JP2018085954A

JP2018085954A - プラスチック基材及び血液標本の作製方法

Info

Publication number: JP2018085954A
Application number: JP2016230988A
Authority: JP
Inventors: 宗明橋本; Muneaki Hashimoto; 山村　昌平; Shohei Yamamura; 昌平山村; 寛和坂本; Hirokazu Sakamoto; 正俊片岡; Masatoshi Kataoka
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2018-06-07

Abstract

【課題】高価な装置のない環境下で熟練者でなくても容易にマラリア原虫を検出できる技術を提供する【解決手段】ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°である、血液中のマラリア原虫観察用のプラスチック基材。【選択図】なし

Description

本発明は、プラスチック基材及び血液標本の作製方法に関する。

マラリアはハマダラカを媒体として人体に注入されたマラリア原虫に感染して発病する感染症であり、ヒトに感染するマラリア原虫には熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）の４種類があり、世界中で年間３〜５億人がマラリアに罹患し、死者１５０〜２７０万人と推定されている。

マラリア感染症に対しては、重篤症状を回避するため早期発見・早期治療が重要である。マラリアの診断は、血液塗抹標本を光学顕微鏡で観察することにより行われるが、従来の血液塗抹標本では、赤血球の凝集がなくマラリア原虫を観察できる部分が少なく、また、赤血球の形状が細長くなり、マラリア原虫の種類と感染率を正確に検出するために熟練が必要であった。

特許文献１は、マラリア原虫の存在の有無を判定する方法と装置を開示する。

特開2007-24844

マラリアはアフリカが主な発生地域であるので、複雑な装置を使用せず、簡便かつ安価な検査法が求められている。

本発明は、高価な装置のない環境下で熟練者でなくても容易にマラリア原虫を検出できる技術を提供することを目的とする。

本発明は、以下のプラスチック基材及び血液標本の作製方法を提供するものである。
項１．ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°である、血液中のマラリア原虫観察用のプラスチック基材。
項２．前記基材が透明基材である、項１に記載のプラスチック基材。
項３．プラスチックがポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ABS樹脂、アクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂からなる群から選ばれる、項１又は２に記載の透明樹脂。
項４．以下の工程１〜４を含む、マラリア原虫観察用の血液標本の作製方法：
工程１：項１〜３のいずれかに記載のプラスチック基材に血液サンプルを適用する工程、
工程２：工程１で得られたプラスチック基材を含水アルコール溶液に接触させて重層した赤血球を除去する工程、
工程３：工程２で得られたプラスチック基材を乾燥後、赤血球を固定する工程、
工程４：固定された赤血球を染色する工程。

本発明のプラスチック基材は、マラリア原虫を観察可能な領域が広く、赤血球が球形であるのでマラリア原虫の鑑別が容易であり、感染率が低い感染者の原虫の発見が容易になる。

マラリア原虫観察用の血液標本の１つの作製方法を示す。スライドガラスと本発明のプラスチック基材を用いた標本の比較接触角の異なるプラスチック基材の結果を示す。本発明のプラズマ処理されたプラスチック基材を用いた結果を示す。矢印は赤血球に寄生するマラリア原虫を示す。

本明細書において、基材を構成するプラスチックとしては、透明なプラスチックが好ましい。透明なプラスチックとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ABS樹脂、アクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂が挙げられる。

プラスチック基材は、必要に応じて表面を親水化処理することができる。親水化処理としては、プラズマ処理、紫外線処理、電子線処理などの物理的処理、親水性物質のコーティング、オゾン処理などの化学的処理が挙げられる。親水性物質としては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリウレタン、アクリル酸およびメタクリル酸のホモポリマーおよびコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、マレイン酸無水物系コポリマー、ポリエチレンイミン、ポリエチレンオキシド、ポリ（カルボン酸）、ポリホスファゼン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヘパリン、デキストラン、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ゼラチン、キチン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、コラーゲン、アルブミンなどが挙げられる。

本発明の基材は、ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°、好ましくは８〜３８°、より好ましくは１０〜３１°である。

本発明の基材は顕微鏡観察されるので、平らな基材が好ましい。基材の形状は特に限定されないが、例えばスライドガラスのような長方形の基材が好ましい。

本発明のマラリア原虫観察用の血液標本の作製方法の一例を図１に示す。
（１）プラスチック基材の親水化処理
プラスチック基材は、適度は親水性を有するプラスチックで構成している場合には親水化処理は必ずしも必要ないが、プラスチックの表面が疎水性の場合、親水化処理を行うことが好ましい。親水化処理は、酸素プラズマなどのプラズマ処理、ＵＶ処理、電子線処理などの物理的処理が好ましい。親水化処理は、基材表面の水（ヘマトクリット値１％の血液）の接触角が適切な範囲になるように行う。
（２）血液サンプルのプラスチック基材への適用
本発明のプラスチック基材は、適切な親水性を有しているので、血液サンプルを適用すると基材表面で広がり、広範囲でのマラリア原虫の観察が可能である。血液サンプルは、スポイド、ピペットなどによりプラスチック基材に適用することができる。血液サンプルは、血液を希釈せずに用いてもよいが、好ましくは希釈した血液サンプルを使用する。血液サンプルのヘマトクリット値は、５〜０．１％程度、好ましくは３〜０．５％程度、より好ましくは１％程度である。血液の希釈には、水、生理食塩水、緩衝液、細胞培養液などを用いることができる。ヒトの血液のヘマトクリット値は、３０〜５５％程度であるので、血液サンプルは、１０〜１００倍程度、好ましくは３０倍〜５０倍程度に希釈してプラスチック基材に適用するのが好ましい。
（３）洗浄処理
血液サンプルをプラスチック基材に適用することで、血液サンプルは拡散し、赤血球は基材表面に接着する。血液サンプルは、基材に接着していない赤血球を含み、この余分な赤血球が重層することで顕微鏡観察によるマラリア原虫の検出を妨げるので、重層した赤血球を除去する洗浄処理を行う。洗浄処理後には、重層した赤血球は除去され、単層で非凝集の赤血球がプラスチック基材上に残ることになる。

