JP2018002734A

JP2018002734A - イズロン酸−２−スルファターゼのｃｎｓ送達のための方法および組成物

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Publication number: JP2018002734A
Application number: JP2017194348A
Authority: JP
Inventors: チューガオチョン; Gaozhong Zhu; ロウクリス; Kris Lowe; シャーロクザーラ; Zahra Shahrokh; クリスチャンジェイムズ; Christian James; ファーナーリック; Fahrner Rick; パンジン; Jing Pan; リアライトテレサ; Leah Wright Teresa; カリアスペリクルス; Calias Pericles
Original assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2018-01-11
Anticipated expiration: 2031-06-25
Also published as: US10456454B2; PE20130648A1; US20230026836A1; JP6797876B2; AR081678A1; JP6898909B2; US20130295077A1; PT3103469T; CL2017002488A1; HUE056884T2; JP2024097029A; RS62520B1; JP7087175B2; JP2020079297A; TWI669128B; JP7543459B2; US20250161417A1; PT3626257T; JP2018002735A; HRP20211520T1

Abstract

【課題】イズロン酸−２−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物の提供。【解決手段】本発明は、とりわけ、リソソーム蓄積疾患の効果的な治療用のリソソーム酵素のＣＮＳ送達のための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ハンター症候群の治療のための、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む直接的ＣＮＳ髄腔内腔内投与のための安定製剤を包含する。種々の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態による製剤を、治療を必要とする対象に髄腔内腔内投与するステップを含む、ハンター症候群の治療方法を包含する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／３５８，８５７号（２０１０年６月２５日出願）；第６１／３６０，７８６号（２０１０年７月１日出願）；第６１／３８７，８６２号（２０１０年９月２９日出願）；第６１／４３５，７１０号（２０１１年１月２４日出願）；第６１／４４２，１１５（２０１１年２月１１日出願）；第６１／４７６，２１０号（２０１１年４月１５日出願）；および第６１／４９５，２６８号（２０１１年６月９日出願）に対する優先権を主張し、これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。本願は、米国特許出願表題「ヘパランＮ−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「イズロン酸スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「β−ガラクトセレブロシダーゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「アリールスルファターゼＡのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「サンフィリッポ症候群Ｂ型の治療」（同日出願）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）と関連する。

本願は、米国特許出願表題「ヘパランＮ−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「イズロン酸スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「β−ガラクトセレブロシダーゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「アリールスルファターゼＡのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「サンフィリッポ症候群Ｂ型の治療」（同日出願）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）と関連する。

酵素補充療法（ＥＲＴ）は、対象への天然または組換え的に得られるタンパク質および／または酵素の全身投与を伴う。認可療法は、典型的には、対象に静脈内投与され、一般的には、根元的酵素欠乏の身体症候を処置するのに有効である。中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞および組織中への静脈内投与タンパク質および／または酵素の限定的分布の結果として、静脈内投与タンパク質および／または酵素は血液−脳関門（ＢＢＢ）を適切に横断しないため、ＣＮＳ病因を有する疾患の処置は特に挑戦的であった。

血液−脳関門（ＢＢＢ）は、ＢＢＢを横切って、根元的脳脊髄液（ＣＳＦ）およびＣＮＳ中に、血流中の有害物質、例えば細菌、高分子物質（例えばタンパク質）およびその他の親水性分子が分散するのを制限することにより、このような物質から中枢神経系（ＣＮＳ）を保護するよう機能する内皮細胞からなる構造系である。

直接脳内注射、ＢＢＢの一過性透過処理ならびに組織分布を変更するための活性作用物質の改質を含めて、治療薬の脳送達を増強するためにＢＢＢを迂回するいくつかの方法がある。脳組織中への治療薬の直接注射は血管系を完全に迂回するが、しかし、頭蓋内注射により背負い込まれる合併症（感染、組織損傷、免疫応答性）、ならびに投与部位からの活性作用物質の不十分な拡散の危険を主に蒙る。今までのところ、脳物質中へのタンパク質の直接投与は、拡散バリアおよび投与され得る治療薬の用量限定のため、有意の治療効果を達成していない。緩徐長期注入を用いた脳実質中に配置されるカテーテルによる対流拡散（非特許文献１；非特許文献２）が研究されてきたが、しかし長期療法のためにこのアプローチを一般に用いる認可療法はない。更に、脳内カテーテルの配置は、非常に侵襲性であり、臨床的代替法として余り望ましくない。

髄腔内腔内（ＩＴ）注射または脳脊髄液（ＣＳＦ）へのタンパク質の投与も試みられてきたが、しかし未だに治療的成功を見ていない。この処置における大きな挑戦は、脳室の上衣内張りを非常に堅く結合する活性作用物質の傾向であって、これがその後の拡散を妨げた。一般に、ＣＳＦへの直接的投与による脳遺伝子疾患の処置のための認可物質はない。
実際、脳の表面での拡散に対するバリア、ならびに有効且つ便利な送達方法の欠如は、任意の疾患に関する脳における適切な治療効果を達成するには大きすぎる障害物である、と多くの人々が考えていた。

Ｂｏｂｏ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ９１，２０７６−２０８０（１９９４）Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９８，５８４−５９０（２００３））

多数のリソソーム蓄積障害は神経系に影響を及ぼし、したがって伝統的療法でこれらの疾患を処置するに際して独特の挑戦を実証する。罹患個体のニューロンおよび髄膜において、グリコサミノグリカン（ＧＡＣ）の大きな蓄積がしばしば認められ、種々の型のＣＮＳ症候を生じさせる。今までのところ、リソソーム障害に起因するＣＮＳ症候は、利用可能な任意の手段により首尾よく処置されてきた。

したがって、脳に治療薬を有効に送達する必要性が依然として大いに存在する。更に特定的には、リソソーム蓄積障害の処置のために中枢神経系に活性作用物質をより有効に送達することが大いに必要とされている。

本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の直接送達のための有効且つ低侵襲性のアプローチを提供する。本発明は、一部は、酵素が種々の表面を横断して有効に且つ広範に拡散して、深部脳領域を含めて脳を横断する種々の領域に浸透するよう、リソソーム蓄積症のための補充酵素（例えば、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ））が高濃度（例えば、約３ｍｇ／ｍｇ以上、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ以上）での治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接的に導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。更に意外なことに、単なる生理食塩水または緩衝液ベースの製剤を用いて、そして対象において実質的副作用、例えば重篤な免疫応答を誘導することなく、このような高タンパク質濃度送達が達成され得る、ということを本発明人等は実証した。したがって、本発明は、ＣＮＳ構成成分を有する種々の疾患および障害、特にリソソーム蓄積症の治療のための直接ＣＮＳ送達のための非常に効率的な、臨床的に望ましい、且つ患者に優しいアプローチを提供する。本発明は、ＣＮＳターゲッティングおよび酵素補充療法の分野における有意の進歩を示す。

以下に詳細に説明されるように、本発明者は、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の有効な髄腔内腔内（ＩＴ）投与のための安定製剤を成功裏に開発した。しかしながら、本明細書に記載される様々な安定製剤は、種々の他のリソソーム酵素を含める治療薬のＣＮＳ送達のために概ね好適であることが考えられる。事実、本発明による安定製剤は、限定されるものではないが、実質内投与、脳内投与、脳室内（ＩＣＶ）投与、髄腔内腔内（例えば、ＩＴ−腰椎、ＩＴ−大槽）投与およびＣＮＳおよび／またはＣＳＦへの直接的または間接的な注入のための任意の他の技術および経路が挙げられる種々の技術および経路を介してＣＮＳ送達のために用いられ得る。

本明細書に記載される種々の安定製剤は、リソソーム蓄積疾患のための種々の補充酵素を含む治療用タンパク質などの他の治療薬のＣＮＳ送達に概ね好適である。いくつかの実施形態では、補充酵素は、合成、組換え体、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。

種々の実施形態では、本発明は、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む、直接的ＣＮＳ髄腔内内投与のための安定製剤を包含する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、およそ１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（例えば、１〜２５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２００ｍｇ／ｍｌ、１〜１５０ｍｇ／ｍｌ、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、１〜５０ｍｇ／ｍｌ）で存在する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、または３００ｍｇ／ｍｌから選択される濃度でまたはその濃度までで存在する。

種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤を包含し、ここでＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号１に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤は、塩を含む。いくつかの実施形態では、この塩はＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、このＮａＣｌは、およそ０〜３００ｍＭの範囲の濃度（例えば、０〜２５０ｍＭ、０〜２００ｍＭ、０〜１５０ｍＭ、０〜１００ｍＭ、０〜７５ｍＭ、０〜５０ｍＭ、または０〜３０ｍＭ）で存在する。いくつかの実施形態では、このＮａＣｌは、およそ１３７〜１５４ｍＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、このＮａＣｌはおよそ１５４ｍＭの濃度で存在する。

種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤を包含し、ここでポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、このポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート２０である。いくつかの実施形態では、このポリソルベート２０は、およそ０〜０．０２％の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、このポリソルベート２０は、およそ０．００５％の濃度で存在する。

種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤を包含し、ここで製剤は、緩衝剤を更に含む。いくつかの実施形態では、この緩衝剤は、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、Ｔｒｉｓ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、緩衝剤はリン酸塩である。いくつかの実施形態では、このリン酸塩は、５０ｍＭ以下の濃度（例えば、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、または５ｍＭ以下）で存在する。いくつかの実施形態では、このリン酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度で存在する。種々の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤を包含し、ここで製剤はおよそ３〜８（例えば、およそ４〜７．５、５〜８、５〜７．５、５〜６．５、５〜７．０、５．５〜８．０、５．５〜７．７、５．５〜６．５、６〜７．５、または６〜７．０）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この製剤は、およそ５．５〜６．５（例えば、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この製剤は約６．０のｐＨを有する。

種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤を包含し、この製剤は、液体製剤である。種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態の安定製剤を包含し、この製剤は、凍結乾燥粉末として製剤化される。

いくつかの実施形態では、およそ１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でのイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質と、およそ１５４ｍＭの濃度でのＮａＣｌと、約０．００５％の濃度でのポリソルベート２０と、約６．０のｐＨを含む、髄腔内投与のための安定製剤を包含する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、およそ３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、または３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

種々の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される種々の実施形態における安定製剤の単回投与形態を含む容器を包含する。いくつかの実施形態では、この容器は、アンプル、バイアル、ボトル、カートリッジ、レザバー、ｌｙｏ−ｊｅｃｔ、または前充填した注射器から選択される。いくつかの実施形態では、この容器は、前充填された注射器である。いくつかの実施形態では、この前充填された注射器は、ベイクドシリコーン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧されたシリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器、またはシリコーンを含有しないプラスチック樹脂注射器から選択される。いくつかの実施形態では、安定製剤は、約５０ｍＬ未満（例えば、４５ｍＬ、４０ｍＬ、３５ｍＬ、３０ｍＬ、２５ｍＬ、２０ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２．５ｍＬ、２．０ｍＬ、１．５ｍＬ、１．０ｍＬ、または０．５ｍＬ以下）の容量で存在する。いくつかの実施形態では、この安定製剤は、約３．０ｍＬ以下の容量で存在する。

種々の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態による製剤を、治療を必要とする対象に髄腔内腔内投与するステップを含む、ハンター症候群の治療方法を包含する。

いくつかの実施形態では、本発明は、およそ１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でのイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）と、約１５４ｍＭの濃度でのＮａＣｌと、約０．００５％の濃度でのポリソルベート２０と、約６であるｐＨを含む製剤を、治療を必要とする対象に髄腔内腔内投与するステップを含む、ハンター症候群の治療方法を包含する。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、対象における実質的な副作用（例えば、重篤な免疫反応）を生じさせない。いくつかの実施形態では、この髄腔内腔内投与は、被験者において、実質的な適応性Ｔ細胞媒介性免疫反応を生じさせない。

いくつかの実施形態において、この製剤の髄腔内腔内投与は、脳、脊髄、および／または末梢器官内の種々の標的組織へのＩ２Ｓタンパク質の送達を生じさせる。いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、標的の脳組織へのＩ２Ｓタンパク質の送達を生じさせる。いくつかの実施形態では、この脳標的組織は、白質および／または灰白質内のニューロンを含む。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞に送達される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、脊髄内のニューロンに更に送達される。

いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、末梢標的組織へのＩ２Ｓタンパク質の全身的送達を更に生じさせる。いくつかの実施形態では、末梢標的組織は、肝臓、腎臓、膵臓および／または心臓から選択される。

いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内の細胞リソソーム局在化を生じさせる。いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内のＧＡＧ蓄積を減少させる。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ蓄積は、対照（例えば、被験者における治療前のＧＡＧ蓄積）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍まで低減される。いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、ニューロンの空胞化を減少させる（例えば、対照と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍までの）。いくつかの実施形態では、ニューロンは、プルキンエ細胞を含む。

いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内のＩ２Ｓ酵素活性の増加を生じさせる。いくつかの実施形態では、このＩ２Ｓ酵素活性は、対照（例えば、対象における治療前の内因性酵素活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍まで増加される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素活性の増加は、少なくともおよそ１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素活性は、腰部で増加される。いくつかの実施形態では、腰部において増加したＩ２Ｓ酵素活性は、少なくともおよそ２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。

いくつかの実施形態では、この製剤の髄腔内腔内投与は、ハンター症候群の少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、または頻度を低減し、若しくは遅延した発症を生じさせる。いくつかの実施形態では、ハンター症候群の少なくとも１つの症状または特徴は、認知障害；白質病巣；脳実質、神経節、脳梁、および／または脳幹内の膨張した血管周囲腔；委縮、ならびに／または脳室拡大である。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、２週間に１回実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、１ヶ月毎に１回実施される。いくつかの実施形態では、骨髄内投与は、２ヶ月に１回実施される。いくつかの実施形態では、投与間隔は、１ヶ月につき２回である。いくつかの実施形態では、投与間隔は、毎週１回である。いくつかの実施形態では、この投与間隔は、１週間につき２回または数回である。いくつかの実施形態では、この投与は、連続的注入ポンプを通じてなど、継続的である。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、静脈内投与と併せて用いられる。いくつかの実施形態では、この静脈内投与は、毎週１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、この静脈内投与は、２週間に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、この静脈内投与は、１か月に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、この静脈内投与は、２ヶ月に１回以下の頻度である。特定の実施形態では、静脈内投与は、１週間に２回、毎週、隔週、または１ヶ月に２回などの月単位投与よりも頻繁である。

いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、同日に実施される。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、互いに一定時間内、例えば少なくとも２日以内、少なくとも３日以内、少なくとも４日以内、少なくとも５日以内、少なくとも６日以内、少なくとも７日以内、または少なくとも１週間以内には実施されない。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、交互スケジュールで、例えば週１回、隔週、月２回または月１回、交互投与で実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、例えば週１回、隔週、月２回または月１回の静脈内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第３または第４または第５投与毎に、静脈内投与の代わりに髄腔内腔内投与に取り替えられ得る。

いくつかの実施形態では、静脈内投与は、例えば週１回、隔週、月２回または月１回の髄腔内腔内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第３または第４または第５投与毎に、髄腔内腔内投与の代わりに静脈内投与に取り替えられ得る。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、逐次的に実施され、例えば先ず、静脈内投与を実施し（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年若しくはそれ以上の間）、その後、髄腔内腔内投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年若しくはそれ以上の間）を実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与を先ず実施し（例えば週１回、隔週、月２回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回の用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年若しくはそれ以上の間）、その後、静脈内投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年またはそれ以上の間）を実施する。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、静脈内投与の不在下で用いられる。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、併用の免疫抑制療法の不在下で用いられる。

図面は単に説明の目的のためであり、制限のためのものではない。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む、髄腔内腔内投与のための安定製剤。
（項目２）
前記Ｉ２Ｓタンパク質は、約１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、項目１に記載の安定製剤。
（項目３）
前記Ｉ２Ｓタンパク質は、２ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌから選択される濃度で存在する、項目１または２に記載の安定製剤。
（項目４）
前記Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目５）
前記塩がＮａＣｌである、項目１〜４のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目６）
前記ＮａＣｌが、約０〜３００ｍＭの範囲の濃度として存在する、項目５に記載の安定製剤。
（項目７）
前記ＮａＣｌが、約１３７〜１５４ｍＭの範囲の濃度として存在する、項目４に記載の安定製剤。
（項目８）
前記ＮａＣｌが、約１５４ｍＭの濃度として存在する、項目７に記載の安定製剤。
（項目９）
前記ポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１〜８のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目１０）
前記ポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート２０である、項目９に記載の安定製剤。
（項目１１）
前記ポリソルベート２０が、約０〜０．０２％の範囲の濃度で存在する、項目１０に記載の安定製剤。
（項目１２）
前記ポリソルベート２０が、約０．００５％の範囲の濃度で存在する、項目１１に記載の安定製剤。
（項目１３）
前記製剤が、緩衝剤を更に含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目１４）
前記緩衝剤が、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、トリストリス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１３に記載の安定製剤。
（項目１５）
前記緩衝剤が、リン酸塩である、項目１４に記載の安定製剤。
（項目１６）
前記リン酸塩が、５０ｍＭを超えない濃度で存在する、項目１５に記載の安定製剤。
（項目１７）
前記リン酸塩が、２０ｍＭを超えない濃度で存在する、項目１３に記載の安定製剤。
（項目１８）
前記製剤が、約３〜８のｐＨを有する、項目１〜１７のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目１９）
前記製剤が、約５．５〜６．５のｐＨを有する、項目１８に記載の安定製剤。
（項目２０）
前記製剤が、約６．０のｐＨを有する、項目１９に記載の安定製剤。
（項目２１）
前記製剤が、液体製剤である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目２２）
前記製剤が、凍結乾燥された乾燥粉末として製剤化される、項目１〜２０のいずれか一項に記載の安定製剤。
（項目２３）
約１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でのイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質と、約１５４ｍＭの濃度でのＮａＣｌと、約０．００５％の濃度でのポリソルベート２０と、約６．０のｐＨとを含む髄腔内腔内投与のための安定製剤。
（項目２４）
前記Ｉ２Ｓタンパク質が、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目２３に記載の安定製剤。
（項目２５）
前記Ｉ２Ｓタンパク質が、約３０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、または３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目２３に記載の安定製剤。
（項目２６）
項目１〜２５のいずれか一項に記載の安定製剤の単回投与形態を含む容器。
（項目２７）
前記容器が、アンプル、バイアル、カートリッジ、レザバー、ｌｙｏ−ｊｅｃｔ、または前充填した注射器から選択される、項目２６に記載の容器。
（項目２８）
前記容器が、前充填した注射器である、項目２６〜２８のいずれか一項に記載の容器。
（項目２９）
前記前充填した注射器が、ベイクドシリコーン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器、またはシリコーンを含有しないプラスチック樹脂注射器から選択される、項目２８に記載の容器。
（項目３０）
前記安定製剤が、約５．０ｍＬ未満の容積で存在する、項目２７に記載の容器。
（項目３１）
前記安定製剤が、約３．０ｍＬ未満の容積で存在する、項目２７に記載の容器。
（項目３２）
ハンター症候群の治療方法であって、
治療を必要とする被験者に、項目１〜２０のいずれか一項に記載の安定製剤を髄腔内投与するステップを含む、方法。
（項目３３）
ハンター症候群の治療方法であって、
治療を必要とする対象に、約１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でのイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質と、約１５４ｍＭの濃度でのＮａＣｌと、約０．００５％の濃度でのポリソルベート２０と、約６のｐＨと、を含む安定製剤を髄腔内腔内投与するステップを含む、方法。
（項目３４）
前記髄腔内腔内投与するステップが、前記対象において実質的な有害事象を生じさせない、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３５）
前記髄腔内腔内投与が、前記対象において、実質的な適応性Ｔ細胞媒介性免疫反応を生じさせない、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、標的脳組織への前記Ｉ２Ｓタンパク質の送達を生じさせる、項目３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記脳標的組織が、白質および／または灰質内のニューロンを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｉ２Ｓタンパク質が、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞に送達される、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｉ２Ｓタンパク質が、脊髄内のニューロンに更に送達される、項目３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、末梢標的組織内の前記Ｉ２Ｓタンパク質の全身的送達を更に生じさせる、項目３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記末梢標的組織が、肝臓、腎臓、および／または心臓から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるリソソーム局在化を生じさせる、項目３２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、前記脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるＧＡＧ蓄積を減少させる、項目３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記ＧＡＧ蓄積が、対照と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍まで減少される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、ニューロンにおける空胞化を減少させる、項目３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ニューロンが、プルキンエ細胞を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、前記脳標的細胞、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるＩ２Ｓ酵素活性の増加を生じさせる、項目３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記Ｉ２Ｓ酵素活性が、対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍まで増加される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ｉ２Ｓ酵素活性の増加は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｉ２Ｓ酵素活性が、腰部領域で増加される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記腰部領域における前記Ｉ２Ｓ酵素活性の増加が、少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記製剤の前記髄腔内腔内投与が、ハンター症候群の少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度または頻度の低減、ならびに発症の遅延を生じさせる、項目３２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記ハンター症候群の前記症状または特徴の少なくとも１つは、認知障害；白質病巣；脳実質、脳梁、神経節、および／または脳幹内の膨張した血管周囲腔；ならびに／または脳室拡大である、項目３２に記載の方法。
（項目５４）
前記髄腔内腔内投与が、２週間に１回実施される、項目３２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記髄腔内腔内投与が、１ヶ月毎に１回実施される、項目３２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記髄腔内腔内投与が、２ヶ月に１回実施される、項目３２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記髄腔内腔内投与が、静脈内投与と併せて用いられる、項目３２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記静脈内投与が、１か月に１回以下の頻度である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記静脈内投与が、２ヶ月に１回以下の頻度である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記髄腔内腔内投与が、静脈内投与の不在下で用いられる、項目３２〜５６に記載の方法。
（項目６１）
前記髄腔内腔内投与が、同時免疫抑制療法の不在下で用いられる、項目３２〜６０に記載の方法。

