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JP2018087190A - Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）結合タンパク質 - Google Patents

Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）結合タンパク質 Download PDF

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ジェーン クレッグ，ステファニー
クレイゲン，ジェニファー，エル．
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アンドリュー ハンブリン，ポール
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アンドリュー ハンブリン，ポール
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シャー パーマー，ラーダ
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Abstract

【課題】炎症性障害、多発性骨髄腫又は慢性リンパ球性白血病などのB細胞リンパ腫の治療用抗原結合タンパク質の提供。【解決手段】Ｂ細胞成熟抗原(ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９又はＴＮＦＲＳＦ１７)、特にヒトＢＣＭＡ(ｈＢＣＭＡ)に特異的に結合する抗体であって、ＢＣＭＡに対するＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの結合を阻害し、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合できエフェクター機能を有する抗原結合タンパク質及びその断片、及びアウリスタチン又はドロスタチン等の細胞傷害剤とリンカーを介して結合した免疫コンジュゲートの提供。【選択図】図１

Description

本発明は、B細胞成熟抗原(BCMA)、特にヒトBCMA(hBCMA)に特異的に結合する抗原結合タンパク質及びその断片に関する。
本発明はまた、前記抗原結合断片を用いて疾患又は障害を治療する方法、前記抗原結合断片を含む医薬組成物及び製造方法にも関する。本発明の他の実施形態は以下の詳細から明らかになるであろう。
BCMA(CD269又はTNFRSF17)はTNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。それはリガンドBAFF及びAPRILについての非グリコシル化内在性膜受容体である。BCMAのリガンドはまた、APRIL及びBAFF、並びに制限されるがBAFFに対する高親和性を示すBAFF-R(BAFF受容体又はBR3)に結合する、更なる受容体:TACI(膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンド相互作用物質)にも結合できる。まとめると、これらの受容体及びこれらの対応するリガンドは、体液性免疫、B細胞発生及び恒常性の様々な側面を調節する。
BCMAの発現は典型的にB細胞系統に制限され、B細胞の最終分化において応答して増大することが報告されている。BCMAは、ヒト血漿芽球、扁桃腺、脾臓及び骨髄由来の形質細胞により発現されるが、TACI-BAFFR低表現型を有する、扁桃メモリB細胞及び胚中心B細胞によっても発現される(Darce et al, 2007)。BCMAは、未感作細胞及びメモリB細胞上にはほとんど存在しない(Novak et al, 2004a及びb)。BCMA抗原は細胞表面上に発現されるので、抗体に接近できるが、ゴルジ体においても発現される。その発現プロファイルにより示唆されているように、BCMAシグナル伝達は、典型的にはB細胞生存及び増殖と関連しており、B細胞分化の後期において重要であるが、長寿命の骨髄形質細胞(O'Connor et al, 2004)及び形質芽球(Avery et al, 2003)の生存にも重要である。更に、BCMAは高親和性でAPRILに結合するので、BCMA-APRILシグナル伝達軸は、B細胞分化の後期において優性であり、恐らく生理的に最も重要な相互作用であることが示唆されている。
多発性骨髄腫(MM)は、血液循環に拡散する前に、デノボ、又は意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)からの増悪としてのいずれかで骨髄内の多部位において発生するクローン性B細胞悪性腫瘍である。それは一般にパラプロテイン及び破骨細胞活性の増加、並びに高カルシウム血症、血球減少症、腎機能障害、過粘稠及び末梢神経障害により特徴付けられる。正常抗体レベル及び好中球の数の両方の減少もまた一般的であり、生命を脅かす感染感受性を引き起こす。BCMAはインビトロでの骨髄腫細胞株の増殖及び生存に関与している(Novak et al, 2004a及びb、Moreaux et al, 2004)。
BCMA発現(転写産物及びタンパク質の両方)はMMにおける疾患進行と相関することが報告されている。Affymetrixマイクロアレイを使用して、TACI及びBCMA遺伝子がそれらの正常な対と比較して多発性骨髄腫細胞(MMC)において過剰発現したことが実証された(Moreaux et al, 2004)。ヒト骨髄腫細胞と、MGUSを有する患者由来及び正常な骨髄由来の精製した形質細胞並びにB細胞系統白血病由来の原発腫瘍細胞とを比較するために遺伝子発現分析が使用されている(Bellucci et al, 2005)。BCMA遺伝子は全ての骨髄腫試料中に高度に発現した。MGUSを有する患者由来の精製した形質細胞はBCMAをより低く発現するが、正常形質細胞又は骨髄腫細胞において見出された発現と比較した場合、顕著な相違は存在しなかった。対照的に、BCMA発現は、B細胞慢性リンパ球性白血病(CLL)、プレB急性リンパ球性白血病(ALL)及びT細胞ALL(T-ALL)において顕著に低下した。遺伝子導入によりBAFF又はAPRILを過剰発現するマウスモデルはB細胞リンパ腫瘍を顕著に増加させた(Batten et al, 2004-BAFF、Planelles et al, 2004-APRIL)。ヒトにおいて、過剰BAFF及びAPRILは複数のB細胞悪性腫瘍、並びに他のB細胞傷害を罹患している患者の血清及び微小環境中で検出されている。
本明細書内に開示されている全ての特許及び参考文献は参照により明確に、及び全体的に本明細書に組み込まれている。
本発明は膜結合標的物に結合する抗原結合タンパク質であって、内在化できる抗原結合タンパク質を提供する。更なる実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む免疫コンジュゲートを提供する。更なる実施形態において、抗原結合タンパク質はADCCエフェクター機能を有する。例えば抗原結合タンパク質は増強されたADCCエフェクター機能を有する。
本発明は、BCMAに特異的に結合する抗原結合タンパク質、例えばBCMAに特異的に結合し、BCMA受容体に対するBAFF及び/又はAPRILの結合を阻害する抗体を提供する。本発明はまた、BCMAに特異的に結合し、BCMAに対するBAFF及び/又はAPRILの結合を阻害する抗原結合タンパク質であって、FcγRIIIAに結合できるか、又はFcγRIIIA媒介性エフェクター機能であり得る、抗原結合タンパク質を提供する。
本発明の抗原結合タンパク質はBCMAに特異的に結合し、BCMAに対するBAFF及び/又はAPRILの結合を阻害し、該抗原結合タンパク質はFcγRIIIAに対する増強された結合を有するか、又は増強されたFcγRIIIA媒介性エフェクター機能を有する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は内在化できる。
本発明の一態様において、膜に結合しないBCMA、例えば血清BCMAに結合する抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む免疫コンジュゲートが提供される。
更なる実施形態において、抗原結合タンパク質はアウリスタチンなどの毒素にコンジュゲートされる。
なお更なる実施形態において、薬物コンジュゲートはvcMMAE又はmcMMAFである。一実施形態において、免疫コンジュゲートはまた、増強されたADCCである。
抗原結合タンパク質はマウスモノクローナル抗体CA8に関連してもよいか、又はマウスモノクローナル抗体CA8由来であってもよい。CA8マウス重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号7として提供され、CA8マウス軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号9として提供される。
抗原結合タンパク質はマウスモノクローナル抗体S336105A07に関連してもよいか、又はマウスモノクローナル抗体S336105A07由来であってもよい。S336105A07マウス重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号140として提供され、S336105A07マウス軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号144として提供される。
他のマウスモノクローナル抗体(そのマウスモノクローナル抗体から本発明の抗原結合タンパク質も誘導できる)は表Cに含まれる。
抗原結合タンパク質の重鎖可変領域(VH)は、以下のCDR又はそれらのCDRのバリアント(Kabatにより定義される(Kabat et al, Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987))を含んでもよい:
CDRH1は配列番号1又は配列番号182として提供される；
CDRH2は配列番号2又は配列番号183として提供される；
CDRH3は配列番号3又は配列番号184として提供される。
抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域(VL)は、以下のCDR又はそれらのCDRのバリアント(Kabatにより定義される(Kabat et al, Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987))を含んでもよい:
CDRL1は配列番号4又は配列番号185として提供される；
CDRL2は配列番号5又は配列番号186として提供される；
CDRL3は配列番号6又は配列番号187として提供される。
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、及び本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの重鎖をコードするポリヌクレオチド配列、及び本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
このようなポリヌクレオチドは同等のポリペプチド配列に対応するコード配列を表すが、このようなポリヌクレオチド配列は、開始コドン、適切なシグナル配列及び終止コドンと共に発現ベクター内でクローニングされ得ることは理解されるであろう。
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの重鎖及び/又は軽鎖をコードする1種以上のポリヌクレオチドを含む組換え体で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
本発明は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかを産生するための方法であって、該方法は、適切な培地(例えば無血清培地)中で第1及び第2のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含み、前記第1のベクターは、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第2のベクターは本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、方法を更に提供する。
本発明は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を更に提供する。
更なる態様において、本発明は、BCMAと、そのリガンド、BAFF又はAPRILとの間の相互作用の調節などのBCMAの阻害又は遮断に反応する疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、本明細書に記載されるその抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法を提供する。
従って、本発明の目的は、抗体媒介性若しくは形質細胞媒介性疾患又は例えば多発性骨髄腫(MM)などの形質細胞悪性腫瘍などのB細胞関連障害又は疾患の治療に対する治療的なアプローチを提供することである。特に、本発明の目的は、抗原結合タンパク質、特にBCMA(例えばhBCMA)に特異的に結合し、BCMAと、BAFF及び/又はAPRILなどのそのリガンドとの間の相互作用を調節(すなわち阻害又は遮断)する抗体を、その相互作用の調節に反応する疾患及び障害の治療において提供することである。
本発明の別の態様において、抗体媒介性若しくは形質細胞媒介性疾患などのB細胞関連障害若しくは疾患又は例えば多発性骨髄腫(MM)などの形質細胞悪性腫瘍を患っているヒト患者を治療する方法であって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法が提供される。
本発明の別の態様において、慢性関節リウマチ、乾癬、1型糖尿病又は多発性硬化症を患っているヒト患者を治療する方法であって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法が提供される。
FMAT結合アッセイ-ヒト及びcyno BCMAを発現するHEK293細胞に対するCA8抗体結合についてのFMATアッセイの結果を示す図である。ヒトキメラCA8はヒト及びcyno BCMAを発現する細胞に十分に結合する。 ELISA結合アッセイ-ヒト及びcyno BCMA組換えタンパク質に結合するCA8抗体についてのELISAの結果を示す図である。これにより、ヒトキメラCA8抗体がヒト及びcyno BCMAタンパク質に等しく結合することが明らかに示される。 BiaCore結合アッセイ-Biacore実験においてBCMA-Fc、TACI-Fc及びBAFF-R-Fcタンパク質に対するCA8の結合を示す図である。CA8キメラ抗体はTACI又はBAFF-Rタンパク質に結合しない。 細胞結合アッセイ-FACSにより決定した場合、H929多発性骨髄腫細胞に対するマウスS307118G03、S3222110D07、S332121F02及びS332126E04の結合並びにBCMAでトランスフェクトしたARH77細胞に対するS3322110D07、S332121F02及びS332126E04の結合を示す図である。多発性骨髄腫細胞株H929又はARH77-hBCMA 10B5 BCMAを発現する形質転換体細胞を、マウス抗BCMA抗体(中実ヒストグラム)又はマウスIgG2aアイソタイプ対照(開口ヒストグラム)のいずれかで染色した。FACSにより細胞を分析して細胞に結合した抗体を検出した。 細胞結合アッセイ-FACSにより決定した場合、多発性骨髄腫細胞株のパネルに対するキメラCA8の結合を示す図である。フローサイトメトリーによりH929、OPM-2、JJN-3及びU266に対する結合を試験し、平均蛍光強度(MFI)値を測定して結合を決定した。無関係のアイソタイプ対照としてシナジスを使用した。 細胞結合アッセイ-FACSにより決定した場合、BCMAでトランスフェクトしたARH77細胞(A)及び多発性骨髄腫H929細胞(B)に対するヒト化CA8バリアントの結合曲線を示す図である。フローサイトメトリーによりヒト化バリアントJ6M0、J6M1、J6M2、J9M0、J9M1及びJ9M2を試験し、平均蛍光強度(MFI)値を測定してCA8キメラと比較した結合を決定した。 リガンド中和アッセイ-(A及びB)ELISAプレート上でコーティングした組換えBCMAに対する組換えBAFF又はAPRILの結合を中和するCA8及びJ6M0の能力を示す図である。OD値を使用して、組換えBCMAに対する関連リガンド単独結合により達成された最大信号の抗体媒介性阻害を計算した。最大信号の阻害パーセントとしてデータを報告する。試験した抗体は野生型及びアフコシル化(afucosylated)(ポテリジェント)形態の両方におけるキメラCA8及びヒト化CA8型J6M0であった。(A)BAFFリガンド結合の中和、(B)-APRILリガンド結合の中和。(C)-H929細胞中のNFカッパBのBAFF又はAPRIL誘導性リン酸化の阻害におけるJ6M0 BCMA抗体の能力を示す図である。H929細胞を3回洗浄していくらかのsBCMAを除去し、無血清培地中に再懸濁した。J6M0ポテリジェント抗体を96ウェルプレートに加えて、BAFF又はAPRILリガンドと共に100ug/mlまでの最終ウェル濃度を得て、それぞれ0.6又は0.2ug/mlの最終ウェル濃度を得た。次いでH929細胞を無血清培地中に7.5×104個の細胞/ウェルにて播種した。30分後、細胞を溶解し、MSD pNFカッパBアッセイを使用してリン酸化NFカッパBレベルを測定した。MSDリーダー502819。これは一つの独立した実験からのデータである。各データ点は2回の反復の平均/標準偏差である。 図７−１の続きである。 ADCCアッセイ-BCMAを発現する標的細胞と共にキメラCA8及び脱フコシル化(Fc増強)CA8のADCC活性を示す図である。ヒトNK細胞を、種々の濃度の抗体の存在下で、ユーロピウムで標識したARH77 10B5 BCMAでトランスフェクトした標的細胞と共にインキュベートした。標的細胞からのユーロピウムの放出を測定し、特異的溶解を計算した。(A)アイソタイプ対照と比較したキメラCA8のADCC用量反応曲線。(B)BCMA発現細胞株ARH77 10B5に対する、キメラCA8及び脱フコシル化キメラCA8(Fc増強)についてのADCC用量反応曲線。 ADCCアッセイ-ARH77 BCMAを発現する標的細胞を使用したCA8ヒト化抗体でのADCCアッセイを示す図である。ヒトPBMCを、ヒト化CA8抗体の様々な濃度のJ5、J6、J7、J8又はJ9シリーズの存在下で、ユーロピウムで標識したARH77 BCMAでトランスフェクトした標的細胞と共にインキュベートした。標的細胞からのユーロピウムの放出を測定し、特異的溶解を計算した。EC50値をug/mlで示す。 ADCCアッセイ-エフェクター細胞として精製したNK細胞と共にARH7710B5標的細胞に対するキメラ、S332121F02(A)、S3322110D07(B)、S307118G03(C)及びヒト化S307118G03 H3L0(D)のADCC活性を示す図である。ヒトNK標的細胞を、種々の濃度の抗体の存在下で、ユーロピウムで標識したARH77 10B5 BCMAでトランスフェクトした標的細胞と共にインキュベートした。標的細胞からのユーロピウムの放出を測定し、特異的溶解を計算した。 生存アッセイ用量反応曲線-ヒト多発性骨髄腫細胞株(A)NCI-H929、(B)U266-B1、(C)JJN3及び(D)OPM2におけるキメラCA8抗体、キメラCA8-vcMMAE及びキメラCA8-mcMMAF抗体-薬物コンジュゲートについての細胞生存アッセイにおける用量反応曲線を示す図である。抗体を細胞に加え、96時間後の生存細胞の数を、CelltiterGloを使用して測定した。データ点は3連のCellTiterGlo測定の平均を表す。エラーバーは標準誤差を表す。 細胞周期に対するCA8キメラ抗体の影響を示す図である。(A)示した時点についての50ng/mLにてコンジュゲートしていないキメラCA8、キメラCA8-vcMMAE ADC又はキメラCA8-mcMMAF ADCで処理したNCI-H929細胞の細胞周期のヒストグラム。G2/M細胞周期停止及び細胞死について陽性対照としてパクチタキセル(Pactitaxel)(100nM)を使用した。陰性対照として対照ヒトIgG1を使用した。グラフに示した時点において細胞周期分析を実施した。(B)G2/M停止を示す4N DNA細胞集団の定量化及び(C)示した処理の各々についての細胞死を示すサブ2N DNA細胞集団。細胞を12ウェルプレート中に播種した(1mLのRPMI+10%FBS中の2×105個の細胞/ウェル)。細胞播種の6時間後に抗体又はADCを加えた。 ホスホ-ヒストンH3に対するキメラCA8の影響を示す図である。キメラCA8 ADC処理の結果、NCI-H929細胞のホスホ-ヒストンH3染色が増加する。(A、B)対照IgG(A)又はキメラCA8-mcMMAF(B)のいずれかで処理した後、DNA含量(FL3-H)x軸及び抗ホスホ-ヒストンH3(Thr11)抗体(FL1-H)y軸を測定するためにヨウ化プロピジウムで染色した細胞のドットプロット。(C)示した濃度のキメラCA8 ADCによる48時間の処理後のホスホ-ヒストンH3陽性NCI-H929細胞の定量化。有糸分裂停止についての陽性対照としてパクチタキセル(100nM)を使用し、陰性対照として対照キメラIgG1を使用した。細胞を12ウェルプレート中に播種した(1mLのRPMI+10%FBS中に2×105個の細胞/ウェル)。細胞播種の6時間後に抗体又はADCを加えた。 アネキシン-Vに対するキメラCA8の影響を示す図である。キメラCA8 ADC処理の結果、NCI-H929細胞のアネキシン-V染色が増加する。(A)高濃度のキメラCA8 ADCで処理した後のアネキシン-V-FITC(FL1-H、上側パネル)及び生細胞ヨウ化プロピジウム染色(FL3-H、下側パネル)のヒストグラム、(B)示した濃度のキメラCA8 ADCによる96時間の処理後のアネキシン-V陽性NCI-H929細胞の定量化。アポトーシスについての陽性対照としてパクチタキセル(100nM)を使用し、陰性対照として対照キメラIgG1を使用した。細胞を12ウェルプレート中に播種した(1mLのRPMI+10%FBS中の2×105個の細胞/ウェル)。細胞播種の6時間後に抗体又はADCを加えた。 生存アッセイ用量反応曲線-キメラCA8又はヒト化J6M0抗体のコンジュゲートしていない(ネイキッド)並びにvcMMAE及びmcMMAF抗体-薬物コンジュゲートについての用量反応曲線を示す図である。ヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929及びOPM2に対して抗体薬物コンジュゲートを試験した。 生存アッセイ用量反応曲線-ヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929及びU266-B1におけるマウス抗BCMA抗体S332121F02、S322110D07、S332126E04及びS307118G03のコンジュゲートしていない抗体、vcMMAE及びmcMMAF抗体-薬物コンジュゲートについての用量反応曲線を示す図である。 ADC J6M0分子のADCC活性-ARH77 BCMAを発現する標的細胞を使用したJ6M0抗体でのADCCアッセイを示す図である。ヒトPBMCを、様々な濃度のJ6M0 WT及びMMAE、MMAFにコンジュゲートしたポテリジェントBCMA抗体、又はコンジュゲートしていないポテリジェントBCMA抗体の存在下で、ユーロピウムで標識したARH77 BCMAでトランスフェクトした標的細胞と共にインキュベートし、ユーロピウムの放出をVictor 2 1420マルチラベルリーダーでモニターした。 5つの多発性骨髄腫株のパネルに対するCA8 J6M0ポテリジェントのADCC用量反応曲線を示す図である。ヒトPBMCを、50:1のE:T比にて18時間、種々の濃度のCA8 J6M0ポテリジェント抗体の存在下で、多発性骨髄腫標的細胞と共にインキュベートした。次いでエフェクター及び標的混合物中に残存している標的細胞の割合を、標的細胞を検出するために蛍光標識した抗CD138抗体を使用してFACSにより測定し、細胞毒性の割合を計算した。A)試験した5個の多発性骨髄腫細胞株に対するCA8 J6M0ポテリジェントについての例の用量反応曲線。各データ点はシングリケート(singlicate)値からである。 CB.17 SCIDマウスにおけるNCI-H929細胞の増殖及び樹立に対するJ6M0及び薬物がコンジュゲートしたJ6M0の用量増加の効果を示す図である。2週間にわたる、コンジュゲートしていない、又はMMAE又はMMAFにコンジュゲートした、50又は100ugのJ6M0抗BCMA又はIgG1アイソタイプ対照のいずれかの1週間に2回の腹腔内投与後のCB17 SCIDマウスにおけるNCI-H929腫瘍の計算した腫瘍体積。データ点は1群当たりn=5の平均腫瘍体積を表す。 健常ボランティア及び骨髄腫患者由来の血清中の可溶性BCMAレベルの決定を示す図である。血清試料をMM患者から採取し、それらの試料は種々の段階(進行、鎮静、再発、新たに診断及びその他)由来であった。図に示した試料はアッセイ前に1/500希釈した血清由来のものである。可溶性ヒトBCMAレベルを測定するR&D Systems製のヒトBCMA/TNFRSF17サンドイッチELISAキットを使用して、キットと共に提供される標準的なプロトコルの後にBCMAを検出した。
本発明は、膜結合標的物に結合する抗原結合タンパク質であって、内在化できる、抗原結合タンパク質を提供する。更なる実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む免疫コンジュゲートが提供される。更なる実施形態において、抗原結合タンパク質はADCCエフェクター機能を有する。例えば抗原結合タンパク質は増強されたADCCエフェクター機能を有する。
一つのこのような実施形態において、BCMAに特異的に結合する、例えばヒトBCMA(hBCMA)に特異的に結合し、BCMA受容体に対するBAFF及び/又はAPRILの結合を阻害する抗原結合タンパク質又はその断片が提供される。
更なる実施形態において、抗原結合タンパク質又は断片は、BCMAに特異的に結合し、BCMAに対するBAFF及び/又はAPRILの結合を阻害し、該抗原結合タンパク質又はその断片は、FcγRIIIAに結合し、FcgRIIIA媒介性エフェクター機能を媒介する能力を有するか、又は増強されたFcγRIIIA媒介性エフェクター機能を有する。本発明に提供される本発明の一実施形態において、抗原結合タンパク質は内在化できる。
