JP2018091844A - α−シヌクレイン検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】α−シヌクレイノパチーと他の認知症等との鑑別及び鑑別の補助に有用なα−シヌクレインの検出方法、及びα−シヌクレイノパチーの診断を補助及び診断を補助する方法を提供すること。
【解決手段】（１）緩衝液中で、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合し、反応混合液を得る工程；
（２）反応混合液をインキュベーションして、生体試料中の異常α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
（３）形成されたα−シヌクレインの凝集体を検出する工程、
を含む、生体試料中の異常α−シヌクレインを検出する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、α−シヌクレインの検出方法、特に線維化したα−シヌクレインの凝集体を検出する方法、レビー小体病等のα−シヌクレイノパチーの診断を補助するための方法に関する。

脳における大量のミスフォールドタンパク質の蓄積は、大抵の神経変性疾患の決定的な特徴である。レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及びパーキンソン病（ＰＤ）等のレビー小体病（ＬＢＤ）は、主に凝集したα−シヌクレイン（αＳｙｎ）で構成され、細胞質の線維状封入体であるレビー小体（ＬＢ）の存在を特徴とする。病原性のメカニズムは完全に解明されていないが、ＬＢＤはニューロンにおけるＬＢ、即ち凝集したαＳｙｎ蓄積によって起こると考えられる。

ＬＢ中のα−Ｓｙｎ凝集体の大部分は、セリン１２９（Ｓｅｒ１２９）でリン酸化されるが、正常な脳中のαＳｙｎは殆どリン酸化されない。Ｓｅｒ１２９におけるリン酸化はＬＢＤの病理学的特徴であり、ＬＢ形成及びＬＢＤの発症に極めて重要な可能性がある。報告では、Ｓｅｒ１２９のリン酸化により組換えαＳｙｎ（ｒ−αＳｙｎ）の重合が促進された（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２（非特許文献１））。野生型（ＷＴ）ｒ−αＳｙｎの過剰発現により、培養細胞内でＬＢ様封入体の著しい蓄積が誘導されたが、Ｓｅｒ１２９をアラニンに置換した（Ｓ１２９Ａ）リン酸化不能な変異体ではそうならなかった（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５（非特許文献２））。Ｓｅｒ１２９リン酸化によってｒ−αＳｙｎ線維化が阻害され（Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８（非特許文献３））、Ｓ１２９Ａの変異によりショウジョウバエモデルにおいて封入体形成が増加する（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｅａｎｙ，２００５（非特許文献４））ことが、他のグループにより証明された。ショウジョウバエを用いた研究により、封入体数が、ドーパミン作動性ニューロンへの毒性と逆相関することも明らかになったが、このことにより封入体が神経毒性を予防することが示される（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｅａｎｙ，２００５（非特許文献４））。しかし、ＷＴ αＳｙｎ及び変異体αＳｙｎを過剰発現するために組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いたラットモデルにおける研究により、非リン酸化αＳｙｎが、リン酸化型よりも、ドーパミン作動性ニューロンに対する重篤な毒性に関連すること（Ａｚｅｒｅｄｏ ｄａ Ｓｉｌｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９（非特許文献５）；Ｇｏｒｂａｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００８（非特許文献６））、両型間で神経毒性には有意差がないこと（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００９（非特許文献７））が示された。従って、ＬＢＤ発症におけるαＳｙｎのＳｅｒ１２９リン酸化の重要性は殆ど理解されていないままである。

Ｂｒａａｋ及び共同研究者による死後研究により、ＬＢの病変は最初は延髄及び嗅球に生じ、次いで中脳及び大脳辺縁系領域に拡張し、その後ＰＤにおいては新皮質領域に広がることが示された（Ｂｒａａｋ ｅｔ ａｌ．，２００３（非特許文献８））。更に、該病理学的段階は病変の進行及び臨床症状に密接に結びつくようである（Ｂｒａａｋ ｅｔ ａｌ．，２００５（非特許文献９））。脳におけるＬＢの広がりにより、病的なαＳｙｎがプリオンのように伝播する能力を保持することが示唆される。移植研究により、ＰＤ患者の線条体に移植された胎児中脳の正常なニューロンにＬＢが存在する証拠がもたらされたが、このことにより、病変が、宿主脳から、移植された健康な脳へと伝播し得ることが示される（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８（非特許文献１０）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８（非特許文献１１））。その上、運動異常を示すヒトαＳｙｎのＡ５３Ｔ変異体トランスジェニック（Ｔｇ）マウス由来の病変脳ホモジネートの、ＷＴ（Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ（非特許文献１２））及びＡ５３Ｔ Ｔｇマウス（Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ（非特許文献１２）；Ｍｏｕｇｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２（非特許文献１３）；Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３（非特許文献１４））への接種により、内在性αＳｙｎ由来ＬＢ様凝集体及び細胞間の拡散がもたらされ、Ａ５３Ｔ Ｔｇマウスが示す生存期間が減少した（Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ（非特許文献１２））。ＤＬＢ患者由来の脳抽出物を接種したＷＴマウス（Ｍａｓｕｄａ−Ｓｕｚｕｋａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３（非特許文献１５））及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者由来の脳ホモジネートを接種したＡ５３Ｔ Ｔｇマウス（Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３（非特許文献１４））においても、同様のプリオン様現象が誘導された。更に、人工的に形成された線維化ｒ−αＳｙｎの導入により、初代ニューロン（Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１（非特許文献１６））及びＷＴマウス（Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ（非特許文献１７））において、病変αＳｙｎの細胞間伝達が誘発され、運動障害をもたらすドーパミンニューロン喪失が発症した。これらの報告により、αＳｙｎがプリオンのように挙動することが示唆された。

本発明者らは以前、「シード依存的異常凝集タンパク高感度増幅法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｋｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ（ＲＴ−ＱＵＩＣ））」と命名した、組織及び体液におけるプリオン検出のためのin vitro増幅技術を開発した。このアッセイにおいて、シードとしての異常型プリオンタンパク質と基質としての組換えプリオンタンパク質を混和後、撹拌による連続的な反応を行うことでアミロイド形成が誘発され、プリオンの伝播のメカニズムと考えられる核依存的な自己触媒反応を経時的に観察することが可能となった（Ａｔａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１（非特許文献１８））。

最近、ｒ−αＳｙｎのプリオン様構造変換を検出するためにＲＴ−ＱＵＩＣアッセイを用いる方法が報告された（Ｆａｉｒｆｏｕｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１６（非特許文献１９））が、当該方法では検出に少なくとも４８時間程度を要し、より迅速な検出が求められているのが現状である。

Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ａ．，Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｈｅｎ，Ｊ．，Ｔａｋｉｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．（２００２）．ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ４，１６０−１６４． Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｗ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｔｒｏｎｃｏｓｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｖ．Ｌ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｃ．Ａ．（２００５）．Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５，５５４４−５５５２． Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ，Ｋ．Ｅ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ａ．Ｗ．，Ｒｏｓｐｉｇｌｉｏｓｉ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｙ．，Ｌａｍｂｅｒｔｏ，ＧＲ．，Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．Ｏ．，Ｅｌｉｅｚｅｒ，Ｄ．，Ｚｗｅｃｋｓｔｅｔｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｔ Ｓｅｒ−１２９ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｉｃｓ Ｓ１２９Ｅ／Ｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８３，１６８９５−１６９０５． Ｃｈｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｆｅａｎｙ，Ｍ．Ｂ．（２００５）．Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８，６５７−６６３． Ａｚｅｒｅｄｏ ｄａ Ｓｉｌｖｅｉｒａ， Ｓ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ−Ｄｉａｚ，Ｃ．，Ｓａｇｅ，Ｄ．，Ａｂｂａｓ−Ｔｅｒｋｉ，Ｔ．，Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．，Ｕｎｓｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．（２００９）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｐｒｏｍｐｔ，ｎｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔ， ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｏｘｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８， ８７２−８８７． Ｇｏｒｂａｔｙｕｋ．Ｏ．Ｓ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｋｏｎｄｒｉｋｏｖａ，Ｇ．，Ｍａｎｆｒｅｄｓｓｏｎ，Ｆ．Ｐ．，Ｍａｎｄｅｌ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（２００８）．Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ Ｓｅｒ−１２９ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，７６３−７６８． ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｎ．Ｒ．，Ｆａｎ，Ｚ．，Ｘｕ，Ｋ．，Ｓｃｈｗａｒｚｓｃｈｉｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｆｅａｎｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｈｙｍａｎ，Ｂ．Ｔ．，ａｎｄ ＭｃＬｅａｎ，Ｐ．Ｊ．（２００９）．Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ Ｓ１２９ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｏ ｎｏｔ ａｌｔｅｒ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６８，５１５−５２４． Ｂｒａａｋ，Ｈ．，Ｄｅｌ Ｔｒｅｄｉｃｉ，Ｋ．，Ｒｕｂ，Ｕ．，ｄｅ Ｖｏｓ，Ｒ．Ａ．，Ｊａｎｓｅｎ Ｓｔｅｕｒ，Ｅ．Ｎ．，ａｎｄ Ｂｒａａｋ，Ｅ．（２００３）．Ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ２４，１９７−２１１． Ｂｒａａｋ，Ｈ．，Ｒｕｂ，Ｕ．，Ｊａｎｓｅｎ Ｓｔｅｕｒ，Ｅ．Ｎ．，Ｄｅｌ Ｔｒｅｄｉｃｉ，Ｋ．，ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ，Ｒ．Ａ．（２００５）．Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｓｔａｔｕｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｔａｇｅ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６４，１４０１−１４１０． Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｕ，Ｙ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｔ．Ｂ．，ａｎｄ Ｏｌａｎｏｗ， Ｃ．Ｗ．（２００８）．Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４，５０４−５０６． Ｌｉ，Ｊ．Ｙ．，Ｅｎｇｌｕｎｄ，Ｅ．，Ｈｏｌｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｏｕｌｅｔ，Ｄ．，Ｈａｇｅｌｌ，Ｐ．，Ｌｅｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｌａｓｈｌｅｙ，Ｔ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｎ．Ｐ．，Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｇｒａｆｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｇｇｅｓｔ ｈｏｓｔ−ｔｏ−ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４，５０１−５０３． Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｋｅｈｍ，Ｖ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１２ｂ）．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ａ ｒａｐｉｄｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０９，９７５−９８６． Ｍｏｕｇｅｎｏｔ，Ａ．Ｌ．，Ｎｉｃｏｔ，Ｓ．，Ｂｅｎｃｓｉｋ，Ａ．，Ｍｏｒｉｇｎａｔ，Ｅ．，Ｖｅｒｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ｌａｋｈｄａｒ，Ｌ．，Ｌｅｇａｓｔｅｌｏｉｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂａｒｏｎ，Ｔ．（２０１２）．Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ３３，２２２５−２２２８． Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．，Ｏｅｈｌｅｒ，Ａ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｌ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｄ．Ｔ．，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｍ．，ＤｅＡｒｍｏｎｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．（２０１３）．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ ｐｒｉｏｎｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，１９５５５−１９５６０． Ｍａｓｕｄａ−Ｓｕｚｕｋａｋｅ，Ｍ．，Ｎｏｎａｋａ，Ｔ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．，Ｏｉｋａｗａ，Ｔ．，Ａｒａｉ，Ｔ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．（２０１３）．Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ ｂｒａｉｎ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３６，１１２８−１１３８． Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ，Ｌ．Ａ．，Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｐａｔｅｌ，Ｔ．Ｐ．，Ｔａｎｉｋ，Ｓ．Ａ．，Ｒｉｄｄｌｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｔｅｉｂｅｒ，Ａ．，Ｍｅａｎｅｙ，Ｄ．Ｆ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１１）．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｆｉｂｒｉｌｓ ｉｎｄｕｃｅ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅａｔｈ．Ｎｅｕｒｏｎ ７２，５７−７１． Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｋｅｈｍ，Ｖ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１２ａ）．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−ｌｉｋｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３８，９４９−９５３． Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｒ．，Ｓａｔｏｈ，Ｋ．，Ｓａｎｏ，Ｋ．，Ｆｕｓｅ，Ｔ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｄ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｔ．，Ｎａｋａｇａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｈ．，Ｓｈｉｒａｂｅ，Ｓ．，ｅｔ． ａｌ．（２０１１）．Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｋｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７，１７５−１７８． Ｆａｉｒｆｏｕｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）．Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ＲＴ−ＱｕＩＣ ｉｎ ｔｈｅ ＣＳＦ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ｄｏｉ： １０．１００２／ａｃｎ３．３３８．

アルツハイマー病の場合、症状の発症前でも、髄液の検査や、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によってアミロイドが検出できる可能性がある。アルツハイマー病ではアミロイド凝集が早期に起こるためにＰＥＴ検査の有用性が知られている。これに対して、レビー小体型認知症等のα−シヌクレイノパチーは、現在、症状等から他の疾患と鑑別する方法は開発が進んでいるが、症状発症前に迅速に鑑別することは困難である。本発明は、早期に、且つ迅速に、レビー小体病等のα−シヌクレイノパチーを診断することを可能にする、被験体からのα−シヌクレイン、特に重合もしくは、線維化した異常凝集するα−シヌクレインを検出する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、ＲＴ−ＱＵＩＣアッセイを用いて、ｒ−αＳｙｎのプリオン様構造変換が、ＤＬＢ患者由来の脳組織によって誘導されるか否かを調べるために研究を行った。更に、本発明者らは、基質αＳｙｎのＳｅｒ１２９リン酸化が、凝集体の形成に関与するか検証した。そして、特定条件下の溶液中で被験体の生体試料とｒ−αＳｙｎとを混合し、線維形成された基質ｒ−αＳｙｎを検出することがレビー小体病等のα−シヌクレイノパチーの診断に有用であることを見出した。αＳｙｎの線維形成は、レビー小体病に罹患した被験体の生体試料を用いた場合のみ特異的に検出され、これらの鑑別に有用であることを見出し、本発明を完成するに到った。