Ｉ２Ｓの３用量の髄腔内腔内注射後の、脳の表面を覆う髄膜細胞（矢印先端部）の層内にＩ２Ｓを含む大脳皮質および小脳皮質のニューロン（矢印）内で検出されたＩＴ送達されたＩ２Ｓおよびを示す例示的図である。２用量注射された脳におけるＩ２ＳＩＨＣの染色は、より弱かった（写真表示せず）。陽性Ｉ２Ｓ染色は、ビヒクル対照動物の脳のいずれの型の細胞についても観察されなかった。（４０Ｘ）髄腔内腔内−腰椎Ｉ２Ｓ注射後のＩ２Ｓノックアウト（ＩＫＯ）マウスの脳における病変の回復を示す例示的図である。Ｈ＆Ｅ染色された脳組織は、ビヒクル対照動物において多数の細胞内蓄積空胞（矢印）を示した。細胞内空胞化は、２用量（写真表示せず）および３用量が注射されたマウスの双方で脳全体を通して減少された。著しい減少は、３用量が注射されたマウスで認められた。（４０Ｘ）ビヒクル対照マウスと比較して、Ｉ２Ｓの２用量（写真表示せず）および３用量処置後に脳内でのリソソーム活性の著しい減少がある、ＬＡＭＰ−１の免疫組織化学染色を示す例示的図である。この減少は、ＬＡＭＰ−１陽性細胞の数での減少および脳全体の領域でのより明るい染色強度によって特徴付けられた。（４０Ｘ）大脳皮質（Ｃｏｒｔｅｘ）、尾状核（ＣＰ）、視床（ＴＨ）、白質（ＷＭ）および小脳（ＣＢＬ）における、野生型（ＷＴ）、ビヒクル未処置およびＩ２Ｓ（２および３用量）マウスの中での平均ＬＡＭＰ−１陽性領域の比較からの形態計測結果を示す例示的図であり、評価された脳の全ての領域でＬＡＭＰ−１陽性染色での著しい減少があることを確認された。データは、平均値±標準偏差、＃Ｐ＜０．０５；^＊Ｐ＜０．０１；^＊＊Ｐ＜０．００１として表されている。超微細構造レベルでの病変改善を示した脳細胞の例示的電子顕微鏡写真である。ビヒクル処置マウスのニューロンは、板状封入体、ゼブラ小体様構造、および顆粒状蓄積物質（インサート）を含有する空胞を有したが、これがＩ２Ｓ注射マウスでは減少された。ビヒクル処置マウスの希突起グリア細胞は、大きなエレクトロンルーセント蓄積空胞（矢印）を示したが、Ｉ２Ｓ注射マウスは、最小の空胞を有した。（スケールバー：ニューロン内、２μｍ；希突起グリア細胞内、５００ｎｍ）Ｉ２Ｓの３用量の髄腔内腔内注射後に、肝臓のシヌソイド細胞内で検出されたＩ２Ｓを示している例示的に免疫組織化学の結果を示す。２用量注射された肝臓におけるＩ２ＳＩＨＣ染色は、より弱かった（写真表示せず）。ビヒクル対照動物の肝臓では、陽性Ｉ２Ｓ染色はなかった。（４０Ｘ）肝臓からの例示的組織を示す。重篤な細胞空胞化および異常に高いリソソーム活性が、Ｈ＆Ｅ染色によって認められ、強いＬＡＭＰ−１免疫染色が、ＷＴ動物と比較してビヒクル対照動物で見出された。Ｉ２Ｓ処置の３用量および２用量（写真表示せず）での髄腔内腔内処置後に、細胞内空胞化およびＬＡＭＰ−１免疫染色の著しい減少が確認された。Ｈ＆Ｅ染色は、細胞質内空胞化が、ほとんど正常な肝臓細胞構造の状態で、ほぼ完全に消失することを示した。（Ｈ＆Ｅ、４０Ｘ；ＬＡＭＰ−１、２０Ｘ）生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および４０℃で１ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および２５℃で６ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および２〜８℃で２４ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対４０℃で１ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対２５℃で６ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対２〜８℃で２４ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースラインおよび４０℃で１ヶ月について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：２５℃で６ヶ月および２〜８℃で１６ヶ月以上について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を比較する例示的データを示す。３ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。髄膜細胞内に陽性Ｉ２Ｓ染色が認められた。（４Ｘ）３０ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。ニューロンおよび髄膜細胞内に陽性Ｉ２Ｓ染色が認められた。（４Ｘ）１００ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。陽性Ｉ２Ｓ染色ニューロンおよび髄膜細胞は、３および３０ｍｇ処置動物のものよりも強かった。（４Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。ニューロンの大集団が、強い陽性の髄膜細胞に沿って１２Ｓ陽性であった。３０ｍｇ処置群動物において、大脳の層ＩＩＩ内の髄膜細胞に沿ったＩ２Ｓ陽性のニューロンおよびグリア細胞を示している例示的組織を示す。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物において、大脳の層ＩＩＩ内の血管周囲細胞に沿ったＩ２Ｓ陽性のニューロン、グリア細胞を示している例示的組織を示す。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物において、白質に隣接する大脳の層ＶＩ内のＩ２Ｓ陽性のニューロンおよびグリア細胞を示している例示的組織を示す。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物のニューロン（大脳）内の強い陽性Ｉ２Ｓ染色を示している例示的組織を示す。（１００Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の頚部脊髄のＩ２Ｓ免疫染色を示している例示的組織である。（４Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の腰部脊髄での強いＩ２Ｓ免疫染色を示している例示的組織である。（４Ｘ）髄膜細胞、グリア細胞、およびエピ／ペリ／内神経鞘（結合細胞）の強く陽性のＩ２Ｓ免疫染色が、１５０ｍｇ処置群動物の腰部で見出されたことを示している例示的組織である。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の腰部脊髄内のニューロンが強くＩ２Ｓ陽性であったことを示す。（４０Ｘ）３ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。シヌソイド細胞のみがＩ２Ｓ陽性であった。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。シヌソイド細胞および肝細胞がＩ２Ｓ陽性であった。（４０Ｘ）１００ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓ免疫染色は、シヌソイド細胞および肝細胞で非常に強かった。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。強く陽性のＩ２Ｓ染色が、シヌソイド細胞および肝細胞で特定された。（４０Ｘ）３ｍｇ処置群動物に由来する心臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓ免疫染色は陰性であった。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物からの心臓に由来する例示的結果を示す。間質細胞は、Ｉ２Ｓ陽性であった。（４０Ｘ）１００ｍｇ処置群動物に由来する心臓からの例示的結果を示す図である。Ｉ２Ｓについて、間質細胞染色は陽性であった。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物に由来する心臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓについて、間質細胞染色は強く陽性であった。（４０Ｘ）３ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す図である。Ｉ２Ｓ免疫染色は陰性であった。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す。糸球体細胞および間質細胞は、Ｉ２Ｓ陽性であった。１００ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓについての糸球体細胞および間質細胞の染色の増加が認められた。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す。近位細管細胞、糸球体細胞および間質細胞の陽性Ｉ２Ｓ染色が認められた。（４０Ｘ）イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の週単位用量を投与されたカニクイザルのＣＮＳ組織を評価する免疫組織化学（ＩＨＣ）試験の結果を示す。（ＩＨＣ）によって決定されたように、ＣＮＳ全体でＩ２Ｓの広範囲の細胞堆積があった。灰白質では、用量依存的様式で、全ての群の大脳、小脳、脳幹、および脊髄のニューロンでＩ２Ｓが検出された。高用量群の表面灰白質では、大多数の脳内ニューロンが、表面皮質においてＩ２Ｓについて陽性であった（図４０Ａ）。Ｉ２Ｓはまた、視床（図４０Ｂ）、海馬（図４０Ｃ）、尾状核（図４０Ｄ）および脊髄（図４０Ｅ）でも検出された。髄膜細胞および血管周囲細胞もまた、Ｉ２Ｓ染色陽性であった（図４０Ｆ）。特定されたスケールバーは２５μｍに相当する。投与後に頭蓋および脊髄プールでのＩ２Ｓの量を時間に対してプロットすることによって、頭蓋および脊髄プールにおけるイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の排泄をグラフで比較する。６ヶ月にわたり非ヒト霊長類に髄腔内腔内投与されたイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の用量依存的灰白質沈着を示す。図示された染色強度は、視床でのイズロン酸−２−スルファターゼの蓄積に相当する。この図４２では、ＤＡＰＩによって核が対抗染色され、青色で現れ、タンパク質（Ｉ２Ｓ）が緑色で現れた。単回注射および６ヶ月にわたる複数回注射後の非ヒト霊長類に髄腔内腔内投与されたイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の用量依存的灰白質沈着を示す図である。示した染色強度は、大脳皮質におけるイズロン酸−２−スルファターゼの蓄積に対応する。非ヒト霊長類の大脳全体を通してのイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の細胞内局在化を実証する。図４４Ａは、非ヒト霊長類の大脳から抽出された脳組織の横断図を示し、一方、図４４Ｂは、図４４Ａで同定された切片の白質組織の３つの領域（Ｗ１、Ｗ２およびＷ３と呼ぶ）、脳室付近の白質（ＶＷ）および表面灰白質（ＳＧ）組織に対応する特定領域を示す。６ヶ月間にわたる月１回注射後の非ヒト霊長類への髄腔内腔内投与イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）のニューロンおよび希突起グリア細胞取込みおよび軸索会合を示す。特に、図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃおよび図４５Ｄは、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を髄腔内腔内投与された非ヒト霊長類の大脳組織のフィラメント染色を示し、それぞれ、図４４Ｂで同定された白質の３つの領域（Ｗ１、Ｗ２およびＷ３）ならびに表面灰白質（ＳＧ）領域に対応する。図４５Ａは、白質（Ｗ１）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起グリア細胞取込みを示す。図４５Ｂおよび図４５Ｃは、それぞれＷ２およびＷ３白質組織における髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起神経膠取込みおよび軸索会合を示す。図４５Ｄは、表面灰白質（ＳＧ）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓのニューロン取込みを示す。６ヶ月間にわたる月１回注射後の非ヒト霊長類への髄腔内腔内投与イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）のニューロンおよび希突起グリア細胞取込みおよび軸索会合を示す。特に、図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃおよび図４５Ｄは、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を髄腔内腔内投与された非ヒト霊長類の大脳組織のフィラメント染色を示し、それぞれ、図４４Ｂで同定された白質の３つの領域（Ｗ１、Ｗ２およびＷ３）ならびに表面灰白質（ＳＧ）領域に対応する。図４５Ａは、白質（Ｗ１）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起グリア細胞取込みを示す。図４５Ｂおよび図４５Ｃは、それぞれＷ２およびＷ３白質組織における髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起神経膠取込みおよび軸索会合を示す。図４５Ｄは、表面灰白質（ＳＧ）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓのニューロン取込みを示す。非ヒト霊長類の脳室付近の白質（ＶＷ）中のイズロン酸−２−スルファターゼの細胞内同定を示す。補充画像に示すように、イズロン酸−２−スルファターゼはミエリンと会合されない（赤色）。本発明の図４６では、核はＤＡＰＩにより対比染色される（下左）。タンパク質（Ｉ２Ｓ）は上左枠で現れている。イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の単回注射を脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内腔内（ＩＴ）投与された健常ビーグル犬の組織における染色を示す。図４７Ａ〜４７Ｈで示されるように、Ｉ２Ｓは、免疫組織化学（ＩＨＣ）により確定されるように、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方の灰白質全体に広範に分布された。図４７Ａおよび４７Ｂは、大脳皮質において、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方の表面分子層から深部内部層まで、６つのニューロン層すべてで、ニューロンがＩ２Ｓに関して陽性であったことを示す。図４７Ｃおよび４７Ｄは、ＩＴおよびＩＣＶ群の小脳皮質において、Ｉ２Ｓが、プルキンエ細胞を含めてニューロン中で検出されたことを示す。同様に、図４７Ｅおよび４７Ｆは、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方で、海馬中のニューロンの大集団がＩ２Ｓに関して陽性であったことを示す。最後に、画像ｇおよびｈは、Ｉ２Ｓ陽性ニューロンが、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方で、視床および尾状核においても見出されたことを実証する。本発明の図４７では、Ｉ２Ｓ染色は矢印で示されている。非処置のまたはＩ２Ｓを髄腔内腔内投与されたいずれかのイズロン酸−２−スルファターゼノックアウト（ＩＫＯ）マウスの脳梁組織を比較して示す。図示したように、処置ＩＫＯマウスは、Ｉ２Ｓ処置ＩＫＯマウスの脳梁および脳弓組織におけるある種のリソソーム貯蔵障害の特徴とする細胞内空胞化の低減を示した。図９３Ａは、非処置ＩＫＯ対照マウス（図４９Ｂ）に比して、処置ＩＫＯマウス（図４９Ａ）の表面大脳皮質組織中の、リソソーム病病理バイオマーカーであるリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）の存在の顕著な低減を示す。倍率２０倍および４０倍。図９３Ａは、非処置ＩＫＯ対照マウス（図４９Ｂ）に比して、処置ＩＫＯマウス（図４９Ａ）の表面大脳皮質組織中の、リソソーム病病理バイオマーカーであるリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）の存在の顕著な低減を示す。倍率２０倍および４０倍。例示的髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。例示的ＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）低プロフィール髄腔内腔内埋込み可能アクセス系を示す。例示的髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。ＣＮＳ酵素補充療法（ＥＲＴ）のための在宅投与を可能にする、髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。ニューロン内（プルキンエ細胞）のイズルスルファーゼの単回脳内注射後の空胞形性の例示的作用を示す。用量および領域による脳中のＩ２Ｓ活性を示す例示図である。大脳皮質の異なる深度でのイズルスルファーゼの免疫組織化学的局在化のデータを示す例示図である。イズルスルファーゼを髄腔内腔内用量投与後のサルの脊髄中のＩ２Ｓ活性を示す例示図である。イズルスルファーゼを髄腔内腔内用量投与後のサルの肝臓、心臓および腎臓中のＩ２Ｓ活性を示す例示図である。拡大ハンターＩＴ試験プログラムのための例示的模式図を表す。３０ｍｇ用量投与後の脳組織の種々の切片におけるＩ２Ｓ濃度の測定値を示す例示図である。異なるプロットは、異なる測定時間に対応する。種々の生成物濃度に関して種々の投与経路で長時間投与後のＩ２Ｓ濃度の測定値を示す例示図である。ＩＶ、ＩＴ−ＬまたはＩＣＶ用量投与後ｔ＝５時間でのカニクイザルにおける^１２４Ｉ標識化イズルスルファーゼ−ＩＴのＰＥＴ画像を例示図である。髄腔内腔内薬剤送達装置ＩＤＤＤの例示的線図である。対象の体内（図６４Ａ）および平面での表示（図６４Ｂ）の双方でのＩＤＤＤの多様な特徴を示す。対象の体内（図６４Ａ）および平面での表示（図６４Ｂ）の双方でのＩＤＤＤの多様な特徴を示す。対象の体内（図６４Ａ）および平面での表示（図６４Ｂ）の双方でのＩＤＤＤの多様な特徴を示す。

定義
本発明をより容易に理解するために、一定の用語を先ず以下で定義する。以下の用語および他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。

「およそまたは約」は、本明細書中で用いる場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の当該値に適用される場合、記述参照値と類似する値を指す。ある実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別記しない限り、或いはそうでない場合は本文から明らかな記述参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下内にある一連の値を指す（このような数が考え得る値の１００％を超える場合を除く）。

「改善」：本明細書中で用いる場合、「改善」という用語は、ある状態の防止、低減または緩和、或いは対象の状態の改善を意味する。改善は、疾患状態の完全回復または完全防止を包含するが、しかし必要とするわけではない。いくつかの実施形態では、改善は、関連疾患組織中に欠けている漸増レベルの関連タンパク質またはその活性を包含する。

「生物学的に活性な」：本明細書中で用いる場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系において、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物体に投与された場合、その生物体に及ぼす生物学的作用を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的活性」部分として言及される。

「増量剤」：本明細書中で用いる場合、「増量剤」という用語は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する（例えば、開口構造を保持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの生産を促す）化合物を指す。バルク剤の例としては、マンニトール、グリシン、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトース、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコールおよびデキストランが挙げられる。

「陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」：本明細書中で用いる場合、「陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」という用語は、リソソームへの輸送を定められているゴルジ装置における酸加水分解酵素上のマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）タグを結合する細胞受容体を指す。マンノース−６−ホスフェートのほかに、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩも結合する。ＣＩ−ＭＰＲは、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」または「ＩＧＦ２受容体」としても既知である。これらの用語およびその略語は、本明細書中で互換的に用いられる。

「同時免疫抑制薬療法」：本明細書中で用いる場合、「同時免疫抑制薬療法」という用語は、前処置、前状態調節として、またはある処置方法と平行して用いられる任意の免疫抑制薬療法を包含する。

「希釈剤」：本明細書中で用いる場合、「希釈剤」という用語は、再構成処方物の調整のために有用な製薬上許容可能な（例えば、ヒトへの投与のために安全且つ非毒性の）希釈物質を指す。希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（後、リン酸塩緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。

「剤形」：本明細書中で用いる場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、処置されるべき患者のための治療用タンパク質の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医により決定される、と理解される。

「酵素補充療法（ＥＲＴ）」：本明細書中で用いる場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、失われている酵素を提供することにより酵素欠乏症を矯正する任意の治療戦略を指す。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、髄腔内腔内投与により提供される。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、血流中への注入により提供される。一旦投与されると、酵素は細胞に取り込まれ、リソソームに運ばれて、そこで酵素は、酵素欠乏のためにリソソーム中に蓄積された物質を除去するよう作用する。典型的には、有効であるべきリソソーム酵素補充療法に関して、治療用酵素は、貯蔵欠陥が顕在性である標的組織中の適切な細胞中のリソソームに送達される。

「改善する、増大するまたは低減する」：本明細書中で用いる場合、「改善する」、「増大する」または「低減する」という用語、或いは文法的等価物は、基線測定値、例えば本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、或いは本明細書中に記載される処置の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値と比較した場合の値を示す。「対照個体」は、処置されている個体と同一型のリソソーム貯蔵疾患に罹患している個体であって、処置されている個体とほぼ同年齢である（処置個体と対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。

「個体、対象、患者」：本明細書中で用いる場合、「対象」、「個体」または「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を指す。処置されている個体（「患者」または「対象」としても言及される）は、疾患に罹患している個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。

「髄腔内腔内投与」：本明細書中で用いる場合、「髄腔内腔内投与」または「髄腔内腔内注射」という用語は、脊柱管（脊髄周囲の髄腔内腔内空隙）への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔或いは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内腔内投与」または「髄腔内腔内送達」は、腰椎域または領域を介したＩＴ投与または送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与または送達を指す。本明細書中で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎域」という用語は、第三および第四腰椎（背中下部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。

「リンカー」：本明細書中で用いる場合、「リンカー」という用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質中の特定位置に出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、一般的に、柔軟性であるよう、または２つのタンパク質部分の間の構造物、例えばらせんを間に置くよう意図される。リンカーは、スペーサーとしても言及される。

「リオプロテクタント」：本明細書中で用いる場合、「リオプロテクタント」という用語は、凍結乾燥およびその後の貯蔵時に、タンパク質または他の物質の化学的および／または物理的不安定性を防止するかまたは低減する分子を指す。リオプロテクタントの例としては、糖、例えばスクロースまたはトレハロース；アミノ酸、例えばグルタミン酸またはヒスチジン一ナトリウム；メチルアミン、例えばベタイン；リオトロピック塩、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ならびにその組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、リオプロテクタントは、非還元糖、例えばトレハロースまたはスクロースである。

「リソソーム酵素」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム酵素」という用語は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を還元し得るか、或いは１つ以上のリソソーム貯蔵疾患症候を救出するかまたは改善し得る任意の酵素を指す。本発明に適しているリソソーム酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成され得るし、或いは天然供給源から精製され得る。リソソーム酵素の例は、表１に列挙されている。

「リソソーム酵素欠乏症」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム酵素欠乏症」は、高分子物質（例えば酵素基質）をリソソーム中でペプチド、アミノ酸、単糖、核酸および脂肪酸に分解するために必要とされる酵素の少なくとも１つにおける欠乏に起因する遺伝子障害の一群を指す。その結果、リソソーム酵素欠乏症に罹患している個体は、種々の組織（例えば、ＣＮＳ、肝臓、脾臓、腸、血管壁およびその他の器官）中に物質を蓄積している。

「リソソーム蓄積症」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム蓄積症」という用語は、天然高分子物質を代謝するために必要な１つ以上のリソソーム酵素の欠乏に起因する任意の疾患を指す。これらの疾患は、典型的には、リソソーム中に非分解分子の蓄積を生じて、貯蔵顆粒（貯蔵小胞とも呼ばれる）の数を増大する。これらの疾患および種々の例は、以下で詳細に記載される。

「ポリペプチド」：本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、概して、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の紐である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その各々が少なくとも１つのペプチド結合により他のものと結合される少なくとも３〜５つのアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、時として、「非天然」アミノ酸、或いはそれでも任意にポリペプチド鎖に一体化し得る他の実体を包含する、と当業者は理解する。

「補充酵素」：本明細書中で用いる場合、「補充酵素」という用語は、処置されるべき疾患において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、「補充酵素」という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、或いは１つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。本発明に適している補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成し得るし、或いは天然供給源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。

「可溶性の」：本明細書中で用いる場合、「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成する治療薬の能力を指す。いくつかの実施形態では、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。いくつかの実施形態では、本発明による治療薬は、その対応する薬学的組成物中で可溶性である。非経口投与薬のためには等張溶液が一般的に好ましいが、等張溶液の使用は、いくつかの治療薬、特にいくつかのタンパク質および／または酵素に関する適切な溶解度を制限し得る、と理解される。わずかに高張性の溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に１７５ｍＭまでの塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に２％までのスクロース）は、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。例えば、最も一般に認可されたＣＮＳボーラス製剤組成物は、生理食塩水（水中１５０ｍＭのＮａＣｌ）である。

「安定性」：本明細書中で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間に亘ってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大部分）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間に亘って査定され得る（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）。概して、本明細書中に記載される薬学的組成物は、それらが、一緒に処方される１つ以上の治療薬（例えば、組換えタンパク質）を安定化し、或いはそれらの分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。一処方物の状況では、安定処方物は、貯蔵時、および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）中に、その中の治療薬が本質的にその物理的および／または化学的完全性および生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成および電荷プロフィールの移動により測定され得る。

「対象」：本明細書中で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳動物を意味する。本発明のある実施形態では、対象は、成人、若者または幼児である。薬学的組成物の投与、および／または子宮内治療方法の実施も、本発明により意図される。

「実質的相同性」：「実質的相同」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に相同な残基を含有する場合、一般的に「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は、同一残基であり得る。代替的には、相同残基は、ほぼ同様の構造的および／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知であるように、あるアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として分類され、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有するとして分類される。一アミノ酸の、別の同一型のアミノ酸への置換は、しばしば、「相同」置換とみなされ得る。

当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，「ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ」，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。

「実質的同一性」：「実質的同一性」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般的に「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔａｌ．，
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。

「合成ＣＳＦ」：本明細書中で用いる場合、「合成ＣＳＦ」という用語は、脳脊髄液と一致するｐＨ、電解質組成、グルコース含量および浸透圧を有する溶液を指す。合成ＣＳＦは、人工ＣＳＦとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、合成ＣＳＦはエリオットＢ溶液である。

「ＣＮＳ送達に適している」：本明細書中で用いる場合、「ＣＮＳ送達に適している」または「髄腔内腔内送達に適している」という語句は、それが本発明の薬学的組成物に関する場合、一般的に、このような組成物の安定性、耐容性および溶解度特性、ならびに標的送達部位（例えば、ＣＳＦまたは脳）にその中に含有される有効量の治療薬を送達するこのような組成物の能力を指す。

「標的組織」：本明細書中で用いる場合、「標的組織」は、処置されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、或いは欠乏リソソーム酵素が正常に発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹患し易い患者において、検出可能な、または異常に高量の酵素基質が存在する、例えば当該組織の細胞リソソーム中に貯蔵される組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、欠乏リソソーム酵素が高レベルで正常に発現される組織を包含する。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。

「治療的部分」：本明細書中で用いる場合、「治療的部分」という用語は、分子の治療作用を果たす分子の一部分を指す。いくつかの実施形態では、治療的部分は、治療活性を有するポリペプチドである。

「治療的有効量」：本明細書中で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な合理的利益／危険比で、処置対象に治療効果を付与する治療用タンパク質（例えば、補充酵素）の量を指す。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能）または主観的（すなわち、対象は、作用の指示を与えるかまたは作用を感じる）であり得る。特に、「治療的有効量」は、例えば疾患に伴う症候を改善し、疾患の開始を防止するかまたは遅延し、および／または疾患の症候の重症度または頻度を下げることにより、所望の疾患または症状を処置し、改善し、または防止するために、或いは検出可能な治療的または予防的作用を示すために有効な治療用タンパク質または組成物の量を指す。治療的有効量は、一般に、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで投与される。任意の特定治療用タンパク質に関して、治療的有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。更にまた、任意の特定患者に関する具体的治療的有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば処置されている障害、および障害の重症度；用いられる具体的な薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝の速度；処置の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような同様の因子によって決まる。

「耐容可能な」：本明細書中で用いる場合、「耐容可能な」および「耐容性」という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。

