JP2018093870A

JP2018093870A - ヘルパーｔ細胞の活性化方法

Info

Publication number: JP2018093870A
Application number: JP2017237964A
Authority: JP
Inventors: 治夫杉山; Haruo Sugiyama; 真司十河; Shinji Sogo; 佐藤　政芳; Masayoshi Sato; 政芳佐藤; 竜生北本; Ryuki Kitamoto; 義博後藤; Yoshihiro Goto
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2010-10-05
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2018-06-21
Also published as: EP2626418A4; IL225536B; EP2626418B8; CN105802910A; IL225536A0; KR20200018738A; KR102079480B1; TWI608099B; JP2017006120A; MY170306A; KR20140009168A; MX361299B; JP6134139B2; MX2013003884A; BR112013008230A2; ZA201303056B; CO6710946A2; US10654892B2; WO2012046730A1; US20200354405A1

Abstract

【課題】ヘルパーＴ細胞を活性化する方法の提供。【解決手段】ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化させる工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである方法、そのための組成物、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化方法、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化誘導剤、ならびにヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などに関する。なお、本願は、２０１０年１０月５日出願の日本国特許出願第２０１０−２２５８０６号に対して優先権を主張するものであり、参照により該日本国特許出願の内容を本願に一体化させる。

ＷＴ１遺伝子（Wilms' tumor 1 gene）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の原因遺伝子として同定され、ジンクフィンガー構造を有する転写因子をコードする（非特許文献１および２）。その後の研究により造血器腫瘍や固形癌において癌遺伝子として働くことが示された（非特許文献３〜６）。

ＷＴ１タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部を有するペプチドを用いて末梢血単核球をインビトロで刺激することにより、ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、これらのＣＴＬがＷＴ１を内在的に発現する造血器腫瘍や固形癌の癌細胞を傷害することが示された。ＣＴＬは、前記ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に結合した複合体の形で認識するため、かかるペプチドはＭＨＣクラスＩのサブタイプにより異なる（特許文献１〜４、および非特許文献７）。

一方、ＣＴＬが有効に誘導されるためには、癌抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の存在が重要である（非特許文献８）。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子と抗原ペプチドとの複合体を認識して誘導・活性化される。活性化されたヘルパーＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはインターフェロンなどのサイトカインを産生することにより、Ｂ細胞の増殖、分化、成熟を補助する。かかるヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞の増殖・活性化を促進することにより免疫系を活性化する機能を有することから、癌免疫療法においてＭＨＣクラスＩＩ結合性の抗原ペプチドを介してヘルパーＴ細胞の機能を増強し、癌ワクチンの効果を増強することが有用であることが示唆される（非特許文献９）。

近年、ＷＴ１タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部を有する特定のペプチド（以下、本明細書においてＷＴ１ペプチドともいう）には、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ヘルパーＴ細胞を活性化できるpromiscuousヘルパーペプチドが存在することが示された（特許文献５および６）。しかしながら、このＷＴ１ペプチドが他のＭＨＣクラスＩＩ分子に対しても効果を有するかを検証することは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の種類が多いことから極めて困難であった。

国際公開２００３／１０６６８２号公報国際公開２００５／０９５５９８号公報国際公開２００７／０９７３５８号公報国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４１４６国際公開２００５／０４５０２７号公報国際公開２００８／１０５４６２号公報

Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69 Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20 Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84 Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76 Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505 Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107 Gao FG et al., Cancer Res. 2002 Nov 15;62(22):6438-41 Zeng G, J Immunother. 2001 May;24(3):195-204

したがって、本発明の解決課題は、特定のＷＴ１ペプチドを用いることにより、広範囲のＭＨＣクラスＩＩ分子陽性対象に適用してヘルパーＴ細胞を活性化する方法、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する方法、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化誘導剤、および癌の治療／予防用医薬組成物などを提供することである。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸配列：ＬｙｓＡｒｇＴｙｒＰｈｅＬｙｓＬｅｕＳｅｒＨｉｓＬｅｕＧｌｎＭｅｔＨｉｓＳｅｒＡｒｇＬｙｓＨｉｓを有するペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子に結合し、ヘルパーＴ細胞を活性化し、および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化させる工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである方法、
（２）ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちの少なくとも２つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである、（１）記載の方法、
（３）ＷＴ１ペプチドが、さらに、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子に結合する能力を有するものである、（１）または（２）記載の方法、
（４）ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加が、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞の添加により行われる、（１）から（３）のいずれか１つ記載の方法、
（５）ＷＴ１ペプチドが、アミノ酸配列：ＬｙｓＡｒｇＴｙｒＰｈｅＬｙｓＬｅｕＳｅｒＨｉｓＬｅｕＧｌｎＭｅｔＨｉｓＳｅｒＡｒｇＬｙｓＨｉｓ（配列番号：２）を含むペプチド、その変異体または修飾体である、（１）〜（４）のいずれか１つ記載の方法、
（６）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化させるための、ＷＴ１ペプチドを含む組成物であって、該ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである組成物、
（７）ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちの少なくとも２つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである、（６）記載の組成物、
（８）ＷＴ１ペプチドが、さらに、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子に結合する能力を有するものである、（６）または（７）記載の組成物、
（９）ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加が、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞の添加により行われる、（６）〜（８）のいずれか１つ記載の組成物、
（１０）ＷＴ１ペプチドが、アミノ酸配列：ＬｙｓＡｒｇＴｙｒＰｈｅＬｙｓＬｅｕＳｅｒＨｉｓＬｅｕＧｌｎＭｅｔＨｉｓＳｅｒＡｒｇＬｙｓＨｉｓ（配列番号：２）を含むペプチド、その変異体または修飾体である、（６）〜（９）のいずれか１つ記載の組成物、
（１１）ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体が提示されている抗原提示細胞であって、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子である、抗原提示細胞、
（１２）ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞であって、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子である、ヘルパーＴ細胞、
（１３）（１１）記載のヘルパーＴ細胞により活性化される、細胞傷害性Ｔ細胞、
（１４）（６）〜（１０）のいずれか１つ記載の組成物、（１１）記載の抗原提示細胞、（１２）記載のヘルパーＴ細胞、または（１３）記載の細胞傷害性Ｔ細胞のいずれかを有効成分として含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（１５）ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞のいずれかを有効成分として含む、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させるための医薬組成物であって、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、またはＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与するための医薬組成物、
（１６）ＷＴ１ペプチドに特異的に結合する抗体であって、該ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである抗体、
（１７）ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子陽性対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）前記対象から取得した試料をＷＴ１ペプチドを用いて刺激し、
（ｂ）サイトカインまたはヘルパーＴ細胞の存在または量を調べる、
工程を含み、サイトカインまたはヘルパーＴ細胞の存在または量の増大がＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を示すものである方法、
を提供する。