即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］ （１）緩衝液中で、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合し、反応混合液を得る工程；
（２）反応混合液をインキュベーションして、生体試料中の異常α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
（３）形成されたα−シヌクレインの凝集体を検出する工程、
を含む、生体試料中の異常α−シヌクレインを検出する方法。
［２］ （１）緩衝液中で、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合し、反応混合液を得る工程；
（２）反応混合液をインキュベーションして、生体試料中の異常α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
（３）形成されたα−シヌクレインの凝集体を検出する工程、
を含む、α−シヌクレイノパチーの診断を補助する方法。
［３］ 正常α−シヌクレインが組換えα−シヌクレイン、又は精製α−シヌクレインである、［１］又は［２］の方法。
［４］ 生体試料が脳組織サンプルである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ 生体試料が血液、血漿、血清、白血球又は脳脊髄液サンプルである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［６］ 反応混合液中の正常α−シヌクレインの濃度が、１２０μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬである、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］ 緩衝液がｐＨ７．２〜７．８の緩衝液である、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］ 緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］ 工程（２）において、反応混合液を震盪することを特徴とする、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］ α−シヌクレインの凝集体の形成が、震盪期間及び無震盪期間のサイクルで行われる、［９］の方法。
［１１］ サイクルが、全体で３分間である、［１０］の方法。
［１２］ α−シヌクレインの凝集体が、抗体を用いて検出される、［１］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］ 抗体が抗α−シヌクレインポリクローナル抗体、抗α−シヌクレインモノクローナル抗体若しくは抗Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレインモノクローナル抗体である、［１２］の方法。
［１４］ （３）の工程が、形成されたα−シヌクレインの凝集体を定量することを含む、［１］〜［１３］のいずれかの方法。
［１５］ （３）の工程が、ウェスタンブロット法を含む、［１］〜［１４］のいずれかの方法。
［１６］ （３）の工程が、蛍光分光法を含む、［１］〜［１５］のいずれかの方法。
［１７］ α−シヌクレインの凝集体を検出する工程がチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の使用を含む、［１６］の方法。
［１８］ 検出が、１０分毎に行われる、［１６］又は［１７］の方法。
［１９］ α−シヌクレイノパチーと、他の認知障害を伴う疾患との鑑別を補助するための方法である、［２］〜［１８］のいずれかの方法。
［２０］ α−シヌクレイノパチーが、レビー小体病、又は多系統萎縮症である、［２］〜［１９］のいずれかの方法。
［２１］ レビー小体病が、レビー小体型認知症、パーキンソン病、若しくはびまん性新皮質型レビー小体型認知症である、［２０］の方法。

本発明によれば、被験体の生体試料から、異常α−シヌクレインを高感度且つ迅速に検出することができる。本発明によれば、症状発症前に異常α−シヌクレインを患者から検出することが可能となり、従って、より早期に被験体がα−シヌクレイノパチーに罹患しているか否かの診断が可能になる。一般に認知症はそのタイプによって治療方針が異なるが、本発明を用いて早期にα−シヌクレイノパチーを鑑別することにより、より適切な治療を早期から受けることが可能となる。

図１は、組換えα−シヌクレインの精製及び構造解析を示す図である。（Ａ，Ｂ）精製したＨｉｓタグ付ヒト組換えαＳｙｎ（Ｈｉｓ−ｒ−αＳｙｎ）、ＤＡＰａｓｅ処理後のＨｉｓ−ｒ−αＳｙｎ（Ｈｉｓ−ｒ−αＳｙｎ＋ＤＡＰａｓｅ）、及びＨｉｓ−ｒ−αＳｙｎとＤＡＰａｓｅを除去した後の生成物（ｒ−αＳｙｎ）を、（Ａ）ＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び（Ｂ）抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９（上パネル）及び抗Ｈｉｓ抗体（下パネル）によるウェスタンブロット解析により検証した。（Ａ）ＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ＤＡＰａｓｅ処理後のＨｉｓ−ｒ−αＳｙｎのサイズは、１８ｋＤａから１７ｋＤａにシフトすることが示され、Ｈｉｓ−ｒ−αＳｙｎとＤＡＰａｓｅの除去後に、タンパク質の単一の最多量バンドが観察された。（Ｂ）抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９を用いたイムノブロット法により、やはり同様のＨｉｓ−ｒ−αＳｙｎの分子サイズシフトが観察された。精製ｒ−αＳｙｎは、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたイムノブロット法により検出されないことが確認された。各パネルの左側に分子量マーカーをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。（Ｃ）ｒ−αＳｙｎの円二色性（ＣＤ）スペクトル。ＣＤスペクトルにより、変性タンパク質の特徴的な、１１９ｎｍでの最少平均残基楕円率が示された。（Ｄ）ｒ−αＳｙｎのフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトル。ＦＴＩＲスペクトルにより、変性構造に帰属する、１６５０ｃｍ^−１における顕著なバンドが示された。 図２は、組織化学的解析及びウェスタンブロット解析による、ヒト脳由来α−シヌクレインの特性解析の図である。（Ａ）ＤＮ−ＤＬＢ患者２名（症例＃１及び＃２）、Ｌｉ−ＤＬＢ患者、及び非ＤＬＢ症例（乳がん患者）由来黒質及び前頭葉の皮質中における、ヘマトキシリン及びエオジン染色並びにリン酸化αＳｙｎに対する抗体を用いた免疫組織化学的染色。矢印及び矢頭は、それぞれＬＢ及びｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎを示す。スケールバーは５０μｍ。（Ｂ−Ｄ）ＤＮ−ＤＬＢ（症例＃１及び＃２）、Ｌｉ−ＤＬＢ、統合失調症、アルツハイマー病（ＡＤ）（症例＃１及び＃２）、弧発性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｓＣＪＤ）１型（ｓＣＪＤ ＭＭ１）（症例＃１及び＃２）、ｓＣＪＤ２型（ｓＣＪＤ ＭＭ２）、及びゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）の患者由来脳ホモジネート（ＢＨ）試料を、（Ｂ）抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９、（Ｃ）抗ｐＳeｒ１２９−αＳｙｎモノクローナル抗体、及び（Ｄ）抗Ｓｅｒ８７リン酸化α−Ｓｙｎポリクローナル抗体でイムノブロットした。（Ｃ）に提示するｐＳeｒ１２９−αＳｙｎについてのイムノブロット解析においては、試料を３０秒の短時間露光（上パネル）及び２分の長時間露光（下パネル）で検出した。各パネルの左側に分子量マーカーをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。矢印は濃縮ゲルの上端を示す。 図３は、ＲＴ−ＱＵＩＣ反応におけるｒ−αＳｙｎの線維形成を示す図である。（Ａ）ヒトｒ−αＳｙｎを、表示した希釈のＤＮ−ＤＬＢ（症例＃１及び＃２）、Ｌｉ−ＤＬＢ、統合失調症（Ｓｃ）、ＡＤ（症例＃１及び＃２）、ｓＣＪＤ ＭＭ１（症例＃１及び＃２）、ｓＣＪＤ ＭＭ２、及びＧＳＳ患者のＢＨとともに用いるか、又はシード無し（Ｎｏ−ｓｅｅｄｅｄ；患者由来のＢＨ無し）で、ＲＴ−ＱＵＩＣを行った。曲線は６レプリケートウェルすべての平均ＴｈＴ蛍光動態を表す。図９も参照。（Ｂ）９６時間反応後に個別の試料において得られた最大蛍光強度の値及び遅滞期の値を、それぞれ上及び下のグラフにプロットする。遅滞期は、蛍光強度が＞１２０任意単位に到達するのに必要な時間と定義した。水平のバーは平均±標準偏差を示す。最大蛍光強度についてのデータは一元配置分散分析、続いてテューキー−クレーマー検定で解析した。遅滞期についてのデータ解析は、ログランク検定及びテューキー−クレーマー検定により行った。^＊＊、Ｐ＜０．０１（シード無しと比較）；^＊、Ｐ＜０．０５（シード無しと比較）。（Ｃ）ＴＥＭにより試料を検証した。バーは１００ｎｍ。（Ｄ）試料をＦＴＩＲ解析に供した。（Ｃ）及び（Ｄ）のＤＮ−ＤＬＢ＃１、ＤＮ−ＤＬＢ＃２、Ｓｃ、及びＡＤ＃２の試料は、５×１０^−６希釈のＢＨでシーディングした。 図４は、４つの更なるＤＮ−ＤＬＢ脳のウェスタンブロット解析及びＲＴ−ＱＵＩＣ解析を示す図である。（Ａ）ＤＮ−ＤＬＢ患者由来のＢＨ試料（症例＃３、＃４、＃５及び＃６）を、抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９（左パネル）及び抗ｐＳeｒ１２９−αＳｙｎモノクローナル抗体（右パネル）でイムノブロットした。各パネルの左側に分子量マーカーをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。矢印は濃縮ゲルの上端を示す。（Ｂ）ヒトｒ−αＳｙｎを、表示した希釈のＤＮ−ＤＬＢ由来ＢＨとともに用いてＲＴ−ＱＵＩＣを行った。曲線は６レプリケートウェルすべての平均のＴｈＴ蛍光動態を表す。図１０も参照。（Ｃ）９６時間反応後に個別の試料において得られた最大蛍光強度の値及び遅滞期の値を、それぞれ上及び下のグラフにプロットする。遅滞期は、蛍光強度が＞１２０任意単位に到達するのに必要な時間と定義した。水平のバーは平均±標準偏差を示す。最大蛍光強度についてのデータは一元配置分散分析、続いてテューキー−クレーマー検定で分析した。遅滞期についてのデータ解析は、ログランク検定及びテューキー−クレーマー検定により行った。^＊＊、Ｐ＜０．０１（シード無しと比較）；^＊、Ｐ＜０．０５（シード無しと比較）。 図５は、インキュベーションにより誘導したｒ−αＳｙｎ不溶性凝集体のシーディング活性を示す図である。ＷＴ又はＳ１２９Ａのｒ−αＳｙｎ（１４μｇ）を、１４０Ｕのカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）又は３５μｌの反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５０ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中２００μＭ ＡＴＰの存在下（＋）又は非存在下（−）、３７℃でインキュベーションした。（Ａ）０（左パネル）、７２（中央パネル）又は２６４時間（右パネル）のインキュベーション後、試料を、抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９及び抗ｐＳeｒ１２９−αＳｙｎモノクローナル抗体でイムノブロットした。各パネルの左側に分子量マーカーをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。矢印は濃縮ゲルの上端を示す。（Ｂ）０、７２、１６８及び２６４時間のインキュベーション後、ＡＴＰの非存在下（ＷＴ^ＣＫ２）又は存在下（ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）でＣＫ２と混合したＷＴ ｒ−αＳｙｎ並びにＣＫ２及びＡＴＰと混合したＳ１２９ｒ−αＳｙｎ（Ｓ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）のＴｈＴ蛍光レベルを測定した。データを平均±標準偏差で表す（ｎ＝４）。（Ｃ）ＣＫ２及びＡＴＰと０時間（ＷＴ−０ｈ及びＳ１２９Ａ−０ｈ）又は２６４時間（ＷＴ−２６４ｈ及びＳ１２９Ａ−２６４ｈ）インキュベーションしたＷＴ又はＳ１２９Ａ ｒ−αＳｙｎをＦＴＩＲ解析に供した。（Ｄ）ＴＥＭにより試料を検証した。バーは２００ｎｍ。（Ｅ）ＲＴ−ＱＵＩＣにより、ＷＴ−０ｈ、ＷＴ−２６４ｈ、Ｓ１２９Ａ−０ｈ、及びＳ１２９Ａ−２６４ｈの試料のシーディング活性を、２×１０^−２及び２×１０^−４の希釈で評価した。曲線は３又は４レプリケートウェルの平均ＴｈＴ蛍光動態を表す。 図６は、ＲＴ−ＱＵＩＣにより生成したｒ−αＳｙｎオリゴマーのシーディング活性を示す図である。（Ａ）１２５ＵのＣＫ２のみ（ＷＴ^ＣＫ２及びＳ１２９Ａ^ＣＫ２）又は１２５ＵのＣＫ２と２００μＭ ＡＴＰの両方（ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）の存在下で、ＲＴ−ＱＵＩＣにより、シード無しで、ＷＴ又はＳ１２９Ａ ｒ−αＳｙｎ（１２．５μｇ）の線維形成を誘導した。曲線はトリプリケートウェルの平均ＴｈＴ蛍光動態を表す。（Ｂ）ＲＴ−ＱＵＩＣ試料（ＷＴ^ＣＫ２、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}、Ｓ１２９Ａ^ＣＫ２、及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）を、抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９及び抗ｐＳeｒ１２９−αＳｙｎモノクローナル抗体でイムノブロットした。各パネルの左側に分子量マーカーをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。矢印は濃縮ゲルの上端を示す。（Ｃ）ＲＴ−ＱＵＩＣ試料（ＷＴ^ＣＫ２、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}、Ｓ１２９Ａ^ＣＫ２、及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）をＦＴＩＲ解析に供した。（Ｄ）ＴＥＭにより試料を検証した。バーは５０ｎｍ。（Ｅ）引き続くＲＴ−ＱＵＩＣによる試験により、ＲＴ−ＱＵＩＣ試料（ＷＴ^ＣＫ２、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}、Ｓ１２９Ａ^ＣＫ２、及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）のシーディング活性を、２×１０^−４〜２×１０^−８の希釈で評価した。曲線はレプリケートのウェルの平均ＴｈＴ蛍光動態を表す（ｎ＝３〜６）。（Ｆ）７２時間反応後の個別の試料において得られた最大蛍光強度の値及び遅滞期の値を、それぞれ右及び左のグラフにプロットした。遅滞期は、蛍光強度が＞１２０任意単位に到達するのに必要な時間と定義した。水平のバーは平均±標準偏差を示す。最大蛍光強度についてのデータは一元配置分散分析、続いてテューキー−クレーマー検定で解析した。遅滞期についてのデータ解析は、ログランク検定及びテューキー−クレーマー検定により行った。^＊＊、Ｐ＜０．０１（２×１０^−４希釈のＷＴ−モックと比較）；^＊、Ｐ＜０．０５（２×１０^−４希釈のＷＴ−モックと比較）；＃＃、Ｐ＜０．０１（同じ希釈のＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}と比較）。 図７は、Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のイムノブロット法による、ＤＬＢ脳におけるＳｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン濃度の見積もりを示す図である。（Ａ）ドットブロット解析のための基準としてＳｅｒ１２９リン酸化ｒ−αＳｙｎ（ｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎ）を生成するため、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）及びＡＴＰの存在下でのインキュベーションにより、ｒ−αＳｙｎをリン酸化した。ｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎ濃度の測定を、Ｚｎ^２＋−Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥと引き続くウェスタンブロット法により行った。抗αＳｙｎ抗体Ｄ１１９を用いたイムノブロット法により、試料（全ｒ−αＳｙｎのうちの１μｇ）が、ＣＫ２量に依存した態様で、異なる３状態（ａ、ｂ、ｃ）に分かれることが明らかになった（左パネル）。抗ｐＳｅｒ１２９モノクローナル抗体は（ａ）型及び（ｂ）型を特異的に認識することに留意するべきであり、このことにより、タンパク質（ｂ）はモノ（Ｓｅｒ１２９）−リン酸化ｒ−αＳｙｎであり、タンパク質（ａ）はＳｅｒ１２９及び別のアミノ酸でジリン酸化されていることが示される（右パネル）。５００ＵのＣＫ２で処理した試料中のｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎ濃度を、（ａ）及び（ｂ）のバンドの比から、全ｒ−αＳｙｎのうち４６０ｎｇ／μｇと算出した（左パネル）。ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥは分子量には依存しないが、分子量マーカーをタンパク質の移動の判断基準として用いた。各パネルの左側に分子量マーカーをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。（Ｂ）所定の量のｒ−αＳｙｎ及びｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎを、それぞれ、ＢＨ中のαＳｙｎ（左上パネル）量及びｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎ（左下パネル）量の定量的解析用の基準として用いた。基準のｒ−αＳｙｎについての記号は以下の通りである（左上パネル）：ａ１、０ｎｇ；ａ２、１２５ｎｇ；ａ３、２５０ｎｇ；ａ４、５００ｎｇ；ａ５、１０００ｎｇ；ａ６、２０００ｎｇ。ＢＨ試料についての記号は以下の通りである（左上パネル）：ｂ１、ＤＮ−ＤＬＢの症例１（０．２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｂ２、ＤＮ−ＤＬＢの症例２（０．２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｂ３、Ｌｉ−ＤＬＢ（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｂ４、統合失調症（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｂ５、ＣＪＤ１型の症例１（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）； ｂ６、ＣＪＤ１型の症例２（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｃ５、ＣＪＤ２型（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｃ６、ＧＳＳ（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｄ５、ＡＤの症例１（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｄ６、ＡＤの症例２（２％ ｗｔ／ｖｏｌ）。基準のｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎについての記号は以下の通りである（左下パネル）：ａ１、０ｎｇ；ａ２、５０ｎｇ；ａ３、１００ｎｇ；ａ４、２００ｎｇ；ａ５、４００ｎｇ。ＢＨ試料についての記号は以下の通りである（左下パネル）：ｂ１〜３、ＤＮ−ＤＬＢの症例１（０．１％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｃ１〜３、ＤＮ−ＤＬＢの症例２（０．２％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｄ１〜３、Ｌｉ−ＤＬＢ（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｂ４、統合失調症（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｂ５、ＣＪＤ１型の症例１（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）； ｂ６、ＣＪＤ１型の症例２（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｃ５、ＣＪＤ２型（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｃ６、ＧＳＳ（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｄ５、ＡＤの症例１（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）；ｄ６、ＡＤの症例２（２０％ ｗｔ／ｖｏｌ）。２０μｌの試料を、ニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。ドット強度と基準との間の直線回帰を、ｒ−αＳｙｎ（ｒ^２＝０．９０１８）については右上図に、及びｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎ（ｒ^２＝０．９７８１）について右下図に示す。ＤＮ−ＤＬＢの２症例及びＬｉ−ＤＬＢの１症例由来のＢＨにおいて、αＳｙｎの蓄積が抗αＳｙｎ抗体Ｄ１１９により検出されたが、非ＤＬＢ症例においては何も検出されなかった（上パネル）。ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎに対する抗体との免疫反応性は、ＤＮ−ＤＬＢの２症例及びＬｉ−ＤＬＢの１症例由来ＢＨにおいてのみ観察された（下パネル）。ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１及び＃２におけるｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎのレベルは、それぞれ、１３．５±０．４ｍｇ／ｇ脳及び３．７±０．２ｍｇ／ｇ脳、そしてＬｉ−ＤＬＢのレベルは０．０６±０．０２ｍｇ／ｇ脳と見積もられた。全αＳｙｎに対するｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎの比率は次の通りであった：ＤＮ−ＤＬＢの症例１（５７．９±１．５％）、ＤＮ−ＤＬＢの症例２（２２．６±１．２％）、及びＬｉ−ＤＬＢ（６．１±１．７％）。 図８は、組換えヒトプリオンタンパク質含有反応緩衝液又は基質タンパク質無しの反応緩衝液中のＲＴ−ＱＵＩＣ反応を示す図である。（Ａ）組換えヒトプリオンタンパク質（ｒＰｒＰ）を含有する反応緩衝液中で、５×１０^−６希釈のＤＮ−ＤＬＢ症例＃１を用いて、若しくはシード無しで、又は基質タンパク質を含有しない反応緩衝液中で、５×１０^−６希釈のＤＮ−ＤＬＢ症例＃１を用いてＲＴ−ＱＵＩＣを行った。反応緩衝液成分の最終濃度は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１０μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）であった。ｒＰｒＰの濃度は１５０μｇ／ｍｌであった。曲線は、６レプリケートウェルすべての平均のＴｈＴ蛍光動態を表す。（Ｂ）９６時間の反応後に個別の試料において得られた最大蛍光強度の値及び遅滞期の値を、それぞれ左及び右のグラフにプロットする。遅滞期は、＞１２０任意単位の蛍光強度に到達するのに必要な時間と定義した。水平方向のバーは平均±標準偏差を示す。シード有りと無しの間で、ｒＰｒＰ線維形成における最大蛍光強度又は遅滞期に有意差は無かった。基質を含有しない反応では、ＴｈＴ蛍光は増大しなかった。 図９は、ＤＮ−ＤＬＢ（症例＃１及び＃２）、Ｌｉ−ＤＬＢ、統合失調症、ＡＤ、ＣＪＤ、及びＧＳＳ由来のシードによるｒ−αＳｙｎ線維形成の動態を示す図である。反応はすべて６レプリケートで行った。曲線は、同一のＢＨでシーディングした個別の反応由来のＴｈＴ蛍光動態を表す。 図１０は、ＤＮ−ＤＬＢ（症例＃３、＃４、＃５及び＃６）由来のＢＨでのシーディングによるｒ−αＳｙｎ線維形成の動態を示す図である。反応はすべて６レプリケートで行った。曲線は、同一のＢＨでシーディングした個別の反応由来のＴｈＴ蛍光動態を表す。 図１１は、α−シヌクレインの線維形成を模式的に示す図である。 図１２は、ＤＬＢ患者由来の脳脊髄液（ＣＳＦ）における実験方法の比較を示す図である。 図１３は、プリオン病とＤＬＢとの、鑑別診断補助検査を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、α−シヌクレイノパチー（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）とは、脳組織中の特定の細胞内に、シナプス蛋白質の１種であるα−シヌクレインが凝集した、好酸性の細胞封入体が観察されることを特徴とする脳の疾患を指す。正常機能を有するα−シヌクレインは、神経細胞において、ゴルジ体の機能や小胞輸送の機能に関与し、脳では軸索末端に局在し、タンパク質分解酵素で容易に可溶化されることが知られている。
本発明におけるα−シヌクレイノパチーとしては、レビー小体病及び多系統萎縮症が挙げられる。レビー小体病には、パーキンソン病及びレビー小体型認知症が含まれる。レビー小体病では、この細胞封入体はレビー小体（Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｙ）と呼ばれる。レビー小体は、パーキンソン病では脳幹に属する中脳の黒質及び青斑核の神経細胞中にみられるが、レビー小体病では大脳辺縁系や大脳皮質の神経細胞中にも多数みられる。多系統萎縮症では、細胞封入体はグリア細胞内封入体（Ｇｌｉａｌ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）と呼ばれ、線条体の他、黒質、小脳皮質、橋核、オリーブ核、大脳皮質運動野等のオリゴデンドログリア細胞中、神経細胞質中に見られる。

