JP2018061447A - 希少細胞回収方法 - Google Patents

Abstract

【課題】希少細胞含有液から希少細胞を高収率で回収することを可能とする。
【解決手段】希少細胞回収方法は、流入口と流出口とを有する筐体と、流入口と流出口との間の筐体の内部の流路上に複数の貫通孔を有するフィルターが設けられた細胞捕捉デバイスを用いた希少細胞回収方法であって、流入口から希少細胞含有液を導入し、流出口から排出することで、フィルターによって当該希少細胞含有液をろ過することで希少細胞を捕捉する捕捉工程Ｓ０１と、細胞捕捉デバイス内の流路をバッファで満たすバッファ置換工程Ｓ０３と、細胞捕捉デバイス内の流路のバッファを光硬化性樹脂に置換する樹脂置換工程Ｓ０４と、細胞捕捉デバイス内の光硬化性樹脂を硬化させることで、希少細胞をフィルターから光硬化性樹脂に転写する転写工程Ｓ０５と、転写工程において硬化された光硬化性樹脂を細胞捕捉デバイスから取り出して回収する回収工程Ｓ０６と、を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、希少細胞回収方法に関する。

癌は世界各国で死因の上位を占め、わが国においては年間３０万人以上が癌によって死亡している。癌による死亡のほとんどが、癌の転移再発によるものである。癌の転移再発は、癌細胞が原発巣から血管又はリンパ管を経由して、別の臓器組織の血管壁に定着し、血管壁を浸潤して、血管壁に微細転移層を形成することで起こる。このように、血管又はリンパ管を介して体内を循環する癌細胞は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）と呼ばれる。

一方、末梢血液中には循環内皮細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ、ＣＥＣ）が存在する。ＣＥＣは、内皮細胞が代謝によって血管壁から剥がれ落ちた成熟細胞であり、循環器疾患、感染症、免疫疾患及び癌等の多くの疾患によってＣＥＣの数が増加することが知られている。

以上のように、ＣＴＣ及びＣＥＣ等の希少細胞から疾患に関する多くの情報を得られるため、これら希少細胞の存在及びその増加の早期発見が期待される。

しかしながら、血液には、赤血球、白血球及び血小板等の血球成分が多く含まれ、その数は、血液１ｍＬ中に３．５×１０^９〜９×１０^９個ともいわれている。これに対し、希少細胞は、血液１ｍＬ中に僅か数個程度しか存在しないため、希少細胞の検出及び観察は非常に困難である。血球成分が多く存在する中、希少細胞を効率的に検出するには、希少細胞と血球成分とを分離する必要がある。

血液中の希少細胞を分離する方法として、フィルターを用いる方法がある（例えば、特許文献１〜３）。この方法は、細胞のサイズ及び変形能の違いで希少細胞を分離する方法である。

特開２０１３−４２６８９号公報 特開２０１１−１６３８３０号公報 国際公開第２０１５／０１２３１５号

近年の動向として、分離した希少細胞の遺伝子解析結果を、例えば、最適な薬剤の選定及び予後診断に利用することへの期待が高まっている。遺伝子解析に用いられるＰＣＲ及び次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＮＧＳ）等では、解析の基となる希少細胞の量及び純度が重要となる。

しかしながら、特許文献１〜３のような従来の方法を用いても、フィルター上に捕捉された希少細胞を回収するのが難しく、十分な収率で希少細胞を単離することができなかった。

本発明は、上記の課題を鑑みてなされたものであり、希少細胞含有液から希少細胞を高収率で回収することが可能な希少細胞回収方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明に係る希少細胞回収方法は、液体を内部へ導入するための流入口と、液体を外部へ排出するための流出口と、を有する筐体と、前記流入口と前記流出口との間の前記筐体の内部の流路上に、厚さ方向に複数の貫通孔を有するフィルターが設けられた細胞捕捉デバイスを用いた希少細胞回収方法であって、前記流入口から希少細胞含有液を導入し、前記流出口から排出することで、前記フィルターによって当該希少細胞含有液をろ過することにより、前記フィルターの一方の面上に前記希少細胞含有液に含まれる希少細胞を捕捉する捕捉工程と、前記流入口からバッファを導入することで、前記細胞捕捉デバイス内の流路をバッファで満たすバッファ置換工程と、前記流入口から光硬化性樹脂を導入することで、前記細胞捕捉デバイス内の流路の前記バッファを前記光硬化性樹脂に置換する樹脂置換工程と、前記細胞捕捉デバイス内の前記光硬化性樹脂を硬化させることで、前記希少細胞を前記フィルターの一方の面上から前記光硬化性樹脂に転写する転写工程と、前記転写工程において硬化された前記光硬化性樹脂を前記細胞捕捉デバイスから取り出す回収工程と、を含む。