本発明によれば、ＷＴ１ペプチドを用いることにより、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する広範囲の対象に適用してヘルパーＴ細胞を活性化させる方法、そのための組成物、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる方法、そのための組成物、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化誘導剤、ならびにヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などが得られるので、かかるＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるインビボおよびインビトロでのヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、さらには癌の治療および予防などが可能となる。

図１は、提供者１（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６／１２０１、ＤＲＢ３^＊０１０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性）に由来するＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、ＷＴ１−３３２でパルスした各種提供者由来のＰＢＭＣと共培養した後に、ＩＦＮ−γ量を測定した結果を示す。図中、縦軸は、培養後の上澄み液におけるＩＦＮ−γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。横軸は、各種提供者において陽性を示すＨＬＡ−ＤＲＢ１、３および４分子の種類を示す。図２は、提供者２（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１／１１０１、ＤＲＢ３^＊０２０２、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性）に由来するＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、ＷＴ１−３３２でパルスした各種提供者由来のＰＢＭＣと共培養した後に、ＩＦＮ−γ量を測定した結果を示す。図中、縦軸は、培養後の上澄み液におけるＩＦＮ−γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。横軸は、各種提供者において陽性を示すＨＬＡ−ＤＲＢ１、３および４分子の種類を示す。図３は、提供者３（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１／０４０５、ＤＲＢ４^＊０１０２／０１０３陽性）に由来するＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、ＷＴ１−３３２でパルスした各種提供者由来のＰＢＭＣと共培養した後に、ＩＦＮ−γ量を測定した結果を示す。図中、縦軸は、培養後の上澄み液におけるＩＦＮ−γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。横軸は、各種陽性の提供者において陽性を示すＨＬＡ−ＤＲＢ１および４分子の種類を示す。図４は、提供者４（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１／１１０１、ＤＲＢ３^＊０２０２、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性）に由来するＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、ＷＴ１−３３２でパルスした各種提供者由来のＰＢＭＣと共培養した後に、ＩＦＮ−γ量を測定した結果を示す。図中、縦軸は、培養後の上澄み液におけるＩＦＮ−γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。横軸は、各種陽性の提供者において陽性を示すＨＬＡ−ＤＲＢ１、３および４分子の種類を示す。図５は、ＨＬＡ−クラスＩＩモノマータンパク質（ＤＲＢ１^＊０１０１、ＤＲＢ１^＊０４０５、ＤＲＢ１^＊１５０１、ＤＲＢ１^＊１５０２、ＤＲＢ１^＊０８０３、ＤＲＢ１^＊０９０１及びＤＲＢ４^＊０１０１）と各種ペプチドが特異的に会合したことを示す。図中、縦軸は、保持時間の移動度（分）を示す。横軸は、ＨＬＡ−クラスＩＩモノマータンパク質の種類を示す。また、棒グラフは添加したペプチドの種類（左から、ネガティブコントロール（□）、ポジティブコントロール（■）、ＷＴ１−３３２（斜線□））を示す。図６は、健常人の血液提供者（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１、１５０２、０４０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１、０９０１を少なくとも１つ以上有する、計延べ４２人）に由来するＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＴｈ１比率（ＣＤ４陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞比率）が経時的に有意に増加することを示す。図中、縦軸は、生細胞中のＣＤ４陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞数の割合（％）を表し、横軸は、培養日数（日）を表す。また、●は、ＷＴ１−３３２を添加誘導した試料（ＷＴ１−３３２誘導群）における割合を示し、○は、溶媒（コントロール）を添加誘導した試料（溶媒誘導群）における割合を示す。図７は、健常人の血液提供者（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１、１５０２、０４０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１、０９０１を少なくとも１つ以上有する、計延べ４２人）に由来するＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＣＴＬ細胞数（ＣＤ８陽性/ＩＦＮ−γ陽性の細胞比率）が経時的に有意に増加することを示す。図中、縦軸は、生細胞中のＣＤ８陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞数の割合（％）を表し、横軸は、培養日数（日）を表す。また、●は、ＷＴ１−３３２を添加誘導した試料（ＷＴ１−３３２誘導群）における割合を示し、○は、溶媒（コントロール）を添加誘導した試料（溶媒誘導群）における割合を示す。図８は、図６及び図７においてＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された１７検体（提供者２１〜３７）のＨＬＡ−ＤＲ拘束性について示す。それぞれにおいて、ＷＴ１−３３２添加誘導後１４日目のＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＩＦＮ−γ産生が認められ、そのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を添加し、培養した場合に抑制された。このことは、ＷＴ１−３３２により誘導されたＴ細胞がＨＬＡ−ＤＲ拘束性であることを示す。図中、縦軸は提供者番号（提供者２１〜３７）を示し、横軸はＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ/ｍＬ）を表す。また、■はＷＴ１−３３２刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示し、斜線□は、ＷＴ１−３３２＋抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示し、□は溶媒（コントロール）刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示す。図９は、図６及び図７においてＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された１７検体（提供者２１〜３７）それぞれにおいて、ＷＴ１−３３２添加誘導後１４日目のＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＴｈ１細胞（ＣＤ４陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞）数の割合が増加することを示す。図中、縦軸は提供者番号（提供者２１〜３７）を示し、横軸は生細胞中のＣＤ４陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞数の割合（％）を表す。また、■はＷＴ１−３３２刺激後の割合を示し、□は溶媒（コントロール）刺激後の割合を示す。図１０は、図６及び図７においてＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された１７検体（提供者２１〜３７）それぞれにおいて、ＷＴ１−３３２添加誘導後１４日目のＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＣＴＬ細胞（ＣＤ８陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞）数の割合が増加することを示す。図中、縦軸は提供者番号（提供者２１〜３７）を示し、横軸は生細胞中のＣＤ８陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞数の割合（％）を表す。また、■はＷＴ１−３３２刺激後の割合を示し、□は溶媒（コントロール）刺激後の割合を示す。図１１は、図６及び図７においてＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された９検体（提供者３８〜４６）のＨＬＡ−ＤＰ拘束性について示す。それぞれにおいて、ＷＴ１−３３２添加誘導後１４日目のＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＩＦＮ−γ産生が認められ、そのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を添加し、培養した場合、ならびに抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体を添加し、培養した場合のいずれにおいても抑制されなかった。このことは、ＷＴ１−３３２により誘導されたＴ細胞がＨＬＡ−ＤＰ拘束性であることを示す。図中、縦軸は提供者番号（提供者３８〜４６）を示し、横軸はＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ/ｍＬ）を表す。また、■はＷＴ１−３３２刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示し、斜線□はＷＴ１−３３２＋抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示し、縦線（破線）□はＷＴ１−３３２＋抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示し、ならびに□は溶媒（コントロール）刺激後のＩＦＮ−γ産生量を示す。図１２は、図６及び図７においてＨＬＡ−ＤＰ拘束性ＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された９検体（提供者３８〜４６）それぞれにおいて、ＷＴ１−３３２添加誘導後１４日目のＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＴｈ１細胞（ＣＤ４陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞）数の割合が増加することを示す。図中、縦軸は提供者番号（提供者３８〜４６）を示し、横軸は生細胞中のＣＤ４陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞数の割合（％）を表す。また、■はＷＴ１−３３２刺激後の割合を示し、□は溶媒（コントロール）刺激後の割合を示す。図１３は、図６及び図７においてＨＬＡ−ＤＰ拘束性ＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された９検体（提供者３８〜４６）それぞれにおいて、ＷＴ１−３３２添加誘導後１４日目のＴ細胞をＷＴ１−３３２で刺激した場合、ＷＴ１−３３２特異的なＣＴＬ細胞（ＣＤ８陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞）数の割合が増加することを示す。図中、縦軸は提供者番号（提供者３８〜４６）を示し、横軸は生細胞中のＣＤ８陽性/細胞内ＩＦＮ−γ陽性の細胞数の割合（％）を表す。また、■はＷＴ１−３３２刺激後の割合を示し、□は溶媒（コントロール）刺激後の割合を示す。