本発明において、パーキンソン病とは、安静時振戦，筋固縮，無動，姿勢反射障害の４症候を呈する錐体外路系の進行性変性疾患である。中脳黒質から線条体へ投射されるドーパミン作動性ニューロンの変性によって、錐体外路系の機能不全が生じる。
日本人の患者数は、１０万人あたり約５０〜１００人、（６５歳以上は人口１０万人あたり約２００人）程度である。

本発明において、レビー小体型認知症とは，主として初老期ないし老年期に発症し、進行性の認知機能障害に加えて、パーキンソニズム（パーキンソン病の上記４症候のうちの、一般に２つ以上を示している状態を“パーキンソニズム”という）と特有の精神症状を示す変性疾患を指す。典型的には６０歳超で発症し、日本における患者数は５０万人ほどと考えられ、アルツハイマー病に次いで２番目に多い認知症であることが知られている。レビー小体型認知症では、神経伝達物質の濃度、及び線条体から新皮質までのニューロン経路が異常となる。レビー小体型認知症の必須症状としては、社会、日常生活機能に障害をもたらす認知機能障害が挙げられ、認知機能障害としては記憶障害、注意障害や視空間障害、実行機能障害等が挙げられる。レビー小体型認知症の中核症状としては、認知機能の動揺、幻視、パーキンソン症候群が挙げられる。レビー小体型認知症には病理学的亜型が存在し、レビー小体の分布により、びまん性皮質型ＤＬＢ（ＤＮ−ＤＬＢ）及び大脳辺縁系型ＤＬＢ（Ｌｉ−ＤＬＢ）等に分けられる。

また、レビー小体型認知症は、アルツハイマー病と比較して、初期の段階から幻視、妄想、うつ等の精神症状、パーキンソン病様の運動症状のような特徴が見られる。また、アルツハイマー病の治療薬でもあるドネペジルはレビー小体型痴呆症にも少量で有効であることがあることが知られている。

アルツハイマー病の場合、症状の発症前でも、髄液の検査や、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によってアミロイドが検出できる可能性がある。これに対して、レビー小体型認知症では、症状発症前に迅速に鑑別することは困難であった。

本発明は、α−シヌクレイノパチーの診断に有効な生体試料中の異常α−シヌクレインを迅速に検出する方法、具体的には、（１）緩衝液中で、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合し、反応混合液を得る工程；
（２）反応混合液をインキュベーションして、生体試料中の重合及び線維化α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
（３）形成されたα−シヌクレインの凝集体を検出する工程、
を含む、生体試料中の重合及び線維化α−シヌクレインを検出する方法を提供する。

本発明において、α−シヌクレインは、α−シヌクレイノパチーに関連して、正常α−シヌクレイン及び異常α−シヌクレインに分類される。正常α−シヌクレインは、重合核（本明細書中、シードとも称する）の存在下、異常α−シヌクレインとなり、凝集体を形成することが可能である。正常α−シヌクレイン自体は凝集体形成においてシーディング活性を有しない、α−シヌクレインの単量体を指す（図１１）。

異常α−シヌクレインは、レビー小体で検出される凝集α−シヌクレインであり、α−シヌクレインの凝集体形成においてシーディング活性を有する。正常α−シヌクレインとは異なるβシート様の立体構造をとり、凝集して安定なオリゴマー(重合)様の顆粒状形態となり、一態様では、さらに高分子量の線維化となる（図１１）。本明細書中、重合及び線維化α−シヌクレインのことを「異常α−シヌクレイン」と呼ぶ場合がある。

本発明の方法において、α−シヌクレインの凝集体は、生体試料中に存在する異常α−シヌクレインがシードとなり、基質となる正常α−シヌクレインが構造変換し、重合することによって形成される。１つの態様において、凝集体は高分子の線維状構造体を形成する。１つの態様において、凝集体は不溶性である。本明細書中、α−シヌクレインの凝集体のことを単に「凝集体」と称することがある。

本発明で用いる正常α−シヌクレインには、各種のタンパク質データベースにおいてα−シヌクレインとアノテーションされているタンパク質が含まれる。具体的には、配列番号２で表されるヒトα−シヌクレインアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＡＸ０６０３５．１）を含むタンパク質及びそのスプライシングバリアント（例えば、配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ９８４９３．１）及び４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ９８４８７．１））が挙げられるが、シードの存在下、凝集して構造変換することが可能な限り、これらの構成アミノ酸残基が変異したものであってもよいし、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。本発明におけるα−シヌクレインのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列である。

本発明における正常α−シヌクレインは、シードの存在下、凝集して構造変換するものである限り、構成アミノ酸が修飾を受けたものであってもよい。修飾は、天然に存在するものでも、人工的なものであってもよい。修飾としては、グリコシル化、ユビキチン化、チロシンニトロ化、ビオチン化等が挙げられる。

正常α−シヌクレインは、細菌組織、又は哺乳動物組織から単離及び精製されたものでも、化学的に合成されたものでもよい。正常α−シヌクレインは、自体公知の方法に従って、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からα−シヌクレインを単離精製することによって遺伝子工学的に製造される組換えα−シヌクレインであってもよい。安定的に供給され得るという点から、組換えα−シヌクレインを用いることが好ましい。

本発明に用いられる正常α−シヌクレインは単離又は精製されていることが好ましい。「単離又は精製」とは、天然にある状態から目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製されたα−シヌクレインの純度（全タンパク質重量に対する、α−シヌクレインを特異的に認識する抗体の重量の割合）は、通常５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば実質的に１００％）である。

正常α−シヌクレインとして組換えα−シヌクレインを用いる場合、組換えα−シヌクレインは、例えば以下の方法で作製することができる。α−シヌクレインアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、ヒトα−シヌクレインの場合には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＡＸ０６０３５．１のＣＤＳ）を含むポリヌクレオチド）を適切な発現ベクターに組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換細胞の破砕物から目的とする組換えα−シヌクレインを得ることができる。上記宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物又は動物細胞などを用いることができる。

遺伝子工学的に製造される場合は、合成後の精製を容易にするために、α−シヌクレインポリペプチドにタグ配列を付加してもよい。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を例示することが出来る。タグ配列が付加される位置は、好ましくは、α−シヌクレインポリペプチドのＮ末端又はＣ末端である。また、これらのタグ配列を有するα−シヌクレインポリペプチドは、本発明の方法にそのまま用いられてもよいし、その前に、当該タグが除去されてもよい。

本発明の方法において用いることのできる生体試料としては、血液、脳組織、脳脊髄液等のサンプルが挙げられるが、α−シヌクレイノパチーに伴うα−シヌクレインの線維形成のためのシーディング活性を検出できる限り、特に限定されない。脳組織（例えば、前頭葉領域の脳組織、黒質の脳組織）は、適切な緩衝液中で破砕するなどし、ホモジネートの状態にして本発明の方法に供されることが好ましい。「血液」としては、いかなる組織由来の血液も想定することができるが、採取の容易から、通常は末梢血が用いられる。血液の採取方法としては、自体公知の方法が適用できる。また採取した血液はそのまま本工程に用いてもよいが、自体公知の方法、例えば遠心分離、濾過などを利用して細胞成分（赤血球、白血球、血小板など）と分離した液体成分（血漿）として本工程に用いることが好ましい。また血液を凝固させて血小板や凝固因子を分離した液体成分（血清）として本工程に用いることも好ましい。白血球を生体試料として用いることもまた好ましい。脳脊髄液は、脳組織を満たし、循環しており、脳の状態を反映していると考えられる。脳脊髄液は腰椎穿刺法、後頭下穿刺法、脳室穿刺法等の方法により採取され、本発明の方法に供されることが好ましい。