「処置」：本明細書中で用いる場合、「処置」（更にまた「処置する」または「処置すること」）という用語は、特定の疾患、障害および／または症状（例えば、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ｂ型）の１つ以上の症候または特徴を、部分的にまたは完全に、緩和し、改善し、軽減し、抑制し、その開始を遅延し、その重症度を低減し、および／またはその発生率を低減する治療用タンパク質（例えば、リソソーム酵素）の任意の投与を指す。このような処置は、関連疾患、障害および／または症状の徴候を示さない対象の、および／または疾患、障害および／または症状の早期徴候のみを示す対象のものであり得る。代替的にまたは付加的に、このような処置は、関連疾患、障害および／または症状の１つ以上の確立された徴候を示す対象のものであり得る。

本発明は、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の有効な直接送達のための改良された方法および組成物を提供する。上記のように、本発明は、リソソーム蓄積症（例えば、ハンター症候群）に関する補充酵素（例えば、Ｉ２Ｓタンパク質）が、被験者における実質的副作用を誘導することなく、高濃度で治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。更に意外なことに、合成ＣＳＦを用いることなく、補充酵素が単なる生理食塩水または緩衝液ベースの処方物中で送達され得る、ということを本発明人等は見出した。更に予期せぬことに、本発明による髄腔内腔内送達は、対象における実質的副作用、例えば重症免疫応答を生じない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内腔内送達は、同時免疫抑制薬療法の非存在下で（例えば、前処置または前状態調節による免疫寛容の誘導なしで）、用いられ得る。

いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内腔内送達は、種々の脳組織を通した効率的拡散を可能にして、表面、浅在および／または深部脳領域における種々の標的脳組織における補充酵素の効果的送達を生じる。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内腔内送達は、末梢循環に進入するのに十分な量の補充酵素を生じた。その結果、いくつかの場合には、本発明による髄腔内腔内送達は、肝臓、心臓、脾臓および腎臓のような末梢組織における補充酵素の送達を生じた。この発見は予期せぬものであり、典型的には定期的髄腔内腔内投与および静脈内投与を必要とするＣＮＳおよび末梢構成成分の両方を有するリソソーム蓄積症の処置のために特に有用であり得る。本発明による髄腔内腔内送達は、末梢症候を処置するに際して治療効果を危うくすることなく、静脈内注射の用量投与および／または頻度低減を可能にし得る、ということが意図される。

本発明は、種々の脳標的組織への補充酵素の効率的且つ便利な送達を可能にして、ＣＮＳ指標を有するリソソーム蓄積症の有効な処置を生じる種々の予期せぬ且つ有益な特徴を提供する。

本発明の種々の態様は、以下の節で詳細に記載される。節の記載内容は、本発明を限定するものではない。各説は、本発明の任意の態様に適用し得る。この出願において、「または」は、別記しない限り「および／または」を意味する。
補充酵素
イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質

いくつかの実施形態では、本発明によって提供された発明の方法および組成物は、ハンター症候群の治療のために、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質をＣＮＳへと送達するために用いられる。好適なＩ２Ｓタンパク質は、自然発生型イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質活性に代替となり得る、若しくはＩ２Ｓ欠損症の１つ以上の表現型または症状を救援し得るいずれかの分子または分子の一部であり得る。いくつかの実施形態では、本発明に関して好適な補充酵素は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質とほぼ同様または同一のＮ末端およびＣ末端ならびにアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

典型的には、ヒトＩ２Ｓは、前駆体形として生成される。ヒトＩ２Ｓの前駆体形は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜２５）と、プロペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基２６〜３３）と、４２ｋＤａ鎖（完全長前駆体の残基３４〜４５５）および１４ｋＤａ鎖（完全長前駆体の残基４４６〜５５０）へと更に処理され得る鎖（完全長前駆体の残基３４〜５５０）とを含有する。典型的には、この前駆体形は、完全長前駆体または完全長Ｉ２Ｓタンパク質とも呼ばれ、これは５５０個のアミノ酸を含有する。ヒトＩ２Ｓタンパク質の典型的野生型または天然型の、除去されたシグナルペプチドおよび完全長前駆体（配列番号２）を有する成熟型のアミノ酸配列（配列番号１）が表１に示されている。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、好適な補充酵素は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または同類体であってもよい。例えば、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＩ２Ｓタンパク質活性を保持すると同時に、野生型または天然型Ｉ２Ｓタンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含有する修飾ヒトＩ２Ｓタンパク質であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号１）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明の好適な補充酵素は、配列番号１に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号１）にほぼ同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、配列番号１に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質の断片または一部分を含有する。

あるいは、本発明に好適な補充酵素は、完全長Ｉ２Ｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、好適な補充酵素は、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体は、実質なＩ２Ｓタンパク質活性を保持すると同時に、野生型または天然型完全長Ｉ２Ｓタンパク質（例えば、配列番号２）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含有する修飾完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明の好適な補充酵素は、配列番号２に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、配列番号２にほぼ同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、配列番号２に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な補充酵素は、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質の断片または一部分を含有する。本明細書で使用するとき、完全長Ｉ２Ｓタンパク質は、典型的には、シグナルペプチド配列を含有する。
他のリソソーム蓄積症および補充酵素

本発明の方法は、任意のリソソーム蓄積症、特にＣＮＳ病因および／または症候を有するリソソーム蓄積症、例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、グロボイド細胞白質ジストロフィー症、クラッベ病、糖原病ＩＩ型、ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホッフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノーシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マンノーシドーシス、異染性白質ジストロフィー症、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型、ムコリピドーシスＩＶ型、Ｉ−細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型、偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群Ａ、ＢまたはＤ型、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、多重スルファターゼ欠乏症、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、ＣＬＮ１バッテン病、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症（これらに限定されない）を処置するために用いられ得ると考えられる。

リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症候発現および分子生物学知見は、Ｓｃｒｉｖｅｒｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ，７．ｓｕｐ．ｔｈＥｄ．，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，（１９９５）に詳述されている。したがって、上記疾患における酵素欠乏は当業者に既知であり、これらのいくつかは、以下の表に例示されている：
表２

本発明の方法は、種々の他の補充酵素を送達するために用いられ得る。本明細書中で用いる場合、本発明に適した補充酵素は、処置されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素の少なくとも一部の活性に取って替わるよう作用し得る任意の酵素を包含し得る。いくつかの実施形態では、補充酵素は、リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、或いは１つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。

いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、処置されるべきリソソーム蓄積症に関連づけられることが既知の任意のリソソーム酵素であり得る。いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、上記の表２に列挙された酵素から選択される酵素である。

いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然配列と実質的相同性または同一性を有する（例えば、野生型または天然配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）修飾配列を有し得る。

本発明に適している補充酵素は、任意の利用可能な手段により産生され得る。例えば、補充酵素は、補充酵素コード核酸を発現するよう工学処理された宿主細胞系を利用することにより、組換え的に産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、内因性遺伝子を活性化することにより産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、化学合成により、部分的にまたは完全に、調製され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、天然供給源からも精製され得る。

酵素が組換え的に産生される場合、任意の発現系が用いられ得る。２〜３ではあるが例を挙げると、既知の発現系としては、例えば卵細胞、バキュロウイルス、植物細胞、酵母または哺乳動物細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本発明に適している酵素は、哺乳動物中で産生される。本発明にしたがって用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例としては、以下のものが挙げられる：
ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または２９３細胞（懸濁液培養中での増殖のためにサブクローン化）、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）；ヒト繊維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ハムスター幼仔腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂａｎｄＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒト細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＨＯ細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて送達される補充酵素は、細胞取込みおよび／またはリソソームターゲッティングを助長するために脳細胞の表面の受容体と結合する部分を含有する。例えば、このような受容体は、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）残基を結合する陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）であり得る。更に、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩとも結合する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、タンパク質の表面にＭ６Ｐ残基を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、ＣＩ−ＭＰＲに対するより高い結合親和性を有するビス−ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、酵素当たりおよそ少なくとも２０％のビス−ホスホリル化オリゴ糖のほぼ平均まで含有する。他の実施形態では、適切な酵素は、酵素当たり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビス−ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。このようなビス−ホスホリル化オリゴ糖は酵素上に天然に存在し得るが、酵素はこのようなオリゴ糖を保有するよう修飾され得る、ということに留意すべきである。例えば、適切な補充酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからリソソーム酵素上のα−１，２−連結マンノースの６’位置へのＮ−アセチルグルコサミン−Ｌ−ホスフェートの移動を触媒し得るある種の酵素により修飾され得る。このような酵素を産生し、使用するための方法および組成物は、例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ等により米国特許第６，５３７，７８５号および米国特許第６，５３４，３００号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）に記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明に用いるための補充酵素は、脳細胞の表面の受容体と結合し得るリソソームターゲッティング部分と共役されるかまたは融合され得る。適切なリソソームターゲッティング部分は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、ならびにその変異体、相同体または断片（例えば、野生型成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一な配列を有するペプチド）であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、ＢＢＢを横断し、ＣＮＳ中にこのような作用物質を送達するかまたは輸送するのを増強するよう修飾されていない。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、標的部分（例えば、リソソーム標的配列）および／または膜透過ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的配列および／または膜透過ペプチドは、治療成分の内因性部分（例えば、化学結合を介して、融合タンパク質を介しての）である。いくつかの実施形態では、標的配列は、マンノース−６−リン酸塩部分を含有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＩＧＦ−１部分を含有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＩＧＦ−ＩＩ部分を含有する。
製剤

いくつかの実施形態では、所望の酵素は、髄腔内腔内送達のために安定製剤中で送達される。本発明のある実施形態は、少なくとも一部は、本明細書中に開示される種々の製剤が、ＣＮＳの標的化組織、細胞および／または細胞小器官への１つ以上の治療薬（例えば、酵素）の有効な送達および分布を促す、という発見に基づいている。特に、本明細書中に記載される製剤は、高濃度の治療薬（例えば、タンパク質または酵素）を可溶化し得るし、ＣＮＳ構成成分および／または病因を有する疾患の処置のために対象のＣＮＳにこのような治療薬を送達するのに適している。本明細書中に記載される組成物は、それを必要とする対象のＣＮＳに（例えば髄腔内腔内に）投与される場合、安定性改善および耐容性改善により更に特性化される。

本発明の前に、伝統的非緩衝化等張生理食塩水およびエリオットのＢ溶液（人工ＣＳＦ）が、典型的には髄腔内腔内送達のために用いられた。エリオットのＢ溶液に対するＣＳＦの組成を表す比較は、以下の表３に含まれている。表３に示されているように、エリオットＢ溶液の濃度は、ＣＳＦの濃度と密接に類似している。しかしながら、エリオットのＢ溶液は、極度に低い緩衝剤濃度を含有し、したがって、特に長期間に亘って（例えば、貯蔵状態の間）、治療薬（例えばタンパク質）を安定化するために必要とされる適切な緩衝能力を提供し得ない。更に、エリオットのＢ溶液は、いくつかの治療薬、特にタンパク質または酵素を送達するよう意図された製剤と非相溶性であり得るある種の塩を含有する。例えば、エリオットのＢ溶液中に存在するカルシウム塩は、タンパク質沈降を媒介し、それにより製剤の安定性を低減し得る。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内腔内送達に適した製剤は、合成または人工ＣＳＦではない。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内送達のための製剤は、それらが、それとともに処方される１つ以上の治療薬（例えば、組換えタンパク質）を安定化し、或いはその分解を遅くするかまたは防止し得るよう、製剤化されている。本明細書中で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間に亘ってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大多数）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間（例えば、好ましくは少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）に亘って査定され得る。製剤の状況では、安定製剤は、貯蔵時および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）の間、その中の治療薬が本質的にはその物理的および／または化学的完全性ならびに生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成、および電荷プロフィールの移動により測定され得る。

治療薬の安定性は、特別な重要性を有する。治療薬の安定性は、長期間に亘る治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性に関して更に査定され得る。例えば、所定の時点での安定性は、早期時点（例えば、処方０日目）での安定性に対して、或いは非製剤化治療薬に対して比較され得る。この比較の結果は、パーセンテージとして表される。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、長期間に亘って（例えば、室温で、または加速貯蔵条件下で、少なくとも６〜１２ヶ月間に亘って測定）、治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性の少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％または少なくとも５０％を保持する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、所望の酵素）は、本発明の製剤中で可溶性である。「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成するこのような治療薬の能力を指す。好ましくは、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう製剤化される。

水性形態、前凍結乾燥形態、凍結乾燥または再構成形態のいずれかの好適な製剤は、種々の濃度で対象の治療薬剤を含有してよい。いくつかの実施形態では、製剤は、対象のタンパク質または治療薬剤を、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ）で含有してよい。いくつかの実施形態では、本発明のよる製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌの濃度で治療薬剤を含有してよい。

本発明の製剤は、水性溶液としてまたは再構成された凍結乾燥溶液として、それらの忍容性によって特徴付けられる。本明細書で使用するとき、用語「忍容可能」および「忍容性」とは、このような組成物が投与される対象において有害反応を誘発することがない、あるいはこのような組成物が投与される対象において重篤な有害反応を誘発することがない、本発明の医薬組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、このような組成物が投与される対象者によって、良好に耐容される。

多数の治療薬、特に本発明のタンパク質および酵素は、本発明の薬学的組成物中でそれらの溶解性および安定性を保持するために、制御されたｐＨおよび特定の賦形剤を要する。以下の表４は、本発明のタンパク質治療薬の溶解性および安定性を保持するために重要であるとみなされるタンパク質製剤の典型的例示的態様を特定する。
緩衝液

製剤のｐＨは、水性製剤中または前凍結乾燥製剤用の治療薬剤（例えば、酵素またはタンパク質）の溶解度を変更することが可能である追加的因子である。したがって、本発明の製剤は１つ以上の緩衝液を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、水性製剤は、約４．０〜８．０（例えば、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．２、６．４、６．５、６．６、６．８、７．０、７．５、または８．０）の間で前記組成物の最適ｐＨを維持するために十分な緩衝液の量を含む。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約５．０〜７．５の間、約５．５〜７．０の間、約６．０〜７．０の間、約５．５〜６．０の間、約５．５〜６．５の間、約５．０〜６．０の間、約５．０〜６．５の間および約６．０〜７．５の間である。好適な緩衝液としては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）および他の有機酸が挙げられる。本発明の医薬組成物の緩衝液濃度およびｐＨ範囲は、製剤の忍容性の制御または調整における因子である。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約１ｍＭから約１５０ｍＭの間の、または約１０ｍＭから約５０ｍＭの間の、または約１５ｍＭから約５０ｍＭの間の、または約２０ｍＭから約５０ｍＭの間の、若しくは約２５ｍＭから約５０ｍＭの間の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、好適な緩衝剤は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭまたは１５０ｍＭの濃度で存在する。
浸透圧

いくつかの実施形態では、水性形態、前凍結乾燥形態、凍結乾燥または再構成形態のいずれかでの製剤は、製剤を等張に保つための等張剤を含有する。一般的に、「等張」とは、対象の製剤が、ヒトの血液と本質的に同一の浸透圧を有することを意味する。等張製剤は、約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を概ね有するであろう。等張性は、例えば、蒸気圧または凝固点型浸透圧計を用いて測定され得る。例示的等張剤としては、グリシン、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウムおよびアルギニンが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、好適な等張剤は、約０．０１〜５重量％（例えば、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０または５．０重量％）の濃度で、水性および／または前凍結乾燥製剤で存在し得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥用の製剤は、前凍結乾燥製剤または再構成製剤を等張に保つために等張剤を含有する。

一般的には、等張溶液は、非経口投与される薬剤に好適であるが、等張剤の使用は、いくつかの治療薬剤、特にいくつかのタンパク質および／または酵素に対して溶解度を変化させ得る。僅かに高張な溶液（例えば、ｐＨ７．０で、５ｍＭのリン酸ナトリウム中の１７５ｍＭまでの塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、ｐＨ７．０で、５ｍＭのリン酸ナトリウム中の２％までのショ糖）は、良好に耐容されることが立証されている。最も一般的に承認されているＣＮＳ投与処方組成物は、生理食塩水（水中、約１５０ｍＭのＮａＣｌ）である。
安定化剤

いくつかの実施形態では、製剤は、タンパク質を保護するために、安定化剤、またはリオプロテクタントを含有してよい。典型的には、好適な安定化剤は、糖、非環元糖および／またはアミノ酸である。例示的な糖としては、デキストラン、乳糖、マンニトール、マンノース、ソルビトール、ラフィノース、ショ糖およびトレハロースが挙げられるが、これに限定されない。例示的なアミノ酸としては、アルギニン、グリシンおよびメチオニンが挙げられるが、これに限定されない。追加的な安定化剤としては、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリビニルピロリドンを挙げることができる。凍結乾燥製剤中の安定化剤の量は、概ねその製剤が等張であるような量である。しかしながら、高張の再構成製剤もまた好適であり得る。更に、安定化剤の量は、治療薬剤の分解／凝集の許容不能な量が生じるようなあまりに低い量であってはならない。製剤中の例示的な安定化剤濃度は、約１ｍＭから約４００ｍＭの範囲（例えば、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、および約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、あるいは、０．１％から１５重量％（例えば、１％〜１０重量％、５％〜１５重量％、５％〜１０重量％）の範囲でもよい。いくつかの実施形態では、安定化剤および治療薬剤の質量の比は、約１：１である。他の実施形態では、安定化剤および治療薬剤の質量の比は、約０．１：１、０．２：１、０．２５：１、０．４：１、０．５：１、１：１、２：１、２．６：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、または２０：１であることができる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥に好適な安定化剤はまた、リオプロテクタントである。

いくつかの実施形態では、本発明に好適な液体製剤は、アモルファス材料を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な液体製剤は、アモルファス材料の相当量を含有する（例えばショ糖系製剤）。いくつかの実施形態では、本発明に好適な液体製剤は、部分的に結晶性の材料／部分的にアモルファスな材料を含有する。
増量剤

いくつかの実施形態では、液体凍結乾燥に好適な製剤は、１つ以上の増量剤を更に含んでよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を添加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に関与する。例えば、増量剤は、凍結乾燥ケーク（例えば、本質的に均一な凍結乾燥ケーク）の外観を改善し得る。好適な増量剤としては、限定されるものではないが、塩化ナトリウム、乳糖、マンニトール、グリシン、ショ糖、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。増量剤の例示的な濃度は、約１％から約１０％（例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、および１０．０％）である。
界面活性剤

いくつかの実施形態では、製剤に界面活性剤を付加することが望ましい。界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタルニドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−または二ナトリウムメチルオフェイル−タウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（ＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８等）が挙げられる。典型的には、付加される界面活性剤の量は、それがタンパク質の凝集を低減し、粒子の形成または泡立ちを最小限にするような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１〜０．５％（例えば、約０．００５〜０．０５％または０．００５〜０．０１％）の濃度で製剤中に存在し得る。特に、界面活性剤は、約０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％等の濃度で製剤中に存在し得る。

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ編集（１９８０年）に記載されているものなどの他の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤が、製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないという条件で、製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）中に包含されてもよい。許容可能な担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度で受容者に非毒性であり、限定されるものではないが、追加的緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ポリエステルなどの生体分解性ポリマー；および／またはナトリウムなどの塩形成対イオンが挙げられる。

本発明による水性形態、前凍結乾燥形態、凍結乾燥または再構成形態のいずれかでの製剤は、品質分析、再構成時間（凍結乾燥された場合）、再構成の質（凍結乾燥された場合）、高分子量、水分およびガラス転移温度に基づいて査定され得る。典型的には、タンパク質の質および生成物分析は、例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換−ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回析（ＸＲＤ）、変調型示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、蛍光、紫外線吸収、ネフェロメトリー、毛細管電気泳動（ＣＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその組合せ（これらに限定されない）を含めた方法を用いる生成物分解率分析を包含する。いくつかの実施形態では、本発明による生成物の評価は、外観（液体またはケーク外観のいずれか）を評価するステップを包含する。

一般的に、製剤（凍結乾燥化または水性）は、室温で長期間保存され得る。貯蔵温度は、典型的には、０℃〜４５℃（例えば、４℃、２０℃、２５℃、４５℃等）の範囲であり得る。製剤は、数ヶ月〜数年の間貯蔵され得る。貯蔵時間は、一般的に、２４ヶ月、１２ヶ月、６ヶ月、４．５ヶ月、３ヶ月、２ヶ月または１ヶ月である。製剤は、投与のために用いられる容器中に直接貯蔵されて、移送ステップを排除し得る。

生成物は、凍結乾燥容器（凍結乾燥される場合）中に直接貯蔵され得るが、これは、再構成容器としても機能して、移送ステップを排除し得る。代替的には、凍結乾燥物質製剤は、貯蔵のためにより小さい増分で測定され得る。貯蔵は、一般的に、タンパク質の分解を生じさせる環境、例えば日光、紫外線他の形態の電磁放射線、過剰な熱または寒冷、急速な熱ショック、ならびに機械的衝撃への曝露（これらに限定されない）を避けるべきである。
凍結乾燥

本発明による発明の方法は、いずれかの材料、特に治療薬剤を凍結乾燥するために使用され得る。典型的には、前凍結乾燥製剤は、凍結乾燥および貯蔵中に、対象の化合物が分解すること（例えばタンパク質凝集、脱アミド、および／または酸化）を抑制するために、賦形剤または安定化剤、緩衝剤、増量剤、および界面活性剤などの他の成分の適切な選択を更に含む。凍結乾燥用の製剤は、リオプロテクタントまたは安定化剤、緩衝液、増量剤、等張剤および界面活性剤を含む１つ以上の追加的成分を含むことができる。

対象の物質と任意の追加的成分が一緒に混合される後に、この製剤が凍結乾燥される。凍結乾燥は、一般的に３つの主要ステージを含み、これらは凍結、主乾燥および二次的乾燥である。凍結は、水を氷に変換するかまたはいくつかのアモルファス製剤成分を結晶性形態に変換するために必要である。主乾燥は、低圧および低温での直接的昇華によって氷が凍結した生成物から除去される場合の処理工程である。二次的乾燥は、蒸発表面への残留する水の拡散を用いて生成物マトリックスから結合した水が除去される場合の処理工程である。二次的乾燥中の生成物温度は、主乾燥中よりも通常高い。ＴａｎｇＸ．ら著（２００４年）「Ｄｅｓｉｇｎｏｆｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓｆｏｒｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｄｖｉｃｅ」，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２１：１９１〜２００頁；ＮａｉｌＳ．Ｌら著（２００２年），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．の「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｏｆｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ」，編者ＮａｉｌＳ．Ｌ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ／ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２８１〜３５３頁；Ｗａｎｇら著（２０００年）「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｏｌｉｄｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３：１〜６０頁；ＷｉｌｌｉａｍｓＮ．Ａら著（１９８４年）「ＴｈｅＬｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ａｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗ」Ｊ．ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＳｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３８：４８〜５９頁を参照されたい。概ね、任意の凍結乾燥処理が、本発明に関連して用いられ得る。

いくつかの実施形態では、アニーリング工程が、生成物の最初の凍結中に導入されてもよい。アニーリング工程は、全体のサイクル時間を減らし得る。いずれかの理論に束縛されようとするものではないが、アニーリング工程は、過冷却中に形成される小さな結晶の再結晶化のために、賦形剤結晶化およびより大きな氷結晶の形成を促進するのに役立ち、これが今度は再構成を改善すると考えられる。典型的には、アニーリング工程は、凍結中の温度でのインターバルまたはオッシレーションを含む。例えば、凍結温度は−４０℃であり得、アニーリング工程は、例えば−１０℃に温度を上昇させ、この温度を設定された期間時間で維持するだろう。アニーリング工程時間は、０．５時間から８時間の範囲（例えば、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、６、および８時間）であってもよい。アニーリング温度は、凍結温度と０℃との間であってもよい。