本発明は、１の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する工程を含むヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化方法であって、前記ＷＴ１ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである方法を提供する。本発明において、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する工程は、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を経ることにより行われてもよい。また、本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである。本発明に用いられるＷＴ１ペプチドはまた、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの少なくとも２つまたはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものであってもよい。また、本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ分子、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ分子のうちのいずれのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有していてもよい。

本発明において、ＷＴ１ペプチドは、配列番号：１に示されるヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列の一部を有するペプチドであってもよい。本発明のペプチドは、上記特徴を有する限り、そのアミノ酸配列および長さは特に限定されないが、ペプチドが長すぎると蛋白分解酵素の作用を受けやすくなり、短すぎるとペプチド収容溝にうまく結合できない。本発明のペプチドの長さは、好ましくは１０〜２５アミノ酸、より好ましくは１５〜２１アミノ酸、さらに好ましくは１６〜２０アミノ酸、例えば１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、あるいは１９アミノ酸である。本発明のペプチドの具体例は、アミノ酸配列：ＬｙｓＡｒｇＴｙｒＰｈｅＬｙｓＬｅｕＳｅｒＨｉｓＬｅｕＧｌｎＭｅｔＨｉｓＳｅｒＡｒｇＬｙｓＨｉｓ（配列番号：２）を含むものである。

さらに、本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、上記ペプチドの変異体も包含する。変異体は、例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドを含んでもよい。ペプチド中のアミノ酸の置換はいずれの位置でいずれの種類のアミノ酸との間で行われてもよく、保存的なアミノ酸置換が好ましい。保存的なアミノ酸置換の例としては、Ｇｌｕ残基をＡｓｐ残基に、Ｐｈｅ残基をＴｙｒ残基に、Ｌｅｕ残基をＩｌｅ残基に、Ａｌａ残基をＳｅｒ残基に、Ｈｉｓ残基をＡｒｇ残基に置換することなどが挙げられる。アミノ酸の付加もしくは欠失は、ペプチド中のＮ末端およびＣ末端で行うことが好ましいが、配列内部において行われてもよい。本発明のペプチドの好ましい具体例は、配列番号：２を有するものであるが、上記のいずれのペプチドであっても、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものであって、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（本明細書において、ＣＴＬともいう）を活性化することが条件となる。本明細書において、上記ＷＴ１ペプチドは「ＷＴ１−３３２」とも記載される。また、一般に、ヒトＭＨＣ分子をＨＬＡ分子ともいうので、本明細書ではＭＨＣをＨＬＡと同義語として使用する。

本発明のペプチドはまた、上記アミノ酸配列の修飾体であってもよい。上記アミノ酸配列中のアミノ酸残基を公知の方法にて修飾することができる。そのような修飾体は、例えばアミノ酸残基の側鎖中の官能基にエステル化、アルキル化、ハロゲン化、リン酸化などを施したものであってもよい。また、上記アミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。例えば、ヒスチジンタグを付加してもよく、チオレドキシン等の蛋白とともに融合蛋白となっていてもよい。あるいは、ＷＴ１ペプチドに検出可能な標識を結合させてもよい。本発明のペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記アミノ酸配列からなるペプチドを生じるものであってもよく、ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体として細胞表面に提示されることにより、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞誘導効果を得ることができる。これらの物質は、本発明のペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的に本発明のペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、本発明のペプチド以外のヘルパーペプチドであってもよい。

本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。本発明に用いられるペプチドはまた、当該ペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。これらの手法は、文献に記載される方法などに準じて行うことができる（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985)）。

