JP2018080114A - 抗ヒトｖａｐ−１モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】特異性の高い抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体の提供。【解決手段】特定の配列を有する重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体、別の特定配列を有する重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体、および別の特定配列を有する重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体から選択される、抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体。また、前記抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法、並びに当該測定方法に用いられるキット。【選択図】なし

Description

本願は抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体、当該抗体を用いたヒトＶＡＰ−１検出用キットに関する。

ＶＡＰ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）は、ＳＳＡＯ（セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ）とも呼ばれるタンパク質である。膜結合型のＶＡＰ−１は血管内皮表面に存在し、遊離型のＳＳＡＯは血清中に存在する。前者は白血球（炎症に関連する顆粒球、炎症や免疫に関連するリンパ球や単球）との接着分子の機能を持ち、主に炎症に関連し、後者はアミンオキシダーゼ活性により生体内のアミンの解毒を担う。糖尿病、アトピー性皮膚炎、乾癬、肥満、動脈硬化、心疾患等の患者の血清および種々の組織においてＶＡＰ−１／ＳＳＡＯ活性の増加が見られるとの報告がある。

ＶＡＰ−１に関する研究においてはＶＡＰ−１を感度よく検出するための手段の確立が不可欠である。このような手段としては、抗体を用いてＶＡＰ−１を捕捉して活性を測定する系（以下、ＥＣＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｓｓａｙ）とする）が考えられる。発明者らは、既存の抗ＶＡＰ−１抗体を用いて評価した結果、抗ＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社,カタログ番号：ＡＦ３９５７）のみがＥＣＡとして利用可能であることが分かった（後述の比較例を参照）。しかし、ポリクローナル抗体にはロット差の問題があり、安定供給のリスクがある。また、ポリクローナル抗体の継続的な作製のためにはコストの問題がある。

かかる問題は特異的反応性の高いモノクローナル抗体を用いることによって解消することができる。
本願は、ヒトＶＡＰ−１に高い特異性を有するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。本願はまた、ヒトＶＡＰ−１を正確かつ効率よく、安定して測定可能なヒトＶＡＰ−１検出方法並びに当該方法に用いられるキットを提供することを目的とする。

本願発明は、下記の（１）〜（３）から選択される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせを有する抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体またはその抗体断片を提供する：
（１）１Ｇ３重鎖
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGHTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDTATLTVDKSSSSAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRSHYYSSSPDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLG（配列番号１）、
１Ｇ３軽鎖
MESQTQVFVYMLLWLSGVDGDIVMTQSREFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGANVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCLQYNSFPLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV（配列番号２）、

（２）３Ｆ１０重鎖
MECNWILPFILSVTSGVYSEVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFNTFWMHWVKQRPGKGLEWIGAIYPGNSDTTYYQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTNEDSAVYYCTIYYASSHFDSWGQGATLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLG（配列番号３）、
３Ｆ１０軽鎖
MDFHVQIFSFMLISVTVILSSGEIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSETSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSTYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV（配列番号４）、

（３）３Ｇ６重鎖
MEWPCIFLFLLSVTEGVHSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYTFSSYWVNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNQNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSDYDYDGSYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLG（配列番号５）、
３Ｇ６軽鎖
MVFTPQILGLMLFWISASRGDIVLIQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSLETEDFGMYFCQQSYSWPHTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV（配列番号６）

本願はまた、各重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対して１または数個、例えば１，２または３個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する重鎖および／または軽鎖を有し、かつヒトＶＡＰ−１に特異的に結合する抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体またはその抗体断片を提供する。

本願はまた、各重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対して９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖および／または軽鎖可変領域を有し、かつヒトＶＡＰ−１に特異的に結合する抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体またはその抗体断片を提供する。

さらに、上記抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体またはその抗体断片のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するＤＮＡを提供する。

本願はさらに、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３４、ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３５およびＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３６として寄託されているハイブリドーマならびに当該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を提供する。

他の態様として、本願は上記モノクローナル抗体またはその抗体断片の１または２種類を用いてヒトＶＡＰ−１を測定する、イムノアッセイ法を提供する。

他の態様として、本願は上記モノクローナル抗体またはその抗体断片の１または２種類と共にイムノアッセイ用プレート、およびイムノアッセイ用試薬を含むＶＡＰ−１検出用イムノアッセイ用キットを提供する。本願のキットとしては、ＥＣＡアッセイ（Enzyme Capture Assay）およびＥＬＩＳＡアッセイ用キットが例示される。