凍結乾燥は、チューブ、バッグ、ボトル、トレイ、バイアル（例えば、ガラスバイアル）、注射器または他の好適な容器などの容器内で実行され得る。この容器は、使い捨てであってもよい。凍結乾燥はまた、大スケールまたは小スケールで行われてもよい。いくつかの例では、移動ステップを回避するためにタンパク質の再構成が実行されるべき容器内で、タンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましい。この例での容器は、例えば、３、４、５、１０、２０、５０または１００ｃｃのバイアルであってもよい。

Ｈｕｌｌパイロットスケールドライヤー（ＳＰＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＵＳＡ）、Ｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＰＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）研究室用凍結乾燥器、または所定の凍結乾燥処理パラメータを制御することが可能な任意の凍結乾燥器などの多様な凍結乾燥器が、この目的のために使用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結し、続いて主乾燥のために好適な温度で凍結内容物から氷を昇華することによって達成される。最初の凍結は、典型的には約４時間以内で（例えば、約３時間以内で、約２．５時間以内で、約２時間以内で）、約−２０℃以下の温度（例えば−５０℃、−４５℃、−４０℃、−３５℃、−３０℃、−２５℃など）に製剤を持っていく。この条件下で、生成物温度は、典型的には、製剤の共晶点またはコラスプ温度以下である。典型的には、主乾燥のための貯蔵温度は、典型的には２０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲の好適な圧力で、約−３０℃から２５℃の範囲であるだろう（生成物が主乾燥中に融点以下のままであるという条件で）。製剤、サンプルを保持する容器（例えばガラスバイアル）の寸法および型、ならびに液体の体積は、数時間から数日の範囲であり得る乾燥に必要とされる時間を主に指定するだろう。二次的乾燥ステージは、容器の型および寸法ならびに治療用タンパク質の型に主に依存して、約０〜６０℃で実行される。再び、液体の体積は、数時間から数日の範囲であり得る乾燥に必要とされる時間を主に指定するであろう。

一般的な定理として、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、および約０．５％未満である凍結乾燥製剤を生じさせるだろう。
再構成

本発明の医薬組成物は、被験者に投与される際には概ね水性形態であるが、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は凍結乾燥されている。このような組成物は、被験者に投与される前に、１つ以上の希釈剤をそれに添加することによって再構成されねばならない。所望の段階で、典型的には患者に投与される前の適切な時間に、再構成された製剤中のタンパク質濃度が望ましいものであるように、凍結乾燥製剤は、希釈剤で再構成され得る。

本発明により種々の希釈剤が用いられてよい。いくつかの実施形態では、製剤用の好適な希釈剤は、水である。この希釈剤として使用される水は、逆浸透、蒸留、脱イオン、濾過（例えば、活性炭、マイクロ濾過、ナノ濾過）およびこれらの処理法の組み合わせが挙げられる種々の方法で処理され得る。一般的には、水は、注射用に好適であるべきであり、注射用の無菌水または静菌水が挙げられるが、これに限定されない。

追加の例示的希釈剤としては、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸塩−緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩水、Ｅｌｌｉｏｔの溶液、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。好適な希釈剤は、必要に応じて、防腐剤を含有する。例示的防腐剤としては、ベンジルまたはフェノールアルコールなどの芳香族アルコールが挙げられる。使用される防腐剤の量は、タンパク質および防腐剤効力試験で、併用可能性についての異なる防腐剤濃度を評価することによって決定される。例えば、防腐剤が芳香族アルコール（ベンジルアルコールなどの）である場合、これは約０．１〜２．０％、約０．５〜１．５％、または約１．０〜１．２％の量で存在することができる。

本発明に好適な希釈剤は、ｐＨ緩衝剤（例えばトリス、ヒスチジン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）および上記のもの（例えば、安定化剤、等張剤）を含む他の添加剤（例えば、ショ糖）が挙げられる種々の添加剤を含んでよいが、これに限定されない。

本発明によると、凍結乾燥物質（例えば、タンパク質）は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）の濃度およびこれらの間の任意の範囲の濃度に再構成され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥物質（例えば、タンパク質）は、約１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、約１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ約〜１００ｍｇ／ｍｌ）の濃度に再構成され得る。いくつかの実施形態では、再構成された製剤中のタンパク質の濃度は、前凍結乾燥製剤中の濃度より高くてもよい。再構成された製剤中の高タンパク質濃度は、再構成された製剤の皮下または筋肉内送達が意図される場合特に有用であると考えられる。いくつかの実施形態では、再構成された製剤中のタンパク質濃度は、前凍結乾燥製剤の約２〜５０倍（例えば、約２〜１０倍、約２〜１０倍、または約２〜５倍）であり得る。いくつかの実施形態では、再構成された製剤中のタンパク質濃度は、前凍結乾燥製剤の少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約３、４、５、１０、２０、４０倍）であり得る。

本発明による再構成は、任意の容器内で実行されてもよい。本発明に好適な例示的容器としては、チューブ、バイアル、注射器（例えば、一室または二室）、バッグ、ボトル、およびトレイなどが挙げられるが、これに限定されない。好適な容器は、ガラス、プラスチック、金属などの任意の材料で作られ得る。この容器は、使い捨てまたは再利用可能であってもよい。再構成はまた、大スケールまたは小スケールで実行されてもよい。

いくつかの例では、移動工程を回避するために、タンパク質の再構成が実行されるべき容器内でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましい。この例での容器は、３、４、５、１０、２０、５０または１００ｃｃバイアルであってもよい。いくつかの実施形態では、凍結乾燥および再構成に好適な容器は、二室注射器（例えば、Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔ（登録商標）（Ｖｅｔｔｅｒ）注射器）である。例えば二室注射器は、ストッパーによって分離された（実施例５を参照）別個のチャンバのそれぞれに、凍結乾燥物質および希釈剤の双方を含有し得る。再構成するために、本明細書に記載されるように、希釈剤側でプランジャーがストッパーに取り付けられ、希釈剤が凍結乾燥物質と接触できるように押して、希釈剤を生成物チャンバへと移動させ、再構成が行われ得る（実施例５参照）。

本発明の医薬組成物、製剤、および関連する方法は、種々の治療薬剤を被験者のＣＮＳに送達させる（例えば、髄腔内、脳室内は脳嚢内）ために、ならびに関連する疾患の治療のために有用である。本発明の医薬組成物は、タンパク質および酵素を、リソソーム蓄積疾患を発症した被験者に送達するために（例えば、酵素補充療法）特に有用である。リソソーム蓄積疾患は、リソソーム機能の欠損からもたらされる比較的稀な遺伝性代謝障害の群を示す。リソソーム疾患は、リソソーム内の未消化マクロ分子の蓄積によって特徴付けられ、このようなリソソームの寸法および数の増加をもたらし、最終的には細胞機能障害および臨床的異常を生じさせる。
ＣＮＳ送達

本明細書で記載された種々の安定な製剤は、治療薬剤のＣＮＳ送達に概ね好適であると考えられる。本発明による安定製剤は、限定されるものではないが、実質内投与、脳内投与、脳室内（ＩＣＶ）投与、髄腔内腔内（例えば、ＩＴ−腰椎、ＩＴ−大槽）投与が挙げられる種々の技術および経路を介して、ならびにＣＮＳおよび／またはＣＳＦに直接的または間接的に注入するための任意の他の技術および経路を介してＣＮＳ送達のために用いられ得る。
髄腔内腔内送達

いくつかの実施形態では、補充酵素は、本明細書に記載された製剤中でＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態では、補充酵素は、治療を必要とする被験者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に投与することによって、ＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、所望の補充酵素（例えば、Ｉ２Ｓタンパク質）をＣＳＦ中に送達するために用いられる。本明細書で使用するとき、髄腔内腔内投与（髄腔内腔内注射とも呼ばれる）とは、脊椎管（脊髄を囲む髄腔内腔内空隙）への注射を指す。限定されないが、穿頭孔若しくは大槽穿刺または腰椎穿刺などを経ての外側脳室注射が挙げられる種々の技術が用いられてもよい。例示的方法は、その内容が参照により本明細書に組み込まれた、Ｌａｚｏｒｔｈｅｓら著，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１４３〜１９２頁およびＯｍａｙａら著，ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，１：１６９〜１７９頁に記載されている。

本発明によると、酵素は、脊髄周辺の任意の領域で注入され得る。いくつかの実施形態では、酵素は、腰部または大槽に注入されるか、または脳室空間に脳室内注入される。本明細書で使用するとき、用語「腰部」または「腰部領域」とは、第３と第４腰椎（背下部）との間の領域を指し、より包括的には、脊椎のＬ２−Ｓ１領域を指す。典型的には、腰部または腰部領域を介しての髄腔内注入もまた、「腰椎ＩＴ送達」または「腰椎ＩＴ投与」と呼ばれる。用語「大槽」とは、頭蓋骨と脊椎の先端部分との間の開口部を介する小脳周囲および下部の空間を指す。典型的には、大槽を介しての髄腔内腔内注射はまた、「大槽送達」とも呼ばれる。用語「脳室」とは、脊髄中心管と連続的である脳内の空隙を指す。典型的には、脳室空隙を介しての注入は、脳室内（ＩＣＶ）送達と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内腔内投与」または「髄腔内腔内送達」とは、例えば、第３と第４腰椎（背下部）との間に送達される、またはより包括的には脊椎のＬ２−Ｓ１領域に送達される、腰椎ＩＴ投与または送達を指す。大槽送達が、とりわけ、典型的には遠位脊髄管に良好に送達しない一方で、我々の発明による腰椎ＩＴ投与または送達が、遠位脊髄管により良好かつより効果的な送達を生じさせるという点で、腰椎ＩＴ投与または送達が大槽送達に対して区別されると考えられる。
髄腔内腔内送達のための装置

本発明による髄腔内腔内送達のために、種々の装置が用いられ得る。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与のための装置は、流体アクセスポート（例えば注射用口）；流体アクセスポートと流体連絡する第一流出口、および脊髄中への挿入のために設計された第二流出口；ならびに脊髄における中空体の挿入を固定するための固定機構を含有する。図６２に示した非限定例として、適切な固定機構は、中空体の表面に載せられる１つ以上のノブ、および１つ以上のノブを覆って、中空体が脊髄から滑り落ちないようにする調整可能な縫合環を含有する。種々の実施形態では、流体アクセスポートはレザバーを含む。いくつかの実施形態では、流体アクセスポートは、機械的ポンプ（例えば、注入ポンプ）を含む。いくつかの実施形態では、埋込みカテーテルは、レザバー（例えば、ボーラス送達のため）または注入ポンプと連結される。流体アクセスポートは、埋め込まれるかまたは外側に存在し得る。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち、緩徐ボーラス投与）により、またはポート・カテーテル送達系（すなわち注入またはボーラス投与）を介して実施され得る。いくつかの実施形態では、カテーテルは腰椎の薄板間に挿入され、尖端は、包膜空隙に所望のレベル（一般的にＬ３〜Ｌ４）に装填される（図６３）。

静脈内投与に比して、髄腔内腔内投与に適した単回用量投与容積は典型的に小さい。典型的には、本発明による髄腔内腔内送達は、ＣＳＦの組成の平衡、ならびに対象の頭蓋内圧を保持する。いくつかの実施形態では、髄腔内腔内送達は、対象からのＣＳＦの対応する除去がない時に実施される。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、例えば約１０ｍｌ、８ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１．５ｍｌ、１ｍｌまたは０．５ｍｌ未満であり得る。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、約０．５〜５ｍｌ、０．５〜４ｍｌ、０．５〜３ｍｌ、０．５〜２ｍｌ、０．５〜１ｍｌ、１〜３ｍｌ、１〜５ｍｌ、１．５〜３ｍｌ、１〜４ｍｌまたは０．５〜１．５ｍｌであり得る。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内腔内送達は、所望量のＣＳＦを除去するステップを最初に包含する。いくつかの実施形態では、約１０ｍｌ未満（例えば、約９ｍｌ、８ｍｌ、７ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ未満）のＣＳＦが先ず除去された後、ＩＴ投与がなされる。それらの場合、適切な単回用量投与容積は、例えば約３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌまたは２０ｍｌより大きい。

治療用組成物の髄腔内腔内投与を実行するために、種々の他の装置が用いられ得る。例えば、所望の酵素を含有する製剤は、髄膜癌腫症のための薬剤を髄腔内腔内投与するために一般に用いられるオンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）レザバーを用いて投与され得る（Ｌａｎｃｅｔ２：９８３−８４，１９６３）。更に具体的には、この方法では、脳室チューブは前角中に形成される穴を通して挿入され、頭皮下に設置されるオンマヤレザバーに連結され、レザバーは皮下穿刺されて、レザバー中に注入される補充されるべき特定酵素を髄腔内腔内送達する。個体への治療用組成物または製剤の髄腔内腔内投与のための他の装置は、米国特許第６，２１７，５５２号（この記載内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。代替的には、薬剤は、例えば単回注射または連続注入により、髄腔内腔内投与され得る。投薬処置は、単回用量投与または多数回用量投与の一形態であり得る、と理解されるべきである。

注射のためには、本発明の製剤は、液体溶液中に処方され得る。さらに、酵素は固体形態で処方され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も包含される。注射は、例えば、酵素のボーラス注射または連続注入（例えば、注入ポンプを用いる）の形態であり得る。

本発明の一実施形態では、酵素は、対象の脳への外側脳室注射により投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に作られる穿頭孔を通してなされ得る。別の実施形態では、酵素および／または他の薬学的処方物は、対象の脳室中に外科的に挿入されるシャントを通して投与される。例えば、注射は、より大きい外側脳室中になされ得る。いくつかの実施形態では、より小さい第三および第四脳室への注射もなされ得る。

更に別の実施形態では、本発明に用いられる薬学的組成物は、対象の大槽または腰椎区域への注射により投与される。

本発明の方法の別の実施形態では製薬上許容可能な処方物は、製薬上許容可能な製剤が対象に投与された後、少なくとも１、２、３、４週間またはそれ以上の間、対象に、本発明で用いられる酵素または他の薬学的組成物の持続性送達、例えば「緩徐放出」を提供する。

本明細書中で用いる場合、「持続性送達」という用語は、投与後、長期間に亘って、好ましくは少なくとも数日間、１週間または数週間、ｉｎｖｉｖｏで本発明の薬学的処方物を連続送達することを指す。組成物の持続性送達は、例えば、長時間に亘る酵素の連続治療効果により実証され得る（例えば、酵素の持続性送達は、対象における貯蔵顆粒の量の連続的低減により実証され得る）。代替的には、酵素の持続性送達は、長時間に亘るｉｎｖｉｖｏでの酵素の存在を検出することにより実証され得る。
標的組織への送達

上記のように、本発明の意外な且つ重要な特徴の１つは、本発明の方法を用いて投与される治療薬、特に補充酵素、ならびに本発明の組成物は、脳表面全体に効果的に且つ広範囲に拡散し、脳の種々の層または領域、例えば深部脳領域に浸透し得る、という点である。さらに、本発明の方法および本発明の組成物は、現存するＣＮＳ送達方法、例えばＩＣＶ注射では標的化するのが困難である腰部領域を含める脊髄の組織、ニューロンまたは細胞に治療薬（例えば、Ｉ２Ｓ酵素）を効果的に送達する。更に、本発明の方法および組成物は、血流ならびに種々の末梢器官および組織への十分量の治療薬（例えば、Ｉ２Ｓ酵素）を送達する。

したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、Ｉ２Ｓ酵素）は、対象の中枢神経系に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、Ｉ２Ｓ酵素）は、脳、脊髄および／または末梢期間の標的組織の１つ以上に送達される。本明細書中で用いる場合、「標的組織」という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、或いは欠損リソソーム酵素が正常では発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織としては、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹り易い患者において、例えば組織の細胞リソソーム中に貯蔵される酵素基質が検出可能量でまたは異常に高い量で存在する組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、欠損リソソーム酵素が抗レベルで正常では発現される組織が挙げられる。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。
脳標的組織

概して、脳は、異なる領域、層および組織に分けられ得る。例えば、髄膜組織は、脳を含めた中枢神経系を包む膜系である。髄膜は、３つの層、例えば硬膜、くも膜および軟膜を含有する。概して、髄膜の、ならびに脳脊髄液の主な機能は、脳神経系を保護することである。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、髄膜の１つ以上の層に送達される。

脳は、大脳、小脳および脳幹を含めた３つの主な細区画を有する。大脳半球は、ほとんどの他の脳構造の上に位置し、皮質層で覆われている。大脳の下層には脳幹が横たわり、これは茎に似ており、その上に大脳が取り付けられている。脳の後部、大脳の下および脳幹の背後には、小脳が存在する。

脳の正中線近くおよび中脳の上に位置する間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上部、腹側視床および視蓋腹部を含有する。中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）は、ｍｉｄｂｒａｉｎとも呼ばれ、視蓋、外被、ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｍｅｓｏｃｏｅｌｉａ、ならびに大脳脚、赤核および第三脳神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、警戒および温度調節に関連する。

脳を含めた中枢神経系の組織の領域は、組織の深さに基づいて特性化され得る。ＣＮＳ（例えば脳）組織は、表面または浅在組織、中深部組織および／または深部組織として特性化され得る。

本発明によれば、治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、対象において処置されるべき特定疾患に関連した任意の適切な脳標的組織（単数または複数）に送達され得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、表面および浅在脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、中深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、表面または浅在脳標的組織、中深部脳標的組織および／または深部脳標的組織の組合せに送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、脳の外表面の少なくとも４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍまたはそれより下（または内側）の深部脳組織に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、大脳の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、フィルヒョー・ロバン腔隙、ＶＲ腔隙内の血管、海馬、脳の下面の視床下部の部分、視神経および視索、嗅球および嗅突起ならびにその組合せから選択される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、大脳の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍより下（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍ）に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、大脳皮質リボンを包含する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、間脳（例えば、視床下部、視床、腹側視床および視床腹部等）、後脳、レンズ核、基底核、尾状核、被核、扁桃、淡蒼球およびその組合せの１つ以上を包含する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の１つ以上の組織に送達される。ある実施形態では、小脳の１つ以上の標的化組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚およびその組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の１つ以上の深部組織、例えばプルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層に比して深部）および深部小脳核組織（これらに限定されない）に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脳幹の１つ以上の組織に送達される。いくつかの実施形態では、脳幹の１つ以上の標的化組織は、脳幹白質組織および／または脳幹核組織を包含する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、種々の脳組織、例えば灰白質、白質、脳室周囲域、軟膜−くも膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または延髄の深部領域、およびその組合せ（これらに限定されない）に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脳中の種々の細胞、例えばニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞（これらに限定されない）に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、深部白質の希突起グリア細胞に送達される。
脊髄

概して、脊髄の領域または組織は、組織の深度に基づいて特性化され得る。例えば、脊髄組織は、表面または浅在組織、中深部組織、および／または深部組織として特性化され得る。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、軟膜および／または白質路を含有する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内部に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄灰白質および／または上衣細胞を含有する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄のニューロンに送達される。末梢標的組織

本明細書中で用いる場合、末梢器官または組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部ではない任意の器官または組織を指す。末梢標的組織としては、血管系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣および精巣が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば補充酵素）は、末梢標的組織の１つ以上に送達される。
生体分布および生物学的利用能

種々の態様において、標的組織に一旦送達されると、治療薬（例えばＩ２Ｓ酵素）は、細胞内に局在化される。例えば、治療薬（例えば酵素）は、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞のようなニューロン）のエキソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリアまたは空胞に局在化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与酵素は、酵素が血管周囲腔隙内に移動するよう（例えば、拍動補助対流機構により）、移動力学を実証する。更に、投与タンパク質または酵素と神経細繊維との会合に関する活性軸索輸送機構も、中枢神経系の深部組織中への、髄腔内腔内投与タンパク質または酵素の分布に寄与し得るし、そうでなければそれを助長し得る。

いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、本明細書中に記載される種々の標的組織において、治療的または臨床的有効レベルまたは活性を達成し得る。本明細書中で用いる場合、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織において治療作用を付与するのに十分なレベルまたは活性である。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定）または主観的（すなわち、対象が作用の指標または感覚を提示する）であり得る。例えば、治療的または臨床的有効レベル若しくは活性は、標的組織における疾患に伴う症候（例えば、ＧＡＧ貯蔵）を改善するのに十分である酵素レベルまたは活性であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、標的組織における対応するリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％である酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、対照（例えば、処置を伴わない内因性レベルまたは活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増大される酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、標的組織中で、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ若しくは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腰部領域を標的化するために特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、少なくとも約５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの腰部領域における酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。

概して、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、ＣＳＦならびに脳、脊髄および末梢器官の標的組織中で十分に長い半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、少なくとも約３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、３日まで、７日まで、１４日まで、２１日まで、または１ヶ月までの半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、投与の１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間または１週間後に、ＣＳＦまたは血流中に検出可能なレベルまたは活性を保持し得る。検出可能なレベルまたは活性は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて決定され得る。

ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、投与後（例えば、対象への薬学的組成物の髄腔内腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、対象のＣＮＳ組織および細胞中で、少なくとも３０μｇ／ｍｌの濃度を達成する。ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、対象の標的化組織または細胞（例えば、脳組織またはニューロン）中で、このような対象への投与後（例えば、対象へのこのような薬学的組成物の髄腔内腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも０．５μｇ／ｍｌの濃度を達成する。
ハンター症候群および他のリソソーム蓄積疾患の治療

リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠陥に起因するかなり稀な遺伝性代謝障害の一群を表す。リソソーム症は、リソソーム内の酵素基質を含めた未消化高分子物質の蓄積（表１参照）により特性化され、これが、このようなリソソームのサイズおよび数の増大を、そして最終的には細胞機能不全および臨床的異常を生じる。

本明細書中に記載される本発明の方法は、標的化細胞小器官への１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の補充酵素）の送達を有益に助長し得る。例えば、ハンター症候群のようなリソソーム蓄積症は罹患細胞のリソソーム中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積により特性化されるため、リソソームは、リソソーム蓄積障害の処置のための所望の標的細胞小器官を表す。

本発明の方法および組成物は、ＣＮＳ病因または構成成分を有する疾患を処置するために特に有用である。ＣＮＳ病因または構成成分を有するリソソーム蓄積症としては、例えばサンフィリッポ症候群Ａ型、サンフィリッポ症候群Ｂ型、ハンター症候群、異染性白質ジストロフィー症およびグロボイド細胞白質ジストロフィー症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の前に、伝統的療法は、対象に静脈内投与されることに限定されており、一般的には、根元的酵素欠乏症の体細胞性症候を処置するに際して有効であるに過ぎない。本発明の組成物および方法は、このようなＣＮＳ病因を有する疾患に罹患している対象のＣＮＳ中に直接、有益に投与され、それによりＣＮＳ（例えば脳）の罹患細胞および組織内の治療的濃度を達成し、したがって、このような治療薬の伝統的全身投与に伴う制限を克服し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、リソソーム蓄積障害の神経学的および体細胞性後遺症または症候群の両方を処置するために有用である。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、ＣＮＳまたは神経学的後遺症ならびにリソソーム蓄積症の症状発現の処置のために、対象のＣＮＳに１つ以上の治療薬を送達する（例えば、髄腔内腔内、静脈内または槽内に）組成物および方法に関するが、一方、そのリソソーム蓄積症の全身性または体細胞性症状発現も処置するためでもある。例えば、本発明のいくつかの組成物は、対象に髄腔内腔内投与され、それにより、対象のＣＮＳに１つ以上の治療薬を送達して、神経学的後遺症を処置し、それと対になって、全身循環の細胞および組織（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓またははリンパ節の細胞および組織）の両方にこのような治療薬を送達するために１つ以上の治療薬を静脈内投与し、それにより体細胞性後遺症を処置する。例えば、リソソーム蓄積症（例えばハンター症候群）を有するか、そうでなければ影響を及ぼされる対象は、１つ以上の治療薬（例えば、イズロン酸−２−スルファターゼ）を含む薬学的組成物を、神経学的後遺症を処置するために、少なくとも週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回またはそれ以上、髄腔内腔内投与され得るが、一方、異なる治療薬は、当該疾患の全身性または体細胞性症状発現を処置するために、より高頻度ベースで（例えば、１日１回、隔日に１回、週３回または週１回）、対象に静脈内投与され得る。