本発明は、上で説明したＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にも関する。ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であってもよく、ＲＮＡ配列であってもよい。本発明において、ＷＴ１ペプチドを用いる代わりに、これらのポリヌクレオチド配列を用いてもよい。これらのポリヌクレオチド配列を適当なベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられ、例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などが挙げられる。ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していてもよい。これらの遺伝子の細胞や生体への導入方法、発現方法等は当業者に公知である。

本発明に用いられる抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とともに上記ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドをヘルパーＴ細胞に提示することができる細胞であって、例えば、樹状細胞、末梢血単核球などを意味する。それゆえ、本発明に用いられる抗原提示細胞が由来する対象は、添加するＷＴ１ペプチドが結合することができるＭＨＣクラスＩＩ分子と同一の分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子などのうちのいずれか１つまたはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子）を有するものでなければならない。

本発明において、ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加は、ＷＴ１ペプチドを添加することにより直接的に、あるいはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの添加により、または該発現ベクターを含む細胞の添加により間接的に行われてもよい。これらの添加は、当該技術分野で公知の方法により実施することができる。前記ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む細胞は、当業者によく知られた手法により取得することができる。具体的には、本発明に用いられるポリヌクレオチドは、上記ＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列）に基づき決定できる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。また、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオチド配列以外に含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的等に応じて適宜選択でき、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。発現ベクターを含む細胞は、例えば、宿主細胞を形質転換することにより、作製することができる。宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。宿主細胞への導入方法は、通常の方法、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッドを用いることができる。

一般的に、ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ・ＣＤ３複合体が抗原提示細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して抗原ペプチドを認識し、Ｔ細胞表面のインテグリンが抗原提示細胞表面のインテグリンリガンドで刺激されることにより、活性化される。本明細書におけるヘルパーＴ細胞の活性化は、ヘルパーＴ細胞の活性化のみならず、ヘルパーＴ細胞の誘導・増殖を含むものとする。さらに、本発明において活性化されるヘルパーＴ細胞は、未分化なＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）などであってもよい。活性化されたヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導・増殖・活性化を促進することにより免疫系を活性化する機能を有する。それゆえ、本発明の方法を癌などの治療の補助療法として用いることもできる。また、インビトロにおいて本発明の方法を用いて活性化されたヘルパーＴ細胞を癌などの治療または予防、あるいはこれらのための補助剤として用いることもできる。ヘルパーＴ細胞の活性化は、インターフェロン（例えば、インターフェロンγなど）、インターロイキンなどのサイトカインの産生、分泌量を測定することなどにより評価することができる。

本発明は、別の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させるための組成物を提供する。本発明において、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、ヘルパーＴ細胞の活性化を経ることにより行われるものものであってもよい。本発明の組成物に含まれる有効成分として、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞を例示することができるが、ＷＴ１ペプチドを抗原ペプチドとして抗原提示細胞表面にて提示させることができる因子であれば、いかなる分子であってもよい。これらの因子は、上述のごとく当業者によく知られた方法により得ることができる。

本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、上述のごとく、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかに結合する能力を有するものである。さらに、本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの少なくとも２つまたはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものであってもよい。また、本発明に用いられるＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ分子、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ分子のうちのいずれのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有していてもよい。

本発明の組成物がＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれか１つまたはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与されると、対象中のヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されることにより免疫系が活性化される。また、ＷＴ１遺伝子は、各種の癌や腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高発現しているので、本発明の組成物を癌の治療または予防の補助剤として用いることもできる。あるいは、本発明の組成物を用いて活性化されたヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞などは、例えば、上記の癌の治療の補助剤として用いることもできる。

本発明の組成物は、上記ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを含む細胞以外に、例えば、担体、賦形剤、あるいは添加剤などを含んでいてもよい。本発明の組成物に含まれる上記ＷＴ１ペプチド等は、ＷＴ１ペプチド特異的にヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することから、公知のＭＨＣクラスＩ拘束性ＷＴ１ペプチドを含むか、あるいはこれらと共に適用されてもよい。

本発明の組成物の適用方法は、所望のヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。当該適用方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などにより対象に投与すること、あるいは抗原提示細胞培養液に添加することなどが挙げられるが、これらに限らない。本発明の組成物に含まれる上記ＷＴ１ペプチド等の量、組成物の形態、適用回数などは、所望のヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。

本発明は、さらなる別の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する工程を含む、対象における癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである方法を提供する。本発明の方法は、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することにより対象の免疫系を活性化し、対象における癌を治療または予防する方法である。本発明の方法において、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する工程は、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を経ることにより行われるものであってもよい。ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加は、ＷＴ１ペプチドを添加することにより直接的に、あるいはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの添加により、または該発現ベクターを含む細胞の添加により間接的に行われてもよい。前記ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む細胞は、上述のごとく当業者によく知られた方法により取得することができる。本発明の方法を適用できる対象は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子陽性対象である。本発明を適用できる癌は、いずれのものであってもよく、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を挙げることができる。また、本発明の方法は、ＭＨＣクラスＩ分子拘束性ＷＴ１ペプチドを用いた癌の治療または予防方法またはそのための医薬組成物と併用されてもよい。

本発明は、なお別の態様において、上記組成物を製造するためのＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを含む細胞の使用を提供する。さらに本発明は、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させるために用いられる、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを含む細胞を提供する。

本発明は、なおさらなる態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するための上記ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞を含むキットであって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものであるキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化方法に用いられる。本発明のキットは、ＷＴ１ペプチドの他に、例えば、抗原提示細胞の取得手段、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の活性の評価手段などを含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を効率的に活性化することができる。

本発明は、別の態様において、ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体が提示されている抗原提示細胞を提供する。ここで、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかであってもよく、さらには、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの少なくとも２つまたはそれ以上であってもよい。本発明の抗原提示細胞は、当業者間で知られる手法を用いて調製されてもよい。例えば、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、単離した細胞に上記ＷＴ１ペプチド（例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチド）またはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドでパルスするか、または前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞内に導入して、ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を細胞表面に提示させることにより作製してもよい（Cancer Immunol.Immunother. 46:82, 1998、J.Immunol.,158: p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184, 1999 Cancer Res.,56:p5672,1996、J.Immunol.,161: p5607,1998、J.Exp.Med., 184: p465,1996）。本明細書において、抗原提示能を有する細胞とは、ＷＴ１ペプチドを提示することができるＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞表面に発現する細胞であれば、限定されないが、抗原提示能が高い末梢血単核球または樹状細胞が好ましい。また、本発明の抗原提示細胞は、実施例に示されるごとく、インターフェロンγ量の増加により確認される細胞傷害性Ｔ細胞活性の上昇によりその存在が確認される。本発明の抗原提示細胞は、医薬組成物の有効成分として細胞療法（例えば、樹状細胞療法）において有効に用いられる。