別の態様において、本願は上記モノクローナル抗体を含有する、ヒトＶＡＰ−１検出用免疫組織染色用組成物を提供する。本発明はまた、その組成物を利用した免疫組織染色用キットを提供する。

本願のモノクローナル抗体はヒトＶＡＰ−１に対して高い特異性並びに結合力を有しており、イムノアッセイ用抗体として好適に用いることができる。

図１−１は、実施例１で得た各ハイブリドーマの培養上清の力価を、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１を固相化した抗原ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。 図１−２は、実施例１で得た各ハイブリドーマの培養上清から精製したモノクローナル抗体の力価を、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１を固相化した抗原ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。 図２−１は、比較例として用いた抗ヒトＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体のＥＣＡ法における性能を示す図を示す。 図２−２は、抗ヒトＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体１Ｇ３のＥＣＡ法における性能を示す（実施例２）。 図２−３は、抗ヒトＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体３Ｆ１０のＥＣＡ法における性能を示す（実施例２）。 図２−４は、抗ヒトＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体３Ｇ６のＥＣＡ法における性能を示す（実施例２）。 図３−１は、抗ヒトＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体１Ｇ３のＥＣＡアッセイにおける抗体感作濃度の違いによる感度を検討した結果を示すグラフ（実施例２、５μｇ／ｍｌ）を示す。 図３−２は、抗ヒトＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体１Ｇ３のＥＣＡアッセイにおける抗体感作濃度の違いによる感度を検討した結果を示すグラフ（実施例２、１０μｇ／ｍｌ）を示す。 図３−３は、抗ヒトＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体１Ｇ３のＥＣＡアッセイにおける抗体感作濃度の違いによる感度を検討した結果を示すグラフ（実施例２、２０μｇ／ｍｌ）を示す。 図４−１は、抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体１Ｇ３を捕捉抗体としてプレートに感作し、ビオチン化したモノクローナル抗体１Ｇ３、３Ｆ１０、３Ｇ６並びにＴＫ８−１４を標識抗体として用いて健常人血清中のＶＡＰ−１並びにＨＴＧ−ＶＡＰ−１に対するＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを行った結果を示す。 図４−２は、抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体３Ｆ１０を捕捉用抗体としてプレートに感作し、ビオチン化したモノクローナル抗体１Ｇ３、３Ｆ１０、３Ｇ６並びにＴＫ８−１４をdetectorとして用いて健常人血清中のＶＡＰ−１並びにＨＴＧ−ＶＡＰ−１に対するＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを行った結果を示す。 図４−３は、抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体３Ｇ６を捕捉用抗体としてプレートに感作し、ビオチン化したモノクローナル抗体１Ｇ３、３Ｆ１０、３Ｇ６並びにＴＫ８−１４を標識抗体として用いて健常人血清中のＶＡＰ−１並びにＨＴＧ−ＶＡＰ−１に対するＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを行った結果を示す。 図４−４は、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を捕捉用抗体としてプレートに感作し、ビオチン化したモノクローナル抗体１Ｇ３、３Ｆ１０、３Ｇ６並びにＴＫ８−１４を標識抗体として用いて健常人血清中のＶＡＰ−１並びにＨＴＧ−ＶＡＰ−１に対するＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを行った結果を示す。 図５−１は、抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体１Ｇ３または３Ｇ６を捕捉用抗体としてプレートに感作し、ビオチン標識化した３Ｆ１０抗体を標識抗体として用いて、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを行った結果を示す。 図５−２は、抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体１Ｇ３または３Ｇ６を捕捉用抗体としてプレートに感作し、ビオチン標識化した３Ｆ１０抗体を標識抗体として用いて、健常人血清中のＶＡＰ−１に対するＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを行った結果を示す。

本発明は、抗ヒトVAP-1モノクローナル抗体またはその抗体断片を提供する。
本願のモノクローナル抗体は、下記（１）〜（３）いずれかに示される重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含み、かつヒトＶＡＰ−１に対して特異的に結合する抗体を含む：
（１）
配列番号１、または配列番号１の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号１と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
配列番号２、または配列番号２の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号２と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域

（２）
配列番号３、または配列番号３の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号３と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
配列番号４、または配列番号４の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号４と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域

（３）
配列番号５、または配列番号５の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号５と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
配列番号６、または配列番号６の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号６と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域。

本明細書における「抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体」は、ヒトＶＡＰ−１に結合する抗体を意味する。抗体の種は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト由来の抗体が挙げられる。モノクローナル抗体には、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。本願のモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されない。