生体試料は、被験体から採取される。「被験体」は、「α−シヌクレイノパチーに罹患していることが疑われる被験体」である。本明細書中、「α−シヌクレイノパチーに罹患していることが疑われる被験体」とは、α−シヌクレイノパチーに罹患していることが疑われる症状を示している被験体であって、他の認知障害を伴う疾患（伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ又はプリオン病）（ヒトでのクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）及びその亜種（孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｓＣＪＤ）等）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ））、統合失調症及びアルツハイマー病等；本明細書中、「α−シヌクレイノパチー以外の認知症等」と称する場合がある）との鑑別が求められる哺乳動物、好ましくはヒトを指す。

更なる局面において、「被験体」は、「α−シヌクレイノパチーに罹患している被験体」であり得る。具体的には、α−シヌクレイノパチーであることを定義づける臨床所見を認めた被験体であって、該被験体からの生体試料は、本発明においてポジティブコントロールとして用いることができる。

別の態様においては、「被験体」は、「α−シヌクレイノパチーに罹患していない被験体」であり得る。具体的には、α−シヌクレイノパチーであることを定義づける臨床所見を認めない被験体であって、該被験体からの生体試料は、本発明においてネガティブコントロールとして用いることができる。当該被験体としては、健常者の他、α−シヌクレイノパチー以外の認知症等に罹患している被験体が挙げられる。

本発明において、「哺乳動物」としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。

生体試料と正常α−シヌクレインとの混合に使用される容器としては、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート（６、１２、２４、４８又は９６穴マルチウェルプレート）、シャーレ、チューブ、トレイが挙げられる。

生体試料と混合する正常α−シヌクレインは、通常生体試料に存在するであろうシードとなる異常α−シヌクレインに対して過剰量で用いられ、濃度としては、限定されないが、例えば、１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは８０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、より一層好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１２０μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌである。

生体試料の濃度は、例えば、生体試料を適切な緩衝液で希釈することにより、希釈系列を作製し、それぞれに本発明の方法を実施して、異常α−シヌクレインを適切に検出、又は定量できる。

生体試料として脳脊髄液を用いる場合、反応混合液中の脳脊髄液の濃度は、（脳脊髄液の原液に換算して）例えば、全反応混合液中の１％（ｖ／ｖ）〜３０（ｖ／ｖ）％、５％（ｖ／ｖ）〜２０（ｖ／ｖ）％、７（ｖ／ｖ）％〜２５（ｖ／ｖ）％、１０（ｖ／ｖ）％〜１５（ｖ／ｖ）％である。

生体試料と正常α−シヌクレインとの混合に用いられる緩衝液は、一定範囲のｐＨを維持できるものであれば特に限定されず、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等）であってよい。緩衝液は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）及びその組合せによるものであってもよい。好ましくは、ＨＥＰＥＳが用いられる。

上記における緩衝液中のｐＨとしては、通常６．５〜８．５、好ましくは７．０〜８．０、より好ましくは７．２〜７．８、更により好ましくは７．３〜７．７、一層好ましくは７．４〜７．６、最も好ましくは７．５である。ｐＨが６．５未満であるか、又は８．５を超えると、生体内に存在するα−シヌクレインの周囲の環境のｐＨから乖離する可能性がある。

本発明の方法において、生体試料と正常α−シヌクレインとの混合は上記反応混合液中にジルコニウム／シリカ ビーズ等のビーズを加えて実施しても、また加えずに実施してもよい。好ましくはビーズを加えずに混合する。

本発明の方法において、反応混合液には塩を含めてもよい。かかる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム、塩化リチウム、塩化ストロンチウム、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化鉄、塩化銅、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、硝酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、乳酸カルシウム等が挙げられる。

上記塩の混合液中の濃度としては、例えば、１μＭ〜１Ｍ、１００μＭ〜８００ｍＭ、１ｍＭ〜６００ｍＭ、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、１００ｍＭ〜５００ｍＭ、２００ｍＭ〜４００ｍＭ、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭが挙げられる。

凝集体を形成する工程（２）は、上記反応混合液をインキュベーションすることによって行われる。インキュベーションの温度としては、例えば３２℃〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃、より好ましくは３８℃〜４２℃、最も好ましくは４０℃である。３２℃未満では、凝集体形成において正常α−シヌクレイン分子の立体構造変化を抑制してしまう可能性があり、５０℃を超えると凝集体形成に非依存的な正常α−シヌクレイン分子の立体構造変化を誘発してしまう可能性がある。

インキュベーションの時間は、検出される程度に凝集体が形成されれば特に限定されないが、例えば５時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１４時間以上、１６時間以上、２０時間以上、２４時間以上、４８時間以上である。また、長時間インキュベーションしても形成される凝集体の量が一定となり、また、迅速な測定という目的に鑑みれば、通常、インキュベーションは９６時間以下、７２時間以下、４８時間以下で行われる。

凝集体の形成を促進する工程（２）においては、上記反応混合液を震盪してもよい。震盪は、例えば、市販の震盪培養器等を用い、例えば、２００ｒｐｍ〜１,０００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍ、４００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、５００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍ、８００ｒｐｍ〜１,２００ｒｐｍ、好ましくは４２０ｒｐｍ〜４８０ｒｐｍ、最も好ましくは４３２ｒｐｍで行う。

工程（２）には、一定の震盪期間及び一定の無震盪期間が繰り返されるサイクルが含まれ得る。例えば、工程（２）では６０秒間の震盪期間及び６０秒間の無震盪期間のサイクルが含まれる。別の例では、工程（２）には３０秒間の震盪期間及び３０秒間の無震盪期間のサイクルが含まれる。４５秒間の震盪期間及び４５秒間の無震盪期間又は７０秒間の震盪期間及び７０秒間の無震盪期間など、期間は変えられてもよい。他の態様において、震盪期間及び無震盪期間のサイクルは、例えば、サイクル全体で長さが１分間、２分間、好ましくは３分間である。工程（２）にはサイクル全体の長さによって震盪期間及び無震盪期間を変えてもよい。

上記震盪期間／無震盪期間のサイクルを繰り返す時間は、検出される程度に凝集体が形成されれば特に限定されないが、その合計が、例えば１０時間以上、１２時間以上、１４時間以上、１６時間以上、２０時間以上、２４時間以上、４８時間以上である。また、長時間実施しても形成される凝集体の量が一定となり、また、迅速な測定という目的に鑑みれば、通常、サイクルは９６時間以下、７２時間以下、４８時間以下繰り返される。

本発明の方法において形成された凝集体は高分子であり、検出のために凝集体を含む反応混合液をそのまま用いてもよいが、高分子画分を部分的に精製して用いてもよい。検出される凝集体の分子量は、例えば、２００ｋＤａ以上、好ましくは２５０ｋＤａ以上、より好ましくは２８０ｋＤａ以上である。部分的な精製は、例えば、各種クロマトグラフィー又は限外濾過等により行うことができる。

本発明における検出方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法（ＳＰＲ法）ウェスタンブロット法、電子顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、蛍光分光法などを利用することができる。これらの中でも、ウェスタンブロット法、蛍光分光法が操作の容易性及び迅速性の観点からして好適である。

検出が抗体を用いて行われる場合、抗体は、α−シヌクレインの凝集体に特異的に結合する能力があればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。当該抗体としては、キメラ抗体、単鎖抗体又は抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、或いはＦａｂ画分などの結合性フラグメントも含む。これらの抗体としては、免疫原としてα−シヌクレインを用いて自体公知の方法により調製した抗体を用いることができるし、市販の抗体を用いることもできる。

市販の抗α−シヌクレイン抗体としては、抗α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）ポリクローナル抗体Ｄ１１９（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、１２９番目のセリンがリン酸化されたα−シヌクレインに対する抗ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎモノクローナル抗体、及び抗Ｓｅｒ８７リン酸化α−Ｓｙｎポリクローナル抗体等が挙げられるが、抗α−Ｓｙｎポリクローナル抗体Ｄ１１９、抗ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎ（抗Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレイン）モノクローナル抗体が好ましい。

前記抗体は、直接的又は間接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例、ＦＩＴＣ、ローダミン）、放射性物質（例、^１４Ｃ、^３Ｈ、^１２５Ｉ）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、着色粒子（例、金属コロイド粒子、着色ラテックス）、ビオチン等が挙げられる。

このような抗体であれば、本工程において１種のみの抗体を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。

上記「α−シヌクレインを特異的に認識する抗体」は、水溶液の状態で用いることが可能である。その場合、α−シヌクレインの凝集体は固相に結合させてもよい。かかる「固相」としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦ膜）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）、金属膜（例、金膜）などが挙げられる。なかでも、プレート、ビーズ、メンブレン及び金属膜が好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からメンブレンが最も好ましく用いられる。更に、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために、緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記ＢＳＡや牛ミルクタンパク等でブロッキングすることが一般に行われる。

検出における「α−シヌクレインを特異的に認識する抗体」と、「α−シヌクレインの凝集体」との接触は、反応容器中において、α−シヌクレインの凝集体と、α−シヌクレインを特異的に認識する抗体とを混合することでこれらが相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法などは特に限定されない。接触は、上記抗体を水溶液の状態で用いる場合、例えば凝集体が固相化されたメンブレンが浸漬された反応液中に抗体を添加することでなされる。

なお、かかる接触を保つ時間は、前記α−シヌクレインを特異的に認識する抗体と、α−シヌクレインの凝集体とが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常、数秒〜十数時間であり、速やかにα−シヌクレイノパチーであるか否かを判定する観点から、好ましくは１分〜２時間であり、最も好ましくは２分〜３０分である。また、接触を行なう温度条件としては、通常４℃〜５０℃であり、４℃〜３７℃が好ましく、１５℃〜３０℃程度の室温が最も好ましい。さらに、反応を行なうｐＨ条件は、５．０〜９．０が好ましく、特に６．０〜８．０の中性域が好ましい。

検出方法としてウェスタンブロット法を選択した場合は、例えば形成されたα−シヌクレインの凝集体を、ＳＤＳ充填緩衝液と混合して煮沸し、変性させ、試料液を調製する。当該試料液をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン又はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン等のメンブレンに転写し、固相化する。当該メンブレンを適切な反応液（例、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ）中に浸漬し、ブロッキングを行った後、適切な反応液（例、ＴＢＳＴ）中で一次抗体（抗α−シヌクレイン抗体）と反応させる。かかる反応に要する時間は、迅速な測定が必要である観点から、好ましくは１分〜２時間であり、より好ましくは２分〜３０分である。次にメンブレンを洗浄し、適切な反応液（例、ＴＢＳＴ）中で二次抗体（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体）と反応させる。かかる反応に要する時間は、迅速な測定が必要である観点から、好ましくは１分〜２時間であり、より好ましくは２分〜３０分である。再びメンブレンを洗浄し、ハイブリバッグ等の適切な容器中にメンブレンを検出緩衝液と共に含有させて、適切な検出システムにより検出する。

検出方法として分光光度計を選択した場合は、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合した反応混合液にアミロイド線維と結合して蛍光を発するようになる蛍光色素を添加し、凝集体を形成する上記の反応を行う。形成された線維状の凝集体に蛍光色素が結合し、蛍光を発するので、反応混合液に適切な波長の励起光を照射し、蛍光を分光光度計等で検出する。

アミロイド線維と結合して蛍光を発するようになる蛍光色素としては、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、１−Ｂｒｏｍｏ−２，５−ｂｉｓ（３−ｃａｒｂｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ、１−Ｆｌｕｏｒｏ−２，５−ｂｉｓ（３−ｃａｒｂｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）アミロイド検出試薬等が挙げられる。

一態様において、（３）の工程は、異常α−シヌクレインをシードとして形成されたα−シヌクレインの凝集体を定量することを含む。例えば、検出方法としてウェスタンブロット法を選択した場合は、検出した（スメア）バンドの濃さをイメージアナライザー等で測定して凝集体の量を定量することができる。検出方法として分光光度計を選択した場合は、凝集体に結合した蛍光色素による蛍光強度を測定することにより、凝集体の量を定量することができる。

一態様においては、工程（３）の検出は凝集体の形成が進行している間に行われ、その後に更に凝集体を形成する工程が継続する。一態様においては、工程（３）の検出は凝集体の形成が進行している間に断続的に複数回行われる。例えば、工程（３）の検出は工程（２）の震盪期間／無震盪期間の１サイクルの直後に行われる。ただし、検出は各サイクル毎に実施される必要はなく例えば１６分に１回、好ましくは１０分に１回の頻度、例えば５サイクル毎、好ましくは３サイクル毎で行われる。

本発明の方法は、（２）の後に以下の工程を続けて含んでもよい。
（３）緩衝液中で、形成されたα−シヌクレインの凝集体の一部と正常α−シヌクレインとを混合し、更なる反応混合液を得る工程；
（４）更なる反応混合液をインキュベーションして、異常α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
（５）所望により（３）〜（４）を繰り返す工程。

工程（１）〜（２）により形成された凝集体は、その一部と、正常α−シヌクレインとを混合して更なる混合溶液を得、インキュベーションすることにより、更に凝集体を形成することができる。生体試料中の異常α−シヌクレインの量が少なく、工程（１）〜（２）によって生体試料から直接形成されるα−シヌクレインの凝集体の量が少ない場合でも、工程（３）〜（４）又は工程（３）〜（５）を含むことにより、形成されるα−シヌクレインの凝集体の量を増幅することができる。その結果として、生体試料中の異常α−シヌクレイン検出感度を高めることができる。

本発明は、また、本発明の異常α−シヌクレインの検出方法を用いて、α−シヌクレイノパチーを診断補助するための方法を提供する。

本発明の診断の補助方法によれば、判定は、例えば以下のように行われる。健常者又はα−シヌクレイノパチー以外の認知症等の患者（ネガティブコントロール）、及びα−シヌクレイノパチーの患者（ポジティブコントロール）から生体試料（例、脳脊髄液）を採取し、被験体から採取した生体試料によって形成されたα−シヌクレインの凝集体の有無をポジティブコントロール及びネガティブコントロールについて確認する。

そして、確認結果より、被験体由来の生体試料を用いた場合に凝集体が検出された場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、凝集体が検出できない場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に低いと判定することができる。また、本発明の方法を用いて、α−シヌクレイノパチーとα−シヌクレイノパチー以外の認知症等とを鑑別する場合、凝集体が検出される場合には、該被験体は、α−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、凝集体が検出されない場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーではない可能性が高いと判定することができる。

別の態様においては、例えば、健常者又はα−シヌクレイノパチー以外の認知症等の患者（ネガティブコントロール）、及びα−シヌクレイノパチーの患者（ポジティブコントロール）から生体試料（例、脳脊髄液）を採取し、被験体から採取した生体試料によって形成されたα−シヌクレインの凝集体の量をポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較する。

