して、RP-UPLC分析を行った。UV検出を215nmで行った。多くの試料で使用される典型的な勾配プロファイルを下記に示す。
大部分の類似体と比較してかなり異なる保持時間で溶離する一部の個々の類似体について、勾配プロファイルを多少調整することで、試料全体の純度評定比較をより良好に行うことができた。また、1つの注入から次の注入への順番での物質持ち越しをより良好に処理することができるように、チャネルB移動相成分の組成を一部の分析において、90v/v%のアセトニトリル溶媒溶液に変更した。しかしながら、これは、勾配プロファイルを適切に再検討することによって補償された。
緩衝液:
50mMのリン酸二ナトリウム二水和物
184mMのプロピレングリコール
58mMのフェノール
H3PO4を用いてpHを8.15に調整。類似体を再懸濁させた後に、pHを8.15に調整した場合には、0.2MのNaOHを使用した。
アッセイ(XI)
ミニブタにおける薬物動態研究
この研究の目的は、ミニブタへの静脈内投与後のグルカゴン誘導体のin vivoでの薬物動態特性を決定することである。これは、薬物動態(PK)研究で行われ、その際、パラメーターのなかでも、当該の誘導体の終末半減期およびクリアランスを決定する。終末半減期の延長およびクリアランスの低下は、研究化合物がよりゆっくりと身体から排出されることを意味している。グルカゴン類似体では、これは、長期間の薬理学的作用を必要とする。
約7〜14ヶ月齢および体重約16〜35kgの雄または雌のゲッティンゲンミニブタをEllegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から得て、研究で使用した。ミニブタを個別に(長期カテーテルを付けたブタ)、または群で飼育し、SDSミニブタ用食餌(Special Diets Services、Essex、UK)を1日1回または2回制限して給餌した。一部の研究では、少なくとも2週間の順応の後に、2本の長期中心静脈カテーテルをそれぞれの動物の尾または頭部の大静脈にインプラントした。外科手術の後に、動物を1週間回復させ、次いで、連続したグルカゴン誘導体投与の間に適切なウォッシュアウト期間を設けた繰り返し薬物動態研究のために使用した。他の研究では、動物を1週間順応させた後に、連続したグルカゴン誘導体投与の間に適切なウォッシュアウト期間を設けた繰り返し薬物動態研究のために使用した。各投与時に、これらのブタの一方の耳静脈にベンフロンを装着し、ベンフロンを介して、誘導体を投与した。血液試料採取を静脈穿刺によって、頚静脈または頭蓋大静脈で行った。
動物を投与前約18時間および投与後0〜4時間は非絶食または絶食させたが、全期間にわたって水は自由に摂らせた。
グルカゴン誘導体を通常は、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%のtween 80、pH7.4に、通常は20〜60nmol/mlの濃度まで溶かした。化合物の静脈内注射(体積は通常、2〜3nmol/kg、例えば0.1ml/kgに対応する)を1個のカテーテルまたはベンフロンを介して投与し、血液を、投与後13日間まで、予め規定の時点で試料採取した(好ましくは他のカテーテルを介してか、または静脈穿刺によって)。血液試料(例えば0.8ml)を、EDTA緩衝液(8mM)を含む管(場合によってはアプロチニン500KIU/血液mlを加えた)に収集し、次いで、4℃および1942Gで10分間遠心分離した。血漿をドライアイス上のMicronic管にピペットで移し、ELISAまたはLC-MSなどの適切な定量アッセイを使用して個々のグルカゴン誘導体の血漿濃度を分析するまで、-20℃で維持した。これらの測定に基づき、研究化合物についての時間-血漿濃度プロファイルをプロットし、いわゆるデータの非コンパートメント薬物動態分析を、WinNonlin v. 5.0もしくはPhoenix v. 6.2(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)またはPK分析のための他の関連ソフトウェアで行う。半対数プロットで表した場合に、当初分布の後に、薬物が身体から一定の画分速度で除去されることを反映して、多くの化合物で、血漿濃度プロファイルの終末部分は線状であろう。速度(ラムだZまたはλz)は、プロットの終末部分の傾斜を引いたものに等しい。この速度から、終末半減期もt1/2=ln(2)/λzとして算出することができる(例えば、Johan GabrielssonおよびDaniel Weiner: Pharmacokinetics and Pharmacodynamic Data Analysis. Concepts & Applications、第3版、Swedish Pharmaceutical Press、Stockholm (2000)を参照されたい)。
クリアランスを、用量(D)を血漿濃度対時間プロファイル上の曲線下面積(AUC)で割ったものとして定義する(Rowland, MおよびTozer TN: Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications、第3版、1995年、Williams Wilkins)。
アッセイ(XII)
食餌誘発性肥満(DIO)ラットにおける体重に対するグルカゴン類似体の作用
このアッセイの目的は、食餌誘発性肥満(DIO)ラットにおける体重に対するグルカゴン類似体の作用を評価することである。
簡略には、ラットに高脂肪食を10週間給餌して、約600gの体重にした。次いで、DIOラットに、グルカゴン類似体の1日皮下用量を3週間投与した。体重を、投与に関連して毎日測定した。
到着時に約325gの体重を有する雄のSprague Dawleyラット(Taconic(Denmark))を、ケージ1個当たり3匹で飼育し、高脂肪食(Research Diets、R12492、カロリーの60%が脂肪に由来)および水を自由に摂らせた。高脂肪食での4週間の後に、動物を無作為化して1ケージ当たり2匹で飼育し、さらに1週間の後に、グルカゴン類似体を毎日皮下投与する1週間研究を開始した。その後、動物に、4週間のウォッシュアウトを与えた後に、本研究を開始した。ウォッシュアウト期間の後に、動物をラット6匹からなる16の群と、ビヒクル群を構成するラット10匹からなる1群に無作為に分けた。全期間を通じて、動物を12時間明暗サイクルで維持した。
グルカゴン類似体を50mMのNa2HPO4、145mMのNaClおよび0.05%のTweenに溶かし、DIOラットに、グルカゴン類似体の1日皮下用量を0.5ml/kgとして3週間投与した(午後4時)。投与に関連して、体重を毎日測定した。
本発明の一定の特徴を本明細書において説明および記載したが、多くの変更形態、置換、変化、および均等物が、当業者には思いつく。したがって、添付の請求項は、本発明の真の精神に該当する限り、そのような変更形態および変化の全てをカバーすることが意図されていることは理解されるべきである。

Claims (20)

  1. グルカゴンペプチドであって、
    ・配列番号1であって、X24がLysであり、以下の置換:X15がGluである置換、またはX16がAla、Ile、Phe、Arg、Thr、Val、Leu、Glu、TrpもしくはTyrである置換のうちの少なくとも1つが存在し、前記グルカゴンペプチド中に6つまでの追加のアミノ酸置換が存在する、配列番号1、ならびに