上記の希少細胞回収方法によれば、細胞捕捉デバイス内に希少細胞含有液を導入することで希少細胞をフィルターにより捕捉した後に、細胞捕捉デバイス内に光硬化性樹脂を導入し、これを硬化させることで、希少細胞を光硬化性樹脂に転写し、回収することができる。このように、希少細胞の周囲に光硬化性樹脂を導入して硬化させることで、希少細胞の移動を抑制しながら、希少細胞を回収することができるため、希少細胞の紛失等を防ぎながら希少細胞を回収することができる。さらに、上記の希少細胞回収方法では、細胞捕捉デバイス内の流路をバッファで満たした後に、バッファと光硬化性樹脂とを置換することで、細胞捕捉デバイス内に光硬化性樹脂が導入される。このような手順とすることで、光硬化性樹脂を導入した際に希少細胞がフィルターの面上から貫通孔内へ移行することが防がれるため、希少細胞の収率をさらに高めることができる。

ここで、前記光硬化性樹脂は、硬化後の可視光の透過率が２０％以上である態様とすることができる。

上記のように、硬化後の可視光の透過率が２０％以上である光硬化性樹脂を用いると、回収工程で回収した光硬化性樹脂に希少細胞が保持された状態で、希少細胞を観察することが可能となる。

また、前記回収工程において、前記フィルターの一方の面側に相当する前記光硬化性樹脂を他の前記光硬化性樹脂と区別して回収する態様とすることができる。

上記のように、前記フィルターの一方の面側に相当する前記光硬化性樹脂を他の前記光硬化性樹脂と区別して回収する構成とすることで、希少細胞の観察又は光硬化性樹脂から取り出した希少細胞の解析等の後段の作業を好適に行うことができる。

また、前記回収工程において、前記細胞捕捉デバイスから取り出した前記光硬化性樹脂から前記希少細胞を個別に回収する工程をさらに含む態様とすることができる。

上記のように、希少細胞を個別に回収する工程を含むことで、遺伝子解析等の希少細胞に係るより詳細な解析を行うことが可能となる。

本発明によれば、希少細胞含有液から希少細胞を高収率で回収することが可能な希少細胞回収方法が提供される。

本発明の一実施形態に係る希少細胞回収方法を含む一連の操作手順を説明するフロー図である。 細胞捕捉デバイスの構成を示す模式図である。 樹脂置換工程、転写工程及び回収工程を示す模式図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

本発明の一実施形態に係る希少細胞回収方法は、細胞捕捉デバイスに保持されたフィルターにより、希少細胞含有液をろ過することで、希少細胞をフィルターに捕捉した後、この希少細胞を光硬化性樹脂に転写して回収することを特徴とする。細胞捕捉デバイスを用いて光硬化性樹脂に対して転写して回収をする構成とすることで、フィルター上に捕捉された希少細胞の紛失等を防ぎながら希少細胞を回収することができるため、より高い収率での回収を可能とする。

本実施形態に係る希少細胞の回収方法における回収の対象となる「希少細胞」とは、生体試料に含まれる特定種類の細胞のことであり、通常、その細胞数の割合が希少細胞含有液に含有される全細胞の総数に対して極めて小さいものをいう。希少細胞は、例えば、ＣＴＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ）等の癌細胞及びＣＥＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）等の内皮細胞であることができるが、これらに限定されない。

希少細胞含有液は、上記の希少細胞が含まれる液であり、例えば、血液、腹水、胸水及びその他の細胞懸濁液であることができる。細胞懸濁液は、例えば、白血球を含有する液であることができる。なお、希少細胞含有液には、緩衝液又は添加剤がさらに含まれていてもよい。

本実施形態における「捕捉」とは、希少細胞含有液をフィルターでろ過して、希少細胞をフィルター上に残留させることをいう。

また、本実施形態における「転写」とは、フィルターに希少細胞が捕捉された状態から、光硬化性樹脂に希少細胞が保持された状態へと移行することをいう。すなわち、フィルターから光硬化性樹脂に対して希少細胞を転写することで、光硬化性樹脂に希少細胞が保持されている状態となる。

また、本実施形態における「回収」とは、希少細胞を回収することをいう。ただし、希少細胞を単体で回収することに限定されず、希少細胞を保持した状態の光硬化性樹脂を回収することについても、本実施形態における「回収」に該当する。

以下、本実施形態に係る希少細胞回収方法について図１〜３を参照しながら、説明する。本実施形態に係る希少細胞回収方法は、図１に示すように、捕捉工程（ステップＳ０１）、洗浄工程（ステップＳ０２）、置換工程（バッファ置換工程：ステップＳ０４）、樹脂置換工程（ステップＳ０４）、転写工程（ステップＳ０５）、回収工程（ステップＳ０６）、及び、解析工程（ステップＳ０７）を含む。