そして、α−シヌクレインの凝集体の量の比較結果より、被験体由来の生体試料から形成された凝集体の量が相対的に多い場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、凝集体の量が相対的に少ない場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に低いと判定することができる。また、本発明の方法を用いて、α−シヌクレイノパチーとα−シヌクレイノパチー以外の認知症等とを鑑別する場合、凝集体の量が相対的に多い場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、凝集体の量が相対的に少ない場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーではない可能性が高いと判定することができる。

或いは、反応混合液におけるα−シヌクレインの凝集体の量のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定されたα−シヌクレインの凝集体の量とこのカットオフ値とを比較することによって行うこともできる。例えば凝集体の量が前記カットオフ値以上である場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が高いと判定することができる。逆に、凝集体の量がカットオフ値を下回る場合には、該被験体がα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性は低いと判定することができる。また、本発明の方法を用いて、α−シヌクレイノパチーとα−シヌクレイノパチー以外の認知症等とを鑑別する場合、凝集体の量が前記カットオフ値以上である場合には、該被験体は、α−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、凝集体の量がカットオフ値を下回る場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーではない可能性が高いと判定することができる。

また別の態様においては、例えば、健常者又はα−シヌクレイノパチー以外の認知症等の患者（ネガティブコントロール）、及びα−シヌクレイノパチーの患者（ポジティブコントロール）から生体試料（例、脳脊髄液）を採取し、被験体から採取した生体試料を用いて形成されるα−シヌクレインの凝集体の量を連続的に（例、リアルタイムで）測定し、反応開始からα−シヌクレインの凝集体が（一定レベルで）検出されるまでの時間を、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較する。

そして、比較結果より、凝集体が形成されるまで時間が相対的に短い場合には、該被験体は異常α−シヌクレインの量が相対的に多量と判定することができる。逆に、凝集体が形成されるまでの時間が相対的に長い場合には、該被験体は異常α−シヌクレインの量が相対的に少量と判定することができる。また、本発明の方法を用いて、α−シヌクレイノパチーとα−シヌクレイノパチー以外の認知症等とを鑑別する場合、ネガティブコントロールが陰性である時、凝集体が形成されるまでの時間が相対的に長い、短いに関係なく、該被験体は、α−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。

或いは、さらに別の態様では、反応混合液におけるα−シヌクレインの凝集体が形成されるまでの時間についてカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定されたα−シヌクレインの凝集体が形成されるまでの時間とこのカットオフ値とを比較することによって行うこともできる。例えば、凝集体が形成されるまでの時間が前記カットオフ値よりも短い場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が高いと判定することができる。逆に、凝集体が形成されるまでの時間が前記カットオフ値と同じか、より長い場合には、該被験体がα−シヌクレイノパチーに罹患している可能性は低いと判定することができる。また、本発明の方法を用いて、α−シヌクレイノパチーとα−シヌクレイノパチー以外の認知症等とを鑑別する場合、凝集体が形成されるまでの時間が前記カットオフ値よりも短い場合には、該被験体は、α−シヌクレイノパチーに罹患している可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、凝集体が形成されるまでの時間がカットオフ値と同じか、より長い場合には、該被験体はα−シヌクレイノパチーではない可能性が高いと判定することができる。

「カットオフ値」は、その値を基準として疾患や状態の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）及び高い診断特異度（無病正診率）の両方を満足できる値である。例えば、α−シヌクレイノパチーの患者で高い陽性率を示し、かつ、健常人又はα−シヌクレイノパチー以外の認知症等の患者で高い陰性率を示す、α−シヌクレインの凝集体の量又はα−シヌクレインの凝集体形成までの時間をカットオフ値として設定することが出来る。カットオフ値は、個々の被験体における検出や定量の結果に基づく診断の感度と特異度の関係を表した受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を作成することで求めることができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

材料及び方法
患者
ＤＬＢの脳組織を、臨床診断を組織病理学的に確認した患者７名からの剖検で得た。ブラーク病期分類によると、これらの被験者のうち、６名はびまん性皮質型ＤＬＢ（ＤＮ−ＤＬＢ）に罹っていると分類され、残り１症例は大脳辺縁系型ＤＬＢ（Ｌｉ−ＤＮＢ）であった。プリオン病の脳組織は、３名の孤発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）患者及び１名の、ＰＲＮＰのコドン１０２におけるＰｒｏからＬｅｕへの変異に関連する、ＧＳＳ患者からの剖検で得た。ｓＣＪＤのサブタイプは、ＰＲＮＰ遺伝子のコドン１２９における遺伝子型及び異常プリオンタンパク質（ＰｒＰ^Ｓｃ）の生理学的特性に従って診断した。彼らは１型、コドン１２９ＭＭ（ＭＭ１）の２症例、２型、コドン１２９ＭＭ（ＭＭ２）の１症例を含んでいた。ＡＤの脳組織は、神経原線維変化及び老人斑の存在という神経病理学的診断を受けていた患者２名からの剖検で得た。脳標本は、ＬＢＤの共存を殆ど又は全く伴わない純粋型のＡＤであった。脳における組織病理学的変化が無い、統合失調症及び乳癌の患者由来の脳組織を、非変性的症例として用いた。本研究に加わることについての、書面のインフォームドコンセントを患者の家族から受け取った。研究プロトコールは長崎大学病院の倫理委員会により承認され（ＩＤ：１００４２８２３）、大学病院医療情報ネットワークに登録された（ＩＤ：ＵＭＩＮ０００００３３０１）。

組換えヒトα−シヌクレインの発現及び精製
Ｈｉｓタグ付き野生型ヒトαＳｙｎのＮ末端残基１〜１４０をコードするＤＮＡ配列を、ヒトｃＤＮＡ（Ｔｏｙｏｂｏ）から、フォワードプライマー（５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇａａａｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｇａｔｇｇａｔｇｔａｔｔｃａｔｇａａａｇｇ−３’（配列番号５））及びリバースプライマー（５’−ｃｔａｇｃｔａｇｃｔａｇｔｔａｇｇｃｔｔｃａｇｇｔｔｃｇｔａｇｔｃｔｔ−３’（配列番号６））により増幅した。Ｓ１２９Ａ変異体は、フォワードプライマー（５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇａａａｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｇａｔｇｇａｔｇｔａｔｔｃａｔｇａａａｇｇ−３’（配列番号７））及びリバースプライマー（５’−ｃｔａｇｃｔａｇｃｔａｇｔｔａｇｇｃｔｔｃａｇｇｔｔｃｇｔａｇｔｃｔｔｇａｔａｃｃｃｔｔｃｃｔｃａｇｃａｇｇｃ−３’（配列番号８））により増幅した。Ｎ末端Ｈｉｓタグを消化するジペプチジルペプチダーゼＩのための終止点を、発現コンストラクトにグルタミンコドンを挿入することにより、タンパク質配列に導入した。増幅したＰＣＲ断片を、ｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ及びＮｈｅＩ部位に挿入し、配列決定解析により確認した。プラスミドを、Ｂ２１ ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントセル（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に形質転換後、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、組換えタンパク質を発現させた。細胞ペレットを、リゾチーム（Ｗａｋｏ）及びベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の存在下、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁した。溶解物を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）と室温で３０分間インキュベーションした。タンパク質を３００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶出させ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。図１Ａ及び１Ｂに示す通り、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付ヒトα−シヌクレインからのタグの除去を、ＴＡＧＺｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。精製Ｈｉｓ−ｒ−Ｓｙｎは、Ｎ末端側エキソペプチダーゼのＤＡＰａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）のためのグルタミンの終止点を、Ｈｉｓタグ配列とαＳｙｎの最初のアミノ酸との間に含有する。グルタミンシクロトランスフェラーゼのＱｃｙｃｌａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）存在下、ＤＡＰａｓｅによりタグを切断し、生成物をＮｉ−ＮＴＡ ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライして未切断のＨｉｓタグ付タンパク質を除去した。Ｑｃｙｃｌａｓｅ存在下、グルタミン残基は、ＤＡＰａｓｅ分解に対する終止点として作用するピログルタミン酸に変換される。ピログルタミルアミノペプチダーゼのｐＧＡＰａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）の作用により、ピログルタミン酸を除去することによってヒトαＳｙｎを得た。ＤＡＰａｓｅ、Ｑｃｙｃｌａｓｅ、及びｐＧＡＰａｓｅは、そのＣ末端にＨｉｓタグを有するので、Ｎｉ−ＮＴＡ ｒｅｓｉｎ用いて除去した。最終タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、２．０μｍシリンジフィルターで濾過した。タンパク質試料の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット法により、９８％＞と見積もった。円二色性（ＣＤ）及びフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）による解析によって、ｒ−αＳｙｎの変性構造が示された（図１Ｃ及び１Ｄ）。精製後、タンパク質の等分割量を、使用するまで−８０℃で保存した。

ＲＴ−ＱＵＩＣ実験
我々は、黒色の９６ウェル蛍光用プレート（Ｎｕｎｃ）中に、最終全体積１００μｌの反応混合物を調製した。混入を防ぐため、我々は、物質をすべて生物学的安全キャビネットの内側で調製し、エアロゾル耐性チップを用いた。反応緩衝液成分の最終濃度は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１０μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）であった。ｒ−αＳｙｎの濃度は１００μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌで、解凍したてのｒ−αＳｙｎのみを用いた。我々は、ｒ−αＳｙｎのロット間で至適ｒ−αＳｙｎ濃度（１００μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ）に軽度のばらつきを認めたが、最終感度は概ね同一であった。マルチビーズショッカーを用い、タンパク質分解酵素阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ）を添加した氷冷ＰＢＳ中、１０％で脳組織（前頭葉領域）をホモジェナイズした。２０００×ｇで２分間遠心分離後、上清を採取し、使用するまで−８０℃に凍結した。脳ホモジネートは、反応前にＰＢＳで希釈した。９６ウェルプレートを密封テープ（Ｎｕｎｃ）で覆い、プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；ＴＥＣＡＮ）中で断続的に震盪（円形状の震盪を最大速度で４０秒、２０秒間震盪無し、次いで蛍光測定のため２分休止から成る）して４０℃でインキュベーションした。励起光及び蛍光の波長をそれぞれ４４０ｎｍ及び４８５ｎｍとした単色光分光器を用いて、プレート底部の蛍光強度を１０分毎に読み取り、アミロイド形成の動態をモニターした。各希釈脳ホモジネート試料を６レプリケート測定した。不溶性凝集体及びｒ−αＳｙｎオリゴマーの各希釈試料を、それぞれ、３〜４レプリケート及び３〜６レプリケートアッセイした。我々は、１２０任意単位超の蛍光強度を有する反応を陽性反応とし、レプリケート反応の５０％において陽性反応を示したシード用量（ＳＤ_５０）を、スピアマン−ケルバー方法を以前（Ｗｉｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）記載された通りに用いて算出した。

ウェスタンブロット法
脳組織（前頭葉領域）を、Ｔｒｉｔｏｎ−デオキシコール酸（ＤＯＣ）溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，２ｍＭ ＥＤＴＡ，及びタンパク質分解酵素阻害剤を含有））により、４℃で３０分間溶解させた。２０００×ｇで２分間遠心分離後、上清を採取し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて全タンパク質濃度を測定した。試料を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）充填緩衝液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ６．８（５％ ２−メルカプトエタノール，２％ＳＤＳ，５％ショ糖，及び０．００５％ブロモフェノールブルー含有））と共に９５℃で５分間煮沸し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。タンパク質を、１５％メタノールを含有する転写緩衝液中、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に３００ｍＡで２時間転写し；膜を、ＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中５％脱脂粉乳で４℃で２時間ブロッキングし、希釈した一次抗体と反応させた。免疫反応したバンドを、増強化学発光システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＨＲＰ−結合二次抗体により可視化した。

透過型電子顕微鏡法
カーボン支持膜グリッド（染色前にグロー放電した）上でネガティブ染色を行った。試料の５μｌ等分割量をグリッド上に吸着させ、残液を濾紙で吸収した。グリッドを、新たに濾過した染色液（２％酢酸ウラン）５μｌで染色した。乾燥した時点で、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１４００ＰＬＵＳ；ＪＥＯＬ）で試料を観察した。

ＣＤ
円二色性（ＣＤ）スペクトルを、石英セルを用い、ＪＡＳＣＯ Ｊ−８２０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ）により、１ｍｍの経路長で測定した。１９５ｎｍ〜２５０ｎｍの波長範囲での４回のスキャンを平均することにより、ＣＤスペクトルを得た。ｒ−αＳｙｎは２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌの緩衝液中に溶解させた。ｒ−αＳｙｎの濃度は３００μｇ／ｍｌであった。

ＦＴＩＲ
フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルは、液体窒素で冷却した水銀カドミウムテルル（ＭＣＴ）検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ ２７ ＦＴＩＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）により測定した。試料の２０μｌ等分割量を、ＢｉｏＡＴＲｃｅｌｌ ＩＩ減衰全反射型反射ユニットに装填した。４ｃｍ^−１分解能における、全１２８スキャンを、一定の窒素パージの下、各試料について収集し、水蒸気に関して補正し、緩衝液の背景スペクトルを差し引いた。

組織病理学及び免疫組織化学的染色
脳組織を２０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ミクロトームで、スライドグラス上に８μｍのパラフィン切片を作製した。脱パラフィン及び再水和後、組織切片をヘマトキシリン及びエオジンでの染色、並びに抗Ｓｅｒ１２９リン酸化α−Ｓｙｎ抗体（１：３０００希釈；Ｗａｋｏ）を用いた免疫組織化学的染色に供した。免疫原性を増進するため、一次抗体とインキュベーションする前に、９８℃で４０分間加熱することにより切片を作製した。一次抗体の結合は、標識ストレプトアビジン−ビオチン法（ＤＡＫＯ）により検出した。ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを、３’３−ジアミノベンジジン（Ｗａｋｏ）を発色原として可視化した。免疫染色した切片を、マイヤーのヘマトキシリンで軽く対比染色した。

統計解析
最大蛍光強度についてのデータは一元配置分散分析、続いてテューキー−クレーマー検定で解析した。遅滞期についてのデータ解析は、ログランク検定及びテューキー−クレーマー検定に供した。統計学的有意を示すため、Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１を用いた。

補足的な実験手順
組換えα−シヌクレインのｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化
ｒ−αＳｙｎ（３μｇ）を、２０μｌの反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５０ｍＭ ＫＣｌ，及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で、カゼインキナーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び２００μＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で５時間インキュベーションした。９５℃で１０分間煮沸することにより反応を停止した。

Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法
ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に基づいてＰｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ポリアクリルアミドの分離ゲルには１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４５），０．１％ＳＤＳ，１３．３％グリセロール，１００μＭ Ｐｈｏｓ−ｔａｇ，及び４００μＭ ＺｎＣｌ_２を含めた。陽極緩衝液成分の濃度は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）とした。陰極緩衝液成分の濃度は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ，及び０．１％ＳＤＳとした。ＳＤＳ充填緩衝液（５％ ２−メルカプトエタノール，２％ＳＤＳ，５％ショ糖，及び０．００５％ブロモフェノールブルーを含有する６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）と共に、試料を９５℃で５分間煮沸し、Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法に供した。電気泳動後、ゲルを、Ｚｎ^２＋イオンをキレートするための１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する転写緩衝液で洗浄した。タンパク質を、１５％メタノールを含有する転写緩衝液中、３００ｍＡで２時間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中５％脱脂粉乳で、４℃で２時間ブロッキングし、希釈した一次抗体と反応させた。増強化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、免疫反応性のバンドを、ＨＲＰ結合二次抗体で可視化した。ＩｍａｇｅＪ １．４１を用いて、バンドの強度を測定した。

ドットブロット
ＢＨ及びｒ−αＳｙｎを、ＳＤＳ充填緩衝液（５％ ２−メルカプトエタノール及び２％ＳＤＳを含有する６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）と共に９５℃で１０分間煮沸した。ｂｉｏ−ｂｌｏｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、試料を、穏やかな減圧促進条件下でニトロセルロース膜上にブロットした。ＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄及びＴＢＳＴ中５％脱脂粉乳で２時間ブロッキング後、希釈した一次抗体で膜をプローブした。増強化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、免疫反応性のバンドを、ＨＲＰ結合二次抗体で可視化した。ＩｍａｇｅＪ １．４１を用いて、ドットの強度を測定した。

結果
Ｓｅｒ１２９がリン酸化されたα−シヌクレインはレビー小体型認知症由来の脳中に多量にある。
まず、我々は、ＤＬＢ患者の脳中にＬＢ及びＳｅｒ１２９でリン酸化されたαＳｙｎ（ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎ）が存在することを、それぞれヘマトキシリン・エオジン染色及び免疫組織化学的染色により確認した（図２Ａ）。びまん性新皮質型ＤＬＢ（ＤＮ−ＤＬＢ）患者２名及び大脳辺縁系型ＤＬＢ（Ｌｉ−ＤＬＢ）患者１名由来の剖検で得られた黒質及び前頭葉の皮質の切片において、ＬＢ及びｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎの両方が観察された。ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎは、ＬＢ中に存在するように見えた。皮質中では、ＤＮ−ＤＬＢにおける、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎを含有するＬＢは、Ｌｉ−ＬＤＢにおけるそれよりも明らかに大きかった。対照的に、組織化学的解析により、非ＤＬＢ症例の脳では、病理学的異常が明らかではなかった。Ｔａｎｎｉｃｋａｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）による以前の報告と整合して、黒質中の、メラニン顆粒を含有する細胞は、通常、ＤＮ−ＤＬＢ及びＬｉ−ＤＬＢ患者では恐らく神経変性のため喪失していたが、非ＤＬＢではそうではなかった。

次に、我々は、抗αＳｙｎ抗体Ｄ１１９を用いたウェスタンブロット法により、ＤＬＢ患者由来の脳ホモジネート（ＢＨ）中のαＳｙｎの生化学的特性を検証し、非ＤＬＢ症例由来のそれらの結果と比較した（図２Ｂ）。全患者由来試料イムノブロット解析により、１８ｋＤａにおける天然のαＳｙｎのバンド、３６ｋＤａの二量体型、又は両方が示された。ＤＮ−ＤＬＢの２症例及びＬｉ−ＤＬＢの１症例は、＞２５０ｋＤａの分子量範囲の、顕著に嵩張った多量体型αＳｙｎを含有していた。不溶性多量体はＬｉ−ＤＬＢよりも、ＤＮ−ＤＬＢにおいてより豊富であったが、このことにより、αＳｙｎ多量体形成が、疾患進行に極めて重要であることが示された。このバンドは非ＤＬＢ症例では観察されなかったが、ＧＳＳにおいて、比較的少量の重合体が観察された。すべての症例で、約５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの分子量範囲に、様々な大きさのバンドが示された。これらのバンドは、恐らくオリゴマーのαＳｙｎ及び／又はユビキチン化αＳｙｎに起因し、症例間で大きく異なってはいなかった。ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎに対する抗体は、ＤＮ−ＤＬＢの２症例において、高分子量（＞２５０ｋＤａ）の見かけ上のバンドを検出した（図２Ｃ）。同様の大きさのバンドが、Ｌｉ−ＤＬＢの１症例で観察されたが、免疫反応性の強度はＤＮ−ＤＬＢのよりもずっと弱かった。対照的に、非ＤＬＢ症例では、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎに対する抗体への免疫反応性は示されなかった。これらの観察により、ＤＬＢの脳中、＞２５０ｋＤａの、（多くがＳｅｒ１２９でリン酸化された）αＳｙｎの不溶性多量体の存在が示された。更に、我々はＰｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く定量的ドットブロットイムノアッセイにより、ＤＬＢ症例の脳におけるｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎのレベルを見積もった（図７）。ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１及び＃２におけるｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎのレベルは、それぞれ１３．５±０．４ｍｇ／ｇ脳及び３．７±０．２ｍｇ／ｇ脳であり、Ｌｉ−ＤＬＢにおけるレベルは０．０６±０．０２ｍｇ／ｇ脳であった。ＤＮ−ＤＬＢにおける全αＳｙｎに対するｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎの割合は、Ｌｉ−ＤＬＢにおけるそれよりも高かった：ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１（５７．９％±１．５％）、ＤＮ−ＤＬＢ＃２（２２．６％±１．２％）、及びＬｉ−ＤＬＢ（６．１％±１．７％）。これらの結果により、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎが疾患の進行に関連することが示唆される。以前の研究により、ＬＢＤ脳において、Ｓｅｒ８７でリン酸化されたαＳｙｎのレベルも上昇することが示された（Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかし、Ｓｅｒ８７リン酸化αＳｙｎに対する抗体では３６ｋＤａの二量体バンドが検出され、Ｓｅｒ８７リン酸化型のレベルにおける、症例間での顕著な差はなかった（図２Ｄ）。

ＲＴ−ＱＵＩＣによる、可溶型の組換えヒトα−シヌクレインのアミロイド線維への転換
我々は、次に、ＤＬＢ患者由来のＢＨを反応液に添加した場合に、ＲＴ−ＱＵＩＣにおいてｒ−αＳｙｎ線維形成が誘導され得るかどうかを、ＴｈＴ蛍光レベルをモニタリングすることによって検証した（図３Ａ及び図３Ｂ）。５×１０^−５及び５×１０^−６希釈の、ＤＮ−ＤＬＢの２症例由来ＢＨを添加した場合、早くて２４時間、すべての反応液では９６時間以内にＴｈＴ蛍光陽性が示された。５×１０^−７希釈では、症例＃１の６レプリケートウェルのうちの４、症例＃２の６ウェルのうち３で、アッセイが陽性であった。５×１０^−８希釈では、症例＃１についての６反応のうち２で陽性であったが、症例＃２では蛍光の増大は観察されなかった。５×１０^−９希釈の反応では、症例＃１ですべて陰性であった。Ｌｉ−ＤＬＢ症例については、５×１０^−５希釈での６反応のうち２で陽性反応が示されたが、より薄い希釈では反応が観察されなかった。我々はＬｉ−ＤＬＢについての５×１０^−４希釈の効果も検証したが、蛍光の増大は観察されなかった（データ示さず）。陰性反応は、おそらく、反応においてｒ−αＳｙｎ線維形成を阻害する、ＢＨ中の多様な成分のレベルが高いことに起因すると思われた。対照的に、シード無しの対照及び統合失調症のＢＨの５×１０^−５及び５×１０^−６希釈による反応では、９６時間超でレスポンスがもたらされなかった。最大蛍光強度は、シード無しの対照に比べて、ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１の５×１０^−５及び５×１０^−６希釈、ＤＮ−ＤＬＢ症例＃２の５×１０^−５〜５×１０^−７の範囲の希釈、及びＬｉ−ＤＬＢの５×１０^−５希釈での反応で有意に強かった（図３Ｂ）。遅滞期は、シード無しの対照に比べて、ＤＮ−ＤＬＢの２症例由来の５×１０^−５希釈での反応で有意に短かった（図３Ｂ）。ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１及び＃２のＳＤ_５０／ｇ脳の値は、それぞれ１０^７．８及び１０^７．３であった。我々はＬｉ−ＤＬＢのシーディング用量を正確に算出できなかったが、その値は、５×１０^−４希釈で１００％陽性が示されるとの仮定に基づいて、５．１（ｌｏｇＳＤ^５０／ｇ脳）未満と見積もられた。組換えヒトプリオンタンパク質を基質とする反応又はタンパク質無しの反応においては、ＤＬＢの特異的検出は認められなかった（図８）が、このことにより、ＤＬＢ症例由来ＢＨの、ｒ−Ｓｙｎをシーディングする能力が証明されたが、他のタンパク質をシーディングする能力に関しては証明されなかった。他のタンパク質ミスフォールディング疾患及び変性の疾患の、ＲＴ−ＱＵＩＣに対する影響を更に評価するために、我々はアルツハイマー病（ＡＤ）、孤発性クロイツフェルト−ヤコブ病（ｓＣＪＤ）１型及び２型、並びにＧＳＳの患者由来のＢＨをアッセイに適用した。ＡＤ、ｓＣＪＤ（１型及び２型）並びにＧＳＳにおいては、５×１０^−５及び５×１０^−６希釈の反応すべてで、９６時間以内に陰性のレスポンスがもたらされた（図３Ａ及び３Ｂ）。これらの観察により、ＲＴ−ＱＵＩＣがＤＬＢ症例由来のＢＨの存在下のみで、ｒ−αＳｙｎ線維の形成を誘導すること、及びＤＮ−ＤＬＢのシーディング活性はＬｉ−ＤＬＢのそれよりも高いことが示された。これらの知見により、ｒ−αＳｙｎは、プリオン様の機構によりアミロイド線維に転換され得ることが示唆された。

ｒ−αＳｙｎの線維構造を特性解析するために、試料をネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により検証した。ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１でシーディングしたｒ−αＳｙｎ線維の電子顕微鏡写真により、長く、細く、且つ分岐した線維束が明らかにされたが、シーディング無しの陰性対照反応においては、線維が観察されなかった（図３Ｃ）。フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）により、ＤＬＢと非ＤＬＢの症例との間で、変性構造に帰属する、１６５０ｃｍ^−１における最も顕著なバンドにほぼ差がないことが示された（図３Ｄ）。該結果により、ＤＬＢ ＢＨでシーディングされた反応においては、少量のｒ−αＳｙｎ線維のみが生成したことが示唆される。ＲＴ−ＱＵＩＣの確実性を更に確認するため、我々は、更に４名のＤＮ−ＤＬＢ患者由来のＢＨ試料を解析した（図４Ｂ及び４Ｃ）。ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１及び＃２と同様に、すべての患者由来試料のイムノブロット解析により、＞２５０ｋＤａの不溶性αＳｙｎ多量体が示された。ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎは、多量体の大きさでのみ検出された（図４Ａ）。これらの症例の５×１０^−６及び５×１０^−７希釈を添加した場合、ＲＴ−ＱＵＩＣ反応ですべて陽性が示された。症例＃５及び＃６の５×１０^−８希釈での反応も、すべて陽性であった。症例＃３及び＃４については、５×１０^−８希釈での６反応のうちの５で、陽性レスポンスが示された。５×１０^−９希釈では、症例＃４については６ウェルのうち４で、症例＃５については全ウェルで、症例＃６については６ウェルのうちの４でアッセイが陽性であり、症例＃３のウェルはすべて陰性であった。５×１０^−１０希釈では、症例＃４、＃５及び＃６での反応はすべて陰性であった。最大蛍光強度は、シーディング無しの対照と比較して、症例＃３、＃４及び＃６の５×１０^−５〜５×１０^−８の範囲、及び症例＃５の５×１０^−６〜５×１０^−９の範囲の希釈での反応において有意に強かった（図４Ｃ）。遅滞期は、シーディング無しの対照と比較して、症例＃３及び＃４の５×１０^−６〜５×１０^−８及び症例＃５及び＃６の５×１０^−６〜５×１０^−９の範囲の希釈での反応において、有意に短かった（図４Ｃ）。ＳＤ_５０／ｇ脳の値は、以下の通りであった：１０^８．６（症例＃３）１０^９．３（症例＃４）１０^９．８（症例＃５）及び１０^９．５（症例＃６）。従って、我々は、他のＤＮ−ＤＬＢ患者由来の脳のシーディング活性を検出できた。

α−シヌクレインの不溶性凝集体は、シーディング活性を殆ど又は全く有しない
次に、我々は、Ｓｅｒ１２９でリン酸化されたｒ−αＳｙｎ（ｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎ）を用いて、Ｓｅｒ１２９リン酸化が、プリオン様機構によるαＳｙｎ線維形成に極めて重要なのかどうかを検証した。ＷＴ ｒ−αＳｙｎは、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）及びＡＴＰの両方の存在下でのインキュベーションによってのみＳｅｒ１２９でリン酸化されたが、Ｓ１２９Ａ変異体は同一条件下でリン酸化されなかった（図５Ａ）。ＤＬＢ ＢＨでの場合と同様に、不溶性ｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎは、７２及び２６４時間のインキュベーション後の＞２５０ｋＤａの分子量範囲にのみ観察された。ＡＴＰ非存在下（ＷＴ^ＣＫ２）又は存在下（ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）、ＣＫ２とインキュベーションしたＷＴ ｒ−αＳｙｎとＣＫ２及びＡＴＰとインキュベーションしたＳ１２９Ａ ｒ−αＳｙｎ（Ｓ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）との間でＴｈＴ蛍光レベルの増大に有意差はなかったが（図５Ｂ）、７２時間インキュベーション後、ｐＳｅｒ１２９−ｒ−αＳｙｎの凝集体形成は、非リン酸化ｒ−αＳｙｎのそれよりも効率的に誘導された（図５Ａ）。これらの結果により、Ｓｅｒ１２９リン酸化によってｒ−Ｓｙｎの重合が促進されることが示唆された。以前の報告（Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）と整合して、７２時間インキュベーション後の試料すべてにおいて、全長ｒ−αＳｙｎよりも低分子量の、１３ｋＤａのバンドが観察されたが、このことにより、ｒ−αＳｙｎ凝集体形成はｒ−αＳｙｎの切断及び／又は分解に仲介されることが示された。ＣＫ２及びＡＴＰと２６４時間インキュベーションしたＷＴ（ＷＴ−２６４ｈ）及び変異体ｒ−αＳｙｎ（Ｓ１２９Ａ−２６４ｈ）のＦＴＩＲスペクトルにより、インキュベーション前（ＷＴ−０ｈ及びＳ１２９Ａ−０ｈ）と比較して、わずかに低い波数へのシフトが示されたが、このことにより、βシート含有量の小幅な増加（１６３０〜１６１０ｃｍ^−１）が示された（図５Ｃ）。インキュベーションの前後で、ＷＴと変異体ｒ−αＳｙｎとの間には、赤外線スペクトルに差が殆ど無かった（図５Ｃ）。ＴＥＭ解析により、ＷＴ−２６４ｈ及びＳ１２９Ａ−２６４ｈが、専ら非晶質の凝集体から成ることが示された（図５Ｄ）。我々は、次に、ＲＴ−ＱＵＩＣにおいて、非晶質のｒ−αＳｙｎ凝集体の存在下で、ｒ−αＳｙｎが新たにアミロイド線維に転換され得るかどうかを検証した。意外にも、ＷＴ−２６４ｈ又はＳ１２９Ａ−２６４ｈとの反応はすべて、２×１０^−２及び２×１０^−４希釈で、ＲＴ−ＱＵＩＣアッセイにおいて否定的な結果をもたらした（図５Ｅ）。従って、ｒ−αＳｙｎの不溶性凝集体は、それらがＳｅｒ１２９でリン酸化されていようがいまいがに関係なく、プリオン様のシーディング活性を有しなかった。