「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ））で提供されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標） ｖｅｒ．１２）を用いて求めることもできる。

「抗体断片」は、抗原と特異的に結合する抗体の一部である。抗体の断片には、Fab （fragment of antigen binding）、F(ab')2、Fab'、一本鎖抗体（single chain Fv)、ジスルフィド安定化抗体(disulfide stabilized Fv)、２量化体Ｖ領域断片、CDRを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第6巻、第5号、第441〜456頁、1996年）。抗体および抗体の断片は、当業界にて周知の方法により調製可能である（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988、http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/Original/Antibody.html、米国特許第6331415号、米国特許第5693761号、米国特許第5225539号、米国特許第5981175号、米国特許第5612205号、米国特許第5814318号、米国特許第5545806号、米国特許第7145056号、米国特許第6492160号、米国特許第5871907号、米国特許第5733743号）。

本願によって、モノクローナル抗体のいずれかを分泌するハイブリドーマが提供される。発明者らは、このようなハイブリドーマを、2015年4月17日（原寄託日）に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １１２号室）に国際寄託した。具体的には、モノクローナル抗体３Ｆ１０、１Ｇ３、３Ｇ６それぞれを産生するハイブリドーマをＶＡＰ−１ Ｃｌ．ＡＦ−３Ｆ１０Ｈ７Ａ１１Ｈ９、ＶＡＰ−１ Ｃｌ．ＡＦ−１Ｇ３Ｇ５Ｈ２Ｈ１、ＶＡＰ−１ Ｃｌ．ＡＦ−３Ｇ６Ｇ７Ａ５Ｇ８と名付け、上述の特許微生物寄託センターに寄託し、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３４、ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３５およびＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３６を得た。

本願の抗体は、上記ハイブリドーマを常法により培養することによって、培養上清中に分泌される。培養上清を、プロテインＡアフィニティーカラムを用いる精製法など、従来から使用されている精製法により単離、精製して用いることができる。

本願のモノクローナル抗体またはその断片はまた、本願の特定の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入して発現させることにより、得ることができる。具体的には、抗体またをコードする配列がエンハンサーやプロモーターなどの発現制御領域のもとで発現するよう発現ベクターを構築し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、抗体を発現させる。

宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などの真核細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞（例えば、CHO、COS、NIH3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞）、または昆虫細胞（例えば、Sf9、Sf21、Tn5）が挙げられる。真菌細胞としては、酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））などが挙げられる。また、大腸菌（E. coli）（例えば、JM109、DH5α、HB101等）、枯草菌などの原核細胞を宿主細胞として用いることもできる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法により行うことができる。

本願のモノクローナル抗体またはその断片は、ヒトＶＡＰ−１に高い特異性を持って結合する。本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、生体試料中のヒトＶＡＰ−１を検出するためのイムノアッセイに好適に用いられる。イムノアッセイとしては、抗原抗体反応を利用するアッセイ法全般を含み、例えばＥＣＡ（Enzyme Capture Assay）法、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などが例示される。なお、本願明細書および請求の範囲において、「Enzyme Capture Assay（ＥＣＡ）法」とは、固定化した抗体により目的の酵素を捕捉し、捕捉された酵素の活性を測定することによって捕捉された酵素の検出および／または定量を行う方法を意味する。

本願はまた、本願の抗体またはその断片を１以上と、イムノアッセイ用試薬を含む、ヒトＶＡＰ−１測定用キットを提供する。抗体は必要に応じて標識されていてもよい。イムノアッセイ用試薬は公知であり、目的とするアッセイ方法によって適宜選択すればよい。

ＥＣＡキットである場合、本願のモノクローナル抗体の１Ｇ３または３Ｇ６またはその抗体断片、プレート、ブロッキング溶液（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、乳蛋白質溶液等）；洗浄液（界面活性剤を含むリン酸緩衝液（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）））；ＶＡＰ−１基質（例えばベンジルアミン）、および発色基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））を含むキットが例示される。本願のモノクローナル抗体またはその抗体断片はプレートに固相化した状態で提供されてもよい。

サンドイッチＥＬＩＳＡ用キットの場合は、捕捉用抗体として本願のモノクローナル抗体またはその抗体断片のいずれか１つと、標識抗体として標識化した本願モノクローナル抗体またはその抗体断片の他の１つを含む。併せて、プレート、ブロッキング溶液、洗浄液、および発色基質を含むキットが例示される。抗体の標識は、例えば、ＨＲＰ、ビオチンなどを用いることができる。ビオチンを用いる場合はビオチンに特異的に結合するアビジンを、シグナルを発する物質で標識してもよい。