捕捉工程Ｓ０１は、希少細胞含有液を細胞捕捉デバイスに取り付けられたフィルターによりろ過して、希少細胞をフィルターの一方の面上に捕捉する工程である。洗浄工程Ｓ０２は、フィルター表面を洗浄液（ウォッシュバッファ）により洗浄する工程である。
置換工程Ｓ０３は、細胞捕捉デバイス内のフィルター周辺の領域を洗浄液等のバッファに置換する工程である。また、樹脂置換工程Ｓ０４は、細胞捕捉デバイス内のフィルター周辺の領域に対して硬化前の光硬化性樹脂を導入する工程である。転写工程Ｓ０５は、フィルター表面上の光硬化性樹脂を硬化させることで、フィルターの面上の希少細胞を、光硬化性樹脂が保持している状態に移行させる工程である。回収工程Ｓ０６は、希少細胞が保持された光硬化性樹脂を回収し、必要に応じて光硬化性樹脂から希少細胞を回収する工程である。解析工程Ｓ０７は、回収された希少細胞に係る解析を行う工程である。各工程の詳細は後述する。

まず、捕捉工程Ｓ０１について説明する。捕捉工程Ｓ０１は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞をフィルターの面上に捕捉する工程である。希少細胞含有液とは、捕捉対象の希少細胞が含まれている液体であり、例えば、血液又は血液由来の液体等が挙げられるが、これに限定されるものではない。

ろ過を行う際には、細胞捕捉デバイスが用いられる。細胞捕捉デバイスについて、図２を参照しながら説明する。

図２は細胞捕捉デバイスの構成を示す模式図である。細胞捕捉デバイス１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。筐体１２０の形状は直方体又は円筒等であってよく、特に制約はない。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されていて、流入口１３０と流出口１４０との間に形成される筐体１２０の内部の流路上に配置される。

上部部材１１０及び下部部材１１５は、例えばクリップ（図示せず）で互いに固定されており、クリップを外して筐体１２０を解体することで、フィルター１０５を取り出すことができる。本実施形態に係る希少細胞回収方法では、上部部材１１０及び下部部材１１５に挟まれた空間に光硬化性樹脂が導入されるので、硬化後の光硬化性樹脂を回収することが可能な構成とされていることが好ましい。なお、図２に示すように、上部部材１１０及び下部部材１１５に挟まれた空間とは、上部部材１１０とフィルター１０５とにより形成される上部空間Ａ１と、下部部材１１５とフィルター１０５とにより形成される下部空間Ａ２と、のことをいう。

流入管１２５の上流には、例えば、希少細胞含有液又は洗浄液等の処理液が入ったリザーバーが接続される。リザーバーに入った液体は、流入管１２５から筐体１２０の内部に流れ、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、流出管１３５の下流に接続されたポンプＰの駆動により作り出すことができる。また、ポンプＰの駆動により、細胞捕捉デバイス１００内での液体の移動速度（流速）を制御することができる。ポンプＰとしては、例えばペリスタルティックポンプ等を利用することができる。

フィルター１０５には厚さ方向に貫通する複数の貫通孔１０６が形成されている。例えば、希少細胞含有液として癌細胞を含む血液を細胞捕捉デバイス１００内に導入すると、血液の血小板及び赤血球等の成分は貫通孔１０６を通過するが、希少細胞及び一部の白血球は貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５上の一方側の表面（流入管１２５側の面）に残留する。

フィルター１０５は、プラスチック又は金属等の薄膜に、多数の貫通孔が形成されている構造を有するものであれば特に限定されず、従来公知のものを使用することができる。フィルター１０５は、希少細胞含有液から希少細胞以外の成分をろ液とともに取り除き、貫通孔１０６を通過しなかった希少細胞をその表面に捕捉する。例えば、希少細胞含有液として癌細胞を含む血液を使用する場合には、８μｍ（短辺）×１００μｍ（長辺）程度の大きさの略矩形状の貫通孔１０６を有するフィルターを用いることによって、赤血球、白血球、及び血小板等の血液成分をろ液として取り除き、希少細胞である癌細胞をフィルター１０５に捕捉することができる。なお、フィルター１０５に設けられる貫通孔１０６の孔径は、捕捉対象の細胞の種類等に応じて適宜変更することができる。また、貫通孔１０６の形状についても適宜変更することができる。貫通孔１０６形状としては、楕円、正方形、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。なお、細胞の捕捉効率の観点からは、円、長方形又は角丸長方形が好ましい。角丸長方形とは２つの等しい長さの長辺と２つの半円形からなる形状である。

希少細胞含有液及び洗浄液等の液体が流入管１２５を通過するときの流速は、１００μＬ／分〜８００μＬ／分であることが好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分であることがより好ましい。液体の流速が上記範囲以内であると、希少細胞に対するダメージをより低減することができ、希少細胞の回収率を向上させることができる。

フィルター１０５の貫通孔１０６に対して希少細胞含有液を通過させることが可能であれば、細胞捕捉デバイス１００の具体的な構成は特に限定されない。

次に、洗浄工程（ステップＳ０２）について説明する。洗浄工程Ｓ０２は、フィルター表面を洗浄液で洗浄する工程である。洗浄工程Ｓ０２は、必要に応じて実施される工程であり、省略してもよい。

まず、細胞捕捉デバイス１００の流入管１２５から洗浄液を導入し、希少細胞を捕捉したフィルター１０５を洗浄液で洗浄する。洗浄液としては、フィルター１０５上に残留した希少細胞以外の成分を洗い流せるものであれば特に限定されない。洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝液等が挙げられる。洗浄液の量は特に制限されないが、希少細胞含有液の量の倍量程度とすることができる。