本発明は、さらなる別の態様において、ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞を提供する。ここで、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかであってもよく、さらには、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの少なくとも２つまたはそれ以上であってもよい。本発明のヘルパーＴ細胞として、例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む抗原ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞を挙げることができる。本発明のヘルパーＴ細胞は、当該技術分野における公知の手法を用いて当業者が容易に調製・取得することができる（Iwata, M. et al., Eur. J. Immunol, 26, 2081(1996)）。

本発明は、なお別の態様において、ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞により活性化される細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞として、例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む抗原ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞により活性化される細胞傷害性Ｔ細胞を挙げることができる。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、当業者が公知の手法により容易に調製することができる。例えば、患者の末梢血リンパ球を単離し、これをペプチド（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド）、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれを含む発現ベクターでインビトロにて刺激することにより作製される（Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669）。上記のごとく調製された細胞傷害性Ｔ細胞は、癌などの治療または予防用医薬組成物の有効成分として用いることができる。本明細書の実施例において、ＷＴ−３３２投与により一定のＭＨＣクラス分子を有する対象由来の試料において、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性が認められた。このことは、末梢血単核球中に、ＷＴ１ペプチドからなる抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この複合体を提示する抗原提示細胞、これを特異的に認識するヘルパーＴ細胞、およびヘルパーＴ細胞により誘導された細胞傷害性Ｔ細胞が存在することを示すものである。

本発明は、なおさらなる別の態様において、上記ＷＴ１ペプチドを含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡテトラマーを提供する。前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子のうちのいずれかであってもよく、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの少なくとも２つまたはそれ以上であってもよい。本明細書において、ＨＬＡテトラマーは、ＨＬＡタンパク質をペプチドと会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを意味する。ＨＬＡテトラマーとして、種々の抗原ペプチドを含有するものが市販されており、本発明のＨＬＡテトラマーを容易に作製することができる（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)）。本発明のテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合した本発明のヘルパーＴ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞を容易に選別または検出できるように、蛍光標識されることが好ましい。本発明におけるＨＬＡテトラマーは、テトラマーに限定されるものではなく、必要に応じてペンタマー、デンドリマーなどのマルチマーを使用することもできる。本明細書において、マルチマーとは、ＨＬＡタンパク質をペプチドと会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）を、公知の手法を用いて２つまたはそれ以上結合させることにより多量体化したものをいう。

本発明は、別の態様において、上記組成物、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞またはテトラマーのいずれかを有効成分として含む、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させるための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、上記組成物、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞またはテトラマーのうちのいずれか１つまたはそれ以上を有効成分として含んでもよい。本発明の医薬組成物は、癌を治療または予防するために用いることができる。本発明の医薬組成物は、ＷＴ１を発現する各種癌および腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌に適用することができる。また、本発明の医薬組成物は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子などのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与するために用いることができる。本発明の医薬組成物を、その他の癌の治療または予防方法またはそのための医薬組成物と併用してもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化剤、増殖剤、誘導剤などを含んでいてもよく、あるいは公知のＭＨＣクラスＩ拘束性ＷＴ１ペプチドを含んでいてもよい。

本発明の医薬組成物は、有効成分以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の医薬組成物に含まれる上記有効成分の量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。

本発明は、さらなる別の態様において、上記の組成物、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞またはテトラマーのうちのいずれかの有効量を対象に投与する工程を含む、癌を治療または予防するための方法であって、対象が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子を有するものである方法を提供する。本発明の方法により治療または予防できる癌は、ＷＴ１を発現する各種癌および腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌である。本発明の方法は、その他の癌の治療または予防方法、例えば、公知のＭＨＣクラスＩ分子拘束性ＷＴ１ペプチドを用いた癌の治療または予防方法と併用されてもよい。

本発明は、なおさらなる別の態様において、上記医薬組成物を製造するための、上記の組成物、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞またはテトラマーのいずれかの使用を提供する。さらに本発明は、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させるために用いられる、上記の組成物、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞またはテトラマーを提供する。さらに本発明は、癌の治療または予防に使用される、上記の組成物、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞またはテトラマーを提供する。

本発明は、１の態様において、上記ＷＴ１ペプチドまたは該ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体（以下、抗ＷＴ１抗体ともいう）に関するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。具体的には、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体などを挙げることができる。これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、この動物の血清から常法により得ることできる。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明に用いられるペプチド（配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。また、本発明の抗ＷＴ１抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。かかるアジュバントとして、ミネラルゲル（例えば、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなど）、表面活性物質、ヒトアジュバントなどを挙げることができる。本発明の抗ＷＴ１抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等に用いることができる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等から適宜選択できる。

本発明は、別の態様において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子陽性対象におけるＷＴ１ペプチドの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）前記対象から取得した試料を上記抗ＷＴ１抗体と反応させ、次いで、
（ｂ）前記試料に含まれる上記抗ＷＴ１抗体の存在または量を調べる、
工程を含む方法を提供する。前記工程（ａ）において用いられる試料として、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象から取得されたものを用いることができる。前記工程（ａ）に用いられる試料は、例えば、血液、リンパ球などの体液、組織などを挙げることができる。試料の取得や抗体との反応などは、当業者であれば公知の手法を用いて適宜行うことができる。本発明における工程（ｂ）は、例えば、上記抗ＷＴ１抗体の局在、部位、量等を決定することを含むので、癌の診断、予後診断などに用いることができる。上記抗ＷＴ１抗体は標識されていてもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することによりＷＴ１ペプチドの存在または量の決定を簡便かつ迅速に行うことが可能となる。