サンドイッチＥＬＩＳＡの捕捉用抗体として１Ｇ３または３Ｇ６を用い、標識抗体を３Ｆ１０とする組み合わせとすると、特に感度良い測定が可能である。捕捉用抗体が３Ｇ６、標識用抗体が３Ｆ１０とする組み合わせがより好適に用いられる。

本発明の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体はＶＡＰ−１検出のための免疫組織染色用抗体としても好適に用いられる。免疫組織染色は、確立された技術であり、本願のモノクローナル抗体を使用することを除いては、公知の方法に基づいて行うことが可能である。

具体的には、免疫組織染色は、例えば以下のように行うことができる。生体組織を凍結切片として薄切、又は固定後パラフィン包埋したブロックから薄切し、組織切片を作製する。組織切片上に本願の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体を反応させる。この抗体を、シグナルを発する物質で標識しておくことにより、ＶＡＰ−１の発現を組織切片上において可視化し、検出することができる。また、抗ＶＡＰ−１抗体を標識せずに、抗ＶＡＰ−１抗体に対する第２抗体を、シグナルを発する物質で標識してもよい。

組織の可視化の方法としては、ジアミノベンジン染色法、蛍光抗体法（蛍光色素により標識した抗体を調製して、抗原抗体反応後にその蛍光色素の励起波長を照射して蛍光発症させ方法）などが挙げられるが、これらに限定されない

従って、本発明は上記抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体またはその断片と、免疫組織染色用試薬を含むヒトＶＡＰ−１検出のための免疫組織染色用キットを提供する。本発明のキットには、例えば標識された本発明の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体またはその断片並びに発色基質を含むもの、および、本発明の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体と、標識した二次抗体並びに発色試薬を有しているものが例示される。

（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立）
ＴＡＬＯＮカラムにて精製したＨｉｓタグ付加組み換えヒトＶＡＰ−１タンパク質（ＨＴＧ−ＶＡＰ−１）を免疫原として用いた。ＶＡＰ−１タンパク質をフロイントアジュバントと混和し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，メス）４匹へ免疫をおこなった。２週間隔で３回免疫した後、脾臓もしくはリンパ節から血球細胞を分離した。分離した血球細胞はマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とＰＥＧ法により細胞融合させた。融合細胞は９６穴プレートに分注し、コロニーが形成されるまで培養をおこなった。
コロニー形成が観察された時点で、９６穴プレートの各ウェルの細胞培養上清を用いて、ＥＣＡ法およびサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングをおこなった。

（ＥＣＡ法によるスクリーニング）
プレート固相抗体：抗マウスＩｇＧ抗体
捕捉用抗体：各ウェルの細胞培養上清（モノクローナル抗体が含まれている）
測定検体：ＨＴＧ−ＶＡＰ−１および健常人血清
測定手順：抗マウスＩｇＧ抗体を９６穴プレートの各ウェル上に固定化した。次いで各培養上清を各ウェルへ添加して培養上清中に含まれる抗体を固定化抗マウスＩｇＧ抗体に結合させることによって、培養上清中の抗体をウェルに結合させた。その後、抗体液を除去し、ＰＢＳ／０．１３％ Ｔｗｅｅｎ２０でウェルを洗浄してスクリーニング用ＥＣＡキットを得た。

（ＥＣＡ法による測定）
スクリーニング用ＥＣＡキットの９６穴プレートの各ウェルに１００μｌの健常人血清（２倍希釈）を加えて、室温で１時間反応させ、血清中に含まれるＶＡＰ−１をウェルに結合した抗体へ結合させた。次に、各ウェルを緩衝液で洗浄し、そこにＶＡＰ−１の基質となるベンジルアミン（２ｍＭ）と蛍光物質前駆体ＡＤＨＰ（４００μＭ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；２Ｕ／ｍｌ）とを含む反応液１００μｌを加えて、室温で３時間反応させた。ＶＡＰ−１がベンジルアミンを酸化することにより生じる過酸化水素が、ＡＤＨＰと反応することにより生じる蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を、蛍光プレートリーダを用いて測定する。この蛍光強度から、蛍光物質レゾルフィン量を決定した。このレゾルフィン量を反応時間で除算することで、ＶＡＰ−１の酵素活性を得た。
ＶＡＰ−１の酵素活性が認められた培養上清を特定した。

（サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング）
プレート固相（捕捉）抗体：抗ＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社,カタログ番号：ＡＦ３９５７）
測定用抗原：ＨＴＧ−ＶＡＰ−１タンパク質および健常人血清（２倍希釈）
検出用抗体：各ウェルの細胞培養上清（モノクローナル抗体が含まれている）
２次抗体：抗マウスＩｇＧ抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識）
測定手順：９６穴プレートの各ウェルに捕捉用抗体を固定した。補足用抗体と測定用抗原を反応させた後、９６穴プレートの各ウェルへ細胞培養上清をそれぞれ添加した。培養上清中の抗体を抗原へ結合させた後、洗浄し、次いで検出用抗体を各ウェルに添加した。検出用抗体により抗原をサンドイッチできる抗体が含まれている細胞培養上清を特定した。

両スクリーニングのどちらかにおいて陽性となった９６穴プレートの各ウェルについて３〜４回、限界希釈法によりクローニングをおこない、最終的にモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を３クローン（１Ｇ３、３Ｆ１０および３Ｇ６）樹立した。

得られた各クローンは２０１５年４月１７日（原寄託日）に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １１２号室）に国際寄託した。クローン３Ｆ１０、１Ｇ３、３Ｇ６の受託番号はそれぞれＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３４、ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３５およびＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３６である。

（ハイブリドーマ培養上清からのモノクローナル抗体の精製）
樹立したハイブリドーマ３クローンを小スケールで培養し、培養上清を１００ｍｌずつ回収した。培養上清よりプロテインＡアフィニティーカラムを用いて各抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体の精製をおこなった。結果を表１に示す。

精製されたモノクローナル抗体の吸光度から収量を算出した結果、１００ｍｌの培養上清からクローン１Ｇ３は２．３ｍｇ、クローン３Ｆ１０は１．１２ｍｇ、クローン３Ｇ６は１．３６ｍｇであった（表１）。

精製されたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を常套法に従って確認した。各可変領域の配列は、下記のとおりである：
１Ｇ３ 重鎖 配列番号１、軽鎖 配列番号２
３Ｆ１０ 重鎖 配列番号３、軽鎖 配列番号４
３Ｇ６ 重鎖 配列番号５、軽鎖 配列番号６
また、軽鎖のクラスはいずれもκであった。

（モノクローナル抗体の力価）
免疫原であるＨＴＧ−ＶＡＰ−１に対する各モノクローナル抗体の力価を、抗原であるＨＴＧ−ＶＡＰ−１を固相化した抗原ＥＬＩＳＡ法により確認した。
まず、力価測定用のプレートを作製した。ＨＴＧ−ＶＡＰ−１をＰＢＳで希釈し１０μｇ／ｍｌとした。それを９６穴プレートへ１００μｌずつ添加し、４℃で１晩静置して抗原をウェル上に感作させた。上記で添加した溶液を除去してブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）を２００μｌずつ添加し、再び４℃で１晩静置した後に、ブロッキング液を除去し、室温で６時間放置して完全にブロッキング液を乾燥除去した。

培養上清（図１−１参照）および精製した抗体(図１−２参照)を所定濃度に希釈し、１００μｌ／ウェルずつ添加して次に、抗体希釈液で１０００倍に希釈したＨＲＰ標識２次抗体を１００μｌずつウェルへ添加し、室温で１時間反応させ、ウェル上の捕捉された抗体と結合させた。室温で１時間反応させたのち、未結合の抗体を除去後、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄した。

次に、ＨＲＰに対する基質溶液を加えることで発色反応を起こさせ、発色反応停止後、吸光度Ａ４５０を測定した。精製抗体は、精製の原料である細胞培養上清とほぼ同じ強さを持つことが確認できた（図１−１、図１−２）。以上より、培養上清からプロテインＡアフィニティーカラムを用いることで、失活などの問題なく、これらのモノクローナル抗体を精製できることが確認された。

（ＥＣＡ用抗体としての評価）
実施例１で得た精製した抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体の各々を、９６穴プレートへ直接感作し、ＥＣＡ法において使用可能であるかどうかを検討した。測定対象として健常人血清（２倍希釈）を用いた。健常人血清にはＶＡＰ−１が含まれている。

（抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体を用いたＥＣＡキットの作製）
抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体の各々をＰＢＳで希釈し２μｇ／ｍｌとした。それを９６穴プレートへ１００μｌずつ添加し、４℃で１晩静置して抗体をウェル上に結合させた。抗体液を除去してブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）を２００μｌずつ添加し、再び４℃で１晩静置した後に、ブロッキング液を除去し、室温で６時間放置して完全にブロッキング液を乾燥除去して試験用ＥＣＡキットを得た。

（比較例：抗ＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体のＥＣＡキット（試作ＥＣＡキット）の作製）
抗ＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社,カタログ番号：ＡＦ３９５７）を備えたＥＣＡキット（以下、試作ＥＣＡキット）を作製した。抗体をＰＢＳで希釈し１０μｇ／ｍｌとした。希釈した抗体を９６穴プレートへ１００μｌずつ添加し、４℃で１晩静置してウェル上に感作させた。上記で添加した溶液を除去してブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）を２００μｌずつ添加し、再び４℃で１晩静置した後に、ブロッキング液を除去し、室温で６時間放置して完全にブロッキング液を乾燥除去して試作ＥＣＡキットを得た。

各モノクローナル抗体を用いて作製した試験用ＥＣＡキットおよび抗ヒトＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体を用いて作製した比較例の試作用ＥＣＡキットを用いた。希釈液で予め調製しておいた健常人血清を各ウェルへ１００μｌずつ添加した。室温で１時間反応させて健常人血清中ＶＡＰ−１をウェル上に捕捉させた。添加した健常人血清を除去後、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄した。ネガティブコントロールとしては、健常人血清に代えて健常人血清の希釈に用いた溶液を１００μｌ添加した。

予め調製しておいた４００μＭ ＡＤＨＰ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、２Ｕ／ｍｌ ＨＲＰ，２ｍＭ ベンジルアミンを含む反応液を１００μｌずつ添加して反応を開始させた。所定の時間に蛍光強度を測定した。反応温度は３０℃で行った。比較例の抗ヒトＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体を用いた場合の結果を図２−１に、各モノクローナル抗体を用いた結果を図２−２、図２−３、および図２−４に示す。健常人血清の測定結果はAssay Controlと、健常人血清の希釈に用いた溶液（またはネガティブコントロール）の測定結果はNo Enzymeとして図中に示す。

今回樹立された３クローン中、１Ｇ３および３Ｇ６の２つの抗体がＥＣＡ法で好適に使用できることが確認された（図２−２、図２−４）。抗ＶＡＰ−１ヤギポリクローナル抗体を用いた試作ＥＣＡキット（図２−１）に比べて、クローン１Ｇ３ではより強いシグナルを、クローン３Ｇ６ではほぼ同等のシグナルを得ることができた。

試作ＥＣＡキットよりも強いシグナルを示したクローン１Ｇ３を５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度として、上記と同様にして９６穴プレートへ直接感作した。次いで、上記と同じ方法にてＥＣＡをおこなったが、濃度の差によるシグナルには大きな違いは見られなかった（図３−１、図３−２および図３−３）。

（ＥＬＩＳＡ用抗体の組み合わせの検討）
３種類の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体１Ｇ３、３Ｆ１０、３Ｇ６について、ＥＬＩＳＡ用に抗体サンドイッチの組み合わせの評価を行った。

（ＥＬＩＳＡ用プレートの作製）
３種類それぞれの抗体を実施例２と同様にして９６穴プレートに感作させて、抗体プレートを作製した。コントロールとして、Ｈｉｓ Ｔａｇに結合する抗体プレート（抗Ｈｉｓ抗体感作）も同様に作製した。

各モノクローナル抗体をＰＢＳで希釈し５μｇ／ｍｌとした。９６穴プレートへ１００μｌずつ添加し、４℃で１晩静置してそれぞれの抗体をウェル上に感作させた。抗体液を除去してブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）を２００μｌずつ添加し、再び４℃で１晩静置した後に、ブロッキング液を除去し、室温で６時間放置して完全にブロッキング液を乾燥除去した。

また、各モノクローナル抗体を常法によりビオチン標識した。コントロールとして市販の抗ＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体ＴＫ８−１４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−３３６７０）をビオチン標識したものを用いた。