ハンター症候群、またはムコ多糖症ＩＩ（ＭＰＳＩＩ）は、酵素イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の不全に起因するＸ連鎖遺伝性代謝異常である。Ｉ２Ｓは、リソソームに局在化し、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）へパリン−および硫酸ダルマタンの異化作用で重要な役割を果たす。酵素の不在下では、これら物質が細胞内に蓄積し、最終的には充血を引き起こし、細胞死および組織破壊に続く。酵素の広範囲な発現のために、ＭＰＳＩＩ患者では、複数の細胞型および器官系が冒される。

この障害の決定的な臨床的特徴は、中枢神経系（ＣＮＳ）変性であり、これが認知障害（例えば、ＩＱの低下）を生じさせる。更に、罹患者のＭＲＩスキャンは、明確な白質病巣；脳実質、神経節、脳梁、および脳幹における膨張した血管周囲腔；委縮；および脳室拡大を有する（Ｗａｎｇら著、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００９年）。この疾患は、典型的には、臓器巨大症および骨格異常で、生後数年後に現れる。大部分の罹患者が１０歳または２０歳までに疾患に関連する合併症で死亡するとともに、一部の罹患者は、認知機能の進行性低下を経験する。

本発明の組成物および方法は、ハンター症候群に冒されたまたは罹患し易い個体を効果的に治療するために用いられ得る。本明細書で使用されるような用語「治療する」または「治療」は、疾患に関連する１つ以上の症状の軽減、疾患の１つ以上の症状の発症の抑制または遅延、および／または疾患の１つ以上の症状の重症度または頻度の緩和を指す。

いくつかの実施形態では、治療とは、ハンター症候群患者における部分的または完全な緩和、軽減、鎮静、発症の遅延、重症度および／または神経性障害の発症率の低減を指す。本明細書で使用するとき、用語「神経性障害」は、中枢神経系（例えば、脳および脊髄）の障害に関連する種々の症状を含む。神経性障害の症状としては、例えば、認知障害；白質病巣；脳実質、神経節、脳梁、および／または脳幹における膨張した血管周囲腔；委縮；および／または脳室拡大などが挙げられる。

いくつかの実施形態では、治療とは、種々の組織におけるリソソーム蓄積（例えばＧＡＧの）減少を指す。いくつかの実施形態では、治療とは、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるリソソーム蓄積の低下を指す。ある実施形態では、リソソーム蓄積は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上まで低減される。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍まで低減される。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積は、リソソーム蓄積顆粒（例えば、ゼブラストライプ形状）の存在によって測定される。リソソーム蓄積顆粒の存在は、組織学的分析によるなどの当該技術分野で既知の種々の方法によって測定され得る。

いくつかの実施形態では、治療とは、ニューロン（例えば、プルキンエ細胞を含有するニューロン）における空胞化の減少を指す。ある実施形態では、ニューロンにおける空胞化は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上まで低減される。いくつかの実施形態では、空胞化が、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍まで低減される。空胞化の存在および減少は、組織学的分析によるなどの当該技術分野で既知の種々の方法によって測定され得る。

いくつかの実施形態では、治療とは、種々の組織におけるＩ２Ｓ酵素活性の増加を指す。いくつかの実施形態では、治療とは、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるＩ２Ｓ酵素活性の増加を指す。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素活性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上まで増加される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素活性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍まで増加される。いくつかの実施形態では、増加したＩ２Ｓ酵素活性は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素活性は、腰部内または腰部の細胞内で増加される。いくつかの実施形態では、腰部において増加したＩ２Ｓ酵素活性は、少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素活性は、遠位脊髄内または遠位脊髄の細胞内で増加される。

いくつかの実施形態では、処置は、認知能力の喪失の進行低減を指す。ある実施形態では、認知能力の喪失の進行は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、処置は、発育遅延低減を指す。ある実施形態では、発育遅延は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。

いくつかの実施形態では、処置は、生存（例えば、生存時間）増大を指す。例えば、処置は、患者の平均余命増大を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、処置を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約５％より多く、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、処置を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約６ヵ月より長く、約７ヵ月、約８ヵ月、約９ヵ月、約１０ヵ月、約１１ヵ月、約１２ヵ月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、患者の長期間生存を生じる。本明細書中で用いる場合、「長期間生存」という用語は、約４０年、４５年、５０年、５５年、６０年またはそれより以上の生存時間または平均余命を指す。

「改善する」、「増大する」または「低減する」という用語は、本明細書中で用いる場合、対照と対比する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な対照は、基線測定値、例えば、本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、或いは本明細書中に記載される処置の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値である。「対照個体」は、処置されている個体とほぼ同一年齢および／または性別である、同一疾患に苦しむ個体である（処置個体および対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。

治療される個体（「患者」または「被験者」とも呼ばれる）とは、ハンター症候群を有するまたはハンター症候群を発症する可能性を有する個体（胎児、乳幼児、青少年、または成人）である。この個体は、残留内因性Ｉ２Ｓタンパク質発現および／または活性を有し得るか、または測定可能な活性を有し得ない。例えば、ハンター症候群を有する個体は、正常なＩ２Ｓ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満であるＩ２Ｓ発現レベルを有する場合もある。

いくつかの実施形態では、個体とは、最近病気と診断された個体である。典型的には、早期治療（診断後、可能な限りすみやかに治療を開始すること）が、疾患の影響を最小化し、かつ治療の利点を最大化にするために重要である。
免疫寛容

一般的に、本発明による治療薬（例えば補充酵素）の髄腔内腔内投与は、対象において重篤な副作用を生じない。本明細書中で用いる場合、重症副作用は、実質的免疫応答、毒性または死（これらに限定されない）を誘導する。本明細書中で用いる場合、「実質的免疫応答」という用語は、重症または重篤免疫応答、例えば適応Ｔ細胞免疫応答を指す。

したがって、多くの実施形態において、本発明の方法は、同時免疫抑制剤療法（すなわち、前処置／前状態調節として、或いは当該方法と平行して用いられる任意の免疫抑制剤療法）を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、処置されている対象における免疫寛容誘導を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤を用いる対象の前処置または前状態調節を包含しない。

いくつかの実施形態では、治療薬の髄腔内腔内投与は、これらの作用物質に対する免疫応答を高め得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵素補助療法に対して寛容な補助酵素を患者に接種させることが有用であり得る。免疫寛容は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて誘導され得る。例えば、Ｔ細胞免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）および抗増殖剤、例えばアザチオプリン（Ａｚａ）を、低用量の所望の補充酵素の毎週髄腔内腔内注入と組合せた初期３０〜６０日レジメンが、用いられ得る。

当業者に既知の任意の免疫抑制剤は、本発明の組合せ療法と一緒に用いられ得る。このような免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗ＴＮＦ剤、例えばエタネルセプト（例えば、Ｍｏｄｅｒ，２０００，Ａｎｎ．ＡｌｌｅｒｇｙＡｓｔｈｍａＩｍｍｕｎｏｌ．８４，２８０−２８４；Ｎｅｖｉｎｓ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２，１４６−１５０；Ｋｕｒｌｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０００，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１，２２４−２３０；Ｉｄｅｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９５，２１７−２２６；Ｐｏｔｔｅｒｅｔａｌ．，１９９９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７５，１５９−１７４；Ｓｌａｖｉｋｅｔａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９，１−２４；Ｇａｚｉｅｖｅｔａｌ．，１９９９，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５，６８９−６９６；Ｈｅｎｒｙ，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３，２０９−２２０；Ｇｕｍｍｅｒｔｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０，１３６６−１３８０；Ｑｉｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６９，１２７５−１２８３参照）が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＩＬ２受容体（アルファ−サブユニット）抗体ダクリズマブ（例えば、ゼナパックスＴＭ）（これは、移植患者において有効であることが実証されている）も、免疫抑制剤として用いられ得る（例えば、Ｗｉｓｅｍａｎｅｔａｌ．，１９９９，Ｄｒｕｇｓ５８，１０２９−１０４２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚｅｔａｌ．，２０００，Ｎ．ＥｎｇｌＪ．Ｍｅｄ．３４２，６１３−６１９；Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉｅｔａｌ．，１９９９，ＤｒｕｇｓＲ．Ｄ．１，５５−６０；Ｂｅｒａｒｄｅｔａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ１９，１１２７−１１３７；Ｅｃｋｈｏｆｆｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６９，１８６７−１８７２；Ｅｋｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．１３，１５１−１５９参照）。付加的免疫抑制剤としては、抗ＣＤ２（Ｂｒａｎｃｏｅｔａｌ．，１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６８，１５８８−１５９６；Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａｅｔａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９２，４０６６−４０７１）、抗ＣＤ４（Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａｅｔａｌ．，２０００，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．４３，６３８−６４４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２，１３８−１５２）および抗ＣＤ４０リガンド（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．，２０００，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０，１０８−１２５；Ｃｈｉｒｍｕｌｅｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３３４５−３３５２；Ｉｔｏｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，１２３０−１２３５）が挙げられるが、これらに限定されない。
投与

本発明の方法は、治療的有効量の本明細書中に記載される治療薬（例えば補充酵素）の単回ならびに多数回投与を意図する。治療薬（例えば補充酵素）は、対象の症状（例えば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度および程度によって、一定間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療的有効量の治療薬（例えば補充酵素）は、一定間隔で（例えば、年１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週）、定期的に髄腔内腔内投与され得る。

いくつかの実施形態では、髄腔内腔内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経腸的、経皮的、または経筋肉的に（例えば、経口的または鼻に））と共同で用いられ得る。いくつかの実施形態では、他の投与経路（例えば、静脈内投与）は、隔週、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年投与以下の頻度で実施され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、対象にＩ２Ｓ補充酵素を投与することを更に含む。ある実施形態では、静脈内投与は、毎週投与以下の頻度（例えば、隔週、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、または６ヶ月に１回以下の頻度）である。ある実施形態では、静脈内投与は、週２回、毎週、隔週、または１ヶ月に１回などの毎月以上の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、同日に実施される。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、少なくとも２日以内、少なくとも３日以内、少なくとも４日以内、少なくとも５日以内、少なくとも６日以内、少なくとも７日以内、または少なくとも１週間以内ではないなどの、互いに一定の時間内では実施されない。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内腔内投与は、毎月、隔週、１ヶ月２回、または毎月の交代投与などの交代投与計画で実施される。いくつかの実施形態では、毎月、隔週、１ヶ月に２回、または毎月の静脈投与などの投与計画においてクモ膜下腔内投与が静脈内投与に置き換わり、この計画における第３または第４若しくは第５の毎投与が静脈投与の代わりに髄腔内腔内投与で置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、毎月、隔週、１ヶ月に２回、または毎月の髄腔内腔内投与などの投与計画において静脈内投与がクモ膜下腔内投与に置き換わり、この計画における第３または第４若しくは第５の毎投与が、髄腔内腔内投与の代わりに静脈内投与で置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、静脈および髄腔内腔内投与は、先ず初めに静脈内投与を実施し（例えば、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上の間、毎週、隔週、１ヶ月に２回、または毎月投与）、続いて髄腔内腔内投与が実施される（例えば、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上の間、毎週、隔週、１ヶ月に２回、または毎月投与）など、逐次的に実施される。いくつかの実施形態では、先ず初めに髄腔内腔内投与が実施され（例えば、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上の間、毎週、隔週、１ヶ月に２回、または毎月投与）、これに静脈内内投与（例えば、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上の間、毎週、隔週、１ヶ月に２回、または毎月投与）が続く。

いくつかの実施形態では、ハンター症候群は、末梢の諸症状と関連があり、当該方法は、補充酵素を髄腔内腔内投与することを包含するが、対象に補充酵素を静脈内投与することは包含しない。ある実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素の髄腔内腔内投与は、対象のＩ２Ｓ欠乏に関連する１つ以上の末梢の諸症状を改善または低減する。

本明細書中で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、主として、本発明の薬学的組成物中に含有される治療薬の総量に基づいて確定される。一般的に、治療的有効量は、対象に対して意義のある利益（例えば、根元的疾患または症状を処置し、調整し、治癒し、防止し、および／または改善すること）を達成するのに十分である。例えば、治療的有効量は、所望の治療的および／または予防的作用を達成するのに十分な量、例えばリソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調整し、それによりこのようなリソソーム蓄積症またはその症候を処置する（例えば、対象への本発明の組成物の投与後の、「ゼブラ体」の存在または出現の、或いは細胞空胞形成の低減または排除）ために十分な量であり得る。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療薬（例えば、組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特質によって決まる。このような特質としては、対象の症状、疾患重症度、全身健康状態、年齢、性別および体重が挙げられる。これらのおよびその他の関連因子によって、適切な投与量を、当業者は容易に決定し得る。更に、最適投与量範囲を同定するために、客観的および主観的検定がともに任意に用いられ得る。

治療的有効量は、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで一般に投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関しては、治療的有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者のための具体的治療的有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば処置されている障害および障害の重症度；用いられる具体的薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食餌；投与時間；投与経路、および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝速度；処置の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような因子によって決まり得る。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜５００ｍｇ／脳１ｋｇ、例えば、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜４００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜３００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜９０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜８０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜７０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜６０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜５０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜４０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜３０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２５ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１５ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１０ｍｇ／脳１ｋｇの範囲である。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．１ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約０．５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１．０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約６０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約７０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約８０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約９０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５００ｍｇ／脳１ｋｇより多い。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、ｍｇ／体重１ｋｇによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重は相関し得る（ＤｅｋａｂａｎＡＳ． “Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｂｒａｉｎｗｅｉｇｈｔｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｓｐａｎｏｆｈｕｍａｎｌｉｆｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｂｒａｉｎｗｅｉｇｈｔｓｔｏｂｏｄｙｈｅｉｇｈｔｓａｎｄｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｓ，” ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ１９７８；４：３４５−５６）。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、表５に示されるように換算され得る。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重に基づいた治療的有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃに換算され得る。例えば、成人におけるＣＳＦの容積は約１５０ｍＬである（ＪｏｈａｎｓｏｎＣＥ，ｅｔａｌ． “Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ，” ＣｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌＦｌｕｉｄＲｅｓ．２００８Ｍａｙ１４；５：１０）。したがって、成人への０．１ｍｇ〜５０ｍｇの単一用量注射は、成人では約０．０１ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃ（５０ｍｇ）用量である。

任意の特定の対象に関して、具体的投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに酵素補充療法の投与を施すかまたは指図する専門家の判断によって経時的に調整されるべきであり、そして本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、本発明の範囲または実行を限定するものではない、と更に理解されるべきである。
キット

本発明は更に、本発明の処方物を含有するキットまたは他の製品を提供し、そしてその再構成（凍結乾燥された場合）および／または使用のための機器を提供する。キットまたはその他の製品としては、容器、ＩＤＤＤ、カテーテル、ならびに髄腔内腔内投与および関連外科手術に有用な任意のその他の物質、装置または設備が挙げられ得る。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器（薬剤充填済み注射器）、アンプル、カートリッジ、レザバーまたはｌｙｏ−ｊｅｃｔｓが挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから作られ得る。いくつかの実施形態では、容器は薬剤充填済み注射器である。適切な薬剤充填済み注射器としては、ベイクドシリコーン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器またはシリコーンを含有しないプラスチック樹脂注射器が挙げられるが、これらに限定されない。

典型的には、容器は、製剤、ならびに再構成および／または使用に関する指示を示し得る容器上の、または容器に付随したラベルを保持し得る。例えば、ラベルは、製剤が上記のようなタンパク質濃度に再構成される、ということを示し得る。ラベルは更に、製剤が、例えばＩＴ投与のために有用であるかまたは意図される、ということを示し得る。いくつかの実施形態では、容器は、治療薬（例えば補充酵素）を含有する単一用量の安定製剤を含有し得る。種々の実施形態において、単一用量の安定製剤は、約１５ｍｌ未満、１０ｍｌ、５．０ｍｌ、４．０ｍｌ、３．５ｍｌ、３．０ｍｌ、２．５ｍｌ、２．０ｍｌ、１．５ｍｌ、１．０ｍｌまたは０．５ｍｌの容量で存在する。代替的には、製剤を保持する容器は、多数回使用バイアルであって、これは、処方物の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にし得る。キットまたは他の製品は更に、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、生理食塩水、緩衝化生理食塩水）を含む第二容器を包含し得る。希釈剤および製剤の混合時に、再構成化製剤中の最終タンパク質濃度は、一般的に、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）である。キットまたは他の製品は更に、商業的および使用者の見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、ＩＤＤＤ、カテーテル、注射器および使用説明書を伴う添付文書を包含し得る。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、更に十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。引用文献はすべて、参照により本明細書に援用される。

実施例１：生体分布
本試験の主な目的は、髄腔内腔内−腰椎経路によって、組換え体ヒトＩ２Ｓが成体ＭＰＳＩＩマウスの脳に送達されることができるかどうかを判定することである。
材料および方法
動物：

マウスを、１２時間の明暗周期下、コロニールーム内の１つの檻につき最高４匹の群で収容した。実験の続く間、囓歯類用飼料（ＬａｂＤｉｅｔ−５００１，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）および水（逆浸透によって精製されたＬｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ公共水道水）を自由に摂取させた。動物の管理は、「ｔｈｅＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ」（ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＰｒｅｓｓ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，１９９６年）に記載されたガイドラインに従って実施した。最新のＩＫＯ繁殖コロニーが、ＩＫＯ突然変異についてヘテロ接合性である４匹のキャリア雌マウスから確立され、これはＤｒ．ＪｏｓｅｐｈＭｕｅｎｚｅｒ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ）から入手された。キャリアの雌は、Ｃ５７ＢＬ／６背景種の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）で繁殖され、ヘテロ接合の雌およびヘミ接合の雄ノックアウトマウス、ならびに野生型の雄および雌の同腹子を発生させた。組織ＤＮＡのＰＣＲ分析によって、全ての子孫は遺伝子型であった。この実験で使用された全てのマウスは、８週齢と１２周齢との間のヘミ接合ＩＫＯ（−／０）または野生型（ＷＴ）同腹子（＋／０）マウスのいずれかとして同定された雄であった。
イズルスルファーゼ

２２ｍＬのＩ２Ｓ（組換え体ヒトイズルスルファーゼ）を、２Ｌのリン酸塩緩衝生理食塩水の４つの変化に対して透析した。次いでＩ２Ｓを、Ｖｉｖａｓｐｉｎカラムによって濃縮し、最終容積１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、続いて０．２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した。最終濃度は、５１ｍｇ／ｍＬであった。
髄腔内腔内−腰椎注射：

成体マウスを、腹腔内注射により２００〜３００μＬ／１０ｇ体重（２５０〜３５０ｍｇ／ｋｇ）で、１．２５％の２，２，２−トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ）を用いて麻酔した。背部の体毛を、尾の根元から肩甲骨まで除去し、刈られた領域をポビダイン／ベータダイン洗浄、続いてイソプロピルアルコールでぬぐった。小さな正中線の皮膚切開創（１〜２ｃｍ）を腰仙椎上につくり、背側正中線と腸骨翼の頭側との交差部分（腸骨特異点）を特定した。腸骨窩内の筋肉（中殿筋）は、ハート形状の筋肉であり、「ハート」の頂部の両側は、腸骨翼の位置を近似する。気密の１０〜２０μＬのガラスＨａｍｉｌｔｏｎ注射器に取り付けられた３２ゲージの針を、抵抗が下にある骨から感じ取られるまで挿入した。約２μＬ／２０秒（１０μＬ／２分）の速度で、１０μＬの供試物質の注射が行われた。皮膚切開創を、創傷用クリップを用いて適切に閉じて、動物を適切な檻に戻す前に、回復室で回復させた。
組織学的処理

動物を、最終の注射後１時間で致死させた。

脳および肝臓組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、次いで処理し、パラフィンに埋め込んだ。ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）染色用に、５μｍの切片を調製した。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色：

脳および肝臓部分をＨ＆Ｅで染色した。染色結果は、核を紫色で、細胞質を桃色から赤色で示した。Ｈ＆Ｅ染色されたスライドガラスは、組織病理学的形態学的評価のために用いられた。
免疫組織化学：

Ｉ２Ｓ生体内分布評価のために、脱パラフィン化し再水和化した脳および肝臓切片を、注射されたＩ２Ｓを検出するために、組換え体ヒトＩ２Ｓに対するマウスモノクローナル抗体２Ｃ４−２Ｂ２（ＭａｉｎｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）（または陰性対照抗体としての無関係なマウスＩｇＧ；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に、一夜インキュベートした。２〜８℃で一夜のインキュベーション後に、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した二次のヤギ抗マウス抗体ＩｇＧを添加した。３７℃で更に３０分間のインキュベーション後に、Ｔｙｒａｍｉｄｅ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識溶液（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を更に１０分間で加えた。核対比染色として１．５μｇ／ｍｌの４’−６−ジアミンジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有するフェージング防止封入剤（ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて切片をカバーガラスで覆い、マルチチャンネルＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡で観察した。染色結果は、Ｉ２Ｓ陽性細胞を緑色に、核を青色に、背景領域を黒色で示した。

効果的な分析のために、脳および肝臓切片を、一次抗体としてのラット抗−ＬＡＭＰ−１（リソソームマーカーとしてのリソソーム結合膜タンパク質）ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で染色した。無関係な抗体としてのラットＩｇＧを、陰性対照として用いた。ＡＢＣ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手したアビジン−ビオチン複合体キット）法が、標的のマーカーを増幅するために用いられた。

簡単に言うと、脱パラフィン化切片を再水和化し、一次抗体と共にインキュベートした。２〜８℃で一夜のインキュベーション後に、二次ビオチニル化ウサギ抗−ラットＩｇＧ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いでサンプルを洗浄し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３０分間処置した。発色のために、３，３’−ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）四塩酸塩を色素体として用いた。次いで切片をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスで覆った。染色結果は、ＬＡＭＰ−１陽性細胞を茶色で、核を青色で示した。

代表的な写真を撮影し、ＬＡＭＰ−１陽性細胞の領域を、Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ．Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）で解析し、スチューデントのｔ検定を用いて、比較統計を実施した。
電子顕微鏡法：

Ｉ２Ｓの３用量で処置された動物からの脳組織を、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中、２．５％ＰＦＡ／２．５％グルタルアルデヒドで、４℃で一夜固定した。次いで、サンプルをカコジル酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、四酸化オスミウム中で後固定し、アルコールおよび酸化プロピレン中で脱水し、Ｅｐｏｎ樹脂中に埋め込んだ。超薄切片を１００ｎｍで切断し、クエン酸鉛で染色し、Ｔｅｃｎａｉ（登録商標）Ｇ^２ＳｐｉｒｉｔＢｉｏＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡で観察した。
結果

脳においては、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色で判定されたように、Ｉ２Ｓはビヒクル対照動物で認められなかった。対照的に、Ｉ２Ｓ注入動物においては、髄膜細胞、大脳および小脳のニューロンは、Ｉ２Ｓについて陽性に染色された。染色シグナルは、３用量投与された動物でより強かった（図１）。

