JP2018081027A - バイオセンサ用電極の表面修飾方法 - Google Patents

Abstract

【課題】電極表面に結合する抗体の量を調節しつつ、非特異的修飾を抑制することができるバイオセンサ用電極の表面修飾方法の提供。
【解決手段】電極表面に、カルボキシ基を有する自己組織化単分子膜を形成する工程、前記自己組織化単分子膜のカルボキシ基をスクシンイミド化する工程、ならびに、抗体とアルカノールアミンとを同時に前記自己組織化単分子膜に適用する工程を含むバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、バイオセンサ用電極の表面修飾方法に関する。特に電気化学測定に用いることのできるバイオセンサ電極の表面修飾方法に関する。

様々な分野において、血液などの体液、食品、工場排水などの検査試料から試料中に含まれるペプチドやタンパク質といった生体物質、細胞、微生物などを、酵素反応や抗原抗体反応などを用いて検出・測定するためのセンサが種々開発されている。

例えば、抗原抗体反応を用いる表面プラズモン共鳴法を利用したセンサでは、通常センサチップ上に抗体を固定した抗原認識表面を作製し、フローセルと呼ばれる微小な流路に測定試料を添加し、チップ上で生じた抗原抗体反応による重量変化を屈折率の変化として光学的に測定する。特許文献１では、このようなバイオセンサに用いられる抗原認識表面の製造方法として、カルボジイミド法を用いて基板表面上のカルボキシ基をスクシンイミド化し、抗体のアミノ酸側鎖のアミノ基とアミド結合を形成させることにより抗体を固定し、ついで、未反応のスクシンイミド基をエタノールアミンで不活性化する方法が用いられている（図３参照）。

特開２０１３−１７７３３７号公報

特許文献１では、抗体の固定量は、特に制御されておらず、その用途からも抗体をより多く結合しようとするものであると考えられるが、インピーダンス測定やサイクリックボルタンメトリーなどの電気化学測定を用いる場合には、電極表面に抗体が過度に結合すると、その後の抗原の検出におけるインピーダンス等の変化率が小さくなり、検出精度が低下する問題があった。

また、抗体密度を小さくするため、作用させる抗体濃度を低くすると、未反応の活性末端が増加し、不活性化処理の前に加水分解して電極表面にカルボキシ基を生じ、非特異的吸着が増加して十分な検出精度が得られないという問題があった。

そこで、本発明は、電極表面に結合する抗体の量を所望のものとし、非特異的修飾を抑制することができるバイオセンサ用電極の表面修飾方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成するため、スクシンイミド化により活性化した自己組織化単分子膜のカルボキシ基に抗体を固定化する際に、アルカノールアミンを抗体と同時に供給することにより、電極表面に結合する抗体の量を所望のものとしつつ、非特異的修飾を抑制できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
［１］電極表面に、カルボキシ基を有する自己組織化単分子膜を形成する工程、前記自己組織化単分子膜のカルボキシ基をスクシンイミド化する工程、ならびに抗体とアルカノールアミンとを同時に前記自己組織化単分子膜に適用する工程を含むバイオセンサ用電極の表面修飾方法、
［２］抗体が、免疫グロブリン、またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂もしくはＦａｂ’である上記［１］記載の表面修飾方法、
［３］バイオセンサが電気化学測定を用いるものである上記［１］または［２］記載の表面修飾方法、ならびに、
［４］電気化学測定が、インピーダンス測定である上記［３］記載の表面修飾方法、
に関する。

本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法によれば、電極表面に結合する抗体の量を所望のものとし、かつ非特異的修飾を抑制できるバイオセンサ用電極を提供することができ、これにより、バイオセンサの測定手段としてインピーダンス測定などの電気化学測定を利用することが可能となる。

また、本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法によれば、抗体の固定化と活性化された官能基の不活性化とを同時に行うことができるため、工程を簡略化することができる。

本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法を説明するフローチャートである。 本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法の一例の説明図である。 従来のバイオセンサ用電極の表面修飾方法の一例の説明図である。