洗浄液でフィルター１０５を洗浄する場合、洗浄液の流速は特に限定されないが、洗浄液の移動に伴って希少細胞が貫通孔１０６内へ移動することを抑制可能な流速とすることが好ましい。すなわち、流入管１２５から導入する洗浄液の流速が、１００μＬ／分〜８００μＬ／分であることが好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分であることがより好ましい。

なお、洗浄液でフィルター１０５を洗浄した後、フィルター１０５の表面から洗浄液が除去されない状態を維持することが好ましい。フィルター１０５の表面に洗浄液が残存している状態とし、フィルター１０５表面の希少細胞が露出しない状態を維持することで、希少細胞の乾燥等を防ぐことができる。また、洗浄液の移動に伴って希少細胞が貫通孔１０６内へ移動することを防ぐこともできる。なお、フィルター１０５の表面から洗浄液が除去されない状態を作るためには、細胞捕捉デバイス１００のポンプＰの駆動により洗浄液の流速を制御し、洗浄液の移動を止めればよい。

置換工程（ステップＳ０３）、樹脂置換工程（ステップＳ０４）及び転写工程（ステップＳ０５）については、図３を参照しながら説明する。

置換工程（ステップＳ０３）は、細胞捕捉デバイス１００内の上部空間Ａ１、下部空間Ａ２、及び貫通孔１０６内をバッファで満たす工程である。図３（Ａ）は、希少細胞Ｃがフィルター１０５の表面に捕捉されている状態を示している。希少細胞Ｃは、フィルター１０５の貫通孔１０６上又はフィルター１０５の表面上に存在した状態でフィルター１０５に捕捉される。この状態で、細胞捕捉デバイス１００内の空間がバッファで満たされるように、細胞捕捉デバイス１００内にバッファを導入する。バッファとしては、リン酸緩衝液等の希少細胞Ｃに影響を与えない緩衝液等が用いられるが、洗浄液（ウォッシュバッファ）をバッファとして用いてもよい。また、バッファとして水を用いてもよい。

バッファを細胞捕捉デバイス１００に対して供給する際のバッファの流速は特に限定されないが、バッファの移動に伴って希少細胞が貫通孔１０６内へ移動することを抑制可能な流速とすることが好ましい。すなわち、流入管１２５から導入するバッファの流速が、１００μＬ／分〜８００μＬ／分であることが好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分であることがより好ましい。

図３（Ａ）では、上部部材１１０及び下部部材１１５は省略し、上部空間Ａ１及び下部空間Ａ２を示している。上部空間Ａ１、下部空間Ａ２、及びフィルター１０５により形成される領域は、細胞捕捉デバイス１００内の流入口１３０と流出口１４０との間に形成される流路に相当する領域である。また、図３（Ａ）では、置換工程Ｓ０３を経ることで、細胞捕捉デバイス１００内の上部空間Ａ１、下部空間Ａ２、及びフィルター１０５の貫通孔１０６内をバッファＢで満たした状態を示している。このように、細胞捕捉デバイス１００内をバッファＢにより置換することで、細胞捕捉デバイス１００内に残存する気泡等を減らすことができる。

樹脂置換工程Ｓ０４は、細胞捕捉デバイス１００内の流路に流動性を有する光硬化性樹脂を導入し、内部のバッファと置換するする工程である。本実施形態では、光硬化性樹脂を導入する前に、細胞捕捉デバイス１００内はバッファＢにより満たされている。したがって、樹脂置換工程Ｓ０３は、細胞捕捉デバイス１００内のバッファＢを光硬化性樹脂Ｒに置換することで、細胞捕捉デバイス１００内を光硬化性樹脂Ｒで満たす工程である。細胞捕捉デバイス１００内に光硬化性樹脂を導入した状態を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）に示すように、細胞捕捉デバイス１００内の上部空間Ａ１、下部空間Ａ２、及び貫通孔１０６内が光硬化性樹脂Ｒで満たされる。この結果、フィルター１０５の表面に存在する希少細胞Ｃの周囲が光硬化性樹脂Ｒで覆われた状態となる。なお、フィルター１０５及びその周辺が空気に触れることなく、バッファから光硬化性樹脂Ｒへ置換することが好ましい。

本実施形態における光硬化性樹脂とは、光エネルギーの作用で液状から固体に変化する樹脂を指す。光硬化性樹脂としては、例えば、紫外線の照射により固体に変化する紫外線硬化型樹脂等が挙げられるが、これに限定されるものではない。光硬化性樹脂としては、例えば、生体適合性のあるポリエチレングリコールを有するアクリル樹脂を用いることができる。具体的には、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、エトキシ化エチルヘキシルポリエチレングリコール、ブトキシ化ポリエチレングリコール、メトキシポリプロピレングリコールメタクリレート等が挙げることができる。また、これらの光硬化性樹脂は、光重合性開始剤を含むことが好ましい。