ビヒクル処置ＩＫＯマウスの脳組織では、細胞空胞化、すなわちリソソーム蓄積疾患の組織病理学的特徴が、野生型動物と比較して脳全体で認められた。Ｉ２Ｓ処置ＩＫＯマウスでは、未処置マウスと比較して、表面大脳皮質、尾状核、視床、小脳から白質までの細胞空胞化の広範囲の減少が存在した（図２）。野生型動物と比較した場合、異常に高いリソソーム活性が、リソソーム活性および疾患状態の指標であるリソソーム結合膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）染色によって、ビヒクル処置ＩＫＯマウスの小グリア細胞、髄膜細胞および血管周囲細胞で認められた。Ｉ２Ｓ髄腔内腔内処置マウスは、ＬＡＭＰ−１免疫染色で著しい減少を有した。この減少は、ＬＡＭＰ−１陽性細胞の数およびより明るい染色での低下によって特徴付けられる。この減少は、Ｉ２Ｓの２用量および３用量処置動物の双方で、表面大脳皮質、尾状核、視床、小脳から白質に至る脳全体で認められた（図３）。種々の脳領域のＬＡＭＰ−１免疫染色の形態計測学的分析は、評価された脳の全ての領域でＬＡＭＰ−１免疫染色陽性染色における著しい減少があることを確認した（図４）。

ビヒクル処置ＩＫＯマウスの電子顕微鏡観察は、アモルファスな顆粒蓄積物質を含有する腫大した空胞および板状でゼブラ小体様構造を有する封入体を明らかにした。超微細構造レベルでのリソソーム蓄積のこれら典型的な病理特徴は、Ｉ２Ｓの髄腔内腔内−腰椎注射マウスでは、減少された（図５）。

肝臓では、ビヒクル処置動物においては、Ｉ２Ｓの陽性染色はなかった。Ｉ２Ｓ髄腔内腔内注射マウスにおいては、大量の注射されたＩ２Ｓのが、シヌソイド細胞で明確に見出され（図６）、これは髄腔内腔内空隙に注射されたＩ２Ｓが、ＣＳＦと共に循環し、次いでクモ膜顆粒を経て循環系に吸収されたことを示している。

ビヒクル処置ＩＫＯマウスの肝臓組織では、Ｈ＆Ｅ染色によって立証された重症の細胞空胞化および異常に高いリソソーム活性ならびに強いＬＡＭＰ−１免疫染色が、ＷＴマウスと比較して確認された。肝臓における細胞内空胞化およびＬＡＭＰ−１免疫染色の著しい減少が、Ｉ２Ｓでの髄腔内処置後に確認された。Ｈ＆Ｅ染色は、細胞質内空胞化は、正常な肝臓細胞構造に近い状態で、ほぼ完全に消失した（図７）。

ＩＫＯマウスでは、髄腔内腔内−腰椎経路によって組換え体ヒトＩ２Ｓが脳に送達され、注射されたＩ２Ｓは、脳の種々の領域において広範囲の組織病理学的改善を生じさせる。
・注射されたＩ２Ｓは、髄膜細胞および脳のニューロンで検出された。
・光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルの双方での脳全体の細胞空胞化の減少。
・脳全体のＬＡＭＰ−１リソソームマーカーの減少。
・髄腔内腔内注射されたＩ２Ｓは、末梢循環に入り、肝臓の形態学的および組織学的マーカーを改善した。
実施例２：毒性

本実施例は、カニクイザルにおける月単位のボーラス髄腔内腔内腰椎投与を介するイズルスルファーゼに関連する臨床的徴候を示す。これを達成するために、以下の表に示されるように、１４匹の雄カニクイザルを５種の処置群に無作為割付した。

全ての群の動物は、腰部脊椎のレベルで月単位のインターバルでＩＴにて３回投与された。１ｍｌの投与容積は、０．３ｍｌのＰＢＳでカテーテルシステムから流された。各投与の１〜２日前に、大槽のレベルでＩＴ脊椎穿刺から約２ｍＬのＣＳＦを採取した。血液サンプル（２ｍｌ）もまた、この時点で採取した。血液（２ｍｌ）およびＣＳＦ（０．１ｍｌ）を５群の動物から、投与前、最初の投与から０．５、１、２、４、８、２４、および４８時間後に採取した。臨床的徴候を１日２回記録した。死体解剖を第３回目の投与後約２４時間で実施し、選択した組織を採取し、保存した。

１日目に、４群（１５０ｍｇ）の全ての３匹の動物が、投与後３〜１２分以内に最小限のハインドクウォーター傾向を示し、これが５〜１５分間続き、この徴候は、供試物質に関連するとみなされた。供試物質に関連すると考えられる体重、餌消費量および神経学的／理学的試験パラメータでの変化はなかった。

血清およびＣＳＦサンプルの分析ならびに投与溶液分析が示されている。内因性イズルスルファーゼ活性における変動が、カニクイザルからの異なる組織で観察され、脳および脊髄は、肝臓、心臓、および腎臓を含む試験された他の末梢器官よりも大きな内因性活性を有した。イズルスルファーゼ投与は、種々の脳領域、ならびに脳幹および脊髄におけるイズルスルファーゼ活性での用量依存型増加に関連した。ＩＴ送達は、右大脳半球と左大脳半球との間の分布では、観察可能な差異をもたらさなかった。以下の器官、すなわち脳、肝臓、心臓、および腎臓におけるイズルスルファーゼ活性での明確な用量依存型増加が存在した。脳におけるイズルスルファーゼについての免疫染色は、染色強度における用量依存型増加を立証した。３ｍｇの群では、髄膜細胞染色および髄膜下の限定されたグリア細胞染色が観察され、ニューロン染色は、３ｍｇ処置群からの動物では、明らかではなかった。イズルスルファーゼのＩＴ投与が起こっている場所である腰部領域における非常に高い染色強度を伴い、脊髄では、イズルスルファーゼ染色は陽性かつ用量依存型であった。肝臓、腎臓、および心臓におけるイズルスルファーゼ染色強度は用量依存型であり、これら器官におけるイズルスルファーゼ活性の増加と一致した。

結論として、月単位の間隔での１５０ｍｇまでの用量でのイズルスルファーゼのＩＴ投与は、副作用を有さなかった。したがって、無影響量（ＮＯＡＥＬ）は１５０ｍｇであると解釈され、これは本試験でテストされた最高投与量である。イズルスルファーゼ投与は、ＣＮＳにおけるイズルスルファーゼ活性の用量依存型増加に関連し、全身のＩ２Ｓレベルならびに肝臓、腎臓、および心臓における活性をもたらした。

供試物質、イズルスルファーゼは、１５４ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ５．３〜６．１中で供給された。供給された投与溶液の公称濃度は、０、３、３０または１５０ｍｇ／ｍｌであった。供試物質は冷凍庫内で−８２〜−７９℃で保存した。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２を、用量が投与された後ならびに一連のＣＳＦが採取された後のフラッシュ剤として用いた。このＰＢＳは、Ｇｉｂｃｏ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手された。
供試物質投与量調製

それぞれの時間間隔についての投与の第１日目に、それぞれの濃度の１つのバイアルを−８０℃の冷凍庫から取り出し、作業台上で室温まで融解した。一旦融解したら、１、２、３群についてのバイアルにラベルを貼付し、重量計測し、投与計画された各動物用に、０．２２μｍフィルターを通して１ｍｌを採取した。全ての用量が投与された後に、バイアルを再重量計測し、冷凍庫内に配置した。

翌日（動物００３、４群および５群に対する投与日）、１群および４群用の投与溶液を冷凍庫から取り出し、作業台上に配置し、室温に到達させた。室温まで到達したら、１群および４群用のバイアルを重量計測し、４群バイアルにラベルを貼付し、１群および４群の投与を計画されたそれぞれの動物用に、フィルターを通して１ｍｌを採取した。次いで、５群用の投与溶液を、４群投与溶液および１群（ビヒクル）の適当量を無菌ポリプロピレンバイアルに注入することによって調製した。１群および４群から添加された量を記録した。バイアルを軽く反転させることによって溶液を混合し、５群の動物用に、フィルターを通して２〜１ｍｌ用量を採取した。投与の完了の際に、１群および４群用のバイアルを再重量計測し、全てのバイアル（１〜５群）を冷凍庫内に配置した。

以下の表に記載されているように、１４匹の動物を処置群に無作為割付した。

投与のＩＴ経路が、これがヒト投与のために意図された経路であるために選択された。この試験のために選択されたイズルスルファーゼの投与量（３、３０、１００、および１５０ｍｇ／ｍｌ）は、３回の継続的な毎月のボーラスＩＴ腰椎注射後のヒト以外の霊長類中枢神経系（ＣＮＳ）内の変化する酵素の投与レベルの生体内分布を評価するために選択された。
臨床観察

臨床的徴候の全発生率は、最小であった。１群（対照）、２群（３ｍｇ）、３群（３０ｍｇ）、または５群（１００ｍｇ）の動物は、試験中のいずれの時点でも供試物質に関連すると考えられる臨床的徴候を有さなかった。

１日目には、４群（１５０ｍｇ）の全ての３匹の動物（０１２〜０１４）は、投与後３〜１２分以内で５〜１５分間続く最小のハインドクウォーターの傾向を示した。この徴候は、供試物質に関連すると考えられ、より低い投与量群のいずれでも観察されなかった。第１回目の投与直後および供試物質投与直後の日に、他の臨床的徴候は見られなかった。４群動物について観察された唯一の他の徴候は、３５日目に動物０１３での一回の嘔吐の発生であった。

単回の毎月の髄腔内腔内ボーラス投与としての供試物質の投与は、挿入された薬物送達装置による固有の変化を考慮に入れるとき、有害な肉眼的または顕微鏡的変化に関連しなかった。対照群を含める全ての群は、薬剤送達システムに対する炎症反応を示す髄膜での顕微鏡的変化を有した。３０ｍｇまたはそれ以上の供試物質の用量を受容した動物では、髄膜での炎症反応がより明白な好酸球性成分を有する傾向があった。

対照動物と供試物質処置動物との間の差があまりに僅かであったために、無影響量（ＮＯＡＥＬ）は、本試験でテストされた最高用量である１５０ｍｇであると解釈された。

全ての群（対照を含める）での髄膜における全炎症反応は、サルでこの持続時間の髄腔内腔内試験で全般的に発生したものよりは僅かに明確であった。しかしながら、これは、ビヒクルの若干の特性または死体解剖前の２４時間の投与量の作用に関連する可能性があると考えられる。

脳イズルスルファーゼ染色は、１５０ｍｇの群で確認された最高の染色強度で、３ｍｇ群の１匹の動物を除けば、全ての処置動物で陽性であった（図１６、１７、１８および１９）。３ｍｇ群では、髄膜細胞および髄膜細胞の下の数個のグリア細胞のみが陽性であり、注射されたイズルスルファーゼは、ニューロンでは検出されなかった。より高い用量群（３０、１００および１５０ｍｇ）では、髄膜細胞、グリア細胞および血管周囲細胞に加えて、脳内ニューロンの大規模な集団がイズルスルファーゼ染色について陽性であった。イズルスルファーゼ免疫染色は、髄膜近くの表面での層Ｉ内のニューロンから白質に隣接したより深い層ＩＶ内のニューロンに至る脳内ニューロンにおいて、注射されたイズルスルファーゼの広範囲な分布を明らかにした（図２０、２１および２２）。ニューロンの顕著な染色はまた、１５０ｍｇ投与群についても観察された（図２３）。全ての動物（３０〜１５０ｍｇの投与群）では、ニューロンのイズルスルファーゼ染色で顕著な違いは、脳の前頭部、中頭部、および後頭部の間では認められなかった。

イズルスルファーゼ染色は、腰部で最高の染色強度を伴い、全ての動物の脊髄において陽性であった（図２４および２５）。イズルスルファーゼ免疫染色もまた、用量依存型であった。ニューロン、髄膜細胞、グリア細胞、血管周囲細胞および神経線維を取り囲むエピ／ペリ／神経内膜（結合細胞）は、１５０ｍｇ群ではイズルスルファーゼ染色について強く陽性であった。

肝臓では、イズルスルファーゼについての陽性染色は、全ての動物のシヌソイド細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞および内皮細胞）で認められた。しかしながら、イズルスルファーゼは３ｍｇ処置群については肝細胞内で検出されず（図２８）、一方肝細胞における陽性イズルスルファーゼ染色は、１５０ｍｇ処置群での最大の染色強度を伴い、より高い投与群で見出された（図２９、３０および３１）。

３ｍｇ処置群からの動物では、イズルスルファーゼについて陽性染色は存在しなかった。これとは対照的に、間細胞は、陽性細胞数および染色強度に関して、１５０ｍｇ群で著しい染色を伴い、３０、１００および１５０ｍｇ群においてイズルスルファーゼについて陽性に染色された（図３３、３４および３５）。
腎臓

注射されたイズルスルファーゼは、３ｍｇ投与群からの動物では、ほとんどまたは全く検出されなかった（図３６）。しかしながら、陽性イズルスルファーゼ染色が、３０および１００ｍｇ群において糸球体細胞および間細胞で認められた。１５０ｍｇ群では、イズルスルファーゼ免疫染色は、糸球体細胞および肝細胞の顕著な染色に加えて、近位細管細胞のイズルスルファーゼ染色を更に明白にした（図３９）。
考察

体重、餌消費、理学的検査所見および神経学的検査所見に及ぼす供試物質に関連する臨床的徴候または影響はなかった。１日目に、４群（１５０ｍｇ）動物は、投与後３〜１２分以内で、５〜１５分間持続するハインドクウォーターへの最小の傾向を示し、この徴候は、供試物質に関連するものであると判定された。

イズルスルファーゼ投与は、種々の脳領域、ならびに脳幹および脊髄におけるイズルスルファーゼ活性での用量依存型増加に関連した。脊髄内の染色強度の最高レベルは、腰部であり、ここはイズルスルファーゼのＩＴ投与が生じた場所である。イズルスルファーゼＩＴ投与はまた、肝臓、腎臓、および心臓における用量依存型染色強度で全身的曝露をもたらした。３０ｍｇおよびそれ以上で供試物質の用量の投与を受けた動物は、髄膜内の炎症反応がより明白な好酸球性成分を有する傾向を示したが、この差異は、生物学的に有意であるとは考えられない。

毎月の間隔で送達される１５０ｍｇまでの用量でのイズルスルファーゼのＩＴ投与は、副作用を有さなかった。したがって、無影響量（ＮＯＡＥＬ）は、本実施例で最高投与量である１５０ｍｇであると解釈された。イズルスルファーゼ投与は、ＣＮＳにおけるイズルスルファーゼの用量依存型増加に関連し、肝臓、腎臓、および心臓において全身的レベルをもたらした。
実施例３：ＩＴ送達されたＩ２ＳのＰＫ（血清およびＣＳＦ）

本実施例は、供試物質（ＴＡ）濃度についてのカニクイザルにおける毎月ボーラス髄腔内腔内腰椎注射および毎週ボーラス髄腔内腔内腰椎注射を介して投与されたイズルスルファーゼの６ヶ月毒性試験に関連する血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）分析を提供する。
実験計画

本試験の目的は、６ヶ月の期間にわたる毒性学的および安全性薬理的観点からイズルスルファーゼ（Ｉ２Ｓ）の反復用量髄腔内腔内（ＩＴ）投与を評価することである。試験計画は、表８に示されている。
供試物質
識別：イズルスルファーゼＩＶ投与量−（２．０ｍｇ／ｍＬ）
ＩＴ投与量−イズルスルファーゼ（０ｍｇ／ｍＬ）、イズルスルファーゼ（３ｍｇ／ｍＬ）、イズルスルファーゼ（３０ｍｇ／ｍＬ）、イズルスルファーゼ（１００ｍｇ／ｍＬ）アッセイ法：

イズルスルファーゼ濃度を決定するために、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）を用いてアッセイを行った。希釈計数を乗ずる前の検出限界値（ＩＯＤ）は１．２５ｎｇ／ｍＬであった。サンプルを１：５０希釈でスクリーニングし、したがって、アッセイ感度は６２．５ｎｇ／ｍＬであった。検量線の高い終点を超えて下降しているサンプルは、検量線の範囲内の値をもたらした適切な希釈で、更に希釈、再試験された。選択されたサンプルを、酵素活性アッセイを用いて更に分析した。このアッセイに関するＬＯＤは、１：５０の最小サンプル希釈で０．１８ｍＵ／ｍＬであった。

１群および２群の動物は、生理食塩水またはビヒクルをそれぞれ投与され、全ての動物は、ＩＶおよびＩＴ投与の期間全体を通して、１３８ｎｇ／ｍＬと＜６２．５ｎｇ／ｍＬ（または＜ＬＯＤ）との間の範囲のイズルスルファーゼレベルを有した。１群および２群からのテストされた２００個のＣＳＦサンプルの６２個が、アッセイＬＯＤ以上のＩ２Ｓのレベルを示した。これらの７個の数値が高かった（＞１，０００ｎｇ／ｍＬ）。ＩＴ投与前に採取されテストされた３つの他のＣＳＦサンプルの１つが、Ｉ２Ｓが１，００ｎｇ／ｍＬ以上であった。

次いで、サンプルがイズルスルファーゼ活性についてテストされた。それぞれの場合、活性の結果は、Ｉ２Ｓの存在を示し、Ｉ２Ｓの適切な濃度が活性レベルに基づいて計算された場合、結果は抗原ＥＬＩＳＡによって得られたものの２０％以内であった（表９参照）。抗原ＥＬＩＳＡ結果＜ＬＯＤで追加的に無作為に選択されたＣＳＦサンプルはまた、いずれかの非特異的活性を排除するための酵素活性アッセイを用いてテストされた。

この試験では、血清およびＣＳＦサンプルを、イズルスルファーゼ濃度について分析した。血清サンプルは、以下の計画により採取された：
ＩＶ投与：投与前および投与１〜１０の後２時間、投与前および投与１１〜２３の後４時間、ならびに死体解剖時。
ＩＴ投与：投与前および投与１および２の後２時間、投与前および投与３〜６の後４時間、ならびに死体解剖時。
ＣＳＦサンプルは以下の計画により採取された：
ＩＶ投与：投与前および投与１の後２時間、ならびに投与３および６の後４時間。
ＩＴ投与：投与前および投与１および２の後２時間、投与前および投与３〜６の後４時間、ならびに死体解剖時。

概ね、血清イズルスルファーゼは、ＣＳＦイズルスルファーゼよりも早く除去された。

生理食塩水またはビヒクルのそれぞれで投与された１群および２群動物における血清イズルスルファーゼレベルは、テストされた全ての時間点で１３８ｎｇ／ｍＬ未満かまたはそれに等しかった。若干の動物が、アッセイ検出限界値（ＬＯＤ）以下のレベルを有した。

高レベル（＞１，０００ｎｇ／ｍＬ）をもたらした７つの著しい例外を伴い、群１および２からのＣＳＦサンプルの少数が、アッセイＬＯＤ以上であった。ＩＴ投与３前の動物から採取された１つのＣＳＦサンプルがまた、１，０００ｎｇ／ｍＬ以上のイズルスルファーゼであるとテストされた。

これらの傾向から外れた結果を生じさせるサンプルを再試験し、確認した。更に、これらサンプルを、イズルスルファーゼ酵素活性について試験した。これら活性結果はまた、イズルスルファーゼ質量アッセイから得られたものの２０％以内の高イズルスルファーゼレベルを確認した。

活性アッセイの特異性は、ＣＳＦサンプルをＬＯＤ以下のイズルスルファーゼ質量単位で無作為に試験することによって、このサンプル集団内で実証され、これらサンプルにおけるイズルスルファーゼレベルが、実際にＬＯＤであることを確認した（データ表示せず）。
実施例４：製剤

本実施例は、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のためのイズルスルファーゼ−ＩＴ薬剤物質の製剤および医薬品製剤を確立するために実施された製剤開発試験を概説する。

ＣＮＳ送達用に好適な賦形剤の制限のために、イズルスルファーゼの髄腔内腔内送達についての製剤開発のための取り組みは、全身的送達のためのＩ２Ｓ製剤と等価な安定性も維持すると同時に、リン酸塩およびポリソルベート２０レベルを低減することに焦点が当てられた。

リン酸塩およびポリソルベートレベルの影響を検討するために、３種の重要なスクリーニングストレス試験が行われた。これら試験とは、凍結融解、振盪ストレス、および熱ストレスが挙げられる。この結果は、生理食塩水製剤が、低タンパク質濃度（２ｍｇ／ｍＬ）で凍結融解ストレスに対してより安定であることを示した。高タンパク質濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）では、凍結融解ストレスは、生理食塩水含有製剤およびリン酸塩含有製剤の双方で不安定性の問題は発生しなかった。振盪ストレス試験は、０．００５％ポリソルベート２０が振盪関連ストレスに対してタンパク質を保護することを確認した。熱安定性試験は、生理食塩水製剤がリン酸塩を含有する製剤に比べてより安定であることを立証した。更に、生理食塩水製剤のｐＨは、２〜８℃で２４カ月間、６．０で維持されることができた。タンパク質に結合された残留リン酸塩の量、ならびにタンパク質濃度の増加が、最終製剤におけるｐＨ安定性に関与することが認められた。
方法
生理食塩水およびリン酸塩製剤中のイズルスルファーゼの安定性に及ぼす凍結／融解ストレスの影響

異なる製剤中のイズルスルファーゼ安定性に及ぼす凍結／融解の影響を検討するために、バイアルのＳＥＣプールを、ＣｅｎｔｒｉｃｔｉｏｎＰｌｕｓ用いて、４回、１５０ｍＭのＮａＣｌまたは２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する１３７ｍＭのＮａＣｌ（双方ともにｐＨ６．０で）のいずれかに交換／濃縮した。タンパク質濃度は、２ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍＬを達成目標とした。全ての溶液は、０．２２マイクロメートルのＰＶＤＦフィルターを通して濾過された。溶液をそれぞれ１ｍＬの等量ずつで２ｍＬのホウケイ酸ガラスバイアルに分けた。このバイアルを凍結乾燥室の中段に配置し、プラセボバイアルで取り囲んだ。サンプルを、プログラムされた凍結／融解サイクル（２０℃で１時間保持し、１℃／分で−５０℃に凍結する）で凍結した。次いで、２段階で融解した（０．０３℃／分で−５０℃から−２５℃まで融解し、−２５℃で２４時間保持し、２〜８℃まで融解させた）。凍結／融解の２または３サイクル後に、サンプルを外観およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって分析した。
リン酸塩および生理食塩水製剤中のイズルスルファーゼに及ぼす振盪／せん断ストレスの影響

異なるタンパク質濃度で、イズルスルファーゼで振盪試験を実施した。タンパク質濃度は、２０ｍＭのリン酸塩中１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）および１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）単独の存在下で、２ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、および９０〜１００ｍｇ／ｍＬで試験された。ポリソルベートが必要であるかどうかを確認するために、種々の量のＰＳ−２０を試験条件にスパイクした。溶液をそれぞれ１．２ｍＬずつの等量で、２ｍＬのガラスバイアルに分け、次いで周辺条件下、２５０ｒｐｍで、旋回シェーカー上で２４時間振盪した。ベースラインと２４時間で、外観を検査し、０．１ｍＬアリコートを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで、０．５ｍＬのポリプロピレンチューブ中で≦−６５℃以下で凍結した状態で採取した。

先ず初めにポリソルベート２０レベルの影響を確認するために、材料の３時間のトラック輸送を用いて輸送模擬輸送試験を行い、続いてランダムテストオプション（Ｌａｎｓｍｏｎｔ（Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）によって実行）を用いた保証レベル１で１時間の気密試験を行った。サンプルを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、粒子の外観および可溶性凝集体について分析した。

安定性に及ぼす攪拌ストレスの影響を検討するために、生理食塩水製剤（５０ｍｇ／ｍＬ、１５４ｍＭのＮａＣｌ、および０．００５％のＰＳ−２０）を、テフロン（登録商標）マグネチック攪拌バー（長さ８ｍｍおよび直径２ｍｍ）を含む３ｍＬ型ガラスバイアル内に１．３ｍＬで充填し、１３ｍｍストッパーで止めた。バイアルを設定６（設定６の選択は、過剰の泡立ちを生じることがない最大速度）で速度を設定した攪拌プレート上に配置した。０、２、２４、４８、および７２時間で外観を決定した。ベースラインおよび７２時間攪拌したサンプルを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法でテストした。
リード製剤についての熱安定性試験