    ・3個以上の負に荷電している部分を含む置換基であって、前記負に荷電している部分のうちの1個が親油性部分の遠位にあり、前記置換基が24位のLysの側鎖窒素に結合している、置換基
    を含む、
    グルカゴンペプチド、または薬学的に許容されるその塩、エステル、アミド、酸もしくはプロドラッグ。
  2. X16が、Ile、Phe、Arg、Val、Leu、Glu、TrpまたはTyrである、請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
  3. X16が、Ile、Val、LeuまたはPheである、請求項1または2に記載のグルカゴンペプチド。
  4. 前記追加のアミノ酸置換が、前記グルカゴンペプチドの以下の位置:
    X10がValである、
    X12がArgである、
    X17がLysである、
    X20がLysである、
    X21がGluである、
    X27がLeuである、
    X28がSer、Ile、GlyまたはThrである、および
    X29がVal、LeuまたはIleである
    から選択され得る、請求項1から3のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  5. X28が、Serである、請求項1から4のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  6. 前記置換基が、式II:
    Z1-Z2-Z3-Z4[II]
    を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド
    [式中、
    Z1は、式IIaまたはIIbの1つによる構造を表し;
    (ここで、式IIa中のnは、6〜20であり、
    式IIaおよびIIb中の記号*は、Z2中の窒素への結合点を表し;
    Z2が存在しない場合、Z1は記号*でZ3上の窒素に結合し;Z2およびZ3が存在しない場合、
    Z1は記号*でZ4上の窒素に結合している)
    Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;
    (ここで、各アミノ酸部分は立体化学LまたはDを独立に有し、
    Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ3の窒素に接続しており;Z3が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ4の窒素に接続しており、Z3およびZ4が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドの24位のLysのイプシロン窒素に接続している);
    Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
    Z3は、記号*を有するZ3の炭素を介して、記号*を有するZ4の窒素に接続しており、Z4が存在しない場合、Z3は、記号*を有する炭素を介して、グルカゴンペプチドの24位のLysのイプシロン窒素に接続しており;
    Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;ここで、各アミノ酸部分は独立に、LまたはDのいずれかであり、Z4は、記号*を有する炭素を介して、グルカゴンペプチドの24位のLysのイプシロン窒素に接続しているが、
    但し、Z2もしくはZ4のいずれか、またはZ2およびZ4の両方が、前記置換基中に存在することを条件とする]。
  7. 前記置換基が、式IIIa、IIIb、IIIc、IIId、IIIe、IIIf、IIIg、IIIh、IIIi、IIIj、IIIk、IIIl、IIIm、IIIn、IIIo、IIIp、IIIq、IIIr、IIIs、IIIt、IIIu、IIIv、IIIw、IIIxまたはIIIyの1つによる構造を表す、請求項1から6のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド:
  8. 前記置換基が、式IIIa、IIIpまたはIIItの1つによる構造を表す、請求項7に記載のグルカゴンペプチド:
  9. 以下の化学式1〜97：
    からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  10. Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Val10,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
    の構造を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  11. Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
    の構造を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  12. Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
    の構造を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  13. Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
    の構造を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  14. GLP-1化合物、インスリン化合物またはエキセンジン-4と組み合わされている、請求項1から13のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
  15. 前記GLP-1化合物が、化合物G1およびG3:
    N-イプシロン26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
    (化合物G1);および
    N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
    (化合物G3)
    からなる群から選択される、請求項14に記載のグルカゴンペプチド。
  16. 前記インスリン化合物が、化合物G5:
    NεB29-ヘキサデカンジイオール-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
    (化合物G5)
    である、請求項14に記載のグルカゴンペプチド。
  17. 請求項1から16のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドを含む医薬組成物。
  18. 1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、請求項17に記載の医薬組成物。
  19. 非経口投与に適している、請求項17または18に記載の医薬組成物。
  20. 治療法における使用のための、請求項1から16のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
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