なお、本実施形態に係る光硬化性樹脂は、硬化後の樹脂について、可視光（波長範囲３８０ｎｍ〜７８０ｎｍの光）の透過率が２０％以上であることが好ましい。硬化後の樹脂における可視光の透過率が２０％以上であると、光硬化性樹脂に保持された状態であっても希少細胞Ｃの視認率が向上する。したがって、光硬化性樹脂に保持された状態での可視光を利用した希少細胞Ｃの観察等を行うことが可能となる。また、波長範囲３８０ｎｍ〜７８０ｎｍに含まれる特定波長の光の透過率が２０％以上であると、当該波長の光に対しては高い透過性を有しているので、当該波長の光を利用した観察等に好適に用いられる。

光硬化性樹脂Ｒを細胞捕捉デバイス１００に対して供給する際の光硬化性樹脂Ｒの流速は特に限定されないが、光硬化性樹脂Ｒの移動に伴って希少細胞が貫通孔１０６内へ移動することを抑制可能な流速とすることが好ましい。すなわち、光硬化性樹脂Ｒの流速は１００μＬ／分〜８００μＬ／分であることが好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分であることがより好ましく、４０μＬ／分〜８０μＬ／分であることが更に好ましい。

転写工程Ｓ０５は、細胞捕捉デバイス１００内に導入した光硬化性樹脂を硬化させる工程である。光硬化性樹脂Ｒに対して所定の光を照射することで、光硬化性樹脂Ｒが硬化する。この結果、希少細胞Ｃの一部が硬化した光硬化性樹脂Ｒにより保持された状態となる。すなわち、光硬化性樹脂Ｒと希少細胞Ｃとが一体的な状態となる。光硬化性樹脂Ｒに対して照射する光の光量等は、光硬化性樹脂Ｒが硬化可能な条件に応じて適宜設定される。なお、光硬化性樹脂Ｒに対して過剰に光を照射することは、希少細胞Ｃに対しても同等の光を照射することにつながるため、希少細胞Ｃに対して何らかの影響を与える可能性がある。したがって、光硬化性樹脂Ｒが硬化可能な範囲であり且つ光量を少なく設定することが好ましい。具体的には、光硬化性樹脂Ｒに対して照射する光の光量（積算光量）は１０〜１０００ｍＪ／ｃｍ^２であることが好ましく、５０〜５００ｍＪ／ｃｍ^２であることがより好ましく、１００〜３００ｍＪ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。

回収工程Ｓ０６は、光硬化性樹脂Ｒを回収する工程である。本実施形態では、光硬化性樹脂Ｒを細胞捕捉デバイス１００内で硬化させているので、細胞捕捉デバイス１００から光硬化性樹脂Ｒを取り出す必要がある。また、図３（Ｂ）に示すように、光硬化性樹脂Ｒは、上部空間Ａ１、下部空間Ａ２及び貫通孔１０６を満たした状態で硬化するので、光硬化性樹脂Ｒは、フィルター１０５とも一体化した状態で硬化する。したがって、細胞捕捉デバイス１００を分解して、硬化した光硬化性樹脂Ｒを取り出すと共に、必要に応じて上部空間Ａ１に相当する部分の光硬化性樹脂Ｒが個別に取りだされる。

図３（Ｃ）では、上部空間Ａ１に相当する部分の光硬化性樹脂Ｒを取り出した状態を示している。図３（Ｃ）に示すように、希少細胞Ｃは、フィルター１０５から外れ、上部空間Ａ１に相当する部分の光硬化性樹脂Ｒ側に移動している（転写）。なお、上部空間Ａ１に相当する部分の光硬化性樹脂Ｒを細胞捕捉デバイス１００及びフィルター１０５と離間させる方法は特に限定されない。例えば、光硬化性樹脂Ｒが硬化した後に筐体１２０を上部部材１１０及び下部部材１１５に分離すると、光硬化性樹脂Ｒ及びフィルター１０５が上部部材１１０側に付着した状態で下部部材１１５と分離される。このとき、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５とは表面張力で吸着しているので、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５とは簡単に分離することができる。フィルターを外すと、光硬化性樹脂Ｒから細胞が露出し、取り出しやすくなっている。また、上記のプロセスの場合には、光硬化性樹脂Ｒが上部部材１１０に付着した状態で後述の回収工程を行ってもよい。また、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５との境界部分が密着している場合には、細胞捕捉デバイス１００の上部部材１１０及び下部部材１１５を外した後に、上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５との境界部分の端部に治具等を挿入することで、両者を離間させることができる。また、細胞捕捉デバイス１００の上部部材１１０及び下部部材１１５を外した後に、上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂Ｒの上面（フィルター１０５側の面とは逆側の面）に対してテープ等を貼付し、このテープを利用して光硬化性樹脂Ｒをフィルター１０５から離間させる方法を用いてもよい。なお、フィルター１０５から離間させた光硬化性樹脂Ｒは、例えばスライドガラス上に移動してもよく、この場合、後述の回収工程における作業性が向上する。