６種のリード製剤を、熱安定性について比較した。これら製剤は、２つのパラメータに基づいて選択された。第１のパラメータは、ＣＮＳ送達のための治療域内で必要とされるタンパク質濃度であった。第２のパラメータは、安定性に及ぼすリン酸塩濃度の影響を制御するためのものである。バイアル濾過されたＳＥＣプールを、ＣｅｎｔｒｉｃｔｉｏｎＰｌｕｓ−８０を用いて、緩衝液交換し濃縮した。５０および１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の目的の濃度が得られた。６種の製剤に、最終濃度０．０１％のＰＳ−２０のために、１％ポリソルベート２０溶液をスパイクした。材料を０．２２マイクロメートルＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、０．５ｍＬを２ｍＬのホウケイ酸ガラスバイアルに添加した。これらバイアルを、逆さにして、負荷安定性（４０℃）、加速安定性（２５℃）、およびリアルタイム保存（２〜８℃）に配置した。それぞれの時間点での安定性サンプルを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＯＤ３２０、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）、ｐＨ、および活性によって試験した。
生理食塩水製剤における安定性の理解

生理食塩水製剤においてｐＨがどのように維持されるかを理解するために、以下の試験が行われた。
生理食塩水製剤におけるリン酸塩の残留試験

バイアル濾過されたＳＥＣプール（２ｍｇ／ｍＬのイズルスルファーゼ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）を、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＦＦシステムおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎＢｉｏｍａｘ３０，５０ｃｍ^２フィルターを用いて濃縮し、１５０ｍＭのＮａＣｌに透析濾過した。０．９％生理食塩水（ＴＫ３で調製）への透析濾過の７Ｘ、１０Ｘおよび１５Ｘサイクル後に、タンパク質に結合されたリン酸塩の量を決定した。更に、１０Ｘ透析濾過後の透過液（濾過を通してタンパク質を含有しないフロー）および濾過で使用された生理食塩水もまた試験された。タンパク質濃度がｐＨに及ぼす影響の判定

緩衝液（リン酸塩）が存在しない状態でのｐＨの制御をより良く理解するために、タンパク質影響試験が行われた。タンパク質のｐＨへの関与を決定するために、材料を１５４ｍＭのＮａＣｌ（生理食塩水）中で、３０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、および生理食塩水単独に希釈した。材料を、各チューブ当たり１ｍＬの充填容積で、２ｍＬのポリプロピレンチューブに等量に分けた。サンプルを≦−６５℃で１時間凍結させて、周囲温度で３０分間融解し、このサイクルを３回繰り返した。最初のｐＨを測定し、３Ｘ凍結／融解サイクル後のものと比較した。ｐＨシフトに及ぼす可能性があるタンパク質濃度の影響を決定するために、サンプルの２４時間の周囲温度露出（チューブのキャップを開けることによって）後にもｐＨが測定された。

ＣＮＳ送達に好適な賦形剤が制限されているために、イズルスルファーゼの髄腔内送達用の製剤開発のための取り組みは、全身的投与のためのＩ２Ｓ製剤と等価な安定性を維持すると同時に、リン酸塩およびポリソルベート２０レベルを低減することに焦点が当てられた。３種の重要なスクリーニングストレス試験が行われ、これらは、凍結融解、振盪ストレス、および熱ストレスが挙げられる。
生理食塩水およびリン酸塩製剤中のイズルスルファーゼに及ぼす凍結／融解の影響

表１０に示されるように、２ｍｇ／ｍＬの低タンパク質濃度で、２０ｍＭのリン酸塩含有製剤は、凍結融解ストレス後により多くの凝集体を生じた。生理食塩水製剤は、ベースラインと同一レベルの凝集体のままであった。高タンパク質濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）では、凍結融解ストレスは、いずれの製剤の安定性にも影響を及ぼさないように思われた（表１１）。このデータは、生理食塩水単独製剤が、凍結融解ストレスに対してより良好な安定性を有することを示唆した。
溶液中のイズルスルファーゼに及ぼす振盪ストレスの影響

振盪試験が、２、８、および１００ｍｇ／ｍＬの３種のタンパク質濃度レベルで行われた。データは、ポリソルベート２０が存在しない場合、沈殿が全てのタンパク質濃度で発生し、高レベルの可溶性凝集体が、２ｍｇ／ｍＬで観察されることを示した（表１２〜表１４）。しかしながら、０．００５％などの低レベルのＰ２０の存在下では、沈殿および可溶性凝集体はほとんど抑制された。データは、低レベルのポリソルベートがタンパク質を振盪ストレスに対して保護するために必要とされることを示唆した。
表１２〜１４：研究室モデルにおける振盪試験（周辺温度で、２５０ｒｐｍで２４時間の回転）

０．００５％が振盪に対する安定性について十分であるかどうかを更に確認するために、実際の輸送条件に近いものである模擬輸送試験が、ポリソルベート２０の異なるレベルで、１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する生理食塩水製剤で行われた。結果は、０．００５％が十分であることを裏付けた（表１５）。

０．００５％のポリソルベート２０で、５０ｍｇ／ｍＬのイズルスルファーゼを含有する生理食塩水製剤に及ぼすマグネチック攪拌バーを用いる攪拌の影響が、表１６に概説されている。示されるように、タンパク質は、マグネチック攪拌バーを用いる７２時間の攪拌によって生じるストレスには感受性がない。この結果は、０．００５％が攪拌ストレスに対して十分であることを同様に裏付けた。
リード候補物についての熱安定性

６種の重要な製剤が、安定性試験のために２４ヶ月にわたり試験された。これら試験の結果が、このセクションで説明されている。
外観

全ての製剤の外観は、僅かに乳白色のままであり、６種の製剤について試験された全ての温度および時間点で、本質的に粒子を含まなかった。
ＯＤ３２０

混濁度での潜在的増加を検討するために、ＯＤ３２０値を決定し、表１７に概説された。示されるように、凍結保存では、全ての製剤についてのＯＤ３２０値は、２４ヶ月保存後に、ベースラインと同様のままであった。２〜８℃条件では、生理食塩水製剤は、ベースラインと同様のままであったが、リン酸塩含有製剤は、ＯＤ３２０値での増加したレベルを有した。２５℃の加速条件では、生理食塩水製剤はまた、３〜６ヶ月後にＯＤ３２０における僅かな増加を有したが、リン酸塩含有製剤は、より著しい増加を示した。これらの結果は、生理食塩水製剤が、熱ストレスに対してより安定であることを示唆している。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ

ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってテストされた全ての製剤のデータ一覧が、表に示されている。凍結保存条件では、ベースラインと比較して２４ヶ月後に変化はなかった。

４０℃のストレス条件では、２週間後に全ての製剤が、可溶性凝集体の増加したレベルを有した。更に、リン酸塩含有製剤はまた、「１２分」ピークを示した。しかしながら、１ヶ月後には、リン酸塩含有製剤で観測されたこの「１２分」ピークは、消失するように見えた。加えて、可溶性凝集体レベルは、２週間の時間点と比較して、全ての製剤についてそれ以上増加しなかった（図８および表１８）。

２５℃の加速条件では、ベースラインと比較して、全ての製剤について、可溶性凝集体の増加したレベルが６ヶ月後には最小であった。しかしながら、リン酸塩含有製剤は、「１２分」ピークを示した（図９および表１８）。

２〜８℃の長期保存条件では、２４ヶ月後に、全ての製剤についての可溶性凝集体の増加はまた、２４ヶ月保存後に最小であった。全ての条件で一貫して、リン酸塩含有製剤はまた、「１２分ピーク」を有し、これは経時的に僅かに増加した（図１０および表１８）。

これら結果は、生理食塩水製剤が、全ての保存条件で、リン酸塩含有製剤と比較して最小の変化に止まることを示唆している。
ＳＡＸ−ＨＰＬＣ

ＳＡＸ−ＨＰＬＣについてのデータ一覧が、表１９に表示されている。ストレス負荷／加速条件では、生理食塩水製剤は、わずかに多い変化を有したように見えたが（図１１および１２）、長期保存条件では、全ての製剤について、２４ヶ月後に変化はなかった（表１９および図１３）。これは、生理食塩水製剤が、２〜８℃で２４ヶ月間安定であることを示している。
ｐＨ

表２０は、全ての製剤のｐＨが、２〜８℃で２４ヶ月間、ベースラインに匹敵するｐＨのままでいたことを示している。生理食塩水製剤については、緩衝液が存在しないが、ｐＨは、２４ヶ月間、６．０で一定に維持された。
酵素活性

参照標準と比較すると、２〜８℃で２４ヶ月後に、全ての製剤についての比活性は、アッセイ間の偏差内で同等であり、これは、イズルスルファーゼが、２４ヶ月間、生理食塩水製剤中で安定のままでとどまることを示唆している（表２１）。

生理食塩水製剤の調製における最終的ＵＦ／ＤＦ工程は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウムからのタンパク質を１５０ｍＭのＮａＣｌへと透析濾過するために用いられた。透析濾過サイクル数が最終生成物中の残留リン酸塩濃度にどのように影響を及ぼすかを検討するために、研究室スケールでの試験が、製剤原料（２ｍｇ／ｍＬのイズルスルファーゼ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）を用いて行われた。製剤原料を先ず初めに、５０ｍｇ／ｍＬのイズルスルファーゼに濃縮し、次いで１５０ｍＭの生理食塩水中に透析濾過した。サンプルを、７Ｘ、１０Ｘ、および１５Ｘ透析濾過工程で採取し、リン酸塩含量についてＩＣＰによって試験した。試験結果は、表２２に概説されている。示されるように、生理食塩水透析濾過溶液は、いずれのリン酸塩も含有しない。７ＸＤＦ後に、タンパク質は約０．２２ｍＭのリン酸塩を含有し、これは、理論的に計算された値よりも高かった。１０ＸＤＦ後に、通過液が約０．０７ｍＭのリン酸塩であったが、タンパク質保持物質は約０．１６ｍＭのリン酸塩を含有し、このことは、リン酸塩がタンパク質に結合していることを示唆した。１５ＸＤＦ後には、リン酸塩レベルは約０．０７ｍＭに下降した。

この試験からの結果は、約０．２ｍＭのリン酸塩残基が、製剤原料中に残留していることを示し、これは、生理食塩水製剤が６．０のｐＨを維持していることに寄与していると思われる。
製剤ｐＨの維持に及ぼすタンパク質濃度の影響

リン酸塩含量分析から、タンパク質へのリン酸塩の結合が明白となった。したがって、高濃度のタンパク質がより多くのリン酸塩に結合し得ることが予期され、このことがｐＨをより良好に維持する可能性がある。この仮説を検討するために、生理食塩水溶液中のタンパク質を異なるレベルに濃縮し、異なる処理条件後の溶液のｐＨをテストした。この結果が、表２３に概説されている。

表示されるように、溶液の最初のｐＨが、タンパク質濃度に依存して約６．０に維持された。しかし、周囲温度に２４時間露出後または３回の凍結融解サイクル後に、０．１ｍｇ／ｍＬまたはそれ未満のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６．０周辺で一定のｐＨを維持しなかった。１ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上のタンパク質濃度では、溶液のｐＨは、６．０周辺で維持された。このことは、タンパク質濃度が、生理食塩水溶液のｐＨを維持する上での制御因子であることを確証した。

この試験からの結果は、生理食塩水製剤（５０ｍｇ／ｍＬのイズルスルファーゼ、０．００５％のポリソルベート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中のイズルスルファーゼが、２〜８℃で保存される場合、少なくとも２４ヶ月安定であることを立証した。この製剤は、リン酸塩含有製剤に比べてより安定であると思われる。０．００５％のポリソルベート２０の選択は、タンパク質を振盪ストレスに対して保護するために十分であった。更に、この試験は、生理食塩水製剤のｐＨが、２〜８℃で２４ヶ月間、６．０で安定に維持され得ることも示し、これは最終製剤における残留リン酸塩および高タンパク質濃度に部分的に起因するものである。
実施例５：生体分布

髄腔内腔内投与がＣＮＳの組織へのＩ２Ｓを送達する有効な方法であることが成功裏に立証されたので、ＩＴ投与されたＩ２Ｓが脳の深部組織への分布が可能であるかどうか、ならびにＩＴ投与されたＩ２Ｓの細胞局在化があるかどうかを決定するために、追加的試験が行われた。組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）製剤を、６．０のｐＨで、１５４ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート２０のビヒクル中で調製かつ製剤化した。

非ヒト霊長類に、Ｉ２Ｓの３ｍｇ、３０ｍｇ、または１００ｍｇのいずれかを月単位で、移植した髄腔内腔内ポートによって、６ヶ月間継続して投与した。試験の計画が、以下の表２４に概説されている。

６ヶ月間の非ヒト霊長類へのＩ２Ｓの繰り返し毎月投与は、テストされた最高用量で良好に忍容され、いずれの重大な有害毒性学的事象に関連しなかった。Ｉ２Ｓの第６回目および最終用量の投与後２４時間に、対象の非ヒト霊長類を致死させて、このようなヒト以外の霊長類のＣＮＳ組織を検査した。

免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって判定されたように、ＣＮＳの細胞および組織全体にＩ２Ｓの広範な細胞堆積があった。Ｉ２Ｓタンパク質は、大脳皮質から脳室白質までの堆積勾配を伴い、ＩＨＣによって脳の全ての組織で検出された。灰白質では、Ｉ２Ｓは、全ての群において、用量依存型の様式で、大脳、小脳、脳幹、および脊髄のニューロンで検出された。高投与量群の表面灰白質では、大多数の脳ニューロンが、表面皮質でのＩ２Ｓ染色について陽性であった（図４０Ａ）。Ｉ２Ｓは、視床（図４０Ｂ）、海馬（図４０Ｃ）、尾状核（図４０Ｄ）および脊髄（図４０Ｅ）内のニューロンでも検出された。髄膜細胞および血管周囲細胞もまた、Ｉ２Ｓ染色について陽性であった（図４０Ｆ）。

図４１および４２に示されるように、対象の非ヒト霊長類のＣＮＳの組織への、特に灰白質、視床および大脳皮質へのＩＴ投与されたＩ２Ｓの分布が認められる。更には、図４２および４３は、ＩＴ投与されたＩ２Ｓが、用量依存型様式で、被験者のヒト以外の霊長類の示されたＣＮＳ組織で蓄積することを図示している。共局在化染色はまた、Ｉ２ＳのＩＴ投与が、ニューロンおよび希突起グリア細胞の双方と結合することを明らかにした。ＩＴ投与されたＩ２Ｓはまた、図４４によって実証されたように、対象のヒト以外の霊長類の大脳全体に分布かつ局在化する。特に、図４５は、フィラメント染色によって示されたように、対象の非ヒト霊長類へのＩＴ投与後のＩ２Ｓのニューロンによる取り込みおよび軸索結合を図示している。また特に興味深いのは、本試験はＩ２Ｓがニューロン細胞に対して選択的であることを示していることであり、このようなニューロン細胞は、脳の深部組織への髄腔内腔内投与されたＩ２Ｓの分布を促進し、軸索構造と結合するように見え、これはＩ２Ｓの順行性軸索輸送を示唆している。

以下の表２５は、個別の動物試験についての種々の投与経路および投与量の薬物動態データを表している。

以下の表２６に示されるように、^１２４Ｉ標識化Ｉ２Ｓを試験動物に投与し、ＰＥＴスキャン結果が図６２、図６３に示されている。

本試験はまた、ＩＴ投与後の対象の非ヒト霊長類の脳室近くの白質脳組織におけるＩＴ投与されたＩ２Ｓの細胞特定も立証した。白質内のＩ２Ｓ染色密度は、灰白質よりも概ね低いが、Ｉ２Ｓは希突起グリア細胞内で検出された（図４６）。特に、図４６は、白質脳組織におけるＩ２Ｓの細胞特定を示していて、Ｉ２Ｓがミエリンと結合するようには見えないことを更に立証している。

ＩＴ投与されたＩ２Ｓの脳組織の深部への分布を立証したことに加えて、本試験はまた、標的の細胞内小器官へのＩ２Ｓの局在化、重要なことは、ハンター症候群などのリソソーム蓄積疾患において影響を受ける細胞内小器官であるリソソームへのＩ２Ｓの局在化を確認したことである。特に、Ｉ２Ｓは、リソソーム内に局在化され、軸索内でも検出された。図４６は、対象の非ヒト霊長類の希突起グリア細胞のリソソーム内のＩＴ投与されたＩ２Ｓの局在化を示していて、したがって、ＩＴ投与されたＩ２Ｓは、脳の組織の深部に分布することが可能であり、ならびに細胞内局在化が可能であることを確認した。

送達されたＩ２Ｓが生物学的活性を保持しているかどうかを明らかにするために、脳におけるＩ２Ｓのレベルを、比活性アッセイを用いて測定した。最後の投与後２４時間の３ｍｇのＩＴ群の脳における活性は、装置対照およびビヒクル対照動物での基底レベルと明らかな差はなかった。３０ｍｇおよび１００ｍｇのＩＴ投与動物の脳における酵素活性は、死体解剖時（投与後２４時間）ではベースライン以上であった。

脳へのＩＴ送達後のＩ２Ｓの生体内分布を明らかにするための更なる動物試験が、図６０に示され、サンプル番号は以下の表２７に対応する。
実施例６：ＩＴ送達対ＩＣＶ送達

前述の実施例で観察されたＩ２Ｓ分布が、単回ＩＴまたはＩＣＶ用量が投与された健常なビーグル犬でも再現された。雄ビーグル犬を、コンピューター作成番号を用いて、２つの群（１群（ＩＣＶ）、Ｎ＝３；２群（ＩＴ）、Ｎ＝４）に無作為割付した。全てのビーグル犬は、腰椎でのクモ膜下腔内または左側脳室内（投与用）ならびに大槽内（サンプリング用）に移植されたカテーテルを有した。全てのカテーテルは、皮下チタンアクセスポートに終結した。追加の犬が、非投与の外科的対照として用いられた。

Ｉ２Ｓの単回ボーラス１ｍＬ注射（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；１３７ｍＭ塩化ナトリウム；０．０２％ポリソルベート−２０中３０ｍｇ／ｍＬ）がＩＴまたはＩＣＶで投与され、続いて、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で０．３ｍＬ流された。臨床的徴候を監視し、投与後２４時間で致死させた。ＥＬＩＳＡ、Ｉ２Ｓ酵素活性およびＩＨＣによって決定されるような定量的Ｉ２Ｓ分析用に脳および脊髄組織サンプルを採取し、試験群間で比較した。

ＩＨＣによって決定されたように、Ｉ２Ｓは、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方の灰白質全体に広く分布した。大脳皮質では、図４７（ＡおよびＢ）によって示されるように、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方で、ニューロンは、表面の分子層から深部の内層までの６つのニューロンでＩ２Ｓについて陽性であった。ＩＴおよびＩＣＶ群の大脳皮質では、図４７（ＣおよびＤ）で示されるように、Ｉ２Ｓは、プルキンエ細胞を含むニューロンで検出された。ＩＴおよびＩＣＶ群の双方において、図４７（ＥおよびＦ）に示されるように、海馬内のニューロンの大集団が、Ｉ２Ｓに陽性であった。Ｉ２Ｓ陽性ニューロンはまた、図４７（ＧおよびＨ）で示されるように、両群において、視床および尾状核でも確認された。

したがって、本試験は、脳の深部細胞および組織分布するためのＩＴ投与された酵素の能力を確認し、ならびにハンター症候群などのリソソーム蓄積疾患に関連するＣＮＳ症状発現の治療のためのＩＴ投与されたＩ２Ｓなどの酵素の利用を裏付ける。
実施例７：イズロン酸−２−スルファターゼ欠損動物モデル

ＩＴ投与されたＩ２Ｓが、脳の組織の深部への分布が可能であることならびにＩ２Ｓの細胞内局在化が立証されたので、ＩＴ投与されたＩ２Ｓの治療的有効性を判定するために、更なる試験が行われた。ＩＴ投与されたＩ２Ｓの疾患の進行を変更するための能力を試験するために、ハンター症候群の遺伝子的に処理されたイズロン酸−２−スルファターゼノックアウト（ＩＫＯ）マウスモデルを開発した。このＩ２Ｓノックアウトマウスモデルは、組織および器官においてグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積を生じさせるＩ２Ｓ遺伝子座の標的破壊を用いて開発された。ＩＫＯマウスモデルは、特徴的顔貌および骨格異常が挙げられるヒトで見られるハンター症候群の多くの身体的特徴を呈する。更に、ＩＫＯマウスモデルは、尿および体全体の組織におけるグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の上昇したレベル、ならびに組織病理学的に観察された広範囲の細胞空胞化を示す。

本試験において、市販のＩ２Ｓ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））を濃縮し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。８〜１２週齢の雄ＩＫＯマウスの６つの群を、Ｉ２Ｓ（１０μｌ；２６ｍｇ／ｍｌ）で処置した。ＡおよびＢ群（Ｎ＝３）には、それぞれＩ２Ｓの２６０μｇ用量を３回（１、８、および１５日目に）および２６０μｇ用量を２回（１および８日目に）髄腔内腔内投与した。Ｄ群もまた、１、８、および１５日目で、２６０μｇの３回の髄腔内腔内投与で処置した。Ｃ群およびＥ群（Ｎ＝３）は未処置対照群であり、Ｆ群（Ｎ＝３）は、未処置の野生型対照であった。対照マウスには、Ｉ２Ｓを含まないビヒクルを投与した。最後の注射後１時間でマウスを致死させて、続いて免疫組織化学法（ＩＨＣ）および組織病理学的分析用に組織調製を行った。

３回目の注射後に、ビヒクル処置マウスに比べてＩ２Ｓ処置マウスで、表面大脳皮質、尾状核、視床および小脳における細胞内空胞化の広範囲の減少があった。細胞内空胞化における減少はまた、ＩＴ処置後に白質において確認された。ＩＫＯマウスの脳組織へのＩ２Ｓの分布は、ＩＴ投与後に明白であった。

ＩＫＯマウスにおけるＩ２Ｓの３週間のＩＴ投与もまた、光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルの双方で、ＣＮＳ細胞内空胞化での著しい減少を示した。Ｉ２ＳのＩＴ投与後の細胞内空胞化の減少は、未処置ＩＫＯマウスに対して明確であって、これは、ＩＴ投与されたＩ２Ｓが疾患の進行を変更することが可能であることを示唆している。図４８に示されるように、細胞空胞化の減少は、Ｉ２ＳのＩＴ投与後にＩＫＯマウスの脳梁および円蓋で顕著であった。図４９は、処置されたＩＫＯマウスの大脳皮質組織における、リソソーム疾患の病理学的生物マーカーであるリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）の存在の著しい減少を示している。

更には、電子顕微鏡は、灰質内のニューロンでの蓄積封入体および白質内の希突起グリア細胞での空胞化の存在の減少を立証した。特に、ＩＫＯマウスのＩＴ投与されたＩ２Ｓは、特定のリソソーム蓄積疾患の特徴である柵状ラメラ体（ゼブラ小体）の減少を立証した。特に、図５は、未処置ＩＫＯマウスに対するＩ２Ｓを投与されたＩＫＯマウスのニューロン内の特徴的ゼブラ小体の減少を示している電子顕微鏡走査を表している。同様に、図５は、脳梁内の希突起グリア細胞の電子顕微鏡走査を示す。

加えて、ＩＫＯマウスへのＩ２ＳのＩＴ投与はまた、表面大脳皮質、尾状核、視床、小脳および白質において、リソソーム活性および病状の指標である、リソソーム疾患病理学的生物マーカーのリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）免疫染色での顕著な減少も示した。図４９Ａに示されるように、ＬＡＭＰ１免疫染色での顕著な減少は、図４９Ｂに示される未処置のＩＫＯ対照マウスの表面大脳皮質組織に対して、処置されたＩＫＯマウスの表面大脳皮質組織で明白であって、これは病変での改善を反映している。