本発明の一態様において、膜に結合しないBCMA、例えば血清BCMAに結合する本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の一態様において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質であって、配列番号3のCDRH3又は配列番号3のバリアントを含む、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の更なる態様において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質であって、配列番号1のCDRH1、CDRH2:配列番号2:CDRL1:配列番号4、CDRL2:配列番号5及び/若しくはCDRL3:配列番号6並びに又はそれらのバリアントのうちの1以上を更に含む、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の一態様において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質であって、配列番号184のCDRH3又は配列番号184のバリアントを含む、抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の更なる態様において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質であって、配列番号182のCDRH1、CDRH2:配列番号183:CDRL1:配列番号185、CDRL2:配列番号186及び/若しくはCDRL3:配列番号187並びに又はそれらのバリアントのうちの1以上を更に含む、抗原結合タンパク質が提供される。
なお更なる態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号3のCDRH3:CDRH2:配列番号2:配列番号1のCDRH1:CDRL1:配列番号4:CDRL2:配列番号5及びCDRL3:配列番号6を含む。
なお更なる態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号184のCDRH3:CDRH2:配列番号183:配列番号182のCDRH1:CDRL1:配列番号185:CDRL2:配列番号186及びCDRL3:配列番号187を含む。
本発明の一態様において、抗原結合タンパク質は増強されたエフェクター機能を有する。別の態様において、抗原結合タンパク質は細胞傷害剤にコンジュゲートされる。なお更なる実施形態において、抗原結合タンパク質は、増強されたエフェクター機能を有し、且つ細胞傷害剤にコンジュゲートされるの両方である。
本発明の抗原結合タンパク質は、天然抗体又はその機能的断片若しくは等価物の構造にフォーマットされ得る本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでもよい。従って本発明の抗原結合タンパク質は、適切な軽鎖と対になる場合、完全長抗体、(Fab')2断片、Fab断片、又はそれらの等価物(例えばscFV、バイボディ(bi-body)、トリボディ(tri-body)又はテトラボディ(tetra-body)、タンダブ(Tandab)など)にフォーマットされる本発明のVH領域を含んでもよい。抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4、又はIgM、IgA、IgE若しくはIgD又はそれらの修飾バリアントであってもよい。抗体重鎖の定常ドメインはそれに応じて選択できる。軽鎖定常ドメインはカッパ又はラムダ定常ドメインであってもよい。更に、抗原結合タンパク質は、全てのクラス、例えばFc受容体にもはや結合しないか、又はC1q結合をもはや媒介しないIgG二量体、Fc変異体の修飾を含んでもよい。抗原結合タンパク質はまた、抗原結合領域及び非免疫グロブリン領域を含むWO86/01533に記載されている種類のキメラ抗体であってもよい。
定常領域は必要とされる任意の機能性に応じて選択される。例えばIgG1は補体への結合による溶解能力を実証できる及び/又はADCC(抗体依存性細胞障害)を媒介する。
本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号7及び配列番号9に記載される可変領域を有するマウス抗体由来又はそれらの非マウス等価物、例えばそれらのラット、ヒト、キメラ又はヒト化バリアントである。例えばそれらは、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27及び配列番号29に記載される可変重鎖配列並びに/又は配列番号31、配列番号33及び/又は配列番号35に記載される可変軽鎖配列を有する抗体由来である。
別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号116又は配列番号118に記載される可変重鎖配列並びに/又は配列番号120若しくは配列番号122に記載される可変軽鎖配列を有する抗体由来である。
別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号140に記載される可変重鎖配列及び/又は配列番号144に記載される可変軽鎖配列を有する抗体由来である。
本発明の一態様において、以下:配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号116又は配列番号118のいずれか一つから選択される単離された重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の別の態様において、以下:配列番号31、配列番号33又は配列番号35、配列番号120又は配列番号122のいずれか一つから選択される単離された軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の更なる態様において、以下:配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27及び配列番号29のいずれか一つから選択される単離された重鎖可変ドメイン並びに以下:配列番号31、配列番号33及び/又は配列番号35のいずれか一つから選択される単離された軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質が提供される。
一態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号23によりコードされる重鎖可変領域及び配列番号31によりコードされる軽鎖可変領域を含む。一態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号27によりコードされる重鎖可変領域及び配列番号31によりコードされる軽鎖可変領域を含む。一態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号29によりコードされる重鎖可変領域及び配列番号31によりコードされる軽鎖可変領域を含む。
一態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号116によりコードされる重鎖可変領域及び配列番号120によりコードされる軽鎖可変領域を含む。
一態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号118によりコードされる重鎖可変領域及び配列番号122によりコードされる軽鎖可変領域を含む。
一態様において、単離された可変重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号12又は配列番号14又は配列番号16又は配列番号18又は配列番号20又は配列番号22又は配列番号24又は配列番号26又は配列番号28又は配列番号30又は配列番号117又は配列番号119又は配列番号141を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
一態様において、単離された可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号32又は配列番号34又は配列番号36又は配列番号121又は配列番号123又は配列番号145を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
更なる態様において、単離された可変重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号24又は配列番号28又は配列番号30を含む、ポリヌクレオチド並びに単離された可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号32又は配列番号34を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
なお更なる態様において、単離された可変重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号24を含む、ポリヌクレオチド及び単離された可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号32を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
なお更なる態様において、単離された可変重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号117を含む、ポリヌクレオチド及び単離された可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号121を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
なお更なる態様において、単離された可変重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号119を含む、ポリヌクレオチド及び単離された可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号123を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
なお更なる態様において、単離された可変重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号141を含む、ポリヌクレオチド及び単離された可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号145を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
更なる態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される軽鎖のいずれか一つと組み合わせて本明細書に記載される可変重鎖のいずれか一つを含んでもよい。
一態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される本発明に係る1以上のCDR又は本明細書に記載される本発明に係る重鎖又は軽鎖可変ドメインの一つ又は両方を含む抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、抗原結合タンパク質は霊長類BCMAに結合する。一つのこのような実施形態において、抗原結合タンパク質は非ヒト霊長類BCMA、例えばカニクイマカクザル(cynomolgus macaque monkey)BCMAに更に結合する。
別の態様において、抗原結合タンパク質は、dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体及びミニボディ(minibody)からなる群から選択される。
本発明の一態様において、抗原結合タンパク質はヒト化抗体又はキメラ抗体であり、更なる態様において抗体はヒト化される。
一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
本発明の一態様において、配列番号55又は配列番号59又は配列番号61に記載される重鎖配列を有する抗体が提供される。
本発明の一態様において、配列番号63又は配列番号65に記載される軽鎖配列を有する抗体が提供される。
本発明の更なる態様において、配列番号55の重鎖配列及び配列番号63に記載される軽鎖配列を有する抗体が提供される。
一実施形態において、本明細書に記載される本発明の抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質が提供される。一つのこのような実施形態において、従って、配列番号23の重鎖可変配列及び配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質が提供される。
更なる実施形態において、従って、配列番号27、配列番号29、配列番号116、配列番号118及び配列番号140の一つから選択される重鎖可変配列並びに配列番号31、配列番号120、配列番号122及び配列番号144の一つから選択される軽鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質が提供される。
別の態様において、抗原結合タンパク質は高親和性でヒトBCMAに結合し、例えばBiacoreにより測定した場合、抗原結合タンパク質は、20nM以下の親和性又は15nM以下の親和性若しくは5nM以下の親和性又は1000pM以下の親和性若しくは500pM以下の親和性又は400pM以下若しくは300pM以下又は例えば約120pMの親和性でヒトBCMAに結合する。更なる実施形態において、抗原結合タンパク質は、Biacoreにより測定した場合、約100pMから約500pMの間又は約100pMから約400pMの間若しくは約100pMから約300pMの間でヒトBCMAに結合する。本発明の一実施形態において、抗原結合タンパク質は150pm未満の親和性でBCMAに結合する。一つのこのような実施形態において、これは例えば実施例4に記載されるようにBiacoreにより測定される。
別の態様において、抗原結合タンパク質はヒトBCMAに結合し、細胞中和アッセイにおいてBCMA受容体に対するリガンドBAFF及び/又はAPRILの結合を中和し、ここで抗原結合タンパク質は、約1nMから約500nMの間又は約1nMから約100nMの間若しくは約1nMから約50nMの間又は約1nMから約25nMの間若しくは約5nMから約15nMの間のIC50を有する。本発明の更なる実施形態において、抗原結合タンパク質はBCMAに結合し、細胞中和アッセイにおいてBCMAを中和し、ここで抗原結合タンパク質は約10nMのIC50を有する。
一つのこのような実施形態において、これは例えば実施例4.6に記載されるように細胞中和アッセイにより測定される。
抗原結合タンパク質、例えば本発明の抗体は、本発明の抗原結合タンパク質についてのコード配列を含む発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクションにより産生され得る。発現ベクター又は組換えプラスミドは、宿主細胞中で及び/又は宿主細胞由来の分泌物中で複製及び発現を制御できる従来の調節制御配列と作動可能に結合した抗原結合タンパク質についてのこれらのコード配列を組み込むことにより産生される。調節配列は、プロモーター配列、例えばCMVプロモーター及び他の公知の抗体由来であり得るシグナル配列を含む。同様に、相補的抗原結合タンパク質軽鎖又は重鎖をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターが産生できる。特定の実施形態において、この第2の発現ベクターは、可能な限り、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを確保するようにコード配列及び選択可能なマーカーが関連する場合を除いて第1と同一である。或いは、抗原結合タンパク質についての重鎖及び軽鎖コード配列は単一ベクターに存在していてもよい。
選択される宿主細胞は、第1及び第2のベクター両方を用いて従来技術により共トランスフェクトされ(又は単に単一ベクターによりトランスフェクトされ)て、組換え又は合成軽鎖及び重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を生成する。次いでトランスフェクトされた細胞は従来技術により培養されて、本発明の操作された抗原結合タンパク質を産生する。組換え重鎖及び/又は軽鎖の両方の結合を含む抗原結合タンパク質は、ELISA又はRIAなどの適切なアッセイにより培養物からスクリーニングされる。類似の従来技術が他の抗原結合タンパク質を構築するために利用できる。
当業者ならば、本発明の組成物の方法及び構築に利用されるクローニング及びサブクローニングステップに適切なベクターを選択することができる。例えば、クローニングベクターの従来のpUCシリーズを使用してもよい。一つのベクターであるpUC19は、Amersham(Buckinghamshire、英国)又はPharmacia(Uppsala、スウェーデン)などの供給会社から市販されている。更に、容易に複製でき、多数のクローニング部位及び選択可能な遺伝子(例えば抗生物質耐性)を有し、容易に操作される任意のベクターをクローニングに使用してもよい。このように、クローニングベクターの選択は本発明における限定要因ではない。
発現ベクターは、異種DNA配列、例えば哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)の発現を増幅するのに適した遺伝子により特徴付けることもできる。他のベクター配列としては、ウシ成長ホルモン(BGH)及びベータグロビンプロモーター配列(ベータグロプロ(betaglopro))由来などのポリAシグナル配列が挙げられる。本明細書に有用な発現ベクターは当業者に周知の技術により合成できる。
このようなベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などは、商業的供給源若しくは天然源から得られてもよいか、又は選択された宿主内の組換えDNA産物の発現及び/若しくは分泌を駆動するのに使用するために公知の手順により合成できる。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母及び真菌発現についての多くの種類が当技術分野において知られている他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために選択できる。
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含有する組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞株を包含する。これらのクローニングベクターのクローニング及び他の操作に有用な宿主細胞も従来からある。しかしながら、大腸菌(E.Coli)の種々の株由来の細胞を、クローニングベクターの複製及び本発明の抗原結合タンパク質の構築における他のステップに使用してもよい。
本発明の抗原結合タンパク質の発現のために適切な宿主細胞又は細胞株としては、NS0、Sp2/0、CHO(例えばDG44)、COS、HEK、線維芽細胞(例えば3T3)及び骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞が挙げられ、例えばそれはCHO又は骨髄腫細胞において発現できる。ヒト細胞を使用してもよく、それにより分子がヒトグリコシル化パターンで修飾されることが可能になる。
或いは、他の真核細胞株を利用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞の選択並びに産物の形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び産生並びに精製のための方法は当技術分野において公知である。例えば上記で引用したSambrook et al.を参照のこと。
細菌細胞は組換えFabの発現又は本発明の他の実施形態に適切な宿主細胞として有用となり得る(例えば、Pluckthun, A., Imuunol.Rev., 130:151-188(1992)を参照のこと)。しかしながら、折り畳まれていない若しくは不適切に折り畳まれた形態又は非グリコシル化形態である細菌細胞中で発現されるタンパク質の性質に起因して、細菌細胞中で産生される任意の組換えFabは抗原結合能力の保持についてスクリーニングされなければならない。細菌細胞により発現される分子が適切に折り畳まれた形態で産生される場合、その細菌細胞は望ましい宿主であるか、又は代替の実施形態において、分子は細菌宿主中で発現でき、次いでその後再び折り畳まれる。例えば、発現に使用される大腸菌の種々の株はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌(B.Subtilis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、他の桿菌など様々な株もまた、本発明に利用できる。
所望の場合、当業者に公知の酵母細胞の株もまた、宿主細胞及び昆虫細胞、例えばショウジョウバエ(Drosophila)並びに鱗翅類(Lepidoptera)及びウイルス発現系として利用可能である。例えば、Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press(1986)及びその中で引用されている参考文献を参照のこと。
ベクターが構築され得る一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要とされるトランスフェクション方法及びこのような宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を産生するのに必要な培養方法は全て従来技術でよい。典型的に、本発明の培養方法は、通常、血清を含まない懸濁液中で細胞を培養することによる無血清培養方法である。同様に、一旦産生されると、本発明の抗原結合タンパク質は、アンモニア16エロキシジ(eroxidi)沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的な手順に従って細胞培養含有物から精製することができる。このような技術は当業者の範囲内であり、本発明を限定するものではない。例えば、改変される抗体の調製はWO99/58679及びWO96/16990に記載されている。
抗原結合タンパク質を発現する更に別の方法は米国特許第4,873,316号に記載されているようにトランスジェニック動物中での発現を利用してもよい。これは、哺乳動物内に遺伝子導入により組み込む場合、メスがそのミルク中に所望の組換えタンパク質を産生できる動物カゼインプロモーターを使用した発現系に関する。
本発明の更なる実施形態において、本発明の抗体を産生する方法であって、本発明の抗体の軽鎖及び/又は重鎖をコードするベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップ並びにこれにより産生された抗体を回収するステップを含む、方法が提供される。
本発明によれば、ヒトBCMAに結合し、ヒトBCMAの活性を中和する本発明の抗BCMA抗体を産生する方法であって、
抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供するステップと、
抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供するステップと、
哺乳動物宿主細胞(例えばCHO)を前記第1及び第2のベクターで形質転換するステップと、
前記宿主細胞から前記培地中に抗体の分泌を誘導する条件下でステップ(c)の宿主細胞を培養するステップと、
ステップ(d)の分泌された抗体を回収するステップと
を含む、方法が提供される。
一旦、所望の方法により発現されると、抗体は次いで適切なアッセイの使用によりインビトロ活性を試験される。現在、従来のELISAアッセイフォーマットがBCMAに対する抗体の定性的及び定量的結合を評価するために利用される。更に、通常のクリアランス機構にも関わらず体内に抗体が持続する持続性を評価するのに実施される後のヒト臨床研究の前に中和効果を検証するのに、他のインビトロ活性を使用することもできる。
投与量及び治療期間は、ヒト循環における本発明の分子の関係する期間に関し、治療される病態及び患者の全体的な健康に応じて、当業者が調節してもよい。長期間(例えば4〜6ヶ月)にわたる反復投与(例えば1週間に1回又は2週間毎に1回若しくは3週間毎に1回)が最大治療効果を達成するのに必要となり得ることも企図されている。
本発明の一実施形態において、例えば発現カセットが本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを更に含む場合、又は二つの発現カセットが存在し、第1が軽鎖をコードし、第2が重鎖をコードする場合、少なくとも一つの発現カセットを含む、組換え体により形質転換された、トランスフェクトされた又は形質導入された宿主細胞が提供される。例えば一実施形態において、第1の発現カセットは、定常領域を含む抗原結合タンパク質又は本明細書に記載される本発明に係る定常領域に連結されるその抗原結合断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、定常領域を含む抗原結合タンパク質又は本明細書に記載される本発明に係る定常領域に連結されるその抗原結合断片の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第2のカセットを更に含み、例えば第1の発現カセットは配列番号56又は配列番号60若しくは配列番号62から選択される重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第2の発現カセットは配列番号64又は配列番号66から選択される軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明の別の実施形態において、定常領域を含む抗体又は本明細書に記載される定常領域に連結されるその抗原結合断片の重鎖及び/又は軽鎖をコードする1以上の発現カセットを含むベクターを含む安定に形質転換された宿主細胞が提供される。例えばこのような宿主細胞は軽鎖をコードする第1のベクター及び重鎖をコードする第2のベクターを含んでもよく、例えば第1のベクターは配列番号55又は配列番号59若しくは配列番号61から選択される重鎖をコードし、第2のベクターは軽鎖、例えば配列番号63又は配列番号65の軽鎖をコードする。一つのこのような例において、第1のベクターは配列番号55から選択される重鎖をコードし、第2のベクターは軽鎖、例えば配列番号63の軽鎖をコードする。
本発明の別の実施形態において、本明細書に記載される本発明に係る宿主細胞が提供され、例えば該細胞が哺乳動物である場合、該細胞は真核性である。このような細胞株の例としてはCHO又はNS0が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、定常領域を含む抗体又は本明細書に記載される本発明に係る定常領域に連結されるその抗原結合断片を産生するための方法であって、宿主細胞を培地、例えば無血清培地中で培養するステップを含む、方法が提供される。
本発明の別の実施形態において、前記抗体を含有する無血清培地に対して前記抗体が少なくとも95%以上(例えば98%以上)に更に精製される、本明細書に記載される本発明に係る方法が提供される。
更に別の実施形態において、抗原結合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の実施形態において、使用のために記載された指示書と一緒に本明細書に記載される本発明に係る組成物を含む部分のキットが提供される。