さらに、回収工程Ｓ０６においては、必要に応じて、光硬化性樹脂Ｒから希少細胞Ｃを取り出して個別に回収してもよい。具体的には、必要に応じて顕微鏡を使用しながら、光硬化性樹脂Ｒに保持されている希少細胞Ｃを別容器等へ移動させることで、希少細胞Ｃを個別に回収することができる。希少細胞Ｃを回収する方法としては、特に限定されないが、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いる方法が好ましい。マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いることで、希少細胞Ｃを一つ一つ個別に回収することができるため、個別に回収した希少細胞Ｃについて遺伝子解析等を行うことができる。なお、マイクロダイセクタは、細胞を上に飛ばして単離する技術である。また、マイクロマニピュレーターは、微細なピンセットのようなもので細胞をつまみ出す技術である。希少細胞の単離に用いるマイクロダイセクタ及びマイクロマニピュレーター３００としては、公知のものを利用することができる。

その後、必要に応じて、解析工程（ステップＳ０７）を実施する。解析工程Ｓ０７は、捕捉工程Ｓ０１から回収工程Ｓ０６までの一連の工程によって単離された希少細胞Ｃに係る解析を行う工程である。

回収工程Ｓ０６において、光硬化性樹脂Ｒに保持された状態の希少細胞Ｃを回収した場合、解析工程では、例えば、希少細胞Ｃを光硬化性樹脂Ｒに保持された状態のまま観察することができる。特に、光硬化性樹脂Ｒにおける可視光の透過率が２０％以上であると、希少細胞Ｃを光硬化性樹脂Ｒに保持された状態であっても、光硬化性樹脂Ｒの観察を好適に行うことができる。

単離された希少細胞Ｃを解析する方法として遺伝子解析を行うこともできる。この場合、単離された希少細胞Ｃに、ＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）等公知の遺伝子解析法を用いて、希少細胞Ｃの遺伝子情報を得る。得られた遺伝子情報は、各種研究、検査又は診断に利用することができる。また、希少細胞Ｃは、得られた遺伝子情報に基づいて、遺伝子型によって分類されることができる。遺伝子型別に分類された癌細胞を培養して、所定濃度の癌細胞サンプルとして提供することも可能である。このように、本発明は医学及び生物学の分野において幅広く応用可能である。

なお、本実施形態の希少細胞回収方法は、希少細胞とその他の細胞とを判別する観点から、以上の工程の他に、希少細胞を染色する工程をさらに含むこともできる。希少細胞Ｃを染色する工程は、希少細胞Ｃを光硬化性樹脂Ｒから単離して回収するより前であれば特に限定されず、例えば、捕捉工程Ｓ０１の前、洗浄工程Ｓ０２の前、置換工程Ｓ０３の前、樹脂置換工程Ｓ０４の前等に行うことができる。希少細胞Ｃの染色の方法は、特に限定されないが、例えば、蛍光染色及びギムザ染色であることができる。

本実施形態の希少細胞Ｃの回収方法によれば、細胞捕捉デバイス１００におけるフィルター１０５によるろ過によって、希少細胞含有液から希少細胞Ｃを収率良く、且つ、希少細胞Ｃが転写されやすいように平面的に分布された状態で捕捉することができる。そして、フィルター１０５の表面に光硬化性樹脂Ｒを導入して硬化させることにより光硬化性樹脂Ｒに対して希少細胞Ｃを転写することで、希少細胞Ｃへの影響及び希少細胞Ｃの紛失を最小限に抑えながら、希少細胞Ｃを回収することができるため、希少細胞を高収率で回収することが可能となる。また、光硬化性樹脂Ｒを希少細胞Ｃの周囲に導入し、これを硬化させることで、希少細胞Ｃの移動を規制することができる。したがって、希少細胞の紛失を抑制することができ、収率を高めることができる。

さらに、本実施形態に係る希少細胞Ｃの回収方法では、細胞捕捉デバイス１００内をバッファで置換した後に、バッファと光硬化性樹脂とを置換することで、フィルター１０５の表面を含む細胞捕捉デバイス１００内に光硬化性樹脂Ｒが導入される。このように細胞捕捉デバイス１００内をバッファで満たした後に、光硬化性樹脂Ｒと置換する手順とすることで、光硬化性樹脂Ｒを導入した際に希少細胞Ｃがフィルター１０５の表面から貫通孔１０６内へ移行することが防がれる。したがって、希少細胞Ｃの収率をさらに高めることができる。なお、バッファから光硬化性樹脂Ｒへ置換することで、希少細胞Ｃが貫通孔１０６に入りにくくなる理由としては、例えば、バッファからの置換により、バッファの表面張力によりフィルター１０５の厚み方向への力が加わることを防ぐことができることが考えられる。また、希少細胞Ｃは気相（乾燥状態）では扁平等の形状に変形しやすくなるのに対して、水環境（湿潤環境）では、球状の形状を保持しやすいこと、及び、バッファからの置換により、希少細胞Ｃが空気（気相）に触れて細胞膜が変質することを抑制することができること、等が考えられる。