本発明は、さらなる別の態様において、上記抗ＷＴ１抗体を必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドの存在または量を決定するためのキットに関するものである。本発明のキットは、上記抗ＷＴ１抗体の他に、例えば、抗ＷＴ１抗体の取得手段、評価手段などを含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いることにより、上述のＷＴ１ペプチドの存在または量を決定する方法において簡便かつ迅速にＷＴ１ペプチドの存在または量を決定することが可能となる。

本発明は、なお別の態様において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子陽性対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞またはＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）前記対象から取得した試料をＷＴ１ペプチドを用いて刺激し、
（ｂ）サイトカイン、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の存在または量を調べる、
工程を含み、サイトカイン、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の存在または量の増大がＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞またはＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在または量を示すものである方法を提供する。本発明の試料は、抗原提示細胞を含むものであればいかなるものであってもよく、例えば、末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、またはリンパ節細胞などを挙げることができる。本発明に用いられる試料は、健常人由来であっても、あるいは癌患者由来であってもよい。健常人由来のこれらの細胞を用いることにより、例えば、癌に罹患しているかどうか、あるいはその素因を有するかどうかを診断することなどが可能になる。癌患者由来のこれらの細胞を用いることにより、例えば、癌患者においてＷＴ１免疫療法が効果を有するかどうかを予測することなどが可能になる。本発明の方法において、取得した試料は、ＷＴ１ペプチドによる刺激の前後に培養されていてもよく、前記培養条件は当業者が適宜決定することができる。ＷＴ１ペプチドを用いたこれらの細胞の刺激は、エレクトロポレーションなどの公知の手法を用いて行うことができ、インビトロまたはインビボのいずれにおいて行われてもよい。サイトカイン産生、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞の反応が存在するか、あるいはサイトカイン産生量、ヘルパーＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞の反応量は既知の方法により調べることができる。

本発明は、なおさらなる別の態様において、上記ＷＴ１ペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドの存在または量を決定するためのキットに関するものである。本発明のキットは、上記ＷＴ１ペプチドの他に、例えば、試料の取得手段、サイトカインなどの評価手段などを含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いることにより、上述のＷＴ１ペプチドの存在または量を決定する方法において簡便かつ迅速にＷＴ１ペプチドの存在または量を決定することが可能となる。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

１．ＷＴ１−３３２特異的Ｉ型ヘルパーＴ細胞の誘導
健常人の血液提供者（提供者１：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６／１２０１、ＤＲＢ３^＊０１０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者２：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１／１１０１、ＤＲＢ３^＊０２０２、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者３：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１／０４０５、ＤＲＢ４^＊０１０２／０１０３陽性、提供者４：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１／１１０１、ＤＲＢ３^＊０２０２、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性）の末梢血より末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。分離したＰＢＭＣ（１．５×１０^７個）を４５％ＲＰＭＩ−１６４０（SIGMA社）、４５％ＡＩＭ−Ｖ（invitrogen社）、１０％ＡＢ型ヒト血清（MP Biomedicals社）より組成される培地へ懸濁し、１．５×１０^６個／ウェルで２４ウェルプレートへ播種した（０日目）。ＰＢＭＣを播種したウェルへＷＴ１−３３２（配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるペプチド）を１０μｇ／ｍＬ、ＩＬ−７（PeproTech社）を１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で１週間培養した。また、分離したＰＢＭＣの一部を再刺激時の抗原提示細胞用に凍結保存した。

１週間後（７日目）、再刺激を行った。まず、凍結保存しておいたＰＢＭＣを解凍し、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２でパルスし、５０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（協和発酵キリン社）で処理し、新しい２４ウェルプレートへ１．０×１０^６〜１．６×１０^６個／ウェルで播種した。次に、１週間培養していた細胞を回収し、１．０×１０^６〜１．６×１０^６個／ウェルで抗原提示細胞を播種したウェルへ播種した。最後に、ＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。２日後（９日目）に各ウェルの培養液を半量静かに抜き取り、代わりに４０Ｕ／ｍＬＩＬ−２（PeproTech社）含有培地を添加して培養を続けた。その後、１日おきに２０Ｕ／ｍＬＩＬ−２含有培地で培養液の半量交換操作を行い、１４日目から２１日目の間に適宜細胞を回収し、実験に使用した。

２．拘束アレル決定実験に用いる抗原提示細胞の調製
健常人の血液提供者（提供者５：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６／１２０１、ＤＲＢ３^＊０１０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者６：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３／１４０５、ＤＲＢ３^＊０２０２、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者７：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３／１２０１、ＤＲＢ３^＊０１０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者８：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１／０９０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者９：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１４０１／１４０６、ＤＲＢ３^＊０２０２陽性、提供者１０：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３／０９０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者１１：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１／１５０２、ＤＲＢ３^＊０２０２陽性、提供者１２：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５／１４０６、ＤＲＢ３^＊０２０２、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者１３：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１／０４０５、ＤＲＢ４^＊０１０２／０１０３陽性、提供者１４：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１／１５０２、ＤＲＢ４^＊０１０２陽性、提供者１５：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１／０４０５、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者１６：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１／１５０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者１７：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５／１５０１、ＤＲＢ４^＊０１０３陽性、提供者１８：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１４０１／１５０２、ＤＲＢ３^＊０２０２陽性、提供者１９：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１４０３／１５０２、ＤＲＢ３^＊０１０１陽性、提供者２０：ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３／１３０２、ＤＲＢ３^＊０３０１陽性）の末梢血よりＰＢＭＣを分離し、拘束アレル決定実験に用いる抗原提示細胞とした。それぞれのＰＢＭＣを、使用するまで−８０℃にて凍結保存した。

３．ＩＦＮ−γの測定（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体における反応阻害）
提供者１〜４のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、ＷＴ１−３３２非存在下、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２存在下、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２および１０μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（BD社）存在下で２４時間培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ（BD社）にて定量した。その結果、誘導されたすべてのＴ細胞がＷＴ１−３３２を認識してＩＦＮ−γを産生すること、またその反応はＨＬＡ−ＤＲ分子拘束的であることが示された。

４．ＩＦＮ−γの測定（拘束アレルの決定）
提供者１〜４のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞をそれぞれ適当なＷＴ１−３３２でパルスした抗原提示細胞と反応させ、誘導されたＴ細胞の拘束アレルを決定した。