α−シヌクレインのオリゴマー様形態は、プリオン様伝播を惹起する
ＷＴ ｒ−αＳｙｎを用いたＲＴ−ＱＵＩＣにより、ＡＴＰ存在下（ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）でのＣＫ２との反応において、その非存在下（ＷＴ^ＣＫ２）においてよりも蛍光強度の迅速な増加及び高いレベルの蛍光強度がもたらされたが、２条件（Ｓ１２９Ａ^ＣＫ２及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）の間でＳ１２９Ａ ｒ−αＳｙｎのＴｈＴ結合動態に差は無かった（図６Ａ）。ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎに対する抗体により、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}にのみ、１６ｋＤａにおける支配的なバンド及び＞２５０ｋＤａの分子量範囲における薄いバンドが検出された（図６Ｂ）。これらの結果により、Ｓｅｒ１２９リン酸化によって、ＲＴ−ＱＵＩＣＫにおいてｒ−αＳｙｎの線維形成が促進されることが示唆される。震盪なしで生成された不溶性凝集体とは異なり、図５Ａに示す通り、反応のすべてで、１６ｋＤａにおいて単量体αＳｙｎの支配的なバンドが示された。更に、２５０ｋＤａ超の重合体は、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}及びＷＴ^ＣＫ２に辛うじて検出された。ｒ−αＳｙｎの凝集サイズにおける、図５Ａとの差は、恐らく、線維の断片化を惹起し得る震盪に起因すると思われる。ＦＴＩＲ解析により、すべての反応間で、変性構造に帰属する１６５０ｃｍ^−１における支配的なバンドには殆ど差が無いことが示された（図６Ｃ）。ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}のＴＥＭ解析により、ｒ−αＳｙｎのオリゴマー様の顆粒状形態が明らかとなった（図６Ｄ）。これらのオリゴマー様分子種がシーディング活性を示すかどうかを検証するために、我々はＲＴ−ＱＵＩＣ試料の２代目継代を行った（図６Ｅ及び６Ｆ）。２×１０^−４及び２×１０^−５希釈のＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}、ＷＴ^ＣＫ２、及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}により、すべての反応で１００％陽性が示された。２×１０^−６希釈では、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}については６ウェルのうち５で、ＷＴ^ＣＫ２については６ウェルのうち２で、Ｓ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}については６ウェルのうち５で、アッセイが陽性であった。２×１０^−７希釈では、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}及びＷＴ^ＣＫ２での反応ですべて陰性であったが、この濃度で、Ｓ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}での６反応のうちの３で陽性であった。５×１０^−８希釈では、これらの３試料でのすべてのウェルで陰性の結果が示された。リン酸化オリゴマー様分子種により１０^４．９／μｇ ｒ−αＳｙｎ（ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）のＳＤ_５０値がもたらされ、非リン酸化オリゴマー様分子種により、１０^４．４／μｇ ｒ−αＳｙｎ（ＷＴ^ＣＫ２）及び１０^５．４／μｇ ｒ−αＳｙｎ（Ｓ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}）のＳＤ_５０値が示された。対照的に、我々は、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}と同一成分を含有し、アッセイ直前に震盪せずに調製したモック試料（ＷＴ−ｍｏｃｋ）の２×１０^−４〜２×１０^−８の範囲の希釈での、あらゆる反応で蛍光の増加を観察しなかった。最大蛍光強度は、２×１０^−５希釈でのＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}及びＷＴ^ＣＫ２との反応及び２×１０^−４〜２×１０^−６の範囲の希釈のＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}との反応で、ＷＴ−ｍｏｃｋと比較して有意に強かった（図６Ｆ）。遅滞期は、２×１０^−４〜２×１０^−６の範囲の希釈のＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}及びＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}との反応並びに２×１０^−４及び２×１０^−５の範囲の希釈のＷＴ^ＣＫ２との反応で、ＷＴ−ｍｏｃｋと比較して有意に短かった（図６Ｆ）。我々の結果により、ｒ−αＳｙｎのオリゴマー様分子種により、Ｓｅｒ１２９でのリン酸化有り又は無しで、シーディング活性が表されることが示された。

更に、２×１０^−４及び２×１０^−５希釈でのＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}との反応の最大蛍光強度は、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}のそれよりも有意に強かった（図６Ｆ）。その上、２×１０^−５希釈のＳ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}との反応の遅滞期は、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}のそれよりも有意に短かった（図６Ｆ）。従って、Ｓ１２９Ａ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}を含有するＲＴ−ＱＵＩＣ反応液は、ＷＴ^{ＣＫ２＋ＡＴＰ}又はＷＴ^ＣＫ２を含有するものよりも高いシーディング能を有することが示された。これらの差についての正確な理由はまだ知られていないが、ＷＴ ｒ−αＳｙｎとＳ１２９Ａ ｒ−αＳｙｎとの間の構造の微妙な差が関連する可能性が高い。

考察
本研究の結果により、ｒ−αＳｙｎ線維の形成が、ＤＬＢ患者由来のＢＨの存在下でのみ、可溶性ｒ−αＳｙｎを用いたＲＴ−ＱＵＩＣにより誘導されることが初めて証明された（図３Ａ及び３Ｂ）。ＤＬＢ症例においてのみ検出される、２５０ｋＤａよりも大きな、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）不溶性凝集体は、Ｓｅｒ１２９で特異的にリン酸化されており（図２Ｃ）、従って我々は、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎの不溶性凝集体が、プリオン様のシーディング活性を付与すると仮定した。しかし、意外にも、βシート構造の増加を伴ったｒ−αＳｙｎの不溶性凝集体は、リン酸化状態及び非リン酸化状態で共にシーディング活性を殆ど有しなかった（図５Ｅ）。その代わりに、ｒ−αＳｙｎの前線維オリゴマーが、リン酸化有り又は無しで、共に、シーディング活性を発揮した（図６Ｅ及び６Ｆ）。我々の知見により、可溶性オリゴマーであるが、完全に線維性でないαＳｙｎが、ｉｎ ｖｉｔｒｏのシーディング分子種であることが示唆される。以前の研究により、ｒ−αＳｙｎのオリゴマー分子種が、初代ニューロン又はニューロン細胞株によって内在化され、内生αＳｙｎの凝集を誘導することが示されている（Ｄａｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｄａｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。更に、オリゴマー形態のαＳｙｎがニューロン細胞死及び神経変性の原因であることを示唆する証拠が相当にある（Ｂｒｏｗｎ，２０１０；Ｖｅｋｒｅｌｌｉｓ．，２０１１）。死後研究においては、ＤＬＢ患者の脳における可溶性αＳｙｎオリゴマーのレベルが、ＡＤ患者及び対照よりも有意に高かった一方、該３群間において、全αＳｙｎレベルに有意差は無かった（Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。これらの報告により、成熟線維又は非晶質凝集体よりも、むしろ前線維αＳｙｎオリゴマーが、ＬＢＤにおける、プリオン用挙動を伴う病原性分子種に相当するという示唆が支持される。単量体アミロイドβ（Ａβ）を用いた同様のアプローチにより、タンパク質ミスフォールディング環状増幅（ＰＭＣＡ）アッセイによって、ＡＤ患者由来のＣＳＦ中に存在するＡβオリゴマーに関連するシーディング活性が検出され得ることが示された（Ｓａｌｖａｄｏｒｅｓ ａｔ ａｌ．，２０１４）。ＤＮ−ＤＬＢ由来脳組織は、症例＃１及び＃２において、それぞれ、１０^３．４／μｇ全αＳｙｎ及び１０^３．１／μｇ全αＳｙｎのＳＤ_５０値を有しており、Ｌｉ−ＬＤＢにおいては１０^２．１／μｇ全αＳｙｎであった（図３Ａ及び３Ｂ）。その一方、ＲＴ−ＱＵＩＣによって生成されたＷＴ ｒ−αＳｙｎオリゴマーの値は１０^４．４μｇ／ｒ−αＳｙｎ〜１０^４．９μｇ／ｒ−αＳｙｎであった（図６Ｅ及び６Ｆ）。ＲＴ−ＱＵＩＣ反応において、全てのｒ−αＳｙｎがオリゴマー形態で存在するかどうかは明らかではないが、もしそうなら、ＤＮ−ＤＬＢ症例＃１及び＃２の脳において、それぞれ全αＳｙｎの３．２％〜１０％及び１．６％〜５．０％が、Ｌｉ−ＬＤＢの脳では０．２％〜０．５％がオリゴマーと見積もられる。不溶性ＬＢ凝集体の正確な役割は不明なままであるが、細胞保護的及び神経保護的な役割が、細胞株（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００４）及びショウジョウバエ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｅａｎｙ， ２００５）を用いた研究で報告されている。Ｓ１２９Ａオリゴマーのシーディング活性は、リン酸化状態に関係なく、ＷＴオリゴマーのそれよりも高く（図６Ｆ）、ウェスタンブロット解析において、ＷＴオリゴマーを含有する反応液中に少量の不溶性凝集体が検出されたが、Ｓ１２９Ａオリゴマーを含有する反応液中ではそうではなかった（図６Ｂ）。これらの結果により、不溶性凝集体によってαＳｙｎのプリオン様伝播からの防御がもたらされることが示唆される。Ｓｅｒ１２９リン酸化型と非リン酸化型との間でｒ−αＳｙｎオリゴマーのシーディング活性に顕著な差はなかったが、我々はｒ−αＳｙｎのリン酸化により、自己凝集が促進されることを見出した（図５Ａ及び６Ａ）。このことは、以前の報告（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２）と整合する。以前の研究により、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎレベルの上昇は、ＬＢＤ患者の脳におけるＬＢの出現に先行すること（Ｌｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、及びＬＢＤの病理で観察される酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全（Ｐｅｒｆｅｉｔｏ ａｔ ａｌ．，２０１４）、及びプロテアソーム阻害（Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）によって誘導されることが示された。更に、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎは、神経機能不全に対する防御効果を有することが報告されている（Ｇｏｒｂａｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｋｕｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。これらの結果により、ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎは、神経機能不全に対する防御機構に起因することが示唆される。ｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎは、その後前線維オリゴマー及び成熟線維への自己凝集の開始を促進すると思われる。

ＲＴ−ＱＵＩＣにより、ＤＬＢの、ＡＤ病及びプリオン病等の他の変性疾患並びに非変性症例からの鑑別が可能となったが、このことにより、ｒ−αＳｙｎは、他のミスフォールドタンパク質、即ち、アミロイドβ、タウ及びＰｒＰ^Ｓｃの、異種交差シーディングを誘導する能力による影響をほぼ受けないことが示唆される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、αＳｙｎと他のミスフォールドタンパク質との間の交差シーディング相互作用の報告（Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）があるが、ＲＴ−ＱＵＩＣ反応に対する影響は殆ど無いように思える。ＤＬＢの、他の変性疾患からの鑑別で、ＲＴ−ＱＵＩＣを用いた特異的検出を、鑑別的な診断に応用する可能性が生じる。ＤＮ−ＤＬＢ患者由来の脳は、ＳＤ_５０値が１０^７〜１０／ｇ脳であり、Ｌｉ−ＤＬＢ患者由来の脳はＳＤ_５０値がおおよそ１０^５．１／ｇ脳であると見積もられた。従って、ＲＴ−ＱＵＩＣは、ウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡを用いたｐＳｅｒ１２９−αＳｙｎについての試験と比較して、ＤＬＢに対して検出感度が高く、より正確な脳の生検又は剖検の診断がもたらされることが示唆された。ＥＬＩＳＡ又はビーズベースのフローサイトメトリーアッセイを用いたいくつかの研究により、ＤＬＢ及び他のシヌクレイノパチーの患者のＣＳＦ及び血液中の全αＳｙｎレベルが調査されたが、結果は結論が出ないもので、且つ矛盾している（Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。その一方、ＤＬＢ及びＰＤのＣＳＦ及び血液では、可溶性αＳｙｎオリゴマーレベルが、ＡＤ及び対照のそれらと比較して上昇することが、ＥＬＩＳＡで示された（Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。これらの報告により、オリゴマー型のαＳｙｎが、ＬＢＤ診断のための重要かつ有望な標的であるという示唆が支持され、ＬＢＤ患者のＣＳＦ及び血液由来オリゴマーのシーディングによるＲＴ−ＱＵＩＣの、診断の潜在力が示唆される。従って、αＳｙｎオリゴマーに特異的な既存のＥＬＩＳＡと共にＲＴ−ＱＵＩＣを用いることが、ＬＢＤの鑑別診断に特に有利だと考えられる。ＲＴ−ＱＵＩＣが、種々のタイプのＬＢＤ間の鑑別に役立つかどうか、及びこのアッセイが体液又は他の組織と共に用い得るかどうかを決定するためには、更なる研究が必要である。

本研究において、我々は、αＳｙｎのシーディング分子種の候補を、実験室で検出するために、ＲＴ−ＱＵＩＣを用いることの実行可能性を証明した。我々のデータにより、オリゴマー型のαＳｙｎが、プリオン様伝播を惹起し、ＬＢＤの発症に重要な役割を果たす病原性分子種であるという示唆に、更なる支持がもたらされる。我々は、この新たな方法が、臨床診断、薬剤候補のスクリーニング、及び我々の、ＬＢＤにおけるプリオン様タンパク質としてのαＳｙｎの役割の理解の進展のための、確固たるツールになると考えている。