また、従来から、フィルターによる捕捉後の希少細胞を回収する方法として、アガロースゲル法、又は、パラフィン固定法のようにフィルター上の細胞を取り巻く液体を固化させて回収する方法が用いられていたが、光硬化性樹脂を用いる方法は、上記の方法と比較して様々な利点がある。例えば、低融点アガロースを用いて液体全体を凝固させるアガロースゲル法は、簡便で細胞紛失のリスクの低い方法であるが、アガロースの融点が高いために、取扱いが難しく、回収率も低い。また、パラフィン固定法は、古くから用いられているパラフィンを用いることで信用性が高いが、融点が高いため、細胞への影響が懸念される。これに対して、本実施形態に係る希少細胞Ｃの回収方法では、光照射のみにより、希少細胞Ｃを光硬化性樹脂Ｒに対する転写を実現することができる。したがって、操作が簡便であり、且つ細胞紛失のリスクが低くなる。また、希少細胞Ｃへのダメージも抑えることができる。

また、上記実施形態のように、硬化後の可視光の透過率が２０％以上である光硬化性樹脂Ｒを用いると、回収工程で回収した光硬化性樹脂Ｒに希少細胞Ｃが保持された状態で、希少細胞を観察することが可能となる。

さらに、上記実施形態のように、フィルター１０５の一方の面側に相当する上部空間Ａ１側の光硬化性樹脂Ｒを他の領域の光硬化性樹脂と区別して回収する構成とすることで、希少細胞Ｃの観察又は光硬化性樹脂Ｒから取り出した希少細胞Ｃの解析等の後段の作業を好適に行うことができる。

また、上記実施形態のように、希少細胞Ｃを個別に回収する工程を含むことで、遺伝子解析等の希少細胞に係るより詳細な解析を行うことが可能となる。

以上、本発明の実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、様々な変形態様が可能である。上記実施形態では、細胞捕捉デバイス１００におけるフィルター１０５の一方の面側に相当する領域、すなわち、上部空間Ａ１の光硬化性樹脂Ｒを、下部空間Ａ２等の他の領域の光硬化性樹脂と区別して回収する場合について説明したが、細胞捕捉デバイス１００内に導入されて硬化した光硬化性樹脂Ｒを一体的に回収してもよい。この場合、細胞捕捉デバイス１００内では、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５とが一体的になっていることが考えられるため、フィルター１０５も一緒に回収されることが考えられる。ただし、光硬化性樹脂Ｒが硬化した際に希少細胞Ｃが光硬化性樹脂Ｒにより保持された状態に移行していると考えられるので、フィルター１０５を光硬化性樹脂Ｒから取り外した後に、希少細胞Ｃを回収することで、希少細胞の紛失等を防ぎながら好適に回収することができる。

＜実施例１＞
（希少細胞含有液サンプルの調製）
希少細胞含有液のサンプルとして、真空採血管（ｃｆＤＮＡ採血管、Ｓｔｒｅｃｋ社製）に採血した健常者の血液に、血液１ｍＬあたり１０００個のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８を含有させた血液サンプルを用いた。なお、血液は採血後６時間のものを用いた。また、ＮＣＩ−Ｈ３５８はあらかじめＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ株式会社製）で蛍光染色されたものを用いた。

（癌細胞の捕捉、転写及び回収）
細胞捕捉デバイスにフィルターを取り付けた後、ＣＴＣ回収装置：ＭＣ６１００（日立化成株式会社製）にセットし、以下の実験を行った。使用したフィルターは、２０ｍｍ×２０ｍｍ×２０μｍ大のニッケル薄膜に、厚み０．２μｍの金めっきを施したもので、７．８μｍ×１００μｍ大の開口部（貫通孔）を、開口率６．７％で有する。ここで、開口率とは、フィルター全体の面積に対する貫通孔が占める面積をいう。この細胞捕捉デバイスは、上記実施形態で説明したものに相当する。ＣＴＣ回収装置は、血液サンプル及び試薬を導入する流路を備える。この流路の入り口に、１０ｍＬシリンジを加工して作製したリザーバーを接続した。

ＣＴＣ回収装置内を蒸留水で満たし、装置のプライミングを行った。リザーバーに、２ｍＭ ＥＤＴＡ−１０．０％ＦＢＳ（牛胎児血清）−ＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ社製）（以下、「洗浄液」ともいう。）を７ｍＬ入れ、リザーバーの下部に血液サンプルを、血液サンプルと洗浄液が層をなすように加えた。

ＣＴＣ回収装置を作動させ、流速２００μＬ／分でリザーバー中の血液サンプル及び洗浄液をフィルターに送液し、癌細胞をフィルターで捕捉した。これにより、リザーバー下層の血液が先に流れ、その後、リザーバー上層の洗浄液が流れた。洗浄液が細胞捕捉デバイス内に満たされた状態を確認し、送液を停止した。

次に、リザーバー内の液体を光硬化性樹脂Ｒに変更した。実施例で用いた光硬化性樹脂Ｒとは、ポリエチレングリコールジメタクリレート（１４Ｇ、新中村化学工業株式会社）であり、光重合性開始剤として、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９（ＢＡＳＦ社製）を添加、混合し、溶解させたものである。流速２００μＬ／分でリザーバー中の光硬化性樹脂Ｒを細胞捕捉デバイス内に導入し、内部の空間が光硬化性樹脂Ｒにより置換されるまで十分送液を行った後、光硬化性樹脂の送液を停止した。