（４−１．提供者１由来Ｔ細胞）
提供者１のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２でパルスした提供者５、６、７、８、９由来抗原提示細胞と２４時間共培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにて定量した。結果を図１に示す。提供者１由来Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１^＊０４０３、０４０６）陽性抗原提示細胞と共培養したときにＩＦＮ−γを産生することから、拘束アレルはＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６であることが示された。また、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３がＷＴ１−３３２を提示してＴ細胞を刺激できることも示された。

（４−２．提供者２由来Ｔ細胞）
提供者２のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２でパルスした提供者１０、１１、１２、９由来抗原提示細胞と２４時間共培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにて定量した。結果を図２に示す。提供者２由来Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２陽性抗原提示細胞と共培養したときにＩＦＮ−γを産生することから、拘束アレルはＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２であることが示された。

（４−３．提供者３由来Ｔ細胞）
提供者３のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２でパルスした提供者１３、１４、１５、１０由来抗原提示細胞と２４時間共培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにて定量した。結果を図３に示す。提供者３由来Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１^＊０４０１、０４０５）陽性抗原提示細胞と共培養したときにＩＦＮ−γを産生した。よって、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、０４０５共にＷＴ１−３３２を提示してＴ細胞を刺激できることが示された。

（４−４．提供者４由来Ｔ細胞）
提供者４のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２でパルスした提供者１６、１１、１７、１８、１９、２０由来抗原提示細胞と２４時間共培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにて定量した。結果を図４に示す。提供者４由来Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１陽性抗原提示細胞と共培養したときにＩＦＮ−γを産生することから、拘束アレルはＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１であることが示された。

次いで、ＷＴ１−３３２とＭＨＣクラスＩＩ分子との結合能を評価するため、ＨＰＬＣを用いることにより、７種類のＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質（ＤＲＢ１^＊１５０１、０１０１、０４０５、０８０３、０９０１、１５０２、またはＤＲＢ４^＊０１０１）とＷＴ１−３３２とのフォールディング試験を行った。簡単に説明すると、ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質、ペプチド（各タンパク質に結合するペプチド（ポジティブコントロール）、結合しないペプチド（ネガティブコントロール）、およびＷＴ１−３３２）、フォールディングｂｕｆｆｅｒを混ぜてフォールディング反応液を作製し、３７℃で反応後、ＨＰＬＣを用いた保持時間を解析した。ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質とペプチドとの結合による保持時間の移動を利用し、ＷＴ１−３３２とのフォールディングを評価した。この試験に用いる試薬類を下記表に示す。
（表１．試験に用いる試薬類）

ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質の調製
−８０℃に凍結保存してあるＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質を氷上で融解した。融解したＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質を８３μＬ中に０．０５ｍｇ（１×１０^−９ｍｏｌ）含まれるように希釈バッファーで調製した。

ペプチド溶液の調製
各ペプチドを電子天秤で約１ｍｇ秤量し，ガラスバイアルに移し２０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯで溶解した。

５０倍モル量のペプチド溶液量の算出
ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質に対し５０倍モル量となるペプチド量を以下の計算式で算出した。
必要なペプチド量：１×１０^−９ｍｏｌ×５０＝５×１０^−８ｍｏｌ（必要なペプチド量）
５×１０^−８×（ペプチド分子量）×１０００＝（必要なペプチド量）（ｍｇ）
（必要なペプチド量）／［ペプチド純度／１００］＝（添加するペプチド量）（ｍｇ）
［（添加するペプチド量）／２０ｍｇ／ｍＬ］×１０００＝（添加するペプチド溶液量）（μＬ）

フォールディングｂｕｆｆｅｒ添加量の算出
フォールディングｂｕｆｆｅｒとして、ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質とペプチドの混合溶液の１０％量を添加した。フォールディングｂｕｆｆｅｒ添加量を以下の計算式で算出した。
［８３μＬ（ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質量）＋（５０倍モル量のペプチド溶液量）］×０．１＝フォールディングｂｕｆｆｅｒ添加量

ＨＰＬＣによるフォールディング解析
ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質が入ったガラスバイアルに、算出して得られたペプチド溶液、フォールディングｂｕｆｆｅｒを添加し、３７℃で一晩静置した。ＨＬＰＣ（Waters 2695 Separation Module）を起動し、Ｓｅｐｅｒｄｅｘ２００カラムを平衡化ｂｕｆｆｅｒで平衡化した。すべてのサンプルに平衡化ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ加え、よく混合し、そのうち１００μＬをSample injection volumeとし、保持時間を算出した。分析時間を５０分とした。ＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質とペプチドがフォールディングした基準は、保持時間がコントロール（溶媒のみ）と比べ０．１分以上移動したものとした。その結果、調べた７種類のＨＬＡクラスＩＩモノマータンパク質（ＤＲＢ１^＊１５０１、０１０１、０４０５、０８０３、０９０１、１５０２、またはＤＲＢ４^＊０１０１）で保持時間の移動度が０．１分以上上昇したことから（図５）、これらのタンパク質に対してＷＴ１−３３２が特異的に結合し、抗原提示できることが明らかとなった。