本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法について、添付の図１および２を参照して説明するが、本発明はこれらの形態に限定されるものではなく、以下に説明する部材、材料等は、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができるものである。また、図面において、同一符号は同等あるいは同一のものを示す。図１には本発明の表面修飾方法を説明するフローチャートを、図２にはその説明図をそれぞれ示している。特に図２は本発明の理解を助けるための説明図であり、各構成要素間の大きさや位置関係、分子中のアルキル鎖の鎖長などは便宜上のものであり、実態を反映したものではない。

本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法においては、まず、図１のフローチャートのＳ１工程に示すように、電極１表面に、カルボキシ基を有する自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）２を形成し、次に図１のフローチャートのＳ２工程に示すように、前記自己組織化単分子膜２のカルボキシ基をスクシンイミド化する（図２参照）。ついで、図１のフローチャートのＳ３工程に示すように、この活性化された表面に、抗体３およびアルカノールアミンを同時に適用し、抗体３の固定とスクシンイミド基の不活性化とを同時に行う（図２参照）ことを特徴とする。

電極１は、電気化学測定に用いることができるものであれば、特に限定されるものではないが、チオール基やジスルフィド基を介して形成されるＳＡＭを用いる場合には、硫黄が金属、特に貴金属に対して高い吸着性と高配向性を有するため、金、白金、銀および銅からなる群から選択することが好ましく、特に金または白金がより好ましい。なかでも、金は、化学的に不活性であり、信号の発生効率が良く、チオール基の吸着力が極めて強いことから特に好ましい。また、電極としては、ガラス基板などに金属薄膜が積層されているものなどを用いることもできる。

ＳＡＭ２は、基板を有機分子を含む溶液に浸漬または有機分子を含む蒸気中に置くことにより、有機分子の官能基、例えばチオール基が基板表面に化学吸着され、自発的に該基板表面に形成される高密度かつ高配向な単分子膜を意味する。具体的には、アルキルチオールやジスルフィド化合物からなるＳＡＭや、固定基としてチオールを有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を配向させたＳＡＭ、ベンゼン環を有するＳＡＭ、炭素鎖長の異なるアルキルチオール類を混合したＳＡＭなどが挙げられる。これらＳＡＭ構成分子は、基板に化学吸着される官能基とは別に、ＳＡＭ表面に特性を持たせるための官能基を有することができる。例えば、本発明においては、基板に化学吸着される官能基と反対の末端にカルボキシ基を有するＳＡＭ構成分子を用いることで、特別な工程を経ることなくＳＡＭ表面にカルボキシ基を有するＳＡＭを形成することができる。また、もちろん、ＳＡＭを構成した後、カルボキシ基以外の表面の官能基をカルボキシ基に変換することにより形成することもできる。

カルボキシ基を有するＳＡＭ構成分子としては、特にカルボキシ基を末端に有するアルキルチオールを用いることができる。カルボキシ基を末端に有するアルキルチオールのアルキル部分の炭素数は、適宜選択することが可能である。具体的には、末端にカルボキシ基を有する、ヘキシルチオール、ヘプチルチオール、オクチルチオール、ノニルチオール、デカンチオール、ウンデカンチオール、ドデカンチオール、トリデカンチオール、テトラデカンチオール、ペンタデカンチオール、ヘキサデカンチオール、およびそれら各々に対応する、２分子がＳ−Ｓ結合したジスルフィドなどが挙げられる。これらは単独で用いても良く、また２種以上併用しても良い。

Ｓ２工程であるＳＡＭ表面のカルボキシ基のスクシンイミド化は、カルボジイミド法などのカルボキシ基とアミノ基とのアミド結合形成のための活性中間体を得るためのものである。具体的には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドやその塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどと共に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やその水溶性類似体であるスルホＮＨＳを作用させ、カルボキシ基をスクシンイミド化して比較的安定な活性中間体を得ることができる。