次に、細胞捕捉デバイス内の光硬化性樹脂に対して紫外線（波長３６５ｎｍ）を１０秒間、積算光量が１００ｍＪ／ｃｍ^２となるように照射し、光硬化性樹脂を硬化させた。その後、細胞捕捉デバイス内部の光硬化性樹脂を取り出し、ピンセットによって上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂、下部空間Ａ２に相当する光硬化性樹脂、フィルター部分に分解した。

＜実施例２＞
ポリエチレングリコールジメタクリレート（１４Ｇ、新中村化学工業株式会社）を、ポリエチレングリコールジアクリレート（Ａ−６００、新中村化学工業株式会社）に代えた他は、実施例１と同様に行った。

（細胞数の計測）
上記の上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂、下部空間Ａ２に相当する光硬化性樹脂、フィルター部分に残存した細胞を、電動ステージ（ＰｒｏＳｃａｎ ＩＩ、Ｐｒｉｏｒ社製）を装備した蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ ２、Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、蛍光観察した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ由来の蛍光を観察するために、蛍光顕微鏡に３８フィルタ（Ｚｅｉｓｓ社製）を使用した。観察視野の画像を取得し、フィルターに捕捉された癌細胞の数を計測した。画像の取得及び解析にはＬｕｍｉｎａ Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社製）を用いた。

上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂、下部空間Ａ２に相当する光硬化性樹脂、フィルター部分のそれぞれに存在する細胞数を比較したところ、上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂には全体の細胞数の９割の細胞が存在することが確認された。また、下部空間Ａ２に相当する光硬化性樹脂に存在する細胞数はゼロであり、フィルター部分には全体の細胞数の１割の細胞が存在することが確認された。フィルター部分に存在する細胞は、フィルターの貫通孔に入り込んだ細胞であると推測される。

＜フィルターからの直接の回収との比較＞
上記の実施例１及び２で説明した方法と同様の方法をフィルター上に捕捉された癌細胞を、マニュピュレータを用いて直接回収する場合と、上記実施例１及び２のように光硬化性樹脂を用いて回収する場合と、の回収成功率について比較した。いずれの場合にも複数の癌細胞を対象としてマニュピュレータを用いて回収操作を行った。フィルター上に捕捉された癌細胞を直接回収する場合、１つの癌細胞の回収に係る所要時間が１０分程度であり、回収対象とした２９個の癌細胞のうち、無事に回収できたのは１個であった。一方、実施例１及び２で説明したように上部空間Ａ１に相当する光硬化性樹脂から癌細胞を回収する場合、１つの癌細胞の回収に係る所要時間が１分程度であり、回収対象とした３０個の癌細胞全てを無事に回収することができた。このように、光硬化性樹脂を用いた回収を行うことで、回収効率が向上することが確認できた。

１００…細胞捕捉デバイス、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口、Ａ１…上部空間、Ａ２…下部空間、Ｂ…バッファ、Ｃ…希少細胞、Ｒ…光硬化性樹脂。

Claims (4)

1. 液体を内部へ導入するための流入口と、液体を外部へ排出するための流出口と、を有する筐体と、前記流入口と前記流出口との間の前記筐体の内部の流路上に、厚さ方向に複数の貫通孔を有するフィルターが設けられた細胞捕捉デバイスを用いた希少細胞回収方法であって、
   前記流入口から希少細胞含有液を導入し、前記流出口から排出することで、前記フィルターによって当該希少細胞含有液をろ過することにより、前記フィルターの一方の面上に前記希少細胞含有液に含まれる希少細胞を捕捉する捕捉工程と、
   前記流入口からバッファを導入することで、前記細胞捕捉デバイス内の流路をバッファで満たすバッファ置換工程と、
   前記流入口から光硬化性樹脂を導入することで、前記細胞捕捉デバイス内の流路の前記バッファを前記光硬化性樹脂に置換する樹脂置換工程と、
   前記細胞捕捉デバイス内の前記光硬化性樹脂を硬化させることで、前記希少細胞を前記フィルターの一方の面上から前記光硬化性樹脂に転写する転写工程と、
   前記転写工程において硬化された前記光硬化性樹脂を前記細胞捕捉デバイスから取り出して回収する回収工程と、
   を含む希少細胞回収方法。
2. 前記光硬化性樹脂は、硬化後の可視光の透過率が２０％以上である請求項１に記載の希少細胞回収方法。
3. 前記回収工程において、前記フィルターの一方の面側に相当する前記光硬化性樹脂を他の前記光硬化性樹脂と区別して回収する請求項１に記載の希少細胞回収方法。
4. 前記回収工程において、前記細胞捕捉デバイスから取り出した前記光硬化性樹脂から前記希少細胞を個別に回収する工程をさらに含む請求項１又は２に記載の希少細胞回収方法。

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