ＷＴ１−３３２特異的Ｔ細胞の誘導
健常人の血液提供者（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１、１５０２、０４０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１、０９０１を少なくとも１つ以上有する、計延べ４２人）の末梢血より末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。分離したＰＢＭＣを１．２×１０^７個ずつ分割し、４５％ＲＰＭＩ−１６４０（SIGMA社）、４５％ＡＩＭ−Ｖ（invitrogen社）、１０％ＡＢ型ヒト血清（MP Biomedicals社）より組成される培地へ懸濁し、１．５×１０^６個／ウェルで２４ウェルプレートへ播種した（０日目）。ＰＢＭＣを播種したウェルへＷＴ１−３３２を２０μｇ／ｍＬ、ＩＬ−７（PeproTeck社）を１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で１週間培養した。対照群としてＷＴ１−３３２の代わりに溶媒（１０ｍＭ酢酸）を最終濃度１０μＭになるように添加した群（溶媒誘導群）を設定した。また、分離したＰＢＭＣの一部を再刺激時の抗原提示細胞用に凍結保存した。
１週間後（７日目）、再刺激を行った。まず、凍結保存しておいたＰＢＭＣを解凍し、２０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２または１０μＭ酢酸溶媒でパルスし、５０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（協和発酵キリン社）で処理し、新しい２４ウェルプレートへ１．０×１０^６〜１．６×１０^６個／ウェルで播種した。次に、１週間培養していた細胞を回収し、１．０×１０^６〜１．６×１０^６個／ウェルで抗原提示細胞を播種したウェルへ播種した。最後に、ＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。２日後（９日目」）、各ウェルの培養液を半量静かに抜き取り、代わりに４０Ｕ／ｍＬＩＬ−２（PeproTech社）含有培地を添加して培養を続けた。その後、１日おきに２０Ｕ／ｍＬＩＬ−２含有培地で培養液の半量交換操作を行った。
０、７、１４日目に細胞を回収し、ＩＦＮ−γ測定実験に使用した。

ＩＦＮ−γの測定（細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ））
０日目においては、調製後のＰＢＭＣ、７日目及び１４日目においては、ＷＴ１−３３２誘導群及び溶媒誘導群より回収した生細胞を９６ウェルＵ底プレートへ播種、及びＷＴ１−３３２含有培地を最終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加して抗原再刺激を入れた。また、比較対照として溶媒含有培地を最終濃度１０μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で４時間培養した後、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（BioLegend）を添加してさらに培養を続けた。培養開始から６時間後に細胞を回収し、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体で染色した。細胞内ＩＦＮ−γ染色を、BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permiabilization Kit（Becton Dickinson）とＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を用いて行った。解析はＥＰＩＣＳ−ＸＬＭＣＬ（Beckman Coulter）を用いた。結果を図６および７に示す。図６より、ＷＴ１−３３２誘導群において、７日目から１４日目の間において、ＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１の顕著な増加が確認され、経時的に増加することがわかった。この増加は溶媒誘導群に比して有意な増加であった（Ｐ＜０．０００１）。また、図７より、ＷＴ１−３３２特異的ＣＴＬに関しても７日目から１４日目の間に、ＷＴ１−３３２誘導群において経時的な増加が確認され、その増加も溶媒誘導群に比して有意であった（Ｐ＜０．０００１）。

ＩＦＮ−γの測定（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体における反応阻害）
１４日目において、提供者２１〜３７のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、１０μＭ溶媒存在下、２０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２存在下、２０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２および１０μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌ２４３[Ｇ４６−６]、BD社）存在下で２４時間培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ（BD社）にて定量した。結果を図８に示す。提供者２１〜３７の検体において、誘導されたＴ細胞がＷＴ１−３３２を認識してＩＦＮ−γを産生すること、またその反応はＨＬＡ−ＤＲ分子拘束的であることが示された。
また、１４日目において、提供者３８〜４６のＰＢＭＣより誘導されたＴ細胞を、１０μＭ溶媒存在下、２０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２存在下、２０μｇ／ｍＬＷＴ１−３３２および１０μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌ２４３[Ｇ４６−６]、BD社）、１０μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体（ＳＰＶＬ３、BC社）存在下で２４時間培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ（BD社）にて定量した。結果を図１１に示す。提供者３８〜４６の検体において、誘導されたＴ細胞がＷＴ１−３３２を認識してＩＦＮ−γを産生し、その反応は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体で阻害されなかった。これらのことから、提供者３８〜４６に由来するＷＴ１−３３２誘導Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＰ分子拘束的であることが示された。

ＷＴ１−３３２特異的Ｔ細胞の誘導（新規アレルとの関係）
図６及び７における健常人の血液提供者（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１、１５０２、０４０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１、０９０１を少なくとも１つ以上有する、計延べ４２人）を用いた結果において、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性且つＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された１７人の検体（提供者２１〜３７）それぞれについて、１４日目の結果を図９および１０に示す。また、１７人の検体（提供者２１〜３７）それぞれのＨＬＡクラスＩＩ型（ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１アレルの型）を以下の表２に示す。ここで、ＤＲＢ３^＊０２０２はＤＲＢ１^＊１１０１、ＤＲＢ１^＊１４０１及びＤＲＢ１^＊１４０５と連鎖不平衡にあり（表中、△で示すＤＲＢ１アレル）、ＤＲＢ４^＊０１０１はＤＲＢ１^＊０４０３、ＤＲＢ１^＊０４０５、ＤＲＢ１^＊０９０１と連鎖不平衡にある（表中、▲で示すＤＲＢ１アレル）。表中、太字斜体の文字で示すアレルは新規適合ＨＬＡ−ＤＲＢ１アレルを表す。

図９、図１０および表２より、これらのＨＬＡ−ＤＲアレルを有する細胞においてＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１およびＷＴ１−３３２特異的ＣＴＬの誘導が認められた。

また、図６及び７における健常人の血液提供者（ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１、１５０２、０４０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１、０９０１を少なくとも１つ以上有する、計延べ４２人）を用いた結果において、ＨＬＡ−ＤＰ拘束性且つＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１が誘導された９人の検体（提供者３８〜４６）それぞれについて、１４日目の結果を図１２および１３に示す。また、９人の検体（提供者３８〜４６）それぞれのＨＬＡクラスＩＩ型（ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１アレルの型）を以下の表３に示す。表中、※はこれまでに知られている適合ＨＬＡ−ＤＰＢ１アレルを表す。

図１２、図１３および表３より、これらのＨＬＡ−ＤＰアレルを有する細胞においてＷＴ１−３３２特異的Ｔｈ１およびＷＴ１−３３２特異的ＣＴＬの誘導が認められた。

本発明により、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０２分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するＷＴ１ペプチドを用いて、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する方法およびそのための組成物、ならびにヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などが提供されるので、医薬品等の分野、例えば、ＷＴ１遺伝子を高発現している種々の造血器腫瘍、固形癌の予防薬または治療薬の開発、製造分野において利用可能である。

Claims

ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化させる工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０６分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０８０３分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３^＊０２０２分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４^＊０１０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０３０１分子のうちのいずれかのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するものである方法。