ＰＢＳ／１％ＢＳＡで調製したサンプルであるＨＴＧ−ＶＡＰ−１ ５００ｎｇ／１００μｌ／ウェルおよび健常人血清の２倍希釈液、４倍希釈液を１００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させ、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１または健常人血清中ＶＡＰ−１をウェル上の抗体に結合させた。サンプルを除去し、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄後、ビオチン標識した各抗体をＰＢＳで希釈し５μｇ／ｍｌとし、ウェルへ１００μｌずつ添加した。室温で１時間反応させ、ウェル上の捕捉されたＨＴＧ−ＶＡＰ−１または健常人血清中ＶＡＰ−１と結合させた。未結合のビオチン標識化抗体を除去後、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄した。次に、ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１００μｌずつウェルへ添加した。室温で１時間反応させ、未結合のＨＲＰ標識ストレプトアビジンを除去後、ＰＢＳ／０．１３％Ｔｗｅｅｎ２０でウェルを洗浄した。ＨＲＰに対する基質溶液を加えることで発色反応を起こさせ、発色反応停止後、吸光度Ａ４５０を測定した。

上記の方法により、健常人血清およびＨＴＧ−ＶＡＰ−１（抗体作製時に抗原に用いたＨｉｓタグ付きＶＡＰ−１タンパク）をサンドイッチが可能な組み合わせを調べた。その結果を図４−１、図４−２、図４−３および図４−４に示す。

１Ｇ３、３Ｇ６をプレートに、標識抗体を３Ｆ１０にした条件で、血清サンプルで高いシグナルが得られた。（健常人血清５０μＬは頭打ちしている。）
ポジティブコントロールの抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体プレートでは、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１に対して全ての抗体が反応し、Ｈｉｓ ｔａｇがない血清中ＶＡＰ−１ではシグナルがみられなかった。ビオチン化ＴＫ８−１４は、１Ｇ３、３Ｇ６、３Ｆ１０の抗体プレートに対してはシグナルが弱かった。

１Ｇ３と３Ｇ６の抗体同士では、プレート感作および標識抗体のいずれに置き換えてもシグナルが弱かったことから、この２種類の抗体はエピトープ部位が近く、この組み合わせでのＥＬＩＳＡ測定には適さない。ＴＫ８−１４も同様である。また、実施例１において力価が弱かった３Ｆ１０が、１Ｇ３、３Ｇ６を感作したプレートに対しては強いシグナルが得られたことから、３Ｆ１０と、１Ｇ３および３Ｇ６とはエピトープ部位が離れているものと考えられる。一方、３Ｆ１０を感作した場合に全般的にはシグナルが低かったのは、３Ｆ１０の力価が他の２種類の抗体よりも低いためと考えられる。

なお、抗ＨｉｓＴａｇプレートでは、ＨｉｓＴａｇの無い血清中ＶＡＰ−１は全ての抗体でシグナルがみられず、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１のみにシグナルがみられることから、用いた全ての標識抗体はＨｉｓＴａｇ抗体に結合したＨＴＧ−ＶＡＰ−１を認識して結合していること、ビオチン化により抗体特異性が失われていないことが確認された。

上記結果より、プレート用の抗体としては、力価が強い１Ｇ３と３Ｇ６を候補とし、標識抗体としては力価は比較的低いが、他の抗体とエピトープが異なる３Ｆ１０を候補として以下の試験を行った。

（ＥＬＩＳＡキットのための最適組み合わせ）
１Ｇ３、３Ｇ６感作抗体プレートと、３Ｆ１０ビオチン標識抗体を用いて、血清およびＨＴＧ−ＶＡＰ−１を希釈して、どちらの組み合わせで強いシグナルが得られるか評価した。

１Ｇ３、３Ｇ６の各マウスモノクローナル抗体をＰＢＳで所定の濃度に希釈し９６穴プレートへ１００μｌずつ添加し、４℃で１晩静置してそれぞれの抗体をウェル上に感作させた。抗体液を除去してブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）を２００μｌずつ添加し、再び４℃で１晩静置した後に、ブロッキング液を除去し、室温で６時間放置して完全にブロッキング液を乾燥除去した。

ＰＢＳ／１％ＢＳＡで所定の濃度および希釈倍数に調製したサンプルであるＨＴＧ−ＶＡＰ−１および健常人血清を１００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させ、ＨＴＧ−ＶＡＰ−１または健常人血清中ＶＡＰ−１をウェル上の抗体に結合させた。サンプルを除去し、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄後、ビオチン標識した３Ｆ１０抗体をＰＢＳで希釈し５μｇ／ｍｌとし、ウェルへ１００μｌずつ添加した。室温で１時間反応させ、ウェル上の捕捉されたＨＴＧ−ＶＡＰ−１または健常人血清中ＶＡＰ−１と結合させた。未結合のビオチン化３Ｆ１０抗体を除去後、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％ Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄した。次に、ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１００μｌずつウェルへ添加した。室温で１時間反応させ、未結合のＨＲＰ標識ストレプトアビジンを除去後、洗浄液（ＰＢＳ／０．１３％ Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを洗浄した。ＨＲＰに対する基質溶液を加えることで発色反応を起こさせ、発色反応停止後、吸光度Ａ４５０を測定した。結果を図５−１および図５−２に示す。