次に、この活性中間体を有するＳＡＭ２表面に抗体３とアルカノールアミンとを反応させると、抗体３とアルカノールアミンとが競合するため、一定の割合で活性中間体と抗体３が反応し、アミノ酸側鎖のアミノ基でアミド結合により抗体がＳＡＭ表面に固定され、残りの活性化中間体はアルカノールアミンにより不活性化される。従来の抗体を固定化した後に未反応のスクシンイミドを不活性化させる方法では、抗体濃度を低くして固定する抗体量を減らしたい場合、Ｎ−ヒドロキシエステル部分の加水分解がアミド化反応と競合するため、後の不活性化工程の前にスクシンイミド基が加水分解してしまい、カルボキシ基がＳＡＭ表面に生じる傾向がある（図３参照）。しかし、本発明の方法では、使用する抗体の量やアルカノールアミンの量を調節することにより固定化される抗体の量を所望のものとしつつ、抗体を固定化する反応中に活性中間体が加水分解してカルボキシ基が生じるのを抑制することができる。これにより、過度な抗体の結合を抑制できるため、抗原抗体反応による、電気化学インピーダンスやサイクリックボルタンメトリーなどの変化率を大きくすることができる。また、電極表面にカルボキシ基が生じるのを抑制し、ヒドロキシ基を導入することができるため、非特異的吸着による測定精度の低下を防ぐことができる。さらに、抗体の結合とアルカノールアミンによる不活性化とを同時に行うことができ、工程を簡略化することができる。

電極表面に結合させる抗体としては、アミド結合により固定化できるものであれば特に限定されるものではないが、免疫グロブリン、またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂もしくはＦａｂ’などが挙げられ、免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどが使用できる。さらに、抗体としては、目的とする抗原と結合する能力を有するものであれば、特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体などを使用することができ、これらは、公知の方法により産生することもできるが、市販のものを用いることもできる。

アルカノールアミンとしては、アルカン骨格にヒドロキシ基とアミノ基を有する化合物であれば特に限定されるものではないが、メタノールアミン、エタノールアミン、プロパノールアミンなどが挙げられ、エタノールアミンを好適に使用することができる。

Ｓ２工程において、抗体とアルカノールアミンとを同時にＳＡＭ表面に適用する方法としては、例えば、電極が浸漬されている液相に、抗体とアルカノールアミンとの両方を含む混合液を添加することによって行うことができる。あるいは抗体を含む液体、アルカノールアミンを含む液体をそれぞれ用意し、同時に添加することによっても行うことができる。この場合、「同時に」の意味するところは、ある程度の範囲を有するものであり、本発明の効果を得ることができる限りは、抗体の適用とアルカノールアミンの適用とは、別々に続けて行うこともできる。その際、スクシンイミド基の加水分解を防止し、バイオセンサの測定精度に影響を与えない範囲の時間差で行うことが好ましい。

本発明の表面修飾方法においては、Ｓ１工程、Ｓ２工程およびＳ３工程の各工程の後にそれぞれ洗浄工程を設けることができる。

本発明の表面修飾方法により抗体を固定化した電極は、当該抗体に結合する試料中の抗原を測定するためのバイオセンサの作用電極として使用することができる。とりわけ、測定対象である抗原の結合による電気化学的変化を検出しやすいことから、インピーダンス法、サイクリックボルタンメトリー法などの電気化学的測定方法により行う測定に好適に使用することができる。

また、本発明の表面修飾方法により得られる電極は、非特異的吸着を生じにくいことから、試料として、体液、血液、唾液などを用いることができる。また、測定対象とする抗原は、特に限定されるものではないが、コルチゾールなどが挙げられる。

１ 電極
２ ＳＡＭ
３ 抗体

Claims (4)

1. 電極表面に、カルボキシ基を有する自己組織化単分子膜を形成する工程、
   前記自己組織化単分子膜のカルボキシ基をスクシンイミド化する工程、ならびに
   抗体とアルカノールアミンとを同時に前記自己組織化単分子膜に適用する工程
   を含むバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
2. 抗体が、免疫グロブリン、またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂もしくはＦａｂ’である請求項１記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
3. バイオセンサが電気化学測定を用いるものである請求項１または２記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
4. 電気化学測定が、インピーダンス測定である請求項３記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。

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