図２０は、脳組織のμｍ^２領域で測定されたＬＡＭＰ−１の濃度を図示しかつ比較する。種々の脳領域のＬＡＭＰ−１免疫染色の形態計測学的分析は、評価された脳の領域におけるＬＡＭＰ−１陽性染色での著しい減少があることを確認した。図４に示されるように、評価された脳組織のそれぞれの領域（皮質、尾状核および被殻（ＣＰ）、視床（ＴＨ）、小脳（ＣＢＬ）および白質（ＷＭ））で、ＬＡＭＰ−１陽性領域は、未処置ＩＫＯ対照マウスに対して処置ＩＫＯマウスで減少され、野生型マウスのＬＡＭＰ−１陽性領域に近づいた。特に注目すべきことは、分析された脳組織の各領域におけるＬＡＭＰ−陽性領域は、継続された処置時間で更に減少された。

異常に高いリソソーム活性の減少は、脳の全ての領域での劇的な形態的改善に相関した。これら結果は、ＩＴ投与されたＩ２Ｓが、遺伝子的に処理されたＩＫＯマウスモデルにおいて、リソソーム蓄積疾患の進行を変更させることが可能であることを裏付け、ならびにハンター症候群などのリソソーム蓄積疾患に関連するＣＮＳ症状発現を治療するためのＩＴ投与されたＩ２Ｓなどの酵素の能力を更に裏付けた。
実施例８：ハンター症候群患者の治療

例えばＩＴ送達を通じての直接的ＣＮＳ投与は、ハンター症候群患者を効果的に治療するために用いられ得る。この実施例は、後期小児型ハンター症候群を有する患者への髄腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を介しての合計で４０週間の３段階隔週（ＥＯＷ）のＩ２Ｓ投与までの安全性を評価するために計画された多施設用量漸増試験を示す。ヒトへの治療に好適な種々の例示的髄腔内薬剤送達装置が、図４５〜４８に示されている。

２０人の患者が登録を予定した：
集団１：５人の患者（最低用量）
集団２：５人の患者（中間用量）
集団３：５人の患者（最高用量）
５人の患者が非処置に無作為割付される。

患者は、以下の基準の試験参加に基づいて試験用に選択され、（１）３０ヶ月齢前に第１の症状の出現があること；（２）スクリーニング時での来院（一人で立ち上がり、片手の支持で前に１０歩歩行する能力として定義された）ができること；（３）スクリーニング時に神経学的徴候の存在があることである。典型的には、造血幹細胞移植の既往歴を有する患者は除外される。

後期小児型ハンター症候群を有する子供における４０週間のＩＴ注射によるＩ２Ｓ投与の増量試験の安全性が決定される。更に、全体の運動機能に及ぼすＩ２Ｓの臨床的活性、ならびに血清中の単回および反復投与の薬物動態および脳脊髄液（ＣＳＦ）中の濃度が評価される。

Ｉ２Ｓの治療的有効量が、疾患の影響の性質および程度に依存して、ならびに進行の基準に依存して、規則的間隔で髄腔内腔内投与される。本明細書で使用されるとき、「間隔」での投与とは、治療的有効量が定期的に投与される（１回投与から区別されるものとして）ことを指す。このインターバルは、標準的な臨床的技術によって決定され得る。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓは、およそ隔週で髄腔内投与される。単一個体のための投与間隔は、固定された間隔である必要はないが、個体の必要性に依存して経時的に変化され得る。例えば、身体の病気またはストレス時に、抗Ｉ２Ｓ抗体が存在するようになるかまたは増加する場合、或いは病状が悪化する場合、投与間の間隔は減らされることができる。
実施例９：ハンター症候群患者の治療

例えばＩＴ送達を通じての直接的ＣＮＳ投与は、ハンター症候群患者を効果的に治療するために用いられ得る。この実施例は、後期小児型ハンター症候群を有する患者への髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を介しての合計で６ヶ月の３段階の毎月Ｉ２Ｓ投与までの安全性を評価するために計画された多施設用量漸増試験を示す。ヒトへの治療に好適な種々の例示的髄腔内腔内薬剤送達装置が、図４５〜４８に示され、試験の概略が図６２に示されている。

１６人までの患者が登録予定である。
集団１：４人の患者（最低用量−１０ｍｇ）
集団２：４人の患者（中間用量−３０ｍｇ）
集団３：４人の患者（最高用量−１００ｍｇ）
４人の患者は、非処置または装置の非使用に無作為割付される。

ハンター症候群患者は、初期発育段階の遅延（例えば、歩行、言語、排泄訓練）知的欠損、過剰亢進、攻撃性、聴覚障害、癲癇および水頭症が挙げられる認知および神経発生学的障害を頻繁に発現する。この指標の全てが、試験についての基準の一部であり得る。患者は、以下の基準の試験参加に基づいて試験用に選択され、（１）３〜１８歳の年齢であること；（２）７７未満の知能指数または過去３年で１５〜３０のＩＱ点の下降があること；（３）ＣＳＦの遮断または十分に制御されない発作障害がないこと、および（４）麻酔および／または手術危険度を示す共存症がないことである。

後期小児型ハンター症候群を有する子供における６ヶ月間のＩＴ注射によって投与されるＩ２Ｓの用量漸増の安全性が決定される。加えて、全体の運動機能に及ぼすＩ２Ｓの臨床的活性、ならびに血清中の単回および反復投与の薬物動態および脳脊髄液（ＣＳＦ）中の濃度が評価される。

この試験の目的は、Ｉ２Ｓの漸増用量の安全性および耐容性、ならびにＩＤＤＤの安全性、忍容性および長期開存性を評価することであろう。更には、単回および反復ＩＴ投与後のＣＳＦおよび末梢血液中のＩ２Ｓの濃度、ならびにＣＦ生物マーカーおよび尿ＧＡＧに及ぼすＩ２Ｓの影響が評価されるだろう。更なる評価としては、生理学的および神経認知的評価、神経機能および脳構造体積などの臨床パラメータに及ぼすＩ２Ｓの影響も挙げられるだろう。加えて、日常生活および生物マーカーと症状との間の関係性に及ぼす治療の効果が評価され得る。

Ｉ２ＳのＩＴ送達によるハンター症候群患者の治療は、種々の組織（例えば、神経系、心臓、肝臓、腎臓、胆嚢、および他の臓器）におけるスルファチドの蓄積を減少させる。

本明細書に記載の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、後の実施例は単に本発明の化合物を例示するためのものであり、これらを限定することを意図するものではない。

本明細書および特許請求の範囲で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが明記されない限り、複数形の指示対象を含むということを理解するべきである。あるグループの１つ以上の要素の間に「または（若しくは、或いは）」が含まれる請求項または記載事項は、そうでないことが明記されるかまたは文脈から明らかでない限り、１つ、２つ以上またはすべてのグループの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する場合に満たされるものとする。本発明は、グループの中の正確に１つの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態を含む。また本発明は、グループの２つ以上の要素または全要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態も含む。更本発明は、別途明記されない限り、または矛盾若しくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙されている１つ以上の請求項の１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、基本請求項に従属する別の請求項に（または関連する他の任意の請求項として）組み込まれるすべての変更、組合せおよび置換を包含するということを理解するべきである。要素が列挙されている場合（例えば、マーカッシュ群またはこれと同様の形式において）、要素の各下位グループも開示され、任意の要素（１つまたは複数）がそのグループから除外され得ることを理解するべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の特定の実施形態または本発明の特定の態様は、このような要素、特徴などからなる、またはこのような要素、特性などから本質的になるということを理解するべきである。簡潔にするために、これらの実施形態があらゆる場合に正確に本明細書に具体的に記載されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様が、本明細書において具体的に除外されることが記載されているか否かにかかわらず、請求項から明確に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明するために、および本発明の実施に関する更なる詳細を提供するために本明細書において参照される刊行物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｉ２Ｓの３用量の髄腔内腔内注射後の、脳の表面を覆う髄膜細胞（矢印先端部）の層内にＩ２Ｓを含む大脳皮質および小脳皮質のニューロン（矢印）内で検出されたＩＴ送達されたＩ２Ｓおよびを示す例示的図である。２用量注射された脳におけるＩ２ＳＩＨＣの染色は、より弱かった（写真表示せず）。陽性Ｉ２Ｓ染色は、ビヒクル対照動物の脳のいずれの型の細胞についても観察されなかった。（４０Ｘ）髄腔内腔内−腰椎Ｉ２Ｓ注射後のＩ２Ｓノックアウト（ＩＫＯ）マウスの脳における病変の回復を示す例示的図である。Ｈ＆Ｅ染色された脳組織は、ビヒクル対照動物において多数の細胞内蓄積空胞（矢印）を示した。細胞内空胞化は、２用量（写真表示せず）および３用量が注射されたマウスの双方で脳全体を通して減少された。著しい減少は、３用量が注射されたマウスで認められた。（４０Ｘ）ビヒクル対照マウスと比較して、Ｉ２Ｓの２用量（写真表示せず）および３用量処置後に脳内でのリソソーム活性の著しい減少がある、ＬＡＭＰ−１の免疫組織化学染色を示す例示的図である。この減少は、ＬＡＭＰ−１陽性細胞の数での減少および脳全体の領域でのより明るい染色強度によって特徴付けられた。（４０Ｘ）大脳皮質（Ｃｏｒｔｅｘ）、尾状核（ＣＰ）、視床（ＴＨ）、白質（ＷＭ）および小脳（ＣＢＬ）における、野生型（ＷＴ）、ビヒクル未処置およびＩ２Ｓ（２および３用量）マウスの中での平均ＬＡＭＰ−１陽性領域の比較からの形態計測結果を示す例示的図であり、評価された脳の全ての領域でＬＡＭＰ−１陽性染色での著しい減少があることを確認された。データは、平均値±標準偏差、＃Ｐ＜０．０５；^＊Ｐ＜０．０１；^＊＊Ｐ＜０．００１として表されている。超微細構造レベルでの病変改善を示した脳細胞の例示的電子顕微鏡写真である。ビヒクル処置マウスのニューロンは、板状封入体、ゼブラ小体様構造、および顆粒状蓄積物質（インサート）を含有する空胞を有したが、これがＩ２Ｓ注射マウスでは減少された。ビヒクル処置マウスの希突起グリア細胞は、大きなエレクトロンルーセント蓄積空胞（矢印）を示したが、Ｉ２Ｓ注射マウスは、最小の空胞を有した。（スケールバー：ニューロン内、２μｍ；希突起グリア細胞内、５００ｎｍ）Ｉ２Ｓの３用量の髄腔内腔内注射後に、肝臓のシヌソイド細胞内で検出されたＩ２Ｓを示している例示的に免疫組織化学の結果を示す。２用量注射された肝臓におけるＩ２ＳＩＨＣ染色は、より弱かった（写真表示せず）。ビヒクル対照動物の肝臓では、陽性Ｉ２Ｓ染色はなかった。（４０Ｘ）肝臓からの例示的組織を示す。重篤な細胞空胞化および異常に高いリソソーム活性が、Ｈ＆Ｅ染色によって認められ、強いＬＡＭＰ−１免疫染色が、ＷＴ動物と比較してビヒクル対照動物で見出された。Ｉ２Ｓ処置の３用量および２用量（写真表示せず）での髄腔内腔内処置後に、細胞内空胞化およびＬＡＭＰ−１免疫染色の著しい減少が確認された。Ｈ＆Ｅ染色は、細胞質内空胞化が、ほとんど正常な肝臓細胞構造の状態で、ほぼ完全に消失することを示した。（Ｈ＆Ｅ、４０Ｘ；ＬＡＭＰ−１、２０Ｘ）生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および４０℃で１ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート −２０を含む）：≦−６５℃および４０℃で１ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および２５℃で６ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート −２０を含む）：≦−６５℃および２５℃で６ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および２〜８℃で２４ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：≦−６５℃および２〜８℃で２４ヶ月について、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対４０℃で１ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対４０℃で１ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対２５℃で６ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対２５℃で６ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対２〜８℃で２４ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースライン対２〜８℃で２４ヶ月について、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ法による変化を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：ベースラインおよび４０℃で１ヶ月について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート−２０を含む）：２５℃で６ヶ月および２〜８℃で１６ヶ月以上について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を比較する例示的データを示す。生理食塩水製剤およびリン酸塩製剤（全て０．０１％のポリソルベート −２０を含む）：２５℃で６ヶ月および２〜８℃で１６ヶ月以上について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を比較する例示的データを示す。３ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。髄膜細胞内に陽性Ｉ２Ｓ染色が認められた。（４Ｘ）３０ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。ニューロンおよび髄膜細胞内に陽性Ｉ２Ｓ染色が認められた。（４Ｘ）１００ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。陽性Ｉ２Ｓ染色ニューロンおよび髄膜細胞は、３および３０ｍｇ処置動物のものよりも強かった。（４Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の大脳を示している例示的組織を示す。ニューロンの大集団が、強い陽性の髄膜細胞に沿って１２Ｓ陽性であった。３０ｍｇ処置群動物において、大脳の層ＩＩＩ内の髄膜細胞に沿ったＩ２Ｓ陽性のニューロンおよびグリア細胞を示している例示的組織を示す。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物において、大脳の層ＩＩＩ内の血管周囲細胞に沿ったＩ２Ｓ陽性のニューロン、グリア細胞を示している例示的組織を示す。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物において、白質に隣接する大脳の層ＶＩ内のＩ２Ｓ陽性のニューロンおよびグリア細胞を示している例示的組織を示す。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物のニューロン（大脳）内の強い陽性Ｉ２Ｓ染色を示している例示的組織を示す。（１００Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の頚部脊髄のＩ２Ｓ免疫染色を示している例示的組織である。（４Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の腰部脊髄での強いＩ２Ｓ免疫染色を示している例示的組織である。（４Ｘ）髄膜細胞、グリア細胞、およびエピ／ペリ／内神経鞘（結合細胞）の強く陽性のＩ２Ｓ免疫染色が、１５０ｍｇ処置群動物の腰部で見出されたことを示している例示的組織である。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物の腰部脊髄内のニューロンが強くＩ２Ｓ陽性であったことを示す。（４０Ｘ）３ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。シヌソイド細胞のみがＩ２Ｓ陽性であった。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。シヌソイド細胞および肝細胞がＩ２Ｓ陽性であった。（４０Ｘ）１００ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓ免疫染色は、シヌソイド細胞および肝細胞で非常に強かった。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物に由来する肝臓からの例示的結果を示す。強く陽性のＩ２Ｓ染色が、シヌソイド細胞および肝細胞で特定された。（４０Ｘ）３ｍｇ処置群動物に由来する心臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓ免疫染色は陰性であった。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物からの心臓に由来する例示的結果を示す。間質細胞は、Ｉ２Ｓ陽性であった。（４０Ｘ）１００ｍｇ処置群動物に由来する心臓からの例示的結果を示す図である。Ｉ２Ｓについて、間質細胞染色は陽性であった。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物に由来する心臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓについて、間質細胞染色は強く陽性であった。（４０Ｘ）３ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す図である。Ｉ２Ｓ免疫染色は陰性であった。（４０Ｘ）３０ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す。糸球体細胞および間質細胞は、Ｉ２Ｓ陽性であった。１００ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す。Ｉ２Ｓについての糸球体細胞および間質細胞の染色の増加が認められた。（４０Ｘ）１５０ｍｇ処置群動物に由来する腎臓からの例示的結果を示す。近位細管細胞、糸球体細胞および間質細胞の陽性Ｉ２Ｓ染色が認められた。（４０Ｘ）イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の週単位用量を投与されたカニクイザルのＣＮＳ組織を評価する免疫組織化学（ＩＨＣ）試験の結果を示す。（ＩＨＣ）によって決定されたように、ＣＮＳ全体でＩ２Ｓの広範囲の細胞堆積があった。灰白質では、用量依存的様式で、全ての群の大脳、小脳、脳幹、および脊髄のニューロンでＩ２Ｓが検出された。高用量群の表面灰白質では、大多数の脳内ニューロンが、表面皮質においてＩ２Ｓについて陽性であった（図４０Ａ）。Ｉ２Ｓはまた、視床（図４０Ｂ）、海馬（図４０Ｃ）、尾状核（図４０Ｄ）および脊髄（図４０Ｅ）でも検出された。髄膜細胞および血管周囲細胞もまた、Ｉ２Ｓ染色陽性であった（図４０Ｆ）。特定されたスケールバーは２５μｍに相当する。投与後に頭蓋および脊髄プールでのＩ２Ｓの量を時間に対してプロットすることによって、頭蓋および脊髄プールにおけるイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の排泄をグラフで比較する。６ヶ月にわたり非ヒト霊長類に髄腔内腔内投与されたイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の用量依存的灰白質沈着を示す。図示された染色強度は、視床でのイズロン酸−２−スルファターゼの蓄積に相当する。この図４２では、ＤＡＰＩによって核が対抗染色され、青色で現れ、タンパク質（Ｉ２Ｓ）が緑色で現れた。単回注射および６ヶ月にわたる複数回注射後の非ヒト霊長類に髄腔内腔内投与されたイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の用量依存的灰白質沈着を示す図である。示した染色強度は、大脳皮質におけるイズロン酸−２−スルファターゼの蓄積に対応する。非ヒト霊長類の大脳全体を通してのイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の細胞内局在化を実証する。図４４Ａは、非ヒト霊長類の大脳から抽出された脳組織の横断図を示し、一方、図４４Ｂは、図４４Ａで同定された切片の白質組織の３つの領域（Ｗ１、Ｗ２およびＷ３と呼ぶ）、脳室付近の白質（ＶＷ）および表面灰白質（ＳＧ）組織に対応する特定領域を示す。６ヶ月間にわたる月１回注射後の非ヒト霊長類への髄腔内腔内投与イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）のニューロンおよび希突起グリア細胞取込みおよび軸索会合を示す。特に、図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃおよび図４５Ｄは、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を髄腔内腔内投与された非ヒト霊長類の大脳組織のフィラメント染色を示し、それぞれ、図４４Ｂで同定された白質の３つの領域（Ｗ１、Ｗ２およびＷ３）ならびに表面灰白質（ＳＧ）領域に対応する。図４５Ａは、白質（Ｗ１）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起グリア細胞取込みを示す。図４５Ｂおよび図４５Ｃは、それぞれＷ２およびＷ３白質組織における髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起神経膠取込みおよび軸索会合を示す。図４５Ｄは、表面灰白質（ＳＧ）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓのニューロン取込みを示す。６ヶ月間にわたる月１回注射後の非ヒト霊長類への髄腔内腔内投与イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）のニューロンおよび希突起グリア細胞取込みおよび軸索会合を示す。特に、図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃおよび図４５Ｄは、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を髄腔内腔内投与された非ヒト霊長類の大脳組織のフィラメント染色を示し、それぞれ、図４４Ｂで同定された白質の３つの領域（Ｗ１、Ｗ２およびＷ３）ならびに表面灰白質（ＳＧ）領域に対応する。図４５Ａは、白質（Ｗ１）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起グリア細胞取込みを示す。図４５Ｂおよび図４５Ｃは、それぞれＷ２およびＷ３白質組織における髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓの希突起神経膠取込みおよび軸索会合を示す。図４５Ｄは、表面灰白質（ＳＧ）組織中の髄腔内腔内投与Ｉ２Ｓのニューロン取込みを示す。非ヒト霊長類の脳室付近の白質（ＶＷ）中のイズロン酸−２−スルファターゼの細胞内同定を示す。補充画像に示すように、イズロン酸−２−スルファターゼはミエリンと会合されない（赤色）。本発明の図４６では、核はＤＡＰＩにより対比染色される（下左）。タンパク質（Ｉ２Ｓ）は上左枠で現れている。イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の単回注射を脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内腔内（ＩＴ）投与された健常ビーグル犬の組織における染色を示す。図４７Ａ〜４７Ｈで示されるように、Ｉ２Ｓは、免疫組織化学（ＩＨＣ）により確定されるように、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方の灰白質全体に広範に分布された。図４７Ａおよび４７Ｂは、大脳皮質において、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方の表面分子層から深部内部層まで、６つのニューロン層すべてで、ニューロンがＩ２Ｓに関して陽性であったことを示す。図４７Ｃおよび４７Ｄは、ＩＴおよびＩＣＶ群の小脳皮質において、Ｉ２Ｓが、プルキンエ細胞を含めてニューロン中で検出されたことを示す。同様に、図４７Ｅおよび４７Ｆは、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方で、海馬中のニューロンの大集団がＩ２Ｓに関して陽性であったことを示す。最後に、画像ｇおよびｈは、Ｉ２Ｓ陽性ニューロンが、ＩＴおよびＩＣＶ群の双方で、視床および尾状核においても見出されたことを実証する。本発明の図４７では、Ｉ２Ｓ染色は矢印で示されている。非処置のまたはＩ２Ｓを髄腔内腔内投与されたいずれかのイズロン酸−２−スルファターゼノックアウト（ＩＫＯ）マウスの脳梁組織を比較して示す。図示したように、処置ＩＫＯマウスは、Ｉ２Ｓ処置ＩＫＯマウスの脳梁および脳弓組織におけるある種のリソソーム貯蔵障害の特徴とする細胞内空胞化の低減を示した。図９３Ａは、非処置ＩＫＯ対照マウス（図４９Ｂ）に比して、処置ＩＫＯマウス（図４９Ａ）の表面大脳皮質組織中の、リソソーム病病理バイオマーカーであるリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）の存在の顕著な低減を示す。倍率２０倍および４０倍。図９３Ａは、非処置ＩＫＯ対照マウス（図４９Ｂ）に比して、処置ＩＫＯマウス（図４９Ａ）の表面大脳皮質組織中の、リソソーム病病理バイオマーカーであるリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）の存在の顕著な低減を示す。倍率２０倍および４０倍。例示的髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。例示的ＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）低プロフィール髄腔内腔内埋込み可能アクセス系を示す。例示的髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。ＣＮＳ酵素補充療法（ＥＲＴ）のための在宅投与を可能にする、髄腔内腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す。ニューロン内（プルキンエ細胞）のイズルスルファーゼの単回脳内注射後の空胞形性の例示的作用を示す。用量および領域による脳中のＩ２Ｓ活性を示す例示図である。大脳皮質の異なる深度でのイズルスルファーゼの免疫組織化学的局在化のデータを示す例示図である。イズルスルファーゼを髄腔内腔内用量投与後のサルの脊髄中のＩ２Ｓ活性を示す例示図である。イズルスルファーゼを髄腔内腔内用量投与後のサルの肝臓、心臓および腎臓中のＩ２Ｓ活性を示す例示図である。拡大ハンターＩＴ試験プログラムのための例示的模式図を表す。３０ｍｇ用量投与後の脳組織の種々の切片におけるＩ２Ｓ濃度の測定値を示す例示図である。異なるプロットは、異なる測定時間に対応する。種々の生成物濃度に関して種々の投与経路で長時間投与後のＩ２Ｓ濃度の測定値を示す例示図である。ＩＶ、ＩＴ−ＬまたはＩＣＶ用量投与後ｔ＝５時間でのカニクイザルにおける^１２４Ｉ標識化イズルスルファーゼ−ＩＴのＰＥＴ画像を例示図である。髄腔内腔内薬剤送達装置ＩＤＤＤの例示的線図である。対象の体内（図６４Ａ）および平面での表示（図６４Ｂ）の双方でのＩＤＤＤの多様な特徴を示す。対象の体内（図６４Ａ）および平面での表示（図６４Ｂ）の双方でのＩＤＤＤの多様な特徴を示す。対象の体内（図６４Ａ）および平面での表示（図６４Ｂ）の双方でのＩＤＤＤの多様な特徴を示す。

Claims

図面に記載された発明。