いずれの組み合わせでも問題無くＥＬＩＳＡアッセイが可能であった。特に血清およびタンパクのいずれでも希釈倍数が大きい条件において３Ｇ６（プレート、捕捉用抗体）−３Ｆ１０（ビオチン標識抗体）の組み合わせが強いシグナルが得られたことから、この組み合わせが最適であると判断される。

（免疫組織染色用の抗体の評価）
本明細書に記載のモノクローナル抗体が、ヒト皮膚組織の免疫組織染色に使用できるか評価した。具体的には、次のような手順に従い当該抗体が免疫組織染色に利用できることを確認した。

（標本の調製および染色方法）
まず、発明者らは、２種の標本、すなわち、凍結したヒト皮膚組織をそのまま薄切した標本と、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(サクラファインテック)で包埋した後に薄切した標本を作製した。
２種類の標本に対してＤＡＢ（ジアミノベンジジン）染色法を行い、３種類の抗体の染色性能を評価した。

１次抗体を０．４〜４μｇ／ｍｌの濃度に調製し、上記標本と約１時間にわたり反応させた。その後、標本を洗浄した後、抗マウスＩｇＧ酵素標識抗体を反応させてから洗浄し、ＤＡＢを反応させて組織を染色した（本工程ではＯｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、ＨＫ５９５−５０Ｋを用いた）。

（染色の評価）
モノクローナル抗体の各々を、次の項目により、免疫組織染色における利用の可否を評価した：（ａ）ＶＡＰ−１の発現が知られている血管内皮が染色されることと、および（ｂ）ヒトＶＡＰ−１を染色可能であることが確認されている抗ＶＡＰ−１マウスモノクローナル抗体ＴＫ８−１４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−３３６７０）の染色像と対比した際に、同じ部位が染色されていること。

（結果）
これらを基準に染色性能の評価を行い、全ての抗体で標本中のヒトＶＡＰ−１を染色できることを確認した。

ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３４
ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３５
ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３６

Claims (13)

1. 下記（１）〜（３）いずれかに示される重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含み、かつヒトＶＡＰ−１に対して特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片：
   （１）
   配列番号１、または配列番号１の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号１と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
   配列番号２、または配列番号２の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号２と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
   （２）
   配列番号３、または配列番号３の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号３と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
   配列番号４、または配列番号４の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号４と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
   （３）
   配列番号５、または配列番号５の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号５と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
   配列番号６、または配列番号６の配列において１〜数個、例えば１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列、もしくは配列番号６と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域。
2. 下記重鎖および軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体：
   配列番号１からなる重鎖可変領域、および
   配列番号２からなる軽鎖可変領域。
3. 下記重鎖および軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体：
   配列番号３からなる重鎖可変領域、および
   配列番号４からなる軽鎖可変領域。
4. 下記重鎖および軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の抗ヒトＶＡＰ−１モノクローナル抗体：
   配列番号５からなる重鎖可変領域、および
   配列番号６からなる軽鎖可変領域。
5. マウスモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
6. 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３４、ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３５およびＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３６により独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマのいずれか１のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
7. 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３４、ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３５およびＮＩＴＥ ＢＰ−０２０３６により独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマから選択される、ハイブリドーマ。
8. 請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその断片の少なくとも１つを用いる、ヒトＶＡＰ−１測定のためのイムノアッセイ方法。
9. 請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその断片の少なくとも１つおよびイムノアッセイ用試薬を備える、ヒトＶＡＰ−１測定用イムノアッセイキット。
10. 請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、前記（１）または前記（３）に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するものを含み、ＥＣＡ用である請求項９に記載のキット。
11. 捕捉用モノクローナル抗体として請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、前記（１）または前記（３）に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するものを含み、標識抗体として請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、前記（２）に記載の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するものを含む、サンドイッチＥＬＩＳＡ用である請求項９に記載のキット。
12. 請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその断片の少なくとも１つを用いてヒトＶＡＰ−１を検出する、免疫組織染色方法。
13. 請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその断片の少なくとも１つ、および免疫組織染色用試薬を含有する、ヒトＶＡＰ−１検出のための免疫組織染色用キット。