本発明の治療剤の投与様式は、薬剤を宿主に送達する任意の適切な経路であってもよい。本発明の抗原結合タンパク質及び医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下(s.c.)、髄腔内、腹腔内、筋肉内(i.m.)又は静脈内(i.v.)に特に有用である。一つのこのような実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は静脈内又は皮下に投与される。
本発明の治療剤は、薬学的に許容可能な担体中に有効成分として有効量の本発明の抗原結合タンパク質を含有する医薬組成物として調製できる。一実施形態において、本発明の予防薬は注射の準備ができている形態で抗原結合タンパク質を含有する水性懸濁液又は溶液である。一実施形態において、懸濁液又は溶液は生理的pHで緩衝化される。一実施形態において、非経口投与のための組成物は薬学的に許容可能な担体中に溶解された本発明の抗原結合タンパク質の溶液又はそのカクテルを含む。一実施形態において、担体は水性担体である。例えば0.9%生理食塩水、0.3%グリシンなどの種々の水性担体を利用してもよい。これらの溶液は無菌にしてもよく、全体的に粒子状物質を含まない。これらの溶液は従来の周知の滅菌技術(例えば濾過)により滅菌できる。組成物は、適切な生理的条件に必要とされる場合、pH調整剤及び緩衝剤などの薬学的に許容可能な補助物質を含有してもよい。このような医薬製剤中の本発明の抗原結合タンパク質の濃度は広範に、すなわち約0.5重量%未満、通常又は少なくとも約1重量%から約15又は20重量%までの量で変化してもよく、選択される特定の投与様式に応じて液量、粘度などに基づいて主に選択される。
このように、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、約250mlの滅菌リンガー溶液及び1mlのリンガー溶液当たり約1〜約30又は5mg〜約25mgの本発明の抗原結合タンパク質を含有するように構成できる。非経口で投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に周知であるか又は明らかになり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにより詳細に記載されている。静脈内に投与可能な本発明の抗原結合タンパク質製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D「The formulation of Biopharmaceutical products」, Pharma.Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3(3rd 2000年4月)、Wang、W「Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals」, Int. J. Pharm 185(1999)129-188、Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY:Plenum Press(1992)、Akers, M.J.「Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations」, J.Pharm Sci 91(2002) 2283-2300、Imamura, K et al「Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state」, J Pharm Sci 92(2003)266-274、Izuts, Kkojima, S.「Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying」, J Pharm. Pharmacol, 54(2002)
1033-1039、Johnson, R,「Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein peroxidise 19g19n」, J. Pharm. Sci, 91(2002)914-922、並びにHa, E Wang W, Wang Y.j.「Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability」, J.Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002)(これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれており、それらを明示的に読者の参照とする)を参照のこと。
一実施形態において、本発明の治療剤は、医薬製剤中にある場合、単位投薬形態で存在する。適した治療有効用量は当業者により容易に決定される。適切な用量は患者の体重に応じて患者のために計算され得る。例えば適切な用量は、約0.1〜約20mg/kg、例えば約1〜約20mg/kg、例えば約10〜約20mg/kg又は例えば約1〜約15mg/kg、例えば約10〜約15mg/kg又は例えば1〜5mg/kgの範囲であってもよい。一実施形態において、抗体は3週間毎に1〜5mg/kgで与えられる。ヒトにおける多発性骨髄腫、SLE又はIPTなどの病態を効果的に治療するために、適切な用量は、約0.1〜約1000mg、例えば約0.1〜約500mg、例えば約500mg、例えば約0.1〜約100mg、又は約0.1〜約80mg、若しくは約0.1〜約60mg、又は約0.1〜約40mg、若しくは例えば約1〜約100mg、又は約1〜約50mgの範囲内の本発明の抗原結合タンパク質であってもよく、その抗原結合タンパク質は、非経口、例えば皮下、静脈内又は筋肉内に投与できる。このような用量は、必要な場合、医師により必要に応じて選択される適切な時間間隔で反復することができる。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は保管のために凍結乾燥してもよく、使用前に適切な担体中に再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリン及び当技術分野で知られている過酸化物により効果的であることが示されており、再構成技術を利用することができる。
本発明の別の態様において、医薬における使用のための本明細書に記載される抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の一態様において、慢性関節リウマチ(rheumatoid arthitis)、1型糖尿病、多発性硬化症又は乾癬の治療における使用のための本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質が提供され、前記方法は本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む。
本発明の一実施形態において、BCMAに特異的に結合する抗原結合タンパク質をヒトに投与するステップを含む、前記ヒトにおける癌を治療するための方法が提供される。一部の例において、抗原結合タンパク質は免疫コンジュゲートの一部である。
本発明の別の態様において、患者が組換えタンパク質補充療法に対して中和抗体を発生する、多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、非分泌性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫(Smoldering multiple myeloma)、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)、孤立性形質細胞腫(骨、髄外)、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、原発性アミロイド症(AL)、重鎖病、全身性エリテマトーデス(SLE)、POEMS症候群/骨硬化性骨髄腫、I型及びII型クリオグロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、急性糸球体腎炎、天疱瘡及び類天疱瘡障害、並びに後天性表皮水疱症、又はBCMA発現を有する任意の非ホジキンリンパ腫B細胞白血病若しくはホジキンリンパ腫(HL)又は任意の疾患から選択されるB細胞媒介性若しくは形質細胞媒介性疾患又は抗体媒介性疾患若しくは障害の治療における使用のための本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質が提供され、前記方法は本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む。
B細胞障害はB細胞発生/免疫グロブリン産生の欠陥(免疫欠損)及び過剰/無制限増殖(リンパ腫、白血病)に分けることができる。本明細書で使用する場合、B細胞障害とは両方の種類の疾患を指し、抗原結合タンパク質を用いてB細胞障害を治療するための方法が提供される。
特定の態様において、疾患又は障害は、多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、孤立性形質細胞腫(骨、髄外)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される。
本発明の一態様において、疾患は、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)又は孤立性形質細胞腫(骨、髄外)である。
本発明の一態様において、疾患は多発性骨髄腫である。
本発明の一態様において、疾患は全身性エリテマトーデス(SLE)である。
本発明の一態様において、疾患は特発性血小板減少性紫斑病(ITP)である。
本明細書に記載される疾患及び障害を治療するための医薬の製造における本明細書に記載される抗原結合タンパク質の使用もまた、提供される。
例えば、本発明の一態様において、BCMAとリガンドBAFF及びAPRILとの間の相互作用の調節(阻害又は遮断など)に反応する疾患及び障害の治療又は予防に使用するための本明細書に記載される抗原結合タンパク質の使用が提供される。
本発明の一態様において、慢性関節リウマチ、1型糖尿病(Type 1 Diabeted Mellitus)、多発性硬化症又は乾癬から選択される抗体媒介性又は形質細胞媒介性疾患又は障害の治療又は予防に使用するための本明細書に記載される抗原結合タンパク質の使用が提供される。
本発明の別の態様において、患者が組換えタンパク質補充療法に対して中和抗体を発生する、多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)、くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)、孤立性形質細胞腫(骨、髄外)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性アミロイド症(AL)、重鎖病、全身性エリテマトーデス(SLE)、POEMS症候群/骨硬化性骨髄腫、I型及びII型クリオグロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、急性糸球体腎炎、天疱瘡及び類天疱瘡障害並びに後天性表皮水疱症、BCMA発現を有する任意の非ホジキンリンパ腫及び白血病又は任意の疾患から選択される抗体媒介性又は形質細胞媒介性疾患又は障害の治療又は予防に使用するための本明細書に記載される抗原結合タンパク質の使用が提供され、前記方法は本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む。
一態様において、本発明は、患者が組換えタンパク質補充療法に対して中和抗体を発生する、慢性関節リウマチ、1型糖尿病、多発性硬化症若しくは乾癬又は多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)、くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)、孤立性形質細胞腫(骨、髄外)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性アミロイド症(AL)、重鎖病、全身性エリテマトーデス(SLE)、POEMS症候群/骨硬化性骨髄腫、I型及びII型クリオグロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、急性糸球体腎炎、天疱瘡及び類天疱瘡障害並びに後天性表皮水疱症、BCMA発現を有する任意の非ホジキンリンパ腫及び白血病若しくは任意の疾患から選択される抗体媒介性若しくは形質細胞媒介性疾患若しくは障害を治療又は予防するための本発明の抗原結合タンパク質又はその機能的断片及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供し、前記方法は本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む。
本発明の別の実施形態において、患者が組換えタンパク質補充療法に対して中和抗体を発生する、慢性関節リウマチ、1型糖尿病、多発性硬化症若しくは乾癬又は抗体媒介性若しくは形質細胞媒介性障害若しくは疾患を患っているヒト患者を治療する方法であって、該方法は本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質の治療有効量を投与するステップを含み、例えば選択される抗体媒介性又は形質細胞媒介性疾患又は障害を患っているヒト患者を治療する方法が提供される。本発明の別の態様において、患者が組換えタンパク質補充療法に対して中和抗体を発生する、多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)、くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)、孤立性形質細胞腫(骨、髄外)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性アミロイド症(AL)、重鎖病、全身性エリテマトーデス(SLE)、POEMS症候群/骨硬化性骨髄腫、I型及びII型クリオグロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、急性糸球体腎炎、天疱瘡及び類天疱瘡障害並びに後天性表皮水疱症、BCMA発現を有する任意の非ホジキンリンパ腫及び白血病又は任意の疾患から選択される抗体媒介性又は形質細胞媒介性疾患又は障害の治療に使用するための本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質が提供され、前記方法は、薬学的に許容可能な担体と併せて本明細書における本発明に係る抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を投与するステップを含む。
更なる実施形態において、多発性骨髄腫(MM)を患っているヒト患者を治療する方法が提供される。
定義
本明細書で使用する場合、「癌」、「新生物」及び「腫瘍」という用語は交換可能に使用され、単数形又は複数形のいずれかで、細胞が宿主生物にとって病的なものとなる悪性形質転換を経た細胞を指す。原発性癌細胞は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって非癌性細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用する場合、癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来する任意の細胞も含まれる。これには、転移性癌細胞、並びに癌細胞に由来するインビトロ培養物及び細胞株が含まれる。通常、固形腫瘍として現れる種類の癌に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、例えばコンピュータ断層撮影(CT)スキャン、磁気共鳴イメージング(MRI)、X線、超音波又は身体検査での触診などの処置により、腫瘍塊に基づいて検出可能及び/又は患者から得られる試料中の1種以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能な腫瘍のことである。腫瘍は、造血(又は血液学的(hematologic)又は血液系(hematological)又は血液関連)癌、例えば「液性腫瘍」と称され得る、血液細胞又は免疫細胞由来の癌であってもよい。血液系腫瘍に基づいた臨床症状の具体的な例としては、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病及び急性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、MGUS及びワルデンシュトレーム型マクログロブリンなどの形質細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫が挙げられる。
癌は、異常数の芽細胞若しくは望ましくない細胞増殖が存在するか又はリンパ性及び骨髄性悪性腫瘍の両方を含む、血液系癌と診断される任意の癌であってもよい。骨髄性悪性腫瘍としては、限定されないが、急性骨髄性(又は骨髄球性又は骨髄性又は骨髄芽球性)白血病(未分化又は分化)、急性前骨髄(又は前骨髄球性又は前骨髄性(promyelogenous)又は前骨髄芽急性(promyeloblastic))白血病、急性骨髄単球性(又は骨髄単芽球性)白血病、急性単球性(又は単芽球性)白血病、赤白血病及び巨核球性(又は巨核芽球性)白血病が挙げられる。これらの白血病は、急性骨髄性(又は骨髄球性又は骨髄性)白血病(AML)とまとめて称される場合がある。骨髄性悪性腫瘍としてはまた、限定されないが、慢性骨髄性(又は骨髄)白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、本態性血小板血症(又は血小板増加症)及び真性多血症(PCV)を含む骨髄増殖性障害(MPD)が挙げられる。骨髄性悪性腫瘍としてはまた、難治性貧血(RA)、過剰芽細胞を伴う不応性貧血(RAEB)及び形質転換における過剰芽細胞を伴う不応性貧血(RAEBT)とも称される場合がある骨髄異形成(又は骨髄異形成症候群若しくはMDS)並びに原発性骨髄線維症を伴う又は伴わない骨髄線維症(MFS)が挙げられる。
造血癌としてはまた、リンパ節、脾臓、骨髄、末梢血及び/又はリンパ節外部位に影響を与え得るリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。リンパ性癌としては、限定されないが、B細胞非ホジキンリンパ腫瘍(B-NHL)を含む、B細胞悪性腫瘍が挙げられる。B-NHLは、無痛性(又は低悪性度)、中悪性度(又は侵攻性)又は高悪性度(非常に侵攻性)であってもよい。無痛性B細胞リンパ腫としては、濾胞性リンパ腫(FL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、節MZL、節外性MZL、脾臓MZL及び有毛リンパ球を有する脾臓MZLを含む辺縁帯リンパ腫(MZL)、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)並びに粘膜関連リンパ組織(MALT又は節外性辺縁帯)リンパ腫が挙げられる。中悪性度B-NHLとしては、白血病に関連した又は関連していないマントル細胞リンパ腫(MCL)、びまん性大細胞型リンパ腫(DLBCL)、濾胞性大細胞(又は悪性度3若しくは悪性度3B)リンパ腫、及び縦隔原発性リンパ腫(PML)が挙げられる。悪性度B-NHLとしては、バーキットリンパ腫(BL)、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫(SNCCL)及びリンパ芽球性リンパ腫が挙げられる。他のB-NHLとしては、免疫芽球性リンパ腫(又は免疫細胞腫)、原発性滲出液、HIV関連(又はAIDS関連)リンパ腫、及び移植後リンパ増殖性疾患(PTLD)又はリンパ腫が挙げられる。B細胞悪性腫瘍としてはまた、限定されないが、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症(WM)、有毛細胞白血病(HCL)、大型顆粒リンパ球(LGL)白血病、急性リンパ性(又はリンパ球性若しくはリンパ芽球性)白血病、及びカストルマン病が挙げられる。NHLとしてはまた、限定されないが、T細胞非ホジキンリンパ腫、別段の定めがなければ(NOS)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、血管免疫芽球性リンパ腫(AILD)、鼻ナチュラルキラー(NK)細胞/T細胞リンパ腫、ガンマ/デルタリンパ腫、皮膚T細胞性リンパ腫、菌状息肉腫、及びセザリー症候群を含む、T細胞非ホジキンリンパ腫(T-NHL)が挙げることができる。
造血癌としてはまた、古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型(LP)ホジキンリンパ腫、結節性LPホジキンリンパ腫、及びリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫(又は疾患)が挙げられる。造血癌としてはまた、くすぶり型MM、意義不明(又は未知若しくは不明確)の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)、形質細胞腫(骨、髄外)、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、及び原発性アミロイド症(AL)を含む多発性骨髄腫(MM)などの形質細胞疾患又は癌が挙げられる。造血癌としてはまた、多形核白血球(又は好中球)、好酸球、樹枝状細胞、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞を含む、更なる造血細胞の他の癌が挙げることができる。「造血細胞組織」と本明細書で称される造血細胞を含む組織としては、骨髄、末梢血、胸腺及び脾臓、リンパ節、粘膜に関連するリンパ系組織(腸管関連リンパ組織など)、扁桃腺、パイエル板及び付属物、並びに他の粘膜に関連するリンパ系組織、例えば気管支内膜などの末梢リンパ組織が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」という用語は、ヒトBCMAに結合でき、それを中和できる抗体、抗体断片及び他のタンパク質構築物を指す。
Fv、Fc、Fd、Fab、又はF(ab)2という用語はそれらの標準的な意味で使用される(例えば、Harlow et al, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照のこと)。
「抗体」という用語は、広い意味において本明細書で使用し、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば二重特異性抗体)を包含する。
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体、すなわち少量で存在し得る、起こり得る天然に生じる突然変異体を除いて同一である集団を含む個々の抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は単一の抗原結合部位に向けられて非常に特異的である。更に、典型的に異なる決定基(エピトープ)に向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。
「キメラ抗体」とは、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定のドナー抗体クラス又はサブクラス由来の抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同するが、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片中の鎖(複数可)の残りが対応する配列と同一であるか又は相同する、操作された抗体の種類を指す(米国特許第4,816,567号及びMorrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)(1984))。
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のそのCDRを有する操作された抗体の種類を指し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分は1種(又はそれ以上)のヒト免疫グロブリン(複数可)由来である。加えて、フレームワーク支持残基は結合親和性を保存するように改変できる(例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032(1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421(1991)を参照のこと)。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列との相同性により、慣用的データベース、例えばKABAT(登録商標)データベース、ロスアラモスデータベース、及びスイスプロテインデータベースから選択されるものであってもよい。(アミノ酸に基づいて)ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域及び/又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であり得る。軽鎖定常又は可変フレームワーク領域を供与し得る適切なアクセプター抗体も同様に選択できる。アクセプター抗体重鎖及び軽鎖は、同じアクセプター抗体が起源である必要はないということに留意すべきである。従来技術はこのようなヒト化抗体を産生するいくつかの方法を記載している(例えば、EP-A-0239400及びEP-A-054951を参照のこと)。
核酸に関して、「実質的に同一」という用語は、最適に整列させ、比較した場合、ヌクレオチドの少なくとも約80%、ヌクレオチドの約90%〜約95%、又は少なくとも約98%〜約99.5%において適したヌクレオチド挿入又は欠失と同一である二つの核酸、又は指定したそれらの配列を示す。或いは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体とハイブリダイズする場合、実質的に同一が存在する。「同一」とは、ポリヌクレオチド及びポリペプチドに関して、場合によっては、以下の(1)及び(2)に与えたアルゴリズムを使用して計算した比較を意味する:
(1)ポリヌクレオチドに対する同一性は、所与の配列中のヌクレオチドの総数に、同一性パーセントを規定する整数(100で除したもの)を乗じ、次いでその積を前記配列中のヌクレオチドの前記総数から減ずること、又は:
nn ≦ xn-(xn・y)
[式中、nnはヌクレオチド改変数であり、xnは所与の配列中のヌクレオチドの総数であり、yは95%に対して0.95、97%に対して0.97又は100%に対して1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xnとyのいずれの非整数積もxnから減ずる前に最も近い整数に切り下げて丸められる]
によって計算される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、このコード配列中でナンセンス、ミスセンス又はフレームシフト突然変異を生じる場合があり、それによりこのような改変後にポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを改変する。
(2)ポリペプチドに対する同一性は、アミノ酸の総数に、同一性パーセントを規定する整数(100で除したもの)を乗じ、次いでその積をアミノ酸の前記総数から減ずること、又は:
na ≦ xa-(xa・y)
[式中、naはアミノ酸改変数であり、xaは配列中のアミノ酸の総数であり、yは95%に対して0.95、97%に対して0.97又は100%に対して1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xaとyのいずれの非整数積もxaからそれを減ずる前に最も近い整数に切り下げて丸められる]
によって計算される。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列に関して、「同一」という用語は、最適に整列させ、適した挿入又は欠失と比較した場合、二つの核酸又はアミノ酸配列との間の同一性の程度を示す。
「単離された」とは、その天然状態から「ヒトの手によって」改変されたことを意味し、その元の環境から変更若しくは除去されているか、又はその両方である。例えば、生物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離されて」おり、限定されないが、細胞が同じ種又は種類(その細胞からポリヌクレオチド又はポリペプチドが分離された)である場合でさえも、このようなポリヌクレオチド又はポリペプチドが細胞内に戻されて導入された場合を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、「含んでいる」及び「含む」という用語は、「からなっている」及び「からなる」を包含する。つまり、これらの用語は、文脈が許容する場合、具体的に列挙されていない他の要素又は整数の可能な包含を伝えることを意図する。
本発明の抗原結合タンパク質に関して本明細書全体を通して使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質が、他のヒトタンパク質に結合せずに、又は有意に結合せずにヒトBCMA(hBCMA)に結合することを意味する。しかしながら、この用語は、本発明の抗原結合タンパク質がまた、BCMA、例えば霊長類BCMAの他の形態と交差反応性であり得るという事実を排除しない。例えば一実施形態において、抗原結合タンパク質はTACI又はBAFF-Rに結合しない。
本発明の抗原結合タンパク質に関して本明細書全体を通して使用する場合、「阻害する」という用語は、BCMAの生物学的活性が、このような抗原結合タンパク質の非存在下でBCMAの活性と比較して本発明の抗原結合タンパク質の存在下で減少することを意味する。阻害は、限定されないが、1種以上の遮断リガンド結合、リガンドが受容体を活性化することの防止及び/又はBCMAの下方制御に起因してもよい。阻害はまた、BCMAに対する抗原結合タンパク質の結合及び細胞アポトーシス又はADCCを引き起こすことを指す場合もある。本発明の抗体はBCMAに対するBCMAリガンドBAFF及び/又はAPRIL結合の活性を中和できる。中和のレベルは、いくつかの方法、例えば以下の実施例、例えばH929細胞NFkBシグナル伝達アッセイにおける4.4に記載したアッセイの使用により測定できる。BCMAリガンドBAFF及びAPRILは、BCMAに結合した後、NFkBシグナル伝達及び下流の事象を誘導できる。このアッセイにおけるBCMAの中和は、BAFF又はAPRILにより駆動されるNFkB誘導を阻害する抗BCMAモノクローナル抗体の能力を評価することによって測定される。
抗体又はその抗原結合断片が中和できる場合、このことはヒトBAFF又はAPRILとBCMAとの間の相互作用の阻害を示す。ヒトBCMAに対する中和活性を有するとみなされる抗体は、実施例4.4に記載したH929刺激アッセイにおいて30マイクログラム/ml未満、又は20マイクログラム/ml未満、又は10マイクログラム/ml未満、又は5マイクログラム/ml未満又は1マイクログラム/ml未満又は0.1マイクログラム/ml未満のIC50を有する。
「CDR」は免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変ドメインである抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。免疫グロブリンの可変部分において3本の重鎖及び3本の軽鎖CDR(又はCDR領域)が存在する。このように、本明細書で使用する場合、「CDR」は、全ての3本の重鎖CDR、又は全ての3本の軽鎖CDR(又は適切な場合、全ての重鎖及び全ての軽鎖CDRの両方)を指す場合がある。
CDRは抗原又はエピトープに対する抗体の結合のための大部分の接触残基を提供する。本発明における対象のCDRは、ドナー抗体可変重鎖及び軽鎖配列由来であり、天然に生じるCDRの類似体を含み、それらの類似体はまた、ドナー抗体(それらの類似体はこのドナー抗体由来である)と同じ抗原結合特異性及び/又は中和能力を共有又は保持する。
抗体のCDR配列は、Kabat番号付け系(Kabat et al, (Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)により決定することができ、或いはそれらは、Chothia番号付け系(Al-Lazikani et al., (1997)JMB 273, 927-948)、接触点の定義方法(MacCallum R.M. and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262(5), 732-745)又は当業者に公知の抗体中の残基の番号付け及びCDR決定のための任意の他の確立された方法を使用して決定することができる。
当業者に利用可能なCDR配列のための他の番号付け慣用法としては、「AbM」(University of Bath)及び「接触」(University College London)法が挙げられる。Kabat, Chothia, AbM及び接触法のうちの少なくとも二つを使用した最小の重複領域が「最小結合単位」を提供するために決定できる。最小結合単位はCDRのサブ部分であってもよい。
以下の表Aは各CDR又は結合単位についての各番号付け規則を使用した一つの定義を表す。Kabat番号付けスキームを可変ドメインアミノ酸配列を番号付けするために表Xにおいて使用する。CDR定義の一部は、使用される個々の刊行物に応じて異なる場合があることに留意すべきである。
Figure 2018087190
本明細書全体を通して、抗体配列中のアミノ酸残基はKabatスキームに従って番号付けされる。同様に、「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」という用語は、Kabat et al, Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987に記載されているKabat番号付け系に従う。
「バリアント(変異体)」という用語は、配列中の少なくとも一つ、二つ又は三つのアミノ酸変化を指す。これらのアミノ酸変化は、欠失、置換又は付加であってもよいが、好ましくは置換である。このような一つの実施形態において、置換は保存的置換である。
代替の実施形態において、バリアント配列は、抗原結合タンパク質の正準を保持しながら、少なくとも一つの置換を含有する。
相補性決定領域(CDR)L1、L2、L3、H1及びH2は、有限の数の主鎖配座のうちの一つを構造的に示す傾向がある。特定の正準構造クラスのCDRは、CDRの長さ並びにCDR及びフレームワーク領域の両方の重要な位置にある残基により決定される(残基又はSDRを構造的に決定する)ループパッキングの両方により定義される。Martin及びThornton(1996, J Mol Biol 263:800-815)は「重要な残基」の正準鋳型を定義するために自動化方法を生み出した。CDRのセットについての正準クラスを定義するためにクラスター分析を使用し、次いで正準鋳型を、埋められた疎水性水素結合残基、及び例えば保存されたグリシンを分析することにより同定する。抗体配列のCDRは、その配列を重要な残基鋳型と比較すること、及び同一性又は類似性マトリクスを使用して各鋳型をスコア付けすることによって正準クラスに割り当てることができる。
「VH」及び「VL」という用語は、抗体のそれぞれ重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを指すために本明細書で使用する。
本明細書で使用する場合、「ドメイン」という用語は、残りのタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性を担い、多くの場合、残るタンパク質及び/又はドメインの機能を失わずに他のタンパク質に添加、除去又は移動させることができる。「単一抗体可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。従って、完全な抗体可変ドメイン及び修飾可変ドメイン(例えば、1以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列に置換されている)、又はN若しくはC末端伸長部分が切断されているか若しくは含まれている抗体可変ドメイン、並びに完全長ドメインの少なくとも結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、異なるV領域又はドメインから独立して抗原又はエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域又は可変ドメインと共に、フォーマット(例えば、ホモ又はヘテロ多量体)で存在でき、この場合、他の領域又はドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には要求されていない(すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは新たな可変ドメインから独立して抗原に結合する)。「ドメイン抗体」又は「dAb」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原に結合が可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、げっ歯類(例えば、WO00/29004に開示されている)、テンジクザメ及びラクダのVHH dAbなどの他の種由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダVHHはラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生する。このようなVHHドメインは、当業者に利用可能な標準的な方法によりヒト化することができ、このようなドメインも本発明による「ドメイン抗体」と考えられる。本明細書で使用される場合、「VHはラクダVHHドメインを含む。NARVは、テンジクザメを含む軟骨魚類で特定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、これらのドメインは、新規抗原受容体可変領域(通常、V(NAR)又はNARVと省略される)としても知られている。更なる詳細については、Mol.Immunol.44, 656-665(2006)及び米国特許出願第20050043519A号を参照のこと。
「エピトープ結合ドメイン」という用語は、異なるV領域又はドメインから独立して抗原又はエピトープに特異的に結合するドメインを指し、これは、ドメイン抗体(dAb)、例えばヒト、ラクダ若しくはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、又はCTLA-4(エビボディ(Evibody))、リポカリン、プロテインAのZ-ドメイン(アフィボディ、SpA)、A-ドメイン(アビマー/マキシボディ(Maxibody))などのプロテインA由来分子、GroEl及びGroESなどの熱ショックタンパク質、29エロキシダイズ(eroxidise)29g(トランスボディ(trans-body))、アンキリン反復タンパク質(DARPin)、ペプチドアプタマー、C-タイプレクチンドメイン(テトラネクチン)、ヒトγ-クリスタリン及びヒトユビキチン(アフィリン(affilin))、PDZドメイン、ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツ(scorpion toxinkunitz)タイプドメイン、及びフィブロネクチン(アドネクチン(adnectin))からなる群から選択される足場の誘導体であるドメインであってもよく、これらは天然のリガンド以外のリガンドに対する結合を得るためにタンパク質操作に供されている。
CTLA-4(細胞毒性Tリンパ球関連抗原4)は主にCD4+T細胞で発現されるCD28-ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Ig折り畳みを有する。抗体のCDRに対応するループは、異種の配列と置換することにより異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたCTLA-4分子は、エビボディとしても知られている。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248(1-2), 31-45(2001)を参照のこと。
リポカリンは細胞外タンパク質のファミリーであり、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する。これらは、円錐形構造の開口端に多くのループを有する強固なβ-シート二次構造を有し、これは様々な標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンはサイズが160〜180の間のアミノ酸で、リポカリン由来である。更なる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、米国特許第7,250,297B1号及び米国特許出願公開第20070224633号を参照のこと。
アフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインA由来の足場で、抗原に結合するように操作することができる。このドメインは約58のアミノ酸の三つのらせん状束から構成される。ライブラリは表面残基の無作為化により生成されている。更なる詳細については、Protein Eng.Des.Sel.17, 455-462(2004)及び欧州特許第1641818A1号を参照のこと。
アビマーは、A-ドメイン足場ファミリー由来の多ドメインタンパク質である。約35アミノ酸の未変性ドメインは、特定のジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、A-ドメインのファミリーにより示される自然変異の混合により生成される。更なる詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561(2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917(June 2007)を参照のこと。
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループ内へのペプチド配列の挿入により様々な標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例としてはトランスボディが挙げられる。更なる詳細については、J.Biol.Chem 274, 24066-24073(1999)を参照のこと。
設計アンキリン反復タンパク質(DARPin)は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン由来である。単一のアンキリン反復は、二つのα-ヘリックス及びβ-ターンから構成される３３残基のモチーフである。これらは、各反復の第1のα-ヘリックス及びβ-ターン中の残基を無作為化することにより様々な標的抗原に結合するように操作することができる。これらの結合面は、分子の数を増やすことにより増加させることができる(親和性成熟の方法)。更なる詳細については、J.Mol.Biol.332, 489-503(2003), PNAS 100(4), 1700-1705(2003)及びJ.Mol.Biol.369, 1015-1028(2007)及び米国特許出願公開第20040132028A1号を参照のこと。
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、ヒトIII型フィブロネクチン(FN3)における15個の反復単位の10番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。β-サンドイッチの一端の三つのループは、アドネクチンに対象の治療標的を特異的に認識させることができるように操作することができる。更なる詳細については、Protein Eng.Des.Sel.18, 435-444(2005)、米国特許出願公開第20080139791号、WO2005056764及び米国特許第6,818,418B1号を参照のこと。
ペプチドアプタマーは、定常性足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入された制限された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン(TrxA)から構成されるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細については、Expert Opin.Biol.Ther.5, 783-797(2005)を参照のこと。
ミクロボディは、長さ25〜50アミノ酸の天然に存在するマイクロタンパク質由来であり、3〜4個のシステインブリッジを含有し、マイクロタンパク質の例としては、KalataB1、及びコノトキシン及びノッティン(knottin)が挙げられる。マイクロタンパク質は、マイクロタンパク質の全体の折り畳みに影響を与えないで25アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッティンドメインの更なる詳細については、WO2008098796を参照のこと。
他のエピトープ結合ドメインとしては、様々な標的抗原結合特性を操作するために足場として使用されてきたタンパク質が含まれ、ヒトγ-クリスタリン及びヒトユビキチン(アフィリン)、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ(kunitz)タイプドメイン、Ras-結合タンパク質AF-6のPDZ-ドメイン、サソリ毒(カリブドトキシン)、C-タイプレクチンドメイン(テトラネクチン)が挙げられ、これらは、Handbook of Therapeutic Antibodies(2007、Stefan Dubelにより編集)からの第7章-Non-Antibody Scaffolds及びProtein Science 15:14-27(2006)でレビューされている。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインのいずれかに由来するものでもよい。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合できるタンパク質上の部位を指し、これは、単一ドメイン、例えばエピトープ結合ドメインであっても、標準的な抗体で見出され得るように対になったVH/VLドメインであってもよい。本発明の一部の実施形態において、一本鎖Fv(ScFv)ドメインが抗原結合部位を与えることができる。
「mAbdAb」及び「dAbmAb」という用語は、本発明の抗原結合タンパク質を指すために本明細書に使用される。この二つの用語は交換可能に使用することができ、本明細書で使用される場合、同じ意味を有することを意図する。
本明細書で使用される場合、「抗原結合タンパク質」とい用語は、抗体、抗体断片、例えばドメイン抗体(dAb)、ScFv、Fab、Fab2、及び他のタンパク質構築物を指す。抗原結合分子は、少なくとも一つのIg可変ドメイン、例えば抗体、ドメイン抗体(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ScFv、ダイアボディ(diabody)、mAbdAb、アフィボディ(affibody)、ヘテロコンジュゲート抗体又は二重特異性抗体を含み得る。一実施形態において、抗原結合分子は抗体である。別の実施形態において、抗原結合分子は、dAb、すなわち免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、異なるV領域又はドメインから独立して、抗原又はエピトープを特異的に結合するVH、VHH又はVLである。抗原結合分子は二つの標的に結合できる。すなわちそれらは二重標的化タンパク質であってもよい。抗原結合分子は、抗体と抗原結合断片の組合せ、例えばモノクローナル抗体と連結された1以上のドメイン抗体及び/又は1以上のScFvであってもよい。抗原結合分子はまた、非Igドメイン、例えば、CTLA-4(エビボディ)、リポカリン、プロテインAのZ-ドメイン(アフィボディ、SpA)、A-ドメイン(アビマー/マキシボディ)などのプロテインA由来分子、GroEl及びGroESなどの熱ショックタンパク質、31エロキシダイズ31g(トランスボディ)、アンキリン反復タンパク質(DARPin)、ペプチドアプタマー、C-タイプレクチンドメイン(テトラネクチン)、ヒトγ-クリスタリン及びヒトユビキチン(アフィリン)、PDZドメイン、ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン、及びフィブロネクチン(アドネクチン)からなる群から選択される足場の誘導体であるドメインを含んでもよく、これらはOSMに対する結合を得るためにタンパク質操作に供される。本明細書で使用される場合、「抗原結合タンパク質」は、ヒトOSMに拮抗及び/又はそれを中和できる。加えて、抗原結合タンパク質は、OSMに結合し、天然リガンドがgp130受容体に結合及び/又はそれを活性化することを防ぐことによってOSM活性を阻害し、遮断できる。
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」という用語は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)、補体依存性細胞傷害活性(CDC)媒介性反応、Fc媒介性食作用及びFcRn受容体を介した抗体の再利用のうちの1以上を指すことを意味する。IgG抗体については、ADCC及びADCPを含むエフェクター機能は、免疫細胞の表面に存在するFcγ受容体のファミリーと重鎖定常領域との相互作用によって媒介される。ヒトでは、これらは、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)を含む。抗原に結合した抗原結合タンパク質とFc/Fcγ複合体の形成との間の相互作用により、細胞傷害、免疫細胞活性化、食作用及び炎症性サイトカインの放出を含む広範囲の作用が誘導される。
抗原結合タンパク質の定常領域と様々なFc受容体(FcR)との間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考えられる。有意な生物学的作用は、エフェクター機能、特に、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)、補体の固定(補体依存性細胞傷害又はCDC)、及び抗原結合タンパク質の半減期/クリアランスの結果であり得る。通常、エフェクター機能を媒介する能力は、抗原に対する抗原結合タンパク質の結合を必要とし、全ての抗原結合タンパク質が全てのエフェクター機能を媒介するとは限らない。
例えば、ナチュラルキラー細胞に対するFcγRIIIの結合を介して、又は単球/マクロファージに対するFcγRIの結合を介してADCCエフェクター機能を測定することを含む多数の方法でエフェクター機能を測定することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、ADCCエフェクター機能について、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて評価することができる。このようなアッセイの例は、Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, p6591-6604、Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol268, p25124-25131、Lazar et al, 2006 PNAS, 103;4005-4010に見出すことができる。
CDCの機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。
ヒト定常領域のいくつかのアイソタイプ、特にIgG4及びIgG2アイソタイプは、a)古典的経路による補体の活性化、及びb)抗体依存性細胞性細胞傷害の機能を本質的に欠く。望ましいエフェクター特性に応じて、抗原結合タンパク質の重鎖定常領域に対する様々な改変を行ってもよい。特定の突然変異を含有するIgG1定常領域は、Fc受容体に対する結合を減少させ、従ってADCC及びCDCを低下させることが別々に報告されている(Duncan et al. Nature 1988, 332;563-564、Lund et al. J.Immunol.1991, 147;2657-2662、Chappel et al. PNAS 1991, 88;9036-9040、Burton and Woof, Adv.Immunol.1992, 51, 1-84、Morgan et al., Immunology 1995, 86;319-324、Hezareh et al., J.Virol.2001, 75(24);12161-12168)。
本発明の一実施形態において、抗原結合タンパク質がADCC及び/又は補体活性若しくはエフェクター機能を低下させるような定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。一つのこのような実施形態において、重鎖定常領域は、IgG2若しくはIgG4アイソタイプの生来不能である定常領域又は突然変異型IgG1定常領域を含んでもよい。適切な修飾の例は欧州特許第0307434号に記載されている。一つの例は235及び237位(EUインデックスの番号付け)におけるアラニン残基の置換を含む。
残基Asn297に特定の突然変異又は改変されたグリコシル化を含有するヒトIgG1定常領域もまた、Fc受容体への結合を増強すると記載されている。いくつかの事例において、これらの突然変異はまた、ADCC及びCDCを増強することが示されている(Lazar et al. PNAS 2006, 103;4005-4010、Shields et al. J Biol Chem 2001, 276;6591-6604、Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44;1815-1817)。
本発明の一実施形態において、このような変異は、239、332及び330(IgG1)から選択される位置のうちの1以上、又は他のIgGアイソタイプにおける等価位置にある。適切な変異の例はS239D及びI332E及びA330Lである。一実施形態において、本明細書に記載される本発明の抗原結合タンパク質は、239位及び332位、例えばS239D及びI332Eにて変異されるか、又は更なる実施形態において、それは239及び332及び330、例えばS239D及びI332E及びA330L(EUインデックスの番号付け)から選択される3以上の位置において変異される。
本発明の代替の実施形態において、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように改変されたグリコシル化プロファイルを有する重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。例えば、抗原結合タンパク質は、増強されたADCC若しくは増強されたCDCを有し、又はそれは、増強されたADCC及びCDCエフェクター機能の両方を有する。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質を生成する適切な方法の例は、WO2003011878、WO2006014679及び欧州特許第1229125号に記載されており、それらの全てが本発明の抗原結合タンパク質に適用可能である。
本発明はまた、本発明に係る抗原結合タンパク質を産生するための方法であって、
a)本明細書に記載される単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養するステップであって、アルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が組換え宿主細胞中で不活性化されるステップと、
b)抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む、方法を提供する。
抗原結合タンパク質を産生するためのこのような方法は、例えば、BioWa,Inc.(Princeton、NJ)から利用可能なポテリジェント(商標)技術システムを使用して実施することができ、そのシステムにおいて、FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くCHOK1SV細胞は、機能的FUT8遺伝子を有する細胞内で産生された同一のモノクローナル抗体に対して増加している増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)活性を有するモノクローナル抗体を産生する。ポテリジェント(商標)技術システムの態様は、米国特許第7,214,775号、米国特許第6,946,292号、WO0061739及びWO0231240(これらの全ては参照により本明細書に組み込まれている)に記載されている。当業者はまた、他の適したシステムを認識するだろう。
本発明の一実施形態において、キメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有する、例えば、それが増強されたADCC若しくは増強されたCDC、又は増強されたADCC及びCDCの機能を有するように、IgG3由来の少なくとも一つのCH2ドメインを有するキメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。一つのこのような実施形態において、抗原結合タンパク質は、IgG3由来の一つのCH2ドメインを含むものでも、両方のCH2ドメインがIgG3由来のものでもよい。
本発明に係る抗原結合タンパク質を産生する方法であって、
a)本明細書に記載される単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養するステップであって、発現ベクターは、IgG1及びIgG3Fcドメインアミノ酸残基を有するFcドメインをコードする核酸配列を含む、ステップと、
b)抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む、方法もまた、提供される。
抗原結合タンパク質を産生するためのこのような方法は、例えば、BioWa,Inc.(Princeton、NJ)及び協和発酵工業(現在、協和発酵キリン株式会社)株式会社から利用可能なコンプリジェント(商標)技術システムを使用して実施することができる。そのシステムにおいて、核酸配列がIgG1及びIgG3Fcドメインアミノ酸残基の両方を有するキメラFcドメインをコードする発現ベクターを含む組換え宿主細胞が発現されて、このようなキメラFcドメインを欠く他の同一の抗原結合タンパク質と比べて増加している増強された補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有する抗原結合タンパク質を産生する。コンプリジェント(商標)技術システムの態様は、WO2007011041及び米国特許出願公開第20070148165号(それらの各々は参照により本明細書に組み込まれている)に記載されている。代替の実施形態において、CDC活性は、配列特異的突然変異をIgG鎖のFc領域内に導入することによって増大させることができる。当業者はまた、他の適したシステムを認識するであろう。
当業者は、このような修飾が単独で使用できるだけでなく、更にエフェクター機能を増強させるために互いに組み合わせて使用できることを理解するであろう。
本発明の一つのこのような実施形態において、変異型及びキメラ重鎖定常領域を含む重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質であって、例えば抗原結合タンパク質はIgG3由来の少なくとも一つのCH2ドメイン及びIgG1由来の一つのCH2ドメインを含み、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有する、例えばそれが以下の機能、増強されたADCC又は増強されたCDCのうちの1以上を有する、例えばそれが増強されたADCC及び増強されたCDCを有するように、IgG1 CH2ドメインは、239及び332及び330から選択される位置において1以上の変異(例えばその変異はS239D及びI332E及びA330Lから選択できる)を有する、抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、IgG1 CH2ドメインは変異S239D及びI332Eを有する。
本発明の代替の実施形態において、キメラ重鎖定常領域を含み、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質が提供される。一つのこのような実施形態において、重鎖定常領域は、IgG3由来の少なくとも一つのCH2ドメイン及びIgG1由来の一つのCH2ドメインを含み、フコース対マンノースの比が0.8:3以下である、例えば抗原結合タンパク質が脱フコシル化され、それにより前記抗原結合タンパク質が、前記変異及び改変されたグリコシル化プロファイルを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域を有する等価の抗原結合タンパク質と比較して増強されたエフェクター機能を有する、例えばそれが以下の機能、増強されたADCC又は増強されたCDCのうちの1以上を有する、例えばそれが増強されたADCC及び増強されたCDCを有するように、改変されたグリコシル化プロファイルを有する。
代替の実施形態において、抗原結合タンパク質は少なくとも一つのIgG3 CH2ドメイン及びIgG1由来の少なくとも一つの重鎖定常ドメインを有し、両方のIgG CH2ドメインは本明細書に記載される制限に従って変異される。
本発明の一態様において、本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質を産生する方法であって、
a)本明細書に記載される単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養するステップであって、前記発現ベクターは、両方のIgG1及びIgG3 Fcドメインアミノ酸残基を有するキメラFcドメインをコードするFC核酸配列を更に含み、アルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子は組換え宿主細胞内で不活性化される、ステップと、
b)抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む、方法が提供される。
抗原結合タンパク質を産生するためのこのような方法は、例えば、ポテリジェント(商標)及びコンプリジェント(商標)技術システムを組み合わせたBioWa,Inc.(Princeton、NJ)から利用可能なアクリタマブ(商標)技術システムを使用して、キメラFcドメインを欠き、オリゴ糖上にフコースを有する他の同一のモノクローナル抗体と比べて増大している、ADCC及びCDC両方の増強される活性を有する抗原結合タンパク質を産生することができる。
本発明の更に別の実施形態において、変異型及びキメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質であって、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有する、例えばそれが以下の機能、増強ADCC機能又は増強CDC機能のうちの一つ以上を有するように、前記抗原結合タンパク質が改変されたグリコシル化プロファイルを有する、抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、突然変異は239位及び332位及び330位から選択される、例えば突然変異はS239D及びI332E及びA330Lから選択される。更なる実施形態において、重鎖定常領域はIgG3由来の少なくとも一つのCH2ドメイン及びIgG1由来の一つのCh2ドメインを含む。一実施形態において、フコース対マンノースの比は0.8:3以下である、例えば抗原結合タンパク質が脱フコシル化され、それにより前記抗原結合タンパク質が、等価非キメラ抗原結合タンパク質又は前記変異及び改変されたグリコシル化プロファイルを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域と比較して増強されたエフェクター機能を有するように、重鎖定常領域は改変されたグリコシル化プロファイルを有する。
免疫コンジュゲート
また、限定されないが、化学療法剤などの1種以上の細胞傷害剤、薬物、増殖抑制剤、毒素(例えばタンパク毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含む、本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質を含む免疫コンジュゲート(交換可能に「抗体-薬物コンジュゲート」又は「ADC」とも称される)も提供される。
免疫コンジュゲートは細胞傷害剤、すなわち癌の治療において細胞の成長又は増殖を死滅又は阻害する薬物の局所送達のために使用されている(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549、Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146、Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614、Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172、米国特許第4,975,278号)。免疫コンジュゲートは、非コンジュゲート薬物の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる場合に、腫瘍への薬物成分の標的指向送達、及びそこでの細胞内蓄積を可能にする(Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05、Thorpe (1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共に、これらの戦略に有用であると報告されている(Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87)。これらの方法に使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが挙げられる(Rowland et al., (1986)上記)。抗体-毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581、Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028、Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許第1391213号、Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928、Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、以下の一般構造:
ABP-((リンカー)n-Ctx)m
(式中、ABPは抗原結合タンパク質であり、
リンカーは存在しないか又は本明細書に記載される切断可能又は切断可能でないリンカーのいずれかであり、
Ctxは本明細書に記載される任意の細胞傷害剤であり、
nは0、1、2、又は3であり、
mは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
を有する免疫コンジュゲートを含む。
MMAE及びMMAFなどのアウリスタチンとMCリンカーにより連結される抗体の例は以下の構造:
Figure 2018087190
に示される。
特定の実施形態において、免疫コンジュゲートは、限定されないが、抗体及び化学療法剤又は他の毒素を含む、抗原結合タンパク質を含む。免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は本明細書に記載されている。使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテスフォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカアメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカチャランチア(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリアオフィシナリス(sapaonaria oficinalis)阻害剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が挙げられる。例えば、1993年10月28日に公開されたWO93/21232を参照のこと。種々の放射性核種が放射性コンジュゲートした抗体の産生に利用可能である。例としては、211At、212Bi、131I、131In、90Y、及び186Reが挙げられる。
本発明の抗原結合タンパク質はまた、限定されないが、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーロスタチン(aurostatin)、トリコテセン、及びCC1065、並びに毒素活性を有するそれらの毒素の誘導体を含む、1種以上の毒素にコンジュゲートすることができる。適切な細胞傷害剤としては、限定されないが、ドバリン(dovaline)-バリン-ドライソロイニン(dolaisoleunine)-ドラプロイン-フェニルアラニン(MMAF)及びモノメチルアウリスタチンE(MMAE)並びにMMAEのエステル形態を含むアウリスタチン、DNAマイナーグルーブ結合剤、DNAマイナーグルーブアルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、パクリタキセル及びドセタキセルを含むタキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド及びビンカアルカロイドが挙げられる。特定の細胞傷害剤としては、トポテカン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、ドラスタチン-10、エチノマイシン、コンブレタトスタチン(combretatstatin)、カリチアマイシン(chalicheamicin)、メイタンシン、DM-1、DM-4、ネトロプシンが挙げられる。他の適切な細胞傷害剤としては、アウリスタチンなどの抗チューブリン剤、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン(cryptophysin)、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、又はドラスタチンが挙げられる。抗チューブリン剤としては、ジメチルバリン-バリン-ドライソロイイン-ドラプロイン-フェニルアラニン-p-フェニレンジアミン(phenylened-iamine)、MMAF、MMAE、アウリスタチンE、ビンクリスタチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンA、エポチロンB、ノコダゾール、コヒルチン、コルシミド(colcimid)、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモリド、メイタンシン、DM-1、DM-4又はエリュテロビンが挙げられる。
小分子抗チューブリン剤モノメチルアウリスタチンE(MMAE)又はモノメチルアウリスタチンF(MMAF)を抗体にコンジュゲートすることによって抗体薬物コンジュゲートを産生した。MMAEの場合、リンカーはチオール-反応性マレイミド、カプロイルスペーサ、ジペプチドバリン-シトルリン、及びp-アミノベンジルオキシカルボニル、自己犠牲型断片化基(self-immolative fragmenting group)からなる。MMAFの場合、プロテアーゼ-耐性マレイミドカプロイルリンカーが使用される。コンジュゲートプロセスは薬物-抗体結合において不均一を導き、各抗体分子に結合される薬物の数(モル比[MR])、及び結合部位の両方を変化させる。最も一般的な種はMR=4を有する物質であり、あまり一般的でないのは0、2、6、及び8のMRを有する物質である。全体の平均薬物-抗体間のMRは約4である。
免疫コンジュゲートの産生
結合点は、抗体がプロテインG親和性樹脂に固定化されている間に実施される抗体の鎖間ジスルフィドの軽度の還元により産生されるシステインである(これにより、中間体を精製せずに大過剰の試薬の使用を可能にする)。固定化の間、大過剰のTCEPは鎖間ジスルフィドを完全に還元するが、樹脂に対する抗体の結合に影響を与えない。
この手順により生成される1個の抗体当たりのチオールの数は抗体の源及びアイソタイプに依存する。例えば、ヒト(及びマウス-ヒトキメラ)IgG1は4個の還元性ジスルフィドを有するので、完全な還元時に8個のチオールを生成し、一方、マウスIgG1は5個の還元性ジスルフィドを有し、10個のチオールを生成する。最大薬物負荷(例えば、マウスIgG1について1個の抗体当たり10個の薬物)を有するADCが望まれる場合、マレイミド-薬物-リンカーが、完全なコンジュゲーションを確保するのに十分過剰に固定化抗体に単に加えられてもよい。しかしながら、1個の抗体当たり少数の薬物を有するADCもまた、抗体上で利用可能なチオールの一部を占めるN-エチルマレイミド(NEM)などの生物学的に不活性のキャッピング剤を含むことによって完全に還元された抗体から調製することができる。マレイミド-薬物-リンカー及びキャッピング剤が完全に還元された抗体に、大過剰(少なくとも3倍)で同時に加えられる場合、2個のマレイミド求電子剤は限定された数の利用可能なチオールを競合する。この様式において、薬物負荷は薬物-リンカー及びキャッピング剤の相対チオール反応速度により決定されるので、速度支配下であるとみなされ得る。マレイミド-薬物-リンカーの相対反応速度は顕著に変化するので、反応混合物中に存在する薬物-リンカー対NEMのモル比は、薬物負荷の所望のレベルを有するADCのパネルに到達するように実験的に決定されなければならない。1個の抗体当たり約4個の薬物を有するADCを生じるNEM混合物中の薬物リンカーSGD-1006(vcMMAE)及びSGD-1269(mcMMAF)のモル分率を、一般的なヒト及びマウスIgGアイソタイプについて表2にまとめる。
アウリスタチン及びドラスタチン
一部の実施態様において、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体である、アウリスタチン(米国特許第5,635,483号、同第5,780,588号)にコンジュゲートした抗原結合タンパク質又は抗体を含む。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管の動態、GTP加水分解、並びに核分裂及び細胞分裂を妨害することが示されており(Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5,663,149号)及び抗真菌活性(Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有する。ドラスチン又はアウリスタチン(これはドラスタチンのペンタプチド誘導体である)の薬物成分は、ペプチド薬物成分のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端を介して抗体に付着され得る(WO02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施形態には、「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、米国特許第7,498,298号(この開示はその全体が参照により明確に組み込まれている)に開示されている、N末端に結合したモノメチルアウリスタチン薬物成分DE及びDFが含まれる。本明細書に使用される場合、「MMAE」という略語はモノメチルアウリスタチンEを指す。本明細書に使用される場合、「MMAF」という略語はドバリン-バリン-ドライソロイン-ドラプロイン-フェニルアラニンを指す。
典型的に、ペプチドベースの薬物成分は、2以上のアミノ酸及び/又はペプチド断片の間にペプチド結合を形成することにより調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知である液相合成法(E. Schroder and K. Lubke,「The Peptides」, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照のこと)に従って調製され得る。アウリスタチン/ドラスタチン薬物成分は、米国特許第5,635,483号、米国特許第5,780,588号、Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465、Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277、Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725、及びPettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863の方法に従って調製され得る。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784;「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、2004年11月5日に出願された米国特許第7,498,298号(その全体が本明細書に参照により組み込まれている)(例えば、リンカーにコンジュゲートしたMMAE及びMMAFなどのモノメチルバリン化合物を調製するリンカー及び方法を開示している)も参照のこと。細胞傷害剤、特にペンタペプチドとして作用する生物学的に活性な有機化合物は、米国特許第6,884,869号、同第7,498,298号、同第7,098,308号、同第7,256,257号、及び同第7,423,116号に開示されている。MMAE及びMMAF並びにアウリスタチンの種々の誘導体に結合したモノクローナル抗体並びにそれらを作製する方法は米国特許第7,964,566号に記載されている。
アウリスタチンの例としてはMMAE及びMMAFが挙げられ、それらの構造を以下に示す:
Figure 2018087190
メイタンシン及びメイタンシノイド
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂(mitototic)阻害剤である。メイタンシンは最初に東アフリカの低木マイテヌスセーラタ(Maytenus serrata)から単離された(米国特許第3,896,111号)。続いて、特定の微生物もまた、メイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが発見された(米国特許第4,151,042号)。高い細胞毒性のメイタンシノイド薬物薬物は、アクチノシネマ(Actinosynnema)などの微生物の発酵により産生されるアンサマイトシン前駆体から調製され得る。アンサマイトシンを単離する方法は米国特許第6,573,074号に記載されている。合成メイタンシノール並びにその誘導体及び類似体は、例えば、米国特許第4,137,230号、同第4,248,870号、同第4,256,746号、同第4,260,608号、同第4,265,814号、同第4,294,757号、同第4,307,016号、同第4,308,268号、同第4,308,269号、同第4,309,428号、同第4,313,946号、同第4,315,929号、同第4,317,821号、同第4,322,348号、同第4,331,598号、同第4,361,650号、同第4,364,866号、同第4,424,219号、同第4,450,254号、同第4,362,663号、及び同第4,371,533号に開示されている。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性も顕著に減少させずに抗体をメイタンシノイド分子に化学的に結合することによって調製される。例えば、米国特許第5,208,020号を参照のこと。1個の抗体分子当たりにコンジュゲートした平均3〜4個のメイタンシノイド分子が、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えずに標的細胞の細胞毒性を増強するのに有効であると示されているが、毒素の1個の分子/抗体でも、ネイキッド抗体の使用より細胞毒性が増強すると予想される。
メイタンシノイドは当技術分野において周知であり、公知の技術により合成され得るか又は天然源から単離され得る。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号並びに本明細書上記に参照した他の文献及び非特許文献に開示されている。メイタンシノイドは、種々のメイタンシノールエステルなどのメイタンシノール分子の芳香環内又は他の位置で修飾されたメイタンシノール及びメイタンシノール類似体である。抗体との結合のためのメイタンシノイドを調製する方法は米国特許第6,570,024号及び同第6,884,874号に開示されている。
カリケアマイシン
抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二本鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5,712,374号、同5,714,586号、同5,739,116号、同5,767,285号、同5,770,701号、同5,770,710号、同5,773,001号、同5,877,296号(全てAmerican Cyanamid Company)を参照のこと。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体としては、限定されないが、.ガンマ.1I、.アルファ.2I、.アルファ.3I、N-アセチル-.ガンマ.1I、PSAG及び.シータ.I1(Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)及び上述のAmerican Cyanamidによる米国特許)が挙げられる。抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは両方、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介性内在化によるこれらの薬剤の細胞への取込により、それらの細胞毒性効果が増強する。
他の細胞傷害剤
抗体にコンジュゲートされ得る他の抗腫瘍剤としては、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、同5,770,710号に記載されており、まとめてLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5,877,296号)が挙げられる。
使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、アルファ-サルシン、アレウリテスフォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカアメリカーナタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカチャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。例えば、1993年10月28日公開のWO93/21232を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、DNアーゼなどのリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートを更に意図する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含んでもよい。放射性コンジュゲートした抗体を産生するために、種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体が挙げられる。コンジュゲートが検出用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m若しくはI123、又は核磁気共鳴(NMR)画像化(磁気共鳴画像化、mriとしても公知)用のスピン標識、例えば再びヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでもよい。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入できる。例えば、ペプチドは生物合成できるか、又は水素の代わりに例えばフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成できる。tc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111などの標識が、ペプチド内のシステイン残基を介して結合できる。イットリウム-90はリジン残基を介して結合できる。ヨウ素-123を導入するために、IODOGEN法(Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)を使用してもよい。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)は他の方法を詳細に記載している。
ADCの調製
抗体薬物コンジュゲートにおいて、抗体は、細胞傷害剤に直接、又はリンカーを介してコンジュゲートできる。適切なリンカーとしては、例えば切断可能及び切断可能でないリンカーが挙げられる。切断可能なリンカーは典型的に細胞内条件下で切断可能の影響を受けやすい。適切な切断可能リンカーとしては、例えば、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。例示的な実施形態において、リンカーは、バリン-シトルリン(val-cit)又はフェニルアラニン-リジン(phe-lys)リンカーなどのジペプチドリンカーであってもよい。他の適切なリンカーとしては、ヒドラゾンリンカーなどの5.5未満のpHで加水分解可能なリンカーが挙げられる。更なる適切な切断可能なリンカーとしてはジスルフィドリンカーが挙げられる。
Bristol-Myers Squibbは、特定のリソソーム酵素-切断可能な抗腫瘍剤コンジュゲートを記載している。例えば、米国特許第6,214,345号を参照のこと。Seattle Geneticsは、米国特許出願公開第2003/0096743号及び米国特許出願公開第2003/0130189号の出願を公開しており、それらは薬物送達剤におけるp-アミノベンジルエーテルを記載している。それらの出願に記載されているリンカーはアミノベンジルエーテル組成物に限定されている。
抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(アジプイミド酸ジメチルHClなど)、活性エステル(スベリン酸ジサクシンイミジル)、アルデヒド(グルタルアルデヒドなど)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど)、ジイソシアネート(トルエン2,6-ジイソシアネートなど)、及びビス-活性フルオリン化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して生成することができる。
更に、リンカーは1以上のリンカー成分からなってもよい。例示的なリンカー成分としては、6-マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、p-アミノベンジルオキシカルボニル(「PAB」)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(「SMCC」)、及びN-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(「SIAB」)が挙げられる。更なるリンカー成分は当技術分野において公知であり、一部は本明細書に記載されている。2004年11月5日に出願された、「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、米国特許第7,498,298号(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている)もまた参照のこと。
リンカーはまた、アミノ酸及び/又はアミノ酸類似体を含んでもよい。アミノ酸リンカー成分としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)が挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基としては、天然に発生するもの、並びに少しのアミノ酸及び非天然に発生するアミノ酸類似体、例えばシトルリンが挙げられる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンB、C及びD、又はプラスミンプロテーゼによる酵素的切断に対するそれらの選択性において設計し、最適化することができる。
抗原結合タンパク質及び抗体はリンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性を示し得る。抗体における求核基としては、限定されないが、(i)N末端アミン基、(ii)側鎖アミン基、例えばリジン、(iii)側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv)抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシル基又はアミノ基が挙げられる。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は求核性であり、(i)NHSエステル、HOBtエステル、ハロホルマート(haloformate)、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、(ii)ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル、(iii)アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬における求電子基と共有結合を形成するように反応できる。特定の抗体は、還元性鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、DTT(ジチオスレイトール)などの還元剤での処理によってリンカー試薬とのコンジュゲートに反応性を示し得る。それ故、各々のシステイン架橋は、理論的に二つの反応性チオール求核試薬を形成する。2-イミノチオラン(トラウト試薬(Traut's reagent))とのリジンの反応により、更なる求核基を抗体内に導入することができ、その結果、アミンのチオールへの変換が生じる。反応性チオール基は、一つ、二つ、三つ、四つ、又はそれ以上のシステイン残基を導入すること(例えば、1以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異抗体を調製すること)によって抗体(又はその断片)内に導入することができる。
抗原結合タンパク質及び抗体はまた、リンカー試薬又は薬物上の求核置換基と反応し得る求電子部分を導入するように修飾することができる。グリコシル化抗体の糖は、例えば過ヨウ素酸酸化剤を用いて酸化されて、リンカー試薬又は薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒド又はケトン基を形成できる。得られるイミンシッフ塩基は安定な結合を形成できるか、又は例えばホウ化水素によって還元されて安定なアミン結合を形成できる。一実施形態において、ガラクトースオキシダーゼ(glactose oxidase)又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとのグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬物上の適切な基と反応し得るタンパク質においてカルボニル基(アルデヒド及びケトン)基が産生され得る(Hermanson, Bioconjugate techniques)。別の実施形態において、N末端セリン又はトレオニン残基を含有するタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、その結果、最初のアミノ酸の代わりにアルデヒドを産生できる(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146、米国特許第5,362,852号)。このようなアルデヒドは、薬物部分又はリンカー求核試薬と反応することができる。
薬物部分上の求核基としては、限定されないが、(i)NHSエステル、HOBtエステル、ハロホルマート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、(ii)ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル、(iii)アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基との共有結合を形成するように反応できるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が挙げられる。
一部の実施形態において、リンカーは、細胞内環境(例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラの中)に存在する切断物質によって切断が可能である。リンカーは、例えば、限定されないが、リソソーム又はエンドソームのプロテアーゼを含む、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであってもよい。典型的に、ペプチジルリンカーは、長さが少なくとも2アミノ酸長又は少なくとも3アミノ酸長である。切断剤としては、カテプシンB及びD並びにプラスミンが挙げられ、それらの全てはジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞内に活性薬物を放出することが知られている(例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照のこと)。ペプチジルリンカーは細胞に存在する酵素によって切断可能であり得る。例えば、癌組織で高度に発現される、チオール依存性プロテアーゼカテプシン-Bにより切断可能なペプチジルリンカーを使用してもよい(例えば、Phe-Leu又はGly-Phe-Leu-Gly(配列番号50)リンカー)。他のそのようなリンカーは、例えば米国特許第6,214,345号に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼによる切断可能なペプチジルリンカーは、Val-Citリンカー又はPhe-Lysリンカーである(例えば、val-citリンカーによるドキソルビシンの合成を記載している米国特許第6,214,345号を参照のこと)。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を使用することの一つの利点は、コンジュゲートされるとその剤が典型的に弱毒化され、コンジュゲートの血清中安定性が典型的に高いことである。
他の実施形態において、切断可能なリンカーはpH感受性、すなわち、特定のpH値での加水分解に感受性である。典型的に、酸性条件下でpH感受性リンカーは加水分解する。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性のリンカー(例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス-アコニット酸アミド、オルソエステル、アセタール、ケタールなど)を使用してもよい。(例えば、米国特許第5,122,368号、同第5,824,805号、同第5,622,929号、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661を参照のこと)。そのようなリンカーは、血液中の条件などの中性pH条件下で比較的安定であるが、リソソームのおおよそのpHであるpH5.5又は5.0以下で不安定である。特定の実施形態において、加水分解性リンカーはチオエーテルリンカー(例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合しているチオエーテルなど(例えば米国特許第5,622,929号を参照のこと))である。
更に他の実施形態において、リンカーは還元条件下で切断可能である(例えば、ジスルフィドリンカー)。例えば、SATA(N-スクシンイミジル-5-アセチルチオアセテート)、SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)、SPDB(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート)及びSMPT(N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)-、SPDB及びSMPTを使用して形成され得るものを含む、様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で公知である(例えば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987。米国特許第4,880,935号も参照のこと)。
更なる他の特定の実施形態において、リンカーは、マロン酸リンカー(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93)、マレイミドベンゾイルリンカー(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304)、又は3'-N-アミド類似体(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)である。
典型的には、リンカーは、細胞外の環境に実質的に感受性でない。本明細書に使用される場合、リンカーに関して「細胞外の環境に実質的に感受性でない」とは、ADC又はADC誘導体が細胞外環境(例えば、血漿中)に存在する場合、ADC又はADC誘導体の試料中で、リンカーの約20%以下、典型的には約15%以下、より典型的には約10%以下、更により典型的には約5%以下、約3%以下、又は約1%以下が切断されることを意味する。リンカーが細胞外の環境に実質的に感受性でないかどうかは、例えば、所定期間(例えば、2、4、8、16又は24時間)、(a)ADC又はADC誘導体(「ADC試料」)及び(b)等モル量のコンジュゲートしていない抗体又は治療剤(「対照試料」)の両方を血漿と独立してインキュベートし、次に、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定される場合、ADC試料中に存在するコンジュゲートしていない抗体又は治療剤の量を、対照試料中に存在する量と比較することによって判定できる。
他の、非相互排他的実施形態において、リンカーは細胞内在化を促進する。特定の実施形態において、治療薬剤にコンジュゲートされると(すなわち、本明細書に記載されるADC又はADC誘導体のリンカー-治療薬剤部分の環境中で)、リンカーは細胞内在化を促進する。更に他の実施形態において、治療剤及び抗原結合タンパク質又はその抗体若しくは誘導体の両方にコンジュゲートされると(すなわち、本明細書に記載されるADC又はADC誘導体の環境中で)、リンカーは細胞内在化を促進する。
本組成物及び方法と使用され得る種々のリンカーは、2003年7月31日に出願された「Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease」と題するWO2004010957及び2002年7月31日に出願された「Drug Conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease」と題する米国仮特許出願第60/400,403号(それらの開示は参照により本明細書に組み込まれている)に記載されている。
或いは、抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成によって作製できる。DNAの長さは、互いに隣接するか、又はコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離されるかのいずれかであるコンジュゲートの二つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでもよい。
更に別の実施形態において、抗体は腫瘍予備標的化に利用するための「受容体」(ストレプトアビジンなど)にコンジュゲートしてもよく、その抗体-受容体コンジュゲートが患者に投与され、その後、洗浄剤を使用して未結合のコンジュゲートが循環から除去され、次いで細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートされる「リガンド」(例えばアビジン)が投与される。
本明細書で使用する場合、「非ヒト抗体又はその抗体断片」という用語は、ヒト以外の任意の種が起源である抗体又はその断片を指すことを意味し、ここで、ヒトはキメラ抗体を含む。
「ドナー抗体」という用語は、改変された免疫グロブリンコード領域を提供し、その結果、ドナー抗体の抗原特異性及び中和活性特性を有する改変された抗体を発現するように、第1の免疫グロブリンパートナーに対して、その可変ドメイン、CDR、又は他の機能的断片若しくはその類似体のアミノ酸配列の一因となる抗体(モノクローナル、及び/又は組換え体)を指す。
「アクセプター抗体」という用語は、ドナー抗体に対して非相同性である抗体(モノクローナル及び/又は組換え体)を指し、それは、第1の免疫グロブリンパートナーに対して、その重鎖及び/若しくは軽鎖フレームワーク領域並びに/又はその重鎖及び/若しくは軽鎖定常領域をコードする全て(又は任意の部分であるが、好ましくは全て)のアミノ酸配列の一因となる。ヒト抗体はアクセプター抗体である。
本明細書で使用する場合、「ヒトアクセプター配列」という用語は、ヒト抗体若しくはその抗体断片由来のVH若しくはVLフレームワーク又は中に非ヒト種由来のCDRが組み込まれ得るヒトコンセンサス配列フレームワークのアミノ酸配列を含む抗体又はその抗体断片のフレームワークを指すことを意味する。
本明細書で使用する場合、CDR又は超可変領域の「組み込み」という用語は任意の手段を包含し、これにより、非ヒトCDRがヒトアクセプターフレームワークと共に配置される。これは種々の方法で達成され得ることは理解されるであろう。例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は非ヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異することによって生成され、それによりそのフレームワーク残基は、ヒトアクセプターフレームワーク残基に変化できるか、又はヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異することによって生成され、それによりCDRは非ヒト残基に変化されるか、又は所望の配列をコードする核酸を合成することによって生成できる。一実施形態において、最終配列はコンピュータ内で生成される。
本発明をここで例示のみにより記載する。添付の特許請求の範囲は、以下の実施例の一つ以上の一般化を含み得る。
[実施例1]モノクローナル抗体生成及び選択
1.1 免疫化戦略
抗ヒトBCMA mAbマウス親CA8を、完全長BCMAで免疫化したマウス由来のハイブリドーマから同定した。BALB/cマウスを、CFAと組み合わせた25μgの組換え(rBCMA)タンパク質を用いてi.p.により免疫化した。25μgの完全長rBCMAタンパク質+10μgのモノホスホリルリピドA-安定なエマルション(MPL-SE)(Corixa Corporation、Seattle、WA)を用いてマウスを一カ月間隔で3回追加免疫し、融合の3日前にi.v.により30μgのrBCMAタンパク質の前融合物追加免疫を与えた。ClonaCell-HYハイブリドーマクローニングキット(StemCell Technologies、Vancouver、BC)を使用して又は従来の方法を使用してハイブリドーマを生成し、クローニングのいずれかをした。従来の方法において、免疫化した動物の脾臓由来のB細胞を、PEG(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下でSp2/0骨髄腫細胞と融合した。一晩回収した後、融合細胞を96ウェルプレート中に限界希釈で播種し、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン選択に供した。ハイブリドーマ培養上清を、ELISA及びフローサイトメトリーにより抗BCMA抗体の存在について試験した。
抗ヒトBCMA mAbマウス親S307118G03を、RIMMS法(急速免疫化多部位)を使用して組換えヒトBCMA/TNFRSF17-Fcキメラ(R&D 193-Fc)で免疫化したSJLマウス由来のハイブリドーマから同定した。0日に、一匹のマウス当たり5ugのタンパク質を、背面上(臀部上及び肩上)で、前面上の4部位における主要リンパ節の下位にある2部位にてAS02aアジュバント中で乳化した。6日及び11日に、一匹のマウス当たりRIBIアジュバント中の2.5ugのタンパク質を、前面上の4部位における主要リンパ節の下位に注射した。14日に動物を屠殺した。リンパ節及び脾臓を摘出し、破砕し、マウス骨髄腫細胞X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754;R17209/58)を含む3:1の比を使用してPEG1500誘導性体細胞融合を実施した。融合物を10×96ウェルプレート内に沈着させ、それらから直接スクリーニングした。
抗ヒトBCMA mAbマウス親S336105A07を同一の免疫化由来のハイブリドーマから同定した。リンパ節及び脾臓を14日に切除し、破砕し、マウス骨髄腫細胞X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754;R17209/58)を含む1:1の比を使用してサイトパルス(Cytopulse)電気融合を実施した。融合物を、10×96ウェルプレート内に採取する前に半固形培地を含有するオムニトレー(omnitray)内に沈着させ、これらの5日後に直接スクリーニングした。
抗ヒトBCMAマウス親mAb S332121F02及びS332126E04を、RIMMS法(急速免疫化)を使用してヒトBCMA(4-53)BCMAの細胞外ドメインの組換えFc融合物で免疫化したSJLマウス由来のハイブリドーマから同定した。0日に、一匹のマウス当たり5ugのタンパク質を、背面上(臀部上及び肩上)で、前面上の4部位における主要リンパ節の下位にある2部位においてAS02aアジュバント中で乳化した。6日に、一匹のマウス当たりRIBIアジュバント中の5ugの組換えcyno BCMA-Fcタンパク質を、前面上の4部位における主要リンパ節の下位に注射した。11日に、一匹のマウス当たりRIBIアジュバント中の2.5ugの組換えヒトBCMA-Fc及び2.5ugの組換えcyno BCMA-Fcを、前面上の4部位における主要リンパ節の下位に注射した。14日に、動物を屠殺し、S307118G03についてと同様に細胞を処理した。
抗ヒトBCMAマウス親mAb S322110D07を、1:1モル比で予混合した組換えヒトApril(R&D 5860-AP/CF)と複合したヒトBCMA(4-53)の細胞外ドメインの組換えFC融合物で免疫化したSJLマウス由来のハイブリドーマから同定した。一匹のマウス当たりRIBIアジュバント(100ul用量)中に懸濁したPBS中の5ugのApril/Cyno BCMA-Fc複合体を用いてマウスをi.p.により免疫化し、腹腔内経路を介して注射した一匹のマウス当たりRIBIアジュバント(100ul用量)中に懸濁したPBS中の2.5ugのApril/Cyno BCMA-Fc複合体を用いて3〜4週間隔で3回追加免疫し、融合の1日前に同じ免疫原の前融合物追加免疫を与え、S307118G03についてと同様に処理した。
抗ヒトBCMA mAbマウス親S335115G01及びS335122F05を、RIMMS法(急速免疫化多部位)を使用して、ヒトBCMA(4-53)の細胞外ドメインの組換えFc融合物及びcyno BCMA(4-52)の細胞外ドメインの組換えFc融合物の混合物で免疫化したSJLマウス由来のハイブリドーマから同定した。0日に、一匹のマウス当たり2,5ugの各タンパク質を、背面上(臀部上及び肩上)で、前面上の4部位における主要リンパ節の下位にある2部位においてAS02aアジュバント中で乳化し、注射した。6日及び11日に、一匹のマウス当たりRIBIアジュバント中の2.5ugの各タンパク質を、前面上の4部位において主要リンパ節の下位に注射した。14日に動物を屠殺した。リンパ節及び脾臓を摘出し、破砕し、マウス骨髄腫細胞X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754;R17209/58)を含む1:1の比を使用してサイトパルス電気融合を実施した。融合物を、32×96ウェルプレート内に採取する前に半固形培地を含有するオムニトレー内に沈着させ、これらの5日後から直接スクリーニングした。
[実施例2]ヒト化
2.1 CA8ハイブリドーマ可変領域のクローニング
全RNAをCA8ハイブリドーマ細胞から抽出し、次いで重鎖及び軽鎖可変ドメインcDNA配列を逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により生成した。RT-PCRについてのフォワードプライマーはマウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーは抗体定常領域に特異的であった。アイソタイプは未知であったので、IgG1、IgG2a及びIgG2bについてのリバースプライマーをこの場合に使用した。プライマーを設計するために、マウスVH及びVk遺伝子のリーダー配列のDNA多配列アラインメントを生成した。
2.2 キメラCA8のクローニング
キメラ抗体をコードするDNA発現構築物を、哺乳動物発現ベクター内でのクローニングのための制限酵素認識部位を含む重複オリゴヌクレオチド及びヒトシグナル配列を構築することによって新たに調製した。HindIII及びSpeI制限酵素認識部位を導入して、ヒトγ1定常領域を含有する哺乳動物発現ベクター内でのクローニングのためのシグナル配列を含有するVHドメインを構成した。HindIII及びBsiWI制限酵素認識部位を導入して、ヒトカッパ定常領域を含有する哺乳動物発現ベクター内でのクローニングのためのシグナル配列を含有するVLドメインを構成した。
2.3 ヒト化CA8バリアントのクローニング
ヒト化抗体バリアントをコードするDNA発現構築物を、哺乳動物発現ベクター内でのクローニングのための制限酵素認識部位を含む重複オリゴヌクレオチド及びヒトシグナル配列を構築することによって新たに調製した。HindIII及びSpeI制限酵素認識部位を導入して、ヒトγ1定常領域を含有する哺乳動物発現ベクター内でのクローニングのためのシグナル配列を含有するVHドメインを構成した。HindIII及びBsiWI制限酵素認識部位を導入して、ヒトカッパ定常領域を含有する哺乳動物発現ベクター内でのクローニングのためのシグナル配列を含有するVLドメインを構成した。
2.4 組換えCA8抗体の発現(抗体定量化を含む)
重鎖及び軽鎖をそれぞれコードする発現プラスミドをHEK293 6E細胞内に一過的に共トランスフェクトし、抗体を産生するように小規模で発現させた。ELISAにより抗体を定量した。ELISAプレートを1mg/mlにて抗ヒトIgG(Sigma I3382)でコーティングし、遮断溶液(トリス緩衝食塩水中の4%BSA)で遮断した。組織培養上清の種々の希釈物を加え、プレートを室温にて1時間インキュベートした。既知の標準的な抗体の希釈物もまた、プレートに加えた。プレートをTBST中で洗浄し、遮断溶液中に1/1000の希釈にて過酸化物で標識した抗ヒトカッパ軽鎖抗体(Sigma A7164)の添加により結合を検出した。プレートを、TBST中で洗浄する前に室温にて1時間インキュベートした。プレートをOPD基質(Sigma P9187)の添加により発現させ、2MのH2SO4の添加により発色を停止させた。吸光度を490nmにて測定し、既知の標準希釈についてのデータを使用して標準曲線をプロットした。標準曲線を使用して、組織培養上清中の抗体の濃度を推定した。プロテインAを使用して大規模で抗体調製物を精製し、ナノドロップ(Nanodrop)(Thermo Scientific)を使用して濃度を測定した。
Figure 2018087190
2.5 脱フコシル化抗体産生
脱フコシル化抗体を生成するために、重鎖及び軽鎖それぞれをCHO DG44 MS705 BioWa細胞中に共トランスフェクトし、抗体を産生する規模で発現させた。簡潔に述べると、30μgのDNAをNot1を用いて一晩線形化し、DNAをエタノール沈殿させ、TE緩衝液中に再溶解した。培養物から、2.4×107個のBioWa DG44細胞を得て、14mlの温PBS-スクロース中で洗浄した。細胞を回転させ、ペレットを1.6mlのPBS-スクロース中に再懸濁した。PBS-スクロース中に懸濁した上述の細胞の半分(0.8ml)を、30μgの線形化DNA(50μlのTE緩衝液中)と共にBioRadキュベットに加えた。BioRad GenePulserを25μFのキャパシタンスを用いて380Vにプログラムし、キュベットを電気穿孔のために入れた。得られた850ulの電気穿孔した細胞及びDNAを(80ml)温SFM512培地(フェノールレッド、2XHT(ヌクレオシド)、グルタマックス(glutamax)及びGibcoサプリメント4を含む)に加えた。最後に、得られた80mlの細胞懸濁液を4×96-ウェルプレートの一つの各ウェルに移した(150μl/ウェル)。48時間後、約130μlの馴化を除去することによって培地を、ヌクレオシドを含まないように変化させ、150μlの新しい選択培地であるSFM512培地(フェノールレッド及びグルタマックスを含む)と置き換えた。3〜4日毎に、130〜150μlの馴化培地を除去し、新しい選択培地と置き換えた。色の変化についてウェルをモニターし、以前に記載したようにIgG濃度についてアッセイした。
2.6 更なる抗体-ハイブリドーマ可変領域のクローニング
S307118G03、S332121F02、S332126E04、S322110D07、S336105A07、S335115G01及びS335122F05ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した。次いで重鎖及び軽鎖可変ドメインcDNA配列を逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により生成した。RT-PCRについてのフォワードプライマーはマウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーは、抗体定常領域、この場合、アイソタイプIgG2aに特異的であった。Jones及びBendig(Bio/Technology 9:88, 1991)に記載されている戦略に基づいてプライマーを設計した。正確なV領域配列の後の検証を可能にするために両方のV領域配列についてRT-PCRを実施した。RT-PCRにより生成したV領域産物についてのDNA配列データを得た。
2.7 更なる抗体-キメラのクローニング
哺乳動物発現ベクター内でのV遺伝子PCR産物のインフュージョンアドバンテージPCRクローニング(Clonetech)によってキメラ抗体をコードするDNA発現構築物を新たに調製した。このクローニング法により、マウス可変領域と、ヒトIgG1 H鎖及びカッパL鎖定常領域との融合が可能となった。
2.8 S307118G03-ヒト化バリアントのクローニング
クローニングを段落2.3についてと同様に実施した。
2.9 組換え抗体のS307118G03発現
関連重鎖及び軽鎖(以下の表8に記載した)をコードする発現プラスミドを、HEK293 6E細胞内で一過的に共トランスフェクトし、抗体を産生するように小規模で発現させた。抗体は上清から精製したプロテインAであり、ナノドロップ分光光度計を使用して定量化した。
以下の8)をHEK293 6E細胞内で一過的に共トランスフェクトし、抗体を産生するように小規模で発現させた。抗体は上清から精製したプロテインAであり、ナノドロップ分光光度計を使用して定量化した。
[実施例3]抗体薬物コンジュゲート(ADC)を生成するためのvcMMAE及びmcMMAFに対する抗体のコンジュゲーション
表B 薬物-リンカーの化学構造
Figure 2018087190
ガンマバインドプラスプロテインGセファロース(Gammabind Plus Protein G Sepharose)(GE Healthcare)樹脂スラリー(75uL)を深いウェル(2mL容量)のフィルタープレートの各ウェルに加えた。コンジュゲートされる抗体を種及びアイソタイプにより分類し、0.5mg以下の各抗体をプレートの各ウェルに移した。各抗体を二つの別のウェルに移して、薬物-リンカーSGD-1006及びSGD-1269を有する二つのコンジュゲートの調製を促進した。次いでフィルタープレートを5℃にて2時間1200RPMで振盪して抗体を樹脂に結合させた。次いでフィルタープレートを3分間500×gで遠心分離して、各ウェルの底に対する全ての流体及び樹脂の完全な引落としを確実にした。
次いで結合した抗体を、100mM KPO4中の10mM TCEP、150mM NaCl、pH7、1mM EDTA500uLを加え、22℃で30分間振盪することによって還元した。還元後、プレートを再び遠心分離してTCEP溶液を除去し、その後PBS+1mM EDTA、1mL/ウェルで洗浄した。洗浄溶液を遠心分離により除去し、合計4回の洗浄についてプロセスを3回繰り返した。次いで結合し、還元した抗体を、表2に示したモル分率に従って調製したNEM及び薬物リンカーの混合物を使用してコンジュゲートさせた。
Figure 2018087190
このようにNEM及び薬物リンカーの別々の混合物を、SGD-1006、SGD-1269(表Bを参照のこと)及びNEMの10mM DMSOストック溶液を使用して各抗体種/アイソタイプについて調製した。適切な比で混合した場合、従って全マレイミド濃度はまだ10mMであり、この値を使用して、各ウェルに加えられるマレイミド溶液の体積を計算した。例えば5個の還元性ジスルフィド(還元した場合、10個の利用可能なチオール)を有するマウスIgG1について、150kDにおける0.5mgの抗体は33.3nmolのチオールに対応する3.33nmolである。従って3倍過剰は100nmolの全マレイミド又は10μlの10mM薬物リンカー/NEM混合物である。SGD-1269コンジュゲートに関して、次いでこの混合物を5.86μLのSGD-1269及び4.14μLのNEMと共に調製する。次いでマレイミド混合物を、固定した還元抗体に加える前に500μLのPBS中に希釈する。実際には、各アイソタイプの複数の抗体は単一のSGD-1269/NEMと同時にコンジュゲートしたので、各アイソタイプについての混合溶液を、そのアイソタイプを含有するウェルの数と10μL/ウェルを掛け合わせることによって調製し、次いでウェルの数の500μL倍と等しいPBSの体積中で希釈した。同様に、合計8個の薬物-リンカー/NEM混合物を調製し(4個はSGD-1006を有し、4個はSGD-1269を有する)、PBS中で希釈した。次いで3個の混合物を還元抗体(500μL/ウェル)に加え、プレートを22℃にて30分間振盪した。次いでプレートを上記のように遠心分離して過剰な反応溶液を除去し、その後、以前のようにPBSで4回洗浄した。次いで結合したADCを、200uLの50mMグリシンpH2.5を各ウェルに加え、1200RPMで3分間プレートを振盪することによって溶出した。振盪している間、20uLの中和緩衝液 (1Mリン酸カリウム、pH7.4、500mM NaCl、0.2%Tween-20)を1mLの回収プレートの各ウェルに加えた。次いでADCを6分間1500×gにて回転させることによって回収プレート内で溶出した。次いで回収プレートを短時間振盪して、中和緩衝液の完全な混合を確実にした。
次いで溶液をUVアッセイプレート(Costarモデル3635、Corning)内に移し、280nmにおける光学密度を測定することによって吸光度プレートリーダーを用いて各ADCの濃度を決定した。1.45mL mg-1 cm-1の平均IgG吸光係数を使用して、パネルにわたるADC濃度の適切な推定を与えた。成功したコンジュゲーションを確認するために、逆相タンパク質HPLC法(以下に記載した)を使用してアイソタイプ対照の薬物負荷を推定した。CA8のヒト化バリアントを含有するプレートに関して、この方法を使用して全てのADCの負荷を直接推定した。
薬物負荷を決定するための逆相タンパク質クロマトグラフィー法は、PLRP-Sポリマー固定相(Agilent Technologies)を利用する。抗体はコンジュゲーションプロセスの間、完全に還元したので、抗体サブユニットの全ては単一ポリペプチド鎖としてカラムから溶出し、種々のレベルの薬物負荷を有する軽鎖及び重鎖種の亜集団を別々に評価できる。それ故、これらのデータの分析は、独立因子として平均軽鎖薬物負荷及び平均重鎖薬物負荷の計算を可能にし、次いでその独立因子は組み合わされて、その各抗体が2本の軽鎖及び2本の重鎖からなるという基本的知識により平均抗体薬物負荷を決定できる。クロマトグラフ条件は以下の通りであった:移動相Aとして水+0.05%TFA及び移動相Bとしてアセトニトリル+0.01%TFAを有するPRLP-Sカラム、1000Å、50×2.1mm、8um粒径(Agilent Technologies)、12.5分における27%B〜42%Bの線形勾配を有する溶出。
抗BCMA抗体は数ヶ月の期間にわたって三つの別々のバッチ中でSGD-1006及びSGD-1269とコンジュゲートした。第1のバッチにおいて、合計29個の抗体がコンジュゲートした(58個のADCを生じた)。PLRPクロマトグラフィー及びデータにより決定される各アイソタイプ対照の薬物負荷を表3にまとめる。
Figure 2018087190
第2のバッチに関して、更なる25個の抗体をコンジュゲートした(50個のADCを生じた)。PLRPクロマトグラフィー及びデータにより再び決定した各アイソタイプ対照の薬物負荷を表4にまとめる。
Figure 2018087190
第3のバッチにおいて、13個のCA8のヒト化バリアントを含む、30個の抗体がコンジュゲートした(60個のADCを生じた)。この最後のバッチにおいて、全てのADCの薬物負荷を決定し、以下の二つのプレートマップ(表5及び6)にまとめる。
Figure 2018087190
Figure 2018087190
平均薬物負荷及び%CVを各アイソタイプ種について底部に示す。薬物負荷において特徴的でない大きな変動性を、mIgG2b抗体で調製したSGD-1269 ADCについて観測し、この理由は不明である。また、Fcが増強したCA8抗体は他のCA8ヒトバリアントよりいくらか低い薬物負荷レベルを生じ、これに対処するために、更なるFcが増強したCA8を、他の抗体について達成した薬物負荷により良く適合するように溶液-層反応中でコンジュゲートした。
[実施例4]結合データ
4.1 ヒト又はcyno BCMAを発現する細胞に対するキメラCA8の結合を示すFMAT結合アッセイ
凍結保存したトランスフェクトしたヒト、cyno BCMA及び偽トランスフェクトしたHEK293細胞をLN2保存から収集した。広範囲の異なる濃度にてヒトキメラCA8抗体を用いてアッセイウェルを調製し、ヒトBCMA HEK293、cyno BCMA HEK293及び偽トランスフェクト細胞それぞれと混合した。抗ヒトIgG FMATブルー二次コンジュゲートをヒトキメラCA8を検出するために加えた。結果をABI8200(FMAT)プレートリーダーで読み取る前にアッセイプレートを最低90分間そのままにした。
これにより、キメラ形態のCA8抗体が、HEK293細胞で発現されたヒト及びcyno BCMAタンパク質の両方に十分に結合することが示された。
結果を図1に示す。
4.2 組換えBCMAタンパク質に対するキメラCA8の結合を示すELISA実験
Fc融合物として発現されたヒトBCMA及びcyno BCMAに対する結合についてキメラCA8抗体を試験した。ヒトBCMA-Fc及びcyno BCMA-FcをELISAプレートにコーティングし、非特異的結合を減少させるためにBSAを使用してプレートを遮断した。CA8キメラ抗体を、5ug/ml〜0.1ug/mlの濃度範囲で、ヒト及びcyno BCMAでコーティングしたELISAプレートに加えた。必要に応じて、抗ヒトIgG HRPがコンジュゲートした二次抗体を使用していくらかの結合したヒトキメラCA8抗体を検出した。HRP基質(TMB)を加えてELISAを発展させた。これにより、ELISAアッセイにおいてCA8抗体が組換えヒト及びcyno BCMAに結合したことが示された。
結果を図2に示す。
4.3 TACIタンパク質との交差反応を決定するためのBCMA及びTACIタンパク質に対するCA8抗体結合を示すBiacore実験
CA8キメラ抗体を注入し、プロテインA上で捕捉した。(プロテインA誘導性センサチップを使用した)。残余のプロテインA結合を高濃度のヒトIgG溶液の注入により遮断した。次いでBCMA-Fc、TACI-Fc又はBAFF-R-Fc溶液を抗体に対する結合について試験した。3個のタンパク質を順に注入し、結合事象を測定した。各タンパク質の注入の間に表面を再生した。
Biaevaluationプログラムにおいてセンサグラム(sensorgram)を分析した。二重参照減算を行って、センサグラム曲線から装置雑音及びあらゆる非特異的結合を除去した。
これにより、CA8が、BCMA結合に対する結合に特異的であり、TACI及びBAFFRに特異的でないことが示された。
BCMA-Fc、TACI-Fc及びBAFF-R-Fcに対するCA8抗体の結合を図3に示すようにプロットした。
4.4 細胞結合及び中和データ
4.4.1 多発性骨髄腫細胞及びBCMA発現細胞に対するマウス抗BCMA抗体の結合
多発性骨髄腫細胞株H929及びARH77-hBCMA 10B5 BCMAを発現するトランスフェクト細胞を、5μg/mLにてマウスS332211D07、S3332121F02若しくはS332126E04又はマウスアイソタイプ対照で染色した。多発性骨髄腫細胞株H929をマウスS307118G03で染色した。細胞を室温(RT)にて20分間インキュベートし、次いでFACS緩衝液(PBS+0.5%BSA+0.1%アジ化ナトリウム)で洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞をRTにて15分間、二次PE標識化抗マウスIgG抗体とインキュベートし、次いでFACS緩衝液で洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞をFACSにより分析して、細胞に結合した抗体を検出した。
結果(図4)は、全ての4個のマウス抗体がH929多発性骨髄腫細胞株に結合し、ARH77 BCMAトランスフェクト細胞で試験した3個の抗体がそれらに結合したことを示した。
4.4.2 FACSにより決定した場合の多発性骨髄腫細胞に対するキメラCA8の結合曲線
多発性骨髄腫細胞株のパネルを使用してキメラCA8の結合を決定した。細胞株H929、OPM-2、JJN-3及びU266を、RTにて20分間、様々な濃度でキメラCA8又は関係のない抗体(シナジス(Synagis))のいずれかで染色した。次いで細胞をFACS緩衝液(PBS+0.5%BSA+0.1%アジ化ナトリウム)で洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞を、RTにて15分間、二次PE標識化抗ヒトIgG抗体とインキュベートし、次いでFACS緩衝液で洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞をFACSにより分析して、平均蛍光強度(MFI)値を測定して結合を決定した。
結果は、キメラCA8が用量依存的に多発性骨髄腫細胞株H929、OPM-2、JJN-3及びU266に結合したことを示した(図5)。
4.4.3 FACSにより決定した場合のBCMAトランスフェクト細胞に対するヒト化CA8の結合 ARH77-hBCMA 10B5 BCMA発現トランスフェクト細胞又はH929細胞を、RTにて20分間、種々の濃度でキメラCA8又はJ6M0、J6M1、J6M2、J9M0、J9M1、J9M2と指定したCA8のヒト化バリアントのいずれかで染色した。次いで細胞をFACS緩衝液(PBS+0.5%BSA+0.1%アジかナトリウム)で洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞を、RTにて15分間、二次PE標識化抗ヒトIgG抗体とインキュベートし、次いでFACS緩衝液で洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞をFACSにより分析し、平均蛍光強度(MFI)値を測定して結合を決定した。
結果は、キメラCA8及びJ9M2以外の試験した全ての抗体が、用量依存的にARH77-hBCMA 10B5 BCMA発現トランスフェクト細胞及びH929細胞に結合したことを示した(図6)。
4.5 組換えBCMAに対するBAFF又はAPRILの結合を中和するCA8及びヒト化型J6M0の能力の実証
このアッセイの目的は、BCMAリガンド、BAFF又はAPRILのいずれかの結合能力を中和するために、種々の濃度にて野生型及びアフコシル化(ポテリジェント)形態の両方において抗体CA8、及びヒト化型J6M0の能力を評価することであった。
96ウェル平底プレートを、PBS中の組換えヒトBCMA Fc4-53の1μg/mL溶液で一晩コーティングした。0.05% TWEEN20を使用した洗浄工程の後、室温にて1時間、PBS中の2%ウシ血清アルブミン溶液を用いてプレートを遮断した。プレートを上記のように洗浄し、10μg/mLで開始し、2連において2中の1で滴定した40μLの各抗体(マウスIgG、マウスCA8、及びキメラCA8)を関連ウェルに加え、室温にて1時間インキュベートした。40μlの2%BSAを関連対照ウェルに加えた。10μLの組換えヒトBAFF(2149-BF/CF、R&D Systems)又は組換えヒトAPRIL(5860-AP/CF、R&D Systems)のいずれかをそれぞれ30ng/mL及び750ng/mLで加え、各ウェルにおいてそれぞれ6ng/mL及び150ng/mLの最終濃度を得た。等価体積の2%BSAを関連対照ウェルに加えた。プレートを室温にて2時間インキュベートし、その後、それらを上記のように洗浄した。ビオチン化抗ヒトリガンド(BAFF BAF124又はAPRIL BAF884、R&D Systems)を50ng/mLにて関連ウェルに加え、1時間インキュベートした。洗浄工程の後、ストレプトアビジン-HRP(Amersham RPN4401)の50μLの1:4000希釈を各ウェルに加え、室温にて30分間インキュベートした。洗浄プロセスを再度繰り返し、その後、100μLのテトラメチルベンジジン基質溶液(T8665、Sigma)を各ウェルに加えた。プレートを室温にて20〜25分間インキュベートし、ホイル中に包んだ。100μLの1M H2SO4を加えて反応を停止した。Spectromaxリーダーを使用して450nmにて光学密度を決定した。図7A及びBを参照のこと。
BCMAに対するBAFF又はAPRILの結合を中和するためのプレートベースのアッセイにおいて、キメラCA8について計算したEC50値はそれぞれ0.695μg/mL及び0.773μg/mLであった。ヒト化J6M0についての値は0.776ng/ml及び0.630ng/mlであった。J6M0 ポテリジェント型についての値はそれぞれ0.748及び0.616ng/mlであった。
4.6 H929細胞におけるNFkBのBAFF又はAPRIL誘導性リン酸化に対するキメラ化CA8及びヒト化J6M0 BCMA抗体の効果
一セットの実験において、H-929細胞を96ウェルプレートにおいて無血清培地中で75,000個の細胞/ウェルにて播種した。キメラCA8抗体を24時間後に加えて、200ug/mlまでの最終ウェル濃度を得た。10分後、BAFF又はAPRILリガンドを細胞に加えて、それぞれ0.6又は0.3ug/mlの最終ウェル濃度を得た。30分後、細胞を溶解し、MSD pNFカッパBアッセイを使用してリン酸化NfカッパBレベルを測定した。
キメラBCMA抗体CA8は、H-929細胞においてBAFF及びAPRIL誘導性NFカッパB細胞シグナル伝達の両方を中和した。それは、APRIL誘導性NfカッパB細胞シグナル伝達についての257nMと比較して、10nMの平均IC50を有するこの細胞種類においてBAFF誘導性NfカッパB細胞シグナル伝達を中和するのに特に有効であった。
2回の実験についての平均化データ(meaned data)
IC50は、BAFF誘導性NfカッパB中和について10nMであり、APRIL誘導性NfカッパB中和について257nMであり(2回の独立した実験の平均)、それらを表7に示す。
Figure 2018087190
細胞ベース系においてAPRIL及びBAFFの中和における効力の間のこのような相違が存在する理由を理解することを目的として更なるセットの実験を実施した。BCMAの可溶性形態を発見した後、抗体結合によるBCMAの溶解の妨害を減少させるためにアッセイ前にH929細胞を洗浄するステップを含むように実験設計を変更した。H-929細胞を3回洗浄して、いくらかのsBCMAを除去し、無血清培地中に再懸濁した。J6M0ポテリジェント抗体を96ウェルプレートに加えて、BAFF又はAPRILリガンドと共に100ug/ml以下の最終濃度を得て、それぞれ0.6又は0.2ug/mlの最終濃度を得た。次いでH-929細胞を無血清培地中に7.5×104個の細胞/ウェルにて播種した。30分後、細胞を溶解し、MSD pNFカッパBアッセイを使用してリン酸化NFカッパBレベルを測定した。これは1回の実験からのデータである。各データ点は2回の反復の平均/sdである。この実験からのデータを図7cに示す。BAFF及びAPRILシグナル伝達を阻害するためのIC50をそれぞれ0.91ug/ml及び2.43ug/mlと決定した。
4.7 抗BCMA CA8キメラ及びヒト化構築物のProteOn分析
ProteON XPR36(Biorad)においてCA8キメラ及びヒト化バリアントの開始スクリーニングを行った。この方法は以下の通りであった。第一級アミンカップリングによりプロテインAをGLCチップ(Biorad、カタログ番号:176-5011)上に固定し、次いでCA8バリアントをこの表面上で捕捉し、結合曲線を二重で参照するために使用した組換えヒトBCMA(社内又は市販のUS Biological、B0410)物質(2回のみの実施))を、0nM注入(すなわち緩衝液のみ)を用いて256、64、16、4、1nMにて通過させた。使用した緩衝液はHBS-EP緩衝液である。50mM NaOHを使用して捕捉表面を再生した。ProteOn XPR36に内在している分析ソフトウェアを使用してデータを1:1モデルに適合した。実施1はヒト化CA8バリアント(J0〜J5シリーズ)の第1のスクリーニングに対応し、実施2はヒト化CA8バリアント(J5〜J9シリーズ)の第2のスクリーニングに対応する。両方の実施は25℃で行った。
実施1から得たデータを表8に示し、実施2からのデータを表9に示す。実施2(表09)におけるいくつかの分子はProteOnにより測定可能な親和性値を得ることができず、これはこのアッセイにおける機械の感度を超えるオフ速度(off-rate)に起因したが、これにより、全てのこれらの分子が組換えヒトBCMAに強固に結合していることが示される。実施1から、データは一部の構築物が組換えcyno BCMAに全く結合を示さなかったことを示す。
Figure 2018087190
Figure 2018087190
4.8 抗BCMA CA8キメラ及びヒト化構築物(J7〜J9シリーズ)のBIAcore分析
第一級アミンカップリングによりプロテインAをCM5チップ(GE Healthcare、カタログ番号:BR-1005-30)に固定し、次いでこの表面を使用して抗体分子を捕捉した。256nM、64nM、16nM、4nM及び1nMにて検体として組換えヒトBCMA(US Biological、B0410)を使用した。50mM NaOHを使用して捕捉表面の再生を行った。全ての結合曲線は緩衝液注入(すなわち0nM)により二重に参照し、T100評価ソフトウェアに内在している1:1モデルを使用してデータを適合した。ランニング緩衝液としてHBS-EPを使用して実施を37℃にて行った。
その結果により、J9M2を除いて試験した分子が、キメラ分子と同様の親和性を有して組換えヒトBCMAに結合したことが示された。この実験から生成されたデータを表10に提示する。
Figure 2018087190
4.9 抗BCMA CA8キメラ及びヒト化構築物J6M0及びJ9M0のBIAcore分析
第一級アミンカップリングによりプロテインAをCM5チップ(GE Healthcare、カタログ番号:BR-1005-30)に固定し、次いでこの表面を使用して抗体分子を捕捉した。256nM、64nM、16nM、4nM及び1nMにて検体として組換えヒトBCMA(US Biological、B0410)を使用した。50mM NaOHを使用して捕捉表面の再生を行った。全ての結合曲線は緩衝液注入(すなわち0nM)により二重に参照し、T100評価ソフトウェアに内在している1:1モデルを使用してデータを適合した。ランニング緩衝液としてHBS-EPを使用して、実験1について25℃及び37℃並びに実験2について37℃のみで実施を行った。
両方の実施は、ヒトBCMAに対する全親和性に関してJ9M0を最適な分子と識別した。この実験から生成したデータを表11に提示する。
Figure 2018087190
4.10. 新規抗BCMAキメラ構築物のProteOn分析
ProteOn XPR36(Biorad)においてハイブリドーマの第2のバッチ由来の新規キメラバリアントの開始スクリーニングを行った。この方法は以下の通りであった。第一級アミンカップリングによりプロテインAをGLMチップ(Biorad、カタログ番号:176-5012)上に固定し、次いで抗BCMAバリアントをこの表面上で捕捉し、結合曲線を二重で参照するために使用した組換えヒトBCMA(社内の物質)を、0nM注入(すなわち緩衝液のみ)を用いて256、64、16、4、1nMにて通過させた。使用した緩衝液はHBS-EP緩衝液である。50mM NaOHを使用して捕捉表面の再生を行った。ProteOn XPR36に内在している分析ソフトウェアを使用してデータを1:1モデルに適合した。実施は25℃にて行った。
この実験から生成したデータを表12に提示する。
Figure 2018087190
[実施例5]細胞死滅アッセイ
5.1 BCMAを発現するARH77細胞におけるキメラCA8及び脱フコシル化キメラCA8型のADCC効力
ヒトナチュラルキラー(NK)細胞を、2時間、5:1のE:T比にて種々の濃度の抗体の存在下で、ユーロピウム標識したARH77 BCMAトランスフェクト標的細胞(10B5)とインキュベートした。標的細胞からのユーロピウムの放出を測定し、特異的溶解を計算した。
結果:キメラCA8及び脱フコシル化キメラCA8は、ADCCによりBCMA発現標的細胞を死滅させた。脱フコシル化キメラ抗体は、試験した全ての標的細胞で達成した、より高い割合の溶解により測定した場合、十分に有効なADCC活性、及び親キメラ抗体と比較して、高BCMA発現標的細胞株10B5において10倍低いEC50を示した。図8A及び8Bを参照のこと。
5.2 ARH77 BCMA発現標的細胞及びエフェクターとしてPBMCを使用したCA8ヒト化抗体のADCC活性
ヒトPBMCを、2時間、5:1のE:T比にてCA8抗体の種々の濃度のヒト化型(5ug/ml〜0.005ug/ml)の存在下で、ユーロピウム標識したARH77 BCMAトランスフェクト標的細胞(10B5)とインキュベートした。標的細胞からのユーロピウムの放出を測定し、特異的溶解を計算した。
結果:
結果:CA8のヒト化型のJ5、J6、J7、J8及びJ9シリーズの全ては、用量依存的にARH77高BCMA発現細胞株10B5に対してADCC活性を示した。ADCCは、キメラCA8分子を使用した実験において見出されたものと同様のレベルであった。図9を参照のこと。
5.3 エフェクター細胞として精製したNK細胞を用いてBCMAを発現するARH77 10B5細胞に対するキメラS322110F02、S322110D07及びS307118G03及びヒト化S307118G03 H3L0のADCC効力
ヒトナチュラルキラー(NK)標的細胞を、2時間、5:1のE:T比にて種々の濃度の抗体の存在下で、ユーロピウム標識したARH77 BCMAトランスフェクト標的細胞(10B5)とインキュベートした。標的細胞からのユーロピウムの放出を測定し、特異的溶解を計算した。
結果:試験した全ての4個の抗体はARH77 10B5細胞に対してADCC活性を示した。図10を参照のこと。
5.4 キメラCA8 ADCの抗体-薬物コンジュゲート(ADC)活性
ヒト多発性骨髄腫細胞株に対するキメラCA8抗体、キメラCA8-mcMMAF抗体薬物コンジュゲート及びキメラCA8-vcMMAE抗体薬物コンジュゲートのADCC活性を測定する。キメラCA8抗体-薬物コンジュゲートを用いて多発性骨髄腫細胞株を処理して、成長阻害及び死に必要なADC濃度を決定した。
試験した抗体薬物コンジュゲートを、1ug/ml〜5ng/mlの範囲の濃度にて多発性骨髄腫細胞を含有するウェルに加えた。プレートを37℃にて96時間インキュベートし、その時点でCell titre Gloを使用して生存細胞を定量した。コンジュゲートしていないキメラCA8抗体は、試験した抗体濃度にて有意な成長阻害活性を示さなかった。キメラCA8-mcMMAF抗体-薬物コンジュゲートは、試験した多発性骨髄腫細胞株の4個全てにおいてキメラCA8-vcMMAE抗体-薬物コンジュゲートより高い成長阻害活性を示した。図11及び表13を参照のこと。
Figure 2018087190
5.5 ヒト多発性骨髄腫細胞株H929に対するキメラCA8抗体、キメラCA8-mcMMAF抗体薬物コンジュゲート及びキメラCA8-vcMMAE抗体薬物コンジュゲートの細胞周期停止活性の測定。
(ADCの)キメラCA8抗体薬物コンジュゲートが多発性骨髄腫細胞において成長阻害を引き起こす機構を決定するために、キメラCA8抗体及びキメラCA8 ADC処理後の複数の時点での固定細胞プロピジウムヨウ化物染色により細胞DNA含量測定することによってNCI-H929細胞をモニターした。
試験したキメラCA8 ADC濃度(50ng/mL)にて、キメラCA8-mcMMAF ADCは有意なG2/M細胞周期停止(4N DNA含量)を引き起こし、それは48時間で最大になった。その後、48、72及び96時間の時点にて、キメラCA8-mcMMAF ADCによる処理の結果、サブ-2N DNA含量を含む細胞集団の蓄積が生じ、これは細胞死を表す。試験した50ng/mLの濃度にて、キメラCA8-vcMMAE ADCは、G2/M細胞周期停止又はサブ-G1蓄積に対して有意な効果を有さなかった。図12を参照のこと。
5.6 キメラCA8-mcMMAF抗体薬物コンジュゲート及びキメラCA8-vcMMAE抗体薬物コンジュゲートにより誘導される有糸分裂停止についてのマーカーとしてのホスホ-ヒストン-H3(Thr11)染色
4N DNA含量を有する細胞の蓄積が、キメラCA8により誘導される有糸分裂停止の特異的結果であるかどうかを決定するために、増加させた濃度のコンジュゲートしていないキメラCA8、キメラCA8-vcMMAE又はキメラCA8-mcMMAFによる48時間の処理後、抗ホスホ-ヒストンH3抗体を用いてADC NCI-H929細胞を染色した。
キメラCA8 ADCによる処理の結果、65エロキシジ-ヒストンH3(Thr11)、有糸分裂細胞の特異的マーカーについて陽性染色したNCI-H929細胞の用量依存性蓄積が生じた。キメラCA8-mcMMAF ADCにより、キメラCA8-vcMMAE ADCより低い濃度で65エロキシジ-ヒストンH3陽性細胞の蓄積が生じた。図13を参照のこと。
5.7 アネキシンVを染色することによるキメラCA8 ADCに反応するNCI-H929細胞におけるアポトーシスの測定
サブ-2N DNA含量を有する細胞の蓄積が、キメラCA8 ADCにより誘導されるアポトーシスの特異的結果であるかどうかを決定するために、増加させた濃度のコンジュゲートしていないキメラCA8、キメラCA8-vcMMAE又はキメラCA8-mcMMAFによる48時間の処理後、NCI-H929細胞を抗アネキシン-V抗体で染色した。キメラCA8 ADCによる処理の結果、アポトーシスの特異的マーカーである、アネキシン-Vについて陽性染色したNCI-H929細胞の用量依存性蓄積が生じた。キメラCA8-mcMMAF ADCにより、キメラCA8-vcMMAE ADCより低い濃度にてアネキシン-V陽性細胞の蓄積が引き起こされた。図14を参照のこと。
5.8 CA8抗BCMA抗体-薬物コンジュゲートのヒト化バリアントの抗体-薬物コンジュゲート(ADC)活性
細胞を96ウェルプレート中に播種した(100μLのRPMI+10%FBS入りの1個のウェル当たり4,000個の細胞)。細胞播種の6時間後にネイキッド抗体又はADCを加え、プレートを144時間インキュベートした。抗体又はADCCの存在下で増殖阻害を、Cell Titre gloを使用して144時間に測定した。データ点は、三連のCellTiterGlo測定の平均を表す。エラーバーは標準誤差を表す。
多発性骨髄腫細胞株NCI-H929及びOPM2をヒト化CA8抗BCMA抗体-薬物コンジュゲートにより処理して、成長阻害及び死に必要なADC濃度を決定した。これらの抗体のmcMMAF及びvcMMAE抗体-薬物コンジュゲート形態は、CA8キメラにより見出されたものと比較して有意な成長阻害活性を示した。バリアントJ6M0はキメラより高い効力を示し、データを図15においてH929細胞及びOPM2細胞で示す。mcMMAF抗体-薬物コンジュゲートは、試験した両方の細胞株において全ての抗体についてvcMMAE抗体-薬物コンジュゲートより高い成長阻害活性を示した。全てのヒト化バリアントについての結果を表14に示す。
Figure 2018087190
5.9 他のマウス抗BCMA抗体-薬物コンジュゲートの抗体-薬物コンジュゲート(ADC)活性 細胞を96ウェルプレート中に播種した(100μLのRPMI+10%FBS入りの1個のウェル当たり4,000個の細胞)。細胞播種の6時間後に抗体又はADCを加え、プレートを144時間インキュベートした。ADCの存在下で成長阻害を、Cell Titre gloを使用して144時間に測定した。三連のCellTiterGlo測定の平均を表す。表15a及び15bは異なるシリーズの抗体で異なる時間に行った実験からである。多発性骨髄腫細胞株NCI-H929及びU266-B1を表15aにおいて抗体について使用した。
マウス抗体S322110D07、S332121F02及びS332136E04のmcMMAF及びvcMMAE抗体-薬物コンジュゲート形態は有意な成長阻害活性を示した。mcMMAF抗体-薬物コンジュゲートは、活性が見られた試験したマウス抗BCMAの全てにおいてvcMMAE抗体-薬物コンジュゲートより高い成長阻害活性を示した。IC50の図は表15aに示す。これらの3個の抗体及びまたS107118G03についての用量反応曲線に関しては図16を参照のこと。エラーバーは標準誤差を表す。表15bにおける抗体についてのNCI-H929、U266-B1、JJN3及びOPM2細胞を異なるシリーズのマウス抗BCMA抗体-薬物コンジュゲートにより処理して、成長阻害及び死に必要なADC濃度を決定した。IC50の図を表15bに示す。その表に示した5個の抗体全ては有意なADC活性を有した。
Figure 2018087190
Figure 2018087190
5.10 コンジュゲートした、アフコシル化J6M0(ポテリジェント)のADCC効力
MMAE又はMMAFにコンジュゲートしたアフコシル化J6M0を、そのADCC活性がコンジュゲーションによって支障を来されないことを確実にするためにBCMA形質転換体を使用してADCCアッセイにおいて試験した。PBMC(PBMC:標的細胞の比50:1)を加える前に、ユーロピウム標識したARH77-10B5細胞を、10000ng/ml以下の濃度にて30分間、種々のJ6M0 WT及びポテリジェントBCMA抗体とインキュベートした。2時間後、細胞培地のアリコートをサンプリングし、強化溶液と混合した。プレート振盪器で30分後、ユーロピウムの放出をVictor 2 1420マルチラベルリーダーでモニターした。データ点は三連の値の平均を表す。このデータは2回の実験を表す。
J6M0ポテリジェントのコンジュゲートしていない形態とADC形態との間にADCC効力において有意な相違はなかった。同じ実験において、どれくらいの効力がアフコシル化型と匹敵するかを示すためにJ6M0の野生型が含まれた。予想される通りに、脱フコシル化の結果、より低いEC50及びより高い最大溶解が生じた。J6M0のFc無効形態では溶解は観測されなかった(図17)。
5.11 MM細胞株に対するアフコシル化J6M0のADCC効力
ヒトPBMCを、種々の濃度のアフコシル化(ポテリジェント)J6M0の存在下で50:1のE:T比にて多発性骨髄腫標的細胞とインキュベートした。18時間後にエフェクター+標的細胞混合物中に残存している標的細胞の割合を、標的細胞を検出するために蛍光標識抗CD138抗体を使用してFACSにより測定し、溶解の割合を計算した。これはいくつかの実験の代表である。
J6M0ポテリジェント抗体は、試験した5個の多発性骨髄腫細胞株全てに対してADCC活性を示した。このことは、初期の研究がトランスフェクト細胞を使用して行われたので、試験することが重要であった。結果を図18に示す。複数のドナーを含む完全なデータセットを表16に示す。効力は全て、形質転換体により見出されたものと同様の範囲であった。ADCC活性はこれらの細胞株でのBCMA表面発現に直接関連していなかった。
Figure 2018087190
[実施例6]異種移植片データ
6.1 インビトロで検出された抗体効力がインビボでも実証され得ることを確実にするためにヒトMM細胞株のマウス異種移植片を試験した。異種移植片研究について選択した細胞株は、インビトロで死滅するADC及びADCCに感受性があるNCI-H929であった。T及びB細胞を欠くが、ADCC活性を可能にするNK細胞を維持する免疫不全CB.17 SCIDマウスにおいて研究を行った。しかしながら、ヒトIgG1はマウスFc受容体と会合できるが、ポテリジェント増強は、ヒトFc受容体を用いて行う場合、親和性を改良しないことに留意すべきである。
6.2 NCI-H929腫瘍成長に対するコンジュゲートしていない及びMMAE又はMMAFがコンジュゲートしたJ6M0の影響
J6M0のADCC及びADCの両方の活性を独立して分析するために、我々はMMAF又はMMAEコンジュゲーションの存在下及び非存在下でJ6M0抗体を試験した。コンジュゲートしていないJ6M0を試験することによって、いくらかの抗腫瘍効果は、ADCC及び機能的阻害活性の一部の組み合わせが原因となるようであった。
平均で200mm3の体積に到達したNCI-H929腫瘍を有するマウスを、2週間にわたって、50ug又は100ugの用量で1週間に2回、ヒトIgG1対照又はJ6M0抗体(コンジュゲートしていないMMAE又はMMAF)を用いて試験した。この研究からの結果により、100ug用量のJ6M0-MMAFコンジュゲートが、投薬を完了したこれらのマウスにおいて腫瘍の除去を生じたことが示される。最後の投薬後、J6M0-MMAFマウスを40日間維持し、腫瘍発生の再発はなかった。この実験からのこれらの結果により、MMAFコンジュゲーションが、コンジュゲートしていないJ6M0抗体及びJ6M0-MMAEコンジュゲートの両方より抗腫瘍活性を増加させたことが実証される。図19を参照。
[実施例7]MM患者血清由来の可溶性BCMAレベルの評価
7.1 BCMAが細胞外に存在し、血液中で検出され得るかどうかは現在知られていない。この研究において、我々はMM患者由来のヒトBCMAの血清レベルを決定した。54個のMM及びプラズマ細胞悪液質の患者由来の血清試料並びに20個の正常対照試料をELISAにより分析した。ヒト被験体の承認はWestern Institutional Review Boardから得た。
7.2 血清ヒトBCMAレベルの評価
診療所において患者及び正常対照由来の血液を血清回収管中に回収した。MM患者の試料は種々の段階(進行、寛解、再発、新たに診断された、及びその他)由来であった。血液試料を10分間10,000rpmにて回転させ、血清を無菌微小遠心管内に移した。
可溶性ヒトBCMAレベルを測定する、R&D Systems製のヒトBCMA/TNFRSF17 ELISAキット(カタログ番号DY193E)を使用して、キットが供給されている標準的なプロトコルの後にBCMAを検出した。
簡潔に述べると、96ウェルマイクロプレートを100ul/ウェルの捕捉抗体でコーティングし、4℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液(PBS中に0.05%Tween20、pH7.2)で3回洗浄し、室温にて2時間、PBS中の1%BSA 300ulで遮断した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。100ulの血清試料又は標準物を各ウェル内に加え、室温にて2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、次いで100ulの検出抗体を各ウェルに加え、室温にて2時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した後、100ulのストレプトアビジン-HRPを各ウェルに加え、暗室で20分間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、50ulの停止溶液を加え、次いで570nM波長を用いてマイクロプレートリーダーにより測定した。
存在したBCMAのレベルに適した血清希釈係数を測定するために一連のアッセイを実施した。1:500の希釈係数が大部分の試料に適切であると見出し、それは図20に示したデータに使用した希釈係数である。完全なデータセットを表17に示す。
三連で希釈し、実施した患者及び正常な対照血清試料は測定したBCMAレベルを有した。BCMAの血清レベルは、この研究において正常な対照と比較してMM患者由来の血清において顕著に増加した。疾患サブセットを更に分けた場合、寛解におけるものと比較して、進行性MM患者由来の血清中でBCMAの血清レベルが増加する傾向が存在した。これはいくらかのヒト疾患において血清BCMAを識別する最初の報告であり、これらのレベルが、MM患者の、及びプラズマ細胞媒介性疾患を患っている他の患者についての疾患状態及び治療反応をモニターするための新規バイオマーカーであり得ることを示唆している。
Figure 2018087190
P-値(片側T検定、95%有意性)
〜1-500 単一
正常対進行性:p=.0010*
進行性対寛解:p=.0146*
〜1-500 三連
正常対進行性:p=.0004*
進行性対寛解:p=.0091*
〜1-50 試行1
正常対進行性:p=.0171*
進行性対寛解:p=.0777
〜1-50 試行2
正常対進行性:p=.0184*
進行性対寛解:p=.0876
*は有意性を示す。
Figure 2018087190
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配列表
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Claims (31)

  1. BCMAに特異的に結合し、且つBCMAに対するBAFF及び/又はAPRILの結合を阻害する抗原結合タンパク質であって、FcγRIIIAに結合できるか、又はFcγRIIIA媒介性エフェクター機能であり得、且つ内在化できる、前記抗原結合タンパク質。
  2. FcγRIIIAに対する増強された結合を有するか、又は増強されたFcγRIIIA媒介性エフェクター機能を有する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. 抗原結合断片が、増強されたADCCエフェクター機能を有する、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  4. 脱フコシル化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  5. 抗原結合断片がTaciに結合しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  6. 配列番号３のCDRH3又は配列番号３のバリアントを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  7. 配列番号１のCDRH1、CDRH2:配列番号２、CDRL1:配列番号４、CDRL2:配列番号５及び/又はCDRL3:配列番号６のうちの1以上を更に含む、請求項６に記載の抗原結合タンパク質。
  8. i)配列番号３に記載されるCDRH3、
    ii)配列番号１に記載されるCDRH1、及び
    iii)配列番号２に記載されるCDRH2、
    を含む、請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
  9. i)配列番号３に記載されるCDRH3、
    ii)配列番号１に記載されるCDRH1、
    iii)配列番号２に記載されるCDRH2、
    iv)配列番号４に記載されるCDRL1、
    v)配列番号５に記載されるCDRL2、及び
    vi)配列番号６に記載されるCDRL3、
    を含む、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
  10. 配列番号２３又は配列番号２７又は配列番号２９のいずれか1つによりコードされる重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  11. 配列番号３１又は配列番号３３のいずれか1つによりコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  12. 配列番号２３によりコードされる重鎖可変領域及び配列番号３１によりコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  13. 配列番号２７によりコードされる重鎖及び配列番号３１によりコードされる軽鎖を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  14. ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  15. 前記抗体がIgG1アイソタイプである、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
  16. 請求項６〜９のいずれか１項に記載のCDRを含み、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離されたVH又は単離されたVLである断片である、抗原結合タンパク質。
  17. 非ヒト霊長類BCMAに更に結合する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  18. 150pMより強い親和性でBCMAに結合する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む、免疫コンジュゲート。
  20. 抗原結合タンパク質がリンカーを介して細胞傷害剤に結合される、請求項１９に記載の免疫コンジュゲート。
  21. 細胞傷害剤がアウリスタチン又はドロスタチンである、請求項１９又は２０に記載の免疫コンジュゲート。
  22. 細胞傷害剤がMMAE及びMMAFから選択される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
  23. 細胞傷害剤が抗原結合タンパク質に共有結合される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
  24. リンカーが切断可能なリンカーである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
  25. リンカーが切断可能でないリンカーである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
  26. リンカーが、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、バリン-シトルリン(val-cit)、アラニン-フェニルアラニン(ala-phe)、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PAB)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(SMCC)、及びN-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(SIAB)から選択される、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
  27. 免疫コンジュゲートが、腫瘍細胞と接触した場合、腫瘍細胞により貪食される、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
  28. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又は免疫コンジュゲート及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  29. 炎症性障害又は疾患を患っているヒト患者を治療する方法であって、請求項２８に記載の組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  30. 多発性骨髄腫(MM)又は慢性リンパ球性白血病(CLL)などのB細胞リンパ腫を患っているヒト患者の治療における請求項２７に記載の組成物の使用。
  31. 多発性骨髄腫(MM)又は慢性リンパ球性白血病(CLL)などのB細胞リンパ腫を患っているヒト患者を治療するのに使用するための請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又は免疫コンジュゲート。
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