追加実験
脳脊髄液サンプルによるα−シヌクレイノパチーと他の認知症等との鑑別
剖検により、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び弧発性クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）であることが確認されている患者の脳脊髄液サンプルを採取し、それぞれに対してα−シヌクレイノパチーのためのＲＴ−ＱＵＩＣを行った（図１２）。尚、反応混合液には、３００ｍＭ ＮａＣｌを含めた。ＤＬＢについて５例（症例＃１〜５）、ＣＪＤについて１例（症例ＣＪＤ＃１）の結果を、図１２に示す。剖検例(確実例)におけるＤＬＢ患者のサンプルのみで特異的にシグナルを検出した。ＣＪＤ患者のサンプル及びシード無しのコントロール（ＰＢＳ）では、シグナルを検出しなかった。

鑑別診断補助検査（プリオン病ｖｓ ＤＬＢ）
プリオン病（ＣＪＤ）とＤＬＢの診断が難しい症例において、採取した髄液に対する、ＲＴ−ＱＵＩＣ検査を行ったところ、シヌクレイン／ＱＵＩＣ法で陽性を示した（図１３；シード無しのコントロール（ＰＢＳ）では、シグナルを検出せず、ＣＪＤのためのＲＴ−ＱＵＩＣ検査（非特許文献１８）では陰性であった）。本実験においては、反応混合液にＮａＣｌは含めなかった。その後の検査で、ＭＩＢＧ心筋シンチと脳血流シンチの結果からＤＬＢと診断され、ＲＴ−ＱＵＩＣ法の結果と一致した。

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Ｄａｎｚｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｒｅｂｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｗｏｌｆｆ，Ｍ．，Ｂｉｒｋ，Ｇ．，ａｎｄ Ｈｅｎｇｅｒｅｒ，Ｂ．（２００９）．Ｓｅｅｄｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１１，１９２−２０３．
Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ａ．，Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｈｅｎ，Ｊ．，Ｔａｋｉｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．（２００２）．ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ４，１６０−１６４．
Ｇｏｒｂａｔｙｕｋ．Ｏ．Ｓ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｋｏｎｄｒｉｋｏｖａ，Ｇ．，Ｍａｎｆｒｅｄｓｓｏｎ，Ｆ．Ｐ．，Ｍａｎｄｅｌ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（２００８）．Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ Ｓｅｒ−１２９ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，７６３−７６８．
Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｏ．，Ｈａｌｌ，Ｓ．，Ｏｈｒｆｅｌｔ，Ａ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｈｏｎ，Ｌ．，Ｎａｇｇａ，Ｋ．，Ｌｏｎｄｏｓ，Ｅ．，Ｖａｒｇｈｅｓｅ，Ｓ．，Ｍａｊｂｏｕｒ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ ６，２５．
Ｋａｓｕｇａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．（２０１２）．ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ａｓ ＣＳＦ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１２，４３７０２５．
Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｕ，Ｙ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｔ．Ｂ．，ａｎｄ Ｏｌａｎｏｗ， Ｃ．Ｗ．（２００８）．Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４，５０４−５０６．
Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｔ．，Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｒ．，Ｉｔｏ，Ｇ．，Ｍｉｔａｎｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．（２０１２）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔ Ｓｅｒ−１２９ ｒｅｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｉｔｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７，７０９８−７１０９．
Ｌｉ，Ｊ．Ｙ．，Ｅｎｇｌｕｎｄ，Ｅ．，Ｈｏｌｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｏｕｌｅｔ，Ｄ．，Ｈａｇｅｌｌ，Ｐ．，Ｌｅｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｌａｓｈｌｅｙ，Ｔ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｎ．Ｐ．，Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｇｒａｆｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｇｇｅｓｔ ｈｏｓｔ−ｔｏ−ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４，５０１−５０３．
Ｌｕｅ，Ｌ．Ｆ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｇ．，Ａｄｌｅｒ，Ｃ．Ｈ．，Ｓｈｉｌｌ，Ｈ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｓｕｅ，Ｌ．Ｉ．，Ｃａｖｉｎｅｓｓ， Ｊ．，Ｓａｂｂａｇｈ，Ｍ．Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅａｃｈ，Ｔ．Ｇ．（２０１２）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｅｗｙ−ｔｙｐｅ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｂｒａｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２２，７４５−７５６．
Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｋｅｈｍ，Ｖ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１２ａ）．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−ｌｉｋｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３８，９４９−９５３．
Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｋｅｈｍ，Ｖ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１２ｂ）．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ａ ｒａｐｉｄｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０９，９７５−９８６．
Ｍａｓｕｄａ−Ｓｕｚｕｋａｋｅ，Ｍ．，Ｎｏｎａｋａ，Ｔ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．，Ｏｉｋａｗａ，Ｔ．，Ａｒａｉ，Ｔ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．（２０１３）．Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ ｂｒａｉｎ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３６，１１２８−１１３８．
ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｎ．Ｒ．，Ｆａｎ，Ｚ．，Ｘｕ，Ｋ．，Ｓｃｈｗａｒｚｓｃｈｉｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｆｅａｎｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｈｙｍａｎ，Ｂ．Ｔ．，ａｎｄ ＭｃＬｅａｎ，Ｐ．Ｊ．（２００９）．Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ Ｓ１２９ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｏ ｎｏｔ ａｌｔｅｒ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６８，５１５−５２４．
Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｒ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｏｔｏ，Ｃ．（２０１３）．Ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ９，ｅ１００３５３７．
Ｍｏｕｇｅｎｏｔ，Ａ．Ｌ．，Ｎｉｃｏｔ，Ｓ．，Ｂｅｎｃｓｉｋ，Ａ．，Ｍｏｒｉｇｎａｔ，Ｅ．，Ｖｅｒｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ｌａｋｈｄａｒ，Ｌ．，Ｌｅｇａｓｔｅｌｏｉｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂａｒｏｎ，Ｔ．（２０１２）．Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ３３，２２２５−２２２８．
Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ，Ｋ．Ｅ．，Ｋｒａｇｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｓａｌｅｍ，Ｓ．Ａ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｉ，Ｒ．，Ａｌｌｓｏｐ，Ｄ．，Ｈａｓｓａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｈ．，ａｎｄ Ｅｌ−Ａｇｎａｆ，Ｏ．Ｍ．（２００９）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｎ ｐｏｓｔ−ｍｏｒｔｅｍ ｂｒａｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３２，１０９３−１１０１．
Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ，Ｋ．Ｅ．，Ｏｕｅｓｌａｔｉ，Ａ．，Ｓｈａｋｋｅｄ，Ｇ．，Ｒｏｓｐｉｇｌｉｏｓｉ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｙ．，Ｌａｍｂｅｒｔｏ，Ｇ．Ｒ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．ｏ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ａ．，Ｃｈｅｇｉｎｉ，Ｆ．，Ｇａｉ，Ｗ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｔ Ｓ８７ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ， ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３０，３１８４−３１９８．
Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ，Ｋ．Ｅ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ａ．Ｗ．，Ｒｏｓｐｉｇｌｉｏｓｉ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｙ．，Ｌａｍｂｅｒｔｏ，ＧＲ．，Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．Ｏ．，Ｅｌｉｅｚｅｒ，Ｄ．，Ｚｗｅｃｋｓｔｅｔｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｔ Ｓｅｒ−１２９ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｉｃｓ Ｓ１２９Ｅ／Ｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８３，１６８９５−１６９０５．
Ｐｅｒｆｅｉｔｏ，Ｒ．，Ｌａｚａｒｏ，Ｄ．Ｆ．，Ｏｕｔｅｉｒｏ，Ｔ．Ｆ．，ａｎｄ Ｒｅｇｏ，Ａ．Ｃ．（２０１４）．Ｌｉｎｋｉｎｇ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６２，５１−５９．
Ｓａｌｖａｄｏｒｅｓ，Ｎ．，Ｓｈａｈｎａｗａｚ，Ｍ．，Ｓｃａｒｐｉｎｉ，Ｅ．，Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｏｔｏ，Ｃ．（２０１４）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ Ａｂｅｔａ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ７，２６１−２６８．
Ｓａｎｏ，Ｋ．，Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｒ．，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｄ．，Ｎａｋａｇａｋｉ，Ｔ．，Ｓａｔｏｈ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｎ．（２０１４）．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｉｂｒｉｌｓ ｉｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｋｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８，１１７９１−１１８０１．
Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｗ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｔｒｏｎｃｏｓｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｖ．Ｌ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｃ．Ａ．（２００５）．Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５，５５４４−５５５２．
Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｇ．，Ｊｕｎｎ，Ｅ．，Ｉｗａｔｓｕｂｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｍｏｕｒａｄｉａｎ，Ｍ．Ｍ．（２００４）．Ａｇｇｒｅｓｏｍｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ａｎｄ ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ−１ ａｒｅ ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７９，４６２５−４６３１．
Ｔｈａｎｎｉｃｋａｌ，Ｔ．Ｃ．，Ｌａｉ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｍ．（２００７）．Ｈｙｐｏｃｒｅｔｉｎ（ｏｒｅｘｉｎ）ｃｅｌｌ ｌｏｓｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３０，１５８６−１５９５．
Ｔｏｋｕｄａ，Ｔ．，Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｍ．Ｍ．，Ａｒｄａｈ，Ｍ．Ｔ．，Ｖａｒｇｈｅｓｅ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｂ，Ｓ．Ａ．，Ｋａｓａｉ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｇａｍｉ，Ｎ．，Ｔａｍａｏｋａ，Ａ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｅｌ−Ａｇｎａｆ，Ｏ．Ｍ．（２０１０）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｎ ＣＳＦ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７５，１７６６−１７７２．
Ｖｅｋｒｅｌｌｉｓ，Ｋ．，Ｘｉｌｏｕｒｉ，Ｍ．，Ｅｍｍａｎｏｕｉｌｉｄｏｕ，Ｅ．，Ｒｉｄｅｏｕｔ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｔｅｆａｎｉｓ，Ｌ．（２０１１）．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １０，１０１５−１０２５．
Ｖｌａｄ，Ｃ．，Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｋ．，Ｋａｒｒｅｍａｎ，Ｃ．，Ｓｃｈｉｌｄｋｎｅｃｈｔ，Ｓ．，Ｌｅｉｓｔ，Ｍ．，Ｔｏｍｃｚｙｋ，Ｎ．，Ｒｏｎｔｒｅｅ，Ｊ．，Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｊ．，Ｄａｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｃｉｏｓｓｅｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ／ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ：ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １２，２７４０−２７４４．
Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ，Ｌ．Ａ．，Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｐａｔｅｌ，Ｔ．Ｐ．，Ｔａｎｉｋ，Ｓ．Ａ．，Ｒｉｄｄｌｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｔｅｉｂｅｒ，Ａ．，Ｍｅａｎｅｙ，Ｄ．Ｆ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１１）．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｆｉｂｒｉｌｓ ｉｎｄｕｃｅ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅａｔｈ．Ｎｅｕｒｏｎ ７２，５７−７１．
Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．，Ｏｅｈｌｅｒ，Ａ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｌ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｄ．Ｔ．，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｍ．，ＤｅＡｒｍｏｎｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．（２０１３）．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ ｐｒｉｏｎｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，１９５５５−１９５６０．
Ｗｉｌｈａｍ，Ｊ．Ｍ．Ｏｒｒｕ，Ｃ．Ｄ．，Ｂｅｓｓｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｒ．，Ｓａｎｏ，Ｋ．，Ｒａｃｅ，Ｂ．，Ｍｅａｄｅ−Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｔａｕｂｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｔｉｍｍｅｓ，Ａ．，ａｎｄ Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｂ．（２０１０）．Ｒａｐｉｄ ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｏｎ ｓｅｅｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ ｔｏ ｂｉｏａｓｓａｙｓ．ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６，ｅ１００１２１７．

本発明によれば、被験体がα−シヌクレイノパチーに罹患しているか否かの診断を補助することができる。当該方法は、α−シヌクレイノパチーと他の認知症等との明確な鑑別を補助できる強力な方法となり得る。当該方法により、早期に鑑別することにより、α−シヌクレイノパチーの進行を抑制するための適切な治療法の選択が可能となる。

Claims (21)

1. （１）緩衝液中で、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合し、反応混合液を得る工程；
   （２）反応混合液をインキュベーションして、生体試料中の異常α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
   （３）形成されたα−シヌクレインの凝集体を検出する工程、
   を含む、生体試料中の異常α−シヌクレインを検出する方法。
2. （１）緩衝液中で、生体試料と正常α−シヌクレインとを混合し、反応混合液を得る工程；
   （２）反応混合液をインキュベーションして、生体試料中の異常α−シヌクレインをシードとしたα−シヌクレインの凝集体を形成する工程；及び
   （３）形成されたα−シヌクレインの凝集体を検出する工程、
   を含む、α−シヌクレイノパチーの診断を補助する方法。
3. 正常α−シヌクレインが組換えα−シヌクレイン、又は精製α−シヌクレインである、請求項１又は２記載の方法。
4. 生体試料が脳組織サンプルである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 生体試料が血液、血漿、血清、白血球又は脳脊髄液サンプルである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
6. 反応混合液中の正常α−シヌクレインの濃度が、１２０μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 緩衝液がｐＨ７．２〜７．８の緩衝液である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 工程（２）において、反応混合液を震盪することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. α−シヌクレインの凝集体の形成が、震盪期間及び無震盪期間のサイクルで行われる、請求項９記載の方法。
11. サイクルが、全体で３分間である、請求項１０記載の方法。
12. α−シヌクレインの凝集体が、抗体を用いて検出される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 抗体が抗α−シヌクレインポリクローナル抗体、抗α−シヌクレインモノクローナル抗体若しくは抗Ｓｅｒ１２９リン酸化α−シヌクレインモノクローナル抗体である、請求項１２記載の方法。
14. （３）の工程が、形成されたα−シヌクレインの凝集体を定量することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. （３）の工程が、ウェスタンブロット法を含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. （３）の工程が、蛍光分光法を含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. α−シヌクレインの凝集体を検出する段階がチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の使用を含む、請求項１６記載の方法。
18. 検出が、１０分毎に行われる、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. α−シヌクレイノパチーと、他の認知障害を伴う疾患との鑑別を補助するための方法である、請求項２〜１８のいずれか１項記載の方法。
20. α−シヌクレイノパチーが、レビー小体病、又は多系統萎縮症である、請求項２〜１９のいずれか１項記載の方法。
21. レビー小体病が、レビー小体型認知症、パーキンソン病、若しくはびまん性新皮質型レビー小体型認知症である、請求項２０記載の方法。