洗浄処理は、含水アルコール溶液にプラスチック基材を接触させることにより行うことができる。含水アルコール溶液とプラスチック基材の接触は、プラスチック基材上に含水アルコールをピペットなどで供給し、余分な赤血球を流出させることで行ってもよいが、好ましくは赤血球が付着したプラスチック基材を含水アルコール溶液に浸漬することが好ましい。浸漬時間は特に限定されないが、例えば３〜３０秒程度、好ましくは５〜２０秒程度であり、浸漬温度は、室温〜４０℃程度が好ましい。

含水アルコールのアルコール濃度は５〜２０容量％程度、好ましくは１０容量％程度である。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコールが挙げられ、好ましくはエタノールである。

含水アルコール溶液はこれらアルコールと水、生理食塩水などの溶液であってもよく、アルコールと緩衝液（クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など）、細胞培養液（D-MEM、E-MEM、RPMI 1640など）を含む溶液であってもよい。
（４）乾燥処理
洗浄処理で得られたプラスチック基材は、乾燥処理し、基材に赤血球を結合させて次の固定処理で赤血球が剥がれないようにする。乾燥処理では、水分をできるだけ蒸発させる。乾燥処理は、例えばドライヤーの熱風を送り、速やかに乾燥させる。ドライヤーを用いた熱風処理の時間は、２０〜６０秒程度、好ましくは２０〜４０秒程度である。
（５）固定処理
乾燥されたプラスチック基材は、赤血球の固定処理を行う。固定処理は、アルデヒド（グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなど）、アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）、酢酸、アセトンなどの固定剤を用いて行うことができる。固定剤は、１種単独でもよく、２種以上を混合してもよい。固定処理は、プラスチック基材を固定剤の溶液に浸漬して行うことができる。固定処理は、１〜５分程度で行うことができる。
（６）染色処理
染色処理としては、ギムザ染色、ロマノフスキー染色、ライト染色、メイギムザ染色、ライトギムザ染色、ペルオキシターザ染色などが挙げられ、ギムザ染色が好ましい。

ギムザ染色は、リン酸緩衝液などの中性付近の緩衝液、生理食塩水、蒸留水などの溶媒1mlにつきギムザ液を1〜2滴の割合で混合し、15分〜90分程度反応させることにより行うことができる。染色が終了したら、染色液を水洗し、風乾させることで、顕微鏡観察用の血液標本を得ることができる。

顕微鏡は、光学顕微鏡を使用することができ、倍率は、２００〜１０００倍程度が挙げられる。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１及び比較例１〜２
基材として、スライドグラス（比較例１）、プラズマ非処理のプラスチックプレート（比較例２）、又は、プラズマ処理プラスチックプレート（実施例１、環状オレフィン・コポリマー（COC））にヘマトクリット値１％の血液サンプルをスポイドで滴下し、基材上に赤血球を拡げた（図２）。

プラスチック基材を１０％エタノールを含むＲＰＭＩ１６４０溶液に１０秒間浸漬し、取り出した後ドライヤーで２０〜３０秒間、乾燥した。次いで常法に従いメタノールで赤血球を固定後、ギムザ染色、水洗、風乾して血液標本を作製した。

得られた血液標本（実施例１，比較例２）、血液塗抹標本（比較例１）を各倍率で光学顕微鏡により観察した。結果を図２〜４に示す。

本発明のプラズマ処理されたプラスチック基材は円形に近い赤血球の形状であり、かつ、凝集していないので、マラリア原虫の感染率と種類を用意に鑑別できる。また、感染率が低い血液サンプルであってもマラリア感染を鑑別できる。

一方、スライドガラスを基材として用いた血液塗抹標本の場合、赤血球の形状が細長くなり、マラリア原虫の種類を検出するのが難しかった。さらに、標本上の赤血球を観察できる部分が非常に少ない。さらに、赤血球の密度が低いところでも凝集しているので、マラリア原虫の十分な検査ができなかった。

Claims

ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°である、血液中のマラリア原虫観察用のプラスチック基材。
前記基材が透明基材である、請求項１に記載のプラスチック基材。
プラスチックがポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ABS樹脂、アクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の透明樹脂。
以下の工程１〜４を含む、マラリア原虫観察用の血液標本の作製方法：
工程１：請求項１〜３のいずれかに記載のプラスチック基材に血液サンプルを適用する工程、
工程２：工程１で得られたプラスチック基材を含水アルコール溶液に接触させて重層した赤血球を除去する工程、
工程３：工程２で得られたプラスチック基材を乾燥後、赤血球を固定する工程、
工程４：固定された赤血